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Capitulo INTRODUCCIN A LAS TCNICAS ANALTICAS APLICADAS A LA DETERMINACIN Y CARACTERIZACIN DE COMPUESTOS Y ELEMENTOS QUMICOS PRESENTES EN EL MEDIO AMBIENTE Dra. Conxita Lao Luqu Departamento de Ingeniera Minera y Recursos Naturales, Universidad Politcnica de Catalua. Espaa. conxita@eupm.upc.edu Dra. Mnica Iglesias Departamento de Qumica Analtica. Facultad de Ciencias. Universidad de Girona. Espaa. monica.iglesias@udg.es Dr. Roberto Rodrguez Departamento de Qumica Analtica. Facultad de Ciencias. Universidad de Girona. Espaa. roberto.rodriguez@udg.es

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Capitulo INTRODUCCIN A LAS TCNICAS ANALTICAS APLICADAS A LA DETERMINACIN Y CARACTERIZACIN DE COMPUESTOS Y ELEMENTOS QUMICOS PRESENTES EN EL MEDIO AMBIENTE 1. INTRODUCCIN La mejor forma de poder conocer la presencia y concentracin de un compuesto o elemento qumico en el medio ambiente es mediante su determinacin cualitativa y cuantitativa. La revolucin cientfico tcnica y el desarrollo tecnolgico ha permitido el desarrollo de diferentes tcnicas analticas. Hay que sealar que hay tcnicas que permiten realizar una evaluacin cuantitativa y cualitativa de estos y algunas tcnicas solo permiten una determinacin cualitativa y semicuantitativa. Consecuentemente una de las actividades ms importante que desarrolla un profesional en los estudios de contaminacin ambiental es conocer las sustancias presentes en el medio natural y los diferentes componentes de este. Para tal efecto es necesario elegir las tcnicas analticas e instrumentales adecuadas de acuerdo al problema planteado y el tipo de contaminante de que se trate. Con tal propsito el objetivo de este capitulo es mostrar las tcnicas analticas e instrumentales ms usadas en la caracterizacin cualitativa y cuantitativa de los diferentes tipos de compuestos y elementos qumicos existentes en el medio ambiente. Las descripciones que se presentan aqu de las tcnicas analticas e instrumentales ms usadas en la actualidad y que se encuentran disponibles en el mercado no pretende ser intensiva ni exhaustiva, sino una gua orientativa para los profesionales de diferentes campos de la ciencia que necesitan tener un conocimiento elemental de estas en su proceso de formacin y especializacin profesional en temas de contaminacin y evaluacin de impactos medioambientales. En cada caso se hace referencia a las fuentes bibliogrficas donde se puede ampliar la informacin sobre cada una de estas tcnicas analticas. Es de sealar que los elementos contaminantes que se estudian con las tcnicas analticas que se describen a continuacin pueden ser de origen natural o antropognico. Conocer la concentracin de los elementos qumicos y el tipo de compuesto en que se presentan estos en el medio ambiente permite determinar los posibles niveles de contaminacin existente o no en muestras de slidos, lquidos y gases que se estn analizando. Es de sealar que la condicin para que un elemento sea contaminante lo determinan las diferentes normativas existentes en funcin del uso o aplicacin que tenga la muestra que se este analizando. Al ser detectado un determinado tipo de sustancia o elemento contaminante en el medio se puede hacer un diagnostico de la situacin y en funcin de los niveles de concentracin y el tipo de compuesto o compuestos presentes establecer el tipo de medida de rehabilitacin o tcnicas de tratamiento a utilizar en la solucin del problema detectado. 2. METODOS ESPECTROFOTOMTRICOS DE ANLISIS Las tcnicas espectrofotomtricas de anlisis se basan en la interaccin entre la radiacin electromagntica (luz) y la materia (absorcin, emisin, reflexin,..) con intercambio de energa entre ellas. La radiacin electromagntica (REM) es una forma de energa que se transmite en el espacio a gran velocidad. La REM puede representarse por una onda harmnica, constituida por un campo elctrico alternante perpendicular a la direccin de propagacin del haz, asociado a dicho campo se propaga un campo magntico variable perpendicular al campo elctrico (figura 1).

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Figura 1. Radiacin electromagntica (http://www.astronomynotes.com/light/s3.htm). Existen diferentes radiaciones electromagnticas (visible, ultravioleta, infrarrojas, rayos X, etc.), (figura 2) Todas estas radiaciones tienen la misma naturaleza, se mueven a la misma velocidad en el vaco.

Figura 2. Espectro de la radiacin electromagntica (http://webvision.med.utah.edu/spanish/fisicaluz.html).

Cada radiacin viene caracterizada por una frecuencia, una amplitud y es portadora de una determinada energa. La longitud de onda y la frecuencia determinan el color de la luz, la amplitud afecta a su luminosidad. La relacin entre energa (E) y frecuencia de la radiacin () es: E = h (1)

Donde h es la constante de Planck con el valor de 6,6262 x 10-34 J s. La relacin entre la frecuencia y la longitud de onda es: c = ? (2)

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La velocidad de la luz en el vaco (c), es constante (c = 3.00 x 1010 cm s-1), luego la longitud de onda () y la frecuencia () son inversamente proporcionales. Cuando una se incrementa, la otra decrece.

La primera cuestin a plantearnos es que le ocurre a la materia cuando es sometida a una determinada radiacin. Tal y como podemos imaginar dicho efecto depender de la energa de dicha radiacin. En la tabla 1 se indican los efectos inmediatos sobre la materia, destacando de mayor a menor energa:

Tabla 1. Algunas radiaciones electromagnticas y el efecto que producen en la materia.

Radiacin Efecto Rayos X y csmicos Ionizaciones de las molculas UV-Visible Transiciones electrnicas entre los orbtales atmicos o moleculares Infrarrojo Deformacin de los enlaces qumicos (transiciones entre estados

vibracionales) Microondas Rotaciones de los enlaces qumicos (transiciones entre estados

rotacionales) Radiofrecuencias Transiciones de spn electrnico o nuclear en los tomos de la

molcula.

Tabla 2. Mtodos de anlisis espectroscpicos e informacin que proporcionan. Tcnica espectroscpica Informacin obtenida

Rayos X Estructura total de la molcula incluida la estereoqumica de la misma a partir de las posiciones relativas de los tomos.

Ultravioleta-Visible Existencia de cromforos y/o conjugacin en la molcula a partir de las absorciones observadas.

Infrarrojo Grupos funcionales a partir de las absorciones observadas. Espectrometra de masas Formula molecular y subestructuras a partir de los iones

observados.

Cuando la radiacin incide sobre una sustancia no toda ella se ve afectada por la misma; al tomo o conjunto de tomos que absorben radiacin se le denomina cromforo y en cada tcnica espectroscpica ser distinto dentro de una misma molcula. En las molculas existen tambin tomos o grupos de tomos que no absorben radiacin, pero hacen que se modifique alguna de las caractersticas de la absorcin del cromforo, a estos grupos se les llama auxocromos.

La segunda cuestin es como podemos utilizar dichos efectos sobre las sustancias para obtener informacin sobre la estructura y composicin de la materia y como utilizar dicha informacin. A estas dos interrogantes daremos respuesta en lo adelante con la descripcin de los mtodos que utilizan los espectros de emisin y de adsorcin de las sustancias.

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1.1. ESPECTROS DE EMISIN Y ESPECTROS DE ABSORCIN

Emisin de REM. Espectros de emisin

Cuando los tomos o molculas que se encuentran en estado fundamental son excitados trmica o elctricamente, sus electrones pueden pasar a un estado de energa superior (Estado excitado). El estado excitado es inestable y se vuelve al nivel de energa fundamental, emitiendo la energa en exceso en forma de REM (figura 3)

Figura 3. Absorcin y emisin de energa de una sustancia. Cada tomo o molcula tiene unos estados electrnicos caractersticos y por tanto emite unas longitudes de onda determinadas (espectro de emisin), diferentes a la de los otros tomos o molculas, lo que permite caracterizarlos.

Emisin de REM

Excitacin elctrica

H2

Dispersin de la REM

Figura 4. Espectro de emisin del tomo de hidrgeno.

Los tomos tienen espectros de emisin (as como de absorcin) de lneas y en cambio, las molculas tienen espectros de bandas. En una molcula existen distintos niveles vibracionales y rotacionales dentro de cada nivel electrnico que pueden acomodar al electrn. De esta

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manera entre dos niveles de energa electrnicos existen muchas transiciones posibles de energa muy parecida. Este gran nmero de posibles niveles produce bandas anchas en lugar de picos de una sola frecuencia. En los tomos, al no haber enlaces, no existen subniveles vibracionales ni rotacionales, y por tanto entre dos niveles solo hay una transicin posible.

Absorcin de REM. Espectros de absorcin

Cuando una REM pasa a travs de una muestra, se produce una disminucin de la intensidad de ciertas longitudes de onda debido a la absorcin de stas por parte de la sustancia que utiliza la energa para pasar a niveles de energa superiores. Las lneas o bandas que se absorben son caractersticas de cada sustancia (figura 5b).

Coinciden por tanto, las bandas del espectro en las que emite radiacin con los huecos o lneas negras del espectro de absorcin de la radiacin, como si un espectro fuera el negativo del otro (figura 5).

Figura 5. Espectro de emisin (a) y de absorcin (b) de un mismo elemento. (http://personales.ya.com).

Medicin de la radiacin

La determinacin de las lneas del espectro de emisin/absorcin de una sustancia permite identificarla, mientras que la intensidad de una determinada lnea es proporcional a la concentracin y por tanto, permite su cuantificacin.

Identificacin

La observacin de las lneas de determinadas longitudes de onda caractersticas de determinados elementos o compuestos permite identificarlos. En la figura 6 se ilustran diferentes espectros atmicos. El sodio (Na) emite en el amarillo en las bandas de longitudes de onda de 5896 A y 5890 A (figura 6a). El calcio emite en la longitud de onda del espectro visible 6162 A (amarillo-naranja), 4454 A y 4435 (color ail) y 4226 A (violeta) figura 6b).

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El mercurio (Hg) emite radiacin en dos longitudes de onda del visible: 5460 A (color verde) y 4358 A, (color ail) (figura 6c).

c)

b)

a)

Figura 6. Espectro de emisin de determinados elementos qumicos: a) sodio, b) calcio y c) mercurio (http://personales.ya.com).

La identificacin de analitos elementales mediante sus espectros de emisin no siempre es posible, debido a que los elementos con muchos niveles posibles tienen espectros de emisin muy complejos con miles de lneas, este es el caso, por ejemplo, de los metales de transicin. Como se ha comentado anteriormente, los espectros moleculares son de bandas. La interpretacin de las bandas de los espectros moleculares, especialmente los de la zona del infrarrojo, que permiten la identificacin de compuestos se describen en el apartado 1 de este captulo. Cuantificacin Tcnicas de absorcin: ley de Lambert-Beer

La cantidad de luz absorbida depende de la concentracin de solutos en la muestra, a ms concentracin mayor intensidad de luz se absorbe. Esta relacin viene dada por la ley de Lambert-Beer (Skoog et al., 2005). La cantidad de luz absorbida a una determinada longitud de onda es proporcional a la concentracin de la muestra (Ley de Lambert-Beer).

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Io

I

b

Figura 7. La radiacin de intensidad Io, incide sobre el material absorbente de grosor b, I es la intensidad de la radiacin transmitida despus de atravesar el material.

A = =IIolog = b CM (3)

donde A es la absorbancia, Io es la intensidad de la luz incidente, I es la intensidad de la luz transmitida, es la constante (absortividad molar) cuyo valor depende de la sustancia (material absorbente) y de la longitud de onda de trabajo, b es el camino ptico (grueso del material absorbente) y C es la concentracin en mol/L.

La ley de Lambert-Beer es la ecuacin fundamental que rige los fenmenos de absorcin electromagntica. Solo se cumple para radiaciones monocromticas (formadas por una sola longitud de onda). Segn la ley de Lambert-Beer, existe una relacin lineal entre la absorbancia y la concentracin. Si se representan los valores de la absorbancia (A) frente la concentracin, se obtiene una recta que pasa por el origen de pendiente (figura 8)

0

50

100

0 1 2 3 4 5 6 7

C

A

Figura 8. Relacin lineal entre la absorbancia y la concentracin.

Otra unidad que se utiliza como medida de la cantidad de luz absorbida es la tansmitncia (T), que es la relacin entre la luz transmitida y la luz incidente.

IoIT = ; A = Log

T1

(4)

Tcnicas de emisin de radiacin La intensidad de luz emitida por el analito, que ha sido excitado, al volver a su estado fundamental, es proporcional concentracin de este segn la ecuacin:

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I = k C (5) Donde I es la intensidad de la lnea seleccionada y C es la concentracin del analito en la muestra. k depende de distintos factores, pero para una determinada sustancia y una determinada longitud de onda es constante. Mtodos de cuantificacin en las tcnicas instrumentales a) Recta de calibrado b) Mtodo del patrn aadido c) Mtodo del patrn interno a) Curva de calibrado Se preparan soluciones de concentracin conocida y creciente de patrones del analito

(Con la matriz lo ms parecida a las muestra posible) Se prepara un blanco (contiene todo lo que contienen las soluciones patrn y la muestra

excepto el analito) Con el blanco se ajusta el cero del aparato ( 0 de absorbancia, 100% T) Se analiza cada solucin patrn por orden creciente de concentracin y se lee la seal

(absorbancia, intensidad de emisin, rea, conductividad) dada por el instrumento utilizado. Finalmente, se introduce la muestra y se lee la respuesta de la muestra (tabla 3).

Se calcula la recta de regresin: seal frente concentracin y en ella se interpola la seal de la muestra (figura 9). Para calcular la ecuacin de la recta normalmente se utiliza el mtodo de mnimos cuadrados.

Tabla 3. Concentraciones de las soluciones patrn y seales analticas correspondientes.

y = 0,0987x + 0,0419R2 = 0,9971

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 5 10 15 20 25

concentracin (ppm)

sea

l ana

ltic

a

8,39

Figura 9. Curva de calibrado directo y ecuacin de la recta de regresin. Clculo de la concentracin de la muestra:

Concentracin (ppm) Seal analtica 2 0,21 5 0,53 10 1,09 20 0,99

Cx (muestra) 0,87

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0,87 = 0,0987Cx + 0,0419 => Cx = 8,39 ppm Ejemplo: determina la concentracin de sodio en meq/L de una muestra de agua de 0.1 mL que diluida hasta 20 mL con agua destilada, dio una lectura en el fotmetro de llama de 64 (Tcnica de emisin atmica). La curva de calibracin se hizo con los datos de la siguiente tabla. Tabla 4. Concentraciones de las soluciones patrn y seales analticas correspondientes.

g/mL 5 10 15 20 Lectura fotmetro 20 40 60 80

y = 4xR2 = 1

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25

concentracin (ppm)

Inte

nsid

ad e

mis

in

Figura 10. Curva de calibrado y ecuacin de la recta de regresin. Sustituyendo la lectura de la muestra en la ecuacin de la recta, 64 = 4C => C = 64/4 = 16 g/mL Deshacemos la dilucin: 16 g/mL x (20mL/0,1mL)x (1000mL/1L)x (1mg/1000g) x (1mmol/ 23 mg) x ( 1meq/1mmol) = 139.13 meq Na/L) La curva de calibrado directa es el sistema de cuantificacin ms sencillo y rpido, pero si la matriz de la muestra es compleja o desconocida y no se puede reproducir en los patrones, puede dar bastante error. Por ejemplo por la presencia de una sustancia que afecte la capacidad de emisin del analito, entonces seria necesario preparar los patrones con la misma matriz que la muestra y esto, normalmente, es muy difcil. En estos casos se puede utilizar el mtodo de la adicin de patrn de patrn o patrn aadido. b) Mtodo del patrn aadido Primero se hace una lectura de la muestra problema para hacer una estimacin aproximada de la intensidad de la seal analtica. Se preparan soluciones de concentracin creciente de patrn del analito en la propia muestra y se mide la seal (intensidad de emisin, absorbancia, etc.). Se hace una representacin de la seal analtica medida frente a la concentracin de patrn aadido. La recta que se obtiene extrapolada a concentracin cero da la concentracin de la muestra problema (figura 11).

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Figura 11. Curva de calibrado para el mtodo de la adicin de patrn. Este mtodo permite solucionar el problema del efecto de la matriz de la muestra, ya que los patrones se preparan con la misma muestra. Ejemplo: en un anlisis de galio por fotometra de lama, se preparan 5 soluciones de galio de 25 mL cada una de concentraciones: 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 ppm de galio. A cada una de estas soluciones se aaden 25 mL de la muestra (una solucin de un residuo de concentracin desconocida que contiene galio). Les intensidades ledas fueron: 37, 46, 55, 63 i 82 respectivamente. Calculen la concentracin de galio en la muestra. Con las concentraciones de galio aadidadas y las intensidades de emisin (IE) calculamos la recta de regresin que resulta ser: IE = 24.5 + 107C Para calcular la concentracin de la muestra extrapolamos a 0 la intensidad de emisin: 0 = 24.5 + 107C => C = 0,229 ppm 0,229 ppm x (50 mL/25mL) = 0.458 ppm c) Mtodo del patrn interno Se preparan una serie de soluciones patrn de concentracin conocida y creciente del analito (CX). Se aade a todas estas soluciones y a la muestra una cantidad conocida y constante de patrn interno (CS) (sustancia no presente en la muestra, pero que tiene un comportamiento similar al analito). Se prepara un blanco en las mismas condiciones. Se determinan las seales analticas de las soluciones patrn a dos longitudes de onda (la mxima del analito (Seal X) y la mxima del patrn interno (Seal S). Si no se trata de un mtodo de emisin se miden las seales correspondientes qu da el instrumento (reas de los picos, absorbancia, etc.). Se determina la recta de regresin de Seal X/Seal S frente CX/CS (figura 12).

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Se interpolan en la recta los valores de la muestra.

Figura 12. Curva de calibrado para el mtodo del patrn interno.

Ejemplo: para valorar el contenido de potasio por fotometra de llama de una muestra se aplica el mtodo del patrn interno. Se prepararon una serie de soluciones de potasio, a cada una de ellas y de la muestra se aade litio hasta una concentracin final de 0.6 ppm de litio. Se determina la intensidad de emisin a la longitud de onda caracterstica del litio (232 nm) y del potasio (670.8 nm) obtenindose los siguientes resultados: Tabla 5. Concentraciones de las soluciones patrn y seales analticas correspondientes. K+ (ppm) 3 5 7 9 X IE 232 ( Li ) 27.3 27.1 26.9 27.0 27.1 IE 670.8 ( K ) 18.0 30.1 42.4 56.2 25.8 Calcular la concentracin de potasio de la muestra problema. En primer lugar calculamos los cocientes Concentracin de potasio en cada matraz dividido por concentracin de litio (CK/CLi) y intensidad de emisin del potasio dividido por intensidad de emisin del litio (IEK/IELi). Tabla 6. Relacin de concentraciones de las soluciones patrn y de las seales analticas.

K+ (ppm) 3 5 7 9 x IE 232 ( Li ) 27.3 27.1 26.9 27.0 27.1 IE 670.8 ( K ) 18.0 30.1 42.4 56.2 25.8 CK/CLi 3/0.6 =5 5/0.6=8.3 7/0.6=11.6 9/0.6=15 x/0.6 IEK/IELi 0.66 1.11 1.57 2.08 0.95 Calculamos la recta de regresin IEK/IELi frente en funcin de CK/CLi y se obtiene:

IEK/IELi = -0.062 + 0.95 CK/CLi ,

Sustituyendo las intensidades obtenidas con la muestra en la recta, tenemos:

0.95 = -0.062 + 0.95 x => x = 7.13

CK/0.6 = 7.13 => CK = 4.27 ppm

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2. TCNICAS ESPECTROSCPICAS ATMICAS En este apartado se revisan las tcnicas espectroscpicas para el anlisis de los elementos (tomos) que forman parte de la muestra, independientemente del compuesto del que forman parte. Por ello en todas las tcnicas que se describan a continuacin ser necesaria una previa atomizacin de la muestra. Se dividen en dos grupos en funcin del fenmeno que se determina, emisin o absorcin de luz.

2.1. Espectroscopia de absorcin atmica

En la absorcin atmica se mide la luz absorbida por un vapor gaseoso de tomos en estado fundamental al pasar al estado excitado. La luz que absorbe la muestra procede de una fuente de radiacin electromagntica (lmpara de ctodo hueco) y es proporcional a la concentracin.

Instrumentacin La lmpara emite la luz que llega a los tomos de la muestra. La muestra se introduce en forma lquida fuente de atomizacin mediante un nebulizador. Una vez all la llama las molculas se rompen y se forman tomos libres en estado fundamental (atomizacin). Estos tomos absorben parte de la luz que proviene de la lmpara. Mediante un monocromador se selecciona la longitud de onda que nos interesa (normalmente la ms adsorbida) y mediante un detector fotomtrico (clula fotoelctrica, tubo fotomultiplicador, etc,..) se determina la intensidad de luz (figura 13). El aparato compara la intensidad de luz que le llega en ausencia de muestra (Io) y con muestra (I))

Lmpara Atomizador Monocromador Detector

Figura 13. Esquema de un espectrofotmetro de absorcin atmica.

(http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/Atomic_spec/)

La lmpara de ctodo hueco est formada por el mismo elemento que se quiere analizar, de manera que al ser excitada emite las mismas longitudes de onda que absorber el analito. Con ello se consigue una gran sensibilidad. El problema es que no se puede hacer un anlisis multielemental simultneamente.

En la absorcin atmica es necesario transformar el analito que se presenta en la muestra en forma slida, lquida o en disolucin en tomos libres, gaseosos y en estado fundamental

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(atomizacin). Existen dos sistemas de atomizacin en las tcnicas de absorcin atmica: I) la llama y II) la electrotrmica.

I) Atomizadores de llama. La muestra introduce en la llama en forma de fina niebla formada por pequeas gotitas de disolucin mediante un nebulizador. La energa trmica que atomiza la muestra procede de la mezcla de un combustible (acetileno, gas natural o hidrogeno) y un oxidante (aire, oxgeno u xido de nitroso). Las llamas ms utilizadas son las de acetileno-aire (2400 oC) y la de acetileno-xido nitroso (2.800 oC).

II) Atomizadores electrotrmicos: el calentamiento se realiza por resistencias elctricas en vez de la llama, se obtiene con ello un importante aumento de la sensibilidad. El ms utilizado es el horno de grafito. La ventaja de los atomizadores electrotrmicos frente a los de llama es que los primeros permiten analizar directamente muestras slidas, mientras que los de llama solo utilizan muestras lquidas o soluciones. Otra ventaja de los atomizadores electrotrmicos es que se puede realizar un programa de temperaturas adecuado a cada tipo de muestra y analito que permite una mayor eficiencia en la atomizacin y por lo tanto una mayor sensibilidad. Los inconvenientes de este tipo de atomizadores, frente a los de llama, es que la repetibilidad suele ser peor y el tiempo de anlisis mucho mayor.

Aplicaciones Determinacin cuantitativa de tomos en muestras lquidas o soluciones preparadas a partir de muestras slidas de acuerdo con los mtodos descritos en el apartado anterior.

Ejemplo: en la determinacin del cadmio en un suelo contaminado se procede de la siguiente forma: un gramo de tierra se pulveriza y se ataca con cido ntrico concentrado. La solucin obtenida se diluye posteriormente a un volumen final de 100 mL. De esta solucin se toman 10 mL, se llevan a 50 mL con agua destilada en un matraz aforado y se hace la lectura de la absorbancia de esta solucin. Para la realizacin de la curva de calibrado se opera de la siguiente forma: 2.104 gramos de nitrato de cadmio exactamente pesados es levan a 1 litro con agua destilada. 10 mL de esta solucin se diluyen a 100 ml. De esta segunda solucin se toman los siguientes volmenes: 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL y 6 y se llevan a un volumen final de 50 mL. Se realizan las medidas de absorbancia (A) de estas soluciones, frente a un blanco de agua destilada obtenindose los resultados de la tabla 7. Tabla 7. Volumen de las soluciones patrn y absorbancia correspondiente.

mL 1 2 3 4 5 6 A 0.053 0.104 0.160 0.220 0.268 0.315

Calcular el % de cadmio en el suelo si la absorbancia de la solucin de la muestra es de 0.179. Primero determinaremos la curva de calibrado de este mtodo: - Concentracin de la primera solucin patrn 2.104g Cd(NO3)/1L x (1L/1000 mL)x (1000mg/1g) x (112.4 mg Cd/236.4 mg Cd(NO3)) = 1mg Cd /mL

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- 10 mL de esta solucin se llevan a 100mL, por tanto: (10 mL x (1mg Cd/mL)) / 100 mL = 0.1 mg/mL - De esta ltima solucin se toman 1, 2, 3, mL y se llevan a 50 mL, las concentraciones de estas soluciones son: (1 mL/(0.1mg Cd/mL)) / 50 mL x (1000mL /1L) = 2 ppm (2 mL/(0.1mg Cd/mL)) / 50 mL x (1000mL /1L) = 4 ppm (3 mL/(0.1mg Cd/mL)) / 50 mL x (1000mL /1L) = 6 ppm (4 mL/(0.1mg Cd/mL)) / 50 mL x (1000mL /1L) = 8 ppm (5 mL/(0.1mg Cd/mL)) / 50 mL x (1000mL /1L) = 10 ppm (6 mL/(0.1mg Cd/mL)) / 50 mL x (1000mL /1L) = 12 ppm - Determinamos la recta de regresin de absorbancias frente a concentraciones: Tabla 8. Concentraciones de las soluciones patrn y seales analticas correspondientes.

ppm Cd 2 4 6 8 10 12 A 0.053 0.104 0.160 0.220 0.268 0.315

A = 4.67x10-4 + 0.027 C - Ahora sustituimos la absorbancia de la disolucin de la muestra en la ecuacin de la recta y obtenemos:

0.179 = 4.67x10-4 + 0.027 C => C = 6.63 ppm Cd - Deshacemos las diluciones realizadas para determinar la concentracin en la muestra inicial: 6.63 ppm Cd = 6.63 mg Cd/ 1L solucin x (1 L/1000 mL) x (50 mL/10 ml) x (100 mL) x (1 g/ 1000 mg ) /1 g de suelo) 100 = 0.33%

2.2. Espectroscopia de emisin atmica En las tcnicas de espectroscopia de emisin atmica se determina la radiacin electromagntica (REM) caracterstica emitida por tomos libres o iones excitados trmica o elctricamente al volver a su estado fundamental. Si la REM emitida por los tomos se dispersa y se registra en una placa, pelcula fotogrfica o mediante un detector fotoelctrico, se obtiene un espectro de lneas caracterstico de cada elemento que nos permite identificarlo. Si se selecciona una lnea espectral (normalmente una radiacin de resonancia) y se mide su intensidad se obtiene informacin de tipo cuantitativo que nos permite determinar la concentracin del elemento. Instrumentacin En la figura 14 se muestra esquemticamente los principales componentes de un espectrofotmetro de emisin atmica. Fuentes de atomizacin-excitacin: la emisin atmica requiere un sistema que transforme el analito que se encuentra en la muestra en tomos libres gaseosos y que adems excite los tomos

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libres formados. Lossistemas de atomizacin-excitacin ms utilizados son: I) las llamas, II) las fuentes de plasma y III) descargas elctricas.

Muestra

Figura 14. Esquema bsico de un espectrofotmetro de emisin atmica. E: la fuente de atomizacin-excitacin, M: monocromador (selector de la longitud de onda, ) y D: detector. I) Fuentes de llamas: la atomizacin-excitacin se realiza en una llama donde la muestra entra en forma de finas gotas producidas en un nebulizador (figura 15a). La llama se produce por combustin de un combustible (acetileno, butano, propano, etc.) y un oxidante (oxigeno, aire N2O). Se alcanzan temperaturas de 2000-2800oC por lo que solo se pueden analizar elementos fcilmente excitables. Es una tcnica muy adecuada para el anlisis de los alcalinos y alcalino-trreos.

Campo magntico

Argn/muestra

Tubos de cuarzo

a) b)

Figura 15. Fuentes de atomizacin-excitacin en emisin atmica: a) Llama y b) Plasma acoplado por induccin (ICP). (http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/Atomic_spec/). II) Fuentes de plasma: un plasma es un gas caliente, altamente ionizado y macroscpicamente neutro. Los plasmas utilizados en emisin atmica estn formados por un choro de argn que forma cationes de argn y electrones. Las elevadas temperaturas del plasma (6000-10000oC) se alcanzan por el calor de resistencia generado por el movimiento de los iones de argn y los electrones que forman el plasma. Hay distintos sistemas de generar y mantener un plasma, pero lo ms comn es mediante un campo magntico creado por una bobina de induccin (figura 15b). Estas temperaturas tan elevadas permiten una mejor atomizacin de la muestra y estados excitados mucho ms poblados, lo que proporciona una mayor sensibilidad y que se puedan analizar prcticamente todos los elementos de la tabla peridica a concentraciones muy bajas y con gran rapidez. III) Atomizacin elctrica: la atomizacin se realiza mediante una descarga elctrica en un arco elctrico entre dos electrodos de grafito entre los que se encuentra la muestra. Se alcanzan

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temperaturas de 4000-5000oC, lo que permite analizar un mayor nmero de elementos que con la fotometra de llama. Se pueden analizar muestras lquida mediante un electrodo especial (figura 16b) o slidas (figura 16a).

Slidos

a)

Lquidos

b)

Figura 16. Fuentes de atomizacin elctrica a) muestra slida b) muestra lquida. (http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/Atomic_spec/). Aplicaciones Cualitativas El espectro de emisin de cada tomo presenta unas lneas caractersticas que permiten la identificacin del elemento (ver apartado 1). Las tcnicas ms apropiadas para la identificacin son las de plasma y las de atomizacin elctrica ya que proporcionan espectros atmicos con mayor nmero de lneas. Cuantitativas Las tres tcnicas permiten la determinacin cuantitativa los elementos presentes en una muestra mediante los mtodos descritos en el apartado 1. La fotometra de llama es la tcnica que trabaja a temperaturas ms bajas, por lo que solo se pueden determinar elementos con bajo potencial de ionizacin (alcalinos, alcalino-trreos y alguno trreos). La tcnica de plasma permite determinar ms de 70 elementos de la tabla peridica a niveles de concentracin muy bajos (ppb).

3. TECNICAS ESPECTROSCPICAS MOLECULARES

Las tcnicas que se describen en el presente apartado permiten el anlisis de molculas basndose en la medida de la absorcin o emisin de luz que se produce al interaccionar determinadas radiaciones electromagnticas con la muestra. En funcin del tipo de interaccin vamos a distinguir:

Absorcin de REM:

- Ultravioleta Visible (UV-Vis)

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- Infrarrojo (IR)

Emisin de REM

- Fluorescencia

3.1. Espectroscopia de absorcin ultravioleta-visible (UV-VIS)

La espectroscopia UV-VIS es una tcnica de anlisis de compuestos en la que se mide la luz absorbida por las molculas al promocionar el electrn de un estado basal (fundamental) a un estado electrnico excitado. La luz absorbida est dentro de la zona UV-VIS (180-800 nm). No todas los compuestos se pueden analizar por espectroscopia UV-VIS, ya que solo determinadas sustancias son capaces de absorber radiacin entre (180-800 nm). Para que una sustancia absorba en esta zona del espectro debe presentar grupos cromforos en su molcula. Un grupo cromforo es un conjunto de tomos que contienen una o varias insaturaciones (dobles o triples enlaces) que son responsables de las transiciones electrnicas cuya energa se corresponde a la regin ultravioleta y/o visible del espectro electromagntico.

Este tipo de espectroscopia sirve principalmente para el anlisis cuantitativo de compuestos aromticos, carboxlicos, poliinsaturados e iones complejos.

Instrumentacin

Fotmetro

Es el ms sencillo de los instrumentos de absorcin molecular UV-VIS es el fotmetro de filtro esquematizado en la figura 17. El fotmetro dispone de una fuente de emisin de luz visible (lmpara de wolframio). La longitud de onda que interesa se secciona mediante un filtro de absorcin o de interferencias. La radiacin seleccionada es absorbida parcialmente por la muestra que se encuentra en una cubeta. Despus la luz transmitida se detecta mediante un detector fotomtrico.

Fuente de REM

Filtro Muestra Detector Procesador de seal

Blanco

Figura 17. Esquema de un fotmetro donde se muestran las partes principales del equipo.

Antes de iniciar el anlisis de la muestra se debe calibrar el aparato a la longitud de onda seleccionada. Se coloca un blanco (en el lugar de la muestra) y se ajusta la absorbancia a cero. Posteriormente se realizan las lecturas de los patrones y finalmente la muestra. Con este aparato se debe hacer un calibrado cada vez que se cambia de longitud de onda de trabajo y cambiar el filtro utilizado, por ello no es posible realizar el espectro de absorcin (barrido) completo de una sustancia.

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Espectrofotometro Los instrumentos que utilizan selectores monocromticos reciben el nombre de espectrofotmetros (figura 18). El monocromador permite seleccionar cualquier longitud de onda dentro de un intervalo amplio de longitudes de onda y variar la longitud de onda seleccionada sucesivamente en el tiempo, lo que permite obtener el espectro de absorcin completo de una sustancia.

Lampara

Selector Espejo de sectores

Detector

Figura 18. Esquema de un espectrofotmetro de doble haz. http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical. Fuentes de radiacin: para la zona visible se utiliza lmpara de wolframio que emite radiaciones de longitudes comprendidas entre 300-900 nm. Para la zona UV se utilizan tubos de descarga de gases (deuterio, vapor de mercurio, etc.) gases que al ser excitados mediante una descarga elctrica emiten radiacin entre 160-400 nm. Los espectrofotmetros, normalmente, disponen de las dos lmparas y se pueden intercambiar automticamente en funcin de la longitud de onda a la que se pretende trabajar Detectores: tanto los fotmetros como los espectrofotmetros disponen de detectores fotoelctricos que transforman intensidad de REM en intensidad de corriente elctrica. Los ms utilizados son las clulas fotoelctricas, tubos fotomultiplicadores y los fotodiodos de silicio en lnea que permiten la deteccin simultnea de la intensidad de varias longitudes de onda. Aplicaciones Cuantitativas La determinacin de la concentracin del analito por absorcin ultravioleta o visible es uno de los mtodos cuantitativos ms utilizados. Una de las razones es que muchos compuestos inorgnicos y orgnicos tienen fuertes bandas de absorcin en esta zona del espectro electromagntico. Adems, en el caso que los analitos no absorban en esta zona, se pueden hacer reaccionar con un reactivo dando un producto absorbente. Por ejemplo el Fe3+ se puede hacer reaccionar con la fenatrolina dando un compuesto coloreado que absorbe a 520 nm. La aplicacin cuantitativa consiste en hacer una curva de calibrado con patrones tal como se ha explicado anteriormente apartado 1. Si el mtodo es muy preciso (muy repetitivo) y lineal en un amplio rango de longitudes de onda, no es necesario realizar la curva de calibrado cada vez que se analiza una muestra. Basta con analizar un solo patrn y la muestra.

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Cualitativas La espectrofotometria UV-VIS no es en si misma una tcnica de identificacin. Es decir con el espectro de absorcin UV-VIS completo de una sustancia es difcil llegar a identificarla. Sin embargo, la presencia de determinadas bandas de absorcin a determinadas longitudes de onda nos puede indicar la presencia de determinados grupos funcionales y nos pueden orientar sobre la posible identidad de la muestra (figura 19). El estudio del espectro completo del espectro de una sustancia tambin permite realizar un control de pureza, ya que debe ser siempre el mismo y no aparecer en l bandas extraas.

Figura 19. Espectros de absorcin UV-Visible de algunos compuestos orgnicos. 3.2. Espectroscopia de absorcin infrarroja

La radiacin infrarroja es de menor energa que la ultravioleta y que la visible y no es capaz de producir transiciones electrnicas en las molculas. Sin embargo, puede provocar cambios en los estados de vibracin de stas. La espectroscopia infrarroja es una tcnica en la que se mide la longitud de onda e intensidad de la absorcin de luz media infrarroja de una muestra. La longitud de onda de las bandas de absorcin infrarroja es caracterstica de determinados enlaces qumicos por ello la principal aplicacin de la espectroscopia infrarroja es la identificacin de molculas orgnicas y complejos rgano-metlicos. La alta selectividad del mtodo hace posible la estimacin de un analito en una matriz compleja. Este mtodo implica

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el anlisis de los movimientos de torsin, rotatorios y de vibracin de los tomos en una molcula.

La espectroscopia infrarroja es una tcnica empleada principalmente en la elucidacin de estructuras moleculares, aunque tambin se emplea con fines cuantitativos.

Instrumentacin Un espectrmetro infrarrojo consta de una fuente de emisin que emite luz infrarroja. Esta luz pasa travs de la muestra, la cul, en funcin de los grupos funcionales que presenta, absorbe determinadas longitudes de onda para hacer vibrar sus enlaces. Mediante un monocromador se va variando la longitud de onda selecciona y finalmente, mediante un detector se registra la intensidad de la luz despus de haber atravesado la muestra (figura 20). El registro produce un espectro con el trazado de la cantidad de luz transmitida en el eje vertical comparado con la longitud de onda de la radiacin infrarroja en el eje horizontal (figura 22). En el espectro infrarrojo los picos de absorcin se dirigen hacia abajo porque el eje vertical es la transmitanca porcentual de la radiacin a travs de la muestra. La absorcin de radiacin disminuye el valor de transmitancia porcentual. Debido a que los enlaces en una molcula orgnica interactan con radiacin infrarroja, el espectro IR brinda una considerable cantidad de datos estructurales. Los instrumentos para medir la absorcin infrarroja requieren una fuente de radiacin infrarroja continua y un transductor infrarrojo sensible, o detector.

Fuente de REM Monocromador Detector

Figura 20. Esquema de un espectrofotmetro IR (MP: muestra problema. R: rendijas, Det: detector, mp: amplificador, Reg. Registrador). Fuentes de radiacin: las fuentes infrarrojas consisten en un slido inerte el cual es elctricamente calentado a temperaturas entre 1500 y 2200 K. El material calentado emitir asr adiacin infrarroja. Emisor de Nernst: el emisor de Nernst est construido con xidos de tierras raras en forma de cilindro hueco. La fuente Globar: un globar es una varilla de carburo de silicona (5 mm de dimetro, 50 mm de largo) la cual es calentada elctricamente a 1500 K. El lser de dixido de carbono: el lser sintonizable de dixido de carbono es una fuente infrarroja para monitorear algunos contaminantes atmosfricos y para determinar las especies de absorcin en soluciones acuosas. Detectores: estos pueden clasificarse en tres categoras: trmicos, piroelctricos y fotoconductores.

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Detectores trmicos: los detectores trmicos pueden usarse con una variedad de longitudes de onda y funcionan a temperatura ambiente. Sus principales desventajas son tiempo de respuesta corto y sensibilidad ms baja comparada con otros tipos de detectores. Los ms utilizados son los Termopares y Bolmetro. Detectores piroelctricos: los detectores piroelctricos constan de un material piroelctrico el cual es aislante con propiedades trmicas y elctricas. El material ms comn para detectores piroelctricos es el trisulfato de glicina. Fotoconductores: los detectores fotoconductivos son los detectores ms sensibles. Se basan en las interacciones entre los fotones y el semiconductor. El detector consiste en una pelcula delgada de un material semiconductor como sulfuro de plomo, mercurio, telurio de cadmio o antimoniuro de indium depositado en una superficie de vidrio no conductiva y sellada para proteger al semiconductor de la atmsfera. Aplicaciones Cualitativa La absorcin de luz IR provoca vibraciones de los enlaces de una molcula. Cada enlace vibra a una frecuencia distinta. Por tanto es posible relacionar la presencia de ciertas bandas de absorcin IR con la presencia de determinados grupos funcionales en una molcula. Ejemplo:

3700 - 2500 cm-1: X-H tensin (X = C, N, O, S) 2300 - 2000 cm-1: C X tensin (X = C or N) 1900 - 1500 cm-1: C X tensin (X = C, N, O)

En la figura 21 se muestran algunos los grupos funcionales y las bandas de absorcin al IR correspondientes

Figura 21. Algunos grupos funcionales y sus bandas de absorcin al IR. (http://chipo.chem.uic.edu/web1/ocol/spec/IRTable.htm)

Ejemplo: un compuesto de frmula emprica C5H10O presenta el siguiente espectro de

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absorcin infrarrojo (figura 22). Intentar elucidar que sustancia se trata

1

2

Figura 22. Espectro de absorcin IR http://chipo.chem.uic.edu/web1/ocol/spec/IRTable.htm)

De acuerdo con la frmula emprica, se trata de un compuesto que tiene un solo tomo de oxgeno, por tanto puede ser un alcohol, aldehdo, cetona o ter. La interpretacin del espectro revela que: - La ausencia de una banda ancha a 3400 cm-1, (banda caracterstica de la vibracin del enlace O-H) indica que no se trata de un alcohol - La ausencia de bandas a aproximadamente 3090-3100 cm-1 indica que no hay insaturaciones - La banda 1, 2900 cm-1 corresponde a la vibracin del enlace C-H de grupos saturados (metil, metileno) - La banda 2, 1720 cm-1 es una banda intensa caracterstica del grupo carboxilo ( C=O) En base a las deducciones anteriores, la frmula propuesta: CH3-CH2-CO-CH2-CH3 (3-pentanona o dietilcetona) Ejemplo: en la figura 23 se muestra el espectro de absorcin IR de un compuesto orgnico de frmula emprica C7H8O. Trata de elucidar el compuesto.

Figura 23. Espectro de absorcin (http://chipo.chem.uic.edu/web1/ocol/spec/IRTable.htm) De acuerdo con la frmula emprica, se trata de un compuesto que tiene un solo tomo de oxgeno, por tanto puede ser un alcohol, aldehdo, cetona o ter. La interpretacin del espectro

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revela que: La banda 1, entre 3400-3200 cm-1, se trata de una banda ancha e intensa correspondiente a la vibracin del enlace OH. La banda 2 a 3100 cm-1, es una banda delgada y dbil que sugiere la vibracin del enlace C-H de una insaturacin ((C=C-H). La banda de 2900 cm-1, poco intensa, correspondiente a la vibracin C-H, de un grupo saturado (metileno o metilo). Las bandas entre 1450-1500 cm-1, de moderada intensidad, sugieren la presencia de dobles enlaces carbono carbono de un grupo aromtico. La estructura propuesta es la que se muestra en la figura 24:

Figura 24. Estructura del alcohol benclico (http://chipo.chem.uic.edu/web1/ocol/spec/IRTable.htm)

3.3. Fluorimetra

La fluorimetra es una tcnica espectroscpica de anlisis en la que se mide la radiacin emitida por molculas que han sido excitadas previamente mediante una radiacin electromagntica. Al incidir radiaciones electromagnticas de longitud de onda adecuada sobre algunas molculas orgnicas se puede producir una transicin desde el estado electrnico fundamental hasta un estado electrnico excitado. Los estados excitados son inestables; por tanto, existe en las molculas una tendencia a retornar al estado electrnico fundamental, emitiendo la energa que tienen en exceso en forma de REM de longitud de onda ms larga que la absorbida (dentro del visible).

Instrumentacin

Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la fluorescencia son similares a los que se encuentran en los fotmetros o espectrofotmetros ultravioleta/ visible. Se dispone de una fuente de radiacin electromagntica que excita la muestra, un monocromador que selecciona la longitud de onda que interesa. Existe un segundo monocromador que dispersa y selecciona la luz emitida por la muestra al volver al estado fundamental. Los espectrofluormetros disponen de dos detectores uno mide la luz absorbida y otro la luz emitida (figura 25).

Fuentes de REM: lmparas, lseres

Los factores primarios a considerar cuando se selecciona una fuente de radiacin para instrumentacin de fotoluminiscencia son la intensidad de la lmpara, la distribucin de longitudes de onda de la radiacin que la fuente emite y su estabilidad. De inters particular es la dependencia lineal de la seal luminiscente con la potencia de la radiacin de excitacin. En consecuencia, la sensibilidad aumenta con la potencia de la fuente. Los espectrofluormetros de barrido requieren fuentes de radiacin que emitan continuamente sobre un amplio intervalo espectral. Los fluormetros de filtro o espectrofluormetros que se

25

usan especficamente para mediciones analticas a longitudes de onda fijas pueden usar fuentes espectrales de lneas atmicas normalmente ms intensas.

Figura 25. Esquema de un fluormetro. http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical

Lmparas de arco de alta presin de xenn emite de los 300 a los 1300 nm. Varias lneas de emisin fuerte se encuentran entre 800 y 1100 nm.

Lmparas de vapor de mercurio de baja presin son ms frecuentemente utilizadas en los fluormetros de filtro. Las lneas de emisin discontinuas que salen de la lmpara de mercurio muestran una sensibilidad considerable para un material cuyo espectro de excitacin coincide con una lnea de emisin de mercurio, pero la sensibilidad es menor para un compuesto que sea ms fuertemente fluorescente, el cual se excita ms eficientemente con otra longitud de onda de excitacin que no se encuentra presente a la salida de la lmpara de mercurio.

Lser sintonizables de colorante que utilizan, como sistema de bombeo, un lser de nitrgeno pulsante o un lser de Nd: YAG. Las fuentes de lser ofrecen importantes ventajas en determinados casos: por ejemplo, (1) cuando las muestras son muy pequeas como en cromatografa con microcolumnas y en electroforesis capilar donde la cantidad de muestra es de l L o menor; (2) en los sensores de control remoto, como en la deteccin fluorimtrica de radicales hidroxilo en la atmsfera o de clorofila en seres vivos acuticos, donde la naturaleza colimada de los haces de lser es vital; o (3) cuando se requiere una radiacin de excitacin altamente monocromtica para minimizar los efectos de las interferencias fluorescentes.

Cubetas portamuestras: para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas cilndricas como rectangulares, fabricadas con vidrio o con slice.

Detectores

La seal de fluorescencia tpica es de baja intensidad, por ello, para su medida se necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos fotomultiplicadores son los detectores ms utilizados en instrumentos de fluorescencia sensibles. Tambin se han propuesto, para los espectrofluormetros, los detectores de diodos en serie y de transferencia de carga.

Aplicaciones

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Anlisis cuantitativo de especies qumicas fluorescentes. No todas las sustancias qumicas son fluorescentes. Existe una relacin entre estructura qumica y fluorescencia. Normalmente son fluorescentes las siguientes sustancias:

Molculas que contienen anillos aromticos (benceno, tolueno y derivados, fluoreno, bifenilos,..).

Algunos compuestos carbonlicos.

Compuestos orgnicos con dobles enlaces conjugados.

Compuestos orgnicos con heterociclos( piridina, furano, tiofeno, pirrol,..).

La intensidad de la radiacin fluorescente (F) es proporcional a la potencia de la radiacin incidente y a la concentracin de la disolucin. Si la potencia de la fuente se mantiene constante, tenemos:

F = KC (6)

dnde K es la constante y C es la concentracin de la muestra.

Por tanto existe una relacin lineal entre concentracin de la muestra y intensidad fluorescente lo que permite cuantificar la muestra mediante la elaboracin de una curva de calibrado con patrones (ver apartado 1)

Los mtodos de fluorescencia son de uno a tres rdenes de magnitud ms sensibles que los mtodos basados en absorcin (UV-Vis e IR) por tanto permite determinar concentraciones mucho ms bajas. 4. CROMATOGRAFIA

La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el cual los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye la fase estacionaria, de gran rea superficial, y la otra es un fluido (fase mvil) que pasa a travs o a lo largo de la fase estacionaria.

La muestra se introduce en la fase mvil y sus componentes se distribuyen entre la fase estacionaria y la mvil. Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases la columna en la que se encuentra la fase estacionaria, con lo que se produce la separacin. Si un componente est la mayor parte del tiempo en la fase mvil el producto se mueve rpidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho ms lenta (figura 26).

La fase estacionaria puede ser un slido o un lquido dispuesto sobre un slido, que acta como soporte, de gran rea superficial. La fase mvil es un fluido (puede ser gas, lquido o fluido supercrtico) que se usa como portador de la mezcla.

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Figura 26. Esquema del proceso de elucin cromatogrfica.

En funcin de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase mvil, los mtodos cromatogrficos se pueden clasificar en:

Tabla 9. Tipos de cromatrografia

Tipo Fase estacionaria Fase mvil Lquido-slido Slido inerte como gel de slice o almina Disolventes Intercambio inico Resina cambiadora Soluciones acuosas Lquido-lquido Lquido adsorbido en un soporte slido Lquido Gas-lquido Pelcula de lquido adsorbida sobre un

soporte slido Gas

La cromatografa lquida la podemos diferenciar en cuatro grupos:

Cromatografa de reparto: separa los solutos basndose en la solubilidad relativa en dos lquidos distintos. Cromatografa de adsorcin: se basa en la adsorcin superficial sobre la fase estacionaria. Cromatografa de exclusin: separa solutos segn el peso molecular. Cromatografa de intercambio inico: separa solutos segn la carga inica.

Cromatografa de reparto: la cromatografa de reparto o lquido-lquido, se basa en las solubilidad de los analitos en dos lquidos uno es la fase mvil y el otro la fase estacionaria (figura 27). Las sustancias ms solubles en la fase estacionaria avanzan ms lentamente por la columna, mientras que los ms solubles en la fase mvil lo hacen ms rpidamente eluyendo primero. Normalmente, el lquido que acta como fase mvil es un lquido polimrico de elevada viscosidad que esta adherido a un slido que acta de soporte inerte. En general los soportes se preparan con slice rgida o composiciones donde la slice es el elemento bsico. Estos slidos estn formados por partculas mecnicamente resistentes, porosas y uniformes.

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Fase mvil Fase estacionaria

Lquido 1 Lquido 2

Figura 27. Esquema donde se muestra la cromatografa de reparto.

Cromatografa de adsorcin: en la cromatografa de adsorcin o lquido-slido la fase estacionaria es un slido que interacta con los analitos de la mezcla que se pretende separar por fuerzas de van der Waals (figura 28). Las fases que ms se utilizan son la slice y la almina. Es adecuada para compuestos no polares con masas moleculares inferiores a 5000. En general la cromatografa Lquido-Slido es ms adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en soluciones acuosas. En este tipo de cromatografa tambin se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. Una caracterstica particular de este mtodo es su capacidad para diferenciar compuestos ismeros en mezclas.

Fase estacionariaFase mvil

Lquido Slido

Figura 28. Esquema donde se muestra la cromatografa de adsorcin.

Cromatografa de exclusin molecular o tamiz molecular: la cromatografa de exclusin, tambin llamada de filtracin en gel o cromatografa de permeacin en gel, se basa en la diferencia de penetracin de las molculas en los poros de la fase estacionaria en funcin del tamao de la molcula (figura 29). Este tipo de separacin por tamao difiere de las dems tcnicas de cromatografa en que no existen interacciones fsicas o qumicas entre el analito y la fase estacionaria. La fase fija est formada por partculas polimricas o de slice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las molculas de pequeo tamao. Las molculas de tamao grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeo tamao tienen acceso a todo los caminos del interior de las partculas de fase estacionaria y son las ltimas que se eluyen. Las molculas se eluyen por su tamao decreciente. En resumen los factores que determinan la separacin de las molculas son el tamao del poro, el tamao de la partcula y el flujo de elucin.

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Figura 29. Cromatografa de exclusin molecular (http://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimica-s3/cromatografia3.jpg).

Cromatografa de intercambio inico: la cromatografa de intercambio inico est basada en la atraccin entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria (figura 30). En el caso de intercambiadores aninicos, grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. Los intercambiadores catinicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto. Los intercambiadores inicos se clasifican en cidos o bsicos, fuertes o dbiles. Las resinas cidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy cidas, en cambio las resinas cidas dbiles se protonan a un pH prximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catinico. Los grupos muy bsicos de amonio cuaternario siguen siendo catinicos a cualquier valor de pH. Los bsicos dbiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente bsicas y pierden entonces su capacidad.

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Figura 30. Cromatografa de intercambio inico (http://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimica-s3/cromatografia3.jpg).

4.1. Cromatografa de gases

Es un tipo de cromatografia en el que la fase estacionaria es un lquido soportado sobre un slido inerte y la fase mvil es un gas.

La muestra es transportada por una corriente de gas a travs de una columna empacada con un slido o tal vez recubierta con una pelcula de un lquido. Debido a su simplicidad, sensibilidad y efectividad para separar los componentes de mezclas, la cromatografa de gas es una de las herramientas ms importantes en qumica. Es ampliamente usada para anlisis cuantitativos y cualitativos de mezclas de sustancias orgnicas voltiles y trmicamente estables.

Instrumentacin

En la figura 31 se muestra un esquema de un cromatografo de gases. Los componentes principales de este instrumento son:

Bombonas de gas portador Inyector Columna cromatogrfica Detector

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Figura 31. Esquema de un comatgrafo de gases. (http://www.shu.ac.uk/schools/sci/chem/tutorials/chrom/gaschrm.htm)

Columna: es el lugar donde se produce la separacin de los componentes de la muestra. Los materiales con los cuales generalmente se pueden elaborar las columnas son: cobre, aluminio, acero inoxidable, vidrio tefln.

El relleno puede ser un slido, un lquido recubriendo un slido. Podemos clasificar las columnas segn el propsito del proceso cromtografico:

Empacadas o Analtica o Preparativas Capilares o W.C.O.T. (Wall Coated Open Tubular) o S.C.O.T. (Support Coated Open Tubular)

Factores que afectan la eficiencia de una columna cromatrogrfica

Longitud de la Columna Dimetro de la Columna (1/4", 1/8", 1/16" de dimetro externo) Tamao de las partculas del relleno Naturaleza de las fases Cantidad de fase estacionaria Temperatura de la columna Velocidad del gas portador Cantidad de muestra inyectada Material del cual est elaborada la columna Enrollado de la columna

Fase estacionaria: la fase estacionaria suele ser un lquido polimrico de alta viscosidad y gran estabilidad trmica (polisiloxanos (apolares), polietilenglicoles (polares). Para realizar una buena separacin cromatogrfica es conveniente utilizar una fase estacionaria de polaridad similar a la de la mezcla que se pretende separar. Es decir, si la mezcla tiene carcter polar usaremos una columna polar y vice-versa.

Gas portador: el gas portador cumple bsicamente dos propsitos: transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector.

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Un gas portador debe reunir ciertas condiciones:

Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase estacionaria) Debe ser capaz de minimizar la difusin gaseosa Fcilmente disponible y puro Econmico Adecuado al detector a utilizar

Los ms utilizados son el nitrgeno, helio e hidrgeno

Detectores: un detector es un transductor que revela la presencia de las sustancias eludas a la salida de la columna cromatogrfica transformando alguna propiedad fsico-qumica de stas en una seal elctrica cuya magnitud es proporcional a la concentracin de la sustancia. En cromatografa un detector funciona comparando una propiedad fsica entre el gas portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna, esta accin se traduce en una seal tipo elctrica, que posteriormente se amplificar mediante un registrador grfico integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes.

Caractersticas de los detectores

Sensibilidad: medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una seal elctrica medible. Linealidad: rango de masa concentracin de muestra sobre el cual el detector mantiene una sensibilidad constante sin una desviacin arbitraria. El significado prctico de la linealidad del detector es el que le indica al analista la concentracin para la cual el detector es confiable. Hay dos lmites en la curva de linealidad: o El lmite de concentracin inferior, que es dado por el lmite de deteccin y, o El lmite superior, definido por un porcentaje de desviacin arbitrario de la curva de linealidad, normalmente se toma un 5% de desviscin. Rango dinmico lineal: rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante. Ruido: es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la seal. El significado de conocer el nivel de ruido de un detector es un factor determinante. en la determinacin de la cantidad mnima detectable y el lmite inferior del rango lineal. Lmite de deteccin: est definido como la mnima cantidad de sustancia que puede producir una seal que sea el doble del nivel de ruido. Corriente de fondo: seal constante de salida generada por el proceso en el que un detector est operativo sin que alguna sustancia pasa a travs de l. Esta seal es muy importante, ya que permite diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.

Detectores ms usados en cromatografa de gases

Detector de conductividad trmica (catarmetro). Mide variacin de la conductividad trmica del gas portador ocasionada por la presencia de substancias eludas. Es universal, es decir, permite detectar todo tipo de sustancias (orgnicas e inorgnicas), sin embargo, su sensibilidad es inferior a la del resto de detectores utilizados en CG Detector de ionizacin a la llama (FID). Basado en la medida de las variaciones de la corriente que provoca la presencia iones. Estos iones se producen a partir de las sustancias

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que eluyen a la salida de la columna al pasar por una llama de oxgeno-hidrgeno. Permite determinar todo tipo de sustancias orgnicas. Detector de captura electrnica. Basado en la electronegatividad de las substancias eludas, y su habilidad para formar iones negativos por captura de electrones. Se trata de un detector selectivo que solo permite detectar sustancias capaces de captar electrones, pero para estas sustancias es de una elevada sensibilidad (compuestos clorados, fluorados, quinonas) Detector de espectrometra de masas. Detector de fotometra a la llama. Basada en la medida de la intensidad de la emisin molecular de la fluorescencia de heterotomos en las molculas orgnicas. Detector de fotoionizacin. Detector de nitrogeno-fsforo.

En la tabla 10 se comparan algunas caractersticas de estos detectores

Tabla 10. Comparacin de algunos detectores de cromatografa de gases.

Detector Selectividad Lmite de Deteccin

Rango de linealidad

Ionizacin de llama (FID)

Compuestos orgnicos 100 pg 107

Conductividad trmica (TCD)

Universal 1 ng 107

Captura electrnica (ECD)

Haluros, nitratos, nitrilos, peroxidos, anhidridos, organometlicos, quinonas

50 fg 105

Nitrgeno-fsforo Compuestos con nitrgeno o fsforo 10 pg 106 Fotometria de llama (FPD)

sulfuros, fsforo, boro, arsnico, germanio, selenio, cromo 100 pg 103

Fotoionizacin (PID) Alifaticos, aromaticos, cetones, esteres, aldehidos, aminas, heterociclos, organosulfurados, algunos organometlicos

2 pg 107

Aplicaciones

L a cromatografa de gases permite separar mezclas e identificar y cuantificar los distintos componentes separados. A continuacin se explican los mtodos ms utilizados de identificacin y cuantificacin. Estos mtodos tambin son vlidos para la cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC) que veremos en el apartado siguiente y otros tipos de cromatografa.

Cromatograma: identificacin y cuantificacin

Despus del proceso cromatogrfico y si ste ha sido correcto cada sustancia presente inicialmente en la muestra sale en forma de pico cromatogrfico separada del resto de sustancias, es decir del resto de picos (figura 32).

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TR1

Figura 32. Separacin de cationes mono y divalentes por HPLC con columna de intercambio inico. TR es el tiempo de retencin.

El tiempo al que sale cada pico cromatogrfico permite identificar la sustancia, mientras que el rea de cada pico es proporcional a la concentracin de sustancia.

Cualitativa

Los procedimientos para identificacin de los picos cromatogrficos podemos dividirlos en dos categoras:

a) Por tiempo de retencin (TR).

Se compara el tiempo de retencin (tiempo transcurrido entre la inyeccin de la muestra y el mximo del pico) del pico de la muestra problema con el de un patrn inyectado en las mismas condiciones (figura 32).

b) Por tiempos de retencin relativo (TRRX) a un patrn interno segn:

Donde, TRX = tiempo de retencin del analito (X) y TRPI = tiempo de retencin del patrn interno

c) Por ndices de Retencin de Kovats

Los tiempos de retencin pueden variar en funcin de la columna cromatogrfica utilizada, condiciones cromatogrficas, etc. Por ello es prcticamente imposible identificar un compuesto por comparacin con tiempos de retencin descritos en la bibliografa. Sin embargo, existen unos ndices muy reproducibles que permiten identificar compuestos en base a su tiempo de retencin respecto del tiempo de retencin de una serie homloga de compuestos obtenidos en las mismas condiciones. Como sustancias de referencia se suelen utilizar una serie homloga de olefinas debido a su gran estabilidad, fcil disponibilidad. Se

TRRX = TRX/TRPI (6)

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compara el tiempo de retencin del analito con el de los dos n-alcanos que eluyen ms cerca de l (de que eluye antes y el que eluye despus).

El ndice de Kovats para un compuesto xse calcula con la siguiente frmula:

IK = 100n1 + 100 [(LogTRx -logTRn1)/(logTRn2 - logTRn1) (7)

Donde n1 es el alcano que eluye antes del compuesto x y n2 el que eluye despus.

El valor del ndice de Kovats de un compuesto solo depende de la fase estacionaria utilizada y no de las condiciones cromatogfica

d) Por espectrometra de masas

El acoplamiento de un cromatgrafo de gases a un especrometro de masas permite la identificacin de los compuestos (ver apartado 1.6.)

Anlisis cualitativo

a) Normalizacin de rea

Este sistema de cuantificacin presupone que el detector presenta la misma respuesta (sensibilidad) para todos los componentes de la muestra. Esta suposicin nunca es cierta del todo pero se mantiene dentro de un error aceptable cuando se trata de compuestos de volatilidad y estructura similar. El clculo de la concentracin de un compuesto X es:

b) Normalizacin de rea con Factores de Respuesta

Este sistema es como el anterior pero tiene en cuenta el factor de respuesta (FR, ver apartado d) de cada compuesto

Ejemplo: se quiere determinar por el mtodo de normalizacin interna la composicin msica de un residuo constituido por cuatro steres del cido butanoico. Una disolucin patrn de estos cuatro steres (concentraciones conocidas) nos proporciona los siguientes valores de respuesta relativos: 0.919, 0.913 y 1.06 para los butanoatos de metilo (BM), etilo (BE) y propilo (BP) respecto del butanoato de butilo (BB), respectivamente. A partir de los datos obtenidos de un cromatograma de muestra, determinar la composicin de sta (Tabla11).

% BM = (2340.1 x 0.919)/(2340.1 x 0.919) + (2359.0 x 0.913) + (4077.3 x 1.06) + (4320.7 x 1) x 100 = 16,6%

Operando de la misma forma, % BE = 16,6%, %BP = 33.4% y %BB = 33.4%

% X = (rea del pico X/suma rea todos los picos)x100 (8)

% X = (rea del pico X x FRx/areai x FRi)x100 (9)

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Tabla 11. Tiempos de retencin (TR) y reas de los analitos.

Numero de pico Tiempo e retencin rea de los analitos 1 (BM) 2.54 2340.1 2 (BE) 3.47 2359.0 3 (BP) 5.57 4077.3 4 (BB) 7.34 4320.7

c) Estandarizacin Externa

Se inyecta una solucin de patrones de concentracin conocida y se determinan las reas. Se compara el rea del analito (X) con el rea del patrn de X , (P) segn:

Ejemplo: se investiga la presencia de triclorobenceno en una muestra por cromatografa de gases. Se prepara una solucin patrn de 10 mg de triclorobenceno en 100 mL de diclorometano. Se inyectan 5 L de de patrn y 5L de muestra. Los resultados son:

rea del patrn = 2000 unidades

rea de la muestra = 3830 unidades

[Triclorobenceno] = (3830/2000) x 100 mg/lL = 192.5 mg/L

d) Mtodo del patrn interno

Es el mtodo que proporciona mejores resultados. Se trata de aadir una sustancia (patrn interno) a una concentracin constante en todos los patrones y en las muestras antes del anlisis.

El patrn interno es una sustancia que debe reunir las siguientes condiciones:

- no debe estar originalmente en la muestra

- tener unas caractersticas fsico-qumicas similares al analito (volatilidad, estructura, etc)

- ha de tener un pico cromatogrfico bien resuelto que no interfiera con los picos de los anlitos de la muestra

El clculo de la concentracin se realiza:

Donde FRX es el factor de respuesta relativo de X respecto del patrn interno. El factor de respuesta de un compuesto X respecto del patrn interno se calcula inyectando en el cromatgrafo una solucin de concentracin conocida del analito y del patrn interno y aplicando la frmula:

[X] = (rea X/rea P)[P] (10)

[X] = (Area X/Area PI) x [PI] x FRX (11)

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Ejemplo: se analizan algunos compuestos orgnicos voltiles (COV) en agua residual de una industria por cromatografa gaseosa. Se utilitza 2-metil-5-pentanol como patrn interno, que en les condiciones cromatogrficas utilizadas tiene un tiempos de retencin de 39 0.8. Para identificar los compuestos se inyectan patrones de cada uno de los analitos por separado y se determinan los tiempos de retencin relativos al patrn interno que son los que figuran a la tabla 12. Tambin se han determinado los factores de respuesta relativos al patrn interno.

Tabla 12. Tiempos de retencin relativos (TRR) y factores de respuesta (FRR) de los analitos.

Compuesto TRR FRR Isobutanol 28 0.5 0.99 1-propanol 22.5 0.6 1.07 Acetato de propilo 11 0.8 1.47 Acetato de etilo 15.5 0.6 1.35 Alcohol isoamlico 49 0.4 1.15 Metanol 13.5 0.7 1.08 Acetaldehido 4.5 0.2 1.18 A 5 mL de agua residual, exactamente medidos, se aaden 50L de solucin de patrn interno de concentracin 5g/L. Se inyectan 10 L de la muestra y se obtiene el cromatograma adjunto (figura 33). Calculen la concentracin de cada sustancia en el agua problema.

Primero debemos identificar el pico correspondiente a cada una de las sustancias analizadas y del patrn interno, posteriormente miramos las reas correspondiente a los picos y hacemos los clculos correspondientes (Lo haremos con un solo compuesto, los otros se determinan de la misma forma.

Por ejemplo, el pico de tiempo de retencin 22.99 corresponde al propanol (22.5 0.6) y el pico 39.52 al patrn interno. Las reas de estos picos son respectivamente 440360 y 1053600. As pues:

[1-propanol] = (reapropanol/rea P.I.) x [PI] x FRRpropanol

Debemos determinar la concentracin del patrn interno en la muestra:

(50L(5g/1L)) /5 mL = 50g/mL = 50 ppm

[1-propanol] = (440360/1053600) x 50 x 1.07 = 22.36 ppm

FRX = ([X]/areaX)/([PI]/areaPI) (12)

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Figura 33. Cromatograma correspondiente a la muestra de agua que se utiliza como problema.

4.2. Cromatografia lquida de alta eficacia (HPLC)

La HPLC es una tcnica cromatogrfica de reparto o adsorcin en la que la muestra se distribuye entre una fase mvil que es lquida y una fase estacionaria (slido o lquido viscoso dispuesto sobre un slido inerte). Utiliza una presin muy elevada para forzar el paso del disolvente por una columna que contiene partculas muy pequeas y de elevada superficie especfica, consiguiendo as separaciones de gran resolucin. Debido a estas presiones el equipo para HPLC es robusto y costoso.

Instrumentacin

Los componentes bsicos de un equipo para HPLC (figura 34) son:

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Depsitos para la fase mvil (disolventes) Bomba para proporcionar presin a la fase mvil Inyector Columna cromatogrfica Detectores

Bomba

Detector

Depsitos de fase mvil

Vlvula mezcladora

Registrador

Figura 34. Componentes bsicos de un sistema para HPLC (Casas et al., 1994).

Fases mviles Los disolventes ms usados en HPLC son agua, disoluciones tampn acuosas y disolventes orgnicos como el metanol y acetonitrilo. Deben ser espectroscpicamente puros, exentos de partculas slidas y desgasificados, esto se lleva a cabo con un gas inerte muy poco soluble como el helio. Los disolventes se mezclan en las proporciones adecuadas con una vlvula mezcladora. Se puede realizar todo el proceso de elusin con lamisca mezcla (elucin isocrtica) o cambiar la composicin de sta (elucin con gradiente)

Sistema de bombeo: debido al pequeo tamao de las partculas de la fase estacionaria que se encuentra en la columna cromatogrfica existe una gran resistencia al paso de la fase mvil a travs de sta, por ello es necesario el uso de una bomba que permita introducir la fase mvil o disolvente a travs de la columna.

Las bombas empleadas en HPLC son de tres tipos:

Bombas recprocas o de vaivn: son las ms utilizadas. Estn formadas por una pequea cmara cilndrica que se llena y luego se vaca por oscilacin de un pistn de zafiro. El bombeo produce un flujo pulsado que despus debe amortiguarse. Sus principales ventajas son que se consiguen presiones elevadas y se suministra un caudal constante, pudindose adaptar a la tcnica de elucin con gradiente, debido a su pequeo volumen interno. Bombas neumticas o de presin constante: hacen uso de la presin de un gas aplicado al recipiente conteniendo la fase mvil. Son sencillas, no provocan pulsaciones pero estn limitadas a presiones relativamente bajas.

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Bombas de desplazamiento o tipo jeringa: consisten en una cmara equipada con un mecanismo de tornillo. Suministran un flujo libre de pulsaciones pero con una capacidad limitada a unos 250 ml. Inyector: dispositivo con el que se realiza la inyeccin del soluto. El mtodo ms simple es la utilizacin de una jeringa de alta presin con un diafragma (septum) a la entrada de la columna. Est limitado a una presin mxima de operacin de 1500 psi. Las vlvulas de inyeccin con bucles de volumen conocido, es el mtodo ms utilizado Columna: es un cilindro de acero de 15-30 cm de longitud y luz interior 1-7 mm relleno de un slido de tamao de partcula muy pequea (< de 50 ), sobre el que esta dispuesto la fase estacionaria (liquido viscoso, resina de intercambio inico, tamiz molecular, etc.). La columna puede encontrarse en un horno que permite trabajar a distintas temperaturas Detector: el papel del detector es indicar los momentos en los que eluyen los compuestos por el extremo de la columna y proporcionar indicacin cuantitativa y cualitativa de la presencia de los mismos. El detector utilizado depende de la naturaleza de la muestra y deber reunir una serie de caractersticas como son, tener una sensibilidad elevada, buena estabilidad y reproducibilidad. Amplio margen de respuesta lineal, insensible a cambios en la presin y la temperatura. - Los detectores basados en una propiedad del soluto que no la suele presentar la fase mvil. Suelen ser muy selectivos y sensibles:

Detectores de absorbancia ultravioleta, son los ms utilizados. Su fundamento es la espectrofotometra de absorcin de luz visible y ultravioleta de un componente a una determinada longitud de onda (ver apartado 1.5.1). Los ms potentes son los que utilizan un montaje de fotodiodos para registrar el espectro completo de cada soluto que pasa por el detector. Los datos de absorbancia se representan en funcin de la longitud de onda y del tiempo.

Detectores de fluorescencia, son muy sensibles y selectivos, el principio de operacin se basa en la irradiacin con la luz UV al componente de inters y la posterior medida de la luz fluorescente emitida por ste (Apartado 1.5.3)

Detectores electroqumicos, ofrece ventajas debido a su especificidad, sensibilidad y amplia aplicabilidad, especialmente para compuestos orgnicos. Responde a analitos que puedan oxidarse o reducirse. Es el ejemplo de fenoles, aminas, perxidos (pueden detectarse por oxidacin) y cetonas, aldehdos (detectados por reduccin). Las tcnicas electroqumicas ms utilizadas con esta finalidad son la amperometra, voltamperometra y culombimetra (ver apartado 3).

- Los detectores basados en una propiedad de la disolucin, responden a un conjunto amplio de solutos, pero suelen ser poco sensibles :

Detectores de ndice de refraccin, est formado por una celda con dos compartimentos, en

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uno se introduce el disolvente puro y en el otro la muestra, se hace pasar luz visible paralela. Cuando entra en la celda soluto de distinto ndice de refraccin al disolvente el has se desva y vara la seal dada por la fotoclula (Harris, 2001). El principal inconveniente es que son muy sensibles a los cambios de temperatura y no resultan apropiados para trabajar con la modalidad de elusin con gradiente.

Detectores de conductividad, son los ms utilizados cuando los solutos eluidos son inicos, como cidos y bases, as como cationes y aniones inorgnicos despus de su separacin por cromatografa de cambio inico. Tienen elevada sensibilidad, baratos y de larga duracin.

Aplicaciones La cromatografa lquida de alta eficacia permite separar, identificar y cuantificar mezclas de sustancias termolbiles y/o poco voltiles (pesticidas, fenoles, iones, etc.) que por tanto no se pueden analizar de forma directa por cromatografa de gases. Sin embargo, la cromatografa lquida de alta eficacia es una tcnica menos sensible que la cromatografa de gases, debido a que los detectores usados en HPLC no son tan sensibles como los de cromatografa gaseosa. Los sistemas de identificacin y cuantificacin son los mismos que los utilizados en la cromatografa gaseosa (ver apartado 2.2) 5. METODOS ELECTROQUIMICOS DE ANALISIS

Los mtodos electroqumicos son un conjunto de tcnicas en las que la seal analtica que se mide es un potencial elctrico, una corriente eclctica o la carga en una celda electroqumica. Dentro de estos mtodos se pueden distinguir los que se explican a continuacin.

5.1. Mtodos potenciomricos

En la potenciometra se mide el potencial de una celda galvnica en condiciones estticas en la que uno de los electrodos es sensible a la actividad del analito. Se trata de un mtodo cuantitativo. Las mediciones potenciomtricas se llevan a cabo con un potencimetro para determinar la diferencia de potencial entre el electrodo indicador (sensible al analito) y un electrodo de referencia (de potencial constante y que no sufra cambios entre mediciones). Debido a la estabilidad del electrodo de referencia, cualquier cambio en el potencial del sistema se deber a la contribucin del otro electrodo, llamado electrodo indicador o de trabajo. El potencial es directamente proporcional a la actividad del analito (actividad = x concentracin, siendo el coeficiente de actividad) del analito de acuerdo con la ecuacin de Nernst (Skoog et al., 2005).

E=Eo-(0.059/n) logQ (13)

donde Q es el cociente de la reaccin, n el nmero de electrones intercambiables en la reaccin y Eo potencial estandar.

Potencimetro

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El potencimetro, en su forma ms simple, es una celda galvnica constituida por semiceldas cada una de ellas con un electrodo sumergido en una disolucin de iones, una de ellas es la disolucin del analito (electrodo indicador). Las semiceldas estn unidas por un puente salino (figura 35). El potencial medido viene dado por la siguiente ecuacin:

E = (Eindicador - Ereferencia) + Eunin lquida (14)

Figura 35. Celda galvnica (Harvey, D, 2002. Qumica Analtica Moderna).

Electrodos de referencia

Son aquellos que miden el mismo potencial cualquiera que sea la naturaleza de la disolucin en que se introduzcan y por tanto dan una referencia a la medida del electrodo indicador. Los electrodos de referencia ms usados son:

-Calomelanos: es un electrodo de mercurio sumergido en una disolucin saturada de cloruro mercurioso (Hg2Cl2), llamada tambin sal de calomelanos y de KCl de concentracin conocida (a saturacin). La semireaccin te tiene lugar es:

Hg2Cl2(s)+ 2e- 2Hg0(l) + 2Cl-(aq) (15)

- Electrodo de plata/cloruro de plata: consiste en un electrodo de plata recubierto de cloruro de plata (AgCl) sumergido en una disolucin de cloruro de potasio (3,5M o a saturacin) saturada de AgCl. Semirreaccin de reduccin:

Ag+(aq) + 1e- Ago(s) (16)

- Electrodo normal de hidrogeno (ENH) Consiste en un electrodo de negro de platino sumergido en una solucin 1M de H+, por el que se burbujea H2 a 1 atm. Por convenio el potencial de este electrodo a 25C es cero. La reaccin redox implicada es:

2H+ + 2e- H2 (g) (17)

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Electrodos indicadores: un electrodo indicador es aquel que responde de forma rpida y reproducible a los cambios de concentracin del analito. Los electrodos indicadores pueden ser metlicos o de membrana. A continuacin se describen los ms usuales:

a) Electrodos metlicos

1. Electrodos de primera especie: disponen de un electrodo metlico sumergido en la disolucin de su catin. El potencial depende de la actividad del catin segn la ecuacin de Nernst. La reaccin que se produce es:

Xn+(aq) + ne- = Xo(s) (18)

2. Electrodos de segunda especie: los metales no slo sirven como electrodos indicadores para sus propios cationes, tambin responden a la concentracin de aniones que forman precipitados poco solubles o complejos estables con esos cationes. El potencial depende de la concentracin del anin implicado en la sal insoluble o complejos formados. Ejemplos de este tipo de electrodos son los electrodos de referencia de calomelanos y el de AgCl/Ag+ (Skoog et al., 2005). En este ltimo caso, el potencial de un electrodo de plata se relaciona de modo reproducible con la actividad de iones cloruro en una disolucin saturada de cloruro de plata. Aqu la reaccin del electrodo puede escribirse de la manera siguiente:

AgCl(s) + e- = Ag (s) + Cl (ac) (19)

La expresin de Nernst para este proceso a 25oC es:

Eind = EoAgCl/Ag 0.0592 log aCl- (13)

3. Electrodos de tercera especie: en este tipo de electrodos, el catin que deriva del electrodo y otro catin forman una sal insoluble o complejo. El potencial de este electrodo depende del segundo catin. Ej. electrodo de mercurio para la determinacin de la concentracin de calcio en presencia de EDTA. (Harvey, 2002).

4. Indicadores metlicos redox: se denomina as a las celdas que consisten en un electrodo metlico inerte (platino, oro, paladio, ...) que no participa en la reaccin redox, slo intercambia electrones. El electrodo est sumergido en una disolucin que contiene el par redox que sufre la reaccin. Ejemplos: electrodo Ce(IV)/Ce(III), electrodo de quinhidrona (quinona/hidroquinona). (Skoog et al., 2005).

b) Electrodos de membrana: el elemento sensible del electrodo es una membrana semipermeable. A ambos lados de la membrana se desarrolla una diferencia de potencial debido a la asimetra que presentan en la actividad del in, a la que la membrana semipermeable es sensible. Dicha diferencia de potencial se evala por medio de 2 electrodos de referencia, uno situado en el interior de la membrana y otro en el electrolito externo. Conociendo la actividad del in en la disolucin interna, a partir de la diferencia de potencial puede calcularse la actividad del in en el medio externo. La ddp (diferencia de potencial) se debe a que la membrana o bien alguna especie embebida en su matriz, interactan

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selectivamente con los iones del analito. Dentro de las celdas sensibles a iones se distinguen varios tipos segn la naturaleza de la membrana:

1. Electrodos de membrana cristalina: la membrana consiste en un cristal nico (Ej. La F3 para el anlisis del in fluoruro) o en una membrana policristalina (Ej. Ag2S para el anlisis de S2- y Ag+). (Skoog et al., 2005).

2. Electrodos de membrana no cristalina.

a) Vidrio: ejemplo el electrodo de vidrio para determinacin del pH y electrodos de silicato selectivos para otros cationes. Se han diseado electrodos de vidrio que permiten la medida potenciomtrica directa de K+, Na+, Rb+, Li+, NH4+, Cs+, Ag+. (Skoog et al., 2005).

b) Membrana lquida: consiste en una membrana lquida inmiscible con las soluciones con que contacta. Existen electrodos de membrana lquida para la determinacin directa de calcio, magnesio, nitratos, perclorato, potasio,..). (Skoog et al., 2005).

Aplicaciones

a) Medidas potenciomtricas directas

Permiten una determinacin rpida de la concentracin de gran nmero de cationes y de aniones. Tambin se pueden adaptar fcilmente al control continuo y automatizado de diferentes procesos.

El protocolo de una determinacin directa sigue el esquema bsico de toda tcnica analtica instrumental: se preparan una serie de soluciones de concentracin conocida del analito y la solucin de la muestra (ver curva de calibrado, figura 9). Se mide la diferencia de potencial de cada una y se traza la curva de calibrado de sta frente al logaritmo de la concentracin.

Se pueden determinar de forma rpida y a niveles de algunas dcimas de ppm diversos iones como: nitratos, fluoruros, bromuros, calcio, cloruros, cianuros en suelos, residuos, aguas, sedimentos, etc.

b) Titulaciones potenciomtricas

Se determina el potencial del electrodo indicador en funcin del volumen de agente valorante aadido. La determinacin del punto de equivalencia se realiza representando la grfica potencial versus volumen de reactivo aadido. Se obtiene una curva con forma sigmoidal cuyo punto de inflexin que se estima visualmente, coincide con el punto de equivalencia (figura 36). Este punto se observa ms claramente si se representa la primera derivada, es decir, E/V frente al volumen aadido. Se obtiene una curva cuyo valor mximo coincide con el punto de equivalencia. Tambin se puede representar la segunda derivada.

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a) b) c)

Figura 36. a) Curva de valoracin potenciomtrica, b) primera derivada, c) segunda derivada (Skoog et al., 2005).

5.2. Mtodos electrolticos

A diferencia de la potenciometra que opera a corriente nula, otros mtodos electroanalticos requieren una fuente de tensin externa. Se engloban dentro de los mtodos electroqumicos, en los que las reacciones que se producen no son espontneas y por ello se debe aplicar una energa extra (potencial intensidad) para que tenga lugar el proceso redox. De este modo se pueden analizar todo tipo de iones o compuestos orgnicos que puedan ser electro-qumicamente reducidos u oxidados (Skoog et al., 2005).

Entre los mtodos electrolticos podemos distinguir:

Tcnicas voltamperomtricas: al sistema se le aplica un potencial extra conocido y la seal analtica es la intensidad resultante (Harris 2001).

Tcnicas galvanostticas: se aplica al sistema una intensidad determinada, y se mide el potencial (Harris, 2001).

Tcnicas voltamperometricas

Consisten en aplicar una diferencia de potencial variable entre un electrodo de referencia (Ag/AgCl, KCl (3M)) y un electrodo indicador (electrodo de trabajo), en contacto con el cual se va a producir una reaccin del tipo:

Oxidante + ne- Reductor

En la prctica, y con el fin de que ninguna corriente transite por el electrodo de referencia, se utiliza un tercer electrodo (electrodo auxiliar de Pt Carbono Vitrificado) (figura 37). Se obtiene una curva intensidad-potencial, I = f(E), o voltamperograma. La curva resultante permite a la vez identificar la especie qumica y su concentracin.

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Electrodo auxiliar

Gas inerte (N2)

Electrodo de trabajo (gotas de mercurio)

Electrodo de referencia

Muestra

Figura 37. Esquema de una clula voltamperomtrica (http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/Voltammetry/).

Las distintas tcnicas voltamperomtricas que se utilizan, se caracterizan por la forma de aplicar el potencial al electrodo de trabajo y por el material usado en su construccin.

a) Voltamperometra de barrido lineal

Esta tcnica consiste en aplicar un barrido lineal de potencial a velocidades bajas < 10 mV/s a un electrodo de gotas de mercurio, obtenindose un polarograma caracterstico del sistema analizado. La representacin de i frente al voltaje tiene forma sigmoidal llamada onda polarogrfica. Son caractersticas de ella:

Intensidad lmite (Id): que es la intensidad que se alcanza al final de la curva polarogrfica, cuando la velocidad de transporte del reactivo hasta la superficie del electrodo (transporte de masas) alcanza su valor lmite mximo. Al ser directamente proporcional a la concentracin del reactivo, la Id tiene gran valor cuantitativo.

Potencial de semionda (E1/2): se define como el potencial al cual la intensidad de corriente es la mitad de la intensidad lmite. Este potencial de semionda tiene valor cualitativo porque depende de la naturaleza de la especie que sufre la reaccin redox.

Figura 38. Voltamperograma de barrido lineal (http://www.terra.es/personal/acarva/dc_.htm).

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Tipos de voltamperiometra de barrido lineal

Para alcanzar rpidamente intensidades lmites reproducibles, es necesario que la disolucin o el microelectrodo estn en movimiento continuo reproducible. Se originan as dos tipos de voltamperometras ((I) voltamperometra hidrodinmica y (II) polarografa).

I) Voltamperometra hidrodinmica

El reactivo se transporta a la superficie del electrodo por conveccin (agitacin) y difusin (debida al gradiente de analito entre la capa de lquido en contacto con la superficie del electrodo y el seno de la disolucin) (figura 39).

Figura 39. Barrido lineal de potenciales http://www.terra.es/personal/acarva/dc_.htm).

II) Polarografa

La polarografa utiliza un electrodo de gotas de mercurio como electrodo de trabajo. No hay agitacin, por lo que el mecanismo responsable del transporte de masas al electrodo es la difusin. Las intensidades lmite se suelen denominar intensidades de difusin Id

b) Voltamperometra de impulso diferencial

Se aplican seales de excitacin en impulsos (Ej. impulsos de 50 mV durante los ltimos 50 milisegundos de la vida de la gota de mercurio), realizando dos medidas de intensidad: una, se efecta antes del impulso, y otra, despus del impulso. La diferencia de intensidad por impulso (i) se registra en funcin del potencial que aumenta linealmen