TEHNICI MODERNE ÎN lp5

8/8/2019 TEHNICI MODERNE N lp5

1/34

1

TEHNICI MODERNE N

BIOLOGIA CELULAR


2/34

2

STUDIUL PROCESELORCELULARE

2 aspecte:2 aspecte:

Tehnici si metode adecvate de urmTehnici si metode adecvate de urmrire arire afenomenelor celularefenomenelor celulare

Modelarea experimentalModelarea experimental a fenomenelora fenomenelor

celularecelulare


3/34

3

MODALITI DE STUDIU

1.1. in vivoin vivo

2.2. in situin situ

3.3. in vitroin vitro


4/34

4

MODALITI DE STUDIU

in vivoin vivo -- cand celulele sau organele ale caruicand celulele sau organele ale caruicelule dorim sa le studiem sunt abordate incelule dorim sa le studiem sunt abordate inorganismul intactorganismul intact..

Avantaje: rezultatele obinute sunt edificatoareAvantaje: rezultatele obinute sunt edificatoarepentru procesul studiat la nivel de organismpentru procesul studiat la nivel de organism

Dezavantaje: rDezavantaje: rezultatele experimentelor suntezultatele experimentelor sunt dificildificilde interpretatde interpretat datoritdatorit influeninflueneleloror celorlaltecelorlaltecomponente ale organismuluicomponente ale organismului


5/34

5

MODALITI DE STUDIUin situin situ cand organul de interes estecand organul de interes este

mentinut la locul sau in organism dar suntmentinut la locul sau in organism dar suntcontrolate unele influente cum sunt celecontrolate unele influente cum sunt cele

nervoase sau endocrinenervoase sau endocrine

Avantaje: se pot studia variaiile procesuluiAvantaje: se pot studia variaiile procesului

n condiii controlaten condiii controlateDezavantaje: nu se poate identifica rezultatulDezavantaje: nu se poate identifica rezultatul

cu cel n vivocu cel n vivo


6/34

6

MODALITI DE STUDIU

in vitroin vitro cand organul ,cand organul , esutul sauesutul saucelulele sunt izolate din organismcelulele sunt izolate din organism

Avantaje:Avantaje: se permite un control rigurosse permite un control rigurosal experimentului.al experimentului.

Dezavantaje: nu se poate garantaDezavantaje: nu se poate garantaobinerea acelorai rezultate in vivo.obinerea acelorai rezultate in vivo.


7/34

7

Tehnici in vitro

Baia de organBaia de organ

Cultura de celuleCultura de celule


8/34

8

Baia de organ

-- permite menpermite meninerea viabilitinerea viabilitii unor fragmente deii unor fragmente deorgan sauorgan sau esuturi.esuturi.

--variate variate n funcn funcie de organul supus experimentuluiie de organul supus experimentului-- asigurasigur o temperatura constanto temperatura constant , oxigenarea, oxigenareamaterialului biologic , posibilitatea controlmaterialului biologic , posibilitatea controlriiriicompozicompoziiei mediului din baieiei mediului din baie i culegerea dei culegerea dedate funcdate funcionaleionale i ei eantioaneantioane


9/34

Culturi de celule - Etape

DigestiaDigestia enzimaticaenzimatica a tesutului cu obtinerea uneia tesutului cu obtinerea uneisuspensii de celulesuspensii de celule

IzolareaIzolarea unei popunei popuulalaii celulare pureii celulare pure IInsnsmmnnareaarea n flacoane de culturn flacoane de cultur sau plsau plcici

Petri obPetri obininndundu--se astfel o culturse astfel o cultur primarprimar PasareaPasarea -- resuspendarea celulelor din culturaresuspendarea celulelor din cultura

primara urmatprimara urmat de de rede de rensnsmmnnareaarea n flacoanen flacoanede culturde cultur sau plsau plci Petri obci Petri obininndundu--se culturise culturisecundarsecundaree


10/34

10

Culturi celulare - Evoluie

1.1. Faza de lagFaza de lag sau de inducsau de inducieie -- celulelecelulele iirefac suprafarefac suprafaaa i se acomodeazi se acomodeaz cucumediul de culturmediul de cultur

2.2. FFaza exponenaza exponenialial -- celulele se dividcelulele se dividrapid, exponenrapid, exponenialial

3.3. Faza staFaza staionarionar -- nnumumrrulul de celulede celule

rrmmne constant. In aceastne constant. In aceast fazfaz seseefectueazefectueaz pasareapasarea

4.4. Faza de declinFaza de declin -- scscderea nr. de celulederea nr. de celule

datoritdatorit mbmbtrtrniriinirii i mori morii .ii .


11/34

11

Medii de cultur - Componente1.1. AmimoaciziAmimoacizi i vi vitamineitamine2.2. SSruriruri necesare mennecesare meninerii echilibruluiinerii echilibrului

ionicionic i pH mediului de culturi pH mediului de cultur

3.3. Glucoza pentru necesarul energeticGlucoza pentru necesarul energetic4.4. Ser fetalSer fetal

5.5. AntibioticeAntibiotice

6.6. Rosu fenol ca indicator de pHRosu fenol ca indicator de pH


12/34

12

1.1. MMorfologia si morfometriaorfologia si morfometria

2.2. Citometria in fluxCitometria in flux3.3. Fractionarea celularaFractionarea celulara

4.4. Citochimia si citoenzimologiaCitochimia si citoenzimologia

5.5. ImunocitochimiaImunocitochimia6.6. Fluorescenta si imunofluorescentaFluorescenta si imunofluorescenta

7.7. Microfiziologia si microinjectiaMicrofiziologia si microinjectia

8.8. RadioautografiaRadioautografia

9.9. Metode biochimiceMetode biochimice

10.10. Tehnici si metode de biologie molecularaTehnici si metode de biologie moleculara


13/34

13

MORFOMETRIA

-- utilizeaz unutilizeaz un analizor de imagineanalizor de imagine..

-- se stabiletese stabilete criteriul dupa care se va efectuacriteriul dupa care se va efectuaanalizaanaliza, precum i limitele maxim i minim, precum i limitele maxim i minim

ale acestuiaale acestuia-- Rezultat:Rezultat: diferitdiferitee populapopulaii celulare.ii celulare.

Rezultatul analizei cantitative este afisat sub formaRezultatul analizei cantitative este afisat sub formaunei histograme.unei histograme.


14/34

14

Citometria n flux

-- ppeermite analizarmite analiza i separarea celulelor pei separarea celulelor pebaza unor caractere morfologicebaza unor caractere morfologice iibiochimicebiochimice

OferOfer informainformaii asupra :ii asupra :1.1. mmrimii relative a celulelorrimii relative a celulelor

2

.2

. granularitgranularitii interne (neomogenitateaii interne (neomogenitateainternintern citoplasmaticcitoplasmatic) relativ) relativ

3.3. intensitatea relativintensitatea relativ a fluorescena fluoresceneiei..


15/34

15

Citometria n flux - utilitate

1.1. mmsurarea caracteristicilor fizice alesurarea caracteristicilor fizice aleceluleicelulei

2.2. identificarea si separarea populaidentificarea si separarea populaiiloriilor

de celule sanguine ( granulocite, monocitede celule sanguine ( granulocite, monocite, limfocite T sau B), limfocite T sau B)3.3. mmsurarea cantitsurarea cantitii de ADii de ADNN din celuldin celul

4.4. mmsurarea cantitsurarea cantitii intracelulare de Caii intracelulare de Ca5.5. masurarea pHmasurarea pH--ului intracelularului intracelular


16/34

16

Citometria in flux


17/34

17

Fracionarea celular

-- tehnictehnic ce permite izolarea diferitelorce permite izolarea diferitelorelemente ultrastructurale si biochimiceelemente ultrastructurale si biochimiceale celulelorale celulelor


18/34

18

Fracionarea celular - Etape

OmogenizareaOmogenizareadistrugerea integritdistrugerea integritiiiitisularetisulare i apoi celulare cu obi apoi celulare cu obinerea uneiinerea unei

suspensii de organitesuspensii de organite i membranei membraneveziculateveziculate n mediul de omogenizaren mediul de omogenizare

SeparareaSeparareaprin centrifugareprin centrifugare i/ saui/ sauultracentrifugareultracentrifugare


19/34

19

OMOGENIZAREA

a.a. prinprin soc osmoticsoc osmotic.. DiferenDiferena de osmolaritatea de osmolaritatentre mediul i.c. si cel e.c. duce la umflareantre mediul i.c. si cel e.c. duce la umflareacelulelor pana la ruperea membranelor.celulelor pana la ruperea membranelor.

b.b. prinprin ultrasonicareultrasonicare presupune rupereapresupune rupereamembranelor sub acmembranelor sub aciunea undelor ultrasoniceiunea undelor ultrasonice

c.c. cu omogenizatoarecu omogenizatoare se realizeaza sub acse realizeaza sub aciuneaiunea

forforelor de frecareelor de frecare i torsiune care contribuie lai torsiune care contribuie laruperea membranelor.ruperea membranelor.


20/34

20

SEPARAREA

diferendiferenialial cand organitele se depuncand organitele se depunla baza tubului ,la baza tubului , n ordinea densitn ordinea densitii lorii lor

prin centrifugari repetate la forprin centrifugari repetate la fore din cee din ce nnce mai marice mai mari

n gradient de densitaten gradient de densitateprintrprintr--oosingursingur centrifugare la forcentrifugare la fore suficient dee suficient deridicate se obridicate se obin organitele ca fracin organitele ca fraciiiiseparate .separate .


21/34

21

NUCLEI

Ultra so n ic a re

Mitocondri i

Lizozom i

M e m b r a n e

celulare

Golg i

m icrosom i

Ribo som i re tic ul e ndo p la sm ic

Purific a re in

grad ient

de de nsitate

Se p a ra re a c onstituentilor

c e lula ri p rin viteze d e c e ntri-

fuga re c resc a nde


22/34

22

AUTORADIOGRAFIA

--tehnica de investigare celulartehnica de investigare celular ce permitece permiteidentificarea morfologicidentificarea morfologic i ultrastructurali ultrastructural a unora unorcompucompui radioactivi.i radioactivi.

trasori radioactivitrasori radioactivi ::-- aminoacizi, glucide, nucleotideaminoacizi, glucide, nucleotide

-- fosfat sau sulfat radioactivfosfat sau sulfat radioactiv

-- liganzi radioactivi specificiliganzi radioactivi specifici

Marcarea unorMarcarea unorcomponentecomponente

celularecelulare

receptori saureceptori sauanticorpi radioactivianticorpi radioactivi


23/34

23

METODE BIOCHIMICE

ELECTROFOREZAELECTROFOREZA

IMUNOELECTROFOREZAIMUNOELECTROFOREZA

TRANSFERUL ELECTROFORETICTRANSFERUL ELECTROFORETIC


24/34

24

ELECTROFOREZA

PRINCIPIU:PRINCIPIU: particuleleparticulele ncncrcate electricrcate electricmigreazmigreaz ntrntr--un mediu vun mediu vscos , subscos , subacaciunea unui ciunea unui cmp electric.mp electric.

Aplicaii practice:Aplicaii practice: studiul proteinelorstudiul proteinelor i ai a

acizilor nucleici.acizilor nucleici.


25/34

25

ELECTROFOREZA

PROTEINELORa.a. unidimensionalunidimensional , cand migrarea se, cand migrarea se

realizeazrealizeaz n geln gel ntrntr--o singo singuurr direcdirecieie

b.b. bidimensionalbidimensional , c, cnd migrarea se realizeaznd migrarea se realizeazsuccesivsuccesiv n doun dou direcdireciiii

Aplicaii practiceAplicaii practice electroforeza unidimensionalelectroforeza unidimensional SDSSDS PAGEPAGE FOCALIZAREA IZOELECTRICAFOCALIZAREA IZOELECTRICA


26/34

26

ELECTROFOREZA SDS-PAGE

--realizeazrealizeaz separarea proteinelor dintrsepararea proteinelor dintr--ununamestec pe baza gabaritului molecularamestec pe baza gabaritului moleculardirect propordirect proporional cu masa molecularional cu masa molecular..

PrincipiuPrincipiu:: adsorbadsorbiiaa dodecilsulfatdodecilsulfatuluiului dede

sodiu unitar pe proteinesodiu unitar pe proteine,, realizrealiznd ond odensitate de sarcindensitate de sarcin negativnegativ uniformuniform..


27/34

27

ELECTROFOREZA SDS-PAGE


28/34

28

Focalizarea izoelectrica

-- separarea proteinelor dintrsepararea proteinelor dintr--un amestec seun amestec seface pe baza punctului lor izoelectric.face pe baza punctului lor izoelectric.

Principiu: migrarea pPrincipiu: migrarea protroteeinelineloror n funcn funcie deie depunctul izoelectric,punctul izoelectric, pn npn n zona cu pHzona cu pH--ululidentic cu cel al punctului lor izoelectricidentic cu cel al punctului lor izoelectric,,undeunde devin neutre oprindudevin neutre oprindu--i miscarea.i miscarea.


29/34

29

Focalizarea izoelectrica

Benzi r tei e l nct l iz e lectric


30/34

30

Electroforeza bidimensionala

--migrarea proteinelormigrarea proteinelor n doun dou direcdirecii :ii :

1.1. in prima direcin prima direcieie n funcn funcie de punctul lorie de punctul lorizoelectricizoelectric -- FOCALIZARE IZOELECTRICAFOCALIZARE IZOELECTRICA

2.2. a doua direca doua direcieie -- SDSSDS PAGE ,PAGE , n funcn funcie deie degreutatea moleculargreutatea molecular a proteinelor.a proteinelor.

Rezultatul se prezinta sub forma uneiRezultatul se prezinta sub forma unei hhrri cui cuproteinele separateproteinele separate n planul gelului.n planul gelului.


31/34

31

Electroforeza bidimensionala

Elec tr f r ez l nct iz e lectric

SDS-


32/34

32

IMUNOELECTROFOREZA

-- o varianto variant a electroforezei ce combina electroforezei ce combin migrareamigrarea nnccmp electric a proteinelor cu realizarea uneimp electric a proteinelor cu realizarea uneireactii imunereactii imune de tip Agde tip Ag--AcAc

Reactia imunaReactia imuna::

--dupa terminarea migrarii electroforetice,dupa terminarea migrarii electroforetice,

--concomitentconcomitent ((imunoelectroforezaimunoelectroforeza n rachetn rachet)) --apreciere cantitativapreciere cantitativ a Aga Ag ((== suprafsuprafaaaa descrisdescris dedelinia de precipitare cu linia de startlinia de precipitare cu linia de start))..


33/34

33

IMUNOELECTROFOREZA


34/34

34

TRANSFERUL

ELECTROFORETIC

--metodmetod de extragere a proteinelor separatede extragere a proteinelor separateelectroforetic dintrelectroforetic dintr--un gel , cu adsorbireaun gel , cu adsorbirealor pe niste hlor pe niste hrtii cu proprietrtii cu proprieti speciale.i speciale.

ProteineleProteinele sufersufer reacreacii de recunoaii de recunoatereterespecificspecific prin intermediul unorprin intermediul unorinteracinteraciuni de tip receptoriuni de tip receptor ligand sau Agligand sau Ag

AAcc..

Documents

TEHNICI MODERNE ÎN lp5