TBT4170 BioteknologiEksamensnotater

Ove Øyåsoyas@stud.ntnu.no

Sist endret: 5. juni 2011

1

Innhold1 Hva er bioteknologi? 7

2 Livets tre: Hva kom først? 7

3 Prokaryoter, eukaryoter og virus 83.1 Prokaryoter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

3.1.1 Gram-positivitet og -negativitet . . . . . . . . . . . . . . . . 83.1.2 Cellestruktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103.1.3 Organisering av arvestoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113.1.4 Bakteriell vekst . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.2 Eukaryoter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123.2.1 Cellestruktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123.2.2 Organisering av arvestoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133.2.3 Dyre- og planteceller . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.3 Virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153.3.1 Struktur og arvestoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153.3.2 Livssyklus hos bakteriofager . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

4 Sentrale molekyler 164.1 Karbohydrater . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4.1.1 Monosakkarider . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164.1.2 Polysakkarider . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

4.2 Lipider . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184.2.1 Fett, oljer, voks og steroider . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184.2.2 Fosfolipider . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

4.3 Proteiner . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194.3.1 Aminosyrer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204.3.2 Peptidbindinger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214.3.3 Peptider, polypeptider og proteiner . . . . . . . . . . . . . . 224.3.4 Strukturelle organisasjonsnivåer i proteiner . . . . . . . . . . 22

4.4 Nukleinsyrer: DNA og RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 224.4.1 Primær struktur: Nukleotider . . . . . . . . . . . . . . . . . 244.4.2 Sekundær struktur: Komplementær baseparing . . . . . . . . 254.4.3 Tertiær struktur: Dobbel heliks . . . . . . . . . . . . . . . . 254.4.4 Supercoiling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

5 Molekylærbiologiens sentrale dogme 26

2

6 Replikasjon 276.1 Replikasjonsprosessen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

6.1.1 Initiering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286.1.2 Elongering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286.1.3 Terminering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

7 Den genetiske koden 317.1 Standard genetisk kode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

7.1.1 Viktige egenskaper ved den genetiske koden . . . . . . . . . 317.1.2 Avvik fra standard genetisk kode . . . . . . . . . . . . . . . 31

7.2 Gener . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

8 Transkripsjon 338.1 RNA polymerase og sigmafaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338.2 Promotorer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 348.3 Transkripsjonsprosessen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

8.3.1 Binding og initiering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358.3.2 Promotorklarering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358.3.3 Elongering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358.3.4 Terminering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 368.3.5 Prosessering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

9 Translasjon 389.1 Ribosomer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 399.2 tRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 409.3 Translasjonsprosessen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

9.3.1 Initiering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429.3.2 Elongering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429.3.3 Terminering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

9.4 Posttranslatorisk modifikasjon og denaturering . . . . . . . . . . . . 44

10 Genregulering 4510.1 Cellulær differensiering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4510.2 Regulering av transkripsjon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

10.2.1 Negativ regulering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4510.2.2 Positiv regulering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4610.2.3 Operon og polycistronisk mRNA . . . . . . . . . . . . . . . 47

10.3 Regulering av laktosemetabolisme i E. coli . . . . . . . . . . . . . . 4710.3.1 Negativ regulering av lac-operonet . . . . . . . . . . . . . . 4710.3.2 Positiv regulering av lac-operonet . . . . . . . . . . . . . . . 4810.3.3 En kombinasjon av effekter styrer uttrykkingen av lac-operonet 48

3

10.4 Regulering av translasjon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4910.4.1 Regulering ved ribosomproduksjon i bakterier . . . . . . . . 49

10.5 Regulering på enzymnivå . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5010.5.1 Allosteriske enzymer og modulatorer . . . . . . . . . . . . . 5010.5.2 Feedback inhibition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5010.5.3 RNA-regulatorer og regulering ved protein-interaksjoner . . 51

11 Mutasjon og rekombinasjon i DNA 5111.1 Mutasjon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5111.2 Rekombinasjon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

12 Enzymkatalyse 5412.1 Spesifisitet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5412.2 Grunnleggende mekanisme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5412.3 Kofaktorer og koenzymer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5512.4 Navngiving og klassifisering av enzymer . . . . . . . . . . . . . . . . 5612.5 Kinetikk i enzymatiske reaksjoner . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

13 Metabolisme 5813.1 ATP og elektronbærere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5813.2 Anabolisme og katabolisme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5913.3 Sentrale metabolske prosesser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

13.3.1 Glykolysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6013.3.2 Sitronsyresyklusen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6013.3.3 Elektrontransportkjeden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

14 Membrantransport og signaltransduksjon 6314.1 Membranproteiner . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6314.2 Passiv transport . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6414.3 Aktiv transport . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6414.4 Signaltransduksjon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

I Rekombinant DNA-teknologi 66

15 Escherichia coli 66

16 DNA-kloning 6716.1 Kløyving og sammenkobling av DNA-fragmenter . . . . . . . . . . . 67

16.1.1 Restriksjonsenzymer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6816.1.2 DNA ligase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

16.2 Isolering og karakterisering av DNA-fragmenter . . . . . . . . . . . 69

4

16.3 Vektorer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6916.3.1 Metoder for innføring av DNA i levende celler . . . . . . . . 7016.3.2 Plasmider . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

16.4 Hybridisering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7216.5 Polymerase chain reaction (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

17 Genomics 72

18 Proteinproduksjon/“Protein engineering” 72

19 Produksjon av andre biokjemikalier 72

20 Miljøbioteknologi 72

II Praktiske problemstilinger 72

21 Proteinproduksjon fra genet ORF1 i E.coli 72

22 Framstilling av succinat 72

23 Produksjon av marint fett uten fangst av villfisk 72

III Etiske problemstillinger 72

24 Gentesting 72

25 Fosterdiagnostikk 72

26 Genmodifisert mat 72

27 Kloning 72

28 Transgene dyr og planter 72

5

Innledning

6

1 Hva er bioteknologi?Bioteknologi dreier seg mest om celler eller deler av dem, men hele organismer kanogså i noen sammenhenger ses på som en del av bioteknologien. Det ses typisk påcellene eller organismene fra en kjemikers synsvinkel, og det som observeres blirforsøkt forklart molekylært. Dette leder i mange tilfeller inn i en enorm komplek-sitet, noe som har medført en økende trend mot multidisiplinaritet (biologi, kjemi,bioinformatikk, fysikk, matematikk). Bioteknologien er med andre ord ikke lengeret rent deskriptivt fag, slik biologien historisk sett har vært.

Hvit bioteknologi, grønn bioteknologi...

2 Livets tre: Hva kom først?

Figur 1: Livets tre

Figur 1 viser det antatte slektskapet mellom kjente livsformer. Utformingener basert på viten om det molekylære slektskapet organismene imellom og inklu-derer en implisitt antagelse om at alt liv bygger på enklere former for liv, ellermed andre ord: at etablert kompleksitet fungerer som grunnlag for ny og størrekompleksitet. Det gis imidlertid ingen pekepinn på hvordan det hele startet, altsåhvordan det første arvematerialet oppsto og greide å formere seg. Dette er det mestgrunnleggende kriteriet for alt liv.

7

Hvor eller hvordan liv oppsto kan vi si lite om, men vi vet at alle organismerdeler visse fundamentale egenskaper. For eksempel har alt liv samme arvestoff, noesom sterkt antyder at vi alle har opphav i én stamorganisme. Sannsyligheten forat liv stammer fra flere ulike organismer er estimert til å være minst 102860 gangermindre enn for scenarioet med en universell stamfar.

Tanken om en felles “ursuppe” bygger på en hypotese om at forholdene på ur-tidens jord favoriserte kjemiske reaksjoner hvor uorganisk materiale gikk over tilorganiske forbindelser og at dette resulterte i en opphopning av byggematerialersom videre ga spontant opphav til liv. At fullstendige celler kan ha oppstått spon-tant på denne måten er helt usannsynlig, og det antas derfor heller at liv startetsom molekyler med evne til å replikere seg selv. RNA, molekylet som blant annetutgjør arvestoffet til enkelte virus, har tilsynelatende denne egenskapen.

3 Prokaryoter, eukaryoter og virusSom vist i Figur 1, skiller vi mellom prokaryote og eukaryote organismer. Euka-ryoter er langt mer komplekse enn prokaryoter og det antas derfor at prokaryoterutviklet seg først. De viktigste forskjellene mellom pro- og eukaryoter er oppsum-mert i Tabell 1, side 9. Virus er ikke-cellulære og passer følgelig ikke inn i denåværende klassifiseringssystemene som bare tar for seg liv basert på celler.

3.1 Prokaryoter

Prokaryoter er organismer som ikke har cellekjerne eller andre membranbundneorganeller. Disse deles inn i to grupper: bakterier og arkebakterier. Arkebakterier ereksotiske organismer som ofte lever under ekstreme forhold. De er gjerne vanskeligeå dyrke og brukes lite innen bioteknologien. De fleste prokaryoter er unicellulære,men noen få kan ha multicellulære stadier i løpet av sin livssyklus.

3.1.1 Gram-positivitet og -negativitet

Vi skiller mellom to hovedtyper bakterier: Gram-positive (G+) og Gram-negative(G-), som henholdsvis farges og ikke farges ved Gramfarging. Det som skiller deto typene fra hverandre strukturmessig er generelt hvordan cellemembranen eroppbygd; G+-bakterier har som regel bare en indre cytoplasmisk membran, mensG--bakterier har både inner- og yttermembran separert av et periplastisk rom (seFigur 2).

8

Tabell 1: Sammenligning av pro- og eukaryoter

Egenskap Prokaryoter EukaryoterTypiske organismer Bakterier, arkebakte-

rierProtoktister, sopp,planter, dyr

Typisk størrelse ∼1-10 µm ∼10-100 µmOrganisering Oftest encellede Encellet, i kolonier,

høyere multicellulæreorganismer med spe-sialiserte celler

Cellekjerne Nei JaMenbranbundne organeller Nei JaCellevegg Som regel Kun hos planterMitokondrium Nei JaKloroplaster Nei Kun hos planterRibosomer 50S + 30S 60S + 40SCytoplasmisk struktur Svært få strukturer Høyt organisert med

endomembraner ogcytoskjelett

Cellebevegelse Flageller (flagellin) Flageller og flimmer-hår (mikrotubuli); la-mellipodia og filopo-dia (actin)

Celledeling Binær fisjon (enkel de-ling)

Mitose og meiose

DNA-organisering Enkelt, sirkulært kro-mosom uten histoner;plasmider

Flere lineære kromo-somer med histoner

RNA-/proteinsyntese I cytoplasma RNA-syntese i kjer-nen, proteinsyntese icytoplasma

Introns Nei JaAntall RNA polymeraser 1 3Posttranslatorisk modifikasjon Nei JaAlternativ spleising Nei Ja

9

Figur 2: Membraner hos (a) Gram-positiv og (b) Gram-negativ bakterie.

3.1.2 Cellestruktur

Figur 3 viser den generelle strukturen til en bakterie. En prokaryot celle kan ge-nerelt ses på som oppbygd av tre strukturelle regioner:

1. På utsiden stikker flageller, pili og/eller fimbrier ut fra celleoverfalten. Dissefasiliterer all bevegelse samt kommunikasjon med andre celler. Motile (ak-tivt bevegelige) bakterier har vanligvis lange, tynne flageller bygd opp avundereneheter bestående av et protein kalt flagellin. Mindre proteinbaser-te utstikkere kalt fimbrier gjør det lettere for en celle å feste seg til andreog kan eksempelvis gjøre det enklere for sykdomsbærende bakterier å fes-te seg til en vert. Pili er små håraktige utstikkere som kobler en bakteriesammen med andre og bygger broer mellom cellenes indre. Dette muliggjørDNA-utveksling i form av overføring av plasmider bakterier imellom.

2. Cellens ytterste lag sørger for rigiditet og fungerer som et filter som separerercellens indre og omgivelsene. Dette laget består av en semipermeabel plas-mamembran og en cellevegg som selv kan være innkapslet i en kapsel og/elleret gelaktig slimlag. Cellemembranen består nesten alltid av et dobbelt lipid-lag, som regel bygd opp av fosfolipider med hydrofilt hode og hydrofobiskhale. Membranen sørger for at ioner, proteiner og andre molekyler trans-porteres selektivt inn og ut av cellen. Celleveggen består hos bakterier avpeptidoglycan og har i oppgave å virke som en beskyttende barriere moteksterne krefter. Den skal også sørge for at cellen ikke sprekker som følge avdet osmotiske trykket i hypotoniske omgivelser.

3. Cellens innside består av en viskøs cytoplasmisk region som først og fremstinneholder cellens genom og ribosomer.

10

Figur 3: Typisk prokaryot celle.

3.1.3 Organisering av arvestoff

Prokaryoter har oftest ett enkelt, sirkulært kromosom som er lokalisert i en regionkalt nukleoiden i cellens cytoplasma. Denne er ikke membranbundet, men har endistinkt struktur og plassering i cellen. Cytoplasma er en betegnelse på alt inn-holdet i en celle som ikke befinner seg i cellekjernen, mens cytosol kun betegnervæsken i dette området. Et viktig poeng er at prokaryoter kan bære ekstrakromo-somale DNA-elementer kalt plasmider, som vanligvis er sirkulære. Disse muliggjørtilleggsfunksjoner, for eksempel antibiotikaresistens (som åpenbart er kjekt å ha).

3.1.4 Bakteriell vekst

Bakteriell vekst innebærer deling av én bakterie til to datterceller ved binær di-visjon. Under forutsetning av at mutasjoner ikke inntreffer, vil dattercellene væreidentiske med originalen slik at den bakterielle populasjonen fordobles. Dersomantall celler som overlever til neste generasjon er større enn det antall celler somlevde ved starten av den foregående, vil veksten bli eksponentiell. Bakteriell vekstkan deles inn i følgende faser og er illustrert i Figur 4:

1. Lag-fase. Bakteriene tilpasser seg vekstforholdene og har ennå ikke begynt åformere seg. Navnet på fasen kommer av det engelske ordet lag.

2. Eksponentiell fase (log-fase). Dersom vekst ikke begrenses vil bakteriebefolk-ningen vokse eksponentielt.

3. Stasjonær fase. Vekstraten synker når det blir mindre tilgjengelig næring ogavfallsstoffer akkumuleres. Tallet på bakterier stabiliseres.

11

4. Dødsfase. Bakteriene går tomme for næring og dør.

Figur 4: Faser i bakteriell vekst. Logaritmisk plott av antall bakterier mot tid.

3.2 Eukaryoter

Eukaryoter består av celler som inneholder komplekse strukturer omgitt av mem-braner (vesikler). Alle større, komplekse organismer er eukaryoter, inkludert dyr,planter og sopp, men de fleste eukaryoter er mikroorganismer. Eukaryote celler ersom regel omtrent 15 ganger bredere enn en typisk prokaryot og kan ha så myesom 1.000 ganger større volum.

3.2.1 Cellestruktur

Strukturmessig skiller eukaryoter seg først og fremst fra prokaryoter ved at dehar cellekjerne som inneholder organismens fullstendige genetiske materiale. Defleste inneholder også flere ulike membranbundne organeller, slik som mitokondri-um, kloroplaster og Golgi-apparat, hvor metabolsk aktivitet finner sted. Av øvrigeforskjeller mellom prokaryoter og eukaryoter på cellenivå kan følgende nevnes:

• Den eukaryote plasmamembranen skiller seg noe fra den prokaryote, men hartilsvarende funksjon, altså å separerere cellens indre fra omgivelsene samtkontrollere inn- og utgående transport av substanser.

• Mange eukaryote celler er dekket med flimmerhår som spiller viktige rol-ler når det gjelder registrering av kjemiske, mekaniske og termiske stimuli.Flimmerhårene kan ses på som en slags sensoriske antenner som koordinereret stort antall av de cellulære signalmekanismene. Flimmerhårene kan ogsåbrukes til bevegelse sammen med flagellene.

12

3.2.2 Organisering av arvestoff

Eukaryot DNA er organisert i ett eller flere store lineære molekyler kalt kromo-somer og oppbevares bundet til proteiner i kompakte komplekser kalt kromatin.Dette gjør det mulig for de svært lange DNA-molekylene å få plass i cellekjernen.Kromatin kan beskrives ved tre ulike organisasjonsnivåer:

1. DNA binder seg til proteiner kalt histoner og danner nukleosomer. DNA harnegativ ladning og snurrer seg derfor rundt de negativt ladde histonene slikat en struktur kalt beads on a string"oppstår.

2. Nukleosomene pakkes sammen på tettest mulige måte og danner en strukturkalt 30 nm-fiberen.

3. Høyereordens pakking av 30 nm-fiberen. Denne kromatinstrukturen varierertrolig fra kromosom til kromosom, fra én region til en annen i ett enkeltkromsom og over tid i en celles liv. Ingen enkelt modell kan beskrive struktu-rene som oppstår, men hovedprinsippet er likevel klart: tettpakking av DNAi eukaryote kromsomoer involverer snurring etter snurring etter snurring... 30nm-fiberen vil altså snurres videre sammen og på det tetteste (ved cellede-ling) være pakket i metafasekromosomer. Disse består av to identiske tråderkalt kromatider bundet sammen i en region kalt sentromeren.

Noen eukaryote organeller, slik som mitokondriene, inneholder også noe DNA.Dette arvestoffet inneholder ingen informasjon om organismen og det antas derforat slike organeller har opphav i endosymbiotiske prokaryoter.

3.2.3 Dyre- og planteceller

Det finnes mange forskjellige typer eukaryoter, men de mest kjente er dyr og plan-ter. I Figur 5 ses eksempler på en typisk dyrecelle og en typisk plantecelle. Dyre-celler skiller seg fra planteceller ved at de mangler cellevegg og kloroplaster og harmindre vakuoler. Ettersom de ikke har cellevegg, kan dyreceller ha mange ulikeformer. Planteceller skiller seg en del fra cellene til andre eukaryote organismer oghar følgende distinkte strukturelle egenskaper:

• En stor, membranbundet vakuole som kontrollerer trykket fra cellens innholdpå celleveggen og molekylære bevegelser mellom cytosol og sevje.

• En cellevegg bestående av cellulose, hemicellulose og pektin.

• Plasmodesmata, små kanaler som tillater kommunikasjon med omkringlig-gende celler.

13

(a) Dyrecelle.

(b) Plantecelle.

Figur 5: Eksempel på typisk eukaryot dyrecelle og plantecelle

14

• Plastider, særlig kloroplaster som inneholder pigmentet klorofyll (som mu-liggjør fotosyntese).

• Høyerestående planter har ikke flageller eller centrioler.

3.3 Virus

Et virus er et svært lite patogen som kun kan replikere inne i de levende cellenetil andre organismer. De fleste viruser er i størrelsesordenen 0,2-2 µm, noe som ersammenlignbart med et stort protein, og de er dermed for små til å kunne ses medlysmikroskop. De er også mye mindre enn organismene de angriper. Virus utviseren voldsom variasjon og angriper absolutt alle typer organismer samtidig som deer svært spesialiserte og selektive med hensyn på vert.

3.3.1 Struktur og arvestoff

Virus har enten RNA eller DNA som arvemateriale og har ingen mulighet til åformere seg utenfor en vertscelle. Dersom arvestoffet består av én tråd, brukesbetegnelsen ssRNA- eller ssDNA-virus. Virus med dobbelttrådig arvestoff kallesdsRNA- eller dsDNA-virus. Alle virale partikler er bygd opp av to eller tre de-ler: genetisk materiale i form av RNA eller DNA, et ytre proteinlag (kapsid) sombeskytter dette materialet og i noen tilfeller et lipidbasert lag som omgir protein-laget når viruset er utenfor en celle. Denne membranen er egentlig “stjålet” fraplasmamembranen til vertsorganismen viruset først oppsto i.

Hos DNA-virus transkriberes DNA til mRNA som kan instruere cellens ribo-somer til å produsere nye virus. Arvestoffet til RNA-virus er enten umiddelbartlesbart av vertscellens ribosomer eller avhengig av å kopieres før translasjon til pro-teiner kan skje. Hos retrovirus (som sprøyter inn RNA), transkriberes viralt RNAtilbake til DNA av et unikt enzym kalt revers transkriptase. Dette enzymet harnaturligvis stor praktisk betydning innen bioteknologien. Etter replikasjon splei-ses virusets DNA inn i vertens arvemateriale av et integrase-enzym slik at det kanreplikeres som om det var vertens eget. Dette er en av grunnene til at mange retro-virale infeksjoner, eksempelvis AIDS, ikke kan kureres. Reproduksjonsmekanismenfor retrovirus er vist i Figur 6.

3.3.2 Livssyklus hos bakteriofager

Bakteriofager er virus som infiserer bakterier. Disse har to ulike livssykluser: denlytiske og den lysogene. I den lytiske syklusen skjer viral reproduksjon i fem trinn:binding, penetrering, biosyntese, modning og utslipp. Hva som skjer i hvert av disseer oppsummert i Tabell 2. I den lysogene syklusen etterfølges binding og penetre-ring av integrering, hvor viralt DNA inkorporeres i vertsbakteriens DNA uten at

15

Figur 6: Retrovirus transkriberer RNA tilbake til DNA ved hjelp av enzymet reverstranskriptase.

dette ødelegges. Nye virus produseres ikke umiddelbart, men framtidig produksjonligger latent i bakteriens arvemateriale og kan føres videre ved celledeling.

4 Sentrale molekyler

4.1 Karbohydrater

Karbohydrater brukes som umiddelbar energikilde i nesten alt liv og spiller ogsåstrukturelle roller i mange organismer. De varierer i størrelse og kompleksitet fraenkeltmolekyler til lange polymerkjeder og har som regel et karbon-hydrogen-oksygen-forhold på 1:2:1.

4.1.1 Monosakkarider

Monosakkarider er karbohydrater som bare består av ett enkelt sukkermolekyl.Disse er aldoser eller ketoser med ryggrad bygd opp av minst tre og sjelden merenn sju karbonatomer bundet til et varierende antall OH-grupper. Molekyleneer rette eller ringformede. Mange monosakkarider er epimere av hverandre, altsådiastereomere som kun avviker fra hverandre i ett stereogent senter.

16

Tabell 2: Trinn i lytisk reproduksjonssykus.

Trinn Betegnelse Hva skjer?1 Binding Deler av kapsidet kombineres med en reseptor på bakte-

riens cellevegg som en nøkkel i en lås; av og til benyttesheller ren mekanisk makt.

2 Penetrering Deler av celleveggen brytes ned slik at viralt arvestoffkan injiseres i bakterien.

3 Biosyntese Gener hos verten som ikke er nødvendige for replika-sjon av viruset deaktiveres slik at viruset kan ta kontrollover cellens maskineri og igangsette produksjon av storemengder virale komponenter.

4 Modning Viralt DNA og kapsider slås sammen til komplette virusog det påbegynnes produksjon av et enzym som bryterned bakteriens cellevegg slik at væske kan komme inncellen.

5 Utslipp Cellen sprekker (lyseres) og virusene er klare til å infiserenye celler.

Figur 7: Representative monosakkarider. (a) En aldose og en ketose, begge trioser.(b) To vanlige heksoser. (c) Pentosene som i ringform inngår i nukleinsyrer.

17

4.1.2 Polysakkarider

Polysakkarider er polymerer av monosakkarider. Enkelte av disse fungerer somenergilagre, da de ikke er løselige i vann og store nok til at de ikke kan passeregjennom cellemembranen. Eksempler er glykogen i pattedyr og stivelse i planter. Islike tilfeller degraderes sukkerkjedene ved behov til enkeltmolekyler som kan bry-tes videre ned og gi organismen energi. Enkelte polysakkarider har også strukturellfunksjon, slik som cellulose i planter, kitin i dyr og peptidoglykan i bakterier.

Figur 8: Et kort segment av polysakkariden kitin, en sentral strukturell komponenti mange organismer.

4.2 Lipider

Betegnelsen lipider brukes om en lang rekke organiske molekyler. De aller flestelipider inneholder lange, upolare hydrokarbonkjeder som gjør dem uløselige i vann.De forekommer også ofte sammenkoblet med kjeder av karbohydrater i molekylerkalt lipopolysakkarider eller med proteiner i lipoproteiner.

4.2.1 Fett, oljer, voks og steroider

Fett og oljer fungerer som rike energilagre i henholdsvis dyr og planter. De bestårav glyserol bundet til tre fettsyrer og kalles derfor ofte triglyserider. Fettsyrene ermettede i fett og umettede i oljer. Andre viktige fettforbindelser er voks og steroi-der. Voks har både strukturelle og beskyttende egenskaper, mens steroider blantannet har hormonelle funksjoner. Steroidet kolesterol stabiliserer plasmamembra-nen i dyreceller og er kjemisk utgangspunkt for produksjonen av andre steroider,for eksempel kjønnshormonene testosteron og østrogen.

4.2.2 Fosfolipider

Fosfolipider er en klasse lipider som har avgjørende biologisk betydning. I likhetmed fett og oljer består fosfolipidene av glyserol bundet til tre grupper, men bare to

18

av disse er fettsyrer. Den tredje gruppen inneholder en negativt ladd fosfatgruppe.Fosfolipider får således en strutur bestående av et polart, hydrofilt hode og enupolar, hydrofobisk hale, slik at de i vandige omgivelser vil danne komplekser hvormolekylenes haler peker innover mens hodene peker utover. Dette utnyttes i celler,hvor et semipermeabelt dobbeltlag av fosfolipider danner en beskyttende membranmellom cellenes indre og omgivelsene.

Figur 9: Struktur hos et fosfolipid.

4.3 Proteiner

Proteiner er biologiske makromolekyler bygd opp av kjeder av aminosyrer. Debestår av én eller flere underenheter av polypeptider og er helt avgjørende for cellersstruktur og funksjon. Opptil 50 % av tørrvekten til de fleste celler er proteiner. Dekan deles inn etter biologisk funksjon i følgende kategorier:

• Struktur. Strukturelle proteiner gir stivhet og rigiditet til eller flytende bio-logiske komponenter. De fleste strukturelle proteiner består av fibre av po-lymeriserte proteinmonomerer.

• Metabolisme. Enzymer er den største gruppen av proteiner og har i oppgaveå katalysere kjemiske reaksjoner i celler.

• Transport. Kanal- og transportproteiner i plasmamembranen tillater trans-port av molekyler og ioner inn og ut av celler. Andre proteiner transporterer

19

molekyler rundt i organismen slik hemoglobin frakter oksygen gjennom blo-det hos dyr.

• Signalisering og regulering. Mange proteiner bidrar til signalisering i organis-men. Enkelte proteiner, som insulin, er ekstracellulære proteiner som overfø-rer et signal fra cellen hvor de ble syntetisert til andre celler i andre vev. Dissekalles hormoner. Andre er membranproteiner som fungerer som reseptorer oghar som hovedfunksjon å binde signalmolekyler og indusere biokjemisk re-spons til den ytre påvirkningen i cellen.

• Forsvar. Y-formede proteiner kalt antistoffer brukes av dyrs immunsystemertil å identifisere og nøytralisere fremmedlegemer som bakterier og virus. Dissesørger for å opprettholde relativ konstans i organismens indre forhold.

• Bevegelse. Kontraktile proteiner tillater bevegelse av celler og får muskler tilå trekke seg sammen.

4.3.1 Aminosyrer

Proteiner er polymerer bygd opp av aminosyre-monomerer. Aminosyrene har ge-nerell struktur som vist i Figur ?? og har fått navn fra amingruppen (-NH2) ogsyregruppen (-COOH) som er koblet til det sentrale karbonatomet. R-gruppenskiller de ulike aminosyrene fra hverandre og varierer i kompleksitet fra et hydro-genatom til kompliserte ringforbindelser. Enkelte R-grupper er polare mens andreikke er det. Aminosyren cystein har en tiolgruppe (-SH) på enden av R-gruppensom ofte bidrar til å koble ulike aminosyrekjeder sammen ved dannelse av disul-fidbindinger (-S-S-S-).

Figur 10: Generell struktur hos aminosyrer. R-gruppen varierer og er avgjørendefor aminosyrens egenskaper.

Det finnes totalt 22 ulike aminosyrer i naturlig forekommende proteiner. Avdisse kodes 20 av den genetiske koden (se Tabell 5) mens de to siste inkorporeres i

20

proteiner via unike syntesemekanismer. Alle de vanlige aminosyrene unntatt glyciner kirale forbindelser som kan eksistere i to ulike isomere former kalt L og D. Alleaminosyrer som tilføyes et polypeptid ved translasjon er av L-typen, men D-typenkan introduseres ved posttranslatorisk modifikasjon.

Aminosyrene som finnes i levende organismer kan grupperes på mange må-ter ut fra deres fysikalske og kjemiske egenskaper. Viktige faktorer er ladning,hydrofili og -fobi, størrelse, funksjonelle grupper. Et viktig moment er at de ulikesyre-base-egenskapene til aminosyrene har avgjørende betydning for funksjonen tilproteinene de inngår i. Det er ofte interessant å se på sammenhengen mellom nettoladning og pH for en aminosyre i løsning. Et sentralt begrep i den forbindelse erpI, som er pH ved isoelektrisk punkt, altså når netto ladning er null.

4.3.2 Peptidbindinger

Aminosyrer kobles sammen ved hjelp av kovalente bindinger kalt peptidbindin-ger. Disse dannes ved en dehydreringsreaksjon hvor karboksylgruppen til den eneaminosyren reagerer med aminogruppen til den andre. Ettersom oksygenet i kar-boksylgruppen er mer elektronegativt enn nitrogenet i aminogruppen, blir resul-tatet en polarbinding med negativ ladning på O og positiv ladning på N. Dettetillater hydrogenbinding mellom -CO hos én aminosyre og -NH hos en annen.Dannelse av peptidbinding er illustrert i Figur ??.

Figur 11: Peptidbindinger dannes ved dehydrering.

21

4.3.3 Peptider, polypeptider og proteiner

Et peptid er to eller flere aminosyrer koblet sammen og et polypeptid er en sam-menhengende, lineær kjede av aminosyrer bundet sammen av peptidbindinger.Proteiner består av ett eller flere polypeptider sammensatt slik at de har biologiskfunksjon og har gjerne ikke-peptid-grupper festet til seg. Disse gruppene kalleskofaktorer. Merk at betegnelsene peptid, polypeptid og protein ofte brukes omhverandre.

4.3.4 Strukturelle organisasjonsnivåer i proteiner

Strukturen til proteiner kan ses på som organisert i minst tre nivåer, i enkeltetilfeller. Disse nivåene er:

1. Primær struktur. Den lineære sekvensen av aminosyrer. Alle aminosyrese-kvenser har en karboksylgruppe på den ene enden og en amingruppe på denandre. Endene kalles derfor henholdsvis karboksyl- og aminoterminus.

2. Sekundær struktur. Lokale foldinger i polypeptidet. Hydrogenbindinger mel-lom aminosyrene muliggjør to ulike romlige utforminger: en høyrehendt spiralkalt α-heliks og en plateutforming kalt β-sheet. Disse er illustrert i Figur 12.α-heliks optimaliserer intern hydrogenbinding mellom samtlige peptidbindin-ger. β-sheet består av parallelle eller antiparallelle sikksakk-kjeder av amino-syrer festet sammen ved hydrogenbindinger i en blikktakaktig platestruktur.

3. Tertiær struktur. Total folding av polypeptidet. Strukturen opprettholdes avkovalente bindinger samt ione- og hydrogenbindinger mellom R-gruppene.

4. Kvaternær struktur. Enkelte proteiner består av mer enn én aminosyrekjede.Den kvarternære strukturen betegner den romlige strukturen til det resulte-rende komplekset av polypeptider.

Lokale (sekundære) proteinstrukturer kan forutsis rimelig godt teoretisk, mentotale (tertiære) strukturer er langt mer kompliserte og vanskelige å kartlegge. Dekan imidlertid finnes ved røntgenkrystallografi dersom proteinet er i fast fase samtved NMR (Nuclear Magnetic Resonance) eller spektroskopi dersom det er i løsning.

4.4 Nukleinsyrer: DNA og RNA

De to nukleinsyrene i celler er DNA (deoksyribonukleinsyre) og RNA (ribonuk-leinsyre). Betegnelsen nukleinsyre kommer av at disse molekylene først ble funneti cellekjerner og at man tidlig oppdaget at de hadde syreegenskaper. DNA inne-holder genetisk informasjon som koder for rekkefølgen av aminosyrer i proteiner,

22

(a) Hemoglobin består av fire under-enheter som alle hovedsaklig består avα-helikser.

(b) β-sheet kan gi opphav til tønne-strukturer som vist her i et sukrose-spesifikt transmembranprotein.

Figur 12: Eksempler på α-heliks og β-sheet i proteinstrukturer.

mens RNA kan ha flere ulike egenskaper. Messenger RNA (mRNA) er kodendeRNA som har i oppgave å formidle informasjonen i DNA videre til proteinpro-duserende enzymer kalt ribosomer. De fremste eksemplene på ikke-kodende RNA,altså RNA som ikke fungerer som mal ved proteinsyntese, er transfer RNA (tRNA)og ribosomalt RNA (rRNA). Disse har likevel avgjørende betydning for transla-sjonsprosessen: tRNA har i oppgave å frakte aminosyrer til ribosomet mens rRNAinngår i selve ribosomet. rRNA bidrar blant annet ved binding til mRNA og ka-talyserer dannelsen av peptidbindinger.

Nukleinsyrene kan, i likhet med andre makromolekyler, inndeles i ulike struk-turelle organisasjonsnivåer:

1. Primær struktur. Oppbygningen av nukleotidene og rekkefølgen av disse ipolynukleotid-trådene.

2. Sekundær struktur. Interaksjon mellom basene, altså hvilke deler av hvilketråder som er bundet til hverandre.

3. Tertiær struktur. Fullstendig tredimensjonal struktur. Hos DNA vil dettetypisk innebære dobbel heliks.

4. Kvaternær struktur. Høyere grads organisasjon av DNA i kromatin eller in-teraksjoner mellom separate RNA-enheter, for eksempel i et ribosom.

23

4.4.1 Primær struktur: Nukleotider

Nukleinsyrene er bygd opp av nukleotider, molekylære komplekser bestående avet fosfat, en pentose og en nitrogenholdig base. Dersom disse strukturene mang-ler fosfat, kalles de nukleosider. Figur 13 viser hvordan nukleotider i DNA gårsammen i polymerer kalt polynukleotider: Kovalente bindinger mellom sukker ogfosfat, hvor fosfatet binder sammen 5’- og 3’-karbonatomene hos to nabopento-ser (fosfodiester-bro), utgjør molekylets ryggrad, mens basene projekteres ut tilsidene. Nukleotidene i DNA og RNA inneholder ulike strukturelle sukkerenheter,deoksyribose i DNA og ribose i RNA, som skilles ved at deoksyribose ikke har etoksygenatom bundet til 2’-karbonet. Det er herfra DNA og RNA henter sine navn.

(a) Pyrin- og pyrimidinbasene som inngår iDNA og RNA.

(b) Polynukleotider i DNA og RNA.

Figur 13: Baser og polynukleotider i DNA og RNA.

DNA-språket består av de fire bokstavene A, T, C og G som korresponderertil basene adenin, tymin, cytosin og guanin. I RNA erstattes tymin av uracil (U),som er tilnærmet identisk, men uten metylgruppe i sukkerets posisjon 5’. Base-ne tilhører to ulike kjemiske grupper: adenin og guanin er puriner, mens tymin,cytosin og uracil er pyrimidiner. Både puriner og pyrimidiner er heterosykliskearomatiske forbindelser. Pyrimidiner er basert på én enkelt pyrimidinring, menspuriner inneholder en dobbeltring bestående av en pyrimdin- og en imidazolring.

24

Begge grupper består av plane molekyler, noe som er avgjørende for nukleinsyre-nes strukturelle utforming og funksjon. Forskjeller i primærstruktur mellom DNAog RNA er oppsummert i Tabell 3.

Tabell 3: Sammenligning av struktur hos DNA og RNA.

Egenskap DNA RNASukker Deoksyribose RiboseBaser A, T, C, G A, U, C, GTråder Doble med baseparing EnkelHeliks Ja Nei

4.4.2 Sekundær struktur: Komplementær baseparing

I 1950 analyserte kjemikeren Erwin Chargaff DNA kromatografisk og viste at alleorganismer inneholder like mye adenin som tymin og like mye cytosin som guanin.Dette prinsippet, som kalles Chargaffs regel, impliserer at det i DNA forekommerkomplementær baseparing, altså at adenin alltid bindes til tymin og at cytosin all-tid bindes til guanin. De komplementære basene utfyller hverandre romlig, og harhydrogenatomer i posisjoner som faller sammen med plasseringen av de elektrone-gative atomene oksygen og nitrogen hos partneren. Hydrogenbindinger, to mellomA og T og tre mellom C og G, kan dermed sørge for å holde basene sammen. Detteer illustrert i Figur 14a. Komplementær baseparing forekommer også mellom ulikeRNA-molekyler samt mellom DNA og RNA, noe som er grunnleggende i de mestsentrale biologiske prosessene.

4.4.3 Tertiær struktur: Dobbel heliks

Prinsippet om komplementær baseparing ble avgjørende for den videre kartleg-gingen av det genetiske materialets oppbygning og gjorde det mulig for James D.Watson og Francis Crick å modellere DNA-molekylets tertiærstruktur, den dobleheliksen. En annen viktig pekepinn kom fra karaktistiske diffraksjonsmønstre fraeksperimenter hvor krystallaktige DNA-fibre ble analysert med røntgenkrystallo-grafi.

Watson og Cricks konklusjon gikk ut på at DNA i levende celler er et dob-belttrådig molekyl med en utvendig ryggrad bygd opp av sukker og fosfat medhydrogenbundne basepar på innsiden som sørger for å holde trådene sammen. Deto trådene er antiparallelle for å tillate komplementær baseparing og har følgelig en3’-ende og en 5’-ende, avhengig av hvilket karbonatom i pentosen tråden begynnerog avslutter med. Sukkermolekylene i de to trådene er med andre ord rettet i mot-satte retninger. De to trådene er begge helikser med rotasjon om en felles, sentral

25

(a) Komplementær baseparing i DNAmed hydrogenbindinger mellom base-ne.

(b) Tre ulike modeller av DNA-molekylets dobleheliks.

Figur 14: Sekundær og tertiær struktur hos DNA: komplementær baseparing ogdobbel heliks.

akse, slik at de sammen utgjør en dobbel heliks. Denne har en minste repeterendeenhet bestående av en “minor groove” og en “major groove” med en samlet lengdepå omtrent 36 Å (3,6 nm). Radien er anslått til 10 Å og én nukleotid er omtrent 3,4Å lang. Tre modeller av DNA er vist i Figur 14b. Merk at både DNA og RNA kanutvise stor strukturell variasjon og danne flere ulike helikser samt andre tertiærestrukturer.

4.4.4 Supercoiling

Når trådene i DNA vikles sammen eller fra hverandre fra sin naturlige posisjon vilde respondere på det mekaniske stresset ved å danne supercoils (“kjempesnurrer”).Supercoiling er viktig for en rekke biologiske prosesser, først og fremst tettpakkingav DNA.

5 Molekylærbiologiens sentrale dogmeDet sentrale dogmet ble første gang formulert av Francis Crick i 1958:

The central dogma of molecular biology deals with the detailedresidue-by-residue transfer of sequential information. It states that in-

26

formation cannot be transferred back from protein to either protein ornucleic acid.

Med andre ord, mekanismen for produksjon av proteiner er irreversibel: et pro-tein kan ikke brukes til å lage DNA. Dogmet utgjør et rammeverk for forståelsen avoverføring av sekvensiell informasjon mellom informasjonsbærende biopolymerer.Disse er DNA, RNA og proteiner. Figur 15 viser den normale flyten av biologiskinformasjon: DNA kan kopieres til DNA (replikasjon), informasjon i DNA kan ko-pieres til mRNA (transkripsjon) og informasjonen i mRNA kan benyttes som malfor proteinsyntese (translasjon).

Figur 15: Normal informasjonsflyt i biologiske systemer.

6 ReplikasjonReproduksjon av liv er avhengig av reproduksjon på cellenivå, altså at to cellerdannes fra én. Dette krever overføring av cellens genetiske informasjon og DNAmå derfor være i stand til å lage eksakte kopier av seg selv. Denne prosessenkalles DNA-replikasjon. Ved replikasjon fungerer hver av de to trådene fra detopprinnelige DNA-molekylet (parent strands) som mal for en ny, komplementærtråd i et dattermolekyl (daughter strand). Én av de opprinnelige trådene vil alltidvære med videre i dattermolekylet og replikasjonen er følgelig semikonservativ.Svært forenklet kan replikasjonsprosessen oppsummeres i tre trinn:

1. Initiering. DNA-molekylets tråder vikles fra hverandre slik at en strukturkalt replikasjonsgaffel oppstår.

2. Elongering. De to enkelttrådene (template strands) leses av og nye nukleoti-der settes sammen med sine komplemetære baser. Dette skjer kontinuerliglangs leading strand og diskontinuerlig langs lagging strand.

27

3. Terminering. Ved avsluttet syntese løsrives de to semikonserverte DNA-molekylene fra hverandre.

Mange ulike enzymer er nødvendige for at replikasjon skal kunne skje. De mestsentrale enzymene i prosessen og deres funksjon er oppsummert i Tabell 4.

6.1 Replikasjonsprosessen

6.1.1 Initiering

Replikasjon begynner ved ett eller flere fikserte punkter kalt origoer eller start-punkter. Bakterier har ett origo, mens eukaryoter har mange. I origo gjenkjennesspesielle DNA-sekvenser av enzymer kalt SSB (single stranded binding proteins)som sørger for å separere DNA-molekylets tråder. Sekvensene er gjerne rike på A-og T, da disse bindes sammen av to heller enn tre hydrogenbindinger og dermeder lettere å bryte. Etter åpning vikles de to trådene i DNA-molekylet fra hverand-re ved at hydrogenbindingene mellom baseparene brytes av enzymet helicase. Enstruktur kalt replikasjonsgaffelen oppstår, hvor de to trådene henger sammen påden ene siden av enzymet og er adskilt på den andre. Dette er illustrert i Figur 17.Replikasjonsprosessen kan være unidireksjonell (gå i én retning) eller bidireksjonell(gå i to retninger) avhengig av hvilken type origo prosessen starter i, og den kanforegå flere steder samtidig langs samme DNA-molekyl.

6.1.2 Elongering

De to enkelttrådene (template strands) bindes til stabiliserende proteiner og fun-gerer som mal for nye komplementære tråder. Replikasjonsprosessen kompliseresimidlertid av at de to trådene er antiparallelle, da DNA polymerase kun kan festenye nukleotider til 3’-enden hos den foregående nukleotiden. Det følger at avles-ning og syntese av DNA bare er mulig i retningen 3’-5’, slik at én tråd kan kopieresi samme retning som replikasjonsgaffelen mens den andre må kopieres i motsattretning. Disse trådene kalles henholdsvis leading strand og lagging strand. Langstråden som kopieres i samme retning som replikasjonsgaffelen, kan replikasjonenskje kontinuerlig; avlesning, syntese og elongering skjer i én sammenhengende pro-sess. I motsatt retning må replikasjonen starte om og om igjen etter hvert sommolekylet åpnes, slik at replikasjonen blir diskontinuerlig og resulterer i adskiltebiter av ferdig DNA kalt Okazaki-fragmenter.

Ettersom DNA polymerase er avhengig av å feste nye nukleotider til en alleredeeksisterende 3’-OH-gruppe vil det heller ikke være i stand til å syntetisere DNAhelt fra bunnen av. Et annet enzym kalt primase plasserer derfor en kort sekvensav RNA kalt en RNA-primer ved starten av hver avlesning slik at DNA polymerase

28

Figur 16: Prinsippskisse av replikasjonsgaffel med angitte retninger for åpning,syntese og avlesning.

kan komme i gang. Langs tråden som leses av i samme retning som replikasjonsgaf-felen (leading strand) kreves bare én slik primer, mens det for den andre (laggingstrand) kreves flere, én for hvert Okazaki-fragment. DNA polymerase fjerner RNA-primere og fyller de resulterende hullene med komplementære DNA-nukleotidersamtidig som det utfører korrekturlesning av de produserte DNA-sekvensene. Tilslutt slås fragmentene av DNA sammen av enzymet DNA ligase ved dannelse avkovalente fosfodiester-bindinger mellom nukleotidenes pentoser.

6.1.3 Terminering

Hos prokaryoter, som typisk har sirkulære DNA-molekyler, ender replikasjonenved et termineringssete hvor de to sirkulære dattermolekylene forlater hverandre.Hos eukaryoter starter replikasjonen på flere ulike steder i kromosomet og mangeav disse prosessene vil termineres ved at to replikasjonsgafler møter hverandre.Ettersom eukaryoter har lineære kromosomer, er ikke DNA polymerase i stand tilå replikere trådens 5’-ende etter at RNA-primerene er fjernet og DNA-molekyleneblir derfor gradvis kortere for hver replikasjon. Denne effekten motvirkes av tele-omerer, repetitive DNA-sekvenser som sitter på endene av molekylet og ikke koderfor proteiner. Teleomerene hindrer informasjonstap gjennom et visst antall replika-sjoner og setter dermed en øvre grense for hvor mange celledelinger som er mulig.Hos pattedyr vil celler dyrket i kultur dele seg omtrent 50 ganger før tapet avteleomerer signaliserer at celledivisjon skal opphøre.

29

Figur 17: Detaljert oversikt over hva som skjer i replikasjonsgaffelen. (a) Primasesyntetiserer en RNA-primer for et nytt Okazaki-fragment. (b) DNA polymerasebygger på primerene.. (c) DNA polymerase fortsetter til det treffer på en annenprimer. Nye primere syntetiseres etter hvert som gaffelen beveger seg framver langstråden.

Tabell 4: Sentrale enzymer i DNA-replikasjon og deres funksjon.

Enzym FunksjonSSB Binder seg til enkelttrådig DNA slik at trådene

separeres i replikasjonsgaffelen.DNA polymerase Syntetiserer nye DNA-tråder, fjerner RNA-

primere og korrekturleser.Helicase Bryter hydrogenbindinger mellom basene og vik-

ler trådene i DNA-molekylet fra hverandre.Primase Syntetiserer RNA-primere.DNA gyrase (topoisomerase) Frigjør dreiemoment som bygger seg opp i DNA-

molekylet når det vikles ut.DNA ligase Slår sammen fragmenter av DNA.

30

7 Den genetiske koden

7.1 Standard genetisk kode

Den genetiske koden er et sett av regler som bestemmer hvordan informasjonen iarvematerialet oversettes til proteiner av levende celler. Koden er basert på sekven-ser av tre og tre nukleotider kalt kodoner som alle koder for én enkelt aminosyre.Med fire ulike nukleotider gir dette 43 = 64 mulige kombinasjoner, altså mer ennnok til å kode for de 20 forskjellige aminosyrene som finnes i proteiner. Det finnesflere varianter av den genetiske koden, men et klart flertall av gener benytter stan-dardkoden vist i Tabell 5. At koden er tilnærmet universell gjør det mulig å overføregener fra én organisme til en annen, noe som er svært sentralt i bioteknologien.

7.1.1 Viktige egenskaper ved den genetiske koden

Ved å studere Tabell 5 kan følgende viktige egenskaper ved den genetiske kodenses:

1. Koden er degenerert. De fleste aminosyrer kodes av mer enn ett kodon, noesom beskytter mot potensielt skadelige mutasjoner.

2. Koden er utvetydig. Hvert kodon har kun én betydning.

3. Koden har spesifikke start- og stoppsignaler. Det finnes ett startsignal og trestoppsignaler.

7.1.2 Avvik fra standard genetisk kode

Mitokondrielt DNA er et eksempel på bruk av genetisk kode som avviker fra detordinære. Alle organismer inneholder dessuten genetisk informasjon lagret i ikke-kodende sekvenser. Dette gjelder regulatoriske sekvenser, intergenetiske segmenter,kromosomale strukturelle områder og andre områder som ikke følger regelen om atett kodon svarer til én aminosyre. Disse bidrar likevel i stor grad til organismensfenotype.

7.2 Gener

Et gen er en DNA-sekvens som spesifierer rekkefølgen av aminosyrer i et protein(eller av nukleotider i en funksjonell RNA-kjede). Dette ble først formulert på1940-tallet av gentikerne George Beadle og Edward Tatum i deres “ett gen, ettenzym”-hypotese. Gener uttrykkes ved at den genetiske informasjonen oversettestil aminosyresekvenser via transkripsjon og translasjon (se for eksempel Figur 15).

31

Tabell 5: Kodoner i mRNA med tilhørende aminosyrer.

Første base Andre base Tredje baseU C A G

U

UUU UCU UAU UGU Ufenylalanin serin tyrosin cysteinUUC UCC UAC UGC Cfenylalanin serin tyrosin cysteinUUA UCA UAA UGA Aleucin serin stopp stoppUUG UCG UAG UGG Gleucin serin stopp tryptofan

C

CUU CCU CAU CGU Uleucin prolin histidin argininCUC CCC CAC CGC Cleucin prolin histidin argininCUA CCA CAA CGA Aleucin prolin glutamin argininCUG CCG CAG CGG Gleucin prolin glutamin arginin

A

AUU ACU AAU AGU Uisoleucin treonin asparagin serinAUC ACC AAC AGC Cisoleucin treonin asparagin serinAUA ACA AAA AGA Aisoleucin treonin lysin arginin

AUG (start) ACG AAG AGG Gmetionin treonin lysin arginin

G

GUU GCU GAU GGU Uvalin alanin aspartat glycinGUC GCC GAC GGC Cvalin alanin aspartat glycinGUA GCA GAA GGA Avalin alanin glutamat glycinGUG GCG GAG GGG Gvalin alanin glutamat glycin

32

Cistron er i praksis bare en annen betegnelse på et gen, mens en allel er en spe-sifikk variant av et gen. Genomet til en organisme er dens fullstendige genetiskeinformasjon.

8 TranskripsjonVed transkripsjon benyttes sekvenser av DNA som utgangspunkt for dannelse avkomplementære RNA-kopier. RNA polymerase leser av en av trådene i DNA-molekylet (template strand) og produserer en komplementær, antiparallell RNA-tråd. Tråden som ikke leses av kalles non-template strand. Alt RNA produseres pådenne måten, men kun mRNA fungerer som mal for proteinsyntese ved translasjon.En enkel oppsummering av transkripsjonsprosessen finnes i Tabell 6 og prosessener illustrert i Figur 20 samt Figur ??. Merk at transkripsjonsprosessen er langtmer kompleks hos eukaryoter enn hos prokaryoter. Hos prokaryoter kan flere genertranskriberes som en enhet. Disse genene ligger på rekke og rad i DNA-sekvensensom leses av og betegnes samlet som et operon.

Tabell 6: Forenklet oppsummering av transkripsjon.

Trinn Betegnelse Hva skjer?1 Binding og initiering RNA polymerase bindes til en promotor og

DNA-trådene vikles fra hverandre ved brytingav hydrogenbindingene mellom baseparene.

2 Promotorklarering RNA polymerase beveger seg fra promotoren tilregionen som skal avleses.

3 Elongering RNA-nukleotider pares med sine komplemen-tære DNA-baser og molekylets sukker-fosfat-ryggrad dannes.

4 Terminering Hydrogenbindinger mellom RNA og DNA bry-tes slik at den nye RNA-tråden frigjøres.

5 Prosessering I eukaryote celler prosesseres RNA før det be-veger seg ut av cellekjernen til cytoplasmaen.mRNA-molekyler får 3’-poly-A-hale og 5’-capog introner fjernes.

8.1 RNA polymerase og sigmafaktoren

RNA polymerase er enzymet som produserer RNA. I E. coli består det av femsentrale underenheter (α2ββ

′ω) og en sjette kalt sigmafaktoren (σ). Sigmafaktoren

33

er en transkripsjonsfaktor som gjør det mulig for RNA polymerase å binde seg tilspesifikke promotorer (se neste avsnitt). Det finnes mange ulike sigmafaktorer oghvilke som aktiveres avhenger av foholdene i omgivelsene. σ70 kalles “hushjelp”-faktoren, da den sørger for transkripsjon av genene som koder for proteiner som ernødvendige for å holde cellen i live. Betegnelsen “hushjelp”-gener brukes om genenesom koder for disse proteinene.

Figur 18: Tre strukturelle lag av RNA polymerase under transkripsjon.

8.2 Promotorer

Transkripsjonsprosessen starter ved en DNA-region kalt promotor som er plassertnær genet som skal replikeres. Hos eukaryoter finnes promotorene i regioner somligger -35, -75 og -90 basepar unna genet som skal transkriberes i 5’-retning (upstre-am). Promotoren definerer starten på genet, transkripsjonsretningen og hvilkentråd som skal avleses.

Det skilles mellom svake og sterke promotorer. En promotor med sterk affi-nitet for RNA polymerase har gode muligheter for å bli en sterk promotor, mener det ikke nødvendigvis. Konstitutive promotorer er uregulerte promotorer somtillater kontinuerlig transkripsjon av sine tilhørende gener. Indusible promotorerhar aktivitet som avhenger av tilstedeværelse eller fravær av andre faktorer.

Promotorer er ikke like, selv om de har strukturelle fellestrekk. Dette er eteksempel på at sekvenser i DNA eller et annet biologisk makromolekyl kan finnesi flere typer. I slike tilfeller benyttes ofte en konsensussekvens, en slags idealse-kvens basert på gjennomsnittet av de ulike typene med den vanligste basen i hverposisjon.

34

8.3 Transkripsjonsprosessen

8.3.1 Binding og initiering

Ved binding til promotoren er RNA polymerase assosiert med en sigmafaktor somhjelper det med å finne såkalte kjernesekvenser i promotoren. Disse befinner segi regioner som er -35 og -10 basepar unna transkripsjonsstartpunktet (TSS) i 5’-retning (upstream) og er avgjørende for at transkripsjon skal komme i gang. -10-sekvensen kalles gjerne Pribnow-boksen og har konsensussekvensen TATAAT.

I bakterier bindes RNA polymerase direkte til promotoren. I eukaryoter erinitieringen mer kompleks, da den krever at proteiner kalt transkripsjonsfaktorerfester seg til promotoren slik at et initieringskompleks kan dannes. Den vanligstepromotorsekvensen i eukaryoter og arkebakterier er TATA-boksen som har struk-turen 5’-TATAAA-3’ eller en variasjon av denne. Initeringskomplekset er fullsten-dig når det bindes til RNA polymerase (assosiert med sigmafaktor) og kalles pådette tidspunktet et lukket kompleks. Når DNA-molekylet deretter åpnes kallesstrukturen et åpent kompleks.

Figur 19: Konsensussekvenser i en E. coli -promotor.

8.3.2 Promotorklarering

Etter at første binding er syntetisert må RNA polymerase komme seg fra promo-toren til sekvensen som skal avleses. Affiniteten for binding til promotorregionener på dette tidspunktet større enn for sekvensene som skal avleses, noe som skyldessigmafaktoren. Denne må altså fjernes før enzymet kan bli stabilt i et elongerings-kompleks. Når sigmafaktoren skal fjernes og promotoren klareres går prosessengjennom en fase hvor korte RNA-tråder bestående av noen få nukleotider syn-tetiseres og slippes ut. Etter en viss tid slippes sigmafaktoren og når en av desyntetiserte trådene får en lengde på omtrent 23 nukleotider stabiliseres elonge-ringskomplekset slik at elongeringen kan komme i gang. Som regel vil bare noenfå prosent av de påbegynte transkripsjonene komme til elongeringsfasen.

8.3.3 Elongering

Ved elongering benyttes den ene DNA-tråden (template strand )som mal for synte-se av RNA. Dette skjer i 3’-5’-retning slik at RNA-molekylet produseres i retningen

35

5’-3’. Trådene i DNAet som leses av vikles fra hverandre før de kommer inn i RNApolymerase-molekylet og deretter tilbake igjen idet de forlater molekylet etter fer-dig avlesning og syntese. Dreiemomentet som følger av fraviklingen gir negativesupercoils der DNAet åpnes og positive der det lukkes. Syntesen skjer i enzymetsaktive sete hvor nye nukleotid-trifosfater (NTPer) kommer inn gjennom en egenNTP-kanal.

Figur 20: Transkripsjonsboble med DNA polymerase fra E. coli.

Transkripsjon av mRNA kan involvere mange RNA polymeraser samtidig påsamme tråd og prosessen kan skje i mange omganger. Dette gjør det mulig å amp-lifisere et gen, altså å produsere flere mRNA-molekyler og dermed flere proteinerpå kortere tid.

8.3.4 Terminering

Bakterier benytter to ulike strategier for transkripsjonsterminering. Ved Rho-uavhengig (intrinsikk) terminering dannes en G-C-rik, hårnålsaktig struktur bun-

36

det sammen av intern baseparing etterfulgt av en poly-U-hale. Det mekaniskestresset som oppstår i molekylet som følge av hårnålsstrukturem fører til at desvake rU-dA bindingene mellom RNA og DNA brytes. RNAet trekkes dermedut av det aktive setet slik at transkripsjonen termineres. Rho-avhengig termine-ring involverer en proteinfaktor kalt Rho som destabiliserer interaksjonene mellomRNA og DNA slik at syntetisert RNA kan slippe ut av elongeringskomplekset. Nårtranskripsjonen er terminert kalles det resulterende RNA-molekylet transkript.

8.3.5 Prosessering

I prokaryoter vil transkribert RNA som regel være klart for umiddelbar translasjontil proteiner. Dette skjer gjerne allerede før transkripsjonen er fullendt. Eukaryoterhar imidlertid langt mer komplekse gener og RNA-molekylene må derfor modifi-seres før de forlater cellekjernen.

Figur 21: I prokaryoter kan translasjon og transkripsjon foregå samtidig.

De eukaryote genene består av flere distinkte typer regioner som forplanter segvidere til RNA-molekylene som transkriberes fra dem: mRNA-molekyler starter ogslutter med regioner kalt 3’- og 5’-UTR, som ikke koder for proteiner ved transla-sjon og først og fremst har regulatoriske funksjoner. I området som ligger mellomde to UTRene finnes to typer regioner: eksoner, som koder for proteiner, og intro-

37

ner, tilsynelatende meningsløse sekvenser som ikke bidrar til proteinproduksjonenog som må fjernes før molekylet forlater cellekjernen.

RNA-prosesseringen er todelt. I første del festes en poly-A-hale bestående avopptil flere hundre A-nukleotider til ’3-enden ved polyadenylering mens en modi-fisert G-nukleotid, kalt en ’5-cap, festes til 5’-enden. G-nukleotiden forteller ribo-somet hvor det skal feste seg, mens poly-A-halen fasiliterer transport av mRNAetut av cellekjernen. Intronene fjernes deretter i en prosess kalt spleising som utføresav komplekser av ribonukleoproteiner kalt spleiseosomer. Disse danner sirkulæresløyfer av intronene som kuttes samtidig som eksonene fetes sammen. mRNA somikke er prosessert kalles primært mRNA, mens ferdig prosessert mRNA som erklart for translasjon kalles modent mRNA.

Det er mulig å sette eksonene sammen på flere ulike måter. Flere forskjelligemRNAer og proteiner kan følgelig kodes av ett enkelt gen. Dette kalles alternativspleising og varierer som regel med hvilket vev prosessen skjer i. Hos prokaryotermed introner utføres selvspleising. Det vil si at mRNAet selv sørger for å spleise utintroner ved autokatalyse. Slike RNAer med enzymatisk funksjon kalles ribozymer.

Figur 22: Prosessering av eukaryot mRNA etter transkripsjon.

9 TranslasjonTranslasjon er det siste steget på veien fra gen til protein. Informasjonen i mRNAleses av “proteinfabrikker” kalt ribosomer som oversetter kodonene til kjeder avaminosyrer i polypeptider. Hvert kodon koder for én spesifikk aminosyre (se Ta-

38

bell 5. De produserte polypeptidene ender til sutt opp som aktive proteiner medspesifikke funksjoner.

9.1 Ribosomer

Ribosomer oversetter genetisk informasjon i mRNA til proteiner. De er store mo-lekylære komplekser bestående av to underenheter som begge er komplekser avribosomalt RNA (rRNA) og proteiner. Ved translasjon binder den minste under-enhet seg til mRNA mens den større binder seg til aminosyrer og RNA-molekylerkalt transfer RNA (tRNA). Ribosomer har tre bindingsseter for tRNA, kalt E-setet(exit) , P-setet (peptidyl) og A-setet (aminosyre). Ribosomer har blitt klassifisertsom ribozymer (enzymatisk RNA), da det ser ut til at rRNA er viktigste faktornår aminosyrene festes sammen.

De ribosomale underenhetene er relativt like i pro- og eukaryoter. Underenhetenbetegnes med enheten Svedberg (S) som er et mål på sedimenteringsraten vedsentrifugering heller enn masse størrelse. Dette forklarer hvorfor navnene til enunderenhet ikke kan finnes ved addering av dens bestanddeler. Prokaryoter har70S-ribosomer bestående av en liten og en stor underenhet (henholdsvis 30S og50S). 50S-underenheten er bygd opp av en 5S- og en 23S-RNA-underenhet samt34 proteiner, mens 30S-undernheten har én 16S-RNA-undernehet bundet til 21proteiner. Eukaryoter har 80S-ribosomer som består av en liten 40S-underenhetog en stor 60S-underenhet. 60S-underenheten består av tre RNA-underenheter,henholdsvis 5S, 5,8S og 28S, med omtrent 49 proteiner. 40S underneheten har én18S-RNA-underenhet med omtrent 33 proteiner. Strukturen til et typisk prokaryotribosom og dets underenheter er vist i Figur 23.

Figur 23: Bakterielt ribosom. (a) 50S- og 30S-underenhetene hver for seg. (b) Detsammensatte, aktive ribosomale komplekset.

39

I prokaryoter finnes ribsomene i cytoplasmaen sammen med arvestoffet og res-ten av det cellulære maskineriet. I eukaryoter fraktes de ribosomale underenheteneseparat ut av cellekjernen hvor de går sammen til ribosomer ved translasjonsstart,enten i cytoplasmaen eller festet til en organelle kalt endoplasmatisk retikulum.

9.2 tRNA

Transfer RNA (tRNA) er RNA-molekyler som har i oppgave å frakte aminosyrerinn i ribosomene under translasjon. Det finnes minst ett tRNA for hver av de 20aminosyrene. Molekylet består av én enkelt RNA-tråd, typisk 73-93 nukleotiderlang, som foldes sammen som følge av intern baseparing. Det er kovalent bundet tilen aminosyre i 3’-enden og til en fosfatgruppe i 5’-enden. Omtrent midtveis i trådenfinnes en sekvens av tre nukleotider kalt et antikodon som er komplementært tilmRNA-kodonet som svarer til aminosyren molekylet bærer. Et tRNA som harantikodonet GAA vil eksempelvis binde seg til kodonet CUU og bære aminosyrenleucin (se Tabell 5).

(a) Sekundær kløverblad-struktur hostRNA.

(b) Eksempel på tredimensjonal tertiærstruktur hos tRNA.

Figur 24: To strukturelle modeller av tRNA.

Strukturen til tRNA tegnes som regel som et flatt kløverblad. Dette er vist iFigur 24 sammen med et eksempel på molekylets tredimensjonale struktur. Detkan ses at antikodonet ligger eksponert helt ytterst på den ene enden av molekylet i

40

den tredimensjonale strukturen, slik at det lett kan bindes til sitt korresponderendekodon.

En samling aminosyreaktiverende enzymer kalt aminoacyl-tRNA syntetasersørger for at riktig aminosyre festes til riktig tRNA-molekyl ved aminoacylering.Denne reaksjonen drives av at en fosfodiesterbinding i ATP spaltes med frigjøringav pyrofosfat og resulterer i et aminoacyl-tRNA-molekyl (ladd tRNA) som kanfrakte aminosyrer inn i et ribsom. Alle aminoacyl-tRNA syntetaser har et setehvor riktig aminosyre passer som en nøkkel i en lås slik at hver type tRNA barekan festes til én aminosyre. Det kan bemerkes at flere ulike tRNA-molekyler vilbære samme aminosyre dersom denne svarer til flere ulike kodoner i mRNA.

9.3 Translasjonsprosessen

Proteinsyntese kan deles inn i tre trinn: initiering, elongering og terminering. Allede tre leddene krever spesifikke enzymer. Prosessen er energimessig svært kostbarog det forbrukes store mengder GTP i initieringsfasen. Siden det lages veldig myeproteiner i levende celler blir dermed proteinsyntesen en energimessig sett veldigkostbar prosess. I prokaryoter, der arvestoffet befinner seg i cytoplasmaen, kanribosomene begynne å produsere proteiner allerede før transkripsjonen er ferdig.Flere ribosomer kan lese av samme mRNA samtidig både i pro- og eukaryoter ogdanner da et kompleks kalt polyribosom. mRNA-molekylet leses i retningen 3’-5’.

Figur 25: (a) Fire ribosomer leser av et eukaryot mRNA-molekyl samtidig i etpolyribosom og syntetiserer et polypeptid fra aminoterminus til karboksylterminus.(b) Mikrografisk framstilling og forklarende illustrasjon av et polyribosom.

41

9.3.1 Initiering

Ved initiering samler spesielle proteiner kalt initieringsfaktorer alle komponentenesom er nødvendige for translasjonen i et initieringskompleks. De nødvendige kom-ponentene er de to ribosomale underenhetene, mRNA og initierende tRNA. Denmindre ribosomale underenheten bindes til mRNA slik at startkodonet AUG blirposisjonert i P-setet (peptidsetet). I prokaryoter bidrar Shine-Dalgarno-sekvenseni mRNA (5’-AGGAGGU-3’ i E. coli) til denne bindingen ved baseparing meden komplementær sekvens i ribosomets 16S-rRNA. Videre rekrutteres tRNA medaminosyren N -formylmetionin til P-setet ved binding til AUG i mRNA før denstørre ribosomale underenheten binder seg til komplekset.

(a) Dannelse av initie-ringskompleks.

(b) Binding av andreaminoacyl-tRNA

Figur 26: Initiering av translasjon.

9.3.2 Elongering

Under elongeringsfasen økes lengden på polypeptidkjeden en aminosyre om gan-gen. I tillegg til tRNA kreves elongeringsfaktorer som fasiliterer binding av tRNA-

42

antikodoner til mRNA-kodoner i ribosomet. Idet initierende tRNA kommer inn i P-setet endres konformasjonen til komplekset slik at A-setet åpnes for nye aminoacyl-tRNA-molekyler. Når tRNAet som svarer til neste kodon er på plass, overføresformylmetionin ved dannelse av en peptidbinding mellom aminosyren til dettetRNAet og formylmetionin, noe som krever energi og katalyse fra et ribozym i denstørre ribosomale underenheten. Til slutt beveger mRNAet seg videre til neste ko-don slik at tRNAene translokeres. tRNAet med dipeptidet flyttes da fra A-setet tilP-setet, mens det “brukte” tRNAet forlater ribosomet via E-setet. Resten av elon-geringsprosessen er repetisjon: Et aminoacyl-tRNA kommer inn i A-setet, peptidetoverføres mellom tRNAene, fra P-setet til A-setet, og tRNAene translokeres idetmRNA går videre til neste kodon. mRNA leses av i 3’-5’-retning slik at peptidetproduseres fra aminoterminus til karboksylterminus.

9.3.3 Terminering

Elongeringsfasen fortsetter helt til ribosomet når et stoppkodon i mRNAet. Dissekodonene gjenkjennes ikke av tRNA, men av proteiner kalt release-faktorer. Dissekatalyserer hydrolyse av esterbindiningen i peptidyl-tRNAet slik at det syntetiserteproteinet slippes ut av ribosomet. Ribosomet spaltes deretter i sine underenheterog bindingene til mRNA brytes.

(a) Dannelse av første pep-tidbinding.

(b) Tredje elongeringstrinn. (c) Terminering

Figur 27: Elongerings- og termineringsfase ved translasjon.

43

9.4 Posttranslatorisk modifikasjon og denaturering

Etter fullendt translasjon må det produserte polypeptidet foldes slik at det fårsin karakteristiske tredimensjonale struktur og kan fungere som det skal. Dettekan skje “av seg selv” som følge av interaksjoner mellom polypeptidets aminosyrer,men krever i mange tilfeller assistanse fra hjelpeproteiner kalt chaperoner. Ofte erogså tilføyelse av funksjonelle grupper eller strukturelle endringer i polypeptidetnødvendig for at det skal få riktig funksjon. Dette gjelder særlig i eukaryoter. Ek-sempler på funksjonelle grupper som kan festes til polypeptider etter translasjoner acetat, fosfat (fosforylering) samt ulike lipider og karbohydrater (eksempelvisglykosylering). Strukturelle endringer i selve aminosyresekvensen kan for eksem-pel innebære dannelse av disulfidbroer, kutting av sekvensen eller utskiftning avaminosyrer. Mange modifikasjoner inngår i mekanismer som kontrollerer oppførse-len til proteiner, for eksempel ved at de aktiverer eller inaktiverer et enzym.

Figur 28: Eksempler på tilføyde funksjonelle grupper ved posttranslatorisk modifi-kasjon. (a) Fosforylerte aminosyrer. (b) En karboksylert aminosyre. (c) Metylerteaminosyrer.

Korrekt tredimensjonal struktur er avgjørende for proteiners funksjon, og feil-folding kan følgelig gi proteiner som mangler eller har feil aktivitet i cellen. Feilfol-ding vil alltid forekomme i større eller mindre grad som følge av feil som gjøres påveien fra gen til protein, men utsettelse for varme eller andre endringer i det cellu-lære miljøet vil kunne øke frekvensen i så stor grad at det gir utslag i organismens

44

fenotype i form av sykdom. Når proteiner eller nukleinsyrer mister sin tertiæreog sekundære struktur som følge av ekstern påvirkning, kalles dette denature-ring. Chaperoner beskytter til en viss grad mot feilfolding, men feil vil forekommeogså for chaperonavhengige proteiner dersom store mengder produseres. Ettersomproteiners funksjon er så avhengig av struktur, utgjør feilaktig posttranslatoriskmodifikasjon et stort problem innen bioteknologien.

10 GenreguleringGenregulering betegner prosesser hvor celler eller virus regulerer hvordan informa-sjonen som ligger lagret i genene omdannes til sine respektive produkter. Alle stegpå veien fra gen til produkt kan reguleres, fra transkripsjon til posttranslatoriskmodifikasjon av et protein. Genregulering øker organismens allsidighet og tilpas-ningsdyktighet ved å tillate at gener uttrykkes ved behov. Dette gjør det mulig forulike celler å ha ulike egenskaper, noe som videre tillater større strukturell kom-pleksitet hos organismen. En tommelfingerregel er at enhver form for reguleringman kan se for seg trolig finnes i naturen.

10.1 Cellulær differensiering

Hvordan kan celler oppføre seg på ulike måter i en organisme når de inneholdernøyaktig samme genetiske informasjon? Dette spørsmålet stilles i det enorme fag-feltet cellulær differensiering som tar for seg den biologiske prosessen hvor cellermed helt ulike egenskaper (ulik fenotype) utvikler seg fra én celle eller celletypeuten at genotypen endres. Det enkle svaret er at ulike deler av informasjonen iDNA brukes i ulike vev, noe som hovedsaklig skyldes at transkripsjonsfaktorenesom er tilstede i de ulike vevene ikke er de samme. Cellulær differensiering kandessuten spores tilbake til den tidligste fosterutviklingen: så snart noen celler harblitt differensiert kan disse utvikle seg videre uavhengig av de andre cellene og giopphav til nye sett av celletyper.

10.2 Regulering av transkripsjon

Genregulering på transkripsjonsnivå kan deles opp i to hovedtyper: negativ ogpositiv regulering. Fire vanlige reguleringsmønstre ved transkripsjon, to negativeog to positive, er vist i Figur 29.

10.2.1 Negativ regulering

Negativ regulering forekommer når et protein kalt repressor binder seg til et bin-dingssete i DNA og hindrer transkripsjon. Dette setet kalles en operator og befinner

45

seg generelt i promotorregionen eller i nærheten av den. Når repressoren er bun-det til operatoren hindres RNA polymerase i å binde seg til promoteren eller i åbevege seg videre til de kodende sekvensene. Repressorbindingen kan reguleres vedat et signalmolekyl binder seg til repressoren og forårsaker konformasjonsendrin-ger, noe som kan øke eller senke muligheten for replikasjon. Dersom repressoreni utgangspunktet sitter på operatoren, vil konformasjonsendringen som regel føretil at den dissosierer slik at genene som tilhører promotoren blir tilgjengelige fortranskripsjon. I andre tilfeller vil repressoren være avhengig av å være bundet til etsignalmolekyl for at den skal kunne binde seg til operatoren. Merk at betegnelsenoperator kun brukes om bindingsseter som fester seg til en repessor, altså kun vednegativ regulering.

Figur 29: Fire reguleringsmekanismer.

10.2.2 Positiv regulering

Positiv regulering er det motsatte av negativ regulering, altså regulering hvor bin-ding av et protein til et bindingssete i DNA gjør transkripsjon mulig. Slike proteinerkalles aktivatorer (eller positive regulatorer) og har ofte bindingsseter som liggeri nærheten av promotorer som i utgangspunktet er svake, altså promotorer som

46

bindes svakt eller ikke i det hele tatt av RNA polymerase når en aktivator ikke ertil stede. Enkelte eukaryote aktivatorer binder seg til seter som ligger langt unnapromotoren og kan påvirke transkripsjon over avstander på flere tusen basepar.Signalmolekyler kan regulere bindingen av aktivatorer på samme vis som hos re-pressorer, altså ved å forårsake konformasjonsendringer som får aktivatoren til åbinde seg til bindingssetet eller løsne fra det. Dett vil henholdsvis muliggjøre ellerhindre transkripsjon.

10.2.3 Operon og polycistronisk mRNA

I bakterier ligger gener som koder for produkter som inngår i relaterte prosesserofte på rekke og rad i kromosomet og har samme promotor. De transkriberersdermed sammen slik at proteinene blir produsert samtidig og kan dermed ogsåreguleres som en enhet. mRNA som inneholder informasjon fra flere gener kallespolycistronisk. En samling av gener og regulatoriske sekvenser som deler sammepromotor kalles en operon.

Figur 30: Representativt bakterielt operon. Genene A, B og C transkriberes til ettenkelt polycistronisk mRNA og deler én promotor med tilhørende reguleringsme-kanismer.

10.3 Regulering av laktosemetabolisme i E. coli

10.3.1 Negativ regulering av lac-operonet

For at laktose skal kunne utnyttes til energi i en E. coli -celle kreves tre enzymer:β-galactosidase (Z), β-galactoside permease (Y) og thiogalactoside transacetylase(A). Disse kodes av tre gener kalt lacZ, lacY, og lacA som ligger rett etter hverandrei lac-operonet og hjelper cellen på ulike måter: β-galactosidase (Z) splitter lakto-semolekylene, β-galactoside permease (Y) er et membranbundet transportproteinsom gjør det lettere for laktose å komme inn i cellen og thiogalactoside transacety-lase (A) ser ut til å fasilitere transport ut av cellen for toksiske galaktosider. Genene

47

har en felles promotorregion, lacP, med en operator, lacO, i regionen mellom pro-motoren og operonet. Denne operatoren er bindingssete for et lac-repressorproteinsom ved binding hindrer RNA polymerase i å utføre transkripsjon.

Så lenge laktose ikke er til stede i cellen vil repressoren sitte på operatoren slikat energi ikke blir sløst bort på produksjon av proteiner som ikke er nødvendige.Dette frandrer seg imidlertid dersom laktose blir tilgjengelig. En laktosemetabolittkalt alllaktose vil da binde seg til repressoren slik at denne ikke lenger kan bindeseg til operatoren. Operonet frigjøres dermed for avlesning av RNA polymeraseog cellen blir i stand til å nyttiggjøre seg den tilgjengelige energien. Dette er eteksempel på negativ regulering hvor binding av et signalmolekyl gjør transkripsjonmulig. Operonet vil uttrykkes så lenge allolaktose er til stede og binder represso-rene, men når all laktose er oppbrukt vil repressoren igjen binde seg til operatorenog hindre transkripsjon.

10.3.2 Positiv regulering av lac-operonet

Når flere sukker er til stede i E. coli vil cellen først forbruke sukkeret som gir mestmulig energi for minst mulig innsats. Dette innebærer at glukose vil forbrukesfør laktose dersom begge forbindelser er tilgjengelige, noe som videre må impli-sere at tilstedeværelse av glukose påvirker hvordan lacO uttrykkes. Når glukoseer tilgjengelig sørger en reguleringsmekanisme kalt katabolittrepresjon for at ge-nene i operonet transkriberes i liten grad, selv når laktose finnes i cellen. Denneeffekten styres av aktivatorproteinet cAMP (syklisk adenosinmonofosfat) som vedtilstedeværelse av signalmolekylet CRP/CAP (cAMP receptor protein/cataboliteactivator protein) binder seg til et sete nær promotoren lacP. Dette er en posi-tiv reguleringsmekanisme som ved binding øker transkripsjonen av genene i lacO.Glukose inhiberer syntese av cAMP samtidig som transport av cAMP ut av cellenstimuleres. Når cAMP-konsentrasjonen synker, vil færre CRP-aktivatorer kunnebinde seg til DNA slik at transkripsjon av lacO blir vanskeligere.

10.3.3 En kombinasjon av effekter styrer uttrykkingen av lac-operonet

Sterk uttrykking av lacO avhenger av en kombinasjon av negativ og positiv regu-lering: det kreves både inaktivering av lac-repressoren og at CRP-aktivatorer er tilstede som følge av lav glukosekonsentrajon. Glukose og laktose har en kombinerteffekt på transkripsjonsfrekvensen som kan ses tydelig i Figur 31.

48

Figur 31: Regulering av lac-operonet i E. coli

10.4 Regulering av translasjon

10.4.1 Regulering ved ribosomproduksjon i bakterier

Når behovet for proteiner øker i en bakterie, vil dette løses ved å øke antall ri-bosomer heller enn å øke aktiviteten til de enkelte ribosomene. En celle i vekstbruker følgelig en svært stor andel av sine ressurser på ribsomproduksjon. Samti-dig er det av avgjørende betydning at ribosomene som produseres fungerer somde skal, og cellen har derfor et system som sørger for å koordinere produksjonenav de ribosomale komponentene (r-proteiner og rRNA). Dette sørger for at cellenikke kaster bort energi på å produsere mer av den ene typen komponenter enn denandre og er et eksempel på en reguleringsmekanisme som i stor grad foregår påtranslasjonsnivå.

De 52 genene som koder for r-proteiner forekommer i minst 20 operoner. Noenav disse operonene inneholder også gener som koder for underenheter i DNA prima-se, RNA polymerase og elongeringsfaktorer, noe som reflekterer den tette koblin-gen mellom replikasjon, transkripsjon og proteinsyntese ved cellevekst. R-protein-operonene reguleres primært via en translatorisk feedback-mekanisme: i hvert ope-ron finnes et gen som koder for et r-protein som også fungerer som en translatoriskrepressor. Ved transkripsjon binder dette proteinet seg til det produserte mRNAetslik at translasjon hindres, noe som fungerer fordi r-protein-operonene kun har énmulig posisjon for translasjonsstart. Proteinet vil imidlertid også binde seg til etrRNA og som regel ha større affinitet for dette enn for mRNAet, slik at translasjonbare vil hindres når nivået av r-protein er større enn av rRNA. Dette utgjør et nega-tivt reguleringssystem som sikrer at translasjon av r-protein-kodende mRNA skjeri balanse med tilgangen på rRNA. Systemet følger en negativ feedback-mekanisme:

49

opphopning av ett produkt påvirker hastigheten til prosessen som helhet (det gåsnærmere inn på dette i det påfølgende delkapitlet om enzymregulering).

10.5 Regulering på enzymnivå

Cellulær metabolisme inkluderer ofte grupper av enzymer som jobber sammeni bestemte rekkefølger for å utføre metabolske prosesser. Flere sekvensielle, en-zymkatalyserte reaksjoner inngår sammen i enzymsystemer hvor produktet fra ettenzym utgjør substratet til det neste, slik at hastigheten til prosessen som helhetblir avhengig av hastigheten til hvert enkelt enzym. Regulatoriske enzymer er en-zymer som har stor effekt på prosessen som helhet som følge av at de utviser størreeller mindre katalytisk aktivitet ved kontakt med spesifikke signalmolekyler. Has-tigheten til hele metabolske sekvenser kan dermed reguleres ved å justere leddetsom katalyseres av et regulatorisk enzym.

10.5.1 Allosteriske enzymer og modulatorer

Aktiviteten til regulatoriske enzymer kan påvirkes på flere ulike måter. En viktigmekanisme er allosterisk regulering, hvor allosteriske enzymer binder seg reversi-belt og ikke-kovalent til regulatoriske forbindelser kalt allosteriske effektorer ellermodulatorer. Allosteriske enzymer har i tillegg til det aktive setet et allosterisk setehvor modulatorer kan binde seg og indusere konformasjonsendringer som påvirkerenzymets aktivitet. Det allosteriske setet er, i likhet med det aktive setet, spesifiktmed hensyn på sin modulator. Modulatorer kalles henholdsvis allosteriske aktiva-torer eller allosteriske inhibitorer avhengig av om de øker eller senker enzymetsaktivitet. Ofte vil modulatoren være identisk med enzymets substrat, og enzymetkalles da homotropisk. Dersom modulatoren er et annet molekyl enn substratetkalles enzymet heterotropisk. Modulatorer kan også binde seg til spesifikke mRNAog dermed hindre eller stimulere tranlasjon. Effekten av en positiv modulator ervist i Figur 32.

10.5.2 Feedback inhibition

I noen enzymsystemer inhiberes de regulatoriske enzymene spesifikt av proses-sens sluttprodukt. Dette skjer når konsentrasjonen av sluttproduktet overstigercellens behov. I slike systemer vil sluttproduktet typisk binde seg til det regula-toriske enzymet slik at dets aktivitet synker. De øvrige enzymene i systemet vilderetter operere i ulike hastigheter mens deres respektive substrater brukes oppog konsentrasjonen av sluttproduktet kommer i balanse med cellens behov. Dennetypen negativ regulering, hvor hastigheten til prosessen senkes ved opphopning avsluttprodukt, kalles feedback inhibition.

50

Figur 32: Modulatorer påvirker aktiviteten til allosteriske enzymer. Her endrerenzymet konformasjon ved binding til en positiv modulator (aktivator) slik ataktiviteten øker.

10.5.3 RNA-regulatorer og regulering ved protein-interaksjoner

Enkelte RNA-molekyler kan også fungere som regulatorer, for eksempel ved åhindre translasjon av mRNA. Det regulatoriske RNA-molekylet kan fungere ved åvære delvis homologt med molekylet det regulerer, slik at et hybridkompleks somblokkerer translasjon kan dannes. En annen form for regulering involverer protein-protein-interaksjoner: et protein A kan bindes til et protein B slik at det mistersin aktivitet.

11 Mutasjon og rekombinasjon i DNA

11.1 Mutasjon

Mutasjoner er permanente endringer i DNA-sekvensen til en organisme som følgeav faktorer i omgivelsene kalt mutagener. Slike mutagener kan være stråling, virus,kjemikalier, feil ved replikasjon eller spontane omrokkeringer i genomet. En mole-kylær feil i DNA kan kalles en “DNA lesion”. Kjemiske modifikasjoner i DNA-basenevil som regel rettes opp via et svært komplekst system av reparasjonsenzymer, menom de forplanter seg videre ved replikasjon vil de kunne bli permanente. I Figur 33kan effektene av en metylert OH-gruppe i guanin ses. Den modifiserte G-basen pa-res feilaktig med tymin, slik at det som opprinnelig var et G-C basepar erstattes

51

av A-T ved replikasjon. Systemet som sørger for å gjenkjenne og reparere feil somgjøres ved DNA-replikasjon kalles “mismatch repair”. Det er trådspesifikt, noe somvil si at det kjenner igjen tråden som sist ble syntetisert (og som dermed har størstsansynlighet for å inneholde feil) og går over denne for å finne feilaktig innsattebaser. Dersom feil oppdages, fjernes den respektive nukleotiden og erstattes medden korrekte. Feil som ikke oppdages blir mutasjoner.

Mutasjoner kan ha flere ulike effekter: de kan være uten betdning, endre struk-turen til et protein eller hindre et gen i å fungere som det skal. Endringer i proteinersom følge av mutasjon vil være skadelig i de fleste tilfeller, men kan enkelte gan-ger ha nøytral eller til og med fordelaktig virkning. Fordelaktige mutasjoner er enforutsetning for evolusjon.

Figur 33: Eksempel på hvordan skader i DNA kan resultere i mutasjon. Her bindesmetylert guanin til tymin heller enn cytosin, noe som gir en feil i basesekvensensom kan forplante seg videre ved replikasjon.

11.2 Rekombinasjon

Genetisk rekombinasjon innebærer utveksling av genetisk informason mellom toulike DNA-molekyler eller mellom forskjellige deler av samme DNA-molekyl. Ho-molog rekombinasjon er utveksling av sekvenser mellom to like eller identiske DNA-molekyler som illustrert i Figur ??. Ikke-homolog rekombinasjon forekommer også.Homolog rekombinasjon varierer i stor grad mellom ulike organismer, men følgerfor det meste de samme grunnleggende stegene: Etter at et dobbelttrådig bruddhar forekommet i én av de to homologene, kuttes de åpne endene av eksonuklea-

52

ser. Eksonukleaser er enzymer som bryter fosfodiesterbindinger på enden av enpolynukleotidkjede, i motsetning til endonukleaser som bryter bindinger inne i enslik kjede. I dette tilfellet degraderer eksonukleasene 5’-endene i større grad enn3’-endene, slik at de to åpne dobbelttrådene begge får en utstikker på 3’-enden.Den ene utstikkereen pares med sin komplementære sekvens i homologen slik athomologens andre tråd forskyves. Dette trinnet kalles trådinvasjon (strand inva-sion) og etterfølges av at den invaderende tråden forlenges av DNA polymerase.Den andre utstikkende 3’-enden fester seg deretter til enden av den invaderendetråden slik at et sammenkoblet DNA-molekyl kalt et Holiday-intermediat opp-står. Tråden som ble forskjøvet fra den invaderte homologen har nå gått inn idet invaderende molekylet (branch migration) og inkorporeres i dette ved replika-sjon etterfulgt av kløyving av endonukleaser. Resulatet er to DNA-molekyler medutvekslede sekvenser.

(a) Eksonukleaser kutter de åpne endene ogden ene utstikkeren pares med sin komplemen-tære sekvens i homologen (strand invasion).

(b) Branch migration og utvidelse av den in-vaderende trådens 3’-ende. Dette gir Holliday-intermediater som kløyves til to DNA-molekyler med utvekslede sekvenser.

Figur 34: Hovedtrekk ved homolog rekombinasjon.

53

12 EnzymkatalyseEnzymer utgjør den største gruppen av proteiner og har i oppgave å katalyserekjemiske reaksjoner. Enzymatiske reaksjoner følger generelt mekanismen

E + S −−⇀↽−− ES −→ EP −→ E + P

der E er enzymet, S substratet og P produktet.

12.1 Spesifisitet

Et enzym kan typisk binde ett spesifikt substrat. Dette kan være en liten orga-nisk forbindelse (for eksempel glukose), et metall (for eksempel magnesium), etannet protein eller DNA. Hva enzymet faktisk binder avhenger av tertiærstruktu-ren som igjen følger av aminosyresekvensen. Med andre ord: Enzymer er normaltsubstratspesifikke og katalyserer bare én reaksjon. Substratspesifitet er ofte ennødvendighet, men i enkelte tilfeller er hensiktsmessig med mer generell aktivitet.Det ville for eksempel vært svært lite økonomisk å ha egne enzymer for å brytened hver enkelt type protein eller polysakkarid i en organisme.

Figur 35: Illustrasjon av “induced fit”-hypotesen. Enzymet gjennomgår konforma-sjonsendringer ved interaksjon med substratet og danner et stabilisert kompleks.

12.2 Grunnleggende mekanisme

Alle enzymer katalyserer reaksjoner ved å senke aktiveringsenergien (E‡a), altså vedå senke den nødvendige tilførselen av fri energi ved reaksjonen (∆G‡). Dette erillustrert i Figur 36. Enzymatisk katalyse skjer i enzymets aktive sete, og ettersomenzymer er fleksible strukturer vil dette setet kontinuerlig skifte form som følgeav interaksjoner med substratet. Denne beskrivelsen av enzymers virkemåte kallesgjerne ‘ìnduced fit”-hypotesen og er illustrert i Figur ??. Konformasjonsendringerhos substratet vil også forekomme i noen tilfeller. Veien fra substrat til produkt

54

blir dermed fylt med en rekke overgangstilstander hvor substratet er stabilisert ikomplekser med enzymet, noe som gjør aktiveringsenergien mindre enn den villevært i det ikke-katalyserte tilfellet. Det viktigste bidraget til denne stabiliseringenkommer som regel fra elektrostatiske krefter.

Mange reaksjoner som katalyseres går av seg selv i utgangspunktet, men ersvært langsomme, og enzymer sørger da for å øke den spontane hastigheten. Denkatalyserte reaksjonshastigheten kan være opptil 1012 ganger så stor som den ikke-katalyserte. Enzymer kan også katalysere reaksjoner som ikke går av seg selv, mendet krever tilførsel av energi, ofte i form av ATP. Et typisk eksempel er fikseringav atmosfærisk nitrogen. Termodynamisk er det viktig å bemerke at enzymer ikkeforskyver likevekt, bare hastigheten likevekt innstilles med. Det kan også bemerkesat enzymer ikke forbrukes. Når en reaksjon har skjedd kan enzymet umiddelbartbegynne på nytt, slik at ett enkelt enzym for eksempel kan utføre 50 katalyser persekund.

Figur 36: Reaksjonskoordinatdiagram for reaksjonen S −→ P med sammenligningav katalysert og ikke-katalysert aktiveringsenergi. Intermediatene ES og EP svarertil minimumsverdier på kurven for den katalyserte reaksjonen.

12.3 Kofaktorer og koenzymer

Enkelte enzymer trenger ingen komponenter uteover polypeptidkjedene for å ut-vise full aktivitet. Mange må imidlertid tilføyes andre kjemiske komponenter kaltkofaktorer for å kunne utføre katalyse. Kofaktorer kan bestå av et eller flere uor-ganiske ioner eller mer komplekse organiske molekyler. Organiske kofaktorer kallesgjerne prostetiske grupper dersom de er kovalent bundet til enzymet og koenzymer

55

dersom dersom de er løst bundet. De binder seg til det aktive setet eller i nærhetenav det og bidrar til katalyse ved å modifisere strukturen til substratet eller vedå flytte elektroner, protoner og kjemiske grupper mellom substratet og enzymet.Kofaktorer separeres fra enzymet ved fullført reaksjon.

Mange koenzymer produseres fra vitaminer, noe som forklarer hvorfor mennske-kroppen behøver konstant, lav tilførsel av enkelte av disse forbindelsene. Et avde mest essensielle koenzymene, NAD+ (nikotinamidadenindinukleotid) produse-res fra niacin. Andre viktige koenzymer er NADH, NADP+, NADPH og FAD.NADH, NADH2 og NADP+ er henholdsvis de reduserte og den fosforylerte ut-gaven av NAD+. NADPH er produktet ved reduksjon av NADP+ mens FAD erflavinadenindinukleotid, også kjent som riboflavin eller vitamin B12. Et siste viktigkoenzym er koenzym A (CoA) som tjener som acylgruppebærer i mange enzyma-tiske reaksjoner og blant annet inngår i sitronsyresyklusen samt ved syntese ogoksidasjon av fettsyrer.

12.4 Navngiving og klassifisering av enzymer

Enzymer kan deles inn etter spesifikk aktivitet i seks kategorier. Disse er opp-summert i Tabell 7. Enzymer betegnes som regel ved kallenavn som sier noe omaktiviteten og har suffikset -ase. I henhold til International Union of Biochemis-try (IUB) skal alle enzymer gis et kodenummer bestående av fire sifre separert avpunktum med betydningen (klasse.gruppe.undergruppe.serienummer). Navnet påenzymet skal baseres på forbindelsen som inngår i enzymreaksjonen og navnet påden dominerende enzymklassen

Tabell 7: Enzymklasser.

Klasse AktivitetOksidoreduktaser Oksidasjon og reduksjon.Transferaser Overføring av funksjonelle grupper.Hydrolaser Hydrolyse.Lyaser Bryting av bindinger ved andre metoder

enn oksidasjon og hydrolyse.Isomeraser Interne omdannelser i et molekyl (isomeri-

sering).Ligaser Danner kovalente bindinger mellom to mo-

lekyler med forbruk av ATP.

56

12.5 Kinetikk i enzymatiske reaksjoner

De fleste enzymkatalyserte reaksjoner kan beskrives ved Michaelis-Menten-kinetikk.Det tas utgangspunkt i reaksjonen

E + SkA−−⇀↽−−k′A

ESkB−→ E + P

der E er enzymet, S substratet og P produktet. Hastighetskonstantene forreaksonene er angitt ved reaksjonspilene. Hastigheten til reaksjonen beskrives ma-tematisk av Michaelis-Menten-ligningen:

V =Vmax[S]

Km + [S](1)

der Vmax er reaksjonens maksimale hastighet, [S] substratkonsentrasjonen ogKm Michaelis-konstanten definert ved

Km =k′A + kBkA

(2)

Km har tolkning som en substratkonsentrasjon og ved innsetting i ligning (1)ser vi at dette er konsentrasjonen når, V = 1

2Vmax, altså når reaksjonen går ved

halvparten av maksimal hastighet. Dette er et mål på substratets affinitet forenzymet. En liten Km indikerer høy affinitet ettersom reaksjonshastigheten vil gåmot Vmax raskere enn for en høyere Km.

Figur 37: Michaelis-Menten-kurve for en irreversibel enzymreaksjon.

57

13 Metabolisme

13.1 ATP og elektronbærere

ATP (adenosintrifosfat) er en multifunksjonell nukleotid som fungerer som et ko-enzym i celler. Molekylet består av en adeninbase koblet til 1’-karbonet i et ribose-molekyl (en adenosin-nukleosid) og tre fosfatgrupper festet til ribosens 5’-karbon.Det har i oppgave å transportere kjemisk energi som forbrukes i den cellulæremetabolismen, og denne energien finnes lagret i fosfoanhydrid-bindingene mellomfosfatene. Ved hydrolytisk avspalting av det terminale fosfatet avtar den indreelektrostatiske repulsjonen i molekylet slik at energi frigjøres. Fosfatet som frigjø-res stabiliseres dessuten ved dannelsen av resonansstrukturer som ikke er muligei ATP og det andre produktet fra hydrolysen, ADP 2 – , ioniseres umiddelbart tilADP 2 – med frigjørelse av H+. Konsentrasjonen av begge produkter ligger langtunder likevektskonsentrasjonene slik at avspaltingen blir ytterligere termodyna-misk favorisert. Endringen i Gibbs’ energi (∆G) for reaksjonen er -30,5 kJ/molved standard forhold, men dette tallet vil være langt høyere i en levende celle (om-trent -52 kJ/mol). Dette skyldes likevektsforholdene (med konsentrasjoner somligger langt under standardtilstandens 1,0 M) samt at både ATP og det hydroly-serte produktet ADP (adenosindifosfat) som regel vil forekomme bundet til Mg 2+

i cytolsolen, noe som delvis avlaster de frastøtende kreftene mellom fosfatene.

(a) ATP (b) NAD+ (c) FAD

Figur 38: Struktur hos ATP, NAD+ og FAD.

Elektronbærere som NADH, NADPH og FADH2 er koenzymer som bidrar iredoksreaksjoner som er viktige for metabolismen. Funksjonen ligger i navnet:de frakter elektroner fra én reaksjon til en annen og forekommer i redusert elleroksidert form. Forbindelsene som er nevnt her svarer til de oksiderte utgaveneNAD+, NADP+ og FAD. Oksidasjon av reduserte elektronbærere er blant an-net den drivende kraften bak ATP-produksjon i elektrontransportkjeden. Selv om

58

elektronoverføring er den viktigste funksjonen til slike forbindelser, har de også av-gjørende betydning for andre cellulære prosesser, særlig som substrat for enzymersom tilføyer eller fjerner funksjonelle grupper fra proteiner under posttranslatoriskmodifikasjon. Til tross for det enorme antallet enzymer som inngår i en levendecelle, skjer elektronoverføring i enzymatiske reaksjoner ved hjelp av en håndfullelektronbærere, først og fremst de som er nevnt her.

13.2 Anabolisme og katabolisme

Metabolisme betegner de kjemiske reaksjonene i levende organismer som er nød-vendige for å opprettholde liv. Katabolisme er nedbryting av stoffer for å henteut energi, mens anabolisme er bruk av energi for å bygge opp cellekomponenter. Ikatabolismen brytes organiske næringsmolekyler (karbohydrater, fett og protein)ned til mindre og enklere sluttprodukter som melkesyre, CO2 eller NH3 og denfrigjorte energien som ikke går bort i varmetap konserveres i ATP eller reduserteelektronbærere (NADH, NADPH og FADH2). Anabolisme kalles også biosynteseog innebærer oppbygning av større, mer komplekse molekyler som lipider, polysak-karider, proteiner og nukleinsyrer fra mindre og enklere forløpere som aminosyrer,sukker, fettsyrer og nitrogenbaser. Energien fra anabolismen forsyner katabolismenmed energi i form av overføringspotensialet til fosfatgruppen i ATP eller reduk-sjonsevnen til de reduserte elektronbærerne.

13.3 Sentrale metabolske prosesser

To av de viktigste prosessene i forbindelse med metabolisme er glykolysen og sitron-syresyklusen, hvor store mengder energibærende molekyler, i all hovedsak ATP,NADH og FADH2, produseres ved nedbryting av glukose eller et annet sukker.Det kommer mest NADH og NADH2 direkte ut fra prosessene, men disse for-bindelsene kan videre fungere som elektrondonorer i elektrontransportkjeden medpåfølgende syntese av ATP, noe som resultererer i et netto energiutbytte for de toprosessene tilsvarende 30-32 ATP-molekyler for hvert eneste glukosemolekyl somgår inn i glykolysen. 7-10 av disse ATP-molekylene kommer fra glykolysen og res-ten fra sitronsyresyklusen. Dersom det ikke tas hensyn til ATP-produksjon somgår via elektrontransportkjeden, gir de to prosessene en netto ATP-produksjon påbare fire molekyler, hvorav to kommer fra glykolysen (som produserer fire, menogså forbruker to innledningsvis) og to fra sitronsyresyklusen. De resterende 26-28ATP-molekylene produseres alle via reduserte elektronbærere i elektrontransport-kjeden.

Enkelte organismer har kun glykolyse, mens andre også har sitronsyresyklus.Dette avhenger av organismens evne til å nyttiggjøre seg av atmosfærisk oksygen.Glykolysen krever ikke oksygen og er derfor vanlig både hos aerobe og anaerobe

59

organismer, mens sitronsyresyklusen bare finnes hos aerobe organismer. Ettersomsitronsyresyklusen gir et mye større ATP-utbytte enn glykolysen, er organismermed sitronsyresyklus i stand til å utnytte tilgjengelig sukker langt bedre enn or-ganismer som kun har glykolyse.

13.3.1 Glykolysen

I glykolysen konverteres glukose, C6H12O6, til pyruvat, CH3COCOOH. Prosessenfinnes i nesten alle organismer og har som funksjon å frigjøre energi som kan brukestil å danne høyenergiforbindelsene ATP og NADH. Den består av ti sekvensiellereaksjoner med ti tilhørende intermediater som fungerer som inngangsporter; defleste monosakkarider vil for eksempel kunne konverteres til ett av disse inter-mediatene og dermed også kunne konverteres til pyruvat. Glykolysen utvinnerkun en liten andel av den totale energien som er lagret i hvert glukosemolekyl ogmesteparten av den kjemiske potensielle energien vil følgelig være med videre ipyruvatmolekylene som dannes. Det følger at pyruvat kan brytes ned ytterligereog gi større energiutbytte, noe som skjer ved oksidasjon i sitronsyresyklusen.

13.3.2 Sitronsyresyklusen

Sluttproduktet pyruvat fra glykolysen kan degraderes videre til CO2 i sitronsyre-syklusen, også kalt Krebs-syklusen. Dette er en syklisk prosess som starter medat pyruvat fra glykolysen konverteres til acetylert koenzym A (acetyl-CoA) somderetter gjennomgår en serie enzymkatalyserte reaksjoner. Mange av stegene i syk-lusen involverer oksidasjon med frigjøring av energirike elektroner som redusererNAD+ til NADH og FAD til FADH2. Disse vil blant annet forbrukes i elektron-transportkjeden og gi produksjon av ATP. Prosessen involverer en rekke enzymermed evne til å utføre de energioverførende reaksjonene. Sitronsyresyklusen er av-gjørende for metabolismen i levende celler og er tett koblet til mange biosyntetiskeprosesser, blant annet aminosyresyntese. Den er dermed også en forutsetning forproteinsyntese.

13.3.3 Elektrontransportkjeden

Elektrontransportkjeden er en prosess hvor oksidasjon av reduserte elektronbærerebrukes til å drive syntese av ATP. Elektronbærerne (for eksempel NADH ellerNADH2) avgir elektroner til en elektronakseptor (for eksempel O2) og H+-ionenesom avgis i reaksjonen overføres gjennom en membran. Dette gir en elektrokjemiskprotongradient som brukes til å drive dannelsen av ATP ved fosforylering av ADP(adenosindifosfat).

60

Figur 39: Oversikt over glykolysen.

61

Figur 40: Oversikt over sitronsyresyklusen.

62

14 Membrantransport og signaltransduksjonCellemembranen er en plasmamembran som omgir cellenes cytoplasma slik at detindre av cellene separeres fra omgivelsene. Den har i oppgave å regulere transportav molekyler og ioner inn og ut av cellen og kalles også cytoplasmisk membran. Ieukaryoter er også cellekjernen og organellene omgitt av membraner. Som nevnt iavsnittet om lipider på side 18, består slike membraner hovedsaklig av et semiper-meabelt dobbeltlag av fosfolipider (phospholipid bilayer) hvor de polare, hydrofilehodene peker utover mot de vandige omgivelsene på inn- og utsiden av cellen og deupolare, hydrofobe halene peker innover mot hverandre. Kolesterol på overflatenav fosfolipidlaget stabiliserer membranen og senker dens permeabilitet.

Figur 41: En membran bestående av et semipermeabelt dobbeltlag av fosfolipider.

At plasmamembranen er semipermeabel innebærer at enkelte molekyler og io-ner kan passere gjennom den mens andre er avhengige av å transporteres. Genereltkan membranen passeres enten ved passiv transport eller ved aktiv transport. Nårstørre mengder partikler eller makromolekyler skal transporteres inn eller ut av encelle benyttes henholdsvis endocytose eller eksocytose. Partiklene innkapsles da ien vakuole av fosfolipider før de fraktes gjennom cellemembranen.

14.1 Membranproteiner

Membranene til ulike celler og organeller har alle unike samlinger av proteinersom er avgjørende for hvordan de fungerer. Proteiner som er permanent integrert imembranen kalles integrale membranproteiner, mens proteiner som er midlertidigfestet til fosfolipidlaget eller integrale proteiner kalles periferale membranprotei-ner. Proteinene i membranene fasiliterer alle membrantransport eller intercellulærkommunikasjon og kan deles inn i følgende kategorier:

• Kanalproteiner strekker seg tvers gjennom membranen og har en kanalaktigstruktur som tillater transport av molekyler og ioner. Disse proteinene kal-

63

les gjerne porer eller kanaler. Et kanalprotein som utnytter elektrokjemiskegradienter til ionetransport kalles en ionekanal.

• Transportproteiner (carrier proteins) binder seg til molekyler eller ioner ogsørger for å frakte dem gjennom membranen. Transportproteinene er selekti-ve når det gjelder binding. Ionoforer er transportmolekyler som frakter ionermed deres elektrokjemiske gradient.

• Cellegjenkjennende proteiner er glykoproteiner som blant annet hjelper tilmed å identifisere inntrengere slik at immunsystemet kan respondere.

• Reseptorproteiner har bindingsseter for spesifikke molekyler. Når molekyletsom passer binder seg til setet induseres konformasjonsendringer i proteinetsom videre gir cellulær respons. Reseptorproteiner er avgjørende for intercel-lulær kommunikasjon. Leveren i menneskekroppen er for eksempel avhengigav hormonet insuling for at lagring av glukose skal igangsettes.

• Enzymer i plasmamembranen utfører metabolske reaksjoner direkte.

• Cellekontaktproteiner assisterer celle-til-celle-kommunikasjon ved å danne fy-sisk kontakt mellom to celler.

14.2 Passiv transport

Små, upolare molekyler som oksygen, karbondioksid og glyserol kan passere mel-lom fosfolipidmolekylene i plasmamembraner og kan dermed bevege seg fritt innog ut av en celle. Dette skjer ved passiv diffusjon som drives av potensialgradientermellom inn- og usiden av membranen. Prosessen krever ikke tilført energi. Dersomet kanalprotein er involvert og energitilførsel ikke er nødvendig ved transporte-ring kalles prosessen fasilitert diffusjon. Fasilitert diffusjon tillater gjerne raskereetablering av likevekt enn passiv diffusjon.

14.3 Aktiv transport

Aktiv transport krever energi og innebærer proteinassistert transport mot en po-tensialgradient. Ved primær aktiv transport kommer denne energien som regel fraATP og brukes direkte til å drive transporten. Ved sekundær aktiv transport drivestransporten av et molekyl av energien som frigjøres når ioner beveger seg med sinelektrokjemiske gradient. Proteiner som er involvert i aktiv transport kalles oftepumper, ettersom et arbeid må utføres for at prosessen skal kunne gå. Et eksem-pel på aktiv transport er den fullstendige absorpsjonen av glukose fra mat i detmenneskelige fordøyelsessystemet.

64

Figur 42: Oversikt over ulike typer membrantransport.

65

14.4 Signaltransduksjon

Signaltransduksjon er prosessen hvor ekstracellulære sigalmolekyler aktiverer mem-branreseptorer som videre induserer intracellulær respons. Dette skjer i to trinn:Først bindes et signalmolekyl til sin spesifikke reseptor. Deretter fører et andresignalmolekyl på innsiden av cellen beskjeden videre slik at cellen kan responde-re. Ett signalmolekyl kan forårsake mange reaksjoner og signalet vil derfor kunneamplifiseres i begge trinn.

Del I

Rekombinant DNA-teknologiI delen om mutasjon og rekombinasjon i DNA på side 52 ble genetisk rekombinasjondefinert som ”utveksling av genetisk informason mellom to ulike DNA-molekylereller mellom forskjellige deler av samme DNA-molekyl“. Dette kan skje naturlig,for eksempel ved meiose, eller ved bruk av menneskelig teknologi. I rekombinantDNA-teknologi (ofte kalt “genetic engineering”) settes genetisk materiale fra ulikekilder sammen slik at sekvenser som ellers ikke ville forekommet i biologiske orga-nismer oppstår. Disse sekvensene kalles rekombinant DNA (rDNA) og kan innføresi levende celler. Rekombinant DNA-teknologi muliggjøres av at alle organismer harsamme DNA-struktur og dermed bare skilles fra hverandre ved rekkefølgen til nuk-leotidene. DNA-sekvensene som brukes til å danne rekombinante DNA-molekylerkan dermed komme fra hvilke organismer som helst; plante-DNA kan for eksem-pel slås sammen med viralt DNA, eller menneskelig DNA kan innføres i sopp.Det er dessuten mulig å syntetisere DNA-molekyler fra bunnen og eksempelvis in-korporere disse i rekombinante DNA-molekyler sammen med naturlige sekvenser.Teknologien tillater med andre ord dannelsen av en hvilken som helst DNA-sekvenssamt innføring av denne i en lang rekke levende organismer. De to mest sentralebioteknologiske metodene innenfor rekombinant DNA-teknologi er DNA-kloningog PCR (polymerase chain reaction) som begge tillater amplifisering av utvalgteDNA-sekvenser.

15 Escherichia coliE. coli er en Gram-negativ, stavformet bakterie som vanligvis forekommer i tarm-systemet hos varmblodige organismer som mennesker. Den har blitt kultivert ilaboratorier i lang tid, er enkel å manipulere og er en av de mest studerte proka-ryote modellorganismene. Bruk av E. coli har mange fordeler: man har stor innsikt

66

i de biologiske prosessene som foregår i bakterien, mange naturlig forekommendekloningsvektorer assosiert med E. coli er grundig karakterisert, og det finnes ef-fektive teknikker for å flytte DNA mellom ulike E. coli -celler. Bruk av plasmiderog restriksjonsenzymer til å danne rekombinant DNA er en av bioteknologiensgrunnstener og ble først utført i E. coli. Bakterien er sentral både innenfor bio-teknologi og industriell mikrobiologi. Teknologien som presenteres i dette kapitletbaserer seg i hovedsak på E. coli, men prinsippene kan i stor grad overføres tilandre organismer.

16 DNA-kloningEn klone er en identisk kopi. Ved kloning av DNA tas et DNA-fragment ut av sinopprinnelige kontekst og oppformeres i en annen organisme. Dette fragmentet kanvære et spesifikt gen eller en annen DNA-sekvens fra et større kromosom. Sekven-sen separeres og innføres i et lite DNA-molekyl (en kloningsvektor) som derettersettes inn i en vertscelle. Der replikeres DNA-molekylet tusener eller millioner avganger, både ved økning av antall vertsceller og ved at det dannes flere kopier avdet klonede DNAet i hver celle. Resultatet er selektiv amplifisering av den utvalgteDNA-sekvensen. DNA-kloning kan oppsummeres i fem trinn:

1. Separasjon av ønsket DNA-sekvens. DNA kuttes i bestemte posisjoner avsekvensspesifikke restriksjons-endonukleaser.

2. DNA innføres i en kloningsvektor. DNA sekvensen settes inn i en klonings-vektor, et lite DNA-molekyl med evne til å replikere seg selv. Disse er typiskplasmider eller virus-DNA.

3. Sammenslåing av DNA-fragmenter. DNA-sekvensen som skal klones bindeskovalent til kloningsvektoren ved hjelp av DNA ligase. Resultatet er et re-kombinant DNA-molekyl.

4. Innføring i vertscelle. Det rekombinante DNA-molekylet flyttes fra reagens-røret til en vert som inneholder det enzymatiske maskineriet som er nødven-dig for replikasjon.

5. Identifisering og selektering. Kopier av det reellene som inneholder den øns-kede DNA-sekvensen skilles fra de som ikke gjør det.

16.1 Kløyving og sammenkobling av DNA-fragmenter

To typer enzymer er særlig viktige innen rekombinant DNA-teknologi: restriksjons-enzymer (restriksjons-endonukleaser) og DNA ligaser. Kombinasjonen av disse en-zymene tillater generering og forplantning av rekombinante DNA-molekyler.

67

16.1.1 Restriksjonsenzymer

Restriksjonsenzymer gjenkjenner og kløyver DNA ved spesifikke sekvenser (restrik-sjonsseter) slik at et DNA-molekyl kan deles opp i et sett av mindre fragmenter,mens DNA ligase sørger for å feste slike DNA-fragmenter sammen. Tusener avulike restriksjonsenzymer har blitt funnet i ulike bakterier og disse gjenkjenner tilsammen mer enn 100 ulike DNA-sekvenser. Sekvensene som gjenkjennes er somregel 4-6 bp lange palindromer, DNA-sekvenser som er like uansett hvilken trådsom avleses. Dette er illustrert i Figur ??. De fleste palindromer gjenkjennes avett eller flere restriksjonsenzymer.

Mange restriksjonsenzymer kutter restriksjonssetet slik at to til fire uparedenukleotider stikker ut på hver av de to nye endene som oppstår ved kutting. Dissekalles sticky ends fordi de kan basepare med hverandre eller komplementære stickyends fra andre DNA-fragmenter. Det er sticky ends som muliggjør dannelsen avrekombinant DNA. Dersom restriksjonsenzymet kutter fosfodiesterbindingene somstår rett ovenfor hverandre i de to trådene vil det ikke oppstå sticky ends i proses-sen. Disse endene kalles blunt ends og vil ikke være i stand til å gå like effektivtsammen med andre DNA-fragmenter som sticky ends.

Den gjennomsnittlige størrelsen til DNA-fragmentene som oppstår ved kløyvingmed restiksjonsenzymer avhenger naturligvis av frekvensen til restriksjonssetet idet opprinnelige DNA-molekylet. Denne frekvensen vil videre avhenge av lengdenpå sekvensen som gjenkjennes; jo lengre sekvens jo lavere sannsynlighet for at denforekommer. For en sekvens bestående av seks basepar vil for eksempel gjennom-snittlig avstand mellom hver sekvens være 46 = 4096 bp dersom det antas tilfeldigrekkefølge og lik fordeling mellom basene. For en 4 bp lang sekvens vil den til-svarende avstanden være 44 = 256 bp. Dette stemmer imidlertid ikke helt overensmed virkeligheten, da ingen naturlig forekommende DNA-molekyler kan sies å hatilfeldig fordelte baser eller lik forekomst av dem. Enkelte sekvenser opptrer hyppi-gere enn andre. Dersom det er ønskelig å øke størrelsen på DNA-fragmentene somproduseres av et restriksjonsenzm, kan dette ganske enkelt reguleres i laboratorietved å avbryte reaksjonen før den er fullført (“partial digestion”). En spesiell klasseendonukleaser kalt “homing endonucleases” kan også benyttes. Disse gjenkjennerog kløyver 14-20 bp lange DNA-sekvenser og vil følgelig gi større fragmenter.

16.1.2 DNA ligase

Etter at de ønskede fragmentene er isolert (se neste del) kan DNA ligase benyttestil å feste disse sammen med kloningsvektorer som er kuttet med samme restrik-sjonsenzym. DNA ligase katalyserer dannelsen av nye fosfodiesterbindinger mellomnukleotidene i en prosess som forbruker ATP eller et lignende koenzym. Basepa-ring mellom komplementære sticky ends fasiliterer ligeringsreaksjonen i stor grad.

68

Blunt ends vil også kunne ligeres, men langt mindre effektivt. Det er også muligå inkorporere syntetiske fragmenter mellom endene som ligeres. Disse inneholdergjerne flere ulike restriksjonsseter som tillater innsetting av DNA på ulike steder imolekylet ved et senere tidspunkt. Slike fragmenter kalles linkers eller polylinkersdersom de inneholder flere restriksjonsseter.

16.2 Isolering og karakterisering av DNA-fragmenter

Resultatet etter kløyving er en samling DNA-fragmenter med ulike størrelser. Etfragment med en bestemt størrelse kan da isoleres ved bruk av agarose- ellerakrylamid-gel-elektroforese. Elektroforese er en viktig teknikk som brukes for åseparere proteiner, DNA-fragmenter eller lignende etter størrelse og ladning. Se-parasjonen utføres i en gel av agarose eller polyakrylamid som fungerer som etmolekylært filter. Når gelen påføres et elektrisk felt, vil molekylene som analyse-res bevege seg nedover gjennom den og denne bevegelsen vil motarbeides omtrentproporsjonalt med forholdet mellom ladning og masse. Dette tillater rask estime-ring av antall ulike molekyler i en prøve og kan brukes til å kartlegge egenskapersom molekylær vekt eller isoelektrisk punkt hos proteiner. En annen teknikk somkan benyttes til isolering av DNA-fragmenter er HPLC (high- performance liquidcromatography). Gel-elektroforese eller HPLC vil ofte være tilstrekkelig dersomman arbeider med prokaryoter eller enkle eukaryoter, men for mammalske cellervil det oppstå for mange ulike DNA-fragmenter med lignende størrelser til at deter praktisk å isolere et spesifikt fragment på denne måten.

Et annet vanlig trinn på dette stadiet i DNA-kloning er å opprette et DNA-bibliotek. Biblioteket fylles med sekvensinformasjon fra alle de rekombinante DNA-molekylene som dannes ved blanding av DNA-molekyler med et bestemt genomog vektorer som alle er behandlet med samme restriksjonsenzym. Mer om dettefinnes i avsnittet om genomics på side 72.

16.3 Vektorer

En vektor er noe som brukes til å frakte fremmed genetisk materiale inn i en celle.De tre viktigste typene vektorer er plasmider, bakteriofager og kunstige bakteriellekromosomer. Felles for alle vektorer som benyttes er at de inneholder et origo forreplikasjon, en polylinker med mange ulike restriksjonsseter og en seleksjonsmarkørsom gjør det mulig å selektere for celler som inneholder vektoren. Formålet med åsette en vektor inn i en celle er som regel å isolere, amplifisere eller uttrykke DNA-sekvensen som er innsatt i vektoren. Ekspresjonsvektorer er spesifikt konstruert foruttrykking (ekspresjon) av et gen som settes inn i vektoren (et transgen) og vil der-for som regel ha en promotorsekvens som driver denne uttrykkingen. Slike vektorer

69

tillater altså produksjon av proteiner. For ekspresjon i eukaryoter må ekspresjons-vektorer også inneholde sekvenser som koder for polyadenylering av mRNA, minstmulig UTR-lengde samt en sekvens som samler de ribosomale underenhetene vedtranslasjon. Enklere vektorer kalt transkripsjonsvektorer er bare i stand til å blitranskribert, ikke til å bli translatert. De kan med andre ord replikeres, men ikkeuttrykkes og brukes til å amplifisere det innsatte DNA-fragmentet.

16.3.1 Metoder for innføring av DNA i levende celler

DNA kan innføres i levende celler på følgende måter:

1. Transformasjon/transfeksjon. “Nakent” eller kunstig pakket DNA tas direkteopp av en celle. Dette kalles typisk transformasjon i bakterier og transfeksjoni eukaryoter. Celler kan være naturlig kompetente for DNA-opptak eller gjøreskompetente. Dersom vertscellene ikke er naturlig kompetente (dette gjelderfor eksempel E. coli), plasseres de sammen med plasmidene som skal innfø-res i en kalsiumkloridløsning ved 0 ◦C og utsettes deretter for et sjokk vedat temperaturen økes til omtrent 40 ◦C. Av grunner som ikke er fullstendigforstått vil dette føre til at enkelte celler tar opp plasmider fra omgivelse-ne. Transformasjon/transfeksjon er den vanligste metoden for innføring avfremmed DNA innen bioteknologi, men fungerer ikke særlig godt for storeplasmider (>15.000 bp).

2. Transduksjon. Virale vektorer overfører DNA til vertsceller ved transduk-sjon. Rekombinant DNA inkorporeres i arvestoffet til bakteriofager og dissesørger for å sprøyte DNAet videre inn i en vertscelle. Omtrent en tredel avarvestoffet til en bakteriofag er ikke-essensielt slik at det kan erstattes medfremmed DNA. DNA må dessuten ha en lengde på 40.000-53.000 bp for åkunne pakkes i bakteriofagen, og denne begrensningen gjør det mulig å sikreat kun DNA som inneholder ønskede sekvenser blir pakket (begrensningenselekterer for rekombinant viralt DNA). Transduksjon er svært effektivt ogmuliggjør overføring av store DNA-fragmenter.

3. Konjugasjon er overføring av DNA mellom bakterieceller ved direkte celle-til-celle-kontakt.

16.3.2 Plasmider

Plasmider er DNA-molekyler som befinner seg utenfor vertskromosomet (er eks-trakromosomale) og er i stand til å replikere seg selv (er autonomt replikerende).Naturlig forekommende bakterielle plasmider er nesten alltid sirkulære og varie-rer i størrelse mellom 5.000 og 400.000 bp. Så godt som alle bakterier inneholder

70

plasmider og nesten alle kjente plasmider er bakterielle. Hvert enkelt plasmid haret fast kopitall som angir det gjennomsnittlige antallet kopier av plasmidet somvil forekomme i en vertscelle. Kopitallet kan variere mellom omtrent 1 og 100 oger en egenskap som er svært nyttig innen bioteknologien. Dersom et stort antallplasmider er ønskelig på kortest mulig tid (slik det ofte vil være), vil det naturligvislønne seg å bruke et plasmid med høyt kopitall.

Plasmider inkorporeres i vertsceller ved transformasjon, noe som ikke er særligeffektivt uansett hvilken metode som brukes (behandling med kalsiumklorid ogtemperatursjokk eller elektroporering). Det er derfor nødvendig med en metodesom gjør det mulig å skille celler som har tatt opp plasmid fra de som ikke har det,altså som tillater selektering for vertsceller med plasmid. Dette oppnås vanligvisved å bruke et plasmid som inneholder et gen som vertscellen er avhengig av forå vokse under spesifikke forhold, typisk et gen som koder for antibiotikaresistens.Dette vil medføre at kun celler som inneholder plasmidet vil vokse når antibiotikaer til stede og dermed gjøre det enkelt å selektere.

Svært mange plasmider som er velegnede for kloning er utviklet ved modi-fikasjon av naturlig forekommende plasmider. Det “klassiske” E. coli -plasmidetpBR322 eksemplifiserer godt hvilke egenskaper som er særlig nyttige i en klonings-vektor:

• Origo for replikasjon (ori) er nødvendig for at plasmidet skal kunne replikereseg selv.

• To gener som koder for antibiotikaresistens. Det ene genet koder for resis-tens mot tetrasyklin, det andre mot ampicillin. Dette gjør det mulig å skillemellom celler som inneholder de opprinnelige plasmidene og celler som inne-holder rekombinante plasmider, da det innførte DNA-fragmentet går inn ien posisjon som splitter genet for ampicillin-resistens.

• Flere unike restriksjonsseter. Disse kan kløyves av ulike restriksjonsenzymerslik at nye DNA-fragmenter kan innføres på et senere tidspunkt.

• Liten størrelse (4.361 bp) fasiliterer transformasjon. Det blir med andre ordlettere for plasmidet å komme inn i vertscellen.

Et eksempel på innføring av fremmed DNA i pBR322-plasmider er vist i Fi-gur ??.

16.4 Hybridisering

Hybridisering er den vanligste sekvensbaserte prosessen for lokalisering av av etspesifikt gen eller andre DNA-fragmenter. Metoden innebærer bruk av en probe,

71

et DNA- eller RNA-fragment (oligonukleotid) av varierende lengde (vanligvis 100-1.000 baser) som er komplementær til sekvensen som skal lokaliseres og er markertslik at den lett kan skilles fra det øvrige DNAet i en prøve. Det finnes mange va-riasjoner av metoden. I én fremgangsmåte tas et nitrocellulosepapir-avtrykk av enblanding av DNA-fragmenter i en agarskål slik at noen celler fra hver koloni blirmed over på papiret. Deretter behandes papiret med en base slik at cellene øde-legges og DNA-molekylene denatureres. Når en probe med radioaktiv markeringtilføres, vil denne binde seg til sin komplementære sekvens slik at kolonier av cellersom inneholder det ønskede DNA-fragmentet lett kan identifseres.

72

16.5 Polymerase chain reaction (PCR)

17 Genomics

18 Proteinproduksjon/“Protein engineering”

19 Produksjon av andre biokjemikalier

20 Miljøbioteknologi

Del II

Praktiske problemstilinger21 Proteinproduksjon fra genet ORF1 i E.coli

22 Framstilling av succinat

23 Produksjon av marint fett uten fangst av vill-fisk

Del III

Etiske problemstillinger24 Gentesting

25 Fosterdiagnostikk

26 Genmodifisert mat

27 Kloning

28 Transgene dyr og planter

73

Register

Bioteknologi, 3

74