Embed Size (px)
Citation preview
Pojavnost viroza u autohtonim kultivarima vinoveloze u hercegovačkomu vinogorju
Karačić, Ana
Doctoral thesis / Disertacija
2015
Degree Grantor / Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: University of Zagreb, Faculty of Agriculture / Sveučilište u Zagrebu, Agronomski fakultet
Permanent link / Trajna poveznica: https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:204:792684
Rights / Prava: In copyright
Download date / Datum preuzimanja: 2021-10-03
Repository / Repozitorij:
Repository Faculty of Agriculture University of Zagreb
AGRONOMSKI FAKULTET
Ana Karačić
Pojavnost viroza u autohtonim kultivarima
vinove loze u hercegovačkomu vinogorju
DOKTORSKI RAD
Zagreb, 2015.
FACULTY OF AGRICULTURE
Ana Karačić
Incidence of viroses in autochthonous grapevine
cultivars in Herzegovina vineyards
DOCTORAL THESIS
Zagreb, 2015.
AGRONOMSKI FAKULTET
Ana Karačić
Pojavnost viroza u autohtonim kultivarima
vinove loze u hercegovačkomu vinogorju
DOKTORSKI RAD
Mentor: izv. prof. dr. sc. Edyta Đermić
Zagreb, 2015.
FACULTY OF AGRICULTURE
Ana Karačić
Incidence of viroses in autochthonous grapevine
cultivars in Herzegovina vineyards
DOCTORAL THESIS
Supervisor: Ph.D. Edyta Đermić, Associate Professor
Zagreb, 2015.
i
Mentorica: izv. prof. dr. sc. Edyta Đermić Datum i mjesto rođenja: 19. srpnja 1972., Bjelovar, Hrvatska
Matični broj znanstvenika: 225544
2013. Izvanredna profesorica Sveučilište u Zagrebu, Agronomski fakultet (znanstveno
područje – Biotehničke znanosti, polje – Poljoprivreda, grana – Fitomedicina).
2009. – 2015. Predstojnica Zavoda za fitopatologiju, Sveučilište u Zagrebu, Agronomski
fakultet.
2008. Docentica, Sveučilište u Zagrebu Agronomski fakultet.
2007. Doktorica znanosti – Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu (znanstveno područje
– Biotehničke znanosti, polje – Poljoprivreda, grana – Fitomedicina).
2002. Magistrica znanosti – Sveučilišni znanstveni poslijediplomski studij na Agronomskom
fakultetu Sveučilišta u Zagrebu (znanstveno područje – Biotehničke znanosti, polje –
Poljoprivreda, grana – Fitomedicina)
Od 1997. sudjelovanje u izvođenju nastave (dodiplomski, preddiplomski, diplomski i
poslijediplomski studiji na Sveučilište u Zagrebu Agronomskom fakultetu).
1997. Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta u Zagrebu, studij Biologije (inženjerski
profil, usmjerenje – Molekularna biologija)
Mentorstva: 1 doktorski rad; 15 diplomskih radova; član povjerenstva u obrani više završnih
i diplomskih radova; član povjerenstva pri obrani jednoga doktorskog rada i četiri
povjerenstva za ocjenu tema doktorskih radova; voditeljica više studentskih stručnih projekata
Znanstveni interesi: Istraživanje bakterijskih, virusnih i subvirusnih patogena biljaka te
genomika eukariotskih, prokariotskih i acelularnih bioloških entiteta.
Projekti: “Science and Innovation Investment Fund TT-IPM FoAZ–Enhancement and
collaboration between science, industry and farmers: Technology transfer for integrated pest
management (IPM) in sugarbeet as the way to improve farmer’s income and reduce pesticide
use” IPAIIIc-EU; “International joint Master degree in Plant Medicine” TEMPUS-EU;
"Identifikacija fitopatogena molekularnim i drugim metodama" MZOŠ RH; „Gospodarske
karakteristike nekih kultivara jabuke otpornih na bakterijsku palež (Erwinia amylovora)" VIP-
Ministarstvo poljoprivrede, šumarstva i vodnog gospodarstva RH, itd.
Skupovi: međunarodni (15) i nacionalni (17) znanstveni i stručni skupovi u RH i inozemstvu
Radovi: znanstveni i stručni (13 CC, 1 SCI, 8 CAB Abstracts).
Članstva: Hrvatsko društvo za biokemiju i molekularnu biologiju, Hrvatsko mikrobiološko
društvo, International working group on fire blight (IWGFB), International working group on
plant viruses with fungal vectors (IWGPVFV), American Phytopathological Society (APS).
ii
Ovu disertaciju ocijenilo je Povjerenstvo u sastavu:
1. Prof. dr. sc. Edi Maletić,
redoviti profesor Sveučilišta u Zagrebu, Agronomskoga fakulteta
2. Prof. dr.sc. Marko Ivanković,
redoviti profesor Sveučilišta u Mostaru, Agronomskoga i prehrambeno-tehnološkog
fakulteta
3. Izv. prof. dr. sc. Dijana Škorić,
izvanredni profesor Sveučilišta u Zagrebu, Prirodoslovno-matematičkoga fakulteta
4. Prof. dr. sc. Ivan Pejić,
redoviti profesor Sveučilišta u Zagrebu, Agronomskoga fakulteta
5. Prof. dr. sc. Mirna Ćurković-Perica,
redoviti profesor Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematičkog fakulteta
Disertacija je obranjena na Agronomskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu,
_______________________. pred povjerenstvom u sastavu:
1. Prof. dr. sc. Edi Maletić,_____________________________
redoviti profesor Sveučilišta u Zagrebu, Agronomskoga fakulteta
2. Prof. dr.sc. Marko Ivanković, _______________________
redoviti profesor Sveučilišta u Mostaru, Agronomskoga i prehrambeno-tehnološkog
fakulteta
3. Izv. prof. dr. sc. Dijana Škorić,____________________________
izvanredni profesor Sveučilišta u Zagrebu, Prirodoslovno-matematičkog fakulteta
4. Prof. dr. sc. Ivan Pejić,_____________________________
redoviti profesor Sveučilišta u Zagrebu, Agronomskoga fakulteta
5. Prof. dr. sc. Mirna Ćurković-Perica,___________________________
redoviti profesor Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematičkog fakulteta
iii
Ova doktorska disertacija izrađena je u Fitosanitarnom laboratoriju Federalnoga
agromediteranskog zavoda Mostar i laboratoriju Zavoda za fitopatologiju Agronomskoga
fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.
Veći dio kemikalija osigurao je Federalni agromediteranski zavoda Mostar, a jedan dio
bio je osiguran preko projekta Providing genetic diversity and healthy plants for the
horticulture in Bosnia and Herzegovina (HERD/Agriculture).
iv
ZAHVALE
Ovaj doktorski rad posvećujem svojim roditeljima. Od srca zahvaljujem mami i tati za
svu podršku i ljubav tijekom moga cijelog školovanja. Iz ove mi se perspektive čini
nemogućim vratiti vam makar i dio onoga što ste mi svo ovo vrijeme davali, ali ponizno
obećavam da ću se truditi. Uvijek ste bili i uvijek ćete biti dio mene.
Najljepše hvala mentorici izv. prof. dr. sc. Edyti Đermić na stručnoj pomoći i
angažmanu. Zahvaljujem na trudu voditeljima poslijediplomskog studija i svim ostalim
profesorima s Agronomskoga fakulteta koji su pomagali da bolje upoznamo ovaj studij i
savladamo potrebnu materiju.
Veliko hvala svim mojim prijateljima, prijateljicama, kolegama i kolegicama na
strpljivom odgovaranju i slušanju na moja mnogobrojna pitanja i dileme. Zahvaljujem od
srca: Darku Vončini, Slavici Matić, Antoneli Kozina, Ani Mandić, Adrijani Filipović, Mileni
Bulić, Mariji Miletić, Stanislavi Sušac i Krešimiru Lasiću na podršci te svima ostalima koji su
sudjelovali u tome.
Posebnu zahvalnost dugujem kolegama Mladenu Gašparu i Branku Rogiću na pomoći
pri prikupljanju uzoraka i stručnim savjetima.
Hvala za nesebičnost prof. dr. sc. Juri Belji.
Thanks a lot Miss Deborah Golino, PhD Director & Miss Lori Leong - Laboratory Manager
(Staff Research Associate), Lab Manager Foundation Plant Services UC Davis for positive
controls.
Kada ti život donese prijatelja koji zauzme ulogu sestre, a koju nemaš, onda kažeš:
Mone hvala ti. (U posljednje vrijeme ima novi nadimak K2.)
Hvala za ljubav, strpljenje, radost, brižnost i podršku obitelji Silvane i Lea Mandića.
Zahvaljujem svom poslodavcu Federalnom agromediteranskom zavodu Mostar koji je
financijski omogućio da upišem ovaj poslijediplomski studij. Također zahvaljujem na danom
povjerenju u stjecanju radnoga iskustva u raznim područjima fitomedicine (zaštite bilja), a
posebice virologije što mi je pomoglo da svoj rad povežem s ovim znanstvenim studijem i
svojim doktorskim radom. Posebno zahvaljujem direktoru FAZ-a Mostar, prof.dr.sc. Marku
Ivankoviću na iskazanom povjerenju.
I najveća hvala dragom Bogu na darovima koji su mi dani da ih mogu koristiti u
ovozemaljskom životu, koji su mi omogućili i to da studiram ovaj studij.
v
Loza i njene rozge
Ovdje je prisutan onaj
Koji po vjernom očitovanju reče
Az esam loza istinia a otac moj je vinogradar
I vsaku rozgu na meni a ploda ne da ja ću odsjeći
Al onu koja rađa da polje bude bolje
Da slađi dar i plod veći
Čistim
Vi već ste čisti slovom istim koje vam glagoljah
Bacite zato tvari svoje u oganj ovog plama
Budite tako u meni a ja ću svakako u vama
Kao u onim što sam od iskoni koje voljah
Az esam loza
A vi ste
Grozje
Ovdje je prisutan onaj
što spreman je uvijek na riječ i na djelo
Gdje riječ je od prijeka lijeka
A djelo kao vrelo
Gvozje
On čeka me od vijeka
On čeka i vidim ga zacijelo
I silazim k njemu
Kroz to bijelo
Lozje
Dizdar, Mehmedalija Mak
vi
TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA
Sveučilište u Zagrebu Agronomski fakultet
Poslijediplomski doktorski studij Poljoprivredne znanosti Doktorska disertacija
POJAVNOST VIROZA U AUTOHTONIM KULTIVARIMA VINOVE LOZE U
HERCEGOVAČKOM VINOGORJU
Ana Karačić
Federalni agromediteranski zavod Mostar
Biskupa Čule 10, Mostar
Vinova loza važna je kultura kojoj infektivne bolesti virusne prirode mogu drastično
skratiti razdoblje eksploatacije. Najvažnija je strateška metoda u kontroli virusnih bolesti
vinove loze preventiva i provodi se korištenjem certificirana sadnog materijala pri podizanju
novih vinograda. Da bi se uspješno kontroliralo rasprostranjivanje viroza, neophodno je
provođenje specifičnih i pouzdanih dijagnostičkih metoda: enzimski imunotest na čvrstoj fazi
(ELISA) i reverzna transkripcija uz lančanu reakciju polimeraze (RT-PCR). Primjenom
navedenih dijagnostičkih metoda na ukupno 1332 testiranih trsova dobiven je uvid u
pojavnost devet virusa na šest ekonomski najvažnijih autohtonih kultivara u hercegovačkim
vinogorjima. U šest autohtonih kultivara serološkim metodama detektirani su: Grapevine
leafroll-associated virus-3 (GLRaV-3) u 884 trsova (66,3 %), Grapevine fanleaf virus
(GFLV) u 500 trsova (37,5 %), Grapevine leafroll-associated virus-1 (GLRaV-1) u 293
trsova (22,0 %), Grapevine fleck virus (GFkV) u 197 trsova (14,7 %), Grapevine leafroll-
associated virus-4-9 (GLRaV-4-9) u 90 trsova (6,7 %), Arabis mosaic virus (ArMV) u 17
trsova (1,2 %), Grapevine leafroll-associated virus-2 (GLRaV-2) u 3 trsa (0,2 %), dok virusi:
Grapevine virus A (GVA) i Grapevine virus B (GVB) nisu detektirani. Od svih je testiranih
trsova, 1153 (86,5 %) uzoraka nosilo barem jedan virus, dok je 179 (13,4 %) uzorka bilo
zdravo, bez prisustva testiranih virusa. Zdravi trsovi predloženi su kao potencijalne biljke
kandidati za proizvodnju sadnoga materijala ‘testiranog na viruse’. Analizom rezultata
virusnih infekcija utvrđeno je da je 546 (40,9 %) uzoraka zaraženo samo s jednim virusom,
423 (31,7 %) s dva, 155 (11,6 %) s tri, 28 (2,1 %) s četiri, 3 (0,2 %) s pet što je ujedno i
najveći broj analizom utvrđenih kombinacija. Od 90 uzoraka koji su serološki bili pozitivni na
grupu virusa GLRaV-4-9 (GLRaV-4, -5, -6, -7, -9), izabrano je njih 27 kod kojih je metodom
RT-PCR i korištenjem para početnica utvrđena prisutnost GLRaV-5 kod šest uzoraka kao i
GLRaV-9 kod sedam uzoraka. Ostali virusi iz grupe GLRaV-4-9 nisu registrirani. Prisutnost
GLRaV-2 u uzorku, u kojem je metodom ELISA detektiran, uspješno je potvrđena primjenom
vii
metode RT-PCR uz korištenje GLR2CP1/GLR2CP2 para početnica. Tijekom dvije
vegetacijske sezone (2011/12 i 2012/13) vršeno je vizualno praćenje analiziranih trsova.
Dominantni simptomi na šest autohtonih kultivara bili su: zastoj u kretanju vegetacije,
skraćeni internodiji, različiti poremećaji u rastu i razvoju, uvijenost lišća, nejednolično
odrvenjavanje i dozrijevanje grozdova, rehuljavost. Prema raspoloživim saznanjima,
provedeno istraživanje predstavlja prvi nalaz GLRaV-2, GLRaV-5 i GLRaV-9 u Bosni i
Hercegovini potvrđen molekularnim metodama, dok GFkV, GLRaV-2 i grupa virusa
GLRaV-4-9 predstavlja prvi nalaz u Bosni i Hercegovini potvrđen serološkim metodama.
(157 stranica, 12 slika, 17 tablice, 213 literarnih navoda, 4 priloga, jezik izvornika: hrvatski)
Ključne riječi: vinova loza, autohtoni kultivari, detekcija, ELISA, RT-PCR.
Mentorica: izv. prof. dr. sc. Edyta Đermić
Stručno Povjerenstvo za ocjenu disertacije: prof. dr. sc. Edi Maletić, redoviti profesor
Sveučilišta u Zagrebu, Agronomskoga fakulteta; prof. dr.sc. Marko Ivanković, redoviti
profesor Sveučilišta u Mostaru, Agronomskoga i prehrambeno-tehnološkog fakulteta; izv.
prof. dr. sc. Dijana Škorić izvanredni profesor Sveučilišta u Zagrebu, Prirodoslovno-
matematičkog fakulteta; prof. dr. sc. Ivan Pejić, redoviti profesor Sveučilišta u Zagrebu,
Agronomskog fakulteta; prof. dr. sc. Mirna Ćurković-Perica redoviti profesor Sveučilišta u
Zagrebu, Prirodoslovno-matematičkoga fakulteta.
Rad je pohranjen u Centralnoj agronomskoj knjižnici na Sveučilištu u Zagrebu Agronomski
fakultet, Svetošimunska 25, Zagreb; Nacionalna i sveučilišnoj knjižnici u Zagrebu, Hrvatske
bratske zajednice b.b. i Sveučilištu u Zagrebu, Trg maršala Tita 14.
viii
BASIC DOCUMENTATION CARD
University of Zagreb Faculty of Agriculture
Postgraduate Doctoral studies in Agricultural Sciences Doctoral Thesis
INCIDENCE OF VIROSES IN AUTOCHTHONOUS GRAPEVINE CULTIVARS IN
HERZEGOVINA VINEYARDS
Ana Karačić
Federal agromediterranean institute of Mostar
Biskupa Čule 10, Mostar
Grapevine is an important species in which infectious diseases caused by viruses can
drastically reduce the period of exploitation. The most important control strategy of grapevine
viroses is prevention and consists of the use of certified planting materials in the
establishment of new vineyards. In order to successfully control the virus spread, the
implementation of specific and reliable diagnostic methods is essential: enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) and reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-
PCR). Using the above mentioned diagnostic techniques from the total number 1332
grapevine, an insight into the incidence of nine viruses in the six most important
autochthonous cultivars grown in Herzegovina was gained. In the six autochthonous cultivars,
using serological methods, the following viruses were detected: Grapevine leafroll-associated
virus-3 (GLRaV-3) - in 884 grapevines (66,3 %), Grapevine fanleaf virus (GFLV) - in 500
grapevines (37,5%), Grapevine leafroll-associated virus-1 (GLRaV-1) - in 293 grapevines
(22,0%), Grapevine fleck virus (GFkV) - in 197 grapevines (14,7 %), Grapevine leafroll-
associated virus-4-9 (GLRaV-4-9) - in 90 grapevines (6,7 %), Arabis mosaic virus (ArMV) -
in 17 grapevines (1,2%), Grapevine leafroll-associated virus-2 (GLRaV-2) - in 3 grapevines
(0,2 %), while viruses Grapevine virus A (GVA) and Grapevine virus B (GVB) were not
detected. Of all tested grapevines, 86,5 % specimens (1153 grapevines) had at least one virus,
while 13,4 % specimens (179 grapevines) was free of tested viruses. The virus-free
grapevines are proposed as a potential candidate plants for production of virus-tested planting
material. The analysis of results showed that 546 grapevines (40,9%) were infected by only
one virus, 423 (31,7 %) by two, 155 (11,6 %) by three, 28 (2,1 %) by four, 3 (0,2 %) by five,
which presented the highest number of viruses in mixed infections. From 90 specimens
positive on GLRaV-4-9 (GLRaV -4, -5, -6, -7, -9) viruses, 27 are chosen, and, by using RT-
PCR method employing pair of primers, the presence of GLRaV-5 in 6 specimens and
ix
GLRaV-9 in 7 specimens is detected. The other viruses belonging to GLRaV-4-9 group were
not detected. The presence of GLRaV-2 in ELISA positive specimen is successfully
confirmed using RT-PCR method with the use of GLR2CP1/ GLR2CP2 pair of primers.
During two vegetation seasons (2011/12, 2012/13) visual observation of analysed grapevines
was carried out. The dominant symptoms on 6 autochthonous cultivars: delayed start
vegetation., reduced internodes, different disturbances in growth and development, leafroll,
irregular lignification and ripening of grapes and, poor fruit set. According to our knowledge,
this is the first report of GLRaV-2, GLRaV-5 and GLRaV-9 in Bosnia and Herzegovina on
the genome (nucleic acids) based methods, and GFkV, GLRaV-2 and group of GLRaV-4-9
associated viruses on the basis of serological methods.
( 157 pages, 12 figures, 17 tables, 213 references, 4 attachments, original in Croatian)
Keywords: grapevine, autochthonous cultivars, detection, ELISA Enzyme Linked
Immunosorbent Assays , RT-PCR.
Supervisor: Ph.D. Edyta Đermić, Associate Professor
Reviewers: Ph.D. Edi Maletić, Full Professor, University of Zagreb Faculty of Agriculture;
Ph.D. Marko Ivanković, Full Professor, University of Mostar Faculty of Agriculture and Food
Technology; Ph.D. Dijana Škorić, Associate Professor, University of Zagreb Faculty of
Science; Ph.D. Ivan Pejić, Full Professor, University of Zagreb Faculty of Agriculture; Ph.D.
Mirna Ćurković-Perica, Full Professor, University of Zagreb Faculty of Science.
Thesis deposited in Central Agricultural Library at the University of Zagreb Faculty of
Agriculture, Svetošimunska 25, Zagreb; National and University Library, Hrvatske bratske
zajednice bb. and University of Zagreb, Trg maršala Tita 14, Zagreb.
x
Sadržaj
1. UVOD ................................................................................................................................................. 1
1.1. Ciljevi istraživanja ........................................................................................................................ 3
1.2. Hipoteza ....................................................................................................................................... 4
1.3. Znanstveni i praktični doprinos disertacije ................................................................................... 4
2. PREGLED LITERATURE ................................................................................................................. 5
2.1. Viroze vinove loze........................................................................................................................ 5
2.1.1. Rodovi Closterovirus i Ampelovirus ..................................................................................... 8
2.1.2. Rod Velarivirus ................................................................................................................... 13
2.1.3. Rod Maculavirus ................................................................................................................. 14
2.1.4. Rodovi Vitivirus i Foveavirus ............................................................................................. 15
2.1.5. Rod Nepovirus ..................................................................................................................... 17
2.2. Pregled dosadašnjih istraživanja na mediteranskom području s posebnim osvrtom na
Bosnu i Hercegovinu i Hrvatsku ....................................................................................................... 21
2.3. Pregled zakonske legislative u Bosni i Hercegovini i EU o temeljnim čimbenicima kakvoće
sadnoga materijala vinove loze ......................................................................................................... 25
3. MATERIJALI I METODE ............................................................................................................... 28
3.1. Materijali .................................................................................................................................... 28
3.1.1. Kolekcijski nasad ................................................................................................................ 28
3.1.2. Terenska istraživanja i podrijetlo virusnih izolata (izvor antigena) .................................... 29
3.1.2.1. Autentičnost uzoraka .................................................................................................... 31
3.1.2.2. Kultivatri u istraživanju ............................................................................................... 31
3.1.3. Lokacije uzorkovanja .......................................................................................................... 35
3.1.4. Osnovne kemikalije ............................................................................................................. 38
3.1.5. Puferi i otopine .................................................................................................................... 38
4.1.6. Oligonukleotidne početnice ................................................................................................. 38
3.1.7. Pozitivne kontrole ................................................................................................................ 40
3.1.8. Standard za utvrdjivanje DNA molekularne mase (DNA fragment size) ............................ 40
3.1.9. Komercijalni dijagnostički kompleti (kitovi) ....................................................................... 40
3.2. Metode ........................................................................................................................................ 41
xi
3.2.1. Vizualni pregledi simptoma virusnih zaraza ....................................................................... 41
3.2.2. Serološke metode za detekciju virusa .................................................................................. 42
3.2.2.1. Virusi obuhvaćeni testiranjem metodom ELISA .......................................................... 43
3.2.2.2. Dvostruka protutijelna sendvič ELISA (DAS ELlSA) ................................................. 43
3.2.2.3. Dvostruka protutijelna sendvič ELISA uz prethodno oblaganje
mikrotitarskih pločica s proteinom A (Protein-A DAS ELlSA) ................................................ 44
3.2.2.4. Trostruka protutijelna sendvič indirektna ELISA (TAS ELISA) ................................. 44
3.2.2.5. Dvostruka protutijelna sendvič indirektna ELISA uz direktno vezanje
antigena (DASI ELISA) ............................................................................................................ 44
3.2.2.6. Spektrofotometrijsko očitavanje ELISA rezultata ........................................................ 45
3.2.3. Utvrđivanje prisutnosti virusa metodom RT-PCR .............................................................. 45
3.2.3.1. Ekstrakcija ukupne RNA .............................................................................................. 46
3.2.3.2. Modifikacija protokola za ekstrakciju ukupne ribonukleniske kiseline (RNA) ........... 47
3.2.3.3. Sinteza virusnih cDNA i PCR amplifikacija ................................................................ 48
3.2.3.4. Semikvantitativni RT-PCR za GLRaV-2 ..................................................................... 50
3.2.3.5. Elektroforeza umnoženih produkata u agaroznom gelu ............................................... 50
4. REZULTATI ..................................................................................................................................... 51
4.1. Rezultati serološke detekcije virusa ........................................................................................... 51
4.2. Rezultati detekcije virusa metodom RT-PCR ............................................................................ 63
4.2.1. Rezultati PCR amplifikacije u detekciji GLRaV-2 ............................................................. 63
4.2.2. Rezultati RT-PCR metode ................................................................................................... 64
4.3. Simptomatologija prirodnih virusnih zaraza autohtonih kultivara ............................................. 67
5. RASPRAVA ...................................................................................................................................... 81
6. ZAKLJUČCI ..................................................................................................................................... 97
7. POPIS LITERATURE ...................................................................................................................... 99
8. PRILOZI .......................................................................................................................................... 120
Prilog 1. Postupak pripreme pozitivnih kontrola. ............................................................................ 120
Prilog 2. Vinogradi u kojima je vršeno istraživanje viroza. ............................................................ 121
Prilog 3. Kolekcijski nasad Višići .................................................................................................... 125
xii
Prilog 4. Rezultati analiza ............................................................................................................... 131
9. ŽIVOTOPIS AUTORICE S POPISOM OBJAVLJENIH DJELA ................................................. 154
Uvod
1
1. UVOD
Vinova loza (Vitis spp. L.) predstavlja jednu od najvažnijih poljodjelskih kultura koja
je široko rasprostranjena u umjerenim klimatskim područjima i predstavlja vrlo vrijednu
poljoprivrednu robu (vino, grožđe, plemke, podloge). Angažmani institucija usko povezanih s
industrijom vinove loze na Mediteranu kao području slobodne trgovine, pridonose direktnom
uključivanju u međunarodne istraživačke projekte i aktivnosti Mediteranske mreže za
cretifikaciju vinove loze, podržavajući kooperativne studije povezane s razvojem
sveukupnoga vinogradarstva.
Vinogradarstvo je važna gospodarska grana Bosne i Hercegovine, a 99,44 %
vinogradarske proizvodnje Bosne i Hercegovine obavlja se na području Hercegovine i to u
mostarskom i lištičkom vinogorju. U preostala je četiri vinogorja vinogradarska proizvodnja
praktično minorna (Lasić, 2014). Službeni statistički podaci o površinama pod vinogradima
postoje do 2012. godine, ali nisu detaljni. Osim niske kvalitete statističkih podataka, prisutna
je i raznolikost modela prikupljanja statističkih podataka po različitim ustrojbenim jedinicama
države (Lasić, 2014). Spomenuta raznolikost modela prikupljanja podataka onemogućava
primjerenu usporedbu podataka i donošenje generalnih zaključaka. Od ukupno 495. 590,00 ha
površina hercegovačkih općina pogodnih za uzgoj vinove loze, vinogradi čine oko 3.521,55
ha površina (Leko, osobna komunikacija1).
Vinogradarska proizvodnja Hercegovine koncentrirana je u mostarskom i lištičkom
vinogorju gdje se uzgajaju autohtoni kultivari. Međutim orijentacija vinogradara na plantažni
uzgoj i na primjenu gotovih cijepova, ima za posljedicu da je danas u uzgoju prisutno do šest
komercijalno važnih autohtonih kultivara, dok ostalima prijeti izumiranje. Unatoč dugoj
tradiciji uzgoja vinove loze, detaljan opis autohtonih hercegovačkih kultivara nije postojao.
Postoji samo djelomičan opis nekih najvažnijih komercijalnih kultivara (Bulić, 1949,
Vuksanović i sur., 1977, Mirošević i Turković, 2004). Međutim Atlas vinogradarstva i
vinarstva Bosne i Hercegovine (Beljo, i sur., 2014), posebice u poglavlju Ampelografske
karakteristike hercegovačkih sorata, pruža do sada najdetaljaniji opis 15 autohtonih kultivara.
Glavno je obilježje hercegovačkih vinograda da su vinski kultivari dominantni u uzgoju (90
%) i da prevladavaju autohtoni kultivari. Od autohtonih hercegovačkih kultivara najznačajniji
1Predstavlja izračun dobiven prilikom izrade vinogradarskog katastra koji još nije objavljen.
Uvod
2
su: Žilavka2 (50 %), Blatina (40 %) i Krkošija (2 %), te kultivari koji se smatraju autohtonim
Bena (5 %), Trnjak (7 %) i Dobrogostina (1 %). Ostali su autohtoni kultivari rijetki i nalaze se
sporadično u starim vinogradima, na odrinama/pergolama seoskih dvorišta, pokraj suhozida i
sl.
Kao i većina vegetativno razmnoženih usjeva, vinova loza izložena je napadima raznih
štetočina i patogena, među kojima infekcije unutarstaničnih i međustaničnih patogena (virusi,
viroidi, na floem i/ili ksilem ograničeni prokarioti) igraju vodeću ulogu uzrokujući velike
gubitke koji se očituju kroz skraćivanje produktivna života vinograda i time dovode u pitanje
rentabilnost zahvaćenih vinograda. S obzirom na važnost industrije vinove loze i veličinu
problema uzrokovanih tim patogenima, potaknut je interes za tu problematiku, što je
rezultiralo intenzivnim istraživanjima osobito aktivnim na međunarodnoj razini od kasnih 50-
ih godina prošloga stoljeća naovamo.
Virusne bolesti spadaju među najopasnije i ekonomski vrlo štetne bolesti biljaka.
Najopasniji su zbog svoga obligatorna parazitizma tako da se za razliku od zaraza većinom
gljivičnih i bakterijskih patogena virotični trsovi ne mogu izliječiti, nego ostaju zaraženi do
kraja života. Vinova loza podložna je zarazi sa 65 do sada poznatih vrsta virusa (Martelli,
2014). Većina štetnih virusa pripada rodovima: Closterovirus, Ampelovirus, Maculavirus,
Vitivirus, Foveavirus i Nepovirus (Fauquet i sur., 2005). Do sada je zabilježeno 25 priznatih
virusnih i virozama sličnih (engl. virus-like) bolesti vinove loze (Vitis i Muscadinia spp.)
(Martelli, 2010). Od toga su najvažniji virusi na vinovoj lozi: virus lepezasta lista vinove loze
(eng. Grapevine fanleaf virus, akronim GFLV), virus mozaika gušarke (eng. Arabis mosaic
virus, akronim ArMV), uvijenosti lista vinove loze pridruženi virusi 1-9 (eng. Grapevine
leafroll associated -1 do -9, akronim GLRaV-1 od -9), virus pjegavosti vinove loze (eng.
Grapevine fleck virus, akronim GFkV), A-virus vinove loze (eng. Grapevine virus A, akronim
GVA) i B-virus vinove loze (eng. Grapevine virus B, akronim GVB).
Ekonomski gubitak u vinogradarskoj proizvodnji uzrokovan virozama teško je
procijeniti jer se temelji osim na smanjenju prinosa u količini i kvaliteti i u smanjenju vigora,
što za posljedicu ima direktno skraćenje eksploatacijskoga vijeka vinograda. Osim toga
smanjena je otpornost prema drugim biotičkim i abiotičkim utjecajima. Viroze uzrokuju
poteškoće i u proizvodnji sadnoga materijala, kroz smanjenje sposobnosti ukorjenjivanja,
2 Naziv kultivara/sorata u radu su pisani velikim slovom kao tradicijski izbor, a ne u skadu s pravopisnom
normom hrvatskog jezika.
Uvod
3
slabijega srašćivanja ili izraženije inkopatibilnosti podloge i plemke. Premda su vektori glavni
prenosioci virusa, u praksi je najčešći način prijenosa korištenje zaražena sadnog materijala.
Stoga u zemljama s razvijenom vinogradarskom proizvodnjom velika važnost pridaje
se proizvodnji bezvirusna sadnog materijala (virus-free) kao najučinkovitijega preventivnog
sustava u borbi protiv virusnih oboljenja. U Bosni i Hercegovini može se nabaviti isključivo
standardni sadni materijal (CAC kategorije - Conformitas Agraria Communitatis) autohtonih
kultivara upitne kakvoće, dok se inducirani/alohtoni kultivari mogu uvesti kao certificirani
sadni materijal. Certifikacija sadnoga materijala omogućuje učinkovitu kontrolu i
sprječavanje rasprostranjivanja gospodarski važnih i administrativno reguliranih biljnih
parazita, u prvom redu virusa i fitoplazmi te gljivičnih i bakterijskih oboljenja vinove loze.
Da bi se osigurao certificirani sadni materijal autohtonih kultivara, neophodno je
provođenje klonske selekcije. Masovna pozitivna selekcija i dobivanje podataka o općem
stanju zaraženosti prvi su koraci u postupku individualne klonske selekcije. Istraživanje
provedeno u ovoj disertaciji stvara osnovu za daljnje korake prema certificiranom sadnom
materijalu hercegovačkih autohtonih kultivara.
Vjerujemo da će ovaj rad pridonijeti boljem sagledavanju trenutnoga zdravstvenog
stanja autohtonih kultivara vinove loze koji se uzgajaju na području Bosne i Hercegovine, a
sve u uspostavljanju prioritetnog cilja proizvodnje certificirana sadnog materijala autohtonih
kultivara vinove loze u Bosni i Hercegovini.
1.1. Ciljevi istraživanja
1. Analizirati prisutnost devet ekonomski najvažnijih virusa kod šest autohtonih kultivara u
Hercegovini.
2. U slučaju pronalaska virusa koji još nisu potvrđeni na području Bosne i Hercegovine
(GVA, GVB, GFkV, GLRaV-2 i GLRaV-4-9) provesti njihovu molekularnu karakterizaciju i
filogenetsku usporedbu s izolatima iz susjednih zemalja (Hrvatska i Italija).
3. Opisati simptome na trsovima autohtonih kultivara s miješanom i pojedinačnom
infekcijom.
Uvod
4
1.2. Hipoteza
S obzirom na rezultate istraživanja u zemaljama iz okruženja pretpostavlja se da su
autohtoni bosansko-hercegovačih kultivari, kod kojih do sada nije istraživana zaraženost
virusima, opterećeni gospodarski štetnim virusima u visokom postotku, ali da je ipak moguće
pronalaženje manjega broja zdravih trsova koji bi poslužili u inicijaciji proizvodnje
bezvirusna materijala.
1.3. Znanstveni i praktični doprinos disertacije
Inventarizacijom virusa vinove loze prisutnih u Hercegovini pružit će se cjelovit
prikaz sanitarnoga statusa autohtonih kultivara. Detaljnim opisom simptoma viroza na
trsovima s pojedinačnim i kombiniranim virusnim infekcijama steći će se uvid u raznolikost
populacija istraživanih virusa na autohtonim kultivarima. Utvrđena prisutnost virusa GLRaV-
4-9 (Grapevine leafroll-associated virus-4-9), kao i GLRaV-2 serološkim metodama
potvrđeno je RT-PCR-om, što predstavlja orginalni aspekt ovoga istraživanja, budući da do
sada nisu provođene dijagnostičke metode bazirane na istraživanju genoma na autohtonim
kultivarima u hercegovačikm vinogorjima.
Trsovi za koje se dokaže da nisu zaražene ni s jednim od 9 virusa (GFLV, ArMV,
GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3, GLRaV-4-9, GFkV, GVA, GVB), bit će uključeni u proces
zdravstvene selekcije. Utvrđivanjem fitosanitarnoga statusa vinove loze u BiH, omogućio bi
se i pokrenuo proces certifikacije i proizvodnje bezvirusna materijala u cilju očuvanja i
popularizacije autohtonih kultivara vinove loze.
Pregled literature
5
2. PREGLED LITERATURE
2.1. Viroze vinove loze
Prema svom podrijetlu vinova loza je šumska puzavica i kao takva u slobodnoj prirodi
raste kao pojedinačan sijanac, najčešće izdvojeno. Uvjete koje je divlja loza imala u takvim
staništima pružali su joj izolaciju od mnogih bolesti. Čovjek ju je počeo uzgajati, a svojim
agrotehničkim zahvatima, koji su se mijenjali kroz stoljeća, uvelike je pridonio
rasprostranjuju brojnih biljnih bolesti.
Negdje na tom putu razvoja vinova loza je inficirana virusima (Vuittenez, 1977).
Prema navodima Hewitta (1970) virus infektivne degeneracije vinove loze evoluirao je kroz
nekoliko milijuna godina.
Premda su virusna oboljenja stara, ekonomska štetnost viroza vinove loze počela je
rasti nakon 1860. godine, kada je iz Amerike unesen trsov ušenac (filoksera, Viteus vitifoliae
Fitch). Taj je opasan štetnik do kraja 1880. godine uništio većinu europskih vinograda. U cilju
eliminacije spomenuta štetnika, reznice su, kao sadni materijal, zamijenjene cijepom
dobivenim spajanjem (cijepljenjem) osjetljivih europskih kultivara na otpornije podloge
američke loze (Vitis riparia, Vitis rupestris, Vitis berlandieri) i njihove hibride.
Nažalost, u isto vrijeme, zbog prometa sadnoga materijala preneseni su i rasprostranjeni
virusi. Unatoč vizualnom odabiru vinove loze, latentne infekcije trsova nisu bile isključene
(Uyemoto i sur., 2009). Rasprostranjivanju virusa vinove loze pridonijeli su i vektori,
uglavnom ektoparazitske nematode iz reda Dorylamidae.
Velike ekonomske štete u vinogradarstvu, i u svijetu i na prostorima Mediterana
uključujući i njegov dio Balkana, nanijete su nekontroliranom razmjenom i prometom sadnica
vinove loze u milijunskim količinama posebice od 30-tih godina prošloga stoljeća (Avramov i
sur. 1987). Visina ekonomske štete ovisi o vrsti i soju virusa, osjetljivosti kultivara, načinu
prijenosa, vrsti simptoma i mnogim drugim čimbenicima (Šutić i sur., 1999). Mnoge divlje
biljke imaju virusnu infekciju i ne razvijaju simptome, što upućuje na mogućnost prilagodbe
biljaka na virus (Kurstaki, 1981). Međutim postoje razlike u interakcijama biljka – domaćin
koje nisu dio „prilagodbe“, nego su ingerentne svakom akteru zasebno, a zatim kod duge
koevolucije biljke i virusa može doći do razvoja takvih interakcija i selekcije onih koje su
najpovoljnije za opstanak obje strane što možemo vidjeti kao asimptomatičnu zarazu.
Pregled literature
6
Nadalje eksperimentalno je potvrđeno da neke viroze imaju širok spektar simptoma
kao posljedica djelovanja kompleksa virusa (Bercks i Stellmach, 1966). Mješovite infekcije
virusima mogu rezultirati izraženijim simptomima virusne bolesti, no simptomi ponekad
izostaju. Simptomi mogu izostati ili biti intenzivniji ovisno o podlozi i kultivaru (Lunden i
sur., 2008; Rowhani i sur., 2005).
Kako su virusne čestice uglavnom nestabilne i podložne brzoj razgradnji usljed
različitih čimbenika, često su u niskoj koncentraciji u biljci-domaćinu (u ovom slučaju
vinovoj lozi) i metode za njihovo potpunije i detaljnije proučavanje sporije su se razvijale
(Pejičinovski, 1974). Prava ekspanzija u proučavanju virusa, pa tako i virusa vinove loze,
nastupila je početkom sedamdesetih godina prošloga stoljeća, a traje i danas. Napretkom
laboratorijskih tehnika usavršavane su metode za brzo i uspješno dokazivanje virusa, kao i za
detaljno proučavanje njihovih genoma: imuno-enzimska metoda na mikrotitarskim
pločicama-MTP-a (eng. enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA), imuno-elektronska
mikroskopija (eng. immuno sorbent electron microscopy, ISEM), metoda dot-blot (eng. dot-
blot method), lančana reakcija polimeraze (eng. Polymerase Chain Reaction, PCR) i reverzna
transkripcija uz lančanu reakciju polimeraze (eng. Reverse Transcription Polymerase Chain
Reaction, RT-PCR) (Boscia i sur. 1995a, 1995b).
PCR s polivalentnim početnicama je jednostavna strategija koja se učestalo
primjenjuje za aspecifičnu i simultanu detekciju članova nekoliko rodova i porodica biljnih
virusa (James i sur., 2006). U slučaju virusa vinove loze, uspješno se koriste degenerirane
(imaju degeneriran dio slijeda) početnice za simultanu detekciju klosterovirusa (Saldarelli i
sur., 1998), foveavirusa i vitivirusa (Dovas i Katis, 2003) te fleck-like virusa (Sabanadzivic i
sur., 2000). Za nepoviruse primjena polivalentnih početnica ograničena je na GFLV i ArMV
korištenjem početnica namijenjenih za konzervirani dio proteinskog gena za kapsidni protein
(Wetzel i sur., 2002). Stvaranje/razvoj tri seta početnica za multiplu detekciju nepovirusa koji
pripadaju podskupinama A, B i C, predstavlja koristan alat za poboljšanje osjetljivosti
detekcije i smanjenje troškova velikih istraživanja (Digiaro i sur., 2007).
Sprječavanje rasprostranjenja virusa zahtijeva učinkovite i robusne dijagnostičke
metode, a oslanja se na provjerene biološke, te dijagnostičke tehnike kao što su serološke
(koje otkrivaju virusni CP) i/ili metode čiji su ciljevi dijelovi genoma (koje otkrivaju virusne
nukleinske kiseline). Trenutačno dostupni laboratorijski protokoli omogućuju dobivanje
rezultata za relativno velik broj uzoraka u nekoliko dana, a neke metodologije, npr ELISA,
predstavljaju jednostavnu dijagnostičku platformu dostupnu minimalno opremljenim
laboratorijima, bez gubitka robusnosti i osjetljivosti (Saldarelli i sur., 2012a).
Pregled literature
7
Dijagnostičke tehnike kao što su serološke i/ili metode čiji su ciljevi dijelovi genoma
(nukleinske kiseline) otkrivaju poznate i dobro karakterizirane viruse. U slučaju pojave
nepoznatih bolesti, provode se strategije otkrivanja "širokoga spektra" patogena (Saldarelli i
sur., 2012a).
Dostupne alate predstavljaju "generički PCR" (Saldarelli i sur., 1998) koji omogućava
identifikaciju na razini virusnoga roda/porodice s degeneriranim početnicama, koje
omogućavaju otkrivanje konzerviranih sekvencija virusnoga genoma (Rott i Jelkmann, 2001)
uglavnom počevši od dvolančane replikativne forme RNA (dvolančana RNA, eng. double
stranded RNA, dsRNA) nepoznatih virusnih genoma.
Odnedavno su novi i suvremeni pristupi u metagenomici omogućili karakterizaciju
virusnih zajednica u vinogradu ili na pojedinim lozama, a to je rezultiralo otkrićem novih
virusa (Giampetruzzi i sur., 2012) čija se uloga u izazivanju bolesti proučava ili samostalno ili
u sinergiji s drugim virusima. Te nove generacije tehnologije sekvenciranja (next generation
sequencing, NGS), iscrpno istražujući genomske sadržaje stanica/tkiva i organizma, otvaraju
novu eru u procjeni fitosanitarnoga statusa biljke, a također i u analizi interakcije biljka –
virus(i) (Saldarelli i sur., 2012a).
Pregled literature pokazuje intenzivan rad na proučavanju viroza vinove loze na
međunarodnoj razini u posebice od 30-ih godina prošloga stoljeća naovamo (Bovey i Marteli,
1986), što je dovelo do formiranja Međunarodnoga vijeća za istraživanje viroza i virozama
sličnih bolesti vinove loze (International Council for the Study of Virus and Virus-like
Diseases of the Grapevine, ICVG). Opise novo otkrivenih virusa vinove loze i nova
istraživanja moguće je pratiti djelomično putem rada toga vijeća, ali za same opise virusa,
potvrde novih vrsta i imenovanje odgovoran je ICTV (International Committee on Taxonomy
of Viruses). Prema posljednjim podacima, uzročnika virusnih bolesti na vinovoj lozi
trenutačno ima 65 vrsta (Martelli, 2014) što je čini domaćinom više virusa, nego što je to kod
bilo koje druge drvenaste vrste. Većina tih virusa imaju jednolančani ili dvolančani RNA-
genom, ali u posljednje vrijeme pronađeno je i par uzročnika s DNA-genomom (Zhang i sur.,
2011; Al Rawhanih i sur., 2013). Unatoč velikom broju virusa kojima je domaćin vinova loza,
samo manji dio njih uzrokuje gospodarski važne bolesti, dok ostatak pripada skupini virusnih
bolesti manje važnosti (Saldarelli i sur., 2012). Najvažniji virusi povezani su s rodovima:
Closterovirus, Ampelovirus, Maculavirus, Vitivirus, Foveavirusi Nepovirus (Fauquet i sur.,
2005) čije su vrste uzročnici bolesti od gospodarske važnosti (Martelli, 2010).
Važnijih je infektivnih bolesti vinove loze u svijetu malo (infectious degeneration,
leafroll, rugose wood, yellows), ali su vrlo štetne. Prevladavajući su uzročnici bolesti virusi
Pregled literature
8
koje prenose nematode (nepovirusi i Strawberry latent ringspot virus), štitaste uši (eng.
pseudococcid mealybugs i eng. soft-scale insekti) klosterovirusi i vitivirusi) (Martelli, 2010).
Na visinu ekonomske štete utječu vrsta i soj virusa, osjetljivost kultivara, način prijenosa,
vrsta simptoma i mnogo drugih čimbenika (Šutić i sur., 1999). Virusi se mogu pojavljivati u
mješovitim zarazama što može rezultirati izraženijim simptomima virusne bolesti ili simptomi
mogu izostajati. Simptomi mogu izostati ili biti intenzivniji ovisno o podlozi i kultivaru
(Lunden i sur., 2008; Rowhani i sur., 2005).
2.1.1. Rodovi Closterovirus i Ampelovirus
Predstavnici su tih rodova virusi skupine GLRaV (LR) koji su pripadnici porodice
Closteroviridae (ICTV). Virusi iz skupine uvijenosti lista vinove loze (leafroll virusi, LR)
rasprostranjeni su širom svijeta (Alkowni i Rowhani, 2003; Martelli i sur., 2002) i uzrokuju
ekonomski važne bolesti kultivirane vinove loze i vinskih i stolnih kultivara (Maree i sur.,
2013). Ni jedan virus od virusa LR-a nema status karantenskoga patogena. Međutim ti virusi
mogu predstavljati fitosanitarni rizik, osobito u područjima gdje se nove sorte vinove loze
uvode bez prethodnoga testiranja (Digiaro i sur., 1998).
Bolest uvijenosti lista, zbog svojih jedinstvenih simptoma, bila je poznata od sredine
19. stoljeća pod raznim imenima (Fabre, 1853; Pastre, 1891; Sannino, 1906; Ravaz i Verge,
1924) i smatrana je fiziološkim poremećajem (Sannino 1906; Ravaz i Verge, 1924). O
virusnoj prirodi bolesti leafroll zaključeno je temeljem pozitivnih rezultata pokušaja prijenosa
virusa provedenih u Njemačkoj (Scheu, 1935). Međutim uzročnik je ostao nepoznat do kasnih
70-ih kad su Namba i sur. (1979) pronašli čestice nalik klosterovirusu u japanskoj lozi sa
simptomima uvijenosti lista, te povezali taj tip virusa s bolešću.
Prva djelomična karakterizacija dva takva serološki različita virusa, označena kao “tip
I” i“tip II”, provedena je nekoliko godina kasnije u Švicarskoj (Gugerli i sur., 1984). To je bio
začetak sustava označavanja zasnovana na uporabi brojeva kako bi se identificirali različiti
virusi.
U Europi i SAD-u stalno se povećao broj novih vrsta virusa u rodovima
Ampeloviruses i Closterovirus identificiranih kod vinove loze sa simptomima leafrolla.
Ovisno o aminokiselinskoj sekvenciji konzervirane HSP70h regije GLRaV-2 je
uključen u rod Closterovirus, a GLRaV-4, GLRaV-5, GLRaV-6, GLRaV-9, GLRaV-Pr,
GLRaV-De i GLRaV-Car u podskupinu I roda Ampelovirus, dok su GLRaV-1 i GLRaV-3 u
podskupini II toga roda (Maliogka i sur., 2008).
Pregled literature
9
Virusne su čestice tih rodova nitaste građe, (dužine 1400-2200 nm i širine/promjera
10-12 nm). Duljina čestica varira ovisno o vrsti virusa (Martelli i sur., 1997); GLRaV-1
sadržava18659 nukleotida (nt), GLRaV-3 18498 nt, a GLRaV-2 16494 nt.
Analiza je pokazala da su GLRaV-1 i GLRaV-3 uže povezane jedna s drugom, nego s
drugim Closteroviridae (Fazeli i Rezaian, 2000). Pažljivim promatranjem simptoma u
zaraženim klonovima loze, otkriva se da postoji nekoliko različitih vrsta leafrolla, koji se
razlikuju i u jačini (Krake, 1993). Svi su GLRaV virusi morfološki slični jedan drugom kada
se promatraju pod elektronskim mikroskopom, ali se serološki razlikuju. Sadrže monopartitni
genom koji čini jednolančana molekula RNA pozitivnoga polariteta [ss(+)RNA] (Martelli i
sur., 2002).
Virusi GLRaV unose se vektorima (Cabaleiro i Segura, 1997), a umnažaju se u
stanicama parenhima, pratećim stanicama i diferenciranim sitastim cijevima, gdje se
nakupljaju virusne čestice (Faoro, 1997). Budući da floemsko tkivo prenosi u vodi otopljene
asimilate u silaznom smjeru odnosno od lista prema drugim dijelovima, asimilate unose u svoj
organizam vektori iz floema u sitastim cijevima gdje se nalaze asimilati koji su produkti
fotosinteze, vektori uzimaju biljni sok i na taj način prenose viruse.
Citopatološke promjene biljnoga tkiva kod LR-zaraza karakterizira prisutnost
inkluzijskih tijela koja se sastoje od virusnih čestica, raspršenih ili u hrpama/skupinama,
pomiješanih s jednom ili skupinom membranastih vezikula. Te su vezikule (vezane za
enodoplazmatski retikulum), koje sadrže dsRNK, vjerojatno mjesto replikacije virusne RNA.
Potječu ili iz endoplazmatskog retikuluma kao u slučaju GLRaV-2 i GLRaV-7 (Castellano i
sur., 2000), ili iz oštećenoga mitohondrija kao u slučaju GLRaV-1, GLRaV- 3 i GLRaV-5
(Faoro i sur., 1991; Faoro i Carzaniga, 1995; Faoro, 1997).
Propagacijski materijal (plemka, podloga, cijep) bili su, i još su uvijek, u velikoj mjeri
odgovorni za rasprostranjenje viroza LR na velike udaljenosti. U rasprostranjenju viroze
unutar nasada posreduju vektorske štitaste uši i to one iz porodice Pseudococcideae (eng.
mealybugs) i one iz nadporodice Cocidae (eng. soft scale).
Prirodno rasprostranjenje LR-a u polju bolesti zamijećeno je još ranih 1970-ih u
Europi, a zatim u Južnoj Africi, Meksiku, Novom Zelandu i Australiji (Martelli i sur., 1997).
Do sada su identificirani sljedeći vektori:
(i) GLRaV-1 prenosi se u prirodi štitastim ušima iz porodice Pseudococcidae (eng.
mealybugs), Heliococcus bohemicus, Phenacoccus aceris (Sforza i i sur, 2000), Pseudococcus
affinis,Ps.calceolariae, Ps. viburni, Ps.maritimus, Ps. comstocki i štitastim ušima nadporodice
Cocidea (eng. soft scale): Pulvinaria vitis (Sforza i sur, 2000), Parthenolecanium corni
Pregled literature
10
(Fortusini i sur., 1997; Sforza i sur., 2000) i Neopulvinaria innumerabilis (Fortusini i sur,
1997);
(ii) vektori GLRaV-3 su Pseudococcideae, kao što su: Planococcus ficus (Rosciglione i
Gugerli, 1989; Engelbrecht i Kasdorf, 1990; Ioannou i sur., 1997), Pl. citri (Cabaleiro i
Segura, 1997; Ioannou i sur., 1997; Golino i sur., 2000), Pseudococcus longispinus (Tanne i
sur., 1989; Boscia i sur., 1993; Golino i sur., 1995, 2000; Petersen i Charles, 1997), Ps.
calceolariae (Petersen i Charles, 1997); Ps. maritimus, Ps. affinis i Ps. viburni (Golino i sur.,
2000). Ps. comstocki, Ph. aceris, i štitaste uši (eng. scale insects), kao što su: Pulvinaria vitis
(Belli i sur., 1994), Neopulvinaria innumerabilis (Fortusini i sur., 1997), Parthenolecanium
corni, Coccus hesperidium, C. longulus, Saissetia i Parasaissetia, i štitaste uši (eng. scale)
roda Ceroplastes;
(iii) GLRaV-4 i ostali virusi iz skupine prenose se s: Ps. longispinus (soj 5 i 9), Pl. ficus (soj
6 i 9) i Ph. aceris (sojevi 5, 6 i 9) (Martelli, 2014).
Prijenos je semiperzistentan (Martelli i sur., 1997; Cabaleiro i Segura, 1997; Krüger i
Douglas 2013; Mahfoudhi i sur., 2009; Cabaleiro i Segura, 2006; Martelli, 2014), a izgleda da
nije specificiran vektorom. Početni su razvojni stadiji ličinke vektora mnogo učinkovitiji u
prijenosu virusa od razvijenijih stadija ličinke i odraslih oblika (Petersen i Charles, 1997; Tsai
i sur., 2008).
GLRaV-2 je jedini predstavnik leafroll skupine koji nema prirodne vektore (Martelli,
2014), lako se prenosi inokulacijom biljnoga soka na zeljaste domaćine i to na nekoliko
Nicotiana vrsta (Monette i Godkin, 1993; Boscia i sur., 1995a; Goszczynski i sur, 1996; Abou
Ghanem-Sabanadzovic i sur., 2000).
Usporedno ispitivanje odstupanja sekvenciji aminokiselinske tri taksonomski relevantna
proteina/gena: gen za RNA-ovisnu RNA-polimerazu (eng. RNA dependent RNA polymerase,
RdRp), homolog gena za heat shock protein 0 (HSP70h), gen za protein kapside (eng. coat
protein, CP) otkrilo je razliku između virusa povezanih s GLRaV-4 (GLRaV-4, -5, -6 i -9) i
skupine nedavno opisanih virusa (GLRaV-Pr, GLRaV-De i GLRaV-Car) ispod granice od 25
% koju je nedavno postavio Međunarodni komitet za taksonomiju virusa (ICTV), kao
razlikovni kriterij za identifikaciju vrsta u porodici Closteroviridae (Martelli i sur., 2012).
Naime u početku je regija HSP7h bila jedno mjesto gdje su se tražile razlike između virusa i
razlika od 5 % smatrala se dovoljnom da se neki virus uvrsti kao novi. Kasnije je ta granica
pomicana na razliku od 10 %, a u posljednjim ICTV objavama ta je razlika 25 % , i uz regiju
HSP70h, razlikovni kriterij su: RdRp i CP. Sve to, uz priznanje da su GLRaV-4, -5, -6 i -9
serološki srodni, da imaju slična biološka i epidemiološka obilježja i da ti virusi i GLRaV-Pr,
Pregled literature
11
GLRaV-De, GLRaV-Car imaju genom iste strukture i veličine, podržava ideju da su sve to
genetički divergentne varijante jedne virusne vrste, GLRaV-4 (Martelli i sur., 2012). Otkriće
da sekvencija nije virusnoga podrijetla, nego dio genoma vinove loze, potaknula je uklanjanje
GLRaV-8 iz roda Ampelovirusa (Martelli i sur., 2011). Kako bi bile valjane, predložene
taksonomske modifikacije moraju se postupno testirati i trebaju ih odobriti različita tijela
ICTV-a, a onda ih plenum toga tijela treba ratificirati (Martelli i sur., 2012).
Slika 1. Elektronska mikrografija čestice virusa GLRaV-ova (Grapevine leafroll virus)
izolirane iz vinove loze s uvijenošću lista (linija u donjem desnom dijelu slike označava 250
nm. Izvor: http://www.cornell.edu; Photo by Marc Fuchs.
Simptomi koji su obično izazvani umnažanjem virusa u floemu utječu na
funkcioniranje vinove loze (Bovey i sur., 1980; Martelli, 1993). Listovi su deblji od
normalnih, krhki, mijenjaju boju i uvijaju se prema naličju na marginama. Kod crnih kultivara
V. vinifera, pojavljuju se crvenkaste točke koje se razvijaju na nižim listovima početkom ljeta.
Te se točke povećavaju i spajaju, te većina lisne površine postaje crvenkasta obično
ostavljajući uzak zeleni pojas duž osnovnih i srednjih žila (Martelli, 2010).
Simptomi su u kultivarima bijelih bobica slični, ali listovi postaju blago klorotični
umjesto crvenkasti. Stabljika lista postaje debela i krhka i savija se nadolje. Ti simptomi
napreduju prema vrhu izbojaka kako sezona odmiče. U najtežim slučajevima cijela lisna
površina postaje intenzivno purpurna.
Zaraženim lozama nedostaje vigora te imaju odgođenu vegetaciju. Dozrijevanje je
bobice nepravilno i može biti odgođeno 2 – 3 tjedna. Uzrokuje slab razvoj boje kod kultivara s
crnim bobcima grozdova i nejednoliko sazrijevanje grozdova. Također je zabilježeno da se
odgađa sazrijevanje grozdova u trajanju od tri tjedna do mjesec dana (Weber i sur., 1993).
Pregled literature
12
Količina je grožđa često manja (predviđaju se gubici od 20 % pa sve do 85 %) i slabije
je kvalitete. Sadržaj šećera može se smanjiti za čak 30 %, a izmijenjeni sastav antocijana i
fenola može imati utjecaj na kvalitetu vina (Martelli, 2010). Američke Vitis vrste i njihovi
hibridi, koji se koriste kao podloge, osjetljivi su na infekciju GLRaVs, ali ne pokazuju
simptome, osim smanjena vigora (Martelli, 1993; Walter i Martelli, 1997). Simptomi variraju
s obzirom na kultivar, vrstu virusa i njihove kombinacije (Krake, 1993).
Na primjer, izražene razlike uočene su kod promatranja jačine i opsega međužiloga crvenila,
koje je najjače kod loze zaražene GLRaV-3 i sve blaže kod loza zaraženih GLRaV-1 i
GLRaV-5 (Gugerli i sur., 1991; Walter i Zimmermann, 1991). Iz francuskih i talijanskih
istraživanja poznato je da GLRaV-2 potiče inkompatibilnosti podloge i plemke što je
otkriveno cijepljenjem na Kober 5BB. Drugi soj istoga virusa identificiran je u Kaliforniji
(SAD) kao kočimbenik u nastanku bolesna stanja poznata kao propadanje mladoga vinograda
(Rowhani i sur., 2000; Golino i sur., 2000). Nekompatibilnost plemke i Kobera 5BB i
propadanje mladoga vinograda karakteriziraju usporen rast, kržljav i grmovit/žbunast izgled,
koji rezultira odumiranjem mladice (Greif i sur., 1995) ili cijepljenih trsova (Golino i sur.,
2000).
Atallah i suradnici (2012) koristeći metodu neto sadašnje vrijednosti (eng. net present
value, NPV) izračunali su ekonomski učinak LR bolesti na V.vinifera ´Cabernet Franc´ u
vinogradu Finger Lakes (New York, USA). Autori su modelirali prihode s jednoga hektara
vinograda tijekom 25 godina koristeći različite scenarije reakcija vlasnika na pojavu virusa u
vinogradu. Predvidjeli su sadnju vinograda s certificiranim sadnim materijalom ili
standardnim sadnim materijalom (s potencijalno 1 % zaraženih trsova) i različitim brzinama
rasprostranjenja virusa kao i različitim načinima sprječavanja rasprostranjenja infekcije (bez
utjecaja čovjeka, krčenje i podsađivanje zaraženih trsova, krčenje cijeloga vinograda). U
slučaju pojave infekcije i izostanku reakcije vinogradara tijekom 25 godina, ekonomska šteta
iznosi od 25.000 do 40.000 $ ovisno o redukciji prinosa (30 ili 50 %). Autori preporučuju
inicijalno korištenje certificiranoga sadnog materijala slobodnoga od virusa jer osigurava
najveći ostvareni dohodak usprkos početnoj većoj cijeni.
Pregled literature
13
2.1.2. Rod Velarivirus
Istraživanje taksonomske strukture familije Closteroviridae imalo je za posljedicu
stvaranje četvrtoga roda privremeno nazvanoga Velarivirus, koji obuhvaća dva ranije
nerazvrstana virusa [GLRaV-7 i LChV-1 (eng. Little cherry virus-1)] kao i novoopisani CoV-
1 (eng. Cordyline virus-1) (Martelli i sur., 2012).
GLRaV-7 prvobitno je nađen kod neidentificiranoga albanskog kultivara bijeloga grožđa koji
je bio bez simptoma, međutim, izazvao je simptome uvijenosti lista na cijepovima kultivara
Cabernet Sauvignon, i na taj način opravdao svoj naziv (Choueiri i sur. 1996; Martelli i sur.
2012).
Sekvencija albanskoga izolata GLRaV-7 nalazi se u bazi GenBank pod oznakama No.
Y15987 i EF093187. Virusni genom sastoji se od 16496 nt s 10 otvorenih okvira čitanja (eng.
open reading frame, ORF). GLRaV-7 ima nitaste čestice duljine 1500-1700 nm (obično su
dugi 1500 nm), s unakrsnim povezivanjem i otvorenom strukturom monomera tipičnom za
klosterovirusne virione.
Identifikacija GLRaV-7, kao različite vrste uvelike je zasnovana na nepostojanju
reakcije antiseruma uzgojena na njegovom CP-u s bilo kojim od šest klosterovirusa koji
inficiraju lozu, a koji su bili poznati u to vrijeme (Choueiri i sur., 1996). Djelomično
sekvenciranje viralnoga genoma (Turturo i sur., 2000) i njegovo svrstavanje u rod Velarivirus
zasnovano je na analizi uočenih različitosti tri taksonomski relevantna gena (polomerza,
HSP70 i CP) virusa članova rodova porodice Closteroviridae.
Originalni albanski izvor (AA42) bio je bez očitih simptoma, ali su simptomi
uvijenosti lista izazvani na indikatorima. Nasuprot tomu, grčke i kalifornijske virotične loze s
prisutnim GLRaV-7 pokazivale su “vrlo blage“ ili “nesigurne“ simptome leafrolla [Avgelisi
Boscia, 2001 (prema Martelli, 2012)] ili da su “simptomatski i asimptomatski” bez daljih
detalja [Moralesi Monis, 2007. (prema Martelli, i sur. 2012)]. Infekcije GLRaV-7 vrlo često
su bez simptoma (Martelli, 2014).
Geografska je distribucija GLRaV-7 prilično široka i obuhvaća europske (Albanija,
Armenija, Grčka, Mađarska, Italija, Švicarska), bliskoistočne (Egipat, Palestina, Turska),
sjevernoameričke (SAD) i južnoameričke (Čile) zemlje te Kinu [Martelli, 2009 (prema
Martelli i sur., 2012)].
Pregled literature
14
2.1.3. Rod Maculavirus
Virusi toga roda povezuju se sa simptomima iz kompleksa pjegavosti vinove loze
(Fleck complex) prisutnoga u Vitis vrstama. Uzročnici kompleksa pjegavosti vinove loze
taksonomski pripadaju rodovima: Marafivirus [vrste: GaMaV (eng. Grapevine asteroid
mosaic-associated virus), GRGV (eng. Grapevine redglobe virus)] i Maculavirus [vrste:
GFkV (eng. Grapevine fleck virus), GRVFV (eng. Grapevine rupestris vein feathering virus)]
i porodici Tymoviridae (Martelli, 2014). Virus pjegavosti vinove loze (eng. Grapevine fleck
virus, akronim GFkV) inficira lozu u vinorodnim regijama svijeta i nalazi se isključivo u
floemu zaraženih trsova (Martelli i Boudon-Padieu, 2006). Ostali uzročnici iz toga kompleksa
determinirani su u malom broju zemalja (Martelli, 2014).
Prijenos virusa vektorima nije poznat ni za jednu vrstu toga kompleksa (Martelli,
2014). Uglavnom se prenosi unosom zaražena sadnog materijala i ne može se prenositi
mehaničkim putem. Na trsovima kultivara Vitis vinifera i većine američkih Vitis vrsta kao i
hibrida podlogu GFkV je obično latentan, s izuzetkom V. rupestris kod koga na mladim
listovima uzrokuje blago prozirne točkice ili mrlje. Listovi s velikim brojem točaka, promjera
od 1 do 3 mm, mogu se naborati i smežurati. Kod indeksiranja na V. rupestris simptomi
uzrokovani GFkV mogu se često zamijeniti s onima uzrokovanim virusom GFLV, naročito
ako je indikator zaražen s oba virusa (Martelli i sur., 2002; Fauquet i sur., 2005).
Viron ima oblik poliedra i sadrži jednu linearnu jednolančanu RNA pozitivna
polariteta [eng. single-stranded RNA, ssRNA; jlRNA]. Virusna kapsida sastavljena je od jedne
vrste proteina relativne molekularne mase 56000 (Mr). Za GFkV infekcije karakteristična je
pojava teških modifikacija strukture mitohondrija nazvane multivezikularna tijela (eng.
multivesiculate bodies). Te izmijenjeni organeli smatraju se mjestima replikacije virusa
(Martelli, 2014).
Fleck je širom svijeta raprostranjena bolest koja može snažno utjecati na razvoj
korijena podloge cijepa (Triolo i Materazzi, 1986). Bolest pjegavosti je latentna u europskim
kultivarima, ali i u većini američkih podloga. Simptomi su izraženi kod Vitis rupestris, a
sastoje se od prosvjetljenja žila trećega i četvrtoga reda, ali i pojave lokaliziranih prozirnih
točkastih kloroza te mrlja. Listovi s velikim brojem točaka, promjera od 1 do 3 mm, mogu se
naborati i smežurati. Zaostajanje u rastu također može bit posljedica prisutnosti virusa
(Martelli, 1993). Uzročnik bolesti nalazi se samo u floemu (eng. floem limited) i nije
mehanički prenosiv. Radi se o izometričnom virusu, promjera 30 nm koji sadrži ssRNA
molekulu (Boscia i sur., 1991). Vektori nisu poznati, pa je glavni način rasprostranjenja
Pregled literature
15
bolesti zaraženim sadnim materijalom. Nedavno su prikupljeni dodatni dokazi o prirodnom
rasprostranjenju bolesti na terenu (Fortusini i sur., 1996). V. rupestris je korišten kao indikator
(Martelli, 1993). Za detekciju toga virusa mogu se koristiti metode ELISA i ISEM (eng.
immuno scanning electron microscopy) (Boscia i sur., 1991), a sintezom cDNA GFkV je
također uspješno otkriven tehnikom RT-PCR, ali i radiografski (Šabanadžović i sur., 1997;
Šabanadžović i sur., 2000).
2.1.4. Rodovi Vitivirus i Foveavirus
Nastanak simptoma naboranosti drveta vinove loze (grapevine rugose wood, RW)
pripisuje se pripadnicima roda Vitivirus (Martelli i sur., 1997a) i jednom pripadniku roda
Foveavirus. Posebice simptom izbrazdanosti Kobera (Kober stem grooving, KSG), koji je
usko povezan s A virusom vinove loze (Grapevine virus A, GVA; Slika 2.) i simptomi
plutavosti kore (Corky bark, CB) povezani s Grapevine virus B (GVB) infekcijom (Garau i
sur., 1994; Bonavia i sur., 1996) te simptom izžljebljenosti drveta hibrida LN-33 (Grapevine
LN33 stem grooving), dok se simptom jamičavosti drveta vinove loze povezuje s virusom
Grapevine rupestris stem pitting associated virus (GRSPaV) iz roda Foveavirus.
Virusi toga roda pripadaju familiji Betaflexiviridae (ICTV, 2009). Virusi su nitastoga
oblika. Ima ih u svim vinorodnim regijama. Njihov genom predstavlja linearna pozitivna
jednolančana RNA (Corky bark, CB). Svi se prenose zaraženim sadnim materijalom, dok se
GVA i GVB prenose i insektima iz porodica Pseudococcidae i Coccidae, a njihov detaljan
prikaz je u Tablici 1. (Martelli, 2010). Bolest se može manifestirati kroz zakašnjelo pupanje,
mladice obložene debelom grubom korom i prisutnost jažica i uzdužnih utora ispod kore
mladica ili podloge, ovisno o različitim kultivarima vinove loze. GVB se dovodi u vezu s
plutastom smežuranošću drveta (Corky bark, CB), ali pretpostavka je da to nije jedini uzrok te
bolesti (Boscia, 1995).
Pregled literature
16
Tablica 1. Bolesti kompleksa rugozna drveta, njihovi uzročnici i vektori
Bolesti Uzročnik Vektor
Rupestris stem pitting
GRSPV Nepoznat
Kober stem grooving
GVA Planococcus citri, Pl. ficus,
Pseudococcus longispinus,
Ps. affinis, Heliococcus
bohemicus, Phenacoccus
aceris, Neopulvinaria
innumerabilis,
Parthenolecanium corni
Corky bark
GVB Pl. ficus, Ps. longispinus,
Ps. affinis,Phenacoccus aceris
LN33 stem grooving
Nepoznat Nepoznat
Rugose wood-like
GVE Pseudococcus comstocki
Virus GVA povezuje se sa smežuranosti drveta tipa Kober (Kober stem grooving,
KSG) (Garau i sur., 1994) i bolešću Shiraza (Shiraz disease, SD) u Južnoj Africi
(Goszczynski i Joosten, 2003). Neka od novijih istraživanja dovode u blisku vezu SD sa
zarazom A-virusom vinove loze (GVA) i to sa sojevima koji pripadaju drugoj skupini, dok se
predstavnici prve i treće skupine ne dovode u vezu s tom bolešću, nego se smatraju tzv.
blagim ili asimptomatičnim sojevima (Goszczynski, 2007; Goszczynski i sur., 2009). GVA
uzrokuje stem grooving u Kober 5BB, ali ne uzrokuje simptom na LN33 i Vitis rupestris
(Savino i sur., 1989).
GVA uzrokuje gubitke prinosa od 5 % do 22% u različitim vinskim kutivarima (Garau
i sur., 1997), a smanjenje prinosa i uginuće stolnih kultivara vinove loze koji su zaraženi i
leafroll virusima (Digiaro i sur., 1997).
U trsovima inficiranim i s GVA i s leafroll-povezanim virusom 1, listovi brzo stare s
posljedičnim gubitkom pigmenata, topivih proteina, proteina RuBPC i sniženom
fotosintetskom aktivno šću, što je zabilježeno kod V. vinifera ´Marzemino´ (Malossini i sur.,
2003).
Poznato je nekoliko sojeva GVA koji se razlikuju biološki (Monet i James, 1990) i
molekularno. Molekularne varijante svrstavaju se u tri grupe koje se selektivno mogu
identificirati pomoću RT-PCR koristeći varijante specifičnih početnica (eng. primer).
Pojedinačni trsovi mogu biti istodobno zaraženi s više od jednoga soja (Goszczynski i Jooste,
2003).
Pregled literature
17
Glavna su fizikalno-kemijska svojstva i genomska organizacija GVA slična ostalim
članovima roda Vitivirus (GVB, GVD, GVE, GVF). Taj je virus serološki u dalekom srodstvu
samo s virusima GVB i GVD, međutim oni se međusobno lako mogu razlikovati (Boscia i
sur., 1992; Goszczynski i sur., 1996; Choueiri i sur., 1997). Izvještaji o fitosanitarnom značaju
GVA pokazuju da je taj virus prisutan u većini glavnih vinorodnih zemalja, te da ne
predstavlja fitosanitarni rizik. Međutim preporučeno je da se samo za certificirani virus-free
sadni materijal uvrsti testiranje kao obveza u nacionalnoj i međunarodnoj trgovini.
GRSPaV je povezan s jamčivosti na Rupestrisu (Rupestris stem pitting, RSP; Meng i
sur., 1998), kao i s bolešću nekroza lisnih žila vinove loze (Vein necrosis, VN; Bouyahia,
2006), te s propadanjem kultivara Syrah u Kaliforniji (Lima i sur., 2006).
Slika 2. Elektronska mikrografija čestica virusa Grapevine virus A (GVA). Linija u donjem
lijevom dijelu predstavlja 100 nm.
Izvor:http://ww.dpvweb.net/dpv/showfig.php?dpvno=383&figno=06).
2.1.5. Rod Nepovirus
Rod Nepovirus nazvan je po svojstvima virusa koji pripadaju tom rodu, kao što su:
prijenos oblićima (NEmatodama) u tlu i poliedrična oblika virusnih čestica (POliedar).
Danas su tu još i virusi koji se prenose grinjama npr. Blackcurrant reversion virus (BRV) ili
virusi za čije prenošenje nije potreban vektor. Prema nedavnoj klasifikaciji roda Nepovirus on
pripada redu Picornavirales, porodici Secoviridae i podporodici Comovirinae (Sanfançon i
sur., 2009). Zajedno s ArMV-om odgovoran je za infektivne degeneracije, najteže virusne
bolesti vinove loze: degeneracije (fanleaf disease) i propadanja (grpevine decline).
Pregled literature
18
Degenerativno stanje uzrokovano europskim nepovirusima obično je poznato kao
'fanleaf disease', dok usporedivi poremećaj izazvan američkim nepovirusima naziva se
propadanje vinove loze (grapevine decline) (Martelli, 1993 i 2014). Nekoliko europskih
nepovirusa (ArMV, GFLV, TBRV, GCMV) uključuje deformirajuće i kromogene sojeve.
Deformirajući sojevi izazivaju deformacije i smanjenje veličine listova, razne uzorke kloroza,
skraćivanje i nepravilan razvoj internodija, dvostruka koljenca, fascijacije/sraslice, smanjenje
broja i veličine grozdova, pucanje bobice i coulure (oštećenja bobica). Infekcija je putem
kromogenih sojeva prvenstveno karakterizirana svijetlim krom žutim diskoloracijama lišća
(Martelli, 2010).
Vinova loza (Vitis vinifera L.) je domaćin 15 različitih vrsta iz roda Nepovirus i jedne
vrste pripadnika porodice Secoviridae (vrsta Strawberry latent ringspot virus, SLRSV). S
izuzetkom GFLV-a, koji je svugdje prisutan, svi ti virusi imaju ograničenu geografsku
distribuciju. Tako se ističu europske nepovirusne vrste [Grapevine degeneration – European
nepoviruses; npr. GFLV, Arabis mosaic virus (ArMV), Tomato black ring virus (TBRV),
Grapevine chrome mosaic virus (GCMV), Grapevine Bulgarian latent virus (GBLV),
Raspberry ring spot virus (RpRSV), Cherry leaf roll virus (CLRV] te američke nepovirusne
vrste [Grapevine decline – American nepoviruses; npr. Tomato ring spot virus (ToRSV),
Tobaco ring spot virus (TRSV), Blueberry leaf mottle virus (BLMV) i Peach rosette mosaic
virus (PRMV] (Martelli i Taylor, 1990). Dodatni nepovirusi zabilježeni su u Sjevernoj Africi
npr. Grapevine Tunisian ring spot virus (GTRSV) u Tunisu (Ouertani i sur. 1991) i Aziji npr.
Grapevine deformation virus (GdefV) i Grapevine anatolian ring sot virus (GARSV) u
Turskoj (Digiaro i sur. 2003).
Vektori uzročnika tih virusnih bolesti nisu poznati za vrste: CLRV, GARSV, GBLV i
GDefV, dok vektori ostalih virusa pripadaju nematodama, nadporodice Longidoroidea
(Martelli, 2014).
Dvije zasebne čestice poliendričnoga oblika promjera 28 nm grade taj vrus, čiji genom
čine dvije pozitivno orijentirane molekule jednolančane RNA dužina 7342 (RNA-1) i 3774
(RNA-1) nukleotida. Zajedničko je obilježje virusa toga roda prisutnost tri domene RNA1
poliproteina u redoslijedu: helikaza, proteaza i RNA-ovisna RNA polimeraza (replikaza)
(HEL-Pro-pol). Ta karakteristika ih razdvaja od rodova Fabavirus i Comovirus, druga dva
člana podporodice Comovirinae. Dendrogram temeljen na Pro-Pol aminokiselinskim
sljedovima Nepovirusa ne podržava trenutačni sastav te skupine i postoji mogućnost da se u
Pregled literature
19
sljedećim godinama rod Nepovirus rastavi na nekoliko različitih rodova (Sanfançon i sur.,
2009).
Nepovirusi se nalaze uglavnom u umjerenim klimatskim područjima diljem svijeta.
Postoje Nepovirusi koji uzrokuju zarazu samo jedne biljne vrste, ali i virusne vrste koje mogu
zaraziti veliki broj biljnih vrsta (Fauquet i sur., 2005). Mnogi Nepovirusi uzrokuju ekonomski
važne bolesti različitih kultiviranih biljaka. Oni su obično ograničene na određeno
zemljopisno područje ili kontinent. Najtipičniji su znakovi zaraze Nepovirusima prstenaste
kloroze na lišću, što se može vidjeti u proljeće, kao i drugi oblici kloroze. Mnoge divlje biljke
zaražene su Nepovirusima i neke od njih ne razvijaju simptome nakon zaraze, što upućuje na
mogućnost prilagodbe biljaka na virus. Pojava i priroda simptoma ovisi o vrsti biljaka, o
vegetacijskoj sezoni (Kurstaki, 1981), ali i o interakciji biljka – domaćin. Te interakcije često
nisu dio „prilagodbe“, nego su utjecaj svakoga sudionika zasebno, a dugom koevolucijom
bilje i virusa dolazi do razvoja tavih interakcija i selekcija koje su najpovoljnije za opstanak
oba sudionika interakcije, što može biti vidljivo kao asimptomatične zaraza.
Glavni simptomi bolesti uključuju fanleaf, lisni mozaik, skraćene internodije i kod
kromogenih sojeva tešku lisnu klorozu. GFLV se prenosi ektoparazitskim nematodama
Xiphinema index, kao i vegetativnim razmnožavnjem i cijepljenjem. GFLV uzrokuje
degeneracije i malformacije bobica, listova i mladica/rozgvi, i odgovoran je za značajne
ekonomske gubitke jer smanjuje urod i do 80 %, skraćuje vijek vinograda te mijenja kvalitetu
grožđa (Andret-Link i sur., 2004; Martelli i Savino, 1990.; Raski i sur., 1983).
GFLV je nazvan po obliku lišća zaražene loze koji imaju abnormalnu raspodjelu
žilnoga tkiva (kutovi se između glavnih žila smanjuju), što im daje izgled lepeze (Pearson i
Goheen, 1998). Glavni je prirodni domaćin GFLV vinova loza. Prisutnost je virusa osim u
njoj potvrđena metodom RT-PCR i u uzorcima zubače (Cynodon dactylon L.) u Iranu
(Horvath i sur, 1994; Izadphanah i sur, 2003).
Virus GFLV potiče stvaranje unutarstaničnih citopatoloških vezikularnih struktura
(eng. vesiculate-vacuolate) koji se kao inkluzivna tijela često nalaze u blizini jezgre. Te
inkluzije nastaju zbog proliferacije stanične membrane, unutarstanične reorganizacije i
redistribucije te se smatraju mjestima poliproteinskih virusnih procesa i replikacije virusne
RNA. Čestice GFLV-a (Slika 3.) često su prisutne u tubularnim strukturama (snopovi, eng.
bundles) koje se akumuliraju u mjehurićima citoplazme ili jezgre. Endocelularne vrpce (eng.
cordon ili trabeculae) su abnormalne ravne cilindrične strukture pektinskih vrpci koje prolaze
Pregled literature
20
kroz stanični lumen (unutrašnjost stanice) različitih tkiva, a posebno su izražene u traheidama,
gdje se pružaju radijalno. Trabekule se lako promatraju u poprečnom presjeku bazalnih
internodija, a češće se mogu naći u američkim podlogama nego u europskim kultivarima.
Njihova prisutnost može se uzeti kao dokaz virusne infekcije, ali njihova odsutnost ne jamči
odsutnost GFLV-a.
Slika 3. Elektronska mikrografija čestica virusa Grapevine fanleaf virus (GFLV). Linija u
donjem lijevom dijelu slike označava 50 nm.
Izvor: http://www.dpvweb.net/dpv/showfig.php?dpvno=385 &figno=11.
Pregled literature
21
2.2. Pregled dosadašnjih istraživanja na mediteranskom području s
posebnim osvrtom na Bosnu i Hercegovinu i Hrvatsku
Na području Bosne i Hercegovine na viruse GFLV i GLRaV upozoravano je još prije
tridesetak godina (Festić i Šutić, 1977). Autori su izvjestili o promjenama vinove loze koje
uzrokuju navedeni virusi (deformacije pojedinih organa, smanjena vitalnost, prerano
odumiranje trsova, slabija oplodnja i prorjeđivanje grozdova, malformacije listova,
asimetričnost i redukcija veličine lista). Buturović i Klindić (1977), kroz dvogodišnje
virološko-nematološko istraživanje, ukazuju koje su vrste nematoda i u kojoj mjeri
zastupljene u hercegovačkim vinogradima. Nakon radova iz 70-ih godina prvi važniji rad
nalazimo u 2007. godini, kada je provedeno prvo testiranje metodom ELISA na 76 uzoraka
(autohtoni kultivari: Blatina, Žilavka, Bena, te alohtoni kultivari: Vranac, Gamay, Moldavia,
Smederevka) (Delić i sur. 2007). U istom radu izvješćuje se o prisutnosti GLRaV-1 i -3 na
autohtonim kultivarima vinove loze na području Bosne i Hecegovine. Naknadno su uslijedila
serološka istraživanja u kojima je testirano 39 uzoraka Blatine i Žilavke na prisutnost 4
virusa: GLRaV-1, GLRaV-3, GFLV i ArMV (Lasić i sur. 2010). Istraživanje je bilo
provedeno u komercijalnom vinogradu na trsovima s dobrim gospodarskim svojstvima koji
nisu pokazivali vidljive znakove virusnih zaraza. Ukupno je 92,3 % testiranih trsova bilo
virotično, što predstavlja vrlo visok stupanj zaraze. U 91,66 % uzoraka utvrđen je GLRaV-3.
Učestalost pojave GFLV bila je 30,55 % dok ArMV nije nađen.
U Bosni i Hercegovini do sada nije sustavno vršena provjera zadravstenoga stanja
vinograda, niti su obavljena cjelovita virološka istraživanja na autohtonim kultivarima
temeljena na suvremenim dijagnostičkim metodama.
Prva istraživanja u Hrvatskoj vezana su za infektivnu degeneraciju vinove loze na
području Istre započela su 50-ih godina 20-og stoljeća (Šarić i Corte, 1959). Autori Šarić
Sabadoš i Corte 1959. godine istaknuli su da su simptomi skraćena internodija, dvostrukoga
nodija, fascijacije, rasta internodija cik-cak, zaostajanje u rastu (kržljavost) i promjene tipa
mozaika na listovima, panaširanosti ili deformacija,vanjske promjene koje ti virusi uzrokuju
na zaraženim biljkama. Šarić (1960) godinu dana kasnije iznosi činjenicu da bolest infektivne
degeneracije nije rasprostranjena samo u Istri, nego i u drugim krajevima Hrvatske uzrokujući
sporo ali sigurno propadanje vinove loze, napomenuvši da se na tu činjenicu ne smije gledati s
nepovjerenjem i ravnodušnošću, nego da se trebaju poduzeti stoge mjere kako bi se zausavilo
Pregled literature
22
njezino rasprostranjenje. Sljedeći je objavljeni rad iz 1963. godine autorā Panjana i Šarić koji
su radili na mogućnosti dijagnosticiranja ArMV-a. Kao rezultat ističu pozitivne reakcije
dobivene kod talijanske Graševine i Kraljevine. Šarić i Hranueli (1977) provode istraživanje
na autohtonim kultivarima u priobalnom području te podlogama, gdje je kao dominantan
izoliran virus lepezastog lista vinove loze (GFLV). Istim istraživanjem navedeni virus utvrđen
je i u kontinentalnom dijelu Hrvatske i to u velikom broju važnijih vinskih sorata i podloga.
Pored istraživanja na autohtonim kultivarima, istraživanja su provedena i na
podlogama. Istraživanja provedena u rasadniku Mladina (Jastrebarsko) na podlozi Kober 5BB
pokazala su relativno nizak stupanj zaraze GFLV-a, te virusima uvijenosti lista vinove loze.
Od 634 testirane podloge Kober 5BB, samo njih 11 (1,74 %) bilo je zaraženo s GFLV-om,
dok zaraza virusima uvijenosti lista kod Kober 5BB od testiranih 514 podloga utvrđena je kod
njih 11 (2,14 %) (Topolovec-Pintarić, 1990).
Na povezanost simptoma uvijenosti lista i jamičavosti drveta sa serološki potvrđenim
virusima na području Slovenije i sjeverozapadne Hrvatske ukazali su svojim istraživamjima
Šarić i Korošec-Koruza 1991. godine. U tom istraživanju kod kultivara Kraljevina i Graševina
klonskoga podrijetla utvrđen je visok stupanj zaraze virusom GLRaV-1, a manji s GLRaV-3,
dok na kultivarima Glera i Pagadebit nije utvrđena prisutnost virusa iz skupine uvijenosti
lista, premda su simptomi uvijenosti lisne plojke prema naličju bili karakteristični. Navedeni
autori ističu potrebu za intenzivnim radom na zdravstvenoj selekciji i daljnjim istraživanjima.
Istraživanja zdravstvenoga statusa hrvatskih autohtonih sorata pokazala su da je veliki
broj trsova zaražen virusima. Poljuha i suradnici (2004) testiranjem 300 uzoraka sorata iz Istre
(Jarbola, Borgonja, Teran, Hrvatica te Muškat Ruža Porečki) utvrdili su da je čak 72,3 %
trsova zaraženo s GLRaV-3. Više od trećine uzoraka bilo je istodobno zaraženo s više virusa,
a kod sorata Hrvatica i Borgonja nije pronađen niti jedan trs da nije zaražen barem jednim od
šest istraživanih virusa.
Peršurić i suradnici (2005) proveli su istraživanje zdravstvenoga stanja šest tržno
najvažnijih autohtonih istarskih kultivara vinove loze koristeći metodu ELISA za detekciju 6
važnih virusa vinove loze (GLRaV-1, GLRaV-3, GFLV, ArMV, GVA). Rezultati te studije
ukazuju da su svi istraživani autohtoni kultivari vinove loze iz Istre zaraženi u visokom
postotku (87 %) najvažnijim virusima.
Na loše zdravstveno stanje najpopularnije i najzastupljenije crne sorte Plavac Mali
ukazuju rezultati testiranja zbirke klonskih kandidata koja se nalazi u sklopu Instituta za
jadranske kulture i melioraciju krša u Splitu. Zdunić i suradnici (2007) utvrdili su da je od 116
Pregled literature
23
biljaka testiranih na prisutnost četiri virusa (GFLV, ArMV, GLRaV-1 i GLRaV-3) bez virusa
bilo samo njih pet. Dominantni virus bio je GLRaV-3 utvrđen u 90 % uzoraka.
Zdunić i sur. (2008.) potvrdili su vrlo loše zdravstveno stanje i kultivara Prč Bijeli,
gdje je od 27 uzoraka testiranih metodom ELISA bez istraživanih virusa bila samo jedna
biljka, 25 ih je bilo zaraženo s GLRaV-3, 17 s GLRaV-1, 3 s GFLV-om, dok nije potvrđena
prisutnost ArMV-a niti kod jednoga uzorka.
U posljednje vrijeme objavljeno je opsežnije istraživanje zdravstvenoga stanja
autohtonih kultivara provedena na širem području Hrvatske, i vezano uz klonsku selekciju
(Karoglan-Kontić i sur., 2009a). Testirano je ukupno 1679 uzoraka iz cijele Hrvatske na
prisutnost 4 virusa: GFLV, ArMV, GLRaV-1 te GLRaV-3. Provedenim testiranjem metodom
ELISA najlošije zdravstveno stanje utvrđeno je na području primorske Hrvatske gdje je
zaraza utvrđena u preko 85 % testiranih uzoraka, a po zastupljenosti na području Dalmacije
dominira GLRaV-3 koji je pronađen u oko 80 % uzoraka. Na istom području pronađeno je
samo 9,8 % nezaraženih trsova, uz napomenu da kod pojedinih sorata nije pronađena ni jedna
zdrava biljka. Na području kontinentalne Hrvatske utvrđena je znatno bolja situacija: zdravo
je bilo gotovo 50 % testiranih uzoraka, a dominantan je virus na tom području GLRaV-1 koji
je utvrđen u oko 45 % uzoraka.
Daljnja istraživanja u 2009. godini (Karoglan Kontić i sur. 2009b) odnosila su se na
prisutnost virusa u komercijalnim vinogradima, posebice u biljkama koje nisu pokazivale
znakove virusne zaraze. U istraživanje je bila uključena 21 sorta: tri sorte iz kontinentalne
Hrvatske (Kraljevina, Škrlet i Graševina), a ostatak iz priobalnoga područja (Borgonja,
Hrvatica, Gegić, Petovka, Plavčina, Teran, Topol, Žlahtina, Babica, Crljenak kaštelanski,
Debit, Dobričić, Galac, Glavinuša, Gustopupica, Lasina, Ljutun, Malvasija dubrovačka,
Mladinka, Ninčuša, Plavac mali, Plavina i Vlaška). Testiran je ukupno 1351 trs, a udio
zdravih biljaka bio je između 11 % i 52,04 % ovisno o regiji Republike Hrvatske. Testirano je
75 trsova sorte Škrlet bijeli i kod 84,6 % utvrđena je prisutnost GLRaV-3 virusa, a u sedam
biljaka nije bilo istraživanih virusa.
Poljuha i sur., 2010. godine provode istraživanje na 18 istarskih autohtonih sorata, od
čega je šest široko rasprostranjeno (Borgonja, Hrvatica, Malvazija istarska, Muškat
momjanski, Muškat ruža i Teran), te 12 ugroženih sorata lokalnoga značenja (Anzulana,
Brajdenica, Dolcin, Duranija, Garganja, Jarbola, Brajdica, Plavinica, Refošk, Surina, Teran
bijeli i Velapergola).
Ukupno je analiziran 781 nasumično odabran uzorak prikupljen s 41 lokacije.
Korištena metoda u radu je ELISA. S najvećim postotkom prevladava GLRaV-3 (69,1%),
Pregled literature
24
zatim GFLV (23,9 %), GLRaV-1 (17,2 %) dok ArMV nije pronađen ni u jednom uzorku.
Ukupno je bilo zaraženo 82,2 % uzoraka od kojih se kod 69 % radilo o pojedinačnim, a kod
31% o zarazama s više virusa. Učestalost pojave virusa bila je veća na područjima intenzivne
vinogradarske proizvodnje (91,8 %), nego kod zemljopisno izoliranih lokacija s ekstenzivnom
vinogradarskom proizvodnjom (48,3 %). Kod zastupljenijih sorata stupanj zaraze varirao je
između 66,1 % kod Terana i 95,8 % kod Borgonje, dok je kod ugroženih sorata od ukupno 76
uzoraka bilo zaraženo njih 47.
Slijedilo je istraživanje kojim je obuhvaćeno područje Dalmacije: ukupno 51
komercijalni vinograd s 13 autohtonih kultivara, a korištenjem metode DAS-ELISA na dva
virusa (GLRaV -1 i GLRaV -3) testirano je 1113 trsova (Vončina i sur., 2009). Postotak
infekcije GLRaV-3 je 79,52 % i zaraza tim virusom je široko rasprostranjena kod svih
istraživanih kultivara, dok je GLRaV-1 nađen u 40,25 % testiranih trsova. GLRaV -3 nije
utvrđen kod kultivara Grk. Istraživanjem je utvrđeno da kod tri autohtona dalmatinska
kultivara (Babić, Babica i Ljutun) u relativno velikom broju analiziranih uzoraka s više
lokacija nije nađen nijedan zdrav trs, a da razlog tako visokih stopa infekcije posebno u
slučaju nekih lokacija i nekih varijeteta tek treba utvrditi (Vončina i sur., 2009). U kaštelskoj
regiji na 7 virusa analizirano je ukupno 323 trsa (6 autohtonih kultivara) iz 10 komercijalnih
vinograda. Visoka stopa infekcije s različitim virusima kakva je nađena u regiji Kaštela nije
potvrđena ni u jednoj drugoj vinogradarskoj regiji Hrvatske. Autori ističu da je obnavljanje
prihvatljivoga zdravstvenog statusa germplazme (s obzirom na viruse na koje su testirali:
GFLV, ArMV, GLRaV -1, GLRaV -2, GLRaV -3, GLRaV -6, GLRaV -7, GFkV, GVA i
GVB) glavni preduvjet za objektvno vrednovanje njezina produktivnog potencijala (Vončina
i sur., 2009a, Vončina, 2011). Do sada u Hrvatskoj nisu nađeni virusi -6 i -7 iz kompleksa
virusa GLRaV (Vončina, 2011). U literaturi nema podataka da je do sada u Hrvatskoj loza
analizirana na viruse GLRaV -4, -5, -6 i -9.
Preiner i sur. (2010.) utvrdili su utjecaj GLRaV-3 na uzgojne karakteristike sorte Grk.
Bez obzira što je istraživanje obuhvaćalo relativno mali broj od svega 5 zaraženih i 5 zdravih
biljaka, dobiveni rezultati ukazuju da je virusna infekcija imala bitan utjecaj na filometrijske
karakteristike, mehaničku strukturu grožđa te pH vrijednost mošta. Kod zdravih biljaka
utvrđena je znatno duža peteljka, znatna razlika između dužine pojedinih lisnih žila, te
karakteristika lisnoga zupca. Kod mošta zaraženih biljaka utvrđena je povećana kiselost.
Budući da je Grk sorta s funkcionalno ženskim cvjetovima, zbog čega nastaju problemi u
oplodnji, zanimljiv je rezultat veći udio oplođenih bobica u masi grožđa kod zaraženih trsova,
iako su ukupno gledajući veći prinosi zabilježeni kod zdravih biljaka.
Pregled literature
25
2.3. Pregled zakonske legislative u Bosni i Hercegovini i EU o temeljnim
čimbenicima kakvoće sadnoga materijala vinove loze
Proizvodnja sadnoga materijala vinove loze u Bosni i Hercegovini propisana je
Zakonom o sjemenu i sadnom materijalu poljoprivrednih biljaka u Bosni i Hercegovini
(Službeni glasnik Bosne i Hercegovine, br.03/05), a Pravilnikom o stavljanju u promet
materijala za razmnožavanje vinove loze u Bosni i Hercegovini (Službeni glasnik Bosne i
Hercegovine, br.50/13) pobliže su utvrđeni uvjeti, detalji i specifičnosti.
Zdravstvena je ispravnost sadnoga materijala vinove loze jedna od temeljnih
čimbenika kakvoće i osnove legislative u tom području su Zakon o zaštiti zdravlja bilja
(Službeni glasnik Bosne i Hercegovine, br.23/03); Pravilnik o službenom nadzoru sadnoga
materijala u Bosni i Hercegovini (Službeni glasnik BiH, br.13/15); Pravilnik o listama štetnih
organizama, listama bilja i biljnih proizvoda i reguliranih objekata (Službeni glasnik Bosne i
Hercegovine, br.48/13) gdje su u listi IV.A. utvrđeni uvjeti koje mora ispunjavati bilje koje je
podrijetlom iz Bosne i Hecegovine (domaća proizvodnja) i koji je u skladu s Council
Directive 2000/29/EC; te Pravilnik o fitosanitarnom registru i o biljnim putovnicama
(Službeni glasnik Bosne i Hercegovine, br.5/13), kao i Pravilnik o izmjenama i dopunama
Pravilnika o fitosanitarnom registru i o biljnim putovnicama (Službeni glasnik BiH, br.35/15).
U Bosni i Hercegovini se trenutačno autohtoni kultivari mogu nabaviti isključivo kao
standardni sadni materijal CAC kategorije, što bi znači da je sadni materijal vinove loze
proizveden prema „zajedničkim načelima u poljoprivredi“ zemljama EU. CAC kategorija je
najniža kategorija sadnoga materijala zakonski propisana na području Europske unije. Osim
sortne čistoće, CAC sadni materijal mora, barem na temelju vizualnoga pregleda, biti bez
parazita i štetnika koji mogu bitno umanjiti vrijednost toga materijala.
Proizvodnja sadnoga materijala u sklopu certifikacijske sheme temelji se na
drugačijim načelima.
Za razliku od sadnoga materijala kategorija CAC, proizvodnja certificiranoga sadnog
materijala nije obvezujuća u zemljama Europske unije. Nacionalne certifikacijske sheme
razlikuju se unutar država članica, ali se sve velikim dijelom oslanjaju na sheme Europske i
mediteranske organizacije za zaštitu bilja (EPPO, eng. European and Mediterranean Plant
Protection Organization).
Pregled literature
26
Vinova loza je prva vrsta koja je postigla EU certifikaciju (Martelli, 2007). Naime
certifikaciju sadnoga materijala započeo je Council of the European Economic community
(EEC) s Direktivom 68/93/EEC pod nazivom Marketing of vegetatively propagated grapevine
material. Direktiva je dopunjena i promijenjena u 71/40/EEC, no nije bila dovoljno
pojašnjena. Nova Direktiva navodila je da matični nasadi za proizvodnju bezvirusna
materijala moraju biti slobodni od GLRaV i GFLV, premda certifikacijski program i načini
testiranja cijepova nisu definirani. Sve je to dovelo do neujednačenosti i velikih razlika u
kvaliteti između zemalja Europe.
Druga je neobičnost EEC Direktive da očigledno postoji mala razlika između
“certificiranoga” i “standardnoga” sadnog materijala. Matične biljke za produkciju
“standardnog” materijala ne smiju biti zaražene virusima fanleaf (GFLV i ArMV) ni virusima
leafroll (GLRaV-1 i GLRaV-3). Produkti rasadnika moraju biti slobodni od istih bolesti, a
kontrole se zasnivaju uglavnom na vizualnim pregledima. To izgleda kao pokušaj ponovna
uvođenja kategorije CAC za vinovu lozu (Martelli, 20073). Prijedlog europskih znanstvenika-
virologa bila bi nadopuna aneksa Direktive 93/1968: kompleks degeneracije i virusi koji idu
uz (degeneraciju), kompleks uvijenosti lista i virusi koji idu uz taj kompleks, kompleks
rugoze drveta i virusi koji idu uz pjegavost (fleck) te, bolesti izazvane fitoplazmama (Martelli,
2007²).
Zemlje koje su prve započele s programima certifikacije su Francuska, Njemačka i
Italija (Martelli, 1999). Direktiva 77/629/EEC nadopunjena je obveznim indeksiranjem kao
metodom determinacije svih virusa. Dodatno, za degeneraciju vinove loze (GFLV) bilo je
potrebno provesti inokulaciju na zeljaste biljke i serološko testiranje. Indeksiranje je
zahtijevalo dvije do tri godine da bi se na biljkama indikatorima razvili simptomi i
vjerojatnost postizanja bezvirusnoga sadnog materijala bila je malo vjerojatna
(Narayanasamy, 2008). ICVG je 1992. godine sažeo certifikacijske programe nekoliko
zemalja u jedan standardni certifikacijski program (Johnson, 2003). Spomenuti certifikacijski
program prihvatio je EPPO, a nadopunjen je 2008. godine (EPPO Bulletin, 2008).
Međunarodna, nevladina organizacija EPPO, sa svojom prvenstveno savjetodavnom
ulogom u fitomedicini, preporuča i sugerira da trenutačni sanitarni minimum za proizvodnju
sadnoga materijala bude odsutnost sljedećih virusa: GFLV, ArMV, GCMV, RpRSV, SLRV,
TBRV, GLRaV-1,-2,-3,-4, GVA, GVB, GRSPV i GFkV (EPPO Bulletin, 2008). S druge
strane European Union Law Direktivom 2005/43/CE Europske unije, nalaže se da cijepovi
3 Predavanja prof.G.P. Martelli
Pregled literature
27
vinove loze moraju biti negativni na sljedeće viruse: GFLV, ArMV, GLRaV-1 i GLRaV-3,
GFkV (samo podloga). Dakle propagativni materijali, bez obzira na to jesu li u komercijalne
ili znanstvene svrhe, trebaju strogo biti u skladu s fitosanitarnim propisima koje je donijela
direktiva EU br. 2005/43/CE, koja definira što se može nazvati "minimalnim" sanitarnim
statusom (Saldarelli i sur. 2012a). Direktivu su usvojile mnoge zemlje EU. Međutim pojedine
zemlje dodatno testiraju sadni materijal na određene viruse, npr. u Italiji je Direktiva
zamijenjena strožim propisom DM 24/6/2008 (Saldarelli, i sur. 2012a) i sadni materijal
podrijetlom iz Italije mora biti negativan i na viruse GVA, GVB, GLRaV-2, GLRaV-7.
Za regionalne certifikacijske standarde (II klasa) preporuka je testiranje prilagoditi
lokalnim uvjetima ovisno o stupnju endemskih zaraza, vinogradarskim uvjetima te potrebama
vezanima uz očuvanje autohtone germplazme (Vončina, 2011).
Materijali i metode
28
3. MATERIJALI I METODE
3.1. Materijali
3.1.1. Kolekcijski nasad
Kolekcijski nasad smješten je na lokalitetu Prokop (Višići), općina Čapljina
(mostarsko vinogorje), pri poduzeću „Agroherc“ d.o.o. Čapljina i u vlasništvu je Aronomsko i
prehrambeno-tehnološkoga fakulteta Mostar. Individualni trsovi autohtonih kultivara, od čega
6 dominantnih (Dobrogostina, Žilavka, Bena, Krkošija, Blatina, Trnjak; Slika 4.) i 25 lokalnih
kultivara/genotipova (Bijela Prošip, Crna Prošip, Dugulja, Lipanjka, Mala Blatina, Blatina
stara, Medenka, Menigovka, Plavka, Podbil, Prošip, Rizling, Ruža, Suščevka, Šilja, Šljiva,
Toboluša, Uzbrdnjača, Zlatka, Zložder, Žilavka Žuta, Žilavka stara, Žuičar (uz dva genotipa
pod oznakama NN), čine zbirku toga kolekcijskog vinograda s ukupno 31 genotipom. Svi su
genotipovi na podlozi SO4 (V. berlandieri x V. riparia). Način je uzgoja jednokraki ili
dvokraki kordonac, uobičajen za uzgojno područje. Svaki genotip sastavljen je od 20 trsova
posađenih u bloku od 5 trsova po slučajnom rasporedu. Eksperimentalni je dizajn
kolekcijskoga nasada potpuno slučajni blok raspored.
Slika 4. Shema rasporeda trsova analiziranih na zarazu virusima u kolekcijskom nasadu
Višići.
Materijali i metode
29
3.1.2. Terenska istraživanja i podrijetlo virusnih izolata (izvor antigena)
Pregledno istraživanje i obilježavanje trsova autohtonih kultivara (Tablica 2.)
uključenih u ovu studiju obavljeno je u privatnim vinogradima dva glavna vinogorja Bosne i
Hercegovine tijekom rujna 2011. godine.
Biljni materijal bio je sakupljen iz ukupno šest općina (Ljubuški, Čitluk, Grude,
Mostar, Čapljina, Stolac), gdje se nalazi većina vinograda u Bosni i Hercegovini.
Uzorkovanje je bilo provedeno i u kolekcijskom nasadu, gdje su na jednom mjestu zastupljeni
svi kultivari koji se analiziraju u ovoj studiji. Uzorkovanje je također bilo provedeno u 3
komercijalna vinograda uključena u pozitivnu masovnu selekciju koju provodi Federalni
agromediteranski zavod Mostar.
Načelo za uzorkovanje bilo je utvrđeno prema podacima Vinogradarskoga katastra
Federacije Bosne i Hercegovine (u izradi). Broj uzoraka prikupljenih u svakom izabranom
vinogradu određen je uzimajući u obzir sljedeće odrednice:
a) važnost uzgojna područja,
b) važnost kultivara u svakoj regiji,
c) tip vinograda (intenzivan plantažni uzgoj, poluintenzivan plantažni uzgoj, ekstenzivan
uzgoj, kolekcijski nasad).
Za svaki prikupljeni uzorak/vinograd prikupljeni su podaci:
1. naziv kultivara,
2. starost biljaka i točna pozicija u vinogradu (tabla, red, prored, položaj u redu),
3. podrijetlo sadnoga materijala,
4. upotrijebljena podloga,
5. glavni problemi/bolesti u vinogradu.
Ukupno 1332 uzorka bilo je prikupljeno tijekom istraživanja:
I. iz ukupno 20 vinograda (Tablica 3. i Tablica 18. Priloga 2.)
II. iz jedan kolekcijski nasad (vinograd br. 20 s rasporedom kultivara prikazanim na Slici
4.).
Materijali i metode
30
III. iz osam registriranih vinograda/vinarija (intenzivan uzgoj; vinogradi br. 2.,5.,7.,
8.,13.,14.,15. i 16. navedeni u Tablici 3.).
IV. iz tri vinograda uključena u pozitivnu masovnu selekciju (vinogradi br. 13.,14. i 15.
navedeni u Tablici 3.).
Biljni materijal bio je prikupljen od listopada 2011. do veljače 2012. Svaki uzorak
sastojao se 2 – 3 reznice dužine 30 – 40 cm, prikupljene s bazalnoga dijela jednogodišnjih,
dobro odrvenjelih rozgvi. Uzorkovani trsovi odabrani su nasumično u vinogradu i većina ih
nije imala vidljive simptome. Uzorci su bili pohranjeni na 4° C do početka testiranja. Trećina
uzoraka testirana je u 2012. godini, dok je radi nedostatka sredstava za nabavu kemikalija
ostatak uzoraka testiran u 2013. godini.
Strugotine floemskoga tkiva sa zrelih rozgvi homogenizirane su uz ekstrakcijski pufer
i korištene kao izvor antigena.
Tablica 2. Glavni autohtoni kultivari u Bosni i Hercegovini i broj uzetih uzoraka za virološke
analize.
Naziv
Kultivara
Zastupljenost
kultivara
(vodeći ili
prateći)
Odrednica
kultivara
Boja
grozda
Broj
vinograda
s kojih je
uzorkovan
Broj uzetih
uzoraka
Žilavka Vodeći vinska bijela 6 278
Blatina Vodeći vinska crvena 6 350
Trnjak Prateći vinska crvena 8 309
Bena Prateći vinska bijela 4 166
Dobrogostina Prateći vinska/stolna bijela 5 117
Krkošija Prateći vinska bijela 5 112
Materijali i metode
31
3.1.2.1. Autentičnost uzoraka
Kod odabira uzoraka uzimana je u obzir sortnost odnosno autentičnost sorte. Sorte
Žilavka i Blatina najčešće su zastupljene u vinogradima Hercegovine te zajedno s Krkošijom,
Benom i Dobrogostinom (od bijelih) odnosno Alicante Bouschet i Trnjakom (od crnih) čine
više od 80 % ukupnih površina (Lasić, 2014). Žilavka i Blatina su sorte poznatih i opisanih
svojstava (Bulić, 1949, Vuksanović i sur., 1977, Mirošević i Turković, 2004, Beljo i sur.
2014). Kao polazna točka u potvrđivanju sortnosti korišten je kolekcijski nasad hercegovačkih
sorta vinove loze u Višićima koji pripada Agronomskom i prehrambeno-tehnološkom
fakultetu Sveučilišta u Mostaru te dostupni opisi hercegovačkih sorta u vinogradarskoj
literaturi (Bulić, 1949, Vuksanović i sur., 1977, Mirošević i Turković, 2004, Beljo i sur.
2014). Sorte u tom nasadu profilirane su SSR molekularnim markerima i dijelom su
ampelografski opisane (Leko i sur., 2012., Beljo, i sur., 2014., Lasić, i sur., 2015.) u svrhu
otklanjanja sinonima i homonima (prof.dr.sc. Jure Beljo, dr.sc. Viktor Lasić, Ana Mandić,
dipl.ing.agr. i Marijo Leko, dipl.ing.agr.).
Pri označavanju i uzorkovanju materijala na terenu sudjelovala su i dva ampelografa
praktičara: mr.sc. Branko Rogić i Mladen Gašpar, dipl.ing. koji imaju višegodišnje iskustvo u
uzgoju i preradi vinove loze, čime se osigurala vjerodostojnost oko sortnosti svih uzoraka
ovoga istraživanja („true-to-type“).
3.1.2.2. Kultivatri u istraživanju
Ovo istraživanje provođeno je na šest autohtonih kultivara s područja Hercegovine.
Radi se o kultivarima: Blatina, Žilavka, Trnjak, Bena, Krkošija i Dobrogostina. Za sve
kultivare slijede karakteristike: sinonim, podrijetlo, rasprostranjenost, unutar sortna
varijabilnost, botanički opis i gospodarsko-tehnološka svojstva što je preuzeto iz Atlasa
vinogradarstva i vinarstva Bosne i Hercegovine (Beljo, i sur., 2014).
Blatina je autohtoni kultivar Hercegovine. Zbog rizika u oplodnji zovu je Zlorod ili
Praznobačva. Ima više hipoteza o njezinu podrijetlu i nazivu. Jedni smatraju da je najprije
uzgajana oko Mostara odakle se raširila po Hercegovini i djelomice susjednoj Dalmaciji.
Drugi smatraju da potječe iz doline Neretve iz neretvanskoga blata po čemu je dobila ime.
Raširena je u cijelom hercegovačkom vinogradarskom kraju kao najvažniji kultivar crnoga
grožđa. Zapažene su stanovite razlike unutar kultivara, ali nisu još dovoljno proučene.
Materijali i metode
32
Ima veoma bujan trs, vrh je mladice neznatno povijen, ružičastozelene boje, slabo
dlakav. List je krupan, petodijelan, sinusi su duboki i preklopljeni, peteljkin sinus je zatvoren i
preklopljen. Lišće je tamnozelene boje, lice lista golo, naličje dlakavo. Rebra pri osnovi
crvenkaste boje. Zupci plojke srednji i oštri. Peteljka dugačka, crvena, ali kraća od plojke.
Cvijet je funkcionalno ženski, tučak je normalan, ali su prašnici zakržljali i spušteni. Stoga se
Blatina mora saditi u smjesi s drugim kultivarima koje će joj biti oprašivači. Grozd: srednje
krupan do krupan, ovisno o uspješnosti oplodnje. Oblik je grozda valjkast i piramidalan.
Uglavnom je rastresit, ali je pri dobroj oplodnji zbijen. Bobica je obično krupna, ali je u
grozdu često nejednake krupnoće zbog neujednačene oplodnje. Okrugle su s tankom i
glatkom pokožicom. Boja je pokožice tamnoplava do crna. Meso je bezbojno.
Dozrijeva u III. dekadi. Oplodnja je neredovita zbog specifične građe cvijeta. Ovisno o
oplodnji prinos može biti nizak do veoma visok. Dobre rezultate daje uzgojem na toplim i
nešto suhljim položajima. Mošt sadrži u prosjeku 18 – 21 % šećera, 6 – 7 g/L ukupnih
kiselina. Vino je tamnocrvene boje, aromatično i veoma ugodna okusa, traženo i cijenjeno.
Dobra kompatibilnost s podlogama koje se koriste u našem području.
Žilavka je autohtoni bijeli vinski kultivar koji se uzgaja na cijelom vinogradarskom području
Hercegovine i manjim dijelom u Dalmaciji. U vrijeme bivše Jugoslavije uzgajana je u
Makedoniji i na Kosovu. Klonovi u okviru toga kultivara za sada nisu izdvajani iako su
zapažene razlike u morfološkim svojstvima. Postoje dva varijeteta koja se razlikuju po boji
bobica, nazvani zelenka i žutka. Neki također spominju više različitih klonova. No tek analiza
genetskih markera poput AFLP, S-SAP ili SNP može pokazati postoje li genetske razlike
među varijetetima i klonovima.
Trs je bujan, vrh je mladice u potpunosti otvoren. Dlačice su na vrhu mladice srednje
gustoće. Položaj je mladice na trsu uspravan. List je srednje velik, kružna oblika i petodijelan.
Liske se peteljkinoga sinusa preklapaju, ali ne u potpunosti. Baza je peteljkinoga sinusa u
obliku slova V i nije ograničena nervaturom. Lice lista glatko i svijetlozelene boja, a naličje
dlakavo blijedozeleno. Gornji postrani sinusi su srednje urezani. Peteljka debela, blijedo
crvenkaste boje. Cvijet je morfološki i funkcionalno hermafroditan. No ponekad se u cvijetu
javljaju anomalije pri otvaranju i na takvim trsovima nema oplodnje, pa ih je dobro
precijepiti. Grozd je srednje veličine i srednje dužine. Peteljka je kratka. Grozd je piramidalna
ili cilindrična oblika, dosta zbijen. Na grozdu se nalaze 1 ‒ 2 krilca. Bobica je srednje duga i
srednje široka. Oblik bobice je sferni. Boja pokožice je zelenožuta, a na suncu zlatnožuta.
Materijali i metode
33
Pokožica je žiličasta, pa otuda teorija da je sorta po tome dobila ime. U bobici su u prosjeku
tri sjemenke i nisu u potpunosti razvijene.
Dozrijeva u III. dekadi, pa je srednje kasna sorta. Oplodnja je normalna i redovita i
prilično je prinosna sorta. Sadržaj šećera u moštu varira 19 – 24 %. Vino Žilavke je visoke
kakvoće s izraženom aromom, zelenožute boje.
Tnjak. Smatra se autohtonom sortom Dalmatinske zagore odakle se proširila u Hercegovinu.
Ima zabilježene sinonime: Trnak, Kovačuša i Rudežuša. Gaji se oko Imotskoga, Vrgorca,
Gruda, Ljubuškoga, a danas se širi i u ostale dijelove Hercegovine. Postoje razlike između
tipova unutar sorte. Veliki trnjak ima duži grozd i krupne bobice, a Mali trnjak ima manji
zbijeniji grozd i sitnije bobice. Selekcija unutar sorte nije provođena.
Trs veoma bujan. Vrh mladice poluotvoren i povijen, s jednom do dvije vitice. List je
okrugao ili duguljast, slabo urezan, petodijelan, naličje golo, peteljkin sinus zatvoren i u
obliku lire. Zupci uspravni. Peteljka lista kratka. Cvijet morfološki i funkcionalno
hermafroditan. Grozd je srednje veličine, zbijen, piramidalna oblika. Ima jedno do dva krilca.
Bobice su srednje krupnoće, okrugle i modre. Meso intenzivno obojeno, pa može služiti kao
bojadiser za Blatinu. Sjemenke potpuno formirane.
Oplodnja redovita, rodnost dobra. Dozrijeva u III. dekadi. Najbolje mu odgovaraju tla
tipa crvenica, srednje visoko stablo i kratak rez. Ožiljava se dobro, afinitet s podlogama poput
Kobera 5BB je dobar. Ima visok sadržaj šećera i obojeno meso. Vino je rubin tamnocrvene
boje, jako, puno, harmonično, ugodne arome.
Bena je nepoznata podrijetla i smatra se autohtonim hercegovačkim kultivarom. Zabilježen
sinonim kultivara je Benac. Bena je raširena po cijelom području Hercegovine kao prateća
sorta Žilavki. Varijabilnost unutar kultivara nije proučena.
Trs nešto slabiji nego u Žilavke. Mladica srednje debljine, plosnata, glatka s glatkim
dlačicama, zatvoreno žute boje. List srednje veličine, petodijelan, s urezima koji dopiru do
polovice plojke i u dnu su zakržljali. Peteljkin sinus otvoren u obliku slova V, često je
zatvoren, ali nije preklopljen. Plojka je čvrsta i debela, s lica hrapava, a naličje dlakavo samo
na rebrima. Rebra su zelena s obje strane, zupci sitni i tupi. Rub lista savijen na niže. Cvijet
morfološki i funkcionalno hermafroditan. Grozd je velik, razgranat, rastresit, piramidalan,
obično s jednim krilcem. Peteljka grozda kratka i odrvenjena. Bobice su velike, duguljaste ili
jajolike, glatke i prozračne, zlatnožute boje, pokožica tanja nego kod Žilavke. Meso je slatko,
Materijali i metode
34
bez izražene arome s 1 ‒ 2 sjemenke. Bobice se vrlo lako osipaju i pri slabijem potresu, što joj
je veliki nedostatak. Gospodarsko-tehnološka svojstva: sazrijeva u prvoj polovini rujna.
Oplodnja je normalna i redovita. Sorta je za toplije krajeve, jako otporna prema plamenjači i
pepelnici. Rodnost je dobra uz kratku rezidbu. Izdržljivija je od Žilavke, pa može uspijevati
na slabijim i nepovoljnim položajima.
Mošt sadrži 16 ‒ 22 % šećera i 4,9 – 7,8 g/L ukupnih kiselina. Vino je osrednje
kakvoće, jer sadrži manje alkohola od Žilavke. Bena nema slast Žilavke i Krkošije i kao
vinski kultivar zaostaje za njima, ali se može miješati s ta dva kultivara. Može se koristiti i u
svježem stanju.
Krkošija je autohtoni bijeli vinski kultivar Hercegovine. Kultivar ima više sinonima: Krkošija
šupljica, Krkošija ptičarka. Postoje još kultivari koje su nosili isti naziv poput Krkošije žute,
Krkošije pirgave ili Biserke. Raširena je u cijeloj Hercegovini, najviše oko Čitluka,
Ljubuškog, Mostara, a u gornjoj je Hercegovini danas skoro nema iako je nekada oko Konjica
bila veoma raširena. Širi se oko Trebinja, a ima je i u Dalmaciji. Veoma je heterogen kultivar,
jer ima više tipova. No selekcija klonova nije provođena.
Trs je srednje bujan, vrh je mladice povijen u stranu, zelene je boje i blijedo dlakav.
Jednogodišnja je mladica debela, rebrasta, glatka sa srednje dugim internodijima. List je
srednje velik, stožasta do okruglasta oblika, petodijelan do sedmodijelan, s dubokim urezima.
Peteljkin sinus je također preklopljen. Lice je lista tamnozeleno, a naličje blijedozeleno. Zupci
su srednje veličine i tupi. Peteljka je lista kratka i srednje debljine. Cvijet je dvospolan, no
katkad popraćen s pojavom anomalije u otvaranju cvjetne kapice u vidu zvjezdice, što
doprinosi slabijoj oplodnji i zametanju bobice. Grozd je srednje velik, zbijen ili katkad
rastresit, stožasta oblika, sa srednje dugom peteljkom. Bobica je okrugla, a ponekad malo
sploštena. Pokožica žutozelena, osrednje debela, s mnogo smeđih točkica. Sok je bezbojan,
vinasto-kiselkasta okusa.
Dozrijeva u III. dekadi kao i Žilavka. Oplodnja je neredovita zbog pojave anomalija u
građi cvijeta. Nije sigurne rodnosti zbog smjese različitih tipova. Voli propusna tla s dovoljno
vlage kakve su crvenice lokalitata: Brotnja, Dubrava i oko Ljubuškoga. Ne podnosi sušu i
suviše mršava tla. Sorta je veoma izdašna u količini šećera, a ima više kiselina od Žilavke.
Daje vino zelenkastožute boje, s dosta alkohola, s dobrim ekstraktom, ali je bez arome. U
čistom sortnom sastavu nije dobre kakvoće, ali se dobro kombinira sa Žilavkom.
Materijali i metode
35
Dobrogostina. Nepoznata je podrijetla, može biti iz Hercegovine ili Dalmacije. Uzgaja se na
području cijele Hercegovine i u Dalmaciji. Nekada se veoma mnogo uzgajala na području
Konjica pod imenom Toboluša. Zabilježen sinonim Toboluša, a po Buliću još se zove Trbljan
bijeli i Dragoboština. Međutim analiza genetskih markera pokazala je da Dobrogostina nije
srodna s Trbljanom. Zapaženi su različiti tipovi, ali klonska selekcija nije provođena.
Trs je srednje razvijen i srednje bujan. Vrh je zelene mladice tanak, savijen, vunast i
jasno zelen. List srednje veličine do velik, okrugao ili duguljast, petodijelan do sedmodijelan,
lice zeleno i golo, a naličje malo vunasto, peteljkin sinus široko otvoren, a postrani zatvoreni.
Zupci krupni i dugi. Peteljka umjereno duga. Cvijet je morfološki i funkcionalno
hermafroditan. Grozd je velik, težak katkad više od kg, piramidalan, rastresit ili srednje
zbijen, drška grozda debela i drvenasta. Bobice nejednake, ali većinom velike i po koja
srednja, okrugle, žutozelene boje, neprozirne, meke i sočne, pokožica tanka.
Traži duboka i umjereno vlažna zemljišta. Prema bolestima nije jako osjetljiva.
Pripada najrodnijim kultivarima. Kako su joj bobice krupne i pune soka, a pokožica tanka, to
u vlažnim i kišovitim godinama lako pucaju. Dozrijeva u IV. dekadi. Grožđe je dobro za jelo
kao stolna sorta, ali se ne može dugo čuvati. Iz Konjica se u prošlosti kao stolno grožđe velika
količina prodavala u Bosni. Mošt sadrži u prosjeku 16 ‒ 19 % šećera i 6 ‒ 8 g/L ukupnih
kiselina. Vino je srednje jačine, s 9 – 11 % alkohola i vrlo harmonično.
3.1.3. Lokacije uzorkovanja
Uzorkovanje se vršilo u vinogradima različite starosti, iz reprezentativnih vinograda
šest općina hercegovačkih vinogorja u kojima se uzgajaju šest autohtinih kultivara. Tablica 3.
prikazuje redni broj vinograda, naziv kultivara koji se uzorkovao u tom vinogradu i točan broj
uzorka. Detaljne informacije o vinogradima (Tablica 3.) prikazane su u Tablici 18. u
poglavlju Prilog.
Materijali i metode
36
Tablica 3. Broj prikupljenih uzoraka po kultivarima i vinogradima.
Oznaka
vinograda
Autohtoni
kultivar
Broj
uzoraka
Oznaka
vinograda
Autohtoni
kultivar
Broj
uzoraka
Vinograd 1. Krkošija 25 Vinograd 11. Trnjak 15
Vinograd 2 Dobrogostin
a
33 Vinograd 12. Žilavka 29
Vinograd 3. Dobrogostin
a
17 Vinograd 13 Žilavka
Blatina
Trnjak
44
50
50
Vinograd 4. Dobrogostin
a
Krkošija
47
13
Vinograd 14. Žilavka
Blatina
150
163
Vinograd 5. Blatina
Trnjak
50
8
Vinograd 15. Trnjak 94
Vinograd 6. Trnjak
Bena
23
37
Vinograd 16. Žilavka
Bena
21
82
Vinograd 7. Bena 29 Vinograd 17. Krkošija 10
Vinograd 8. Krkošija 43 Vinograd 18. Dobrogostina 7
Vinograd 9. Blatina
Žilavka
19
17
Vinograd 19. Blatina
Trnjak
50
50
Vinograd 10. Trnjak 53 Vinograd 20. Žilavka
Blatina
Trnjak
Dobrogostina
Krkošija
Bena
17
18
16
18
19
18
Točan položaj vinograda iz Tablice 3. prikazan je na Slici 5. Tri vinograda smještena su u
općini Grude te su sastavni dio širokobriješkoga vinogorja. Vinogradi smješteni u
mostarskom vinogorju su: devet vinograda u općini Ljubuški, a 8 vinograda smješteno je u 4
općine: Čitluk, Čapljina, Mostar i Stolac.
Materijali i metode
37
Slika 5. Mapa položaja s lokacijama vinograda u kojima su u ovom radu analizirane viroze.
Materijali i metode
38
3.1.4. Osnovne kemikalije
Pri radu korištene su sljedeće osnovne kemikalije:
1. agaroza (Sigma-Aldrich, SAD)
2. tekući dušik (Messer Mostar, BiH)
3. etanol 96 % (Semikem, BiH)
4. RNase Free water 12x1,9 ml (Qiagen, Njemačka)
5. Gel Pilot 100bp Plus Ladder (100) 600μl (Qiagen, Njemačka)
6. Gel Pilot Loading Dye 5x (6x 500μl) (Qiagen, Njemačka)
7. pufer Tris-borat-EDTA (TBE) 5 X (Sigma-Aldrich, SAD)
8. GelRed Nucleic Acid Gel Stain (10,00 x u vodi) i Gel Red (Omni, Sweden)
9. β-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich, SAD)
10. reakcijska smjesa za PCR-umnažanje (mastermix) [5x FIREPol® Master Mix
Ready to Load (7.5 mM MgCl2), SolisBioDyne, Estonia].
3.1.5. Puferi i otopine
- agarozni gel (1,5 %) – 1,2 g/0,45g agaroze 80 mL/30mL 1XTBE pufer
- etidijev bromid (Sigma-Aldrich, SAD)
4.1.6. Oligonukleotidne početnice
Početnice su sintetizirane u tvrtki Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Njemačka). U radu su
korištene početnice čije su karakteristike prikazane u Tablici 4.
Materijali i metode
39
Tablica 4. Početnice korištene za PCR-amplifikaciju genomskih segmenata odabranih virusa.
ID početnice
Sekvencija početnice (5'-3')
Ime virusa
Temperatura
sparivanja
početnice i
kalupa
(annealing)
Dimenzija
amplikona
(pb)
Referenca
GLR2CP1
GLR2CP2
ATGGAGTTGATGTCCGAC
TACATAACTTCCCTTCTACC
Grapevine leafroll-associated virus-2 (GLRaV-2)
52
600
Abou Ghanem-
Sabanadzovic i
sur., 2000
LR4-HSP V
LR4-HSP C
ACATTCTCCACCTTGTGCTTTT
CATACAAGCGAGTGCAATTACA
Grapevine leafroll-associated virus-4 (GLRaV-4)
56
319
Osman i sur.,
2007
LR 5HSP V
LR5HSP C
AACACTCTGCTTTTCTGCTGGCA
TCTCCAGAAGACGGACCAATGTAA
Grapevine leafroll-associated virus-5 (GLRaV-5)
56
273
Osman i sur.,
2007
EST-1
EST-2
TCACAACAGCCTGAACCATCAC
CTCTGTTAGAACCGGACTTATTG
Grapevine leafroll-associated virus-6 (GLRaV-6)
58
350
Abou Ghanem-
Sabanadzovic i
sur., 2012 i
osobna
komunikacija
Sabanadzovic
LR7G23 met L
LR7 G23 met U
TACCACTACCAGGAGGTTTATTCA
AATGACTGTGATGTCGCTTTTAC
Grapevine leafroll-associated virus-7 (GLRaV-7)
55
200
Turturo i sur.,
2000
LR9-F
LR9-R
CGGCATAAGAAAAGATGGCAC
TCATTCACCACTGCTTGAAC
Grapevine leafroll-associated virus-9 (GLRaV-9)
58
393
Alkowni i sur.,
2004
Materijali i metode
40
3.1.7. Pozitivne kontrole
Pozitivne kontrole su iz Laboratorija UC DAVIS (Fundation Plant Services University
of California, Davis, SAD). Dopremljene su kao izolirana ukupna RNA (eng. total RNA;
TRNA) precipitirana (istaložena) u otopini etanola i natrijeva acetata za viruse: GLRaV-2,
GLRaV-4,-5,-6,-7,-9. Prije provedbe analiza trebalo ih je vratiti u otopinu prikladnu za
upotrebu u RT-PCR (Prilog 1.).
3.1.8. Standard za utvrdjivanje DNA molekularne mase (DNA fragment size)
U svim elektroforetskim analizama nukleinskih kiselina korišten je marker
GeneRulerTM
100bp DNA Ladder Plus (Fermentas, USA) koji sadrži 14 fragmenata dužine
3000, 2000, 1500, 1200, 1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 i 100 parova baza (pb).
3.1.9. Komercijalni dijagnostički kompleti (kitovi)
- GFLV ELISA kit (IgG polikolnski za oblaganje, monoklonski konjugat), ArMV ELISA kit
(polikolnski IgG za oblaganje, polikolnski konjugat), GLRaV-1 ELISA kit (monoklonski IgG
za oblaganje, monoklonski konjugat), GLRaV-3 ELISA kit (polikolnski IgG za oblaganje,
monoklonski konjugat), GLRaV-2 ELISA kit (monoklonski IgG za oblaganje, polikolnski
konjugat), GLRaV-4-9 ELISA kit (monoklonski IgG za oblaganje, monoklonski konjugat),
GVA ELISA kit (polikolnski IgG za oblaganje, poliklonski i monoklonski konjugat), GFkV
ELISA kit (polikolnski IgG za oblaganje, monoklonski konjugat); po 960 reakcija (Bioreba,
Švicarska) ), kompletni reagensi za dokazivanje virusa metodom ELISA.
- GFkV ELISA kit (monoklonski), GVA ELISA kit (monoklonski), ArMV ELISA kit
(polikolnski), GLRaV-1 ELISA kit (polikolnski), GLRaV-3 ELISA kit (polikolnski), GLRaV-7
ELISA kit (polikolnski), GVB ELISA kit (monoklonski), po 960 reakcija (Agritest, Italija),
kompletni reagensi za dokazivanje virusa metodom ELISA.
- RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Njemačka), kompletan pribor za izolaciju ukupne RNA
(eng. total RNA, TRNA) iz biljnoga materijala.
Materijali i metode
41
- QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (Qiagen, Njemačka), komplet reagensa za reverznu
transkripciju i umnažanje fragmenata virusnoga genoma lančanom reakcijom polimeraze.
3.2. Metode
Određivanje pojavnosti viroza detekcijom virusa u prikupljenim uzorcima provedeno je
testiranjem trsova sljedećim dijagnostičkim metodama:
vizualnim pregledom simptoma
serološkim metodama (ELISA)
detekcija virusa metodom RT-PCR.
3.2.1. Vizualni pregledi simptoma virusnih zaraza
U kolekcijskom nasadu Višići bila je analizirana simptomatologija. Tijekom dvije
proizvodne sezone (2011./12. i 2012./13. g.) bilo je vršeno vizualno praćenje analiziranih
trsova. U svakoj sezoni bila su obavljena 4 pregleda (Tablica 5.), prilikom čega su bilježene
sve promjene primjećene na: listovima, mladicama, rozgvi, grozdovima, a koje su kasnije
povezane s rezultatima laboratorijskih testova (ELISA i RT-PCR). Korišten je program MS
Access (Microsoft, SAD) za upravljanje prikupljenim i pohranjenim podacima.
Tablica 5. Prikaz obavljenih vizualnih pregleda kroz dvije vegetacijske sezone (A 2011./12. i
B 2012./13. g.)
Broj pregleda Datum
pregleda
Oznaka
fenološke faza
Opis
fenološke faze
1A 3.4.2012. C-D zeleni vrh pupa –
pojava listića
2A 5.6.2012. H-I odvojeni cvjetni
pupovi – cvatnja
3A 21.8.2012. L šarak
4A 8.11.2012. mirovanje mirovanje
Materijali i metode
42
nastavak Tablice 5.
Broj pregleda Datum
pregleda
Oznaka
fenološke faza
Opis
fenološke faze
1B 30.3.2013. C-D zeleni vrh pupa –
pojava listića
2B 4.5.2013. F-G pojava grozdića –
odvojeni grozdići
3B 4.9.2013. L šarak
4B 3.12.2013. mirovanje mirovanje
3.2.2. Serološke metode za detekciju virusa
Serologija kao odabrana metodologija za dijagnosticiranje virusa, zasniva se na
upotrebi virus-specifičnih protutijela. Metoda je vrlo osjetljiva, pouzdana i brza. Zbog svoje
pouzdanosti i relativno niske cijene u otkrivanju virusa, posebice u istraživanjima većih
razmjera, ELISA je najkorisnija rutinska serološka tehnika (Clark i Adams, 1977) i zbog svoje
jednostavnosti i prilagodljivosti jedna od najčešćih metoda detekcije virusa u biljkama
(Copeland, 1998). Navedena tehnika naziva se i enzimski imunotest na čvrstoj fazi.
U toj studiji bile su korištene četiri različite izvedbe metode ELISA:
• dvostruka protutijelna sendvič ELISA (DAS-ELlSA) – BIOREBA i Agritest
• dvostruka protutijelna sendvič ELISA uz prethodno oblaganje mikrotitarskih pločica s
proteinom A (Protein-A DAS ELlSA) – Agritest
• trostruka protutijelna sendvič ELISA (TAS-ELISA) – Agritest
• dvostruka protutijelna sendvič indirektna ELISA uz direktno vezanje antigena – (antigen
direct binding DASI ELISA) – Agritest.
Ekstrakti kortikalnih strugotina iz zrelih rozgvi bili su korišteni kao izvor antigena u
testiranju.
Materijali i metode
43
3.2.2.1. Virusi obuhvaćeni testiranjem metodom ELISA
Nakon prikupljanja uzoraka, oni su testirani na prisutnost deset virusa (Tablica 6.) primjenom
metode ELISA. Svaki je uzorak testiran dva puta, tj. nanošen je u duplikatu na mikrotitarsku
ploču kao što je bio slučaj i s pozitivnim i negativnim kontrolama nabavljenima kod
proizvođača protutijela.
Tablica 6. Taksonomski pregled virusa testiranih metodom ELISA (Izvor: ICTV)
Red Porodica Potporodica Rod Vrsta
Picornavirales Secoviridae Comovirinae Nepovirus Arabis mosaic virus ArMV
Grapevine fanleaf virus GFLV
Tymovirales Tymoviridae - Maculavirus Grapevine fleck virus GFkV
Betaflexiviridae - Vitivirus Grapevine virus B GVB
Grapevine virus A GVA
- Closteroviridae
- Ampelovirus Podgrupa I
Grapevine leafroll-
associated virus 1
GLRaV-1
GLRaV-3
GLRaV-4
Grapevine leafroll-
associated virus 3
Podgrupa II
Grapevine leafroll-
associated virus 4
(-4, -5, -6, -9)
- Closterovirus Grapevine leafroll-
associated virus 2 GLRaV-2
- Velarivirus Grapevine leafroll- GLRaV-7
associated virus 7
3.2.2.2. Dvostruka protutijelna sendvič ELISA (DAS ELlSA)
Taj je test bio primijenjen za otkrivanje: GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3, GLRaV 4-9,
GLRaV -7, GFLV, GVA, ArMV i GFkV i proveden je korištenjem standardnih procedura
proizvođača kompleta reagensa (BIOREBA i Agritest). Polistirenske ploče bile su obložene
poliklonalinim protutijelima (IgG) razrijeđenim u puferu za oblaganje i inkubirane na 30° C
Materijali i metode
44
tijekom 4 sata (za Agritest 2h na 37° C), a zatim su bile isprane tri puta s puferom za
ispiranje. U svaku jažicu MTP naneseno je po 200 µL homogenata uzoraka i ploče su
inkubirane na 4° C, preko noći. Nakon novoga ispiranja, bila je dodana mješavina alkalnom
fosfatazom konjugiranih protutijela (antibody-AP-conjugate) u svaku jažicu po 200 µL, te su
ploče inkubirane na 30° C tijekom 5 sati (za Agritest 2h na 37° C). Nakon ispiranja, svježe
pripravljeni p-nitrofenil fosfat u supstratnom puferu (1 mg/mL) bio je dodan, po 200 µL u
svaku jažicu. Ploče su bile inkubirane na sobnoj temperaturi u tami. Nakon jednoga i nakon
dva sata inkubacije, obavljeno je fotometrijsko očitavanje vrijednosti apsorbancije pri 405 nm
upotrebom spektrofotometrijskoga čitača mikortitarskih ploča (opisano u poglavlju 4.2.2.6.).
3.2.2.3. Dvostruka protutijelna sendvič ELISA uz prethodno oblaganje mikrotitarskih
pločica s proteinom A (Protein-A DAS ELlSA)
Za GVA analize prvi korak postupka sastoji se u presenzibilizaciji mikrotitarske ploče
s proteinom A, koji ima visoki afinitet za (FC) frakcije IgGs. To uzrokuje orijentaciju IgGs
aktivnom stranom, i time optimizira antigensko vezivanje (Boscia u sur., 1992). Uobičajeni
DAS-ELlSA postupak slijedi nakon toga.
3.2.2.4. Trostruka protutijelna sendvič indirektna ELISA (TAS ELISA)
Taj se postupak primjenjuje za GFkV (Agritest, Italija). TAS ELISA razlikuje od DAS
ELlSA zbog upotrebe trećega protutijela u posljednjem koraku. Nakon prva dva slična koraka
(coating s Pab i dodavanja uzoraka), monoklonalna protutijela u PBS bila su dodana u jažice i
inkubirana 2 sata pri 37 °C. Nakon ispiranja, dodano je anti-mišje enzimom markirano (anti
mouse enzyme-labeled) protutijelo, a ploče su nakon inkubacije očitane pri 405 nm.
3.2.2.5. Dvostruka protutijelna sendvič indirektna ELISA uz direktno vezanje antigena
(DASI ELISA)
Dvostruka protutijelna sendvič indirektna ELISA (DASI ELISA) uz direktno vezanje
antigena (antigen direct binding) bila je korištena za GVB (Agritest, Italija) analizu uzoraka
Materijali i metode
45
vinove loze. Kod tih analiza homogenat uzorka prenesi se izravno u jažicu, bez prethodnoga
senzibiliziranja s protutijelom. Postupak se nastavlja kao normalna TAS ELISA, dodavanjem
monoklonskih protutijela u PBS-u i anti-mišjih protutijela konjugiranih s enzimom (anti-
mouse enzyme-linked).
3.2.2.6. Spektrofotometrijsko očitavanje ELISA rezultata
Očitavanje ELISA rezultata bilo je obavljeno pomoću SUNRISE-ELISA
spektrofotometra (TECAN koji koristi Magellan™ softw (Švicarska) pri valnoj duljini od 405
nm nakon jednoga i nakon dva sata inkubacije otopine supstrata u supstratnom puferu u
reakcijskim bazenima mikrotitarskih pločica. Pozitivnim je bio smatran onaj uzorak čija je
izmjerena apsorbancijska vrijednost bila veća od dvostruke vrijednosti apsorbancije izmjerene
za negativnu kontrolu.
3.2.3. Utvrđivanje prisutnosti virusa metodom RT-PCR
Kako bi se u vinogradima autohtonih hercegovačkih kultivara uključenih u ovu studiju
procijenila prisutnost svakoga pojedinog virusa iz grupa GLRaV-4-9, istraživanje je bilo
prošireno putem RT-PCR dijagnostičkih tehnika na dio onih uzoraka koji su u testiranju
metodom ELISA bili pozitivni korištenjem kompleta za detekciju GLRaV -4-9. RT-PCR je
bio primijenjen za provjeru prisutnosti svih virusa grupe GLRaV -4-9 na ukupno 27 uzoraka
loze. Za tu svrhu bile su korištene degenerirane početnice dizajnirane na konzerviranom genu
HSP80 iz porodica Closteroviridae, posebice Ampeloviruses Podgrupa II, Closterovirus i
Velarivirus (Osmana i sur., 2008.; Abou Ghanem-Sabanadzovic i sur., 2012). Svi su uzorci
izabrani među onima koji su bili pozitivni u testiranju metodom ELISA, kako bi se utvrdili
mogući kandidati za kolekciju pozitivnih kontrola. Cilj tog testa bio je istražiti prisutnost
virusa iz navedenih grupa koji su detektirani metodom ELlSA u trsovima hercegovačkih
kultivara vinove loze.
Ista dijagnostička metoda bila je korištena i za jedan uzorak koji je bio pozitivan na
GLRaV-2 u metodi ELlSA, a radi otkrivanja drugih mogućih klosterovirusa koji inficiraju
hercegovačku vinovu lozu, a nisu do sada istraživani.
Materijali i metode
46
U detekciji virusa metodom RT-PCR obavljeni su sljedeći glavni koraci:
ekstrakcija ukupne ribonukleinske kiseline (RNA)
sinteza virusne komplementarne cDNA i PCR amplifikacija (RT-PCR)
analiza rezultata elektroforezom (vizualzacija produka RT-PCR).
3.2.3.1. Ekstrakcija ukupne RNA
Iz 27 odabranih uzoraka vinove loze bila je izolirana ukupna ribonukleniska kiselina
(TRNA). Za izolaciju se koristio komercijalni komplet kemikalija RNeasy Plant Mini Kit
prema uputama proizvođača, s malim odmakom u količini/volumenu pojedinih komponenata.
Postupak se sastojao od sljedećih koraka:
Floemsko tkivo svakoga uzorka vinove loze (120 – 150 mg) bilo je stavljeno u sterilni
tarionik, a zatim je zaleđeno korištenjem tekućega dušika. Potom je u tarioniku
smrvljeno u prah. Zaleđivanjem se biljnoga tkiva tekućim dušikom direktno zaštićuje
RNA u biljnom tkivu. Tu je operaciju bilo potrebno što brže završiti pazeći da se
biljno tkivo ne odmrzne.
Dobiveni prah bio je prebačen u mikroepruvete (Eppendorfove epruvete od 1,5 i 2,0
ml gdje se homogenizirao dodavanjem 0,8-1 mL RLT pufera. Pufer RLT je pufer za
liziranje stanica, jer je prije upotrebe u njega dodano ß-merkaptoetanola i to na svaki 1
ml RLT pufera dodano 10 µL ß-merkaptoetanola. S obzirom na hlapljivost i toksičnost
ß-merkaptoetanola taj dio postupka izolacije virusnih molekula RNA bio je obavljan u
digestoru. Sadržaj mikroepruvete bio je snažno vorteksiran nekoliko minuta.
Denaturacija sadržaja mikroepruvete pospješuje se zagrijavanjem u termomikseru na
56 °C u trajanju od 3 min.
Dobiveni lizat bio je premješten u namjensku QIAshredder minikolonu i podvrgnut
centrifugiranju 2 min na najvećoj brzini. Tim korakom odstranjeni su grubi stanični
dijelovi i dobivena je tekuća frakcija koja je bila premještena u novu mikroepruvete
(400 µL) uz dodatak pola volumena 96 % etanola (200 µL).
Materijali i metode
47
Dobivena mješavina bila je premještena u namjensku kolonu s RNeasy-silikatnom gel
membranom (RNeasy Mini Spin Columns), te podvrgnuta centrifugiranju u trajanju od
15 sekundi na 10000 rpm. Tako se ukupna RNA vezala za membranu kolone.
Kako bi RNA bila što čistija, membranu RNeasy kolone potrebno je bilo isprati sa 700
µL RW1 pufera i centrifugirati 15 sekundi na 10000 rpm. U dva navrata korištenjem
500 µL RPE pufera trebalo je ponoviti ispiranje membrane RNeasy kolone. Oba
centrifugiranja za ta dva ispiranja obavljena su na 10000 rpm. Prilikom se svakoga
ispiranja uvijek u završnom koraku odbacilo sve što je prošlo kroz membranu kolone.
Nakon posljednjega ispiranja, RNeasy kolone bile su premještene u novu 2 ml
mikrotubu i centrifugirane 1 min pri punoj brzini, kako bi se otklonili ostatci pufera.
Tako pripremljenu kolonu s membranom bile su premještene u novu mikroepruvete
volumena 1,5 mL i dodato je 30 µL vode slobodne od ribonukleaza direktno na
membranu kolone čime su s membrane eluirane molekule RNA. Slijedilo je
cetrifugiranje u trajanju 1 min 10000 rpm da se dobije RNA.
Ekstrahirane molekule RNA bile su pohranjene na -20 °C do korištenja u daljim
analizama.
3.2.3.2. Modifikacija protokola za ekstrakciju ukupne ribonukleniske kiseline (RNA)
Modifikacija je bila napravljena kod uzorka koji je serološki pozitivan na GLRaV-2,
na način da je strugotina folemskog tkiva (oko 5 g) homogenizirana s 3 mL RTL korištenjem
maceratora/homogenizatora Homex 6 (BIOREBA). Dobiveni homogenat u sljedećem koraku
razdijeljen je u dva dijela. Jednom dijelu od 100 μL Sap homogenata dodano je 450 μL RTL i
5,5 merkaptoetanol (oznaka 1). Dok je drugom dijelu od 50 μL homogenata u daljnjim
koracima izolacije dodano 500 μL RTL i 5,5 merkaptoetanol (oznaka 2). Ta dva različita
razrjeđenja (oznake 1 i 2) predstavljaju jedan te isti uzorak.
Materijali i metode
48
3.2.3.3. Sinteza virusnih cDNA i PCR amplifikacija
Kako bi se mogla provesti amplifikacija izoliranih molekula RNA za vrstu specifičnih
dijelova genoma primjenom reakcije PCR, potrebno ih je bilo reverznom transkripcijom
prepisati u njihovu komplementarnu DNA (cDNA) što je obavljeno primjenom enzima
reverzne transkriptaze u protokolu RT-PCR. U ovom istraživanju bio je primijenjen protokol
One-Step RT-PCR u kojem su u istoj reakcijskoj smjesi obavljene i sinteza cDNA, i reakcija
PCR. Bili su korišteni reagensi (5xQiagen buffer, 5xQ-solution, dNTP mix, enzim mix) i upute
za provedbu reverzne transkripcije i lančane reakcije polimeraze tvrtke Qiagen. Volumen
mješavine reagensa (tzv. mastermiksa) korišten za dokazivanje svih šest virusa bio je 10 µL, a
korišteni sastav mješavina reagensa za svaki pojedini uzorak nalazi se u Tablici 7.
Tablica 7. Sastojci reakcijske smjese volumena 10 µL za provođenja dijagnostičke metode
RT-PCR u detekciji virusa GLRaV-4-9 primjenom kompleta Qiagen One Step.
Reagens u reakcijskoj smjesi
(mastermiksu)
Volumen sastojka u smjesi (µL)
Qiagen OneStep RT-PCR pufer
(5x koncentriran)
Q-Solution (5x koncentrirana)
2,2
2,2
dNTP mix (sadrži 10 mM svakog dNTP) 0,44
Qiagen OneStep RT-PCR smjesa enzima
(HotStarTaq DNA Polymerase i Sensiscript and Omniscript
Reverse Transcriptases)
0,44
Početnica A (10 µM) 0,55
Početnica B (10 µM)
Voda bez RNaza
0,55
2,4
Ukupno
8,8
Ekstrakt RNA
izoliran iz analiziranog uzorka tkiva vinove
loze (RNA template)
2
Ukupni reakcijski volumen
u reakciji RT-PCR
10,8
Materijali i metode
49
Korišteni reagensi čuvali su se na -20 C, ali su u trenutku stavljanja u reakcijsku
mješavinu bili odleđeni, te držani na ledu. Reakcijska smjesa promiješana je uvlačenjem i
ispuštanjem otopine pomoću nastavka mikropipete. Nakon što se mješavina reagensa za
detekciju određenog analiziranog virusa metodom RT-PCR (po 8,8 µL) raspodijelila u
mikroepruvete, u svaku od njih je dodano, uz miješanje mikropipetiranjem, po 2 µL ranije
izoliranih molekula RNA iz svakoga pojedinog analiziranog uzorka vinove loze.
Konvencionalne lančane reakcije umnožavanja sekvencija uz prethodno obrnuto
prepisivanje (RT-PCR) odvijale su se PCR-uređajima (eng. thermocycler; model: 1659
Eppendorf Mastercycler, Njemačka; te model: 2720 Thermal Cycler Applied Biosystems,
SAD). Za amplifikaciju korištene su specifične početnice za šest virusa (Tablica 4.).
Reverzna transkripcija odvijala se 30 minuta pri 52 °C. Zatim je uslijedila denaturacija
lanaca i inaktivacija reverzne transkriptaze primjenom temperature od 94 °C u trajanju od 30
sekundi.
Postupak amplifikacije dobivenih molekula cDNA odvijao se u 35 ciklusa od kojih se u
svakom ponavljao sljedeći obrazac:
denaturacija 30 sekundi na 94 °C
sparivanje početnica i kalupa u trajanju od 45 sekundi na temeraturama koje
variraju za svaki virus/početnicu (Tablica 4.):
56 °C (za virus GLRaV-4, -5)
58 °C (za virus GLRaV-6, -9)
55 °C (za virus GLRa -7)
52 °C (za virus GLRaV-2)
ekstenzija, tj. produljivanje lanaca DNA 1 min na 72 °C.
Nakon posljednjeg, trideset i petog ciklusa provedeno je završno produljenje lanaca
DNA u trajanju od 7 minuta pri 72 °C. Temperatura na kojoj su se držali produkti u PCR-
uređajima nakon završetka amplifikacije bila je 4 °C.
Materijali i metode
50
3.2.3.4. Semikvantitativni RT-PCR za GLRaV-2
Nakon izolacije RNA za serološki pozitivan uzorak na GLRaV-2, bila je vršena
semikvantitativna konverzija ukupne RNA (izolirane iz uzorka) u jednolančanu
komplementarnu DNA (cDNA) korištenjem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit
(Applied Biosystems, SAD). Za pripremu reakcijske mješavine bile su korištene komponente
kita (po reakciji/uzorku): Aqua bidest 4,2 μL, 10x RT Buffer 2 μL, 10x Random Primer
2 μL, 25x dNTPs Mix 0,8 μL, Transcriptase 1 μl. Na 10 μl reakcijske mješavine
dodano je 10 μl izolirane RNA.
Tako pripremljena smjesa bila je podvrgnuta prepisivanju u PCR-uređaju (Thermal
Cycler 2720 Applied Biosystems, SAD). Proces konverzije obavljen je uz temperature: 10
min. na 25°C, 120 min. na 37°C, 5 min na 85 °C. Nakon procesa prepisivanja uzorci su
pohranjeni na -20°C do početka analize [prethodno je obavljena provjera vizualizacijom
produkata (Slika 13. Priloga 4.)].
Konvencionalne lančane reakcije umnožavanja sekvencija (PCR) bile su provođene u
istom PCR-uređaju kao i perthodno opisan korak konverzije/prevođenja RNA u cDNA.
Korišten je namjenski mastermiks [5x FIREPol® Master Mix Ready to Load (7.5 mM
MgCl2)] u volumenu od 2 μL s RNase-free water 6 μL i specifične početnice (R/F)
svake 0,5 μL po reakciji. Tako da je konačni volumen bio 9 μL reakcijske mješavine uz 2 μL
cDNA po reakciji.
3.2.3.5. Elektroforeza umnoženih produkata u agaroznom gelu
Prisutnost i veličine amplificiranih RT-PCR produkata je provjeren na 1,5 %
agaroznom gelu u 1xTBE puferu [40mM Tris baze, 20mM natrijeva acetata, 1mM EDTA (pH
8,0)], uz bojenje s etidijevim bromidom, Gel Red (Omni) [4 kapljice na 100-120 mL gela] ili
GelRed Nucleic Acid (Gel Stain 10x u vodi) i vizualizacijom pod UV osvjetljenjem.
Elektroforeza je provedena tijekom 40 min. pri naponu od 70 V, nakon čega su gelovi
fotografirani.
Rezultati
51
4. REZULTATI
Tijekom terenskoga istraživanja od listopada 2011. godine do prosinca 2013. godine
sakupljeno je 1332 uzoraka u 20 vinograda u kojima su serološki dokazivani virusi (rezultati
testiranja metodom ELISA navode se u pogl. 4.1.). Od 1332. uzorka 106 ih je sakupljeno u
kolekcijskom vinogradu Višići (vinograd 20., Tablica 3.). Na svim uzorkovanim trsovima u
Višićima vršen je monitoring simptoma u okviru 8 obilazaka terena kroz cijelo razdoblje
istraživanja (rezultati su predstavljeni u pogl. 4.3.). Odabranih 27 uzoraka pozitivnih u
testiranju metodom ELISA na neki od virusa GLRaV-4-9 i jedan uzorak pozitivan na
GLRaV-2, testirano je na te viruse primjenom RT-PCR metode (pogl. 4.2.).
4.1. Rezultati serološke detekcije virusa
Učestalost pojave 9 virusa (ArMV, GFLV, GFkV, GLRaV -1, GLRaV -2, GLRaV -3,
GLRaV -4-9, GVA, GVB) u 20 vinograda na 6 autohtonih hercegovačkih kultivara u 2
hercegovačka vinogorja, evaluirana je pomoću ELISA metoda. Korištenjem komercijalnih
kompleta reagensa provedene su ELISA metode (DAS ELISA, Protein A DAS ELISA, TAS-
ELISA, antigen direct binding DASI ELISA) kojima su detektirani svi navedeni virusi osim
virusa GVA i GVB. Detaljan prikaz zaraze istraživanih kultivara, pojedinim virusnim vrstama
utvrđenim u 20 vinograda/lokacija nalazi se u Tablici 8. Pregled rezultata testiranja metodama
ELISA koji se odnosi na 1332 uzoraka testiranih na viruse u ovom radu prikazan je u okviru
Tablica 8. – 11. te za kolekcijski nasad Višići još detaljnije u Tablici 26. Priloga 4. Pregled
broja biljaka slobodnih od svih istraživanih virusa (virus-tested), kao i onih zaraženih samo
jednim virusom te onih istodobno zaraženih s dva ili više virusa (mješovite zaraze) nalazi se u
Tablici 9. Podaci o učestalosti pojave virusa i tipu zaraze (jednostruke ili miješane) prikazani
su u Tablici 10. Tablica 11 prikazuje sanitarni status šest autohtonih kultivara u
hercegovačkim vinogradima s obzirom na pojavnost 9 virusa obuhvaćenih ovim
istraživanjem.
Rezultati pokazuju visoku učestalost zaraženih trsova (86,56 %) i veći broj višestrukih
(45,73%), u usporedbi s brojem pojedinačnih (40,99 %) virusnih zaraza. Virus s najvećim
postotkom učestalosti bio je virus GLRaV-3 iz roda Ampelovirus, a slijedi ga virus GFLV iz
roda Nepovirus. Potom su sljedili ostali uzročnici LR iz roda Ampelovirus, i to GLRaV-1 koji
je bio češće detektiran od GLRaV-4-9. GLRaV-4-9 bio je odmah iza virusa GFkV iz roda
Rezultati
52
Maculavirus koji je na trećem mjestu po broju nalaza. Nasuprot tomu ArMV (još jedan član
roda Nepovirus) imao je manju učestalost, a GLRaV-2 (član roda Closterovirus) bio je
rijedak, dok GVA i GVB iz roda Vitivirus nisu nađeni ni u jednom od analizirana 1332
uzorka.
Podaci o brojnosti nalaza virusa i pojavnosti virusnih zaraza (jednostruka ili miješana)
prikazani su u Tablici 9. Bez obzira na različite kultivare i vinograde istraživanje pokazuje
visoku učestalost prisustva virusa čiji nalazi su bili relativno brojni i kretali su se od 0,23 % za
kombinaciju od pet virusnih vrsta do 40,99 % za pojedinačne infekcije s jednim od ukupno 7
utvrđenih vrsta virusa.
Vidljivo je da je od 546 trsova s pojedinačnim infekcijama prisutnost GLRaV-3
utvrđena u 349 trsova, što predstavlja najveću učestalost pojave neke od virusnih vrsta u
ovom istraživanju (Tablica 10.). Potom slijedi 200 trsova s kombinacijom GLRaV-3GFLV
(15,02 %). Nakon dvostrukih kombinacija virusnih infekcija (GLRaV-1GLRaV-3 i
GLRaV-3GFkV) u slijedu učestalosti nalaženja testovima sljedeća je trostruka virusna
infekcija GFLVGLRaV-1GLRaV-3 nađena u ukupno 49 trsova. Od ukupno 28 trsova na
kojima je utvrđeno 6 kombinacija s četiri virusa, dominiraju dvije kombinacije:
GFLVGLRaV-1GLRaV-3GFkV i kombinacija GFLVGLRaV-1GLRaV-
3GLRaV-4-9. Najveći broj virusa u kombinaciji utvrđen ovim istraživanjem je pet. Od tri
trsa u kojima je detektirano istodobno pet virusa u kominaciji, kombinacija GFLVGLRaV-
1GLRaV-3GLRaV-4-9GFkV zabilježena je u dva trsa.
Rezultati
53
Tablica 8. Pregled rezultata seroloških analiza (ELISA metode) kojima je utvrđena zaraza 6 autohtonih hercegovačkih kultivara vinove loze
prikupljenih u 20 vinograda dvaju hercegovačkih vinogorja. Za svaki kultivar naveden je broj trsova kod kojih je utvrđena zaraza s nekim od 9
istraživanih virusa (zaraženi trsovi), kao i broj trsova slobodan od istraživanih virusa (zdravi trsovi/virus-tested), a prikazan je i broj trsova u
kojima je detektiran neki od virusa obuhvaćenih ovim istraživanjem (ArMV, GFkV, GFLV, GLRaV4-9, GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3). Dva
istraživana virusa (GVA, GVB) nisu detektirani niti u jednom od 1332 testirana trsa te se oni ne navode u ovoj tablici.
Count – Uzorak Virus
Sorta Oznaka
vinograda
Broj testiranih uzoraka
Zdravi uzorci
Zaraženi uzorci
ArMV GFkV GFLV GLRaV-
4-9 GLRaV-
1 GLRaV-
2 GLRaV-
3 virus-tested
Bena 6. 37 0 37 0 5 3 3 9 0 37 0
0,00% 100,00% 0,00% 13,51% 8,11% 8,11% 24,32% 0,00% 100,00% 0,00%
20. 18 1 17 4 6 7 4 7 0 17 1
5,56% 94,44% 22,22% 33,33% 38,89% 22,22% 38,89% 0,00% 94,44% 5,56%
16. 82 7 75 0 12 2 17 20 0 71 7
8,54% 91,46% 0,00% 14,63% 2,44% 20,73% 24,39% 0,00% 86,59% 8,54%
7. 29 3 26 0 8 20 2 6 0 20 3
10,34% 89,66% 0,00% 27,59% 68,97% 6,90% 20,69% 0,00% 68,97% 10,34%
Blatina 19. 50 0 50 0 14 43 0 29 0
0,00% 100,00% 0,00% 28,00% 86,00% 0,00% 0,00% 0,00% 58,00% 0,00%
20. 18 0 18 2 1 10 1 4 0 18 0
0,00% 100,00% 11,11% 5,56% 55,56% 5,56% 22,22% 0,00% 100,00% 0,00%
5. 52 1 51 0 12 50 2 6 0 26 1
1,92% 98,08% 0,00% 23,08% 96,15% 3,85% 11,54% 0,00% 50,00% 1,92%
13. 50 1 49 0 19 25 2 2 0 48 1
2,00% 98,00% 0,00% 38,00% 50,00% 4,00% 4,00% 0,00% 96,00% 2,00%
9. 19 4 15 0 2 7 0 2 0 9 4
21,05% 78,95% 0,00% 10,53% 36,84% 0,00% 10,53% 0,00% 47,37% 21,05%
14. 163 39 124 0 24 56 4 19 0 96 39
23,93% 76,07% 0,00% 14,72% 34,36% 2,45% 11,66% 0,00% 58,90% 23,93%
Rezultati
54
nastavak Tablice 8.
Sorta Oznaka
vinograda
Broj testiranih uzoraka
Zdravi uzorci
Zaraženi uzorci
ArMV GFkV GFLV GLRaV-
4-9 GLRaV-
1 GLRaV-
2 GLRaV-
3 virus-tested
Dobrogostina 2. 33 0 33 0 0 30 0 7 0 33 0
0,00% 100,00% 0,00% 0,00% 90,91% 0,00% 21,21% 0,00% 100,00% 0,00%
20. 18 0 18 1 4 6 3 5 1 18 0
0,00% 100,00% 5,56% 22,22% 33,33% 16,67% 27,78% 5,56% 100,00% 0,00%
3. 17 0 17 0 3 15 1 9 0 17 0
0,00% 100,00% 0,00% 17,65% 88,24% 5,88% 52,94% 0,00% 100,00% 0,00%
18. 7 0 7 0 2 7 1 1 1 7 0
0,00% 100,00% 0,00% 28,57% 100,00% 14,29% 14,29% 14,29% 100,00% 0,00%
4. 42 7 35 0 0 11 0 3 0 34 7
16,67% 83,33% 0,00% 0,00% 26,19% 0,00% 7,14% 0,00% 80,95% 16,67%
Krkošija 8. 43 0 43 0 3 20 7 28 0 36 0
0,00% 100,00% 0,00% 6,98% 46,51% 16,28% 65,12% 0,00% 83,72% 0,00%
1. 25 0 25 0 9 2 23 1 0
0,00% 100,00% 0,00% 36,00% 0,00% 8,00% 92,00% 4,00% 0,00% 0,00%
20. 19 0 19 3 3 9 5 8 0 19 0
0,00% 100,00% 15,79% 15,79% 47,37% 26,32% 42,11% 0,00% 100,00% 0,00%
4. 13 0 13 0 0 11 0 7 0 13 0
0,00% 100,00% 0,00% 0,00% 84,62% 0,00% 53,85% 0,00% 100,00% 0,00%
17. 10 0 10 1 1 5 4 5 0 10 0
0,00% 100,00% 10,00% 10,00% 50,00% 40,00% 50,00% 0,00% 100,00% 0,00%
Rezultati
55
nastavak Tablice 8.
Sorta Oznaka
vinograda
Broj testiranih uzoraka
Zdravi uzorci
Zaraženi uzorci
ArMV GFkV GFLV GLRaV
4-9 GLRaV-
1 GLRaV-
2 GLRaV-
3 virus-tested
10. 53 5 48 0 0 44 0 19 0 15 5
9,43% 90,57% 0,00% 0,00% 83,02% 0,00% 35,85% 0,00% 28,30% 9,43%
20. 16 2 14 1 5 2 0 6 0 8 2
12,50% 87,50% 6,25% 31,25% 12,50% 0,00% 37,50% 0,00% 50,00% 12,50%
15. 94 14 80 0 17 31 20 28 0 51 14
Trnjak 14,89% 85,11% 0,00% 18,09% 32,98% 21,28% 29,79% 0,00% 54,26% 14,89%
13. 50 9 41 0 15 19 4 15 0 15 9
18,00% 82,00% 0,00% 30,00% 38,00% 8,00% 30,00% 0,00% 30,00% 18,00%
5. 8 3 5 0 0 3 0 3 0 3
37,50% 62,50% 0,00% 0,00% 37,50% 0,00% 37,50% 0,00% 0,00% 37,50%
11. 15 6 9 0 1 5 0 4 0 1 6
40,00% 60,00% 0,00% 6,67% 33,33% 0,00% 26,67% 0,00% 6,67% 40,00%
6. 23 11 12 0 1 1 0 6 0 6 11
47,83% 52,17% 0,00% 4,35% 4,35% 0,00% 26,09% 0,00% 26,09% 47,83%
19. 50 32 18 0 0 7 0 10 0 4 32
64,00% 36,00% 0,00% 0,00% 14,00% 0,00% 20,00% 0,00% 8,00% 64,00%
Rezultati
56
nastavak Tablice 8.
Sorta Oznaka
vinograda
Broj testiranih uzoraka
Zdravi uzorci
Zaraženi uzorci
ArMV GFkV GFLV GLRaV
4-9 GLRaV-
1 GLRaV-
2 GLRaV-
3 virus-tested
Žilavka 12. 29 0 29 0 8 3 0 7 0 29 0
0,00% 100,00% 0,00% 27,59% 10,34% 0,00% 24,14% 0,00% 100,00% 0,00%
20. 17 0 17 5 3 3 0 1 0 17 0
0,00% 100,00% 29,41% 17,65% 17,65% 0,00% 5,88% 0,00% 100,00% 0,00%
14. 150 15 135 0 15 39 5 19 0 122 15
10,00% 90,00% 0,00% 10,00% 26,00% 3,33% 12,67% 0,00% 81,33% 10,00%
13. 44 4 40 0 2 1 3 1 0 38 4
9,09% 90,91% 0,00% 4,55% 2,27% 6,82% 2,27% 0,00% 86,36% 9,09%
9. 17 4 13 0 4 0 2 0 11 4
23,53% 76,47% 0,00% 0,00% 23,53% 0,00% 11,76% 0,00% 64,71% 23,53%
16. 21 9 12 0 2 1 0 1 0 11 9
42,86% 57,14% 0,00% 9,52% 4,76% 0,00% 4,76% 0,00% 52,38% 42,86%
Total Result 20 1332 179 1153 17 197 500 90 293 3 886 179
13,44% 86,56% 1,28% 14,79% 37,54% 6,76% 22,00% 0,23% 66,52% 13,44%
Rezultati
57
Tablica 9. Rezultati seroloških analiza (ELISA metode); broj trsova/uzoraka prikupljenih iz 20 vinograda hercegovačkog vinogorja kod kojih je
utvrđena zaraza s nekim od 9 istraživanih virusa, te o detektiranim višestrukim zarzama, bilo da se radi o kombinaciji s dva, tri, četiri ili pet
virusa, kao i onih u kojima nije utvrđena prisutnost ni jednoga od 9 istraživanih virusa.
broj virusa
Kultivar/sorta Oznaka
vinograda
Broj testiranih uzoraka
Zdravi uzorci
Zaraženi uzorci
1 2 3 4 5 0
6. 37 0 37 22 10 5 0 0 0
0,00% 100,00% 59,46% 27,03% 13,51% 0,00% 0,00% 0,00%
BENA 20. 18 1 17 1 9 3 3 1 1
5,56% 94,44% 5,56% 50,00% 16,67% 16,67% 5,56% 5,56%
18. 82 7 75 37 30 7 1 0 7
8,54% 91,46% 45,12% 36,59% 8,54% 1,22% 0,00% 8,54%
7. 29 3 26 5 15 3 3 0 3
10,34% 89,66% 17,24% 51,72% 10,34% 10,34% 0,00% 10,34%
19. 50 0 50 23 18 9 0 0 0
0,00% 100,00% 46,00% 36,00% 18,00% 0,00% 0,00% 0,00%
BLATINA 20. 18 0 18 7 6 4 1 0 0
0,00% 100,00% 38,89% 33,33% 22,22% 5,56% 0,00% 0,00%
5. 52 1 51 17 25 7 2 0 1
1,92% 98,08% 32,69% 48,08% 13,46% 3,85% 0,00% 1,92%
13. 50 1 49 19 15 13 2 0 1
2,00% 98,00% 38,00% 30,00% 26,00% 4,00% 0,00% 2,00%
9. 19 4 15 10 5 0 0 4
21,05% 78,95% 52,63% 26,32% 0,00% 0,00% 0,00% 21,05%
14. 163 39 124 62 49 13 0 0 39
23,93% 76,07% 38,04% 30,06% 7,98% 0,00% 0,00% 23,93%
Rezultati
58
nastavak Tablice 9.
Kultivar/sorta Oznaka
vinograda
Broj testiranih uzoraka
Zdravi uzorci
Zaraženi uzorci
1 2 3 4 5 0
2. 33 0 33 3 23 7 0 0 0
0,00% 100,00% 9,09% 69,70% 21,21% 0,00% 0,00% 0,00%
DOBROGOSTINA 20. 18 0 18 5 7 5 1 0 0
0,00% 100,00% 27,78% 38,89% 27,78% 5,56% 0,00% 0,00%
3. 17 0 17 9 5 3 0 0
0,00% 100,00% 0,00% 52,94% 29,41% 17,65% 0,00% 0,00%
18. 7 0 7 4 2 0 1 0
0,00% 100,00% 0,00% 57,14% 28,57% 0,00% 14,29% 0,00%
4. 42 7 35 22 13 0 0 7
16,67% 83,33% 52,38% 30,95% 0,00% 0,00% 0,00% 16,67%
8. 43 0 43 12 17 8 6 0 0
0,00% 100,00% 27,91% 39,53% 18,60% 13,95% 0,00% 0,00%
KRKOŠIJA 1. 25 0 25 16 8 1 0 0 0
0,00% 100,00% 64,00% 32,00% 4,00% 0,00% 0,00% 0,00%
20. 19 0 19 3 6 8 2 0 0
0,00% 100,00% 15,79% 31,58% 42,11% 10,53% 0,00% 0,00%
4. 13 0 13 8 5 0 0 0
0,00% 100,00% 0,00% 61,54% 38,46% 0,00% 0,00% 0,00%
17. 10 0 10 1 4 4 0 1 0
0,00% 100,00% 10,00% 40,00% 40,00% 0,00% 10,00% 0,00%
Rezultati
59
nastavak Tablice 9.
Kultivar/sorta Oznaka
vinograda
Broj testiranih uzoraka
Zdravi uzorci
Zaraženi uzorci
1 2 3 4 5 0
10. 53 5 48 28 10 10 0 0 5
9,43% 90,57% 52,83% 18,87% 18,87% 0,00% 0,00% 9,43%
TRNJAK 20. 16 4 14 4 8 0 0 0 4
25,00% 87,50% 25,00% 50,00% 0,00% 0,00% 0,00% 25,00%
15. 94 14 80 31 33 14 2 0 14
14,89% 85,11% 32,98% 35,11% 14,89% 2,13% 0,00% 14,89%
13. 50 9 41 18 19 4 0 0 9
18,00% 82,00% 36,00% 38,00% 8,00% 0,00% 0,00% 18,00%
5. 8 3 5 4 1 0 0 0 3
37,50% 62,50% 50,00% 12,50% 0,00% 0,00% 0,00% 37,50%
11. 15 6 9 7 2 0 0 0 6
40,00% 60,00% 46,67% 13,33% 0,00% 0,00% 0,00% 40,00%
19 50 32 18 15 3 0 0 0 32
64,00% 36,00% 30,00% 6,00% 0,00% 0,00% 0,00% 64,00%
6. 23 11 12 10 2 0 0 0 11
47,83% 52,17% 43,48% 8,70% 0,00% 0,00% 0,00% 47,83%
12. 29 0 29 16 8 5 0 0
0,00% 100,00% 55,17% 27,59% 17,24% 0,00% 0,00% 0,00%
ŽILAVKA 20. 17 0 17 8 7 2 0 0
0,00% 100,00% 47,06% 41,18% 11,76% 0,00% 0,00% 0,00%
14. 150 15 135 85 37 11 2 0 15
10,00% 90,00% 56,67% 24,67% 7,33% 1,33% 0,00% 10,00%
13. 44 4 40 35 5 0 0 0 4
9,09% 90,91% 79,55% 11,36% 0,00% 0,00% 0,00% 9,09%
9. 17 4 13 9 4 0 0 0 4
23,53% 76,47% 52,94% 23,53% 0,00% 0,00% 0,00% 23,53%
16. 21 9 12 9 3 0 0 0 9
42,86% 57,14% 42,86% 14,29% 0,00% 0,00% 0,00% 42,86%
Total Result 1332 179 1155 546 423 155 28 3 179
13,44% 86,56% 40,99% 31,76% 11,64% 2,10% 0,23% 13,44%
Rezultati
60
Tablica 10. Učestalost pojave najčešćih virusa ili njihovih kombinacija detektiranih metodom ELISA kod trsova testiranih u ovom istraživanju,
kao i ukupan broj uzoraka skupine (virus/kombinacija) te njihov postotni udio u svakoj skupini i njihov postotni udio u ukupnom broju uzoraka.
Moguće kombinacije prisutnosti virusa
Ukupan broj uzoraka s mogućom
kombinacijom
Broj virusnih
kombinacija
% s obzirom
na moguću
kobinaciju
Pojedinačan broj uzoraka kombinacije
% od
ukupnog broja
uzoraka
virus-tested 0 179 13,44%
GLRaV-3
546 1
63,92% 349 26,20%
GFLV 21,25% 116 8,71%
GLRaV-1 10,62% 58 4,35%
GFkV 2,75% 15 1,13%
GLRaV-4-9 1,10% 6 0,45%
ArMV 0,37% 2 0,15%
GFLVGLRaV-3
423 2
47,28% 200 15,02%
GLRaV-1GLRaV-3 18,20% 77 5,78%
GLRaV-3GFkV 11,82% 50 3,75%
GLRaV-3GLRaV-4-9 6,38% 27 2,03%
GFLV GLRaV-1 6,15% 26 1,95%
GLRaV-1GFkV 3,55% 15 1,13%
GFLVGFkV 3,55% 15 1,13%
GLRaV-1GLRaV-4-9 1,42% 6 0,45%
ArMVGLRaV-3 0,95% 4 0,30%
GLRaV-4-9GFkV 0,47% 2 0,15%
GFLVGLRaV-4-9 0,24% 1 0,08%
Rezultati
61
nastavak Tablice 10.
Moguće kombinacije prisutnosti virusa
Ukupan broj uzoraka s mogućom
kombinacijom
Broj virusnih
kombinacija
% s obzirom
na moguću
kobinaciju
Pojedinačan broj uzoraka kombinacije
% od ukupnog
broja uzoraka
GFLVGLRaV-1GLRaV-3
155 3
31,61% 49 3,68%
GFLVGLRaV-3GFkV 30,32% 47 3,53%
GLRaV-1GLRaV-3GFkV 13,55% 21 1,58%
GLRaV-1GLRaV-3GLRaV-4-9 7,10% 11 0,83%
GFLVGLRaV-3GLRaV-4-9 4,52% 7 0,53%
GFLVArMVGLRaV-3 3,23% 5 0,38%
GLRaV-3GLRaV-4-9GFkV 1,94% 3 0,23%
GLRaV-1GLRaV-4-9GFkV 1,94% 3 0,23%
ArMVGLRaV-1GLRaV-3 1,94% 3 0,23%
GFLVGLRaV-4-9GFkV 1,94% 3 0,23%
GLRaV-2GLRaV-4-9GFkV 0,65% 1 0,08%
GLRaV-2GLRaV-3GFkV 0,65% 1 0,08%
GFLVGLRaV-1GFkV 0,65% 1 0,08%
GFLVGLRaV-1GLRaV-3GFkV
28 4
28,57% 8 0,60%
GFLVGLRaV-1GLRaV-3GLRaV-4-9 28,57% 8 0,60%
GFLVGLRaV-3GLRaV-4-9GFkV 25,00% 7 0,53%
GFLVArMVGLRaV-1GLRaV-3 10,71% 3 0,23%
GLRaV-1GLRaV-3GLRaV-4-9GFkV 3,57% 1 0,08%
GFLVGLRaV-1GLRaV-4-9GFkV 3,57% 1 0,08%
GFLVGLRaV-1GLRaV-3GLRaV-4-9GFkV 3 5
66,67% 2 0,15%
GFLVGLRaV-2GLRaV-3GLRaV-4-9GFkV 33,33% 1 0,08%
Rezultati
62
Tablica 11. Sanitarni status šest autohtonih kultivara u hercegovačkom vinogorju.
Kultivar Virus-
tested
Broj
vinograda
Broj
testiranih
trsova
GLRaV-3
%
GFLV
%
GLRaV-1
%
GFkV
%
GLRaV-4-9
%
ArMV
%
GLRaV-2
%
Zaražen
i trsovi
Bena 11
6,62%
4 166
12,46%
87,35 19,27 25,30 18,67 15,66 2,40 0 155
93,37%
Blatina 45
12,8%
6 352
26,42%
64,20 54,26 9,37 20,45 2,55 0,56 0 307
87,21%
Dobrogostina 7
6,4%
5 117
8,78%
93,16 58,97 21,36 7,69 4,27 0,85 1,70 110
94,01%
Krkošija 0 5 110
8,25%
70,90 40,90 64,54 14,54 16,36 3,63 0,90 110
100%
Trnjak 84
28%
8 309
23,19%
31,71 36,24 29,44 12,62 7,76 0,32 0 225
72,81%
Žilavka 32
11,5%
6 278
20,87%
82,01 18,34 11,15 10,79 2,87 1,79 0 246
88,48%
UKUPNO 179
13,44%
20 1.332 66,37 37,54 22,00 14,79 6,76 1,28 0,23 1.153
86.56%
Rezultati
63
4.2. Rezultati detekcije virusa metodom RT-PCR
Dijagnotičkom metodom bazranoj na istraživanju genoma analizirano je šest virusa LR
skupine, testirano je ukupno 27 trsova. Kroz šest RT-PCR testova analizirano je svih šest
autohtonih kultivara. Rezultati testiranja prikazani su u Tablici 20. Priloga 4.
4.2.1. Rezultati PCR amplifikacije u detekciji GLRaV-2
Prisutnost GLRaV-2 potvrđena je vizualizacijom amplikona iz reakcije PCR kod
pozitivnoga uzorka uključena u ovo istraživanje, ali u dva različita razrjeđenja (opisano u
poglavlju 4.2.3.). Kod navedena uzorka nakon elektroforeze u 1,5 % agaroznom gelu i nakon
bojenja gela etidijevim bromidom uočeni su fragmenti očekivane duljine od 600 parova baza
(Slika 6.). Bio je to uzorak kultivara Dobrogostina iz kolekcijskoga nasada Višići (oznake:
Višići red 2 Dobrogostina 3). GLRaV-2 je u njemu bio detektiran i u serološkoj metodi
ELISA istodobno s još nekoliko virusa (miješana zaraza).
Slika 6. Agarozni gel nakon provedene horizontalne gel-elektroforeze pri testiranju na virus
GLRaV-2 metodom RT-PCR (1,5 % agarozni gel; produkti su obojeni etidijevim bromidom).
Jažice 1 i 2 predstavljaju isti uzorak (različita razrjeđenja). Radi se o uzorku Dobrogostine iz
Višića koji je i u ELISA metodi bio pozitivan na GLRaV-2. P – pozitivna kontrola (GLRaV-
2; amplikon je veličine 600 pb); N – negativna kontrola; M – marker DNA.
Rezultati
64
4.2.2. Rezultati RT-PCR metode
Od ukupno 90 uzoraka koji su bili ELISA-pozitivni na neki od virusa iz skupine
GLRaV-4-9 (Tablica 8.), njih dvadeset sedam (Tablica 20.) dodatno je testirano na navedene
viruse metodom RT-PCR uz primjenu specifičnoga para početnica za svaki istraživani virus iz
skupine GLRaV-4-9 (Tablica 4.). Nakon elektroforeze u 1,5 % agaroznom gelu i bojenja s
GelRed Nucleic Acid bojilom, kod 6 uzoraka bili su dobiveni produkti duljine od 273 parova
baza uz korištenje para početnica za GLRaV-5 (Slika 8.), a kod 7 uzoraka bili su dobiveni
produkti duljine 393 bp uz korištenje para početnica za GLRaV-9 (slika 11.). U RT-PCR
analizi ni u jednom testiranom uzorku nisu detektirani virusi GLRaV-4, GLRaV-6, ni
GLRaV-7 (Slike 7., 9. I 10.).
Slika 7. Agarozni gel nakon provedene horizontalne gel-elektroforeze pri testiranju na
GLRaV-4 metodom RT-PCR (1,5 % agarozni gel; produkti su obojeni GelRed Nucleic Acid
bojilom). Jažice: M – marker DNA; 1-27 – negativni uzorci; P – pozitivna kontrola (GLRaV-
4; amplikon veličine 319 bp); N – negativna kontrola.
Rezultati
65
Slika 8. Agarozni gel nakon provedene horizontalne gel-elektroforeze pri testiranju na
GLRaV-5 metodom RT-PCR (1,5 % agarozni gel; produkti su obojeni GelRed Nucleic Acid
bojilom). Jažice: M – marker DNA; 1, 17, 21, 22, 26, 27 – pozitivni uzorci; 2 do 16, 18 do
20, 23 do 25 – negativni uzorci; P – pozitivna kontrola (GLRaV-9; amplikon veličine 273
bp); N – negativna kontrola.
Slika 9. Agarozni gel nakon provedene horizontalne gel-elektroforeze pri testiranju na
GLRaV-6 metodom RT-PCR (1,5 % agarozni gel; produkti su obojeni GelRed Nucleic Acid
bojilom). Jažice: M – marker DNA; 1-27 – negativni uzorci; P – pozitivna kontrola (GLRaV-
6; amplikon veličine 350 bp); N – negativna kontrola.
Rezultati
66
Slika 10. Agarozni gel nakon provedene horizontalne gel-elektroforeze pri testiranju na
GLRaV-7 metodom RT-PCR (1,5 % agarozni gel; produkti su obojeni GelRed Nucleic Acid
bojilom). Jažice: M – marker DNA; 1-27 – negativni uzorci; P – pozitivna kontrola (GLRaV-
7; amplikon veličine 200 bp); N – negativna kontrola.
Slika 11. Agarozni gel nakon provedene horizontalne gel-elektroforeze pri testiranju na
GLRaV-9 metodom RT-PCR (1,5 % agarozni gel; produkti su obojeni GelRed Nucleic Acid
bojilom). Jažice: M – marker DNA; 1, 2, 8, 9, 17, 24, 26 – pozitivni uzorci; 3 do 7, 10 do 16,
18 do 23, 25 i 27-negativni uzorci; P – pozitivna kontrola (GLRaV-9; amplikon veličine 393
bp); N – negativna kontrola.
Rezultati
67
Jedan od ciljeva ove doktorske disertacije bio je provođenje molekularne karakterizacije i
filogenetske usporedbe s izolatima iz susjednih zemalja (Hrvatska i Italija) od virusa koji su
prvi put detektirani u istraživanoj regiji. Ključni problemi u realizaciji toga cilja bili su
ograničeni proračuni i vremenski okviri javnih nabava za kupnju reagensa. Od prijave teme
2011. godine do pisanja disertacije u skupini GLRaV-4-9 došlo je do značajnoga smanjenja
broja virusnih vrsta, što je uzrokovalo izmjene u daljem istraživanju. Virusi iz skupine
GLRaV-4-9 detektirani RT-PCR-om više nisu zasebne vrste, nego je riječ o GLRaV-4.
Planirano je nastaviti istraživanje, a sljedeći je korak sekvenciranje onih virusa nepotvrđenih
RT-PCR metodom, njihova molekularna karakterizacija i filogenetska usporedba s virusnim
izolatima susjednih zemalja (Hrvatska i Italija). Rezultati će se potom objaviti u relevantnim
znanstvenim časopisima.
4.3. Simptomatologija prirodnih virusnih zaraza autohtonih kultivara
Tijekom vizualnih pregleda trsova vinove loze kroz ukupno osam obilazaka
kolekcijskoga nasada Višići, u kojem se nalazilo svih šest istraživanih autohtonih kultivara,
zabilježeno je ukupno 22 različita simptoma (Prilog 3.), od kojih su pojedini bili češće uočeni
(Slika 12.). Trsovi iz toga kolekcijskog nasada uzorkovani su i serloški testirani (ELISA
metode; Prilog 4.). Budući da je iz literature poznato da simptomi variraju tijekom vegetacije,
odnosno da su manjega intenziteta ljeti, te da ih većina nestaje zimi, a da se najbolje uočavaju
u proljeće i jesen, vizualni pregledi obavljeni su od 2011. do 2013 g. (proljeće, kraj ljeta i na
jesen; poglavlje 3.2.1.; Tablica 5.).
Rezultati vizualnih pregleda trsova u kontekstu rezultata serološke detekcije virusa
(Tablica 20. Priloga 4.) u vinogradu Višići za sve istraživane kultivare (Bena, Baltina,
Krkošija, Dobrogostina, Trnjak, Žilavka) prikazani su tablično (Tablice 12. Do 17.) kako bi se
simptomi doveli u direktnu vezu s virusima. U Tablici 19. Priloga 3. nalaze se fotografije svih
simptoma uočenih na virotičnim trsovima autohtonih hercegovačkih kultivara u kolecijskom
nasadu Višići.
Rezultati
68
Slika 12. Najčešći simptomi viroza na trsovima autohtonih kultivara u kolekcijskom nasadu
Višići: skraćeni internodiji (A), neujednačenost trsa u porastu (B), zastoj u rastu (C), zastoj u
kretanju vegetacije (D), povećan broj grozdova smanjene veličine (F i E).
A B
C D
E F
Rezultati
69
Tablica 12. Raznolikost simptoma uslijed zaraza različitim virusima kultivara Bena u
kolekcijskom nasadu Višići.
KULTIVAR: BENA
vir
us
simptom G
LR
aV
-3
, G
FL
V
GL
Ra
V -
3, G
Fk
V,
GL
Ra
V -
1, G
LR
aV
-
4-9
GL
Ra
V -
3, G
Fk
V
GL
Ra
V -
3, G
LR
aV
-1
GL
Ra
V -
3,
ArM
V
GL
Ra
V -
3,
ArM
V,
GF
LV
, G
LR
aV
-1
GL
Ra
V -
3
GL
Ra
V -
3, G
LR
aV
-1,
GL
Ra
V 4
-9
GL
Ra
V -
3,
ArM
V,
GF
LV
, G
LR
aV
-1,
GL
Ra
V -
4-9
GL
Ra
V -
3, G
Fk
V,
GF
LV
, G
LR
aV
-1
GL
Ra
V -
3,
ArM
V,
GF
LV
0 (
vir
us-
test
ed
)
UK
UP
NO
deformiranost lista
asimetričnost,
naboranost, pojačana
nazubljenost lista
klorotična išaranost
nenormalno grananje
rozgve/mladice
(rašljanje, bifurkacije)
GF
LV
skraćenje internodija
(nepravilan razvoj
internodija, dvostruki
nodiji)
+ (+)* (+) + + (+) (+) + + + + 7 (4)
fascijacije (sraslice,
izgledom podsjeća na
dvije slijepljene mladice)
rast cik-cak
(+) + + 2 (1)
manji broj grozdova koji
su smanjeni veličinom,
pucanje bobica
+ (+) + + + + 5 (1)
grozdovi rehuljavi
(+) + 1 (1)
neujednačeno
dozrijevanje bobica
+ (+) + (+) +
3 (2)
formiranje manjeg broja
bobica smanjene veličine
(+) (1)
žuti mozaik, tj. žućenje
koje može zahvatiti sve
zelene dijelove
(djelomičan ili
kompletan)
(+) (+) (+) + 1 (3)
nejednolično
odrvenjavanje rozgve
(+) +
1 (1)
smanjenje veličine listova
(+) (1)
klorotična diskoloracija
(+) + 1 (1)
listovi mogu imati krom
žute mrlje duž vena
(chrome yellow flecking).
Rezultati
70
Nastavak Tablice 12.
Vir
us
simptom
GL
Ra
V -
3, G
FL
V
GL
Ra
V -
3, G
Fk
V,
GL
Ra
V -
1, G
LR
aV
-4
-9
GL
Ra
V -
3, G
Fk
V
GL
Ra
V -
3, G
LR
aV
-1
GL
Ra
V -
3,
ArM
V
GL
Ra
V -
3,
ArM
V,
GF
LV
, G
LR
aV
-1
GL
Ra
V -
3
GL
Ra
V -
3, G
LR
aV
-1,
GL
Ra
V 4
-9
GL
Ra
V -
3,
ArM
V,
GF
LV
, G
LR
aV
-1,
GL
Ra
V -
4-9
GL
Ra
V -
3, G
Fk
V,
GF
LV
, G
LR
aV
-1
GL
Ra
V -
3,
ArM
V,
GF
LV
0 (
vir
us-
test
ed
)
UK
UP
NO
GL
Ra
V
kasnije otvaranje pupova
+ + + + + + + 7 slabiji razvoj mladica
+ + + + + + + + + + + 11 crvenilo među žilnog područja
listova kod crnih kultivara
uvijanje listova prema naličju
žućenje među žilnog područja
lista kod bijelih kultivara
smanjenje vigora
+ 1 dozrijevanje grozdova kasni
+ 1 zastoj rasta u vegetaciji
+ + + + + + + + + + 10
GL
RaV
-2 pojava guka, tj. zadebljanje
na mjestu srastanja
plemka/podloga
Ru
gosa
wood
com
ple
x
pojava brazdi i udubina na
centralnom cilindru
(plemka/podloga)
pojava guka, tj. zadebljanje
na mjestu srastanja
plemka/podloga
uvijenost, žućenje i crvenilo
listova smanjen vigor
kasnije otvaranje pupova
iznenadno propadanje trsova
GF
kV
prosvjetljenje žila
nastajanje pjega
listovi naborani
deformirani
uvijanje listova
zastoj u rastu
+ + + 3
UKUPNO: 14 (2) 54 (15)**
*(+) simptom nije svojstven za virus/e u kombinaciji **(2) zbroj netipičnih simptoma za taj virus
Rezultati
71
Tablica 13. Raznolikost simptoma uslijed zaraza različitim virusima kultivara Blatina u
kolekcijskom nasadu Višići.
KULTIVAR: BLATINA
vir
us
simptom
GL
Ra
V-3
GL
Ra
V-3
,
GF
LV
GL
Ra
V-3
,
GF
LV
,
GL
Ra
V-4
-9
GF
LV
GL
Ra
V-3
,
GF
LV
,
GF
kV
GL
Ra
V-3
,
ArM
V,
GL
Ra
V-1
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-1
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-1
,
GF
LV
UK
UP
NO
deformiranost lista
(+)* (1)
asimetričnost,
naboranost, pojačana
nazubljenost lista
(+) + + + (+) 3 (2)
klorotična išaranost
nenormalno grananje
rozgve/mladice
(rašljanje, bifurkacije)
(+) + 1 (1)
GF
LV
skraćenje internodija
(nepravilan razvoj
internodija, dvostruki
nodiji)
(+) + + + + (+) 4 (2)
fascijacije (sraslice,
izgledom podsjeća na
dvije slijepljene mladice)
rast cik-cak
(+) + + + +
4 (1)
manji broj grozdova koji
su smanjeni veličinom,
pucanje bobica
(+) + + + 3 (1)
grozdovi rehuljavi
+ + + 3
neujednačeno
dozrijevanje bobica
(+) (1)
formiranje manjeg broja
bobica smanjene veličine
žuti mozaik, tj. žućenje
koje može zahvatiti sve
zelene dijelove
(djelomičan ili
kompletan)
(+) (+) (2)
nejednolično
odrvenjavanje rozgve
(+) + + 2 (1)
smanjenje veličine
listova
klorotična diskoloracija
(+) + +
2 (1)
listovi mogu imati krom
žute mrlje duž vena
(chrome yellow flecking).
Rezultati
72
Nastavak Tablice 13.
Vir
us
simptom
GL
Ra
V-3
GL
Ra
V-3
,
GF
LV
GL
Ra
V-3
,
GF
LV
,
GL
Ra
V-4
-9
GF
LV
GL
Ra
V-3
,
GF
LV
, G
Fk
V
GL
Ra
V-3
,
ArM
V,
GL
Ra
V-1
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-1
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-1
,
GF
LV
UK
UP
NO
GL
Ra
V
kasnije otvaranje pupova
+ + + (+) + + + 6 (1)
slabiji razvoj mladica
+ + 2 crvenilo među žilnog područja listova kod crnih
kultivara
+ 1
uvijanje listova prema naličju
žućenje među žilnog područja lista kod bijelih
kultivara
smanjenje vigora
dozrijevanje grozdova kasni
+ 1
zastoj rasta u vegetaciji
+ + (+) + 3 (1)
GL
RaV
-
2
pojava guka, tj. zadebljanje na mjestu srastanja
plemka/podloga
(+) (+) (2)
Ru
gosa
wood
com
ple
x
pojava brazdi i udubina na centralnom cilindru
(plemka/podloga)
pojava guka, tj. zadebljanje na mjestu srastanja
plemka/podloga
uvijenost, žućenje i crvenilo listova
smanjen vigor
kasnije otvaranje pupova
iznenadno propadanje trsova
GF
kV
prosvjetljenje žila
nastajanje pjega,
listovi naborani
deformirani
uvijanje listova
zastoj u rastu
+ 1
UKUPNO tipova simptoma: 15 (4) 38 (17)**
*(+) simptom nije svojstven za virus/e u kombinaciji **(2) zbroj netipičnih simptoma za taj virus
Rezultati
73
Tablica 14. Raznolikost simptoma uslijed zaraza različitim virusima kultivara Dobrogostina
u kolekcijskom nasadu Višići.
KULTIVAR: DOBROGOSTINA
vir
us
simptom
GL
Ra
V-3
GL
Ra
V-3
, G
LR
aV
-
4-9
GL
Ra
V-3
, G
FL
V
GL
Ra
V-3
, G
LR
aV
-1
GL
Ra
V-3
, G
FL
V,
GL
Ra
V-1
GL
Ra
V-3
, A
rM
V,
GF
LV
GL
Ra
V-3
, G
Fk
V,
GF
LV
, G
LR
aV
-1
GL
Ra
V-3
, G
Fk
V,
GL
Ra
V-2
, G
LR
aV
-
4-9
G
LR
aV
-3,
GF
kV
,
GL
Ra
V-1
GL
Ra
V-3
, G
FL
V,
GL
Ra
V-4
-9
GL
Ra
V-3
, G
Fk
V
UK
UP
NO
deformiranost lista
asimetričnost, naboranost, pojačana
nazubljenost lista
(+)* + 1
(1)
klorotična išaranost
nenormalno grananje rozgve/mladice (rašljanje,
bifurkacije)
GF
LV
skraćenje internodija (nepravilan razvoj
internodija, dvostruki nodiji)
(+) (+) + (+) + (+) (+) 2 (5)
fascijacije (sraslice, izgledom podsjeća na dvije
slijepljene mladice)
rast cik-cak
(+) (+) + + +
3 (2)
manji broj grozdova koji su smanjeni veličinom,
pucanje bobica
(+) (+) + (+) 1 (3)
grozdovi rehuljavi
(+) (+) + +
2 (2)
neujednačeno dozrijevanje bobica
(+) (+) + + (+) (+)
2 (4)
formiranje manjeg broja bobica smanjene
veličine
+ 1
žuti mozaik, tj. žućenje koje može zahvatiti sve
zelene dijelove (djelomičan ili kompletan)
(+) (+) + + (+) 2 (3)
nejednolično odrvenjavanje rozgve
(+) (+) + + + + (+) (+)
4 (4)
smanjenje veličine listova
+ 1
klorotična diskoloracija
(+) (+) + (+) + + +
4 (3)
listovi mogu imati krom žute mrlje duž vena
(chrome yellow flecking).
Rezultati
74
Nastavak Tablice 14.
Vir
us
simptom
GL
Ra
V-3
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-4
-9
GL
Ra
V-3
, G
FL
V
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-1
GL
Ra
V-3
, G
FL
V,
GL
Ra
V-1
GL
Ra
V-3
, A
rM
V,
GF
LV
GL
Ra
V-3
, G
Fk
V,
GF
LV
, G
LR
aV
-1
GL
Ra
V-3
, G
Fk
V,
GL
Ra
V-2
,
GL
Ra
V-4
-9
GL
Ra
V-3
, G
Fk
V,
GL
Ra
V-1
GL
Ra
V-3
, G
FL
V,
GL
Ra
V-4
-9
GL
Ra
V-3
, G
Fk
V
UK
UP
NO
kasnije otvaranje pupova
+ + + + + + + + 8
slabiji razvoj mladica
+ 1
crvenilo među žilnog područja listova
kod crnih kultivara
GL
R
aV
uvijanje listova prema naličju
žućenje među žilnog područja lista
kod bijelih kultivara
smanjenje vigora
dozrijevanje grozdova kasni
+ 1
zastoj rasta u vegetaciji
+ + + + + + + 7
GL
RaV
-2 pojava guka, tj. zadebljanje na mjestu
srastanja plemka/podloga
Ru
gosa
wood
com
ple
x
pojava brazdi i udubina na
centralnom cilindru (plemka/podloga)
pojava guka, tj. zadebljanje na mjestu
srastanja plemka/podloga
uvijenost, žućenje i crvenilo listova
smanjen vigor
kasnije otvaranje pupova
iznenadno propadanje trsova
GF
kV
prosvjetljenje žila
nastajanje pjega
listovi naborani
deformirani
uvijanje listova
zastoj u rastu
+ 1
UKUPNO: tipova simptoma: 16 41
(27)**
*(+) simptom nije svojstven za virus/e u kombinaciji **(2) zbroj netipičnih simptoma za taj virus
Rezultati
75
Tablica 15. Raznolikost simptoma uslijed zaraza različitim virusima kultivara Krkošija u
kolekcijskom nasadu Višići.
KULTIVAR: KRKOŠIJA
vir
us
simptom
GL
Ra
V-3
GL
Ra
V-3
, G
FL
V
GL
Ra
V-3
, G
FL
V,
GL
Ra
V-1
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-1
, A
rM
V
GF
LV
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-1
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-1
,
GL
Ra
V-4
-9
GL
Ra
V-3
, G
Fk
V,
GL
Ra
V-1
GL
Ra
V-3
, A
rM
V,
GF
LV
GL
Ra
V-3
, G
Fk
V,
GL
Ra
V-4
-9
GL
Ra
V-3
, G
Fk
V
GL
Ra
V-3
, G
FL
V,
GL
Ra
V-4
-9
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-4
-9
UK
UP
NO
deformiranost lista
(+)* + + + 3
(1)
asimetričnost, naboranost,
pojačana nazubljenost lista
+ + + (+) 3
(1)
klorotična išaranost
nenormalno grananje
rozgve/mladice (rašljanje,
bifurkacije)
GF
LV
skraćenje internodija
(nepravilan razvoj
internodija, dvostruki nodiji)
(+) + + + + (+) (+) (+) (+) (+) +
(+)
5 (7)
fascijacije (sraslice, izgledom
podsjeća na dvije slijepljene
mladice)
rast cik-cak
+ (+)
1 (1)
manji broj grozdova koji su
smanjeni veličinom, pucanje
bobica
(+) + + (+)
2 (2)
grozdovi rehuljavi
(+) + + + (+)
3 (2)
neujednačeno dozrijevanje
bobica
(+) + + (+) (+) 2
(3)
formiranje manjeg broja
bobica smanjene veličine
(+) + 1
(1)
žuti mozaik, tj. žućenje koje
može zahvatiti sve zelene
dijelove (djelomičan ili
kompletan)
+ + (+)
2 (1)
nejednolično odrvenjavanje
rozgve
(+) + + (+) + (+) 3
(3)
smanjenje veličine listova
+ (+)
1 (1)
klorotična diskoloracija
(+) +
(+)
1 (2)
listovi mogu imati krom žute
mrlje duž vena
(chrome yellow flecking).
Rezultati
76
Nastavak Tablice 15.
Vir
us
simptom
GL
Ra
V-3
GL
Ra
V-3
,
GF
LV
GL
Ra
V-3
,
GF
LV
, G
LR
aV
-
1
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-1
,
ArM
V
GF
LV
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-1
G
LR
aV
-3,
GL
Ra
V-1
,
GL
Ra
V-4
-9
GL
Ra
V-3
,
GF
kV
, G
LR
aV
-1
GL
Ra
V-3
,
ArM
V,
GF
LV
G
LR
aV
-3,
GF
kV
, G
LR
aV
-
4-9
GL
Ra
V-3
, G
Fk
V
GL
Ra
V-3
,
GF
LV
, G
LR
aV
-
4-9
G
LR
aV
-3,
GL
Ra
V-4
-9
UK
UP
NO
GL
Ra
V
kasnije otvaranje pupova
+ + + (+) + + + + + 8
(1) slabiji razvoj mladica
+ 1
crvenilo među žilnog područja
listova kod crnih kultivara
uvijanje listova prema naličju
žućenje među žilnog područja lista
kod bijelih kultivara
smanjenje vigora
dozrijevanje grozdova kasni
zastoj rasta u vegetaciji
+ + + (+) + + + + 7
(1)
GL
RaV
-
2
pojava guka, tj. zadebljanje na
mjestu srastanja plemka/podloga
Ru
gosa
wood
com
ple
x
pojava brazdi i udubina na
centralnom cilindru
(plemka/podloga)
pojava guka, tj. zadebljanje na
mjestu srastanja plemka/podloga
uvijenost, žućenje i crvenilo listova
smanjen vigor
kasnije otvaranje pupova
iznenadno propadanje trsova
G F k V prosvjetljenje žila
nastajanje pjega,
listovi naborani
deformirani
uvijanje listova
zastoj u rastu
+ + + 3
UKUPNO: 16 46 (27)**
*(+) simptom nije svojstven za virus/e u kombinaciji **(2) zbroj netipičnih simptoma za taj virus
Rezultati
77
Tablica 16. Raznolikost simptoma uslijed zaraza različitim virusima kultivara Trnjak u
kolekcijskom nasadu Višići.
KULTIVAR: TRNJAK
vir
us
simptom
GL
Ra
V-1
,
GF
kV
GL
Ra
V-3
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-1
GF
LV
GL
Ra
V-3
,
GF
LV
ArM
V
GF
kV
GL
Ra
V-3
,
GF
kV
0 (
vir
us-
test
ed
)
UK
UP
NO
deformiranost lista
asimetričnost, naboranost, pojačana nazubljenost lista
(+)* + 1 (1)
klorotična išaranost
nenormalno grananje rozgve/mladice (rašljanje, bifurkacije)
GF
LV
skraćenje internodija (nepravilan razvoj internodija,
dvostruki nodiji)
(+) +
1 (1)
fascijacije (sraslice, izgledom podsjeća na dvije slijepljene
mladice)
rast cik-cak
(+) +
1 (1)
manji broj grozdova koji su smanjeni veličinom, pucanje
bobice
+ 1
grozdovi rehuljavi
neujednačeno dozrijevanje bobica
(+) (+) + + +
3 (2)
formiranje manjeg broja bobica smanjene veličine
žuti mozaik, tj. žućenje koje može zahvatiti sve zelene
dijelove (djelomičan ili kompletan)
nejednolično odrvenjavanje rozgve
(+) (+)
(2)
smanjenje veličine listova
(+) +
1 (1)
klorotična diskoloracija
(+) (1)
listovi mogu imati krom žute mrlje duž vena
(chrome yellow flecking).
Rezultati
78
Nastavak Tablice 16.
Vir
us
simptom
GL
Ra
V-1
,
GF
kV
GL
Ra
V-3
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-1
GF
LV
GL
Ra
V-3
,
GF
LV
ArM
V
GF
kV
GL
Ra
V-3
,
GF
kV
0 (
vir
us-
test
ed
)
UK
UP
NO
kasnije otvaranje pupova
+ + + + + 5
slabiji razvoj mladica
+ 1
crvenilo među žilnog područja listova kod crnih kultivara
GL
Ra
V
uvijanje listova prema naličju
žućenje među žilnog područja lista kod bijelih kultivara
smanjenje vigora
dozrijevanje grozdova kasni
+ 1
zastoj rasta u vegetaciji
+ + + + + + 6
GL
RaV
-
2
pojava guka, tj. zadebljanje na mjestu srastanja
plemka/podloga
Ru
gosa
wood
com
ple
x
pojava brazdi i udubina na centralnom cilindru
(plemka/podloga)
pojava guka, tj. zadebljanje na mjestu srastanja
plemka/podloga
uvijenost, žućenje i crvenilo listova
smanjen vigor
kasnije otvaranje pupova
iznenadno propadanje trsova
GF
kV
prosvjetljenje žila
nastajanje pjega
listovi naborani
deformirani
uvijanje listova
zastoj u rastu
+ +
2
UKUPNO: 11 (2) 23 (9)**
*(+) simptom nije svojstven za virus/e u kombinaciji **(2) zbroj netipičnih simptoma za taj virus
Rezultati
79
Tablica 17. Raznolikost simptoma uslijed zaraza različitim virusima kultivara Žilavka u
kolekcijskom nasadu Višići.
KULTIVAR: ŽILAVKA
vir
us
simptom
GL
Ra
V-3
GL
Ra
V-3
,
ArM
V
GL
Ra
V-3
,
GF
kV
GL
Ra
V-3
,
GF
LV
GL
Ra
V-3
,
ArM
V,
GF
LV
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-1
ArM
V
UK
UP
NO
deformiranost lista
(+)* (1)
asimetričnost, naboranost,
pojačana nazubljenost lista
(+) (+) + (+) 1 (3)
klorotična išaranost
(+) (1)
nenormalno grananje
rozgve/mladice (rašljanje,
bifurkacije)
GF
LV
skraćenje internodija
(nepravilan razvoj
internodija, dvostruki
nodiji)
(+) + (+) + + (+) +
4 (3)
fascijacije (sraslice,
izgledom podsjeća na dvije
slijepljene mladice)
rast cik-cak
(+) +
1 (1)
manji broj grozdova koji
su smanjeni veličinom,
pucanje bobice
(+) + (+) (+) + 3 (2)
grozdovi rehuljavi
neujednačeno dozrijevanje
bobica
(+) (1)
formiranje manjeg broja
bobica smanjene veličine
+ (+)
1 (1)
žuti mozaik, tj. žućenje
koje može zahvatiti sve
zelene dijelove (djelomičan
ili kompletan)
(+) + (+)
1 (2)
nejednolično
odrvenjavanje rozgve
(+) + + + 3 (1)
smanjenje veličine listova
klorotična diskoloracija
(+) + +
2 (1)
listovi mogu imati krom
žute mrlje duž vena
(chrome yellow flecking).
Rezultati
80
Nastavak Tablice 17. V
iru
s
simptom
GL
Ra
V-3
GL
Ra
V-3
,
ArM
V
GL
Ra
V-3
,
GF
kV
GL
Ra
V-3
,
GF
LV
GL
Ra
V-3
,
ArM
V,
GF
LV
GL
Ra
V-3
,
GL
Ra
V-1
ArM
V
UK
UP
NO
kasnije otvaranje pupova
+ + + 3
slabiji razvoj mladica
crvenilo među žilnog područja listova kod
crnih kultivara
GL
Ra
V
uvijanje listova prema naličju
žućenje među žilnoga područja lista kod
bijelih kultivara
smanjenje vigora
dozrijevanje grozdova kasni
+ + + + 4
zastoj rasta u vegetaciji
+ + + + + 5
GL
RaV
-
2
pojava guka, tj. zadebljanje na mjestu
srastanja plemka/podloga
Ru
gosa
wood
com
ple
x
pojava brazdi i udubina na centralnom
cilindru (plemka/podloga)
pojava guka, tj. zadebljanje na mjestu
srastanja plemka/podloga
uvijenost, žućenje i crvenilo listova
smanjen vigor
kasnije otvaranje pupova
iznenadno propadanje trsova
GF
kV
prosvjetljenje žila
nastajanje pjega
+ 1
listovi naborani
deformirani
uvijanje listova
zastoj u rastu
+
1
UKUPNO: 13 (3) 30 (17) **
*(+) simptom nije svojstven za virus/e u kombinaciji **(2) zbroj netipičnih simptoma za taj virus
Rasprava
81
5. RASPRAVA
Terenskim istraživanjem i uzorkovanjem provedenim 2011. godine u dva
hercegovačka vinogorja, smještenim u šest općina na prostoru dviju županija
(Zapadnohercegovačke i Hercegovačko-neretvanske) u Federaciji Bosni i Hercegovini, u
ukupno dvadeset vinograda sakupljeno je 1332 uzoraka autohtonih kultivara vinove loze.
Visoka zastupljenost virusa u testiranim uzorcima iz hercegovačkoga vinogorja može
se velikim dijelom povezati s nedovoljno kvalitetnim sadnim materijalom. Naime poznato je
da pojedini vinogradi, u kojima je vršeno prikupljanje uzoraka u ovoj studiji, potječu iz 60-ih
godina prošloga stoljeća, pa se može pretpostaviti da korišteni sadni materijal nije bio niti
kategorije CAC. Starost trsova u vinogradima u vrijeme istraživanja kretala se od 5 do 40
godina. Većina vinograda odabranih za istraživanje bili su homogeni u smislu starosti, ali su
većinom bili heterogeni u smislu sortimenta jer su sadržavali po nekoliko kultivara, ili se
radilo o autohtonim kultivarima ili alohtonim. Najzastupljeniji u studiji, s gotovo polovicom
(47,29 %) od ukupna broja testiranih uzoraka, bili su uzorci dvaju najvažnijih autohtonih
hercegovačkih kultivara, Žilavke i Blatine. Od toga ukupna broja uzoraka Žilavke i Blatine
41% činili su uzorci ta dva kultivara uzeti s trsova iz vinograda uključenih u pozitivnu
masovnu selekciju (početak klonske selekcije). Najbrojniji je prateći autohtoni kultivar Trnjak
činio 23,19 % od broja prikupljenih uzoraka u ovom istraživanju, dok su tri manje zastupljena
prateća autohtona kultivara činili 29,49 % u ukupnom broju od 1332 analizirana trsa (Bena
12,46 %, Dobrogostina 8,78 % i Krkošija 8,25 %). Istraživanje se temeljilo na pretpostavci da
je unatoč očekivanoj visokoj opterećenosti autohtonoga sortimenta vinove loze virusima ipak
moguće pronalaženje i zdravih trsova koji bi mogli poslužiti kao osnova za inicijaciju
proizvodnje kvalitetna sadnoga materijala. U skladu s tim izabran je ranije navedeni skup
atraktivnih autohtonih kultivara i većina uzrokovanih trsova nije imala vidljive simptome
viroza. Pretpostavka je potvrđena i nađeno je 179 (13,4 %) uzoraka vinove loze u kojima nisu
detektirani testirani virusi (virus-tested). Najviše uzroka u kojima nisu detektirani virusi bilo
je kod kultivara Trnjak (čak njih 84 od ukupno 309 analiziranih iz toga kultivara), 45 ih je
bilo kod Blatine, 32 kod Žilavke, 11 kod Bene i 7 kod Dobrogostine, dok kod kultivara
Krkošija ni jedan uzorak nije bio bez virusa.
Rasprava
82
Rezultati istraživanja viroza vinove loze iz susjednih zemalja poslužili su kao osnova
za usporedbu sa zatečenim stanjem viroza u hercegovačkom vinogorju otkrivenim u ovom
radu koji je, nakon nekoliko parcijalnih istraživanja stanja u pojedinim regijama i na
pojedinačnim kultivarima u BiH (Festić i Šutić, 1977; Buturović i Klindić, 1977; Delić i sur.,
2007; Lasić i sur., 2010), prvi cjelovito obradio pojavnost 9 viroza u hercegovačkom
vinogorju na svih 6 najvažnijih autohtonih kultivara. Učestalost pojave virusa, većinom
temeljena na primjeni metoda ELISA (kakvi su u dijagnostici virusa vinove loze primjenjeni i
u ovom radu), varira u različitim regijama uzgoja loze, ali u BiH bliskim regijama
prevladavaju iste ili srodne virusne vrste koje su nađene i ovom studijom. U LR skupini
virusa u testiranim uzorcima utvrđena je zastupljenost virusa iz porodice Closteroviridae
izrazito veća (95,36 %) u odnosu na Comoviridae (38,82 %) i Tymoviridae (14,79 %). Unutar
virusne porodice Closteroviridae među detektiranim virusima dominirali su predstavnici roda
Ampelovirus, posebice Podgrupa I (88,37 %), a potom virusi iz Podgrupe II (6,76 %). Virusi
iz roda Closterovirus imali su malu pojavnost (0,23 %), dok Velarivirus nisu detektirani u
ovom istraživanju. Unutar roda Ampelovirus virus GLRaV-3 iz Podgrupe I ima veću
pojavnost (66,52%) nego virus GLRaV-1 (22 %) u okviru od 1332 analizirana uzorka.
Suprotno podacima Delić i sur. (2007) u čijoj je studiji provedeno testiranje na 76
uzoraka u Hercegovini (autohtoni kultivari: Blatina, Žilavka, Bena, te alohtoni kultivari:
Vranac, Gamay, Moldavia, Smederevka) gdje su dobiveni rezultati ukazali na dominantnost
virusa GLRaV-1 (47,37 %), ova studija na 1332 uzorka na isključivo 6 autohtonih kultivara
(Žilavka, Blatina, Bena, Krkošija, Dobrogostina, Trnjak) ukazuje na dominantnost GLRaV-3
(66,52 % pozitivnih uzoraka) u odnosu na GLRaV-1 (22 % pozitivnih uzoraka) unutar
Podgrupe I roda Ampelovirus. Ako bi iz spomenute studije izuzeli rezultate koji se odnose na
alohtone kultivare, ostaju rezultati 48 uzoraka kultivara Blatina, Žilavka i Bena. Analizirajući
izdvojeni dio rezultata te studije Delić i suradnika (2007), uočava se blago smanjenje razlike u
dominatnosti GLRaV-1 u odnosu na GLRaV-3 s 18,36 % na 16,58 %, ali i dalje u korist
GLRaV-1.
Međutim rezultati su dobiveni u ovoj studiji, a i u studiji Lasića i sur. (2010), u skladu
s dobivenim rezultatima istraživanja provedenim na autohtonim kultivarima Istre (Poljuha i
sur., 2004), te također kasnijim testiranjem istih autora iz 2010., kao i s onima Peršurića i sur.,
(2005), te s ishodima istraživanja provedenim na autohtonim kultivarima Dalmacije (Zdunić i
sur., 2007; Karoglan Kontić i sur., 2009a; Karoglan Kontić i sur., 2009b; Vončina i sur., 2009;
Vončina i sur., 2009b; Vončina, 2011.). Rezultati tih studija, ali i svih ostalih ranije
provedenih istraživanja potvrđuju činjenicu da je GLRaV-3 najučestaliji virus u priobalnom,
Rasprava
83
mediteranskom dijelu Hrvatske. Spomenuta istraživanja, ali i brojna druga istraživanja
zdravstenoga stanja vinove loze provedena u Alžiru, Cipru, Grčkoj, Malti, Maroku (Digiaro i
sur., 2000) te u Italiji (Savino i sur. 2001), idu u prilog činjenici da je GLRaV-3 dominantan
virus na području Mediterana, dok se prema sjevernijim vinogradarskim područjima smanjuje
njegova učestalost, a počinje dominirati GLRaV-1 (Maixner, 2005; Savino i sur., 2001; Credi
i Giunchedi, 1996). Rezultati se ovog istraživanja u hercegovačkom vinogorju većim dijelom
podudaraju i s rezultatima publiciranim u radu Giovanna i sur. (2015) koji su istraživali
različite autohtone kultivare u južnoj talijanskoj regiji Kalabriji. Postotak se zaraze u
navedenom istraživanju kretao od udjela za GVA od 37,4 % pa sve do GVB s 0,3 %
pojavnosti (32,6 % GLRaV-3; 12,8 % GFLV; 7,7 % GFkV; 7,3 % GLRaV-1; 1,9 % GLRaV-
2); uz napomenu da virus ArMV u tom istraživanju nikada nije pronađen, ali u jednoj drugoj
studiji (Materazzi i sur., 2009) kod pratećega autohtonog kultivara iz regije Garfagnan (Italija)
ArMV detektiran u 56,5 % istraživanih uzoraka. Značajna je razlika u tome što je u
hercegovačkim vinogorjima dominantan virus GLRaV-3, koji je na drugom mjestu po
dominaciji u pokrajini Kalabriji, dok je tamošnji dominirajući virus GVA.
Rezultati do kojih se došlo ovim istraživanjem pojavnosti viroza vinove loze u
hercegovačkim vinogorjima, jasno pokazuju da je vinova loza u tom podneblju često zaražena
tom grupom patogena, te da su virusi prisutni u svim istraživanim (6) autohtonim kultivarima.
U pogledu zastupljenosti virusa na pojedinim kultivarima u istraživanim vinogradima (20),
nađene su značajne razlike. Najveći broj trsova slobodan od svih istraživanih virusa utvrđen
je, kako je istaknuto ranije, kod kultivara Trnjak (ukupno 84 trsa iz 8 različitih vinograda).
Slijedili su kultivari Blatina i Žilavka koji su istraživani u 6 vinograda gdje je utvrđeno 45
trsova kultivara Blatine i 32 trsa kultivara Žilavka slobodnih od detektiranih virusa. Nasuprot
tome provedenim analizama utvrđeno je da kod kultivara Dobrogostina i Krkošija koji su se
istraživani u 5 vinograda, nađeno 7 trsova kultivara Dobrogostina (6,4 %) slobodnih od
istraživanih virusa, te da kod kultivara Krkošija nije nađen ni jedan bezvirusni trs (bili su
uglavnom zaraženi barem virusom GLRaV-3 samostalno ili u miješanim zarazama). Kod
kultivara Bena u 4 istraživana vinograda utvrđeno je ukupno 11 (6,6 %) trsova slobodnih od
istraživanih virusa. Slična situacija bila je s kultivarima Žilavka (11,5 %) i Blatina (12,8 %),
dok je uvjetno prihvatljiv sanitarni status ustanovljen kod Trnjaka gdje je gotovo 28 % biljaka
bilo slobodno od svih istraživanih virusa. Ta distribucija virusa kao i relativno visok broj
jednostrukih u odnosu na miješane zaraze potvrđuje podatke iz literature o diferencijalnoj
distribuciji virusa u odnosu na klimu i geografsku širinu u drugim zemljama (Digiaro i sur.,
1999.; Savino i sur., 2002). Unatoč činjenici da su ispitivani trsovi hercegovačkih autohtonih
Rasprava
84
kultivara vinove loze izvan kolekcijskoga nasada Višići, bili većinom bez jasnih simptoma
viroza, dobiveni rezultati otkrivaju visoke stope zaraženosti, naročito pojedinim virusnim
vrstama. Prisutan širok dijapazon virusa i ako jasni simptomi izostaju potvđuje činjenicu da
simptomi sami za sebe na vinovoj lozi ne mogu biti pouzdani dijagnostički pokazatelj
zaraženosti virusima (Vončina, 2011). Važno je detektirati uzročnike virusnih blesti, posebno
kada trsovi ne pokazuju tipične simptome, jer su nedetektirani pozitivni trsovi (npr. bez jasnih
simptoma) izvor infekcije i širenja virusa, ako se ne identificiraju i ne eliminiraju iz
vinograda.
Promatrajući dobivene rezultate, a posebice dovodeći u vezu virusne zaraze – kultivar
– lokalitet/vinograd, može se uočiti da je kod svih kultivara na svim lokalitetima/vinogradima
daleko najčešće detektiran virus GLRaV-3 nađen u 66,37 % uzoraka i to u svim vinogradima
(11 lokacija). Izuzetak od ove tvrdnje pojavljuje se kod kultivara Blatina na lokalitetima
vinograd br. 5. I 19. U tim vinogradima pojavnost GFLV (96,15 % i 86 %) bila je značajno
veća od GLRaV-3 (50 % i 58 %). Značajno veća pojavnost GFLV (83,02 %) u odnosu na
GLRaV-3 (28,30 %) utvrđena je i kod kultivara Trnjak na lokalitetu vinograd br. 10. Slično je
bilo u još dva vinograda u kojima je uzorkovano u svakom po 50 uzoraka (br.19. i br.13.) gdje
je na kultivaru Trnjak utvrđena veća pojavnost GFLV (14 % i 38 %) u odnosu na inače
dominirajući GLRaV-3 (8 % i 30 %). U vinogradima br. 11. I br. 5. na kultivaru Trnjak
razlika u pojavnosti virusa GFLV (33,33 % i 37,50 % ) u odnosu na GLRaV-3 (6,67 % i 0) je
moguće manja, zbog manjega broja ukupno uzetih uzoraka (15 i 8). Dakle može se reći da je
na kultivaru Trnjak u 5 vinograda (od ukupno 8 istraživanih) veća učestalost zaraze bila ona s
GFLV (36,24 %) u odnosu na pojavnost GLRaV-3 (31,71 %). Kod kultivara Bena jedan
vinograd Rasadnik (vinograd 7.) ima istu pojavnost GLRaV-3 i GFLV (68,97 %). U svim
ostalim testovima virus GLRaV-3 imao je dominantnu pojavnost. Najveći postotak zaraze s
GLRaV-3 kod 6 istraživanih autohtonih hercegovačkih kultivara utvrđen je kod kultivara
Dobrogostina (93,16 %), potom kod dva kultivara Bena (87,35 %) i Žilavka (82,01 %).
Podjednako visok postotak zaraze s GLRaV-3 utvrđen je kod kultivara Krkošija (70,90 %) i
Blatina (64,20 %), dok je najmanja učestalost utvrđena kod kultivara Trnjak (31,71 %).
Njegova prisutnost nije utvrđena na dva lokaliteta u općini Ljubuški. GLRaV-3 nije detektiran
u vinogradu br.1. na kultivaru Krkošija, ni u vinogradu br. 5. na kultivaru Trnjak. Naime,
GLRaV-3 osim zaraženim sadnim materijalom prenosi se i vektorima, stoga bi se dominacija
toga virusa u provedenom istraživanju mogla pripisati utjecaju vektora (štitaste uši). Budući
da u straživanju nije determiniran utjecaj vektora na distribuciju virusa, pretpostavka da je
učestalost infekcije posljedica širenja vektra, u ovom istraživanju, ne može biti potkrjepljena.
Rasprava
85
U daljnjem radu bilo bi potrebno provesi dodatna istraživanja i determinaciju prisutnih
vektora virusa vinove loze, te razviti strategiju praćenja i suzbijanja vektora na području
Hercegovine i povezati s distribucijom virusa. Dominantnost GLRaV-3 potvrđena je u sličnim
studijama provedenim u Hrvatskoj (Poljuha i sur., 2004; Peršurića i sur., 2005; Zdunić i sur.,
2007; Karoglan Kontić i sur., 2009a; Karoglan Kontić i sur., 2009b; Vončina i sur., 2009;
Vončina i sur., 2009b; Poljuha i sur., 2010; Vončina, 2011) čija prisutnost varira u rasponu od
72,3 % do 100 % godine, kao i u onima provedenim u Alžiru, Cipru, Grčkoj, Malti i Maroku
(Digiaro i sur., 2000); onim iz srednje i južne Italije (Savino i sur., 2001 i Giovanna i sur.
2015), te brojim drugim u kojima je GLRaV-3 također potvrđen kao dominantan virus, očito
se radi o najrasprostranjenijem viursu na području mediteranskoga bazena. U prilog toj
činjenici idu i rezultati studije iz Tunisa koja također bilježi GLRaV-3 kao najrašireniji virus
(76,3 %) koji inficira trsove u njihovim vinogradima, a slijede ga GLRaV-4-like virusi
(GLRaV-5, -6), a potom GLRaV-1, GLRaV-2 i GLRaV-7, s tim da se zadnja tri virusa
pojavljuju u manje od 10 % infekcija (Mahfoudhi i sur. 2008). S druge strane, Turska studija
pokazuje veću prisutnost GLRaV-1 u njihovim vinogradima u usporedbi s GLRaV-3 (Akbas i
sur., 2007), što je razlika u odnosu na hercegovačke vinograde u kojima je taj virus na trećem
mjestu po pojavnosti.
Iza GLRaV-3 po učestalosti pojave virusa u Hercegovini slijedio je virus GFLV
(37,54 %). Taj virus jedino kod kultivara Trnjak ima utvrđenu veću pojavnost od 36,24 % u
odnosu na virus GLRaV-3 (31,71 %). Kod kultivara Bena (19,27 %) i Krkošija (40,90 %)
GFLV je na trećem mjestu učestalosti. Virus GLRaV-1 kod ta dva kultivara (25,30 % i 64,56
%) je drugi virus po pojavnosti, odmah iza virusa GLRaV-3. On je utvrđen na svim
lokalitetima i u svim istraživanim kultivarima, osim na kultivaru Krkošija jednoga lokaliteta u
općini Ljubuški (Zgoni; vinograd br. 1.). Radi se o posebice zanimljivom vinogradu (br. 1) u
kojem nije detektirana prisutnost dvaju inače najučestalijih virusa, GLRaV-3 i GFLV. U tom
je vinogradu najveću učestalost imao virus GLRaV-1.
Potvrđen kao treći virus po zastupljenosti u provedenom istraživanju, GLRaV-1 je
detektiran u ukupno 293 uzorka (22 %). Kod kultivara Bena (25,30 %) i Krkošija (64,56 %)
taj je virus drugi po učestalosti, odmah iza virusa GLRaV-3. Štoviše, u vinogradu br. 1. čak
92 % uzoraka kultivara Krkošija sadržavalo je taj virus (testirano je 25 trsova). Tako visok
postotak infekcije GLRaV-1 predstavlja izuzetak. Prisutnost GLRaV-1 nije potvrđena u
vinogradu br.19 na kultivaru Blatina, dok je u istom tom vinogradu na kultivaru Trnjak,
GLRaV-1 bio dominantan virus, kao i na kultivaru Trnjak u vinogradima br. 20 i br. 6., gdje
GLRaV -1 dominatnu pojavnost dijeli s GLRaV-3. U četiri je vinograda GLRaV-1 na drugom
Rasprava
86
mjestu po pojavnosti i to u dva vinograda (br. 6. I 16.) na Beni, u vinogradu br.8 na Krkošiji i
u vinogradu br. 11. na Trnjaku, dok u tri vinograda drugu najveću učestalost dijeli (s GFLV u
vinogradu br. 20 na Beni i u vinogradu br.17. na Krkošiji; s GLRaV-3 u vinogradu br. 10 na
Trnjaku). Na ukupno 50 uzoraka kultivara Trnjak u vinogradu br. 13. drugo mjesto po
pojavnosti virus GLRaV-1 dijeli s GLRaV-3 i GFkV. U čak je sedam vinograda GLRaV-1 na
četvrtom mjestu učestalosti i to na kultivaru Blatina (vinogradi br. 5., 13., 14.), na kultivaru
Žilavka (vinogradi br. 12., 20.), na kultivaru Bena (vinograd br. 7.) i kultivaru Dobrogostina
(vinograd br. 18).
Pojavnost tri virusa GLRaV-3, GFLV i GLRaV-1 u ukupnom zbroju pojedinačnih
infekcija (47,3 %) autohtonih hercegovačkih kultivara je najveća i iznosi 95,8 % pojavnosti.
Miješane infekcije s dva virusa (36,6 %) u ovoj studiji bilježe da su kombinacije s najvećim
postotkom pojavnosti upravo spomenuta tri virusa: i to 47,3 % otpada na GFLVGLRaV-3
kombinaciju i 18,2 % na GLRaV-1GLRaV-3 kombinaciju. Isto se ponavlja u miješanim
infekcijama s tri virusa, gdje od 155 trsova (13,4 %) kombinacija GFLVGLRaV-
1GLRaV-3 čini 31,6 % pojavnosti. Budući da u ovom pregledu nema odstupanja u
dominaciji pojavnosti ta tri virusa i u kombinaciji s četiri virusa (2,4 %) dvije virusne
kombnacije GFLVGLRaV-1GLRaV-3GFkV i GFLVGLRaV-1GLRaV-
3GLRaV-4-9 čine 57,1 % pojavnosti. Isto je i kod miješanih infekcija s pet virusa u
kombinaciji (0,25 %), gdje virusna kombinacija GFLVGLRaV-1GLRaV-
3GFkVGLRaV-4-9, čini 66, 7 % pojavnosti. Slično istraživanje provedeno u Dalmaciji
(Vončina 2011) pokazuje da dva virusa GLRaV-3 i GLRaV-1 imaju dominaciju u pojavnosti
miješanih infekcija zajedno s GVA. U oba istraživanja (vinogradi iz Dalmacije i vinogradi
Hercegovine) zamijećena je podudarnost koja se očituje kroz činjenicu da za tri virusa koja su
dominatna po pojavnosti u istraživanju, njihova se dominacija proteže i u svim
kombinacijama miješanih infekcija. U hercegovačkim vinogradima od ukupno 32
istraživanjem utvrđene kombinacije (s dva, tri, četiri i pet virusa) u 31 kobinaciji miješanih
infekcija pojavljuju se LR virusi. Virusi iz skupine uvijenosti lišća ostvaruju velike zaraze i na
području Dalmacije (Vončna i sur., 2009, Vončina 2011), ali i na području Istre, gdje su virusi
iz skupine uvijenosti lišća pronađeni na gotovo svim istraživanim lokaliteima (Poljuha i sur.,
2010). Turska studija (Akbas i sur., 2007) zabilježila je da su miješane infekcije uobičajene
kod loza pogođenih s virusima povezanim s LR-om i detektirane su miješane infekcije između
razičitih GLRaV-a. Jasno je da su u određenim dijelovima svijeta određeni virusi dominantni
u pojavnosti. Stoga treba proučiti utjecaj štitastih ušiju, vektora LR na učestalost prijenosa
Rasprava
87
različitih LR virusa (Jooste i sur. 2015), ali i drugih vektora (nematode) drugih virusnih vrsta i
njihovih populacija.
Nakon GLRaV-1 po pojavnosti u ovom istraživanju slijedi GFkV, koji je detektiran na
ukupno 197 uzoraka (14,79 %) i to u svim istraživanim kultivarima. GFkV je nađen u najviše
uzoraka kultivara Blatina (72 uzorka; 20,45 %) što ga čini trećem najčešćim virusom (od 10
istraživanih) kod toga kultivara. Na sedam lokacija nije detektiran [tri lokacije Trnjka
(vinogradi: 10., 5., 19.), dvije lokacije Dobrogostine (vinogradi: 2., 4.) i po jedna lokacija
Krkošije (vinograd 4.) i Žilavke (vinograd 9.)]. Najniži postotak pojavnosti toga virusa
zabilježen je kod kultivara Dobrogostina (16 uzoraka; 7,69 %). Učestalost tih virusa po
lokacijama/vinogradimakretao se od 4,55 % do 38 %. Najniža i najveća učestalost u
istraživanju zabilježena je u vinogradu br. 13., gdje je detektiran u svega dva trsa kultivara
Žilavka (od ukupno 44 trsa) i u 19 trsova kultivara Blatina (od ukupno 50 trsova). U četiri
vinograda GFkV bio je na drugom mjestu pojavnosti [na kultivaru Krkošija (vinograd br. 1),
na kultivaru Trnjak (vinograd br. 13.) te na kultivaru Žilavka (vinograd br. 16.)], dok drugo
mjesto dijeli s virusima LR (GLRaV-1, GLRaV-3, GLRaV-4-9) na kultivaru Trnjak
(vinograda br. 13.) i s GFLV na kultivaru Žilavka (vinograd br. 20.). Na trećem mjestu
učestalosti taj virus zabilježen je u šest vinograda: na kultivaru Blatina (vinogradi br. 5., 13.,
14., 19.), na kultivaru Žilavka (vinograd br. 6.) i kultivaru Dobrogostina (vinograd br.18.),
dok četvrto mjesto dijeli s GLRaV-3 na kultivaru Trnjak (vinograd br.11. i 20.), a s GFLV na
kultivaru Trnjak (vinograd br. 11.) i kultivaru Žilavka (vinograd br. 13.), te s GLRaV-1 na
kultivaru Blatina (vinograd br. 9.). Taj je virus na petom mjestu pojavnosti kod kultivara
Krkošija (vinograd br. 20.) i kultivar Trnjak (vinograd br. 15.).
Po učestalosti detekcije u ovom istraživanju iza virusa GFkV slijedio je kompleks
(skupina) virusa GLRaV-4-9, koji je detektiran u ukupno 90 trsova (6,76 %). Najveći postotak
te zaraze imao je kultivar Krkošija s 16,36% pozitivnih testiranih uzoraka. U 10 vinograda
ova skupina virusa nije detektirana. Budući da su za dokazivanje prisutnosti kompleksa
(skupina) virusa GLRaV-4-9 korištena isključivo monoklonska protutijela za koje je
dokazano da ne detektiraju sve sojeve navedenih virusa, nije isključena mogućnost da je
pojavnost toga virusa podcjenjena.
Sagledavajući rezultate RT-PCR analize 27 odabranih uzoraka serološki pozitivnih
(metode ELISA) na GLRaV-4-9 (Tablica 27. Priloga 4.) uz primjenu specifičnih početnica
detektirana su dva virusa iz te skupine od pet virusa i to GLRaV-5 i GLRaV-9. Ukupno je 10
uzoraka bilo pozitivno, od čega su tri uzorka sadržavala oba virusa, dok je 6 uzoraka s
detektiranim GLRaV-5 i 7 s GLRaV-9. Ostali virusi iz te grupe nisu detektirani.
Rasprava
88
Detekcija različitih virusa zasnovana je na komercijalnim početnicama dizajniranim na
osnovu podataka o sekvencijama deponiranim u GenBank (Jooste i sur. 2015), stoga je
etekcija limitirana na točnost i osjetljivost korištenih početnica i predstavljeni rezultati
bazirani su na toj činjenici.
ArMV je na predzadnjem mjestu po učestalosti pojave u ovom istraživanju jer je
detektiran u svega 17 trsova (1,28 %) i to u dva vinograda (br. 20 i br.17.). Dobiveni su niski
postoci zastupljenosti toga virusa u skladu s rezultatima istraživanja na kolonskim
kandidatima u Hrvatskoj (Kontić i sur., 2009a, 2009b), te u istraživanju Vončina i sur. (2011)
gdje utvrđna 3,23 % njegove pojavnosti. Odsutpanje od tako niskih vrijednosti pojavnosti
virusa ArMV kod autohtonih kultivara nalazimo u studiji Materazzi i sur. iz 2009., gdje je
kod autohtonoga kultivara od manje važnosti u regiji Garfagnan (Italija) detektiran kod 56,5
% uzoraka. Razlog takva odstupanja može se tražiti u činjenici da je distribucija ArMV na
istraživanom području ograničena na malo područje zbog karakteristike vektora Xiphinema
diversicaudatim (Harrison i Winslow, 1961), što dovodi do niske učestalosti zbog čega virus
nije mogao biti determiniran. Budući da je u Hercegovini do sada zabilježeno jedno
istraživanje nematoda vektora virusa vinove loze (Buturović i Klindić, 1977), bilo bi uputno
provesti istraživanje s ciljem utvrđivanja prisutnosti nematoda vektora virusa vinove loze.
Prema navodima iz literature (Martelli i Boudon-Padieu, 2006; Vončina, 2011), vrste ArMV i
GFLV često su zastupljene u mješovitim infekcijama zajedno. Učestalost ArMV u miješanim
infekcije s GFLV-om u ovom istraživanju je 88,23 % i u skladu je s navodima iz literature.
Budući da je determinacija ArMV metodom ELISA može uslijed heterogenosti virusnih
izolata polučiti pomanjkanjem učinkovitosti detekcije tom metodom, istraživanje
zastupljenosti toga virusa u autohtonim kultivarima Hercegovine treba nastaviti. Za
kvalitetniju determinaciju toga virusa bilo bi uputno istražiti varijabilnost između izolata s
različitih uzgojinih područja vinove loze i prilagoditi molekularne metode istom (López-
Fabuel i sur., 2013).
Iako je GLRaV-2 u ovom istraživanju pronađen u manjem broju uzoraka (svega u 3
trsa; 0,23 %) ne treba zanemariti njegovu važnost odnosno probleme koje može uzrokovati u
rasadaničarstvu loznoga materijala. Naime GLRaV-2 pronađen je kod kultivara Dobrogostina
(2 trsa) i kultivara Krkošija (1 trs), što također ne mora značiti da je prisutan na drugim
lokalitetima i drugim kultivarima u Hercegovini koji nisu obuhvaćeni ovim istraživanjem.
GLRaV-2 je prvobitno povezivan s uvijenosti lista vinove loze (Gugerli i sur., 1984). Kasnije
je utvrđeno da na kultivarima cijepljenim na podlogu K5BB inducira inkompatibilnost
podloge i plemke (eng. Graft incompatibility) u francuskim i talijanskim vinogradima (Greif i
Rasprava
89
sur., 1995). Na području je Kalifornije i Novoga Zelanda taj virus inducirao spojnu
inkompatibilnost i venuće (eng. Union-incompatibility, decline), kod osjetljivih podloga
potpuno venuće (eng. California's young vine decline, quick decline; Uyemoto i sur., 2001;
Bonfiglioli i sur., 2003; Martelli i Boudon-Padieu, 2006; Martelli i Gallitelli, 2008) i lezije
podloge (eng. Rootstock stem lesion; Meng i sur., 2005; Greif i sur., 1995; Uyemoto i sur.,
2001; Bonfiglioli i sur., 2003; Bertazzon i Angelini, 2004; Bertazzon i sur., 2010; Alkowni i
sur., 2011). GLRaV -2 je u ovom istraživanju potvrđen RT-PCR metodom uz primjenu
specifičnih početnica (GLR2CP1/GLR2CP2; Abou Ghanem-Sabanadzovic i sur. 2000).
Predstoje daljnja istraživanja u kojima će se napraviti karakterizacija detektiranih virusnih
izolata s obzirom na to da se oni mogu razlikovati u simptomima i patogenosti na koje utječu
genetske karakteristike virusa (Bertazzon i sur., 2010).
Iako virusi GVA i GVB, kao i pojedine vrste virusa iz kompleksa LR (GLRaV-4, -6, -
7) u ovom istraživanju nisu pronađeni, ne treba zanemariti njihovu važnost u sanitarnom
statusu vinove loze. Slično su i Mslmanieh i sur. (2006) utvrdili nepostojanje GVB na
sirijskim autohtonim kultivarima, i svega jedan (0,1 %) pozitivnih uzorak na ArMV od
ukupno relativno velikoga broja od 736 uzoraka. Naime u ovom istraživanju na autohtonim
hercegovačkim sortama za detekciju virusa GVA korišteni su komercijalni kompleti reagensa
(Bioreba) s poliklonskim IgG za oblaganje i poliklonski i monoklonski konjugirana
protutijela. Za detekciju GLRaV-7 korišten je komplet reagensa (Agritest) s poliklonskim i
monoklonskim protutijelima, dok su za detekciju GVB korištena monoklonska protutijela
istoga proizvođača. Detekcija virusa ograničena preciznošću i osjetljivošću upotrijebljenih
primarnih i sekundarnih protutijela. Budući da su za dokazivanje prisutnosti GVA i GVB
korištena komercijalna monoklonska protutijela koja ne mogu detektirati sve sojeve
navedenih virusa, nije isključena mogućnost njihove prisutnosti u hercegovačkim
vinogradima. U budućim bi se istraživanjima metode ELISA mogle provesti s komercijalnim
dijagnostičkim kompletima (kitovi) drugih kemijskih kuća za te viruse. U prilog su tomu i
rezultati istraživanja Faggioli i sur. (2012) koji vrijednostima validacijskih parametara
pokazuju da postoje razlike između osjetljivosti, specifičnosti i preciznosti kod pojedinih
virusa između korištenih kitova triju kemijskih kuća: Agritest (Italia), Bioreba (Švicarska) i
Sediag (Francuska). Primjerice za virus GVA najveće vrijednosti validacijskih parametara
imaju kitovi Sediag, potom Agritest, dok Bioreba kitovi imaju niske vrijednosti.
U okviru osam vizualnih pregleda trsova autohtonih kultivara (6) (prethodno testiranih
na viruse serološkim testovima) u kolekcijskom nasadu Višići obavljenih tijekom vegetacije
od 2011. do 2013. godine, zabilježeno je ukupno 38 različitih simptoma. Pojedini uočeni
Rasprava
90
simptomi mogli bi biti uzrokovani i različitim drugim biotskim, ali i abiotskim čimbenicima.
Želeći povezati rezultate preciznih laboratorijskih dijagnostičkih testova i pojavu vidljivih
simptoma na virotičnim kultivarima ova studija naglašava važnost preciznoga detektiranja
virusa u autohtonim kultivarima koji imaju širok raspon viroza, iako simptomi na biljkama
nisu specifični za pojedinu virozu niti su često izraženi u jasnom obliku. Neki od simptoma
koji su u ovom istraživanju uočeni u kolekcijskom nasadu Višići, nalikovali su promjenama
koje su mogli uzrokovati i neki drugi patogeni, štetnici ili abiotski čimbenici. U prilog
navedenom idu i rezultati istraživanja Delić i sur. (2013) provedenih na području Hercegovine
kada je utvrđena pojavnost fitoplazme BN 'Bois noir', tj. Stolbur ('Candidatus Phytoplasma
solani') u šest autohtonih kultivara (Blatina, Žilavka, Trnjak, Krkošija, Bena, Dobrogostina) i
12 alohtonih kultivara. Nadalje opaženi zastoj u kretanju vegetacije kao i stvaranje skraćenih
internodija u cik-cak obliku mogu uzrokovati akarinozne grinje (Ciglar, 1998; Maceljski,
1999; Masten Milek i Masten, 2009). Uočeni simptom zastoja u rastu može biti posljedica
prisutnosti uzročnika crne pjegavosti, mikrogljive Phomopsis viticola (Sacc.) Sacc., kada su
vidljivi problemi u rastu i razvoju mladice, a grozdovi ostaju manji. Također i simptomi
mikoze uzrokovane vrstom Eutypa lata (Pers.) Tul. I C.Tul mogu su zamijeniti s posljedicama
zaraze virusom lepezavosti lista, jer se ti simptomi na napadnutim trsovima često
manifestiraju na mladicama u vidu skraćivanja internodija, zbog čega trs poprima grmolik
izgled (Cvjetković 2010). Početni simptomi zaraze gljivom Pseudopeziza tracheiphila (Müll.-
Turgau) Kofr.& W. Y. Zhang, mogu se zamijeniti sa znakovima bolesti koju uzrokuju
pojedini virusi iz skupine uzročnika crvenila lišća.
Točno dijagnosticiranje bolesti vinove loze iziskuje puno znanja i stručnoga iskustva,
a većinu ih nije moguće odrediti bez primjene laboratorijskih analiza, što je svakako slučaj s
virozama i bakteriozama. Simptomi su u vinogradu rijetko jedinstveni za određenu bolest, čak
i u spektru mikoza i bakterioza, a slika bolesti može biti dodatno usložnjena na razlikama u
sortimentu te u slučajevima miješanih zaraza različitim patogenima. Ponekad zaražena loza ne
pokazuje nikakve simptome koji bi mogli upućivati na loš zdravstveni status, dok u nekim
slučajevima bolesti vinove loze pokazuju jasne simptome, pa ih je lakše uočiti na terenu.
Primjerice crveno lišće može biti znak bolesti virusne bolesti, gljivične bolesti korijena,
nedostatka hraniva, fizičkoga oštećenja ili oštećenja nastala hranidbom ličinki, odraslih
kukaca ili glodavaca. Slično i nekroza može biti simptom nedostatka vode, nekroze tkiva
nastala djelovanjem sumpora ili drugih šteta nastalih neadekvatnom primjenom sredstava za
zaštitu bilja.
Rasprava
91
Kod mnogih virusnih bolesti vinove loze dijagnostički simptomi javljaju se u
određeno godišnje doba. Uvijanje lišća, primjerice, simptom je crvenila lišća na crnim
kultivarima vidljiv u kasno ljeto i jesen. Pregledamo li te kultivare u proljeće nećemo naići na
tipične znakove bolesti. Zimi je, u vrijeme rezanja loze za razmnožavanje, vrijeme mirovanja
vinove loze i praktički je nemoguće uočiti simptome virusne bolest na terenu. Koncentracija
patogena koji uzrokuju bolest može biti niska, pa se ne razvijaju nikakvi simptomi (npr.
ELISA upitni uzorci) ili infekcija može biti na kultivaru koji je tolerantan na tu određenu
bolest. Takve latentne infekcije mogu se otkriti samo pouzdanim metodama testiranja, što je
važna okolnost kod prikupljanja reznica za razmnožavanje.
Nadalje, komercijalni serološki reagensi nisu na raspolaganju za sve viruse i
koncentracija virusa kod vinove loze opada ispod praga detekcije za uobičajene dijagnostičke
tehnike (ELISA ili biotestovi) posebice u predjelima s toplijim klimama (Digiaro i sur. 2007).
Stoga korištenje setova početnica za multipli detekciju virsusa koji pipadaju različitim
subgrupama, predastavlja koristan alat za pobljšanje osjetljvosti detekcije i smanjenju
troškova tih analiza (Digiaro i sur. 2007). To naglašava potrebu ovladavanjem točnim i
osjetjivim metodama detekcije kako bi se trsovi podvrgli strogim ispitivanjima (screen),
posebno kada će strogo kontrolirani sadni materijal biti distribuiran iz rasadnika
prozvođačima (Jooste i sur. 2015).
Priroda je simptoma varijabilna i često je rezultat djelovanja više činilaca, što sugerira
da postavljanje korektne dijagnoze samo na osnovu vizualnih inspekcija simptoma najčešće
nepouzdano i potpuno neprihvatljivo. Ta činjenica ističe potrebu za preciznim i osjetljivim
metodama detekcije, za analitičkim pregledom biljaka (screening), posebno sadnoga
materijala koji će biti distribuiran od rasadničara ka proizvođačima. Zdravstvena kvaliteta
sadnog materijala vinove loze ima najvažniji utjecaj na pojavnost i rasprostranjenje viroza u
vinogorjima.
Provedenim istraživanjem simptomatologije prirodnih virusnih zaraza i analizom
dobivenih podataka dobiven je uvid u raznolikost pojavnosti simptoma istraživanih virusa na
autohtonim kultivarima. Svi testirani trsovi (ELISA rezultati) kolekcijskog nasada Višići imali
su bar jedan od 22 istraživanjem utvrđena simptoma, s tim da su zdravi trsovi (virus-tested)
kultivara Trnjak bili bez simptoma. Međutim kod zdravoga (virus-tested) trsa kultivara Bena
zabilježena su dva simptom: straćenja internodija i zastoj u kretanju vegetacije. Uzroci te
pojave na tom trsu mogu biti posljedica prisutnosti akarinoznih grinja (Ciglar, 1998;
Maceljski, 1999; Masten Milek i Masten, 2009) ili crne pjegavosti (Cvjetković 2010). Jer se
Rasprava
92
složenost infekcija virusima, posebice virusnih varijanti GLRaV-3 (Jooste i sur. 2015) očituje
unatoč činjenici da su uzorkovani trsovi pokazivali simptome GLRaV-3, 20 % (uglavnom
bijeli kultivari) od prikupljenih uzoraka vinove loze nije bilo inficirano s GLRaV-3. To
implicira da kod određenih kultivara, koji ne pokazuju jasne/očite simptome, nije moguća
točna identifikacija virusnih zaraza zasnovana na vizualnim inspekcijama vinograda (Jooste i
sur. 2015).
Nadalje kod trsova svih kultivara zamijećena je pojava tipova simptoma koji se ne
mogu povezati s virusom koji je detektiran na tom istom trsu. Primjerice simptomi koji se
povezuju s prisutnosti Nepovirusa na trsovima koji imaju neki od LR virusa. Ta je pojava
najviše uočena kod kultivara Dobrogostina i Krkošija. Za pretpostaviti je da uzrok navedenih
promjena na tim trsovima neki drugi virus koji nije bio obuvaćen ovim istraživanjem.
Kod kultivara Krkošija i Blatina zamijećana je obrnuta situcaija da su kod trsova u
kojima je detektiran GFLV uočeni simptomi kao što je zastoj u kretanju vegetacije i zastoj u
rastu, što je karakteristika LR virusa. U tim se slučajevima pretpostavlja da su navedeni
simptomi posljedica prisutnosti grinja ili fitopatoloških mikoza.
Najviše različitih simptoma u ovoj studiji uočeno je kod trsova u kojima je detektiran
samo jedan virus i to GLRaV-3, a potom po brojnosti različitih simptoma slijede trsovi
inficirani kombinacijom virusa GLRaV-3GFLV. Najmanja raznolikost simptoma nađena je
na trsovima u kojima su pojedinačno detektirani ili virus GFkV ili ArMV.
Specifičnost je kultivara Blatine funkcionalno ženski cvijet4 što kao posljedicu ima
lošiju oplodnju. Vremenske prilike uvjetuju oplodnju Blatine, prije svega vlaga (potrebna je
barem blaga kiša u vrijeme oplodnje) i temperatura (povoljne temperature su između 20 i 30
°C). Blatina treba oprašivača, a dobar je oprašivač u nasadima kultivar Alicante Bouschet koji
je daleko bolji od kultivara Gamay Tentuinoir, dok je autohtoni kultivar Žilavka najbolji
oprašivač iz razloga što se njezina cvatnja i cvatnja Blatine vremenski podudaraju. Utvrđeno
je da kultivar Blatina cvjeta u hercegovačkom vinogorju između 20. svibnja i 15. lipnja tako
da se simptomi na grozdovima (kojima se očituju prisutne viroze) kod kultivara Blatina ne
mogu u potpunosti dovesti u vezu s virusima jer kultivar Blatina ima specifičnu oplodnju.
U radu Delić i sur. (2007), u dijelu koji se odnosi na simptomatologiju na istraživanim
kultivarima, simptom uvijenosti listova je posebice jasno bio izražen kod crnih kultivara
(Blatina). U istraživanju simptoma u ovom radu pojavljuju se neslaganja s rezultatima rada
4 U cvijetu Blatine su prisutni rudimentirani prašnici koji se ne otvaraju i ne pucaju im vrećice te se polen ne
oslobađa.
Rasprava
93
Delić i sur. (2007). U ovoj studiji na hercegovačkim kultivarima u kolekcijskom nasadu Višići
nisu zabilježeni jasni simptomi u vidu uvijanja rubova lisne plojke prema naličju (epinastija),
promjena koje su karakteristične za viruse iz kompleksa uvijenosti lista vinove loze iz
porodice Closteroviridae. Uočena je promjena boje listova u crvenu uz pojavu uskoga zelenog
pojasa duž osnovnih i srednjih vena na nižim listovima, za promjenu boje listova
neuobičajenom dijelu vegetacije, a svakako prije početka ljeta što je karakteristika simptoma
LR crnih kultivara (Martelli, 2010), ali bez epinastije karakteristične za viruse LR.
Takav je simptom jasno uočen samo kod bojadisera, npr. Game (Gamay Tentuinoir),
koji su prisutni u vinogradima kao prateći. Dimitrijević u radu iz 1973. godine ističe da je
poznato da zaraženi trsovi kultivara Game pokazuju veoma izražene simptome leafroll bolesti
na listu, koji se očituju kroz prijevremenu promjenu boje listova u crveno i uvijenosti lista
prema unutra. Premda razdoblje inkubacije bolesti LR može biti prilično dugačak, smatra se
da nije duži od tri godine (Goheen i sur., 1958; Stellmach, 1968). Moglo bi se pretpostaviti da
smo u kolekcijskom nasadu Višići imali vrlo izraženu toleranciju autohtonih kultivara na
razvoj toga simptoma, tako da su oni bili nositelji virusa bez tipičnih simptoma LR na listu.
Mala je vjerojatnost da su svi virotični trsovi u ispitivanom vinogradu kolekcije Višići, koji su
bili stari oko 6 godina u vrijeme vizualnih inspekcija, bili zdravi prije sadnje jer je čak 97,2 %
testiranih trsova u tom vinogradu u ovom istraživanju bilo virotično.
Uglavnom se smatra da je primarna virusna infekcija cijepova te da viroze općenito
dolaze necertificiranim sadnim materijalom koji se koristi za sadnju novih vinograda. Unutar
su vinograda zatim viroze sekundarno rasprostranjene, pri čemu sudjeluju vektori virusa,
ektoparazitske nematode i štitaste uši (mealybug) vektori (Saldarelli, i sur. 2012a). Prijenos
grupe virusa LR na terenu putem štitastih ušiju (porodice: Pseudococcidae – mealybugs
(rodovi: Heliococcus, Phenacoccus, Pseudococcus i Planococcus) i nadporodice: Coccidae –
soft scale (rodivi: Pulvinaria, Nepulvinaria, Parthenolecanium, Coccus, Parassaissetia,
Saissetia i Ceroplastes) ima veliku ulogu u rasprostranjivanju tih viroza u vinogradima. U
istraživanjima Ostojića i sur. (2010) navedeno je da su u hercegovačkim vinogradima prisutne
štitaste uši iz porodice Pseudococcidae: Planococcus ficus (Signerot 1875), te iz porodice
Coccidae: Partenolecanium corni (Bouche, 1844), Partenolecanium persicae (Fabricius),
Pulvinaria vitis (Linnaeus), Neopulvinaria innumerabilis (Rathvon, 1854). Od tih se vrsta
najčešće u vinogradima Hercegovine javlja: Planococcus ficus i Parthenolecanium corni
(Ostojić, 2014), pa se može pretpostaviti da te vrste doprinose rasprostranjenju viroza unutar
proizvodnoga područja.
Rasprava
94
Tri su različita tipa simptoma vidljiva na listovima vinove loze koja se mogu pripisati
prisutnosti GFLV: prosvjetljavanje žila, žuti mozaik i deformiranost lista (fanleaf). Od
navedenih simptoma u kolekcijskom nasadu Višići, najveću učestalost imao je žuti mozaik,
dok simptom deformiranosti lista nije zabilježen na promatranim trsovima autohtonih
kultivara. Čimbenici koji utječu na pojavu simptoma još su nepoznati. Martelli i Savino
(1990) u svojoj studiji sugerirali su da bi sljedeći čimbenici mogli biti važni: soj virusa,
genotip domaćina, pojava miješanih zaraza s različitim sojevima GFLV, utjecaj drugih virusa
i uvjeti okoliša.Ta studija nije uključivala istraživanje sojeva ni jednog od detektiranih virusa,
pa tako ni sojeve virusa GFLV, ali dobiveni rezultati zahtijevaju daljnja istraživanja i u smislu
istraživanja simptomatologije, naročito kod zaraze vinove loze isključivo jednim virusom.
Naime Liebenberg i sur. (2009) uočavaju pojačavanje simptoma na biljkama vinove loze koje
su zaražene različitima izolatima istoga virusa, što je dovelo do zaključka da mnogostruke
infekcije s različitim sojevima GFLV mogu bitno modificirati simptome zaraze pojedinim
virusom.
Već je istaknuto da jasan simptom fanleaf na listovima onih trsova u kojima je
detektiran GFLV u kolekcijskom nasadu Višići nije uočen, ali je isti simptom zamijećen u
drugim vinogradima u ovom istraživanju. Taj pripadnik roda Nepovirus iz porodice
Comoviridae prenosi se ektoparazitskom nematodom Xiphinema index, kao i vegetativnim
razmnožavnjem i cijepljenjem vinove loze. Osim simptoma na listu GFLV uzrokuje
degeneracije i malformacije bobica, listova i mladica/rozgve. Taj je virus odgovoran za
značajne ekonomske gubitke jer smanjuje urod vinograda za skoro 80 %, skraćuje
dugovječnost vinograda i utječe na kvalitetu grožđa (Andret-Link i sur.; 2004; Martelli i
Savino, 1990.; Raski i sur., 1983). Simptomi uočeni na autohtonim kultivarima u
kolekcijskom nasadu Višići koji bi se mogli pripisati GFVL skraćeni su internodiji. U tom
slučaju za pretpostaviti je da se radi o zarazi nekom od fitoplazmi vinove loze (BN ili
'Candidatus Phytoplasma asteris') koje mogu uzrokovati vrlo slične simptome. U prilog
navedenome idu i rezultati istraživanja Delić i sur. (2011) provedenih u vinogradima na
području zapadne Hercegovine u kojima je utvrđena pojava fitoplazme 'Bois noir'.
Nakon istraživanja 27 odabranih uzoraka koji su bili ELISA pozitivni na neki od
virusa iz grupe GLRaV-4-9, metodom RT-PCR utvrđena je prisutnost GLRaV-5 kod šest
uzoraka i GLRaV-9 kod sedam uzoraka. Ostali virusi iz grupe GLRaV-4-9 nisu registrirani.
Razlozi takvih odstupanja mogu se tražiti u činjenici da su korišteni specifični prajmeri koji
detektiraju odredjene sojeve virusa, pa je dovoljno i malo odstupanje uslijed genetske
Rasprava
95
varijabilnosti ili mutacije u sekvenciji virusnoga genoma, pa da korištene početnice ne
reagiraju na istraživani virus dijagnosticiran prethodno ELISA metodama. U budućnosti će se
RT-PCR metoda obaviti s početnicama iz drugih područja virusnoga genoma, za uzorke u
kojima nije potvrđena prisutnost nekoga od GLRaV-4-9, prilikom čega će se završiti i njihovo
sekvenciranje i filogenetska usporedba s izolatima susjednih zemalja (RH i Italija).
Trenutačno važeći propisi na području Bosne i Hercegovine teže usklađivanju s
propisima Europske unije, i kao takvi trebali bi omogućavati proizvodnju dovoljnih količina
sadnoga materijala vinove loze visoke kakvoće te razvoj i napredak rasadničarstva u Bosni i
Hercegovini. Stoga Bosna i Hercegovina u skoroj budućnosti treba pokrenuti aktivnosti
vezane za uspostavu mreže za cerifikaciju vinove loze. Glavni je cilj uspostave mreže za
certifikaciju kontrolirana proizvodnja loznoga sadnog materijala, putem podizanja matičnih
nasada i proizvodnje reznica cjepova autohtonih kultivara temeljen na lokalnim
certifikacijskim shemama. Slobodan protok robe između europskih zemalja i težnja za
ujednačavanjem standarda temeljni su razlozi propisivanja jedinstvene certifikacijske sheme
za proizvodnju sadnoga materijala na razini Europske unije. Za regionalne certifikacijske
standarde (II klasa) preporuka je testiranje prilagoditi lokalnim uvjetima ovisno o stupnju
endemskih infekcija, vinogradarskim uvjetima te potrebama vezanima uz očuvanje autohtone
germplazme (Vončina, 2014.). Stoga bi u Bosni i Hercegovini trebalo provesti postojeće
smjernice certificirana sadnog materijala kako bi se omogućila učinkovita kontrola i
sprječavanje rasprostranjenja gospodarski važnih, ali i administrativno reguliranih
(„karantenskih“) biljnih parazita, u prvom redu virusa i fitoplazmi.
Međutim vinograde i dalje podižu lokalni proizvođači, a za proizvodnju sadnica
koriste se materijali iz starih nasada i može se pretpostaviti da je, ovisno o odabiru materijala
za proizvodnju cijepova, prisutna nedovoljna kontrola na viruse. Postojanje je pravih matičnih
nasada pod kontrolom ovlaštenih institucija elementarna u certifikacijiskim programima.
Ovaj rad može biti dobar uvod u sanitarnoj i klonskoj selekciji koja je ovim
istraživanjem već započela, s obzirom na to da se pri uzorkovanju inzistiralo na prikupljanju
asimptomatičnih uzoraka za testiranje na viruse, a koja bi rezultirala pokretanjem procesa
certifikacije i proizvodnje virus-tested sadnoga materijala vinove loze autohtonih kultivara
Bosne i Hercegovine.
Ovaj rad predstavlja važan doprinos poznavanju sanitarnoga statusa vinove loze u
Hercegovini jer dosadašnja oskudna istraživanja nisu pružala tu mogućnost. Rezultat je ovoga
rada nepristran sanitarni status autohtonih kultivara Herecegovine, koji sugerira provedbu
Rasprava
96
nacionalnoga programa certifikacije radi poboljšanja lokalne rasadničarske proizvodnje i
zdravstvenoga stanja vinograda na tom području. Dobivanje matičnih biljaka slobodnih od
virusa, može se ostvariti nekom od metoda sanitacije kao što su: primjena konvencionalne ili
modificirane termoterapije (eng. Theromotherapy), mikrocijepljenjem ili primjenom metode
kulture apikalnoga meristema u uvjetima in vitro, somatičnom embriogenezom (eng. Somatic
embryogenesis), zamrzavanjem (eng. Cryopreservaton), kemoterapijom (eng. Chemotherapy)
i elektroterapijom (eng. Electrotherapy) (Martelli 2014; Maliogka, i sur., 2015).
U nastavku istraživanja bilo bi uputno posvetiti veću pozornost promatranju trsova s
jednostrukom zarazom kako bi se mogao proučiti utjecaj virusne zaraze na količinu i kvalitetu
uroda i proizvoda od grožđa. Kako bi to bilo moguće u potpunosti provesti, potrebno je
zasnovati matičnjak autohtonih kultivara virus free materijala čime bi se omogućila relevantna
usporedba tipičnih simptoma. Također bi bilo uputno istražiti trsove s jednostrukim zarazama
sa stajališta zelene mase odnosno količine lista, što opet utječe na kvalitetu i količinu uroda
odnosno ishranjenosti trsa. Isto tako bi bilo uputno istražiti dugovječnost jednostrukih
zaraženih trsova s trsovima slobodnim od istraživanih virusa.
Kako je postupak certifikacije sadnoga materijala složena, ali i zakonom definirana
obveza, trsovi koji su u ovoj studiji bili virus-tested mogu biti predloženi kao materijal za
podizanje matičnih nasada autohtonih kultivara.
Sve do sada provedene mjere idu u smjeru popularizacije autohtonoga sadnog
materijala, kako bi se spriječila erozije autohtone germoplazme hercegovačkih vinogorja čime
bi se očuvali genski resursi vinove loze.
Zaključci
97
6. ZAKLJUČCI
1. Pojavnost 9 virusa (ArMV, GFLV, GFkV, GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3, GLRaV-
4-9, GVA i GVB) na 6 autohtonih hercegovačkih kultivara u 20 vinograda smještenih
u 2 hercegovačka vinogorja ukazuju na prisutnost svih navedenih virusa osim virusa:
GVA i GVB. Analiza rezultata seroloških analiza na 1.332 uzoraka pokazuje visoku
učestalost zaraženih trsova 86,56 % i relativno visok broj pojedinačnih 40,99 % u
usporedbi s višestrukim virusnim infekcijama. Virus s najvećim postotkom pojavnosti
bio je virus GLRaV-3 iz roda Ampelovirus, a slijedi ga virus GFLV iz roda
Nepovirusi, potom LR uzročnici iz roda Ampelovirus i to GLRaV-1 češće od GLRaV-
4-9. Virus GLRaV-4-9 je na petom mjestu pojavnosti, odmah iza GFkV iz roda
Maculavirus. Nasuprot tomu ArMV, još jedan član roda Nepovirus imao je manju
učestalost, a GLRaV-2 član roda Closterovirus bio je rijedak, dok GVA i GVB iz roda
Vitivirus nisu nađeni. Utvrđeno je vrlo loše zdravstveno stanje 6 autohtonih kultivara.
Najlošiji sanitarni status kod istraživanih šest autohtonih kultivara utvrđen je kod
kultivara Krkošija sa stopom infekcije 100 %. Slična situacija bila je kod dvaju
kultivara sa stopom infekcije preko 90 %, i to kod kultivara Dobrogostina (94,01%) i
Bena (93,37 %). Jednako loš sanitarni status imaju kultivari Žilavka i Blatina, koji
imaju gotovo samo 13 % zdravih trsova (virus-tested). Dok je uvjetno prihvatljiv
sanitarni status utvrđen kod kultivara Trnjak koji je imao skoro 30 % trsova čistih od
svih ispitivanih virusa.
2. Za detektirane viruse koji još nisu bili potvrđeni na području Bosne i Hercegovine
(GLRaV-2 i grupa virusa GLRaV-4-9) RT-PCR analiza uz primjenu specifičnih pari
početnica je potvrdila prisutnost: GLRaV-2 (GLR2CP1/GLR2CP2) kao i GLRaV-5
(LR5/ LR5) i GLRaV-9 (LR9-F V/LR9-R C), dok ista metoda nije potvrdila
prisutnost: GLRaV-4 (LR4 HSP C/LR4 HSP V), GLRaV-6 (EST-1/EST-2) i GLRaV-
7 (LR7 G23met L/LR7 G23) u uzorcima podvrgnutim testiranju.
3. Tijekom terenskih istraživanja promatrani su simptomi najvažnijih virusnih bolesti
na autohtonim kultivarima vinove loze u hercegovačkom vinogorju. U skladu s
rezultatima ovog istraživanja na vodećem mjestu po svojoj pojavnosti na autohtonim
hercegovačkim kultivarima su: zastoj u rastu, zastoj u kretanju vegetacije, skraćeni
internodiji, sveopća neujednačenost trsa (kao posljedica slabijega razvoja mladica),
Zaključci
98
grozdovi smanjeni veličinom i brojni, neujednačeno odrvenjavanje, cik-cak rast,
grozdovi neujednačeno dozrijevaju i klorotična diskoloracija.
4. Identificirano je 179 trsova (virus-tested), mogućih kandidata pogodnih za sanitarnu
selekciju i slijedom toga certifikaciju prema EU protokolima. Ta studija donosi važan
doprinos poznavanja sanitarnoga statusa vinove loze Bosne i Hercegovine, za koju
postoje oskudne informacije. Najveći broj trsova virus-tested utvrđen je kod kultivara
Trnjak (84), potom slijedi Blatina (45) i Žilavka (32); Bena (11) i Dobrogostina (7).
Kultivar Krkošija nije imao nijedan trs slobodan od istraživanih virusa.
5. S obzirom na vrlo visok intenzitet pojave virusnih zaraza u 6 autohtonih kultivara, za
poboljšanje sanitarnoga statusa hercegovačkih vinograda bilo bi potrebno provesti
sanitarni program i program certifikacije, s naglaskom na sprječavanje
rasprostranjenja viroza. U tu svrhu neophodno je koristiti validne tehnike (serološke,
molekularne i biološke) i oformiti dijagnostičke kapacitete za detekciju patogena u
biljnom materijalu. Kako bi se spriječila erozija autohtone germplazme svih regija
Mediterana potrebno je razvijati programe za očuvanje genetskih resursa vinove loze.
Kako bi se poboljšala kvaliteta i kvantiteta uroda vinove loze, zemlje Mediteranske
regije trebaju provoditi procese sanitacije svojih kultivara koristeći individualnu
klonsku selekciju. Pristupanjem procesima zdravstvene selekcije, koje za krajnji cilj
imaju podizanje matičnih nasada, prije svega autohtonih kultivara i njihovih
najvažnijih podloga, osigurala bi se proizvodnja zdravoga sadnog materijala
slobodnog od ekonomski važnijih virusa.
Popis literature
99
7. POPIS LITERATURE
° Abou Ghanem-Sabanadzovic, N., Sabanadzovic, S., Gugerli, P., Rowhani, A. (2012).
Genome organization, serology and phylogeny of Grapevine leafroll-associated viruses 4 and
6: Taxonomic implications. Virus Research 163: 120–128.
° Abou Ghanem-Sabanadzovic, N., Sabanadzovic, S., Castellano, M. A., Boscia, D., Martelli,
G. P. (2000). Properties of a new isolate of Grapevine leafroll-associated virus 2, Vitis 39:
119–121.
° Akbas, B., Kunter, B., Ilhan, D. (2007). Occurrence and distribution of Grapevine leafroll-
associated viruses 1, 2, 3, i 7 in Turey, Journal of Phytopathology, 155: 122–124.
° Al Rawhanih, M., Dave, A., Anderson, M.i sur. (2013). Association of a DNA virus with
grapevines affected by Red blotch disease in California, Phytopathology 103: 1069-1076.
° Al Rwahnih, M., Dolja, V., Daubert, S., Koonin, E., Rowhani, A. (2012). Genomic and
biological analysis of Grapevine leafroll-associated virus 7 reveals a possible new genus
within the family Closteroviridae, Virus Research 163: 302–309.
° Alkowni, R., Zhang, Y.-P., Rowhani, A., Uyemoto, J. K., Minafra, A. (2011). Biological,
molecular, and serological studies of a novel strain of Grapevine leafroll-associated virus 2,
Virus Genes 43:102–110.
° Alkowni, R., Rowhani, A., Daubert, S., Golino, D. (2004). Partial characterization of a new
ampelovirus associated with Grapevine leafroll disease, Journal of Plant Pathology 86 (2):
123–133.
° Alkowni, R., Rowhani, A. (2003). Molecular characterization of Grapevine leafroll-
associated virus 9, a new Closterovirus associated with Grapevine leafroll disease complex.
V: 14th Meeting of the International Council for the Study of Viruses and Virus-like Diseases
of Grapevine (ICVG), 12-17 September 2003, Locorotondo, Italy: Extended abstracts. Bari,
University of Bari: 33–33.
° Andret-Link, P., Laporte, C., Valat, L., Ritzenthaler, C., Demangeat, G., Vigne, E., Laval,
V., Pfeiffer, P., Stussi-Garaud, C., Fuchs, M. (2004). Invited review: Grapevine fanleaf virus:
still a major threat to the grapevine industry, Journal of Plant Pathology 86: 183–195.
Popis literature
100
° Atallah, S.S., Gomez, M.I., Fuchs, M.F., Martinson, T.E. (2012). Economic Impact of
Grapevine Leafroll Disease on Vitis vinifera cv Cabernet Franc in Finger Lakes Vineyards of
New York, American Journal of Enology and Viticulture 63(1): 73–79.
° Avramov, L., Cindrić, P., Kovač, V., (1987). Značaj oplemenjivanja vinove loze za
unapređenje vinogradarstva. Rezime rada s I jugoslovenskog simpozija o klonskoj selekciji i
međuvrsnoj hibridizaciji vinove loze, 18-20. Mart, Vrnjačka Banja, 6–12.
° Belli, G., Fortusini, A., Casati, P., Belli, L., Bianco, P. A., Prati, S. (1994). Transmission of
a grapevine leafroll associated closterovirus by the scale insect Pulvinaria vitis L., Riv. Patol.
Veg. 4: 105–108.
° Beljo, J., Mandić, A., Jovanović- Cvetković, T., Dodig, R., Gašpar, M., Ivanković, M.,
Jakirović, ef. J., Lasić, V., Leko, M., Nikić, A., Prusina, T., Sivrić, M. (2014). Atlas
vinogradarstva i vinarstva Bosne i Hercegovine FRAM ZIRAL, Mostar.
° Besse, S., Bitterlin W., Gugerli P. (2009). Development o fan ELISA for the simultaneous
detection og Grapevine leafroll-associated virus 4, 5, 6, 7 and 9, Extended abstracts 16th
Meeting ICVG: 296–298.
° Bercks, R., Stellmach G. (1966). Nachweis verschiedener Viren in reisigkranken Reben,
Phytopathologische Zeitschrift 56: 288–296.
° Bonavia, M., Digiaro, M., Boscia, D., Boari, A., Bottalico, G., Savino, V., Martelli, G. P.
(1996). Studies on „corky rugose wood“ of grapevine and on diagnosis of Grapevine virus B,
Vitis 35: 53–58.
° Boscia, D., Masannat, K.M., Abu-Zurayk, A.R., Martelli, G.P. (1995). Rugose wood of the
grapevine in Jordan, Phytopathologia Mediterranea 34 (2): 126–128.
° Boscia, D., Greit, C., Gugerli, P., Martelli, G.P., Walter, B., Gousalves, D. (1995a).
Nomenclature of Grapevine leafroll – associated putative Closteroviruses, Vitis 34 (3): 171–
175.
° Boscia, D., Elicio, V., Savino, V.,Martelli, G.P. (1995b). Producton of monoclonal
antibodies to grapevine fleck virus, Plant pathology 144: 160–163.
Popis literature
101
° Boscia, D., Savino, V., Minafra, A., Namba, S., Elicio, V., Castellano, M. A., Gonsalves,
D.,Martelli, G. P. (1993). Properties of filamentous virus isolated from grapevine saffected by
corky bark, Archives of Virology 130: 109–120.
° Boscia, D., Aslouj, E., Elicio, V., Savino, V., Castellano, M.A., Martelli, G.P. (1992).
Production, characterization and use of monoclonal antibodies to Grapevine virus A, Archives
of Virology, 127 (1-4): 185–194.
° Boscia, D., Martelli, G.P., Savion, V., Castellano, M.A. (1991). Identification of the agent of
Grapevine flack disease, Vitis 30: 97–105.
° Bouyahia, H., Materazzi, A., Triolo, E. (2006). Grapevine Vein Necrosis: Further Data on
Etiology and Diagnosis. Environment Identities and Mediterranean Area, 2006. ISEIMA '06.
First international Symposium on: 629–631.
° Bovey, R., Martelli, G.P. (1986). The viroses and virus-like diseases of the grapevine. A
bibliographic report, 1979-1984, Vitis 25: 227–275.
° Bovey, R., Gartel, W., Hewitt, W.B., Martelli, G.P., Vuittenez, A. (1980). Virus and virus-
like diseases of grapevines. Colour atlas of symptoms. Maladies a virus et affections
similaires de la vigne. Atlas en couleurs des symptomes. Editions Payot. Lausanne
Switzerland: 183.
° Bulić, S. (1949). Dalmatinska ampelografija. Poljoprivredni nakladni zavod, Zagreb
° Buturović, D., Klindić, O. (1977). Prilog proučavanju viroza i štetnih nematode u
vinogradima Hercegovine. Savjetovanje o eskoriozi i virusnim bolestima vinove loze,
Istraživačko – razvojni centar HEPOK, Mostar: 177–180.
° Cabaleiro, C., Segura, A. (2006). Temporal analysis of Grapevine leafroll-associated virus 3
epidemics, European Journal of Plant Pathology 114: 441–446.
° Cabaleiro, C., Segura, A. (1997). Some characteristics of the transmission of Grapevine
leafroll associated virus 3 by Planococcus citri Risso, European Journal of Plant Pathology,
103(4):373–378.
° Castellano, M.A., Abou-Ghanmen, N., Choueiri, E., Martelli, G.P. (2000). Ultrastructure of
Grapevine leafroll-associated virus 2 and 7 infections, Journal of Plant Pathology 82:9–15.
Popis literature
102
° Carstens, E. B. (2010). Ratification vote on taxonomic proposals to the International
Committee on Taxonomy of Viruses (2009). Virology Division News. Arch Virol 155:133–
146.
° Choueiri, E., Boscia, D., Digiaro, M., Castellano, M.A., Martelli, G.P. (1996). Some
properties of a hitherto undescribed filamentous virus of the grapevine, Vitis 35: 91–93.
° Choueiri, E., Abou-Ghanem, N., Boscia, D. (1997). Grapevine virus A and Grapevine virus
D are serologically distantly related, Vitis, 36 (1):39–41.
° Ciglar, I. (1998). Integrirana zaštita voćaka i vinograda, Zrinski, Čakovec
° Clark, M. F., Adams, A.N. (1977). Characteristics of the microplate method of enzyme-
liked immuno sorbent assay for the detection of plant viruses, Journal of General Virology 34:
475–483.
° Conti, M., Milne, R.G., Luisoni, E., Boccardo, G. (1980). A Closterovirus from stem-pitting
– diseased grapevine, Phytopathology 70: 394–399.
° Copeland, R. (1998). Assaying levels of plant virus by ELISA. In: Plant Virology Protocols:
From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Foster G.D., Taylor S.C. eds.). Humana Press
Inc, Totowa.
° Cornell University http://www.cornell.edu; Photo by Marc Fuchs. Pristupljeno 4.2.2015.
° Credi R., Giunchedi L. (1996). Grapevine leafroll-associated viruses and Grapevine virus A
in selected Vitis vinifera cultivars in northern Italy, Plant Pathology 45: 1110–1116.
° Cvjetković, B. (2010). Mikoze i pseudomikoze voćaka i vinove loze, Zrinski d.d., Čakovec
° Delić D., Đurić Z., Jović J., Lolić B., Toševski I., Karačić A. (2013). “Bois noir”
phytoplasma and Auchenorryncha species in Bosnia and Herzegovina vineyards. II
International symposium and XVIII scientific conference of agronomists of republic of srpska
– Drugi međunarodni simpozijum i 18-to naučno-stručno savjetovanje agronoma Republike
Srpske.
° Delić D., Lolić B., Karačić A. (2011). Screening for phytoplasma presence in West
Herzegovina vineyards. Indian Journals, Phytopathogenic Mollicutes 1(2): 87–90.
Popis literature
103
° Delić D., Jovanović-Cvetković T., Đurić G. (2007). Prisustvo i rasprostranjenost Grapevine
Leafroll-associated Virus – 1 i 3 u Bosni i Hercegovini, Pestic. Fitomed. (Beograd) 22: 45–
50.
° Descriptions of Plant Viruses (DPV)
http://ww.dpvweb.net/dpv/showfig.php?dpvno=383&figno=06) i &figno=11) Pristupljeno:
4.2.2015.
° Digiaro, M., Elbeaino, T., Martelli, G.P. (2007). Development of degenerate and species-
specific primers for the differential and simultaneous RT-PCR detection of grapevine-
infecting nepoviruses of subgroups A, B and C, Journal of Virological Methods 141(1): 34–
40.
° Digiaro, M., Abou Ghanem-Sabanadzovic, N., Cigsar, I., Gokalp, K., De Stradis, A.,
Boscia, D., Martelli, G.P. (2003). Two hitherto undescribed Nepoviruses from Turkish
grapevines, In: Extended Abstracts 14th ICVG Meeting, Locorotondo, Italy: 14–15.
° Digiaro M., Martelli G. P., Savino V. (2000). Phloem-limited viruses of the grapevine in the
Mediterranean and Near East. Proceedings 13th
Meeting of ICVG, Adelaide: 75–76.
° Digiaro M., Martelli G. P., Savino V. (1999). Phloem-limited viruses of the grapevine in
the Mediterranean and Near East: a synopsis. Options Mediterraneennes, (B/n 29):
83–92.
° Digiaro, M., Boscia, D., Simeone, V., Savino, V. (1998). Gravi casi di accartocciamento
fogliare su cultivar ad uva da tavola di recente introduzione in Puglia, Informatore
Fitopatologico 48(1-2):76–79.
° Digiaro, M., Boscia, D., Simeone, V., Savino, V. (1997). Detrimental effects of filamentous
viruses to table grape varieties newly introduced in Southern Italy. Extended Abstracts 12th
Meeting ICVG, Lisbon, Portugal: 169–170.
° Dimitrijević, B. (1973). Some observation on natural spread of Grapevine leafroll disease in
Yugoslavia, Rivista di Patologia Vegetale (IV): 9.
° Dovas, C.I., Katis, N.I. (2003). A spot nested RT-PCR method for the simultaneous
detection of members of the Vitivirus and Foveavirus genera in grapevine, J. Virol. Meth.
107: 99–106.
° Engelbrecht, D. J., Kasdorf, G. G. F. (1990). Field spread of corky bark, fleck, leafroll and
Shiraz decline diseases and associated viruses in South African grapevines,
Popis literature
104
Phytophylactica 22: 347–354.
° EPPO/OEPP (2008). Pathogen-tested materila of grapevine varieties and rootstocks.
Certification scheme PM 4/8 (2), Schemes for the production of healthy plants for planting
Bulleting OEPP/EPPO Bulletin 38: 422–429.
° European Union Law – http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=O
J:L:2005:164:0037:01:EN:HTML; Pristupljeno 2.2.2015.
° Fabre, E., (1853). Observations sur les maladies regnantes de la vigne, Bull. Soc. Centrale
Agr. Hérault. 40: 11–75.
° Faggioli, F., Anaclerio, F., Angelini, E., Antonelli, M.G., Bertazzon, N., Bianchi, G.,
Bianchedi, P., Bianco, P.A., Botti, S. , Bragagna, P., Cardoni, M., Casati, P., Credi R., E. De
Luca, Durante, G., Gianinazzi, C., Gambino, G., Gualandri, V., Luison, D., Luvisi, A.,
Malossini, U., Mannini, F., Saldarelli, P., Terlizzi, F., Triolo, E., Trisciuzzi, N., Barba, M.
(2012). Validation of Diagnostic Protocols for the Detection of Grapevine Viruses Covered by
Phytosanitary Rules, Proceedings of the 17th Congress of ICVG, Davis, California, USA:
260–261.
° Faggioli, F., Pasquini, G., Riccioni, L., Barba, M., (1991). Further characterization and
serology of grape leafroll associated virus III isolated from grape in Italy, Proceedings 10th
Meeting of ICVG, Volos 1990: 473–476.
° Faoro, F. (1997). Cytopathology of closteroviruses and trichoviruses infecting grapevines.
In: Monette PL, ed. Filamentous Viruses of Woody Plants. Research Signpost, Trivandrum :
29–47.
° Faoro, F., Carzaniga, R. (1995). Cytochemistry and immunocytochemistry of the inclusion
bodies induced by grapevine leafroll-associated closteroviruses GLRaV-1 and GLRaV-3,
Rivista di Patologia Vegetale 5(3): 85–94.
° Faoro, F, Tornaghi, R, Belli, G. (1991). Localization of closteroviruses on grapevine thin
sections and their identification by immunogold labelling. Journal of Phytopathology, 133(4):
297–306
° Fazeli, C.F., Rezaian, M.A. (2000). Nucleotide sequence and organization of ten open
reading frames in the genome of Grapevine leafroll-associated virus 1 and identification of
three subgenomic RNAs, Journal of General Virology 81(3): 605–615.
Popis literature
105
° Festić, H., Šutić, D. (1977). Pojava nekih viroza na vinovoj lozi u Hercegovini. Savjetovanje
o eskoriozi i virusnim bolestima vinove loze, Istraživačko – razvojni centar HEPOK, Mostar:
125–130.
° Fortusini, A., Scattini, G., Prati, S., Cinquanta, S., Belli, G. (1997). Transmission of
Grapevine leafroll-associated virus 1 (GLRaV-1) and Grapevine virus A (GVA) by scale
insects. Extended abstracts 1ih Meeting pf ICGV, Lisbon:121–122.
° Fortusini, A., Scattini, G., Cinquanta, S., Prati, S. (1996). Diffusione naturale del virus
1(GLRaV-1) e del virus 3 (GLRaV-3) dell'accartocciamento fogliare e del virus
dellamaculatura infettiva o „fleck“ (GFkV) della vite, Informatore Fitopatologico 46: 39–43.
° Fauquet, C.M., Mayo, M.A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L.A. (2005). Virus
taxonomy. Classification and nomenclature of viruses. Eight report of the International
Comittee on the taxonomy of Viruses. Amsterdam, Elsevier Academic Press: 1259.
° Garau, R., Fiori, P.P., Prota, V., Tolu, G., Fiori, M., Prota, U. (1997). Effect of virus
infection on own-rooted clones of different wine grape cultivars from Sardinia. Extended
Abstracts of the 12th Meeting of ICVG, Lisbon, Portugal: 171–172.
° Garau R., Prota V. A., Piredda R., Boscia D., Prota U. (1994). On the possible relationship
between Kober stem grooving and Grapevine virus A, Vitis 33: 161–163.
° Giampetruzzi, A., Roumi, V., Roberto, R., Malossini, U., Yoshikawa, N., La Notte, P.,
Terlizzi, F., Credi, R., Saldarelli, P. (2012). A new grapevine virus discovered by deep
sequencing of virus- and viroid-derived small RNAs in cv Pinot gris., Virus Research 163:
262–268. [http://dx.doi.org/10.1016/j.virusres.2011.10.010]
° Giovanna, L., Davide, L., Saverio, B. G., Giuliana, A., Francesco, F. (2015). Grapevine
Viruses' Detection and Sanitary Selection in Grapevine Germplasm of Calabria (Southern
Italy), Journal of Phytopathology 163( 7-8): 690–693.
° Goheen, A.C., Harmon, F.N., Weinberger, J.H. (1958). Leaff (White Emperor disaeae) of
grapes in California, Phytopathology 48, 51–54.
° Golino, D.A., Sim, S., Rowhani, A. (2000). Identification of the latent viruses associated
with young vine decline in California. Extended Abstracts 13th Meeting of ICVG, Adelaide:
85–86.
Popis literature
106
° Golino, D. A., Sim, S. T., Rowhani, A. (1995). Transmission studies of grapevine leafroll
associated virus and grapevine corky bark associated virus by the obscure mealybug,
American Journal of Enology and Viticulture 46: 408.
° Goszczynski, D. E., Du Preez, J., Burger, J. T. (2009). Molecular divergence of grapevine
virus A (GVA) variants associated with Shiraz disease in South Africa, Virus Research 138:
105–110.
° Goszczynski, D. E. (2007). Single-strand conformation polymorphism (SSCP), cloning and
sequencing reveal a close association between related molecular variants of grapevine virus A
(GVA) and Shiraz disease in South Africa, Plant Pathology 56: 755–762.
° Goszczynski, D.E., Jooste, A.E.C. (2003). Identification of grapevine infected with
divergent variants of Grapevine virus A using variant-specific RT-PCR. Extended Abstracts
of the 14th Meeting of ICVG, Locorotondo, Italy: 131–132.
° Goszczynski, D.E., Kasdorf, G.F., Pietersen, G. (1996). Western blot reveal that grapevine
virus A and grapevine virus B are serologically related, Journal of Phytopathology 144: 581–
583.
° Greif C., Garau R., Boscia D., Prota V.A., Fiori M., Bass P., Walter B., Prota U. (1995). The
relationship of grapevine leafroll-associated virus 2 with a graft incompatibility condition of
grapevines, Phytopathologia Mediterranea 34: 167–173.
° Gugerli, P., Ramel, M.E. (1993). Grapevine leafroll associated virus II analyzed by
monoclonal antibodies, Extended abstracts 11th Meeting ICVG: 23–24.
° Gugerli, P., Rosciglione, B., Brugger, J.J., Bonnard, S., Ramel, M.E., Tremea, F. (1991).
Further characterization of grapevine leafroll disease, Proceedings 10th Meeting of ICVG,
Volos 1990, 59–60.
° Gugerli, P. (1986). In H.U. Bergmeyer: Methods of Enz. Analysis XI: 474–481.
° Gugerli, P., Brugger, J.J., Bovey, R. (1984). L’enroulement de la vigne: mise en évidence de
particules virales et développement d’une méthode immunoenzymatique pour le diagnostic
rapide. Revue Suisse de Viticulture, Arboriculture et Horticulture 16: 299–304.
° Garau, R., Prota, V.A., Piredda, R., Boscia, D., Prota, U. (1994). On the possibile
relationship between kober stem grooving and grapevine virus A, Vitis 33: 161–163.
Popis literature
107
° Harrison, B. D., Winslow, D. (1961). Laboratory and field studies on the relation of arabis
mosaic virus to its nematode vector Xiphinema diversicaudatum (Micoletzky). Annals of Applied
Biology 49(4): 621–633.
° Horvath, J., Tobias, I., Hunyadi, K. (1994). New natural herbaceous hosts of grapevine
fanleaf nepovirus, Horticultural Science 26: 31–32
° Hewitt, W. B. (1970). Virus and virus-like diseases of the grapevine. In: Virus diseases of
small fruits and grapevines (Frazier N.W. ed.). University of California, Davis, Div. Agr. Sci.:
195–196.
° Hu, J.S., Gonsalves, D., Teliz, D. (1990). Characterization of Closterovirus- like particles
associated with Grapevine leafroll disease, J. Phytopathology 128: 1–14.
° Ioannou, N., Hadjinicolis, A., Hadjinicoli, A. (1997). Epidemiology of the grapevine
leafroll-mealybug complex in Cyprus. Extended Abstracts 12th Meeting of ICVG, Lisbon:
123-124.
° Izadpanah, K., Zaki-Aghl, M., Zhang, Y. P., Daubert, S. D., Rowhani, A. (2003). Bermuda
grass as a potential reservoir host for Grapevine fanleaf virusm, Plant Disease 87: 1178–1182.
° ICTV. 2009. Virus Taxonomx: 2009 Release. International Committee on Taxonomy of
Viruses http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2009;
° International Council for the Study of Virus and Virus-like Diseases of the Grapevine ICVG
http://web.pppmb.cals.cornell.edu/fuchs/icvg/archive.htm; icvg 2012 proceedings.pdf
° James, D., Varga, A., Pallas, V., Candresse, T. (2006). Strategies for simultaneous detection
of multiple plant viruses, Can. J. Plant Pathol. 28: 16–29.
° Johnson, R. C. (2003). Grapevine certification and the importation of grapevines into the
member countries of the North American Plant Protection Organization (NAPPO).
Proceedings of the 14th ICVG Conference, Locorotondo.
° Jooste, A.E.C, Molenaar, N., Maree, H.J., Baster, R., Morey, L., De Koker, W.C., Burger,
J.T. (2015). Identificatin and distribution of multiple virus infections in Grapevine leafroll
diseased vineyards, Eur.J.Plant Pathol. 142: 363–375.
° Karoglan Kontić, J., Pejić, I., Maletić, E., Sladonja, B., Poljuha, D., Vokurka, A., Zdunić,
G.,Preiner, D., Šimon, S., Ruehl, E. (2009a). Virus Diseases Screening in Clonal Selectionof
Popis literature
108
Croatian Grapevine Cultivars, 9th International Conference on Grape Genetics and Breeding,
Udine, Italy, Acta Horticulturae 827: 623–626.
° Karoglan Kontić, J., Preiner, D., Šimon, S., Zdunić, G., Poljuha, D., Maletić, E. (2009b).
Sanitary status of Croatian native grapevine varieties, Agriculturae Conspectus Scientificus
74: 99–103.
° Karoglan Kontić, J., Pejić, I., Maletić, E., Sladonja, B., Poljuha, D., Vokurka, A., Zdunić,
G., Preiner, D., Šimon, S., Ruehl, E. (2008). Virus diseases screening in clonal selection of
Croatian grapevine cultivars, Acta Horticulturae. 827: 623–626.
° Kominek P., Holleinova V. (2003). Evaluation of sanitary status of grapevines in the Czech
Republic, Plant Soil Environ. 49 (2): 63–66.
° Krake, L.R. (1993). Characterization of grapevine leafroll disease by symptomatology,
Australian i New Zealand Wine Industry Journal 8(1): 40–44.
° Krüger K., Douglas N. (2013). Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3)
transmission by three soft scale insect species (Hemiptera: Coccidae) with notes on their
biology, Afr. Entomol. 21: 1–8.
° Kurstak, E. (1981). Handbook of plant virus infections comparative diagnosis. Amsterdam,
New York, Oxford, Elsevier: 943.
° Lasić, V., Karačić, A., Mandić, A. (2015). Ampelografski profil sorte Blatina (Vitis vinifera
L.), Zbornik radova; Međunarodni znanstveni simpozij BLIDINJE 2015., FRAM Ziral,
Mostar 541–559
° Lasić, V. (2014). Sadašnje stanje vinogradarstva u Federaciji, BiH; Atlas vinogradarstva i
vinarstva Bosne i Hercegovine, FRAM ZIRAL, Mostar: 123–128
° Lasić, V., Karačić, A., Gašpar, M., Kojić, A., Blesić, M., Kraljević, M. (2010). Nazočnost
virusa GFLV, ARMV, GLRAV-1 i GLRAV-3, na autohtonim kultivarima Žilavka i Blatina
na lokalitetu Lopate u mostarskom vinogorju, 21st scientific-expert conference in agriculture
and food industry, Neum:130–131.
° Leko, M., Žulj Mihaljević, M., Beljo, J., Šimon, S., Sabljo, A., Pejić, I. (2012). Genetic
relationship among autochthonous grapevine cultivars in Bosnia and Herzegovina. 23rd
Popis literature
109
International Scientific – Congress on Agriculture and Food Industry, 27-29 Septembre 2012
Izmire/Turska, The Journal of Ege University Faculty of Agriculture II: 479–482.
° Leko, M. (2011). Vinogradarski katastar FbiH. (in press).
° Leko, M., Kozina, B. (2009). Projekt izrade vinogradarskog katastra Bosne i Hercegovine.
Stručni skup Vinofest , 29.-30. siječnja 2008., Položaj vinogradarstva i vinarstva u BiH.
Zbornik radova, Turistička zajednica ŽZH Ljubuški: 97–113.
° Liebenberg, A., Freeborough, M.J., Visser, C.J., Bellstedt D.U., Burger J.T. (2009). Genetic
variability within the coat protein gene of grapevine fanleaf virus isolates from South Africa
and the evaluation of RT-PCR, DAS-ELISA and Immuno Strips as virus diagnostic assays,
Virus Research 142 (1-2): 28–35
° López-Fabuel, I., Olmos, A., Bassler, A., Dupuis-Maguiraga, L., Torres, L.B., Bertolini, E.,
Wetzel, T. (2013). Short communication. Molecular analysis of the genomic RNAs 1 i 2 of
the firs Arabis mosaic virus isolate dected in Spanish grapevines. Spanish Jurnal of
Agricultural Research 11(1): 199–203.
° Lima, M.F., Alkowni, R., Uyemoto, J.K., Golino, D., Osman, F., Rowhani, A. (2006).
Molecular analysis of a California strain of Rupestris stempitting associated virus isolated
from declining Syrah grapevines, Archives of Virology 151 (9): 1889–1894.
° Lunden, S., Meng, B., Avery, Jr. J., Qiu, W. (2008). Grapevine fanleaf virus, Tomato
ringspot virus and Grapevine rupestris stem-pitting associated virus are present in
Chardonnay with a severe vein-clearing disease, Proceedings of the 2nd Annual National
Viticulture Research Conference 9: 11.
° Maceljski, M. (1999). Poljoprivredna entomologija, Zrinski, Čakovec.
° Mahfoudhi, N., Digiaro, M., Dhouibi, M. H. (2009). Transmission of grapevine leafroll
viruses by Planococcus ficus (Hemiptera: Pseudococcidae) and Ceroplastes rusci (Hemiptera:
Coccidae), Plant Dis. 93: 999–1002.
° Mahfoudhi, N., Digiaro, M., Dhouibi, M. H. (2008). Incidence and distribution of grapevine
leafroll-associated viruses in Tunisian vineyards, Journal of Phytopathology, 156: 556–558.
° Maixner, M. (2005). Risks posed by the spread and dissemination of grapevine pathogens
and their vectors. International symposium Introduction and Spread of Invasive Species, 9 11
Popis literature
110
June, Berlin, Germany
http://p11631.typo3server.info/fileadmin/alte_Webseiten/Invasive_Symposium/articles/062_
Maixner.pdf
° Maliogka, V.A., Martelli, G.P., Fuchs, M., Katis, N.I. (2015). Control of viruses infecting
grapevines, Advances in Virus Research 91:175–227.
° Maliogka, V.I., Dovas, C.I., Katis, N.I. (2008). Evolutionary relationships of virus species
belonging to a distinct lineage within the Ampelovirus genus, Virus Research 135: 125–135.
° Malossini, U., Roncador, I., Ciccotti, A.M., Bertamini, M., Nedunchezhian, N. (2003).
Grapevine viruses (GLRaV-1 + GVA) inhibit pigments, RuBPC and photosynthetic activities
in field grown grapevine (Vitis vinifera L, cv. Marzemino) leaves. Extended Abstracts of the
14th Meeting of ICVG, Locorotndo, Italy, 2003: 254–255.
° Mandić, B., Ivanović, Ž., Susca, L., Bottalico, G., Starović, M., Jakšić, D.,
Kuzmanović, S.,Ivanišević, D., Gavrilović, V., Korać, N., Digiaro, M., La Notte P.
(2009). Clonalselection and sanitary status of local grapevine germplasm in Serbia. Extended
abstracts 16th Meeting of ICVG, Dijon, France, 60–61.
° Maree, H. J., Almeida, R. P. P., Bester, R., Mun Chooi, K., Cohen, D., Dolja, V. V., Fuchs,
M. F., Golino, D. A., Jooste, A. E. C., Martelli, G. P., Naidu, R. A., Rowhani, A., Saldarelli
P., Burger J. T. (2013). Grapevine leafroll-associated virus 3, Frontiers in microbiology
4(82): 1–21.
° Martelli, G.P. (2014). Directory of virus and virus-like diseases of the grapevine and their
agents, Journal of Plant Pathology 96: 1-136.
° Martelli, G.P., Abou Ghanem-Sabanadzovic, N., Agranovsky, A.A., Al Rwahnih, M.,
Dolja, V.V., Dovas, C.I., Fuchs, M., Gugerli, P., Hu J.S., Jelkmann, W., Katis, N.I.,
Maliogka, V.I., Melzer, M.J., Menzel, W., Minafra, A., Rott, M.E., Rowhani, A.,
Sabanadzovic, S., Saldarelli, P. (2012). Taxonomic Revision Of The Family Closteroviridae
With Special Reference To The Grapevine Leafroll-Associated Members Of The Genus
Ampelovirus And The Putative Species Unassigned To The Family, Journal of Plant
Pathology 94:7–19.
° Martelli, G.P., Agranovsky, A.A., Bar-Joseph, M., Boscia, D.,Candresse, T., Coutts, R.H.A.,
Dolja, V.V., Hu, J.S., Jelkmann, W., Karasev, A.V., Martin, R.R., Minafra, A., Namba, S.,
Popis literature
111
Vetten, H.J. (2011). Family Closteroviridae. In: King A., AdamsM.J., Carstens E.B.,
Lefkowitz E. (eds). Virus Taxonomy.Ninth Report of the International Committee on
Taxonomyof Viruses, Elsevier-Academic Press,Amsterdam, The Netherlands: 987–1001.
° Martelli, G.P. (2010). Virus Diseases of Grapevine. eLS. A21522
° Martelli, G.P. (2009). Grapevine virology highlights 2006-09. V: 16th Meeting of the
International Council for the Study of Viruses and Virus-like Diseases of Grapevine (ICVG),
31 August-4 September, 2009, Dijon, France: Extended abstracts. Le Progres Agricole et
Viticole, 126: 15–23
° Martelli, G.P., Boudon-Padieu, E. (2006). Directory of infectious diseases of grapevines.
Options Méditerranéennes B (55): 11–201.
° Martelli, G.P., Arganovsky, A.A., Bar-Joseph, M., Boscia, D., Candresse, T., Coutts,
R.H.A., Dolja, V.V., Falk, B.W., Gonsalves, D., Jelkmann, W., Karasev, A.V., Minafra, A.,
Namba, S., Vetten, H.J., Wisler, G.C., Yoshikawa, N. (2002). The family Closteroviridae
revised. Archives of Virology 147 (10): 2039–2044.
° Martelli, G. P. (1999). Proceedings of the Mediterrenean network on grapevine
closteroviruses 1992-1997 and the viroses and virus-like diseases of the grapevine a
bibliographic report, 1985-1997. (Martelli G. P., Digiaro M. eds.). Options Mediterraneennes,
Etudes et Recherches. Ciheam, Bari.
° Martelli, G.P., Saldarelli, P., Boscia, D. (1997). Filamentous viruses of the grapevine:
Closterovirus. In: Monette PL, ed. Filamentous Viruses of Woody Plants. Research Signpost,
Trivandrum: 1–9.
° Martelli, G.P., Minafra, A., Saldarelli, P. (1997a). Vitivirus, a new genus of plant viruses.
Archives of Virology 142, 9
° Martelli, G.P. (1993). Graft-transmissible Diseases of Grapevines. Handbook for Detection
and Diagnosis. Rome, Italy: Food and Agricultural Organization of the United Nations
Publication Division.
° Martelli, G.P., Taylor, C.E. (1990). Distribution of viruses and their nematode vectors. Adv.
Dis. Vector Res. 6: 151–189.
Popis literature
112
° Martelli, G.P., Savino, V., (1990). Fanleaf degeneration. In: Pearson, R.C., Gogheen, A.
(Eds.), Compendium of Grapevine Diseases. APS Press, St. Paul, MN, USA:48-49.
° Mslmanieh, T., Digiaro, M., Elbeaino, T., Boscia, D., Martelli, G.P. (2006). Viruses of
grapevine in Syria, EPPO Bulletin 36 (3): 523–528.
° Masten, Milek, T., Masten, R. (2009). Eriofidne i Tetranihidne grinje (Arachnida: Acari) na
vinovoj lozi, Glasilo biljne zaštite 9/5: 343–351.
° Materazzi, A., D'Onofrio, C., Bouyahia, H., Triolo, E. (2009). Sanitary status of autochton
minor wine grape varieties: an unusual diffusion of Arabis mosaic virus. Extended
abstracts 16th Meeting of ICVG, Dijon, France, 127–128.
° Meng, B., Pang, S., Forsline, P.L., McFerson, R., Gonsalves, D. (1998). Nucleotide squence
of Grapevine Rupestris stem pitting associated virus-1 reveal similarities to Apple stem
pitting virus, Journal of General Virology, 79: 2059–2069.
° Milne, R.G., Conti, M., Lesemann, D.E., Stellmach, G., Tanne, E., Cohen, J. (1984).
Closterovirus-like particles of two types associated with diseased grapevines, Phytopathol. Z.
110: 360–368.
° Ministarstvo vanjske trgovine i ekonomskih odnosa/ Uprava Bosne i Hercegovine za zaštitu
zdravlja biljahttp://www.uzzb.gov.ba/
° Mirošević, N., Turković, J. (2004). Ampelografski atlas, Golden marketing – Tehnička
knjiga, Zagreb.
° Monette, P.L., Godkin, S.E. (1993). Mechanical transmission of closterovirus-like particles
from a corky bark affected grapevine to herbaceous species, Plant Pathology, Trends in
Agricultural Science 1: 7–12.
° Monette, P.L., James, D. (1990). Detection of two strains of grapevine virus A, Plant
Disease 74(11): 898–900.
° Namba, S., Yamashita, S., Doi, Y., Yora, K., Terai, Y., Yano, R. (1979). Grapevine leafroll
virus, a possibile member of closteroviruses, Annals of the Phytopathological Society of
Japan 45: 497–502.
Popis literature
113
° Narayanasamy, P. (2008). Molecular biology in plant pathogenesis and disease management
– Microbial plant pathogens. 1. Springer Science Business Media B.V., Netherlands.
° National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ i
http://frodo.wi.mit.edu/; Pristupljeno 18.veljače 2015.
° Osman, F., Leutenegger, C., Golino, D. and Rowhani, A. (2007). Real-time RT-PCR
(TaqMan®) assays for the detection of Grapevine Leafroll associated viruses 1-5 and 9, J.
Virol. Methods 141, 22-29.
° Osman, F., Leutenegger, Ch., Golino, D., Rowhani, A. (2008). Comparison of low-density
arrays, RT-PCR and real-time TaqMan® RT-PCR in detection of grapevine viruses, Journal
of Virological Methods 149: 292–299.
° Ostojić, I., (2014). Pojava mediča vinove loze na području Hercegovine, Zbornik 59.
Turističko-kulturno-gospodarstvene manifestacije „Dani berbe grožđa – Brotnjo 2014, Čitluk.
° Ostojić, I. (2013). Periodički štetnici vinove loze na području Hercegovine, Zbornik 58.
Turističko-kulturno-gospodarstvene manifestacije „Dani berbe grožđa – Brotnjo 2013, Čitluk.
° Ostojić, I., Zovko, M. (2010). Štitaste uši-sve veći problem hercegovačkih vinograda,
Zbornik 55. Turističko-kulturno-gospodarstvene manifestacije „Dani berbe grožđa – Brotnjo
2010, Čitluk.
° Ostojić, I., Zovko, M., Petrović, D., Bulić, P., Dogan, V. (2014a). Smokvin crvac
(Planococcus ficus, Signoret,1875) – opasan štetnik vinove loze na području Hercegovine, 11.
Simpozij o zaštiti bilja u Bosni i Hercegovini, Teslić, 4.–6. studenoga 2014. godine, Zbornik,
Sažetak: 38–40.
° Ouertani, R., Savino, V., Minafra, A., Boscia, D., Castellano, M.A., Martelli, G.P., Greco,
N. (1991). A new mechanically transmissible virus from Tunisian grapevines. In: Proceedings
of the 10th Meeting of ICVG, Volos, Greece, 1990: 129.
° Pastre, J. (1891). La brunissure de la vigne, Progrčs Agricole et Viticole 12: 219–233.
° Panjan, M., Šarić, A. (1963). Serološka dijagnostika Arabis mozaik virusa iz vinove loze i
trešnje gel-difuzionom metodom, Agronomski glasnik 3: 204–206.
° Pearson, R.C., Goheen, A.C. (1998). Compendium of grape diseases. 4th ed. St.Paul, The
American Phytopathological Society Press: 93.
° Pejčinovski, F. (1974). Virozna rehuljavost grozdova sorte Belo Zimsko u Makedoniji.-
Doktorska disertacija, Beograd.
Popis literature
114
° Peršurić, Đ., Ponjuha, D., Sladonja, B. (2005). Zdravstveno stanje autohtonih sorata vinove
loze u Istri, Glasilo biljne zaštite 1: 10–12.
° Peterson, C.L., Charles, J. (1997). Transmission of grapevine leafrollassociated
closteroviruses by Pseudococcus longispinus and P. calceolariae, Plant Pathology 46: 509–
515.
° Poljuha, D., Sladonja, B., Bubola, M. (2010). Incidence of viruses infecting
grapevinevarieties in Istria (Croatia). Journal of Food, Agriculture and Environment 8: 166–
169.
° Poljuha, D., Sladonja, B., Peršurić, D. (2004). Survey of five indigenous Istrian Cultivars
forpresence of six grape viruses. American Journal of Enology and Viticulture 55: 286–287.
° Preiner, D., Cibilić, I., Karoglan Kontić, J., Marković, Z., Maletić, E. (2010). Utjecaj
zarazevirusom uvijenosti lista tip 3 na ampelografske karakteristike sorte Grk (V. viniferaL.).
45. Hrvatski i 5. Menunarodni simpozij agronoma, Opatija, Hrvatska: 1188–1192.
° Primer3web version 4.0.0 – Pick primers from a DNA sequence. http://primer3.ut.ee/
(http://bioinfo.ut.ee/); Pristupljeno 2. veljače 2015.
° Ramel, M.E., Serrant, P., Külling, P. Gugerli, P. (1993). Monoclonal and polyclonal
antibodies for the detection og Grapevine fleck associated virus. Extended abstracts 11th
Meeting ICVG: 161–162.
° Raski, D.J., Goheen, A.C., Lider, L.A., Meredith, C.P. (1983). Strategies against grapevine
fanleaf virus and its nematode vector, Plant Dis. 67: 335–339.
° Ravaz, L., Verge, G.(1924). Le rugeau de la vigne, Progrčs Agricole et Viticole 45: 11–17.
° Rigotti, S., Bitterlin, W., Gugerli, P. (2006). Production of monoclonal antibodies to
grapevine leafroll associated virus 7 (GLRaV-7). In extended abstracts 15th Meeting ICVG:
200–202.
° Rosciglione, B., Gugerli, P. (1989). Transmission of grapevine leafroll disease and an
associated closterovirus to healthy grapevine by the mealybug Planococcus ficus
(Signoret). Proceedings 9th Meeting of ICVG, Kiryat Anavim, Israel 1987: 67–69.
Popis literature
115
° Rott, M.E., Jelkmann W. (2001). Characterization and detection of several filamentous
viruses of cherry: Adaptation of an alternative cloning method (DOP-PCR) and modification
of an RNA extraction protocol, European Journal of Plant Pathology 107: 411–420.
° Rowhani, A., Zhang, Y.P., Golino, D.A., Uyemoto, J.K. (2000). Isolation and partial
characterization of two new viruses from grapevine. Extended Abstracts 13th Meeting of
ICVG, Adelaide 2000: 82.
° Rowhani, A., Uyemoto, J. K., Golino, D. A., Martelli, G.P. (2005). Pathogen testing and
certification of Vitis and Prunus species. Annu. Rev. Phytopathol. 43: 261–278.
° Sabanadzovic, S., Abou Ghanem, N., Castellano, M.A., Digiaro, M., Martelli, G.P. (2000).
Grapevine fleck-like viruses in Vitis, Arch. Virol. 145: 553–565.
° Sabanadzovic, S., Abou-Ghanem, N., Saldarelli, P., Martelli, G. P. (1997). Physico-
chemical and molecular characterization of grapevine fleck virus, p. 25–26. In O. A.
Sequeira,de, J. C. Sequeira, M. T. Santos (ed.), Extended abstracts 12th Meeting ICVG,
Lisbon, Portugal, 29 september-2 October 1997. Dept.Plant Pathology, Estacção Agronomica
Nacional, Oeiras, Portugal.
° Sardarelli, P., Giampetruzzi, A., Minafra, A., Martelli, G. (2012). Grapevine virus diseases.
Impact and advanced diagnosis of associated agents. Istituto di Virologia vegetale del CNR-
UOS, Dipartimento Biologia e Chimica Agroforestale ed Ambientale. University of Bari,
Italy.
° Saldarelli, P., Giampetruzzi, A. Minafra1, A., Martelli, G. (2012°). Grapevine virus
diseases: impact and advanced diagnosis of associated agents, COST Phytoplasma and Virus
Management in Grapevine Collections for Germplasm Conservation, Mobilization and
Evaluation, Abstract book, Sofia: 5–6
° Saldarelli, P., Rowhani, A., Routh, G., Minafra, A., Digiaro, M. (1998). Use ofdegenerate
primers in an RT-PCR assay for the identification and analysis ofsome filamentous viruses,
with special reference to clostero- and vitivirusesof the grapevine, Eur. J. Plant Pathol. 104:
945–950.
° Sanfançon, H., Wellink J., Le Gall O., Karasev A., Van der Vlugt R., Wetzel T. (2009).
Secoviridae: a proposed family of plant viruses within the order Picornavirales that combines
the families Sequiviridae and Comoviridae, the unassigned genera Cheravirus and Sadwavirus
and the proposed genus Torradovirus: Archives of Virology 154 (5): 899–907.
Popis literature
116
° Sannino, F.A. (1906). Il rossore delle viti. Riv. Patol. Veg. 1, 162–163.
° Scheu, G. (1935). Die Rollkrankheit des Rebstockes, Der Deutsche Weinbau 14: 222–223,
345–346, 356–358.
° Savino, V., La Notte P., Bottalico G., Martelli G.P. (2002). Situazione sanitaria della vite in
Italia centro-meridionale, Quaderni della Scuola di Specializzazione in Scienze Viticole ed
Enologiche – Torino 25: 67–76.
° Savino, V., Boscia, D., Martelli, G.P. (1989). Rugose wood complex of grapevine: can
grafting to Vitis indicators can discriminate between diseases. Proceedings 9th meeting
ICVG, Kyriat Anavim, Israel 1987: 91–94.
° Sforza, R., Komar, V., Greif, C. (2000). New scale insect vectors of grapevine
Closteroviruses. Extended Abstracts 13th Meeting of ICVG, Adelaide 2000, 14.
° Stellmach, G. (1968). Propfversushe zum Nachweis der Rollkrankheit im heimischen
Weinbau. Weinb. U. Keller 15: 518–523.
° Šarić, A., Korošec-Koruza, Z. (1991). Occurrence and spread of viruses associated with
leafroll (GLR) and stem pitting (GSP) diseases in north-western part of Yugoslavia.
Proceedings 10th Meeting of ICVG, Volos, Greece, 416.
° Šarić, A., Hranueli, T. (1977). Istraživanje virusnih bolesti loze u SR Hrvatskoj. Proc.
Symp. Ekskoriosis in vine, Mostar: 149–151.
° Šarić, A. (1960). Degeneracija loze u Istri. Biljna zaštita 1: 3–5.
° Šarić Sabadoš A., Corte A. (1959). Dati preliminari su una forma di „degenerazione
infettiva” della vite in Istria a complesso sintomatologico insolito, Atti. Ist. Bot. Univ. Pavia,
5 (17): 268-273.
° Šutić, DD, Ford, R. E., Tošić, M. T. (1999). Handbook of Plant Virus Diseases. CRC Press,
USA.
° Tanne, E., Ben Dov, Y., Raccah, B. (1989). Transmission of the corky-bark disease by the
mealybug Planococcus ficus, Phytoparasitica 17, 55.
° Teliz, D., Tanne, E., Gonsalves, D., Zee, F. (1987). Field serological detection of viral
antigens associated with grapevine leafroll disease, Plant Disease 71, 8
° Topolovec-Pintarić, S. (1990). Analize vinove loze na prisustvo virusa Elisa metodom u
rasadniku Jastrebarsko (Mladina). Diplomski rad.
Popis literature
117
° Triolo, E., Materazzi, A. (1986). La Maculatura Infettiva della vite: influenza di isolati
diversi sull’attitudine alla propagazione vegetativa di Vitis rupestris St George. In: IV Symp
Int Sélection Clonale de la Vigne, Changins, 1986. Rech Agron Suisse 3 (26): 320–324.
° Tsai, C. W., Chau, J., Fernandez, L., Bosco, D., Daane, K. M., Almeida, R. P. P. (2008).
Transmission of Grapevine leafroll-associated virus 3 by the vine mealybug (Planococcus
ficus), Phytopathology 98: 1093–1098.
° Turturo, C., Rott, M. E., Minafra, A., Saldarelli, P., Jelkmann, W., Martelli, G. P. (2000).
Partial molecular characterization and RT-PCR detection of Grapevine leafroll associated
virus -7. Extended abstracts 13th Meeting of ICVG, Adelaide, Australia: 17–18.
° Uyemoto, J.K., Martelli, G.P., Rowhani, A. (2009). Grapevine Viruses, Viruslike Diseases
and Other Disorders. In: Virus Diseases of Plants: Grape, Potato, and Wheat Image Collection
and Teaching Resource CD-Rom. APS Press, St. Paul, MN 55121.
° Vončina, D., Preiner, D., Radović, D., Maletić, E., Karoglan Kontić, J. (2012). Prevalence
of viruses in autochthonous grapevine cultivars from Croatian continental and coastal
grapevine cultivars from Croatian continental and coastal vine-growing regions. International
Symposium on current trends in plant protection (Marisavljević D. ur.). Institute for Plant
Protection and Enviroment, Belgrade.
° Vončina, D. (2011). Utvrđivanje virusa na autohtonim sortama vinove loze (Vitis vinifera
L.) u Dalmaciji serološkim, molekularnim i biološkim metodama, Doktorska disertacija,
Agronomski faklultet Sveučilište u Zagrebu.
° Vončina, D., Zdunić, G., Mihaljević, M., Hančević, K., Budić-Leto, I., Cvjetković, B.
(2011a). Prisutnost viroza u populaciji rijetke sorte „Dobričić“ (Vitis vinifera L.) u obalnom
području Hrvatske, Glasilo biljne zaštite 11(5): 343–352.
° Vončina, D., Badurina, D., Preiner, D., Cvjetković, B., Maletić, E., Karoglan Kontić, J.
(2011b). Incidence of virus infections in grapevines from Croatian collection plantations,
Phytopathol. Mediterr 20: 316–326.
° Vončina, D., Šimon, S., Đermić, E., Cvjetković, B., Pejić, I., Maletić, E., Karoglan Kontić,
J. (2010). Distribution and partial molecular characterization of Grapevine leafroll-associated
virus 2 (GLRaV-2) found in Croatian autochthonous grapevine (Vitis vinifera L.) germplasm,
Journal of plant diseases and protection 117 (2010) 5: 194–200.
Popis literature
118
° Vončina D., Đermić E., Cvjetković B., Maletić E., Pejić I., Karoglan Kontić J. (2009).
Occurence of the important grapevine viruses in population of Croatian autochthonous
grapevine varieties from Kastela region. 32nd World Congress of vine and wine, 7th general
assembly of the OIV and Wine. (Kubanović V. ed.). Zagreb.
° Vuksanović, P., Mijatović, D., Tarailo, R., Kovačina, R., Aničić, Z. (1977). Rejonizacija
vinogradarstva Socijalističke Republike Bosne i Hercegovine, Elaborat, Poljoprivredni
fakultet Sarajevo.
° Vetten, H.J., Wisler, C.G., Yoshikawa, N. (2002a). The family Closteroviridae revised.
Archives of Virology 147: 2039–2043.
° Vuittenez, A. (1977). Metode borbe protiv viroza loze, Savjetovanje o eskoriozi i virusnim
bolestima vinove loze, Istraživačko – razvojni centar HEPOK, Mostar: 177-18
° Zhang, Y., Singh, K., Kaur, R., Qiu, W. (2011). Association with a novel DNA virus with
the grapevine vein-clearing and vine decline syndrome, Phytopathology 101:1081-1090.
° Zdunić, G., Šimon, S., Maletić, E., Vončina, D., Budić-Leto, I., Karoglan Kontić, J., Pejić, I.
(2009). Conservation and valorization of genetic diversity within the population of cv.
Plavac mali (Vitis Vinifera L.). Proceedings of the 16th International GiESCO
Symposium, Davis, USA: 547–551.
° Zdunić, G., Hančević, K., Sladonja, B., Poljuha, D., Hartl-Musinov, D., Budić-Leto I.,
Bućan, L., Pezo, I. (2008). Ampelographic characterization and sanitary status of grapevine
cultivar ‘ Prč bijeli’ (Vitis vinifera L.), Agriculturae Conspectus Scientificus 73: 85–88.
° Zdunić, G., Maletić, E., Vokurka, A., Karoglan Kontić, J., Pezo, I., Pejić, I. (2007).
Phenotypical, Sanitary and Ampelometric Variability within the Population of cv.
Plavac Mali (Vitis vinifera L.), Agriculturae Conspectus Scientificus 72: 117–128.
° Zee, F., Gonsalves, D., Goheen, A., Kim, K.S., Pool, R., Lee, R.F. (1987). Cytopathology of
leafroll-diseased grapevines and the purification and serology of associated Closterovirus-like
particles, Pytopathology 77: 1427–1434.
° Walter, B., Martelli, G. P. (1997). Clonal and sanitary selection of the grapevine. In:
Sanitary selection of the Grapevine (Walter B. ed.). INRA, Paris.
° Walter, B., Zimmermann, D. (1991). Further characterization ofclosterovirus-like particles
associatd with the grapevineleafroll disease, Proceedings 10th Meeting of ICVG,
Volos,Greece: 62–66.
Popis literature
119
° Weber, E., Golino, D., Rowhani, A. (1993). Leafroll diseases of grapevines, Pract. Winery
Vineyard 13: 21–25.
° Wetzel, T., Jardak, R., Meunier, L., Ghorbel, A., Reustle, G.M., Krczal, G. (2002).
Simultaneous RT/PCR detection and differentiation of arabis mosaic and grapevine fanleaf
nepoviruses in grapevine with a single pair of primers, J. Virol. Meth. 101, 63–69.
° WSU Enology and Viticulture. <http://cru.cahe.wsu.edu/CEPublicatios/FS074E/FS074E.pdf
Pristupljeno 22. prosinca 2014.
Prilozi
120
8. PRILOZI
Prilog 1. Postupak pripreme pozitivnih kontrola.
Pozitivne kontrole za viruse GLRaV-2, GLRaV-4, GLRaV-5, GLRaV-6, GLRaV-7 i GLRaV-
9 dopremljene su kao etanol/natrij acetat precipitacija (talog), njihovo vraćanje u otopinu za
upotrebu u RT-PCR obavljeno je po protokolu (Lori Leong, Laboratory Manager (Staff
Research Associate), Foundation Plant Services UC Davis; osobna komunikacija):
1. centifugirati 30 minuta na 10,000 rpm
2. pažljivo odliti supernatant
3. pažljivo pipetirati 0,5 ml hladnog 90 % etanola u epruvetu (bez uzimanja taloga)
4. centrifugirati 7 minuta na 10,000 rpm
5. pažljivo odliti supernatant
6. centrifugirati 1 minutu na 10,000 rpm
7. pažljivo pipetom odstraniti preostali etanol
8. prosušiti na zraku 5 minuta
9. resuspendirati talog u odgovarajućoj količini vode (20 µL Rnase free water)
Prilozi
121
Prilog 2. Vinogradi u kojima je vršeno istraživanje viroza.
Tablica 18. Osnovne informacije o vinogradima u kojima je vršeno istraživanje
Redni
broj Mjesto, lokalitet, položaj vinograda
Autohtoni
kultivar Količina GPS kordinate Općina Napomena
1. lokalitet Humac položaj Zgoni
(vl. Milas Hrvoje) Krkošija 25
6462520 x 4783607
88 m Ljubuški
oko 800 loza (Žilavka i
prateći kultivari )
2.
lokalitet Ljubuški, položaj Donji Radišići
vinogradi i vinarija
(vl. Škegro)
Dobrogostina 33 6462602 x 4784942
127 m Ljubuški
oko 5.000 (Blatina i
Žilavka i prateći
kultivari)
3. lokalitet Vitina položja Proboj
(vl. Bandur Franjo) Dobrogostina 17
6460118 x 4786925
87 m Ljubuški
oko 300 loza
(Kujundžuša,
Smederevka, i prateći
bijeli kultivari)
4. lokalitet Klobuk, položaj Čuljkove njive
(vl. Vegić)
Dobrogostina
Krkošija
42
13
6455864 x 4793515
183 m Ljubuški
oko 1.300 loza (svi
kultivari)
5. lokalitet Ljubuški, položaj Plantaže – Otok
vinogradi i vinarija EROVIN d.o.o.
Blatina
Trnjak
52
8
6462426 x 4784349
111 m Ljubuški 15 ha
6. lokalitet Humac položaj Zgoni
(vl. Milas Zdenko)
Trnjak
Bena
23
37
6462154 x 4783250
132 m Ljubuški
oko 10.000 loze (svi
kultivari)
Prilozi
122
nastavak Tablice 18.
7.
lokalitet Humac, položaj Radišići
RASADNIK
vinogradi i vinarija
Bena 29 6459547 x 4786685
99 m Ljubuški
12 ha (Žilavka i prateći
kultivari)
8. lokalitet Studenci-Kravice, pložaj Doljani
vinogradi i vinarija Vinarija Catena d.o.o. Krkošija 43
6467282 x 4780793
116 m Ljubuški
6,3 ha (Žilavka, Bena,
Krkošija, Blatina,
Trnjak, A. Bouche,
Merlot), zasađen 2007.
9. lokalitet Buna, položaj Stup
(vl. Obitelj Leko)
Blatina
Žilavka
19
17
6487550 x 4790117
81 m Mostar
oko 600 loza, zosađen
1954 godina
(Žilavka i Blatina)
10. lokalitet Drinovci, položaj Drinovačka
Draga (vl.Vlado Rogić) Trnjak 53
43°21.501’ x
17°20.544’ Grude oko 800 loza
11. lokalitet Tihaljina, položaj Nezdravice
(vl.Tomisla Kordić): Trnjak 15
43°18.908’ x
17°23.463’ Grude oko 300 loza
12. lokalitet Stolac, položaj Poprati
(vl. Obitelj Perić) Žilavka 29
6493071 x 4772671
118 m Stolac
oko 500 loza (Žilavka,
Blatina, Plavka)
Prilozi
123
nastavak Tablice 18.
13.
lokalitet Crnopod, pložaj Dugolaze i
Ražovine,
vinogradi i vinarija, Vinarija Nuići d.o.o.
Žilavka
Blatina
Trnjak
44
50
50
6469788 x 4782278
168m (Žilavka)-
Dugolaze
6469294 x 478980
194m (Blatina i
Trnjak)- Ražovine
Ljubuški
Dugolaze (G tabla)
starost 6 god.
Sortiment: Žilavka s
pratećim kultivarima,
Blatina s pratećim
kultivarima i 5
alohtonih kultivara
Ražovine sadnja 2004.;
sortiment: Žilavka,
Bena, blatina, Trnjak,
P.Mali, Vranac
14.
lokalitet Kosor, položaj Lopate I
vinogradi i vinarija, Hercegovina vino d.o.o.
Žilavka
Blatina
150
163
6486986 x 479500
57m Mostar
- sadnja 2006.
- 9,7 ha pod Žilavkom
- 4,8 ha pod Blatinom
15.
lokalitet Žitomislići, položaj Donje Polje
vinogradi i vinarija, Hercegovina vino d.o.o.
Trnjak 94 6482533 x 4782713
34m Mostar
- sadnja 2004.–2005.
- sotiment: Blatina 19,4
ha, Trnjak 4,8ha,
Alicante Bouschet4,8
ha
Prilozi
124
nastavak Tablice 18.
16.
lokalitet Blizanci, položaj plantaže vinarije
Čitluk
vinogradi i vinarija, Hercegovina vino d.o.o.
Žilavka
Bena
21
82
6480831 x 4784549
264 m Čitluk
- sadnja 1982. –1983.
- sortiment Žilavka i
prateći kultivari 6,3ha,
Blatina 0,5ha, P.Mali
5,2 ha
17. lokalitet Vionica,
položaj njiva Tadić Andrije Krkošija 10
6476374 x 4786461
247m Čitluk
oko 300 loza.
Vinograd iz 1919.
- autohtoni kultivari
18.
lokalitet Blizanci, položaj Kordića kuće
(vl. Ilija Kordić)
Dobrogostina 7 6478850 x 4785491
305 m Čitluk oko 400 loza
19.
lokalitet Sovići, položaj Pejići Trnjak
Blatina
50
50
43°24’22.11” x
17°19’29.73” Grude
1.000 m2
700m2 položaj Bobanova Draga 43°23’51.64” x
17°20’53.23”
20. Kolekcijski nasad u Višićima
Svih 6
kultivara 106
6477057 x 4767882
38 m Čapljina
Prilozi
125
Prilog 3. Kolekcijski nasad Višići
Tablica 19. Prikaz simptoma iz Tablica 12. – 17. Poglavlja 4.3.
Zastoj u rastu Smanjena veličina listova
Zastoj u kretanju vegetacije Klorotična diskoloracija
Pojava guka Neujednačeno odrvenjavanje
Prilozi
126
Asimetričnost lista Skraćeni internodiji
Grozdovi imaju dosta neuobičajeno sitnih bobica
koje ne zore
Grozdovi ne dozrijevaju
Smanjenje veličine grozdova Rehuljavost
Prilozi
127
Crvenilo lista (u neuobičajeno vrijeme) Cik-cak rast
Patuljavost Patuljavost
Izraženo neravnomjerno odrvenjavanje rozgve i
grozdovi nedozrijevaju
Grozdovi neujednačeno dozrijevaju
Prilozi
128
Zastoj u vegetaciji Smanjenje vigora
Slabiji rast mladica Uvijenost lista
yellow mosaic – Mozaik lista Grozdovi loše oplođeni
Prilozi
129
Mramoriran (list desno); list lijevo-zdravi list Deformiranost lista
Mozaik lista
Mozaik lista – yellow banding
Rehuljavi grozdovi Dozrijevanje grozdova kasni
Prilozi
130
Fascijacije Iznenadno propadanje trsa
Prilozi
131
Prilog 4. Rezultati analiza
Tablica 20. Rezultati serološke detekcije virusa u trsovima autohtonih kultivara kolekcijskog nasada Višići
Vinograd Sorta Broj virusa u kombinaciji
Virusna kombinacija Pojedinačan broj uzoraka
%
Ukupan broj uzoraka
Višići Bena 1 GLRaV-3 1 5,56 1
2 GLRaV-3GFkV 3 16,67
9 GLRaV-1GLRaV-3 2 11,11
ArMVGLRaV-3 2 11,11
GFLVGLRaV-3 2 11,11
3 GLRaV-1GLRaV-3GLRaV-4-9 1 5,56 2
GFLVArMVGLRaV-3 1 5,56
4 GLRaV-1GLRaV-3GLRaV-4-9GFkV 2 11,11
4 GFLVGLRaV-1GLRaV-3GFkV 1 5,56
GFLVArMVGLRaV-1GLRaV-3 1 5,56
5 GFLVGLRaV-1GLRaV-3GLRaV-4-9 GFkV 1 5,56
1
0 (virus-tested) - 1 5,56 1
Blatina 1 GLRaV-3 6 33,33 7
GFLV 1 5,56
2 GLRaV-1GLRaV-3 1 5,56 6
GFLVGLRaV-3 5 27,78
3 ArMV GLRaV-1 GLRaV-3 1 5,56
4 GFLV GLRaV-3 GFkV 1 5,56
GFLV GLRaV-3 GLRaV 4-9 2 11,11
GFLV GLRaV-1 GLRaV-3 1 5,56
Prilozi
132
nastavak Tablice 26.
Vinograd Sorta Broj virusa u kombinaciji
Virusna kombinacija Pojedinačan broj uzoraka
%
Ukupan broj uzoraka
Dobrogostina 1 GLRaV-3 5 27,78 5
2 GLRaV-3GFkV 1 5,56
7 Višići GLRaV-3GLRaV 4-9 2 11,11
GLRaV-1GLRaV-3 2 11,11
GFLVGLRaV-3 2 11,11
3 GLRaV-2GLRaV-3GFkVGLRaV-4-9 1 5,56
5
GLRaV-1GLRaV-3GFkV 1 5,56
GFLVGLRaV-3GLRaV-4-9 1 5,56
GFLVGLRaV-1GLRaV-3 1 5,56
GFLVArMVGLRaV-3 1 5,56
4 GFLVGLRaV-1GLRaV-3GFkV 1 5,56 1
Prilozi
133
nastavak Tablice 26.
Vinograd Sorta Broj virusa u kombinaciji
Virusna kombinacija Pojedinačan broj uzoraka
%
ukupan broj uzoraka
Krkosija 1
GLRaV-3 GFLV
4 25 5
1 5,26
2 GLRaV-3GFkV 1 5,26
6 GLRaV-1GLRaV-3 1 5,26
GFLVGLRaV-3 4 25
3 GLRaV-3GLRaV-4-9GFkV 1 5,26
8
GLRaV-1GLRaV-3GFkV 1 5,26
GLRaV-1 GLRaV-3GLRaV 4-9 1 5,26
ArMVGLRaV-1GLRaV-3 1 5,26
GFLVGLRaV-3GLRaV-4-9 1 5,26
GFLVGLRaV-1GLRaV-3 2 10,53
GFLVArMVGLRaV-3 1 5,26
Prilozi
134
nastavak Tablice 26.
Vinograd Sorta Broj virusa u kombinaciji
Virusna kombinacija Pojedinačan broj uzoraka
%
Ukupan broj uzoraka
Trnjak 1 GFkV 1 6,25
5 GLRaV-3 2 18,75
ArMV 1 6,25
GFLV 1 6,25
Višići 2 GLRaV-3 GFkV 1 6,25
7 GLRaV-1 GFkV 3 18,75
GLRaV-1 GLRaV-3 2 18,75
GFLV GLRaV-3 1 6,25
0 (virus-tested) - 4 25 4
Zilavka 1 GLRaV-3 6 35,30 7
ArMV 1 5,88
2 GLRaV-3 GFkV 3 17,65
9 GLRaV-1 GLRaV-3 1 5,88
ArMV GLRaV-3 4 23,53
GFLV GLRaV-3 1 5,88
3 GFLV ArMV GLRaV-3 1 5,88 1
Total Result 106 % 106
Prilozi
135
Tablica 21. Rezultati detekcije virusa metodom RT-PCR u uzorcima vinove loze u kojima su
ELISA metodama detektirani virusi GLRaV-2 i GLRaV-4-9
Vinograd, položaj trsa u vinogradu te
naziv i oznaka kultivara
Šifra
uzorka
Virusna vrsta detektirana
reakcijom RT-PCR
Vinograd 20. Red 9 Krkošija 3 1 GLRaV-9 GLRaV-5 -
Vinograd 20. Red 11 Bena 2 2 GLRaV-9 - -
Vinograd 20. Red 2 Dobrogostina 3 3 - - GLRaV-2
Vinograd 20. Red 4 Krkošija (3 polje) 5 4 - - -
Vinograd 20. Red 13 Krkošija 5 5 - - -
Vinograd 20. red 15 Dobrogostina (2 polje) 5 6 - - -
Vinograd 20. red 15 Dobrogostina 4 7 - - -
Vinograd 20. red 2 Krkošija 4 8 GLRaV-9 - -
Vinograd 20. red 15 Dobrogostina 1 9 GLRaV-9 - -
Vinograd 20. red 11 (polje 4) Bena 3 10 - - -
Vinograd 20. red 13 Bena 4 11 - - -
Vinograd 20. red 15 Blatina 2 12 - - -
Vinograd 18. red 9 (I) Dobrogostina 6 (S) 13 - - -
Vinograd 14. tabla 3 red 4 Žilavka 1 14 - - -
Vinograd 15. tabla 4 red 5 Trnjak 11 15 - - -
Vinograd 15. tabla 4 red 5 Trnjak 12 16 - - -
Vinograd 15. tabla 4 red 5 Trnjak 1 17 GLRaV-9 GLRaV-5 -
Vinograd 15. tabla 4 red 5 Trnjak 2 18 - - -
Vinograd 6. red 5 Bena 21 19 - - -
Vinograd 6. red 5 Bena 6 20 - - -
Vinograd 6. red 5 Bena 24 21 - GLRaV-5 -
Vinograd 6. red 5 Bena 34 22 - GLRaV-5 -
Vinograd 3. red 3 Dobrogostina 13 23 - - -
Vinograd 13. red 61 Blatina 11 24 GLRaV-9 - -
Vinograd 13. red 11 Trnjak 24 25 - - -
Vinograd 16. Tabla 4 red 35 Bena 26 26 GLRaV-9 GLRa -5 -
Vinograd 16. Tabla 4 red 35 Bena 10 27 - GLRaV-5 -
Prilozi
136
Slika 13. Vizualizacija cDNA na agaroznom gelu nakon provedene reverzne transkripcije
izolirane RNA iz uzorka vinove loze oznake R 2 D 33 iz Višića.
Prilozi
137
Tablica 28. Prikaz rezultata detekcije devet virusa (GFLV, ArMV, GLRaV -1, GLRaV -2,
GLRaV -3, GLRaV -4-9, GFkV, GVA, GVB) serološkim metodama (ELISA) u svim
uzorcima autohtonih kultivara vinove loze uključenih u istraživanje. Uz svaki je izorak
navedena točna oznaka uzorka (pozicija u vinogradu), kao i oznaka lokacije (vinograda)
sukladno Tablici 18. Poglavlja 2.
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
1. 1. R 6 K 1 - - + - - - - - - 31. 2. R 14 D 13 + - - - + - - - -
2. 1. R 6 K 2 - - + - - - + - - 32. 2. R 43 D 4 + - - - + - - - -
3. 1. R 6 K 3 - - + - - - + - - 33. 2. R 43 D 3 + - - - + - - - -
4. 1. R 6 K 4 - - - + - + + - - 34. 2. UR 2 D 8 + - - - + - - - -
5. 1. R 6 K 5 - - + - - - - - - 35. 2. UR 2 D 3 + - - - + - - - -
6. 1. R 6 K 6 - - + - - - - - - 36. 2. UR 2 D 11 + - + - + - - - -
7. 1. R 6 K 7 - - + - - - - - - 37. 2. UR 2 D 5 + - - - + - - - -
8. 1. R 6 K 8 - - + - - - - - - 38. 2. UR 2 D 7 + - + - + - - - -
9. 1. R 6 K 9 - - + - - - - - - 39. 2. UR 3 D 2 + - + - + - - - -
10. 1. R 6 K 10 - - + - - - - - - 40. 2. UR 3 D 7 + - - - + - - - -
11. 1. R 6 K 11 - - + - - - - - - 41. 2. UR 1 D 1 + - - - + - - - -
12. 1. R 6 K 13 - - + - - - - - - 42. 2. R 7 D 11 + - + - + - - - -
13. 1. R 6 K 14 - - + - - - - - - 43. 2. UR 3 D 6 + - + - + - - - -
14. 1. R 6 K 15 - - + - - - - - - 44. 2. UR 1 T 7 + - - - + - - - -
15. 1. R 6 K 16 - - + - - - - - - 45. 2. UR 2 D 6 + - - - + - - - -
16. 1. R 6 K 17 - - + - - - + - - 46. 2. UR 2 D 10 + - - - + - - - -
17. 1. R 6 K 18 - - + - - + - - 47. 2. UR 2 D 1 + - - - + - - - -
18. 1. R 6 K 19 - - - - - + - - - 48. 2. UR 1 D 12 + - + - + - - - -
19. 1. R 6 K 20 - - + - - - - - - 49. 2. UR 1 D 11 + - - - + - - - -
20. 1. R 6 K 21 - - + - - - + - - 50. 2. UR 1 D 10 - - - - + - - - -
21. 1. R 6 K 22 - - + - - - - - - 51. 2. UR 1 D 13 + - - - + - - - -
22. 1. R 6 K 23 - - + - - - + - - 52. 2. UR 2 D 9 + - - - + - - - -
23. 1. R 6 K 24 - - + - - - - - - 53. 2. UR 2 D 2 + - + - + - - - -
24. 1. R 6 K 25 - - + - - - + - - 54. 2. UR 1 D 4 + - - - + - - - -
25. 1. R 6 K 26 - - + - - - + - - 55. 2. UR 1 D 6 + - - - + - - - -
26. 2. R 13 D 8 + - - - + - - - - 56. 2. UR 4 D 4 - - - - + - - - -
27. 2. R 11 D 2 + - - - + - - - - 57. 2. UR 1 D 3 - - - - + - - - -
28. 2. R 13 D 9 + - - - + - - - - 58. 2. UR 1 D 5 + - - - + - - - -
29. 2. R 10 D 10 + - - - + - - - - 59. 3. R 1 D 23 + - + - + - - - -
30. 2. R 11 D 5 + - - - + - - - - 60. 3. R 1 D 24 + - - - + - - - -
Prilozi
138
nastavak Tablice 28.
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
61. 3. R 2 D 6 + - + - + - - - - 98. 4. R 2 D 14 - - - - + - - - -
62. 3. R 2 D 17 + - - - + - - - - 99. 4. R 2 D 13 + - - - + - - - -
63. 3. R 2 D 19 + - - - + - - - - 100. 4. R 2 D 3 + - - - + - - - -
64. 3. R 2 D 23 + - - - + -- - - - 101. 4. R 3 D 6 - - - - - - - - -
65. 3. R 3 D 7 - - + - + - - - - 102. 4. R 4 D 16 + - - - + - - - -
66. 3. R 3 D 11 + - - - + - - - - 103. 4. R 3 D 18 - - - - + - - - -
67. 3. R 3 D 13 + - + - + + - - - 104. 4. R 3 D 11 - - - - + - - - -
68. 3. R 3 D 20 + - - - + - - - - 105. 4. R 3 D 9 - - - - + - - - -
69. 3. R 4 D 1 + - - - + - + - - 106. 4. R 3 D 14 + - - - + - - - -
70. 3. R 4 D 2 - - + - + - - - - 107. 4. R 4 D 13 - - - - - - - - -
71. 3. R 4 D 4 + - - - + - - - - 108. 4. R 4 D 9 - - - - + - - - -
72. 3. R 4 D 6 + - + - + - + - - 109. 4. R 4 D 12 - - - - + - - - -
73. 3. R 4 D 8 + - + - + - + - - 110. 4. R 8 D 13 - - - - + - - - -
74. 3. R 4 D 10 + - + - + - - - - 111. 4. R 8 D 9 - - - - - - - - -
75. 3. R 4 D 16 + - + - + - - - - 112. 4. R 7 D 12 - - - - + - - - -
76. 4. R 11 K 8 + - + - + - - - - 113. 4. R 0 GOMILA D + - + - - - - - -
77. 4. R 11 K 15 + - - - + - - - - 114. 4. R 6 D15 - - - - + - - - -
78. 4. R 10 K 4 + - - - + - - - - 115. 4. R 8 D 7 - - - - + - - - -
79. 4. R 11 K 5 + - + - + - - - - 116. 4. R 8 D 16 + - - - + - - - -
80. 4. R 11 K 7 + - + - + - - - - 117. 4. R 6 D 3 + - - - + - - - -
81. 4. R 11 K 6 - - + - + - - - - 118. 4. R 6 D 4 - - - - - - - - -
82. 4. R 10 K 6 - - + - + - - - - 119. 4. R 7 D 8 - - - - + - - - -
83. 4. R 10 K 15 + - - - + - - - - 120. 4. R 6 D 13 - - - - + - - - -
84. 4. R 10 K 3 + - - - + - - - - 121. 4. R 6 D 10 - - - - + - - - -
85. 4. R 10 K 2 + - - - + - - - - 122. 4. R 5 D 16 - - - - + - - - -
86. 4. R 11 K 11 + - + - + - - - - 123. 4. R 6 D 16 - - - - - - - - -
87. 4. R 11 K 10 + - + - + - - - - 124. 4. R 5 D 10 - - - - + - - - -
88. 4. R 10 K 14 + - - - + - - - - 125. 4. R 6 D 6 - - - - - - - - -
89. 4. R 2 D 6 + - - - + - - - - 126. 4. R 5 D 17 - - - - + - - - -
90. 4. R 3 D 4 - - + - + - - - - 127. 4. R 5 D 5 - - - - + - - - -
91. 4. R 3 D 3 - - + - + - - - - 128. 4. R 5 D 8 - - - - + - - - -
92. 4. R 3 D 12 + - - - + - - - - 129. 4. R 6 D 11 - - - - - - - - -
93. 4. R 2 D 10 - - - - + - - - - 130. 4. R 6 D 5 - - - - + - - - -
94. 4. R 2 D 7 + - - - + - - - - 131. 5. T 12 R 13 Bl 5 + - - - + - + - -
95. 4. R 2 D 9 - - - - + - - - - 132. 5. T 12 R 13 Bl 2 + - - - + - - - -
96. 4. R 2 D 4 - - - - + - - - - 133. 5. T 12 R 13 Bl 4 + - - - + - - - -
97. 4. R 1 D 4 + - - - + - - - - 134. 5. T 12 R 13 Bl 1 + - - - - - - - -
Prilozi
139
nastavak Tablice 28. R
edn
i b
roj
uzo
rka
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
135. 5. T 12 R 13 Bl 10 + - - - + - - - - 172. 5. T 12 R 15 Bl 4 + - + - - - - - -
136. 5. T 12 R 13 Bl 12 + - - - + - - - - 173. 5. T 12 R 15 Bl 9 + - - - - - + - -
137. 5. T 12 R 13 Bl 6 + - - - + - + - - 174. 5. T 12 R 15 Bl 8 + - - - - - - - -
138. 5. T 12 R 13 Bl 15 + - - - + - + - - 175. 5. T 12 R 15 Bl 31 + - - - + - - - -
139. 5. T 12 R 13 Bl 11 + - - - + - - - - 176. 5. T 12 R 15 Bl 30 + - - - - - - - -
140. 5. T 12 R 13 Bl 7 + - - - + - - - - 177. 5. T 12 R 15 Bl 7 + - + - - - - - -
141. 5. T 12 R 13 Bl 8 + - - - + - + - - 178. 5. T 12 R 15 Bl 29 + - - - - - - - -
142. 5. T 12 R 13 Bl 16 - - + - - - - - 179. 5. T 12 R 15 Bl 18 + - - - - - - - -
143. 5. T 12 R 13 Bl 3 + - - - - - + - - 180. 5. T 12 R 15 Bl 16 + - - - + - - - -
144. 5. T 12 R 13 Bl 27 - - - - - - - - - 181. 5. T 12 R 15 Bl 20 + - - - - - - - -
145. 5. T 12 R 13 Bl 18 + - - - - - - - - 182. 5. T 12 R 15 Bl 21 + - - - - - - - -
146. 5. T 12 R 13 Bl 21 + - - - + - + - - 183. 5. T 12 R 15 Bl 19 + - - - + - - - -
147. 5. T 12 R 13 Bl 9 + - - - + + + - - 184. 5. T 12 R 15 Bl 17 + - - - - - - - -
148. 5. T 12 R 13 Bl 19 + - - - + - - - - 185. 5. T 12 R 15 Bl 23 + - - - - - - - -
149. 5. T 12 R 13 Bl 17 + - - - - - - - - 186. 5. T 12 R 15 Bl 27 + - - - + - - - -
150. 5. T 12 R 13 Bl 26 + - - - - - - - - 187. 5. T 12 R 15 Bl 22 + - - - - - - - -
151. 5. T 12 R 13 Bl 20 + - - - - - + - - 188. 5. T 12 R 15 Bl 25 + - - + - - - -
152. 5. T 12 R 13 Bl 24 + - - - - - - - - 189. 5. T 12 R 15 Bl 26 + - - - - - - - -
153. 5. T 12 R 13 Bl 23 + - + - - - - - - 190. 5. T 12 R 15 Bl 32 + - - - + - - - -
154. 5. T 12 R 13 Bl 22 + - - - + - + - - 191. 6. R 5 Be 1 - - - - + - - - -
155. 5. T 12 R 13 Bl 25 + - - - + - - - - 192. 6. R 5 Be 2 - - - - + - - - -
156. 5. T 12 R 13 Bl 13 + - + - - - - - - 193. 6. R 5 Be 3 - - - - + - - - -
157. 5. T 16 R 2 T 30 - - - - - - - - - 194. 6. R 5 Be 4 - - - - + - - - -
158. 5. T 16 R 2 T 27 - - + - - - - - - 195. 6. R 5 Be 6 - - - - + + - - -
159. 5. T 16 R 2 T 29 - - - - - - - - - 196. 6. R 5 Be 7 - - - - + - - - -
160. 5. T 16 R 2 T 23 - - - - - - - - - 197. 6. R 5 Be 8 - - - - + - - - -
161. 5. T 16 R 2 T 28 + - - - - - - - - 198. 6. R 5 Be 9 - - - - + - - - -
162. 5. T 16 R 2 T 6+3 - - + - - - - - - 199. 6. R 5 Be 10 - - - - + - - - -
163. 5. T 16 R 2 T 13 + - + - - - - - - 200. 6. R 5 Be 11 - - - - + - - - -
164. 5. T 16 R 2 T 12 + - - - - - - - - 201. 6. R 5 Be 12 - - - - + - - - -
165. 5. T 12 R 15 Bl 11 + - - - + - - - - 202. 6. R 5 Be 13 - - - - + - - - -
166. 5. T 12 R 15 Bl 14 + - - - + - + - - 203. 6. R 5 Be 14 - - + - + - - - -
167. 5. T 12 R 15 Bl 2 + - - - - - - - - 204. 6. R 5 Be 15 - - - - + - - - -
168. 5. T 12 R 15 Bl 12 + - - - + - - - - 205. 6. R 5 Be 16 - - + - + - - - -
169. 5. T 12 R 15 Bl 5 + - - - + - - - - 206. 6. R 5 Be 18 - - - - + - - - -
170. 5. T 12 R 15 Bl 1 + - - - + - - - - 207. 6. R 5 Be 19 - - - - + - - - -
171. 5. T 12 R 15 Bl 3 + - + - - + + - - 208. 6. R 5 Be 20 - - + - + - + - -
Prilozi
140
nastavak Tablice 28. R
edn
i b
roj
uzo
rka
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
209. 6. R 5 Be 21 - - - - + + - - - 246. 6. R 10 T 27 - - - - + - - - -
210. 6. R 5 Be 22 - - - - + - - - - 247. 6. R 10 T 31 - - - - - - - - -
211. 6. R 5 Be 23 - - - - + - - - - 248. 6. R 10 T 33 - - - - - - - - -
212. 6. R 5 Be 24 + - - - + + - - - 249. 6. R 10 T 35 - - - - - - - - -
213. 6. R 5 Be 25 - - - - + - - - - 250. 6. R 10 T 37 - - - - - - - - -
214. 6. R 5 Be 26 - - - - + - - - - 251. 7. R 7 Be 30 + - - - + - - - -
215. 6. R 5 Be 27 - - + - + - - - - 252. 7. R 7 Be 31 + - - - + - + - -
216. 6. R 5 Be 28 - - + - + - - - - 253. 7. R 7 Be 32 + - - - + - - - -
217. 6. R 5 Be 29 - - - - + - - - - 254. 7. R 5 (6) Be 7 + - + - - - - - -
218. 6. R 5 Be 30 - - - - + - + - - 255. 7. R 7 Be 6 + - - - + - - - -
219. 6. R 5 Be 31 - - + - + - - - - 256. 7. R 6 (7) Be 15 + - - - + - - - -
220. 6. R 5 Be 33 - - - - + - - - - 257. 7. R 7 Be 15 - - - - - - - - -
221. 6. R 5 Be 34 - - + - + - + - - 258. 7. R 7 Be 12 + - - - + - + - -
222. 6. R 5 Be 36 - - + - + - + - - 259. 7. R 7 Be 16 - - + - + - - - -
223. 6. R 5 Be 37 + - - - + - - - - 260. 7. R 7 Be 7 - - - - + - - - -
224. 6. R 5 Be 38 - - - - + - - - - 261. 7. R 6 (7) Be 2 + - - - + - - - -
225. 6. R 5 Be 39 - - + - + - + - - 262. 7. R 6 (7) Be 6 + - + - + - + - -
226. 6. R 5 Be 40 + - - - + - - - - 263. 7. R 6 (7) Be 17 - - - - + - - - -
227. 6. R 5 Be 41 - - - - + - - - - 264. 7. R 6 (7) Be 12 + - + - + + - - -
228. 6. R 10 T 1 - - + - - - - - - 265. 7. R 7 Be 1 + - - - + - - - -
229. 6. R 10 T 2 - - - - - - - - - 266. 7. R 7 Be 4 + - + - - - - - -
230. 6. R 10 T 3 - - - - + - - - - 267. 7. R 7 Be 9 + - - - + - + - -
231. 6. R 10 T 5 - - - - - - - - - 268. 7. R 7 Be 23 + - - - + - - - -
232. 6. R 10 T 6 - - + - - - + - - 269. 7. R 7 Be 25 + - - - + - - - -
233. 6. R 10 T 9 - - - - - - - - - 270. 7. R 6 (7) Be 26 + - - - - - - - -
234. 6. R 10 T 10 - - - - - - - - - 271. 7. R 7 Be 33 - - - - - - - - -
235. 6. R 10 T 11 - - + - - - - - - 272. 7. R 7 Be 29 + - - - - - - - -
236. 6. R 10 T 12 + - - - + - - - - 273. 7. R 7 Be 8 - - - - + - + - -
237. 6. R 10 T 13 - - - - - - - - - 274. 7. R 7 Be 18 - - - - + - + - -
238. 6. R 10 T 14 - - + - - - - - - 275. 7. R 7 Be 20 + - + - - - - - -
239. 6. R 10 T 15 - - + - - - - - - 276. 7. R 7 Be 10 - - - - + - + - -
240. 6. R 10 T 19 - - - - + - - - - 277. 7. R 7 Be 13 - - - - - - - - -
241. 6. R 10 T 20 - - - - + - - - - 278. 7. R 7 Be 28 + - - - + + + - -
242. 6. R 10 T 21 - - - - - - - - - 279. 7. R 7 Be 24 + - - - - - - - -
243. 6. R 10 T 23 - - + - - - - - - 280. 8. R1 K 1 - - + - + - - - -
244. 6. R 10 T 24 - - - - + - - - - 281. 8. R1 K 2 - - - - + - - - -
245. 6. R 10 T 25 - - - - - - - - - 282. 8. R1 K 27 + - - - + + + - -
Prilozi
141
nastavak Tablice 28.
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
283. 8. R1 K 32 + - - - - - - - - 323. 9. R 6 Ž 31 - - - - - - - - -
284. 8. R1 K 36 + - + - + + - - - 324. 9. R 6 Ž 2 - - + - + - - - -
285. 8. R1 K 37 + - - - - - - - - 325. 9. R 6 Ž 29 - - - - - - - - -
286. 8. R1 K 41 + + - + - - - - 326. 9. R 6 Ž 6 + - - - + - - - -
287. 8. R1 K 44 - - + - + - - - - 327. 9. R 6 Ž 23 + - - - + - - - -
288. 8. R1 K 45 - - + - - - - - - 328. 9. R 6 Ž 13 - - - - + - - - -
289. 8. R1 K 46 + - + - + + - - - 329. 9. R 6 Ž 20 - - - - + - - - -
290. 8. R1 K 47 - - + - + - - - - 330. 9. R 6 Ž 25 - - - - + - - - -
291. 8. R1 K 51 - - + - + - - - - 331. 9. R 6 Ž 9 + - - - + - - - -
292. 8. R1 K 52 + - + - + + - - - 332. 9. R 6 Ž 17 - - + - - - - - -
293. 8. R1 K 54 - - + - + - - - - 333. 9. R 6 Ž 21 - - - - + - - - -
294. 8. R1 K 55 - - - - + - - - - 334. 9. R 6 Ž 11 - - - - + - - - -
295. 8. R1 K 56 - - - - + - - - - 335. 9. R 6 Ž 16 - - - - - - - - -
296. 8. R1 K 58 - - - - + - - - - 336. 9. R 6 Ž 33 - - - - + - - - -
297. 8. R1 K 59 - - + - - - - - 337. 9. R 6 Ž 10 - - - - - - - - -
298. 8. R1 K 60 + - - - + - - - - 338. 9. R 6 Ž 28 - - - - + - - - -
299. 8. R1 K 64 - - + - + - - - - 339. 9. R 6 Ž 1 + - - - - - - - -
300. 8. R1 K 65 + - + - + + - - - 340. 9. R 11 Bl 10 - - - - + - - - -
301. 8. R1 K 67 - - + - + - - - - 341. 9. R 11 Bl 6 - - - - + - - - -
302. 8. R1 K 69 - - + - + - - - - 342. 9. R 4 Bl 9 - - - - - - - - -
303. 8. R1 K 75 + - + - + - - - - 343. 9. R 4 Bl 1 + - - - - - - - -
304. 8. R1 K 76 - - + - + - - - - 344. 9. R 6 Bl 5 - - - - - - - - -
305. 8. R1 K 78 + - - - + - - - - 345. 9. R 3 Bl 6 - - - - - - + - -
306. 8. R1 K 79 - - - - + - - - - 346. 9. R 7 Bl 1 + - - - - - + - -
307. 8. R1 K 81 - - + - + - + - - 347. 9. R 11 Bl 7 + - - - + - - - -
308. 8. R1 K 87 + - + - + - - - - 348. 9. R 6 Bl 4 - - + - - - - - -
309. 8. R1 K 102 + - + - + - - - - 349. 9. R 11 Bl 4 - - + - - - - - -
310. 8. R1 K 109 - - + - + - - - - 350. 9. R 3 Bl 4 - - - - - - - -
311. 8. R1 K 111 - - + - + - - - - 351. 9. R 4 Bl 5 + - - - + - - - -
312. 8. R1 K 112 - - + - + - - - 352. 9. R 1 Bl 8 + - - - + - - - -
313. 8. R1 K 113 + - + - + + - - - 353. 9. R 5 Bl 1 + - - - + - - - -
314. 8. R1 K 114 - - + - + - - - - 354. 9. R 4 Bl 4 - - - - + - - - -
315. 8. R1 K 115 - - - - + - - - - 355. 9. R 4 Bl 2 - - - - - - - - -
316. 8. R1 K 118 + - - - + - - - - 356. 9. R 4 Bl 10 + - - - - - - - -
317. 8. R1 K 122 + - + - + - - - - 357. 9. R 5 Bl 6 - - - - + - - - -
318. 8. R1 K 124 - - + - - - - - 358. 9. R 3 Bl 5 - - - - + - - - -
319. 8. R1 K 128 + - - - + - + - - 359. 10. R 1 T 51 + - - - - - - - -
320. 8. R1 K 132 + - - - + - - - - 360. 10. R 1 T 47 + - + - - - - - -
321. 8. R1 K 135 + - + - + - - - - 361. 10. R 1 T 45 + - - - - - - - -
322. 8. R 1 K 144 + - - - - - - - - 362. 10. R 1 T 44 + - - - - - - - -
Prilozi
142
nastavak Tablice 28. R
edn
i b
roj
uzo
rka
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
363. 10. R 1 T 46 + - - - - - - - - 400. 10. R 1 T 32 + - + - - - - - -
364. 10. R 1 T 50 + - - - - - - - - 401. 10. R 1 T 20 + - - - - - - -
365. 10. R 1 T 43 + - + - + - - - - 402. 10. R 1 T 29 + - + - - - - - -
366. 10. R 1 T 49 + - - - - - - - - 403. 10. R 1 T 6 - - - - - - - - -
367. 10. R 1 T 3 - - - - - - - - - 404. 10. R 1 T 8 - - - - + - - - -
368. 10. R 1 T 55 + - - - - - - - - 405. 10. R 1 T 5 - - - - - - - - -
369. 10. R 1 T 52 + - - - - - - - - 406. 10. R 1 T 22 + - - - - - - - -
370. 10. R 1 T 48 + - - - - - - - - 407. 10. R 1 T 23 + - - - - - - - -
371. 10. R 1 T 53 + - - - + - - - - 408. 10. R 1 T 4 - - - - - - - - -
372. 10. R 1 T 54 - - - - - - - - - 409. 10. R 1 T 28 + - + - - - - - -
373. 10. R 1 T 27 + - + - - - - - - 410. 10. R 1 T 10 - - - - + - - - -
374. 10. R 1 T 35 + - + - + - - - - 411. 10. R 1 T 39 + - + - + - - - -
375. 10. R 1 T 36 + - + - + - - - - 412. 11. R 5 T 11 + - + - - - - - -
376. 10. R 1 T 34 + - + - + - - - - 413. 11. R 5 T 14 + - - - - - - - -
377. 10. R 1 T 38 + - + - + - - - - 414. 11. R 5 T 15 - - - - - - - - -
378. 10. R 1 T 37 + - + - + - - - - 415. 11. R 5 T 6 - - - - - - - -
379. 10. R 1 T 41 + - + - + - - - - 416. 11. R 5 T 8 - - - - - - - - -
380. 10. R 1 T 18 + - - - - - - - - 417. 11. R 5 T 4 - - - - - - - - -
381. 10. R 1 T 42 + - + - + - - - - 418. 11. R 5 T 13 - - - - - - - - -
382. 10. R 1 T 17 + - - - - - - - - 419. 11. R 5 T 12 + - - - - - - - -
383. 10. R 1 T 40 + - + - + - - - - 420. 11. R 5 T 17 - - - - + - - - -
384. 10. R 1 T 19 + - - - - - - - - 421. 11. R 5 T 10 + - + - - - - - -
385. 10. R 1 T 21 + - - - - - - - - 422. 11. R 5 T 1 - - + - - - - - -
386. 10. R 1 T 16 + - - - - - - - - 423. 11. R 5 T 3 - - - - - - - - -
387. 10. R 1 T 26 + - + - - - - - - 424. 11. R 5 T 2 - - + - - - - - -
388. 10. R 1 T 25 + - - - - - - - - 425. 11. R 5 T 9 + - - - - - - - -
389. 10. R 1 T 15 + - - - - - - - - 426. 11. R 5 T 5 - - - - - - + - -
390. 10. R 1 T 12 + - - - - - - - - 427. 12. R 1 Ž 1 + - - - + - - - -
391. 10. R 1 T 7 - - - - + - - - - 428. 12. R 1 Ž 2 - - - - + - - - -
392. 10. R 1 T 13 + - - - - - - - - 429. 12. R 1 Ž 3 - - - - + - - - -
393. 10. R 1 T 11 + - - - - - - - - 430. 12. R 1 Ž 4 + - - - + - + - -
394. 10. R 1 T 31 + - + - - - - - - 431. 12. R 1 Ž 5 - - - - + - - - -
395. 10. R 1 T 30 + - + - - - - - - 432. 12. R 1 Ž 6 - - - - + - - - -
396. 10. R 1 T 33 + - + - - - - - - 433. 12. R 1 Ž 7 - - - - + - - - -
397. 10. R 1 T 24 + - - - - - - - - 434. 12. R 1 Ž 8 - - - - + - - - -
398. 10. R 1 T 9 - - - - + - - - - 435. 12. R 1 Ž 9 - - - - + - - - -
399. 10. R 1 T 14 + - - - - - - - - 436. 12. R 1 Ž 10 - - + - + - - - -
Prilozi
143
nastavak Tablice 28. R
edn
i b
roj
uzo
rka
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
437. 12. R 1 Ž 11 - - + - + - + - - 474. 13. R 61 Bl 6 + - - - + - - - -
438. 12. R 1 Ž 12 - - - - + - - - - 475. 13. R 61 Bl 3 + - - - + - + - -
439. 12. R 1 Ž 13 - - - - + - + - - 476. 13. R 59 Bl 12 - - - - - - - - -
440. 12. R 1 Ž 14 - - + - + - + - - 477. 13. R 61 Bl 4 - - - - + - - - -
441. 12. R 1 Ž 15 - - + - + - + - - 478. 13. R 61 Bl 5 + - - - - - - -
442. 12. R 1 Ž 16 - - - - + - - - - 479. 13. R 61 Bl 7 + - - - + - - - -
443. 12. R 1 Ž 17 - - - - + - + - - 480. 13. R 61 Bl 8 + - - - + - + - -
444. 12. R 1 Ž 18 - - - - + - - - - 481. 13. R 61 Bl 9 - - - - + - + - -
445. 12. R 1 Ž 19 - - - - + - - - - 482. 13. R 61 Bl 10 + - - - + - - - -
446. 12. R 1 Ž 20 - - + - + - - - - 483. 13. R 59 Bl 7 + - - - + - - - -
447. 12. R 1 Ž 21 - - - - + - - - - 484. 13. R 61 Bl 11 + - - - + + + - -
448. 12. R 1 Ž 22 - - - - + - + - - 485. 13. R 56 Bl 5 - - - - + - - - -
449. 12. R 1 Ž 23 + - - - + - + - - 486. 13. R 58 Bl 6 + - - - + - - - -
450. 12. R 1 Ž 24 - - - - + - - - - 487. 13. R 58 Bl 5 + - - - + - + - -
451. 12. R 1 Ž 25 - - - - + - - - - 488. 13. R 55 Bl 2 - - - - + - - - -
452. 12. R 1 Ž 27 - - + - + - - - - 489. 13. R 56 Bl 3 - - - - + - - - -
453. 12. R 1 Ž 28 - - + - + - - - - 490. 13. R 58 Bl 4 - - - - + - - - -
454. 12. R 1 Ž 29 - - - - + - - - - 491. 13. R 55 Bl 7 + - - - + - + - -
455. 12. R 1 Ž 30 - - - - + - - - - 492. 13. R 55 Bl 4 - - - + - - - -
456. 13. R 56 Bl 2 - - - - + - - - - 493. 13. R 55 Bl 8 + - - - + - + - -
457. 13. R 58 Bl 12 - - - - + - + - - 494. 13. R 55 Bl 6 + - - - + - + - -
458. 13. R 55 Bl 11 + - - - + - + - - 495. 13. R 55 Bl 3 + - - - + - + - -
459. 13. R 56 Bl 6 - - - - + - - - - 496. 13. R 56 Bl 9 - - - - + - - - -
460. 13. R 59 Bl 6 + - - - + - - - - 497. 13. R 58 Bl 10 + - - - + - + - -
461. 13. R 58 Bl 7 + - - - + - - - - 498. 13. R 56 Bl 4 - - - - + - - - -
462. 13. R 59 Bl 8 + - - - + - + - - 499. 13. R 56 Bl 12 - - - - + - + - -
463. 13. R 58 Bl 11 + - - - + - + - - 500. 13. R 56 Bl 8 - - - - + - + - -
464. 13. R 59 Bl 13 + - - - + - + - - 501. 13. R 56 Bl 7 - - - - + - - - -
465. 13. R 59 Bl 2 - - - - + - - - - 502. 13. R 56 Bl 10 + - - - + - - - -
466. 13. R 58 Bl 1 - - - - + - - - - 503. 13. R 55 Bl 14 - - - - + - - - -
467. 13. R 58 Bl 2 + - - - + - - - - 504. 13. R 55 Bl 13 - - - - + - - - -
468. 13. R 59 Bl 4 + - - - + - + - - 505. 13. R 55 Bl 1 - - - - + - - - -
469. 13. R 59 Bl 5 - - - - + - - - - 506. 13. R 11 T 16 - - + - - - + - -
470. 13. R 59 Bl 11 - - + - + - - - - 507. 13. R 11 T 19 + - - - + - - - -
471. 13. R 59 Bl 9 + - + - + - + - - 508. 13. R 11 T 22 + - + - - - - - -
472. 13. R 59 Bl 1 - - - - + + - - - 509. 13. R 11 T 10 - - - - + - + - -
473. 13. R 61 Bl 2 - - - - + - - - - 510. 13. R 11 T 21 + - - - + - - - -
Prilozi
144
nastavak Tablice 28.
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
511. 13. R 11 T 24 - - + - - + + - - 548. 13. R 8 T 3 - - - - - - - - -
512. 13. R 11 T 13 - - - - + - - - - 549. 13. R 9 T 17 + - + - - - - - -
513. 13. R 11 T 6 + - - - - - - - - 550. 13. R 9 T 6 - - + - - - - - -
514. 13. R 11 T 3 - - + - + + - - 551. 13. R 8 T 1 - - - - - - - - -
515. 13. R 11 T 4 + - - - + - - - - 552. 13. R 8 T 2 + - - - - - - - -
516. 13. R 11 T 9 + - - - - - + - - 553. 13. R 10 T 14 + - + - - - - - -
517. 13. R 11 T 8 + - - - - - - - - 554. 13. R 8 T 4 + - - - - + + - -
518. 13. R 10 T 21 - - - - + - + - - 555. 13. R 8 T 9 + - - - - - - - -
519. 13. R 10 T 19 + - - - - - - - - 556. 13. R 3 Ž 12 - - - - - - - - -
520. 13. R 10 T 16 - - - - - - - - - 557. 13. R 2 Ž 4 - - - - + - - - -
521. 13. R 10 T 25 - - - - + - - - - 558. 13. R 4 Ž 3 - - - - + - - - -
522. 13. R 10 T 17 + - - - - - - - - 559. 13. R 4 Ž 7 - - - - + - - - -
523. 13. R 10 T 20 - - + - - - - - - 560. 13. R 2 Ž 1 - - - - + - - - -
524. 13. R 10 T 12 - - + - - - - - - 561. 13. R 2 Ž 2 - - - - + - - - -
525. 13. R 10 T 24 - - - - + - + - - 562. 13. R 2 Ž 3 - - - - - - - - -
526. 13. R 10 T 22 - - + - - - + - - 563. 13. R 3 Ž 8 - - - - + - - - -
527. 13. R 10 T 5 - - - - - - - - 564. 13. R 3 Ž 7 - - - - + - - - -
528. 13. R 10 T 7 - - + - - - - - - 565. 13. R 3 Ž 6 - - - - + - - - -
529. 13. R 10 T 6 + - - - - - - - - 566. 13. R 3 Ž 9 - - - - + - - - -
530. 13. R 10 11 - - - - - - - - - 567. 13. R 5 Ž 17 + - - - - - - - -
531. 13. R 9 T 5 - - - - + - - - - 568. 13. R 5 Ž 15 - - - - + - - - -
532. 13. R 10 T 10 - - + - + - + - - 569. 13. R 5 Ž 14 - - - - + - - - -
533. 13. R 9 T 11 - - + - - + - - - 570. 13. R 4 Ž 6 - - - - + - - - -
534. 13. R 9 T 16 - - + - - + - - - 571. 13. R 4 Ž 5 - - - - + + - - -
535. 13. R 9 T 14 - - - - - - - - 572. 13. R 4 Ž 4 - - - - + - - - -
536. 13. R 10 T 4 + - - - + - - - - 573. 13. R 9 Ž 16 - - - - + - - - -
537. 13. R 10 T 15 - - - - + - + - - 574. 13. R 6 Ž 23 - - - - - - - - -
538. 13. R 10 T 13 + - + - - - - - - 575. 13. R 6 Ž 25 - - - - + - - - -
539. 13. R 9 T 10 - - - - - - - - - 576. 13. R 6 Ž 22 - - - - + - - -
540. 13. R 9 T 3 - - - - - - - - - 577. 13. R 6 Ž 24 - - - - + - - - -
541. 13. R 9 T 18 - - - - - - + - - 578. 13. R 9 Ž 18 - - - - + - - - -
542. 13. R 8 T 11 - - - - - - - - 579. 13. R 9 Ž 22 - - - - + - - - -
543. 13. R 9 T 15 + - - - - - + - - 580. 13. R 8 Ž 21 - - - - + - - - -
544. 13. R 8 T 8 - - - - + - - - - 581. 13. R 8 Ž 18 - - - - + - - - -
545. 13. R 8 T 10 - - - - - - + - - 582. 13. R 6 Ž 26 - - - - + - - - -
546. 13. R 8 T 6 - - - - + - - - - 583. 13. R 7 Ž 4 - - - - + - + - -
547. 13. R 8 T 7 + - - - - - + - - 584. 13. R 9 Ž 21 - - + - + - - - -
Prilozi
145
nastavak Tablice 28. R
edn
i b
roj
uzo
rka
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
585. 13. R 7 Ž 5 - - - - + - - - - 625. 14. 1 R 2 Ž 13 - - - - + - - - -
586. 13. R 7 Ž 9 - - - - + - - - - 626. 14. T 1 R 14 Ž 4 - - - - + - - - -
587. 13. R 7 Ž 6 - - - - + - - - - 627. 14. T 1 R 14 Ž 9 - - - - + - - - -
588. 13. R 7 Ž 7 - - - - + + - - - 628. 14. T 1 R 14 Ž 6 - - - - + - - - -
589. 13. R 11 Ž 4 - - - - + - - - - 629. 14. T 1 R 14 Ž 10 - - - - + - - - -
590. 13. R 10 Ž 11 - - - - + - - - - 630. 14. T 1 R 14 Ž 11 - - - - + - - - -
591. 13. R 10 Ž 14 - - - - + - - - - 631. 14. T 1 R 14 Ž 8 - - - - + - - - -
592. 13. R 10 Ž 10 - - - - - + - - - 632. 14. T 1 R 14 Ž 5 - - - - + - - - -
593. 13. R 8 Ž 23 - - - - + - - - - 633. 14. T 1 R 14 Ž 12 - - - - + - - - -
594. 13. R 10 Ž 16 - - - - + - - - - 634. 14. T 1 R 19 Ž 6 - - - - + - - - -
595. 13. R 11 Ž 2 - - - - + - + - - 635. 14. T 1 R 19 Ž 3 - - - - + - - - -
596. 13. R 8 Ž 19 - - - - + - - - - 636. 14. T 1 R 19 Ž 5 - - - - + - - - -
597. 13. R 8 Ž 20 - - - - - - - - - 637. 14. T 1 R 19 Ž 11 - - - - + - - - -
598. 13. R 9 Ž 20 - - - - + - - - - 638. 14. T 1 R 1 Ž 8 + - - - - - - - -
599. 13. R 11 Ž 6 - - - - + - - - - 639. 14. T 1 R 19 Ž 13 - - - - + - - - -
600. 14. T 2 R 18 Bl 1 - - + - - - - - - 640. 14. T 1 R 19 Ž 9 - - - - + - - - -
601. 14. T 1 R 2 Bl 6 - - - - - - - - - 641. 14. T 1 R 19 Ž 7 - - - - + - - - -
602. 14. T 1 R 15 Bl 3 - - - - + - - - - 642. 14. T 3 R 2 Ž 22 - - + - + - + - -
603. 14. T 2 R 21 Bl 36 + - - - + - - - - 643. 14. T 3 R 4 Ž 1 - - - - + + + - -
604. 14. T 2 R 24 Bl 12 + - - - + - - - - 644. 14. T 3 R 4 Ž 4 - - + - + - - - -
605. 14. T 2 R 21 Bl 93 + - - - + - - - - 645. 14. T 3 R 4 Ž 6 - - - - + - - - -
606. 14. T 2 R 24 Bl 100 + - - - + - - - - 646. 14. T 3 R 4 Ž 9 - - - - + - - - -
607. 14. T 2 R 24 Bl 70 + - - - + - - - - 647. 14. T 3 R 2 Ž 21 + - + - + - - - -
608. 14. T 2 R 21 Bl 11 - + - - - - - 648. 14. T 3 R 4 Ž 8 - - - - + - - - -
609. 14. T 2 R 21 Bl 14 + - - - + - - - - 649. 14. T 3 R 4 Ž 7 - - - - + - - - -
610. 14. T 2 R 21 Bl 36 - - - - - - - - - 650. 14. T 3 R 4 Ž 2 - - + - + - - - -
611. 14. T 2 R 21 Bl 30 + - - - + - - - - 651. 14. T 3 R 4 Ž 5 - - + - + - - - -
612. 14. T 2 R 21 Bl 10 + - - - + - - - - 652. 14. T 3 R 2 Ž 19 - - - - + - - - -
613. 14. T 2 R 24 Bl 50 + - - - + - - - - 653. 14. T 3 R 2 Ž 9 - - - - + - - - -
614. 14. T 2 R 24 Bl 108 + - + - + - - - - 654. 14. T 3 R 2 Ž 15 - - + - + - + - -
615. 14. T 1 R 2 Bl 3 - - - - + - - - - 655. 14. T 3 R 2 Ž 11 - - - - + - - - -
616. 14. T 2 R 21 Bl 7 + - + - + - - - - 656. 14. T 3 R 2 Ž 12 - - - - + - - - -
617. 14. T 2 R 39 Bl 52 - - - - - - - - - 657. 14. T 3 R 2 Ž 10 - - + - + - - - -
618. 14. T 2 R 18 Bl 1 - - + - - - - - - 658. 14. T 3 R 2 Ž 16 - - - - + - - - -
619. 14. T 1 R 2 Ž 5 - - - - + - - - - 659. 14. T 3 R 2 Ž 18 - - + - + - + - -
620. 14. T 1 R 2 Ž 6 - - - - - - - - - 660. 14. T 3 R 2 Ž 13 - - - - + - - - -
621. 14. T 1 R 2 Ž 8 - - - - + - - - - 661. 14. T 3 R 2 Ž 17 - - - - + - + - -
622. 14. T 1 R 2 Ž 9 - - - - + - - - - 662. 14. T 3 R 2 Ž 20 - - - - + - - - -
623. 14. T 1 R 2 Ž 10 - - - - + - - - - 663. 14. T 3 R 2 Ž 6 - - - - + - - - -
624. 14. T 1 R 2 Ž 12 - - - - + - - - - 664. 14. T 3 R 2 Ž 4 - - + - + - - - -
Prilozi
146
nastavak Tablice 28.
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
665. 14. T 3 R 2 Ž 8 - - + - + - + - - 707. 14. T 3 R 9 Bl 28 - - - - - - - - -
666. 14. T 3 R 2 Ž 1 - - - - + - + - - 708. 14. T 3 R 9 Bl 25 - - - - + - + - -
667. 14. T 3 R 2 Ž 2 - - - - + - - - - 709. 14. T 3 R 9 Bl 22 - - - - - - + - -
668. 14. T 3 R 2 Ž 7 - - + - - - - - - 710. 14. T 3 R 7 Ž 32 + - - - + - - - -
669. 14. T 3 R 2 Ž 3 + - - - + - - - - 711. 14. T 3 R 7 Ž 17 + - - - - - - - -
670. 14. T 3 R 12 Bl 12 - - + - + - - - - 712. 14. T 3 R 7 Ž 22 + - - - + - - - -
671. 14. T 3 R 12 Bl 14 + - + - + - - - - 713. 14. T 3 R 7 Ž 31 + - - - + - - - -
672. 14. T 3 R 12 Bl 3 + - - - + - - - - 714. 14. T 3 R 7 Ž 33 + - - - + - - - -
673. 14. T 3 R 12 Bl 22 + - + - + - - - - 715. 14. T 3 R 7 Ž 25 + - - - + - - - -
674. 14. T 3 R 12 Bl 24 - - - - + - + - - 716. 14. T 3 R 7 Ž 30 + - - - + - - - -
675. 14. T 3 R 12 Bl 11 - - - - + - - - - 717. 14. T 3 R 7 Ž 27 + - - - + - - - -
676. 14. T 3 R 12 Bl 10 - - - - + - + - - 718. 14. T 3 R 7 Ž 24 + - - - - - - - -
677. 14. T 3 R 12 Bl 5 + - - - - - - - - 719. 14. T 3 R 7 Ž 23 + - - - + - - - -
678. 14. T 3 R 12 Bl 26 - - - - - - + - - 720. 14. T 3 R 7 Ž 19 + - - - + - - - -
679. 14. T 3 R 12 Bl 25 - - - - + - + - - 721. 14. T 3 R 7 Ž 20 + - + - + - - - -
680. 14. T 3 R 12 Bl 17 + - - - + - - - - 722. 14. T 3 R 7 Ž 16 - - - - + - - - -
681. 14. T 3 R 9 Bl 3 - - - - + - + - - 723. 14. T 3 R 7 Ž 15 + - - - + - - - -
682. 14. T 3 R 12 Bl 2 - - - - + - - - - 724. 14. T 3 R 7 Ž 14 + - - - + - - - -
683. 14. T 3 R 9 Bl 6 - - - - - - - - - 725. 14. T 3 R 7 Ž 13 + - - - + - - - -
684. 14. T 3 R 12 Bl 1 + - - - + - - - - 726. 14. T 3 R 7 Ž 11 + - - - + - - - -
685. 14. T 3 R 9 Bl 8 + - - - + - - - - 727. 14. T 3 R 7 Ž 10 + - - - + - - - -
686. 14. T 3 R 9 Bl 2 - - - - + - + - - 728. 14. T 3 R 7 Ž 9 + - - - + - - - -
687. 14. T 3 R 9 Bl 7 - - - - - - - - - 729. 14. T 3 R 7 Ž 7 - - - - + - - - -
688. 14. T 3 R 12 Bl 21 - - - - - - - - - 730. 14. T 3 R 7 Ž 6 + - - - + + + - -
689. 14. T 3 R 12 Bl 20 - - - - + - + - - 731. 14. T 3 R 7 Ž 5 + - - - + - - - -
690. 14. T 3 R 12 Bl 4 - - - - + - + - - 732. 14. T 3 R 7 Ž 3 + - - - + - - - -
691. 14. T 3 R 12 Bl 13 - - - - - - - - - 733. 14. T 3 R 7 Ž 2 + - - - + - - - -
692. 14. T 3 R 12 Bl 16 - - + - - - - - - 734. 14. T 3 R 7 Ž 1 + - - - + - - - -
693. 14. T 3 R 9 Bl 11 - - - - + - - - - 735. 14. T 3 R 7 Ž 4 + - - - + - - - -
694. 14. T 3 R 9 Bl 10 - - - - - - - - 736. 14. T 3 R 1 Ž 27 - - - - - - + - -
695. 14. T 3 R 9 Bl 15 - - - - + - - - - 737. 14. T 3 R 1 Ž 20 - - - - + - - - -
696. 14. T 3 R 9 Bl 14 - - - - - - - - - 738. 14. T 3 R 1 Ž 24 - - - - + - + - -
697. 14. T 3 R 9 Bl 16 + - - - - - - - - 739. 14. T 3 R 1 Ž 26 - - - - + - - - -
698. 14. T 3 R 12 Bl 8 - - - - + - - - - 740. 14. T 3 R 1 Ž 25 - - - - + - - - -
699. 14. T 3 R 12 Bl 7 - - - - + - - - - 741. 14. T 3 R 1 Ž 18 - - - - + - - - -
700. 14. T 3 R 9 Bl 9 - - - - - - - - - 742. 14. T 3 R 1 Ž 17 + - - - + - - - -
701. 14. T 3 R 9 Bl 17 - - - - - + - - - 743. 14. T 3 R 1 Ž 10 + - + - + - - - -
702. 14. T 3 R 9 Bl 23 - - + - + - - - - 744. 14. T 3 R 1 Ž 21 - - - - + - - - -
703. 14. T 3 R 9 Bl 19 + - - - + - + - - 745. 14. T 3 R 1 Ž 15 - - - - + - - - -
704. 14. T 3 R 9 Bl 27 - - - - + - - - - 746. 14. T 3 R 1 Ž 11 - - - - + - - - -
705. 14. T 3 R 9 Bl 12 - - - - - - - - - 747. 14. T 3 R 1 Ž 8 + - - - - - - - -
706. 14. T 3 R 9 Bl 29 - - - - + - - - - 748. 14. T 3 R 1 Ž 9 - - - - + - - - -
Prilozi
147
nastavak Tablice 28.
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
749. 14. T 3 R 1 Ž 14 - - - - + - - - - 791. 14. T 3 R 6 Bl 22 - - - - + - - - -
750. 14. T 3 R 1 Ž 7 - - - - - - - - - 792. 14. T 3 R 6 Bl 27 + - - - - - - - -
751. 14. T 2 R 4 Ž 23 - - - - - - - - - 793. 14. T 3 R 6 Bl 28 - - - - + - - - -
752. 14. T 3 R 1 Ž 23 + - - - - - - - - 794. 14. T 3 R 6 Bl 29 - - - - - - - - -
753. 14. T 3 R 1 Ž 4 + - - - + - - - - 795. 14. T 3 R 3 Bl 4 - - - - - - - - -
754. 14. T 3 R 1 Ž 5 - - - - + - - - - 796. 14. T 3 R 3 Bl 5 + - + - - - + - -
755. 14. T 3 R 1 Ž 13 - - - - - - - - - 797. 14. T 3 R 3 Bl 11 - - - - + - - - -
756. 14. T 3 R 1 Ž 2 - - - - + - - - - 798. 14. T 3 R 6 Bl 13 - - - - + - - - -
757. 14. T 3 R 1 Ž 3 - - - - + - - - - 799. 14. T 3 R 6 Bl 24 - - - - - - - - -
758. 14. T 3 R 1 Ž 1 - - + - + + - - - 800. 14. T 3 R 6 Bl 30 + - - - - - - - -
759. 14. T 2 R 4 Ž 26 - - - - + + - - - 801. 14. T 3 R 3 Bl 16 - - - - + - - - -
760. 14. T 2 R 4 Ž 19 - - - - + - - - - 802. 14. T 3 R 3 Bl 6 - - - - + - - - -
761. 14. T 2 R 4 Ž 14 - - - - + - - - - 803. 14. T 3 R 3 Bl 7 - - - - - - - - -
762. 14. T 2 R 4 Ž 2 + - - - + - - - - 804. 14. T 3 R 3 Bl 13 - - - - - - - - -
763. 14. T 2 R 4 Ž 17 + - - - - - - - - 805. 14. T 3 R 3 Bl 15 - - - - + - - - -
764. 14. T 2 R 4 Ž 16 - - - - + - - - - 806. 14. T 3 R 3 Bl 2 - - + - + - - - -
765. 14. T 2 R 4 Ž 4 - - - - + - - - - 807. 14. T 3 R 3 Bl 19 - - - - - - - - -
766. 14. T 2 R 4 Ž 5 - - - - + - - - - 808. 14. T 3 R 3 Bl 18 + - - - - - - - -
767. 14. T 2 R 4 Ž 20 - - - - + - - - - 809. 14. T 3 R 3 Bl 20 - - - - + - - - -
768. 14. T 2 R 4 Ž 21 - - - - + - - - - 810. 14. T 3 R 3 Bl 22 - - - - + - - - -
769. 14. T 2 R 4 Ž 18 - - - - - - - - - 811. 14. T 3 R 3 Bl 10 - - - - - - - - -
770. 14. T 2 R 4 Ž 1 - - - - + - - - - 812. 14. T 3 R 3 Bl 25 - - - - + - - - -
771. 14. T 2 R 4 Ž 25 - - - - + - - - - 813. 14. T 3 R 3 Bl 8 + - - - - - - - -
772. 14. T 2 R 4 Ž 22 + - - - + - + - - 814. 14. T 3 R 3 Bl 12 - - - - - - - - -
773. 14. T 2 R 4 Ž 15 - - - - - - - - - 815. 14. T 3 R 3 Bl 11 - - - - - - - - -
774. 14. T 2 R 4 Ž 24 - - - - + - - - - 816. 14. T 2 R 2 Ž 15 - - - - - - - - -
775. 14. T 2 R 4 Ž 8 + - + - + - + - - 817. 14. T 2 R 2 Ž 14 - - + - + - - - -
776. 14. T 2 R 4 Ž 27 + - - - - - - - - 818. 14. T 2 R 2 Ž 17 - - - - - - - - -
777. 14. T 2 R 4 Ž 7 + - - - - - - - - 819. 14. T 2 R 2 Ž 13 - - - - - - - - -
778. 14. T 3 R 6 Bl 4 + - + - + - - - - 820. 14. T 2 R 2 Ž 11 - - - - - - - - -
779. 14. T 3 R 6 Bl 14 - - - - + - - - - 821. 14. T 2 R 2 Ž 12 - - - - + - - - -
780. 14. T 3 R 6 Bl 7 - - + - - - - - - 822. 14. T 2 R 2 Ž 18 - - - - - - - - -
781. 14. T 3 R 6 Bl 18 - - - - + - - - - 823. 14. T 2 R 2 Ž 16 - - - - - - - - -
782. 14. T 3 R 6 Bl 9 - - - - + - - - - 824. 14. T 2 R 2 Ž 8 - - - - + - + - -
783. 14. T 3 R 6 Bl 21 - - - - + - - - - 825. 14. T 2 R 2 Ž 21 - - - - - - - - -
784. 14. T 3 R 6 Bl 5 - - - - + - - - - 826. 14. T 2 R 1 Ž 8 - - - - + - - - -
785. 14. T 3 R 6 Bl 10 + - - - - - - - - 827. 14. T 2 R 2 Ž 3 - - - - + - - - -
786. 14. T 3 R 6 Bl 3 - - - - + - + - - 828. 14. T 2 R 2 Ž 1 - - - - - + - - -
787. 14. T 3 R 6 Bl 20 - - + - + - - - - 829. 14. T 2 R 2 Ž 6 - - - - - - - - -
788. 14. T 3 R 6 Bl 23 + - - - + - + - - 830. 14. T 2 R 2 Ž 2 - - - - - - + - -
789. 14. T 3 R 6 Bl 26 - - - - - - - - - 831. 14. T 2 R 2 Ž 7 - - + - - - - - -
790. 14. T 3 R 6 Bl 8 - - - - - - + - - 832. 14. T 2 R 1 Ž 11 + - + - + - - - -
Prilozi
148
nastavak Tablice 28.
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
833. 14. T 2 R 1 Ž 7 - - - - + - - - - 875. 14. T R 24 Bl 19 - - - - + - + - -
834. 14. T 2 R 1 Ž 2 - - - - + - - - - 876. 14. T R 24 Bl 24 + - - - - - - - -
835. 14. T 2 R 1 Ž 3 - - - - + - + - - 877. 14. T R 24 Bl 14 + - - - + - - - -
836. 14. T 2 R 1 Ž 10 - - - - + - - - - 878. 14. T R 24 Bl 12 - - - - - - - - -
837. 14. T 2 R 1 Ž 6 - - - - + - - - - 879. 14. T R 24 Bl 22 + - - - + - - - -
838. 14. T 2 R 1 Ž 9 - - + - + - - - - 880. 14. T R 24 Bl 13 - - - - - + - - -
839. 14. T 2 R 2 Ž 23 - - - - + - - - - 881. 14. T R 24 Bl 21 + - - - - - - - -
840. 14. T 2 R 1 Ž 4 - - - - + - - - - 882. 14. T R 24 Bl 3 - - + - - - - - -
841. 14. T 2 R 2 Ž 9 - - - - + - - - - 883. 14. T R 24 Bl 5 - - - - - - - - -
842. 14. T 2 R 2 Ž 4 - - - - + - - - - 884. 14. T R 24 Bl 8 - - - - - - - - -
843. 14. T 2 R 1 Ž 1 - - - - + - - - - 885. 14. T R 24 Bl 2 + - - - + - + - -
844. 14. T 2 R 1 Ž 5 - - - - + - - - - 886. 14. T R 24 Bl 11 + - - - - - - - -
845. 14. T 2 R 2 Ž 20 - - - - - - - - - 887. 14. T R 24 Bl 6 + - - - + - - - -
846. 14. T 3 R 15 Bl 14 - - + - + - - - - 888. 14. T R 24 Bl 9 + - - - + - - - -
847. 14. T 3 R 15 Bl 10 + - - - + - - - - 889. 14. T R 24 Bl 7 - - - - + - - - -
848. 14. T 3 R 15 Bl 25 - - - - - - - - - 890. 14. T R 24 Bl 10 - - + - + - - - -
849. 14. T 3 R 15 Bl 15 - - - - + - - - - 891. 14. T R 24 Bl 20 - - - - - - - - -
850. 14. T 3 R 15 Bl 9 - - - - - - - - - 892. 14. T R 24 Bl 16 - - - - - - - - -
851. 14. T 3 R 15 Bl 26 + - - - + - - - - 893. 14. T R 24 Bl 41 + - + - + - - - -
852. 14. T 3 R 15 Bl 3 - - - - + - - - - 894. 14. T R 24 Bl 35 + - - - + + - - -
853. 14. T 3 R 15 Bl 13 - - - - + - - - - 895. 14. T R 24 Bl 37 - - - - - - - - -
854. 14. T 3 R 15 Bl 29 - - - - + - - - - 896. 14. T R 24 Bl 38 + - - - + - - - -
855. 14. T 3 R 15 Bl 8 - - - - - - - - - 897. 14. T R 24 Bl 51 + - - - + - - - -
856. 14. T 3 R 15 Bl 6 - - - - + - - - - 898. 14. T R 24 Bl 40 - - - - + + - - -
857. 14. T 3 R 15 Bl 30 - - - - - - - - - 899. 14. T R 24 Bl 46 + - - - + - - - -
858. 14. T 3 R 15 Bl 42 - - - - + - - - - 900. 14. T R 24 Bl 49 + - - - - - - - -
859. 14. T 3 R 15 Bl 34 - - - - + - - - - 901. 14. T R 24 Bl 39 + - - - - - + - -
860. 14. T 3 R 15 Bl 36 - - - - + - - - - 902. 14. T R 24 Bl 50 + - - - + - - - -
861. 14. T 3 R 15 Bl 31 - - - - + - - - - 903. 14. T R 24 Bl 44 + - - - + - - - -
862. 14. T 3 R 15 Bl 33 - - - - - - - - - 904. 14. T R 24 Bl 52 - - - - - - - - -
863. 14. T 3 R 15 Bl 32 - - - - - - - - - 905. 14. T R 24 Bl 48 + - - - + - - - -
864. 14. T 3 R 15 Bl 40 - - - - - - - - - 906. 14. T R 24 Bl 45 + - - - + - + - -
865. 14. T 3 R 15 Bl 21 - - - - - - + - - 907. 14. T R 24 Bl 15 + - - - + - - - -
866. 14. T 3 R 15 Bl 41 - - + - + - - - - 908. 14. T R 24 Bl 32 + - - - + - + - -
867. 14. T 3 R 15 Bl 4 - - - - + - - - - 909. 14. T R 24 Bl 29 - - - - + - + - -
868. 14. T R 24 Bl 36 - - - - + - - - - 910. 14. T R 24 Bl 26 + - - - - - - - -
869. 14. T R 24 Bl 27 + - - - - - + - - 911. 14. T R 24 Bl 18 + - - - - - - - -
870. 14. T R 24 Bl 31 + - - - + - - - - 912. 14. T R 24 Bl 17 - - - - - - - - -
871. 14. T R 24 Bl 30 - - - - - - - - - 913. 15. T 4 R 5 T 1 - - + - - + + - -
872. 14. T R 24 Bl 28 + - - - - - + - - 914. 15. T 4 R 5 T 2 - - - - + + - - -
873. 14. T R 24 Bl 25 - - - - + - - - - 915. 15. T 4 R 5 T 3 - - + - + - - - -
874. 14. T R 24 Bl 23 - - - - - - - - - 916. 15. T 4 R 5 T 4 - - + - + - - - -
Prilozi
149
nastavak Tablice 28.
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
917. 15. T 4 R 5 T 5 + - - - + - - - - 959. 15. T 4 R 5 T 54 - - - - - - - - -
918. 15. T 4 R 5 T 6 - - + - + - - - - 960. 15. T 4 R 5 T 55 - - - - - - - - -
919. 15. T 4 R 5 T 7 - - - - - - - - - 961. 15. T 4 R 5 T 56 + - - - + + - - -
920. 15. T 4 R 5 T 8 + - - - - - - - - 962. 15. T 4 R 11 T 29 - - - - - - - - -
921. 15. T 4 R 5 T 9 - - + - - - - - - 963. 15. T 4 R 11 T 30 - - - - + - - - -
922. 15. T 4 R 5 T 10 - - - - + - - - - 964. 15. T 4 R 11 T 42 - - + - - - - - -
923. 15. T 4 R 5 T 11 - - - - - + + - - 965. 15. T 4 R 11 T 53 + - - - - - - - -
924. 15. T 4 R 5 T 12 - - + - - + - - - 966. 15. T 4 R 11 T 46 - - - - + + - - -
925. 15. T 4 R 5 T 14 - - + - - - - - - 967. 15. T 4 R 11 T 51 + - - - - - - - -
926. 15. T 4 R 5 T 15 + - - - - - - - - 968. 15. T 4 R 11 T 43 + - - - + - - - -
927. 15. T 4 R 5 T 16 - - + - - - - - - 969. 15. T 4 R 11 T 37 - - + - - - + - -
928. 15. T 4 R 5 T 17 - - - - + + - - - 970. 15. T 4 R 11 T 31 - - - + - - - -
929. 15. T 4 R 5 T 18 - - - - - - - - - 971. 15. T 4 R 11 T 39 - - - - + - - - -
930. 15. T 4 R 5 T 19 - - + - + - - - - 972. 15. T 4 R 11 T 47 + - - - - - - - -
931. 15. T 4 R 5 T 20 - - - - - - - - - 973. 15. T 4 R 11 T 54 - - - - + - + - -
932. 15. T 4 R 5 T 21 + - - - + - - - - 974. 15. T 4 R 11 T 36 - - - - + - - - -
933. 15. T 4 R 5 T 24 - - + - + - - - - 975. 15. T 4 R 11 T 28 - - + - + - - - -
934. 15. T 4 R 5 T 25 - - + - - + + - - 976. 15. T 4 R 11 T 23 - - + - + - + - -
935. 15. T 4 R 5 T 26 + - - - - + + - - 977. 15. T 4 R 11 T 50 + - - - + - + - -
936. 15. T 4 R 5 T 27 + - - - + - - - - 978. 15. T 4 R 11 T 44 - - + - + - - - -
937. 15. T 4 R 5 T 28 - - - - + + - - - 979. 15. T 4 R 11 T 21 - - - - - - - - -
938. 15. T 4 R 5 T 29 + - - - + + - - - 980. 15. T 4 R 11 T 33 - - - - - - - - -
939. 15. T 4 R 5 T 30 - - + - + - - - - 981. 15. T 4 R 11 T 17 - - + - + - + - -
940. 15. T 4 R 5 T 32 + - - - - + - - - 982. 15. T 4 R 11 T 2 - - - - - - - - -
941. 15. T 4 R 5 T 33 + - - - - - - - - 983. 15. T 4 R 11 T 38 + - - - + - - - -
942. 15. T 4 R 5 T 34 + - + - + - + - - 984. 15. T 4 R 11 T 15 - - - - + - - - -
943. 15. T 4 R 5 T 35 - - + - - - - - - 985. 15. T 4 R 11 T 35 - - - - + - - - -
944. 15. T 4 R 5 T 36 - - + - + - - - - 986. 15. T 4 R 11 T 25 + - - - + - - - -
945. 15. T 4 R 5 T 37 - - - - + - - - - 987. 15. T 4 R 11 T 4 + - - - - - + - -
946. 15. T 4 R 5 T 38 - - - - + - - - - 988. 15. T 4 R 11 T 20 + - - - - - - - -
947. 15. T 4 R 5 T 39 + - - - + - - - - 989. 15. T 4 R 11 T 22 + - - - + - - - -
948. 15. T 4 R 5 T 40 - - - - + + - - - 990. 15. T 4 R 11 T 26 - - - - + - - - -
949. 15. T 4 R 5 T 41 - - + - + + - - - 991. 15. T 4 R 11 T 9 - - - - - - - - -
950. 15. T 4 R 5 T 43 - - + - - + - - - 992. 15. T 4 R 11 T 40 + - - - + - + - -
951. 15. T 4 R 5 T 44 - - + - + + - - - 993. 15. T 4 R 11 T 6 + - - - + - - - -
952. 15. T 4 R 5 T 45 - - - - + - - - - 994. 15. T 4 R 11 T 34 + - - - + - - - -
953. 15. T 4 R 5 T 46 - - - - + - - - - 995. 15. T 4 R 11 T 5 + - - - - - - - -
954. 15. T 4 R 5 T 47 - - - - + + - - - 996. 15. T 4 R 11 T 3 - - + - - - - - -
955. 15. T 4 R 5 T 48 + - - - + + + - - 997. 15. T 4 R 11 T 27 - - - - - - - - -
956. 15. T 4 R 5 T 49 - - + - + + - - - 998. 15. T 4 R 11 T 13 - - - - - - - - -
957. 15. T 4 R 5 T 52 - - - - - - - - - 999. 15. T 4 R 11 T 1 + - - - + - - - -
958. 15. T 4 R 5 T 53 + - - - - + + - - 1000
.
15. T 4 R 11 T 7 - - + - - - - - -
Prilozi
150
nastavak Tablice 28.
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
1001. 15. T 4 R 11 T 14 - - - - - - + - - 1047
.
16. T 4 R 34 Be 23 - - + - + - - - -
1002. 15. T 4 R 11 T 16 + - - - - - - - - 1048
.
16. T 4 R 34 Be 24 - - + - - - - - -
1003. 15. T 4 R 11 T 18 - - + - - - - - - 1049
.
16. T 4 R 34 Be 5 - - - - + - - - -
1004. 15. T 4 R 11 T 12 - - - - - - + - - 1050
.
16. T 4 R 36 Be 6 - - - - + + - - -
1005. 15. T 4 R 11 T 11 + - - - + - + - - 1051 16. T 4 R 35 Be 25 - - - - + - - - -
1006. 15. T 4 R 11 T 10 - - - - - - - - - 1052 16. T 4 R 35 Be 26 - - + - + + - - -
1007. 16. T 4 R 47 Be 3 - - - - + - - - - 1053 16. T 4 R 34 Be 1 - - - - + - - - -
1008. 16. T 4 R 47 Be 5 + - - - + - - - - 1054
.
16. T 4 R 34 Be 3 - - - - + - - - -
1009. 16. T 4 R 47 Be 15 - - - - + - - - - 1055
.
16. T 4 R 35 Be 13 - - - - + - - - -
1010. 16. T 4 R 47 Be 19 - - - - + - - - - 1056
.
16. T 4 R 35 Be 12 - - + - + - - - -
1011. 16. T 4 R 47 Be 20 - - - - + - - - - 1057
.
16. T 4 R 35 Be 10 - - + - + + - - -
1012. 16. T 4 R 47 Be 23 - - - - + - - - - 1058
.
16. T 4 R 48 Be 45 - - + - + + - - -
1013. 16. T 4 R 47 Be 25 - - - - + - - - - 1059
.
16. T 4 R 34 Be 11 - - - - + + - - -
1014. 16. T 4 R 47 Be 28 - - - - + - - - - 1060 16. T 4 R 35 Be 18 - - - - + - - - -
1015. 16. T 4 R 47 Be 30 - - - - + - + - - 1061
.
16. T 4 R 48 Be 47 - - - - + + - - -
1016. 16. T 4 R 47 Be 31 - - + - + - + - - 1062
.
16. T 4 R 35 Be 8 - - + - + - - - -
1017. 16. T 4 R 47 Be 32 - - - - + - - - - 1063
.
16. T 4 R 48 Be 44 - - - - + - - - -
1018. 16. T 4 R 47 Be 33 - - - - + - - - - 1064
.
16. T 4 R 48 Be 46 - - - - - - - - -
1019. 16. T 4 R 47 Be 37 - - + - + - - - - 1065
.
16. T 4 R 35 Be 20 - - - - - - - - -
1020. 16. T 4 R 47 Be 40 - - - - + - - - - 1066
.
16. T 4 R 48 Be 41 - - - - + - - - -
1021. 16. T 4 R 47 Be 41 - - - - + - - - - 1067
.
16. T 4 R 48 Be 43 - - + - + - + - -
1022. 16. T 4 R 47 Be 42 - - - - + - - - - 1068
.
16. T 4 R 35 Be 1 - - + - + - - - -
1023. 16. T 4 R 47 Be 43 - - - - + - + - - 1069
.
16. T 4 R 48 Be 42 - - + - - + - - -
1024. 16. T 4 R 47 Be 44 - - - - + - + - - 1070
.
16. T 4 R 48 Be 35 - - - - + - - - -
1025. 16. T 4 R 47 Be 45 - - - - + - - - - 1071
.
16. T 4 R 35 Be 7 - - - - + - - - -
1026. 16. T 4 R 47 Be 46 - - - - + - + - - 1072 16. T 4 R 35 Be 16 - - - - - + - - -
1027. 16. T 4 R 47 Be 48 - - - - + - - - - 1073
.
16. T 4 R 48 Be 26 - - - - - + + - -
1028. 16. T 4 R 47 Be 49 - - - - + - - - - 1074
.
16. T 4 R 48 Be 21 - - - - + + - - -
1029. 16. T 4 R 47 Be 50 - - + - + - - - - 1075
.
16. T 4 R 48 Be 39 - - - - + + - - -
1030. 16. T 4 R 47 Be 52 - - + - + - + - - 1076 16. T 4 R 48 Be 48 - - - - + + - - -
1031. 16. T 4 R 47 Be 53 - - - - + - - - - 1077
.
16. T 4 R 48 Be 29 - - - - + - + - -
1032. 16. T 4 R 47 Be 55 - - - - + - - - - 1078
.
16. T 4 R 35 Be 6 - - - - + + - - -
1033. 16. T 4 R 47 Be 57 - - - - + - - - - 1079
.
16. T 4 R 48 Be 24 - - - - - - - - -
1034. 16. T 4 R 47 Be 59 - - - - + - - - - 1080 16. T 4 R 48 Be 30 - - - - + + - - -
1035. 16. T 4 R 47 Be 61 - - - - + - - - - 1081
.
16. T 4 R 48 Be 7 - - + - + - - - -
1036. 16. T 4 R 47 Be 63 - - - - + - + - - 1082
.
16. T 4 R 48 Be 12 - - + - + + - - -
1037. 16. T 4 R 47 Be 64 - - - - + - - - - 1083
.
16. T 4 R 48 Be 6 - - - - - - - - -
1038. 16. T 4 R 47 Be 65 - - - - + - - - - 1084
.
16. T 4 R 48 Be 10 - - - - + + - - -
1039. 16. T 4 R 47 Be 67 - - + - + - - - - 1085
.
16. T 4 R 48 Be 20 + - - - + + + - -
1040. 16. T 4 R 34 Be 4 - - + - + - - - - 1086 16. T 4 R 48 Be 1 - - - - - - - - -
1041. 16. T 4 R 34 Be 7 - - - - + - - - - 1087
.
16. T 4 R 48 Be 4 - - - - + - - - -
1042. 16. T 4 R 34 Be 10 - - - - + - + - - 1088
.
16. T 4 R 48 Be 11 - - - - - - - - -
1043. 16. T 4 R 34 Be 12 - - - - - - - - - 1089
.
16. T 3 R 3 Ž 28 - - - - + - - - -
1044. 16. T 4 R 34 Be 13 - - - - + - - - - 1090
.
16. T 3 R 3 Ž 27 - - - - + - - - -
1045. 16. T 4 R 34 Be 19 - - + - + - - - - 1091
.
16. T 3 R 3 Ž 22 - - - - + - - - -
1046. 16. T 4 R 34 Be 20 - - + - + - - - - 1092
.
16. T 3 R 3 Ž 40 - - - - - - - - -
Prilozi
151
nastavak Tablice 28.
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
1093. 16. T 3 R 3 Ž 32 - - - - - - - - - 1140
.
19. T 14 + - - - - - - - -
1094. 16. T 3 R 3 Ž 41 - - - - - - + - - 1141
.
19. T 15 - - - - - - - - -
1095. 16. T 3 R 3 Ž 43 - - + - + - - - - 1142
.
19. T 16 - - - - - - - - -
1096. 16. T 3 R 3 Ž 33 - - - - + - - - - 1143
.
19. T 17 - - + - - - - - -
1097. 16. T 3 R 3 Ž 59 - - - - + - - - - 1144 19. T 18 + - - - - - - - -
1098. 16. T 3 R 3 Ž 50 + - - - + - - - - 1145 19. T 19 - - - - - - - - -
1099. 16. T 3 R 3 Ž 18 - - - - + - - - - 1146 19. T 20 - - - - - - - - -
1100. 16. T 3 R 3 Ž 15 - - - - - - - - - 1147 19. T 21 - - - - + - - - -
1101. 16. T 3 R 3 Ž 62 - - - - + - - - - 1148 19. T 22 - - + - + - - - -
1102. 16. T 3 R 3 Ž 53 - - - - - - - - - 1149 19. T 23 - - - - - - - - -
1103. 16. T 3 R 3 Ž 54 - - - - - - - - - 1150
.
19. T 24 - - - - - - - - -
1104. 16. T 3 R 3 Ž 1 - - - - - - - - - 1151 19. T 25 - - - - - - - - -
1105. 16. T 3 R 3 Ž 65 - - - - - - - - - 1152 19. T 26 - - - - - - - - -
1106. 16. T 3 R 3 Ž 48 - - - - + - + - - 1153 19. T 27 + - - - - - - - -
1107. 16. T 3 R 3 Ž 20 - - - - + - - - - 1154
.
19. T 28 - - - - - - - - -
1108. 16. T 3 R 3 Ž 68 - - - - - - - - - 1155 19. T 29 - - - - - - - - -
1109. 16. T 3 R 3 Ž 2 - - - - - - - - - 1156 19. T 30 - - - - - - - - -
1110. 17. R 3 K 23 - - - - + + - - - 1157
.
19. T 31 - - + - - - - - -
1111. 17. R 3 K 21 + - + - + + + - - 1158
.
19. T 32 - - - - - - - - -
1112. 17. R 3 K 8 - - - - + + - - - 1159
.
19. T 33 - - - - - - - - -
1113. 17. R 3 K 11 + - + - + - - - - 1160
.
19. T 34 - - - - - - - - -
1114. 17. R 3 K 2 + - - - + - - - - 1161
.
19. T 35 - - - - - - - - -
1115. 17. R 2 K 1 + - - - + - - - - 1162 19. T 36 + - + - - - - - -
1116. 17. R 2 K 2 + - + - + - - - - 1163 19. T 37 - - - - + - - - -
1117. 17. R 1 K 8 - - + - + + - - - 1164 19. T 38 + - + - - - - - -
1118. 17. R 3 K 16 - - - - + - - - - 1165
.
19. T 39 - - - - - - - - -
1119. 17. R 2 K 1 - + + - + - - - - 1166 19. T 40 - - - - + - - - -
1120. 18. R 10 (I) D 6 (S) + - + - + - - - - 1167
.
19. T 41 - - - - - - - - -
1121. 18. R 9 (I) D 7 (S) + - - - + - - - - 1168
.
19. T 42 + - - - - - - - -
1122. 18. R 9 (I) D 6 (S) + - - + + + + - - 1169
.
19. T 43 - - - - - - - - -
1123. 18. R 9 (I) D 9 (S) + - - - + - - - - 1170
.
19. T 44 - - - - - - - - -
1124. 18. R 8 (I) D 7 (S) + - - - + - - - - 1171 19. T 45 - - - - - - - - -
1125. 18. R 8 (I) D 6 (S) + - - - + - + - - 1172
.
19. T 46 - - - - - - - - -
1126. 18. R O GOMILA D 3 + - - - + - - - - 1173
.19. T 47 - - - - - - - - -
1127. 19. T 1 - - + - - - - - - 1174
.
19. T 48 - - - - - - - - -
1128. 19. T 2 - - - - - - - - - 1175
.
19. T 49 - - + - - - - - -
1129. 19. T 3 - - - - - - - - - 1176
.
19. T 50 - - - - - - - - -
1130. 19. T 4 - - - - - - - - - 1177
.
19. Bl 2 + - - - + - - - -
1131. 19. T 5 - - - - - - - - - 1178
.
19. Bl 4 + - - - - - + - -
1132. 19. T 6 - - - - - - - - - 1179
.
19. Bl 5 + - - - - - - - -
1133. 19. T 7 + - - - - - - - - 1180
.
19. Bl 9 + - - - - - - - -
1134. 19. T 8 - - + - - - - - - 1181 19. Bl 10 + - - - + - + - -
1135. 19. T 9 - - - - - - - - 1182
.
19. Bl 11 + - - - + - - - -
1136. 19. T 10 - - + - - - - - - 1183
.
19. Bl 12 + - - - + - + - -
1137. 19. T 11 - - - - - - - - - 1184
.
19. Bl 13 + - - - - - - - -
1138. 19. T 12 - - - - - - - - - 1185
.
19. Bl 14 + - - - + - + - -
1139. 19. T 13 - - + - - - - - - 1186
.
19. Bl 15 + - - - - - - - -
Prilozi
152
nastavak Tablice 28. R
edn
i b
roj
uzo
rka
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
1187. 19. Bl 17 + - - - - - - - - 1234
.
20. R 12 Bl 2 - - - - + - - - -
1188. 19. Bl 18 - - - - + - - - - 1235
.
20. R 16 T 4 - - - - - - - - -
1189. 19. Bl 19 - - - - + - - - - 1236
.
20. R 2 K 2 + - - - + - - - -
1190. 19. Bl 21 + - - - + - - - - 1237
.
20. R 2 D 1 + - - - + - - - -
1191. 19. Bl 22 - - - - + - - - - 1238 20. R 1 T 5 + - - - + - - - -
1192. 19. Bl 23 + - - - + - - - - 1239
.
20. R 2 D 4 + - + - + - + - -
1193. 19. Bl 24 + - - - - - - - - 1240
.
20. R 13 Be 2 + - - - + - - - -
1194. 19. Bl 25 + - - - + - - - - 1241
.
20. R 2 D 5 - - - - + - - - -
1195. 19. Bl 26 + - - - + - - - - 1242 20. R 2 K 4 - - + - + + - - -
1196. 19. Bl 27 + - - - + - - - - 1243
.
20. R 13 K 2 - - - - + - - - -
1197. 19. Bl 28 + - - - - - - - - 1244 20. R 13 Ž 3 (prolaz 4) - - - - + - - - -
1198. 19. Bl 29 + - - - + - + - - 1245 20. R 13 Ž 5 (prolaz 4) - - - - + - + - -
1199. 19. Bl 30 + - - - - - - - - 1246
.
20. R 9 K 3 - - - - + + + - -
1200. 19. Bl 31 - - - - + - - - - 1247 20. R 13 Be 4 + - + - + + + - -
1201. 19. Bl 32 + - - - - - - - - 1248 20. R 7 T 4 - - - - - - - - -
1202. 19. Bl 33 - - - - + - - - - 1249
.
20. R 1 T 2 - - - - + - - - -
1203. 19. Bl 34 + - - - - - - - - 1250 20. R 10 Bl 4 - - - - + - - - -
1204. 19. Bl 35 + - - - - - - - - 1251
.
20. R 6 Ž 2 + + - - + - - - -
1205. 19. Bl 36 + - - - - - + - - 1252
.
20. R 6 Ž 3 - - - - + - - - -
1206. 19. Bl 37 + - - - - - - - - 1253
.
20. R 6 Ž 1 - - - - + - - - -
1207. 19. Bl 38 + - - - - - - - - 1254
.
20. R 3 T 1 + - - - - - - - -
1208. 19. Bl 39 + - - - + - + - - 1255 20. R 5 D 4 - - - - + - + - -
1209. 19. Bl 40 + - - - - - + - - 1256
.
20. R 7 Be 5 - - - - + - + - -
1210. 19. Bl 41 + - - - - - + - - 1257
.
20. R 1 T 4 - - - - - - + - -
1211. 19. Bl 42 - - - - + - - - - 1258
.
20. R 7 T 2 - - + - - - + - -
1212. 19. Bl 43 - - - - - - + - - 1259 20. R 2 D 2 - - + - + - + - -
1213. 19. Bl 44 + - - - + - + - - 1260 20. R 2 K 5 + - + - + - - - -
1214. 19. Bl 45 + - - - + - - - - 1261
.
20. R 7 Be 4 + - - - + - - - -
1215. 19. Bl 47 + - - - - - - - - 1262
.
20. R 4 K 1 + - - - + - - - -
1216. 19. Bl 48 + - - - + - + - - 1263
.
20. R 2 D 3 - - - + + + + - -
1217. 19. Bl 49 + - - - + - - - - 1264
.
20. R 9 K 5 - - - - + - + - -
1218. 19. Bl 50 + - - - + - + - - 1265 20. R 2 K 3 + - + - + - - - -
1219. 19. Bl 20 + - - - - - - - - 1266
.
20. R 3 T 3 - - + - - - + - -
1220. 19. Bl 46 + - - - + - - - - 1267
.
20. R 1 T 3 - - - - - - - - -
1221. 19. Bl 3 + - - - + - - - - 1268
.
20. R 3 T 5 - - + - - - + - -
1222. 19. Bl 1 + - - - + - - - - 1269 20. R 5 Ž 5 - - - - + - + - -
1223. 19. Bl 7 + - - - + - - - - 1270 20. R 13 Ž 1 - - - - + - + - -
1224. 19. Bl 16 + - - - + - + - - 1271
.
20. R 5 D 1 - - + - + - - - -
1225. 19. Bl 8 + - - - - - - - - 1272
.
20. R 7 T 3 - - - - + - + - -
1226. 19. Bl 6 + - - - + - - - - 1273
.
20. R 4 K 2 + - + - + - - - -
1227. 20. R 15 Bl 1 - - - - + - - - - 1274
.
20. R 4 D 5 - - + - + - - - -
1228. 20. R 15 Bl 4 + + + - + - - - - 1275
.
20. R 6 Ž 4 + + - - + - - - -
1229. 20. R 16 T 5 - - + - + - - - - 1276
.
20. R 4 D 3 - - - - + - - - -
1230. 20. R 16 T 2 - - - - - - - - - 1277
.
20. R 13 Ž 2 (prolaz 4) - - - - + - - - -
1231. 20. R 12 Bl 4 + - - - + - - - - 1278
.
20. R 3 T 2 - + - - - - - - -
1232. 20. R 12 Bl 3 + - - - + - + - - 1279
.
20. R 4 D 2 + + - - + - - - -
1233. 20. R 11 Be 4 (prolaz 4) - - - - - - - - - 1280
.
20. R 7 Be 3 + + - + - - - -
Prilozi
153
nastavak Tablice 28. R
edn
i b
roj
uzo
rka
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
Red
ni
bro
j u
zork
a
LO
KA
CIJ
A
OZ
NA
KA
UZ
OR
KA
GF
LV
ArM
V
GL
RaV
-1
GL
RaV
-2
GL
RaV
-3
GL
RaV
- 4
-9
GF
kV
GV
A
GV
B
1281. 20. R 5 Ž 1 - - + - + - - - - 1307 20. R 11 Be 2 - - + - + + - - -
1282. 20. R 7 T 5 - - + - + - - - - 1308 20. R 15 Bl 2 (prolaz 3) - - - - + - - - -
1283. 20. R 13 Be 1 - + - - + - - - - 1309 20. R 11 Be 3 (prolaz 4) - - + - + + + - -
1284. 20. R 9 K 2 - - + - + - - - - 1310 20. R 11 Be 2 (prolaz 4) - - + - + - - - -
1285. 20. R 5 D 2 + - + - + - - - - 1311
.
20. R 5 Ž 3 - - - - + - - - -
1286. 20. R 7 Be 1 + + + - + - - - - 1312 20. R 15 Bl 3 (prolaz 3) + - + - + - - - -
1287. 20. R 13 K 4 - + + - + - - - - 1313 20. R 15 D 1 + - - - + + - - -
1288. 20. R 9 K 1 + + + - + - - - - 1314 20. R 11 Be 4 - - - - + + + - -
1289. 20. R 7 T 1 - - + - + - - - - 1315
.
20. R 15 D 4 - - - - + + - - -
1290. 20. R 13 Ž 5 - + - - + - - - - 1316 20. R 12 Bl 5 + - - - + - - - -
1291. 20. R 10 Bl 1 - + + - + - - - - 1317 20. R 11 Be 3 + - - - + - - - -
1292. 20. R 13 Be 5 - - + - + - - - - 1318
.
20. R 11 Be 1 - - - - + - + - -
1293. 20. R 10 Bl 2 + - - - + - - - - 1319
.
20. R 12 Bl 1 + - - - - - - - -
1294. 20. R 13 Ž 4 (prolaz 4) - + - - + - - - - 1320 20. R 15 D 2 - - - - + - - - -
1295. 20. R 13 Be 3 - + - - + - - - - 1321
.
20. R 11 Be 1 (prolaz 4) + - + - + - + - -
1296. 20. R 4 K 4 - - - - + - - - - 1322
.
20. R 13 K 1 - - + - + - + - -
1297. 20. R 5 Ž 4 - - - - + - - - - 1323
.
20. R 13 K 5 - - - - + + - - -
1298. 20. R 13 Ž 1 (prolaz 4) - + - - + - - - - 1324
.
20. R 10 Bl 3 - + - - + - - - -
1299. 20. R 13 Ž 2 - + - - - - - - - 1325
.
20. R 10 Bl 5 - - + - + - - - -
1300. 20. R 13 K 3 + - - - + - - - - 1326
.
20. R 11 Be 5 (prolaz 2) - - - - + - - - -
1301. 20. R 2 K 1 + + - - + - - - - 1327
.
20. R 5 D 3 (prolaz 1) + - - - + - - - -
1302. 20. R 5 Ž 2 + - - - + - - - - 1328
.
20. R 6 Ž 5 (prolaz 1) - - - - + - - - -
1303. 20. R 15 Bl 5 + - - - + - - - - 1329
.
20. R 4 K 5 (prolaz 3) + - - - + + - - -
1304. 20. R 15 Bl 2 + - - - + + - - - 1330
.
20. R 15 D 5 (prolaz 2) - - - - + + - - -
1305. 20. R 15 Bl 3 - - - - + - - - - 1331
.
20. R 4 K 3 (prolaz 3) - - - - + - - - -
1306. 20. R 15 D 3 - - - - + - - - - 1332
.
20. R 5 D 5 (prolaz 1) - - - - + - - - -
Životopis
154
9. ŽIVOTOPIS AUTORICE S POPISOM OBJAVLJENIH
DJELA
Ana Karačić rođena je u Mostaru 31. siječnja 1975. godine. Na Agronomskomu fakultetu
Sveučilišta u Zagrebu 2003. godine završila je studij programa Zaštite bilja. Znanstvena
usavršavanja stekla je na: Instituto Agronomico Mediteraneo di Bari (CIHEAM-MAI) Bari,
Italija, 9. studenoga 2006. – 29. lipnja 2007. gdje je dobila diplomu “Post Graduate
Specialization” (ECTS 60), Integrated Pest Management of Mediterranean Fruit Crops.
Akademske godine 2008./2009. na Agronomskomu fakultetu Sveučilišta u Zagrebu upisala je
Poslijediplomski doktorski studij ”Poljoprivredne znanosti”.
Bila je angažirana na projektima Improvement of fruit and vegetable yields through the
diffusion of sustainable productive systems in the Balkan area i Providing genetic diversity
and healthy plants for the horticulture in Bosnia and Herzegovina (HERD/Agriculture).
Tijekom 2013. boravila je na dvotjednoj specijalizaciji na Sveučilištu Texas (USA), Cochran
Fellowship Program.
Znanstveni interes je fitomedicina, zaštita bilja.
Do sada je objavila nekoliko znanstvenih i stručnih djela.
Znanstvene publikacije:
a1 (CC):
Delić, D., Afechtal, M., Djelouah, K., Lolić, B., Karačić, A. (2013). First Report of
Citrus tristeza virus in Citrus Orchards in Bosnia and Herzegovina, Plant Disease
97(12): 1665; http://dx.doi.org/10.1094/PDIS-05-13-0548-PDN.
Delić, D., Lolić, B., Karačić, A. (2011). Screening for phytoplasma presence in West
Herzegovina vineyards. Indian Journals, Phytopathogenic Mollicutes 1(2): 87-90.
a2
Kozina, A., Virić, H., Gotlin Čuljak, T., Karačić, A. (2012). Entomofauna of
pomegranate (Punica granatum L.), Glasilo biljne zaštite 5: 405-413.
Životopis
155
a3
Delić, D., Balech, B., Radulović, M., Lolić B., Karačić A., Jovanović Cvetković
T. (2015). Characterization of vmp1 gene of grapevine stolbur isolates from Bosnia
and Herzegovina, Proceedings of the 18th
Congress of ICVG, Ankara, Turkey:
119-120.
Lasić, V., Karačić, A., Mandić, A. (2015). Ampelografski profil sorte Blatina
(Vitis vinifera L.), Zbornik radova; Međunarodni znanstveni simpozij BLIDINJE
2015., FRAM Ziral, Mostar. 541-559.
Međunarodni skupovi
Delić, D., Karačić, A., Lolić, B. (2012). Citrus tristeza virus (CTV) in Bosnia and
Herzegovina 5th Croatian Congres of Microbiology with International Participation
Primošten, Croatia – poster presentation
Karačić, A., Filipović, A., Rotim, N., Perić, I. (2011). Testing of local Herzegovinian
potato cultivar Poluranka on presence of PLRV, PVY, PVX, PVA. 10th Slovenian
conference on plant protection, Podčetrtek, Slovenija – poster presentation
Stručne publikacije:
Kozina, A., Virić, H., Karačić, A., Gadže J., Kos T. (2011). Overview of the harmful
entomofauna in pomegranate (Punica granatum L.) production in the world.
Pomologia Croatica, Glasilo Hrvatskog agronomskog društva17 (1-2): 37-49
Rotim, N., Karačić, A., Perić I. (2011). Paunovo oko (Spilocaea oleagina Cast.) u
maslinicima Hercegovine, Glasnik zaštite bilja 1: 78-82.
Karačić, A., Ivić, D., Perić, I., Rotim, N. (2011). Uzroci propadanja sadnica kupina
(Rubus fruticosus L.) u Tomislavgradu u sezoni 2009./2010., Glasnik zaštite bilja 1:
84-87.
Karačić, A., Kohnić, A., Đikić, M., Gadžo, D., Karić, L. (2010). Distribution, biology
and controlof broom rape (Orobanche ramosa L.), Herbologija 11(1): 1-10.
Kohnić, A., Karačić, A., Injac, M., Rotim, N. (2010). Grinja pupoljaka špinata u
zaštićenim prostorima u Hercegovini, Glasnik zaštite bilja 6: 40- 44.
Životopis
156
Sažeci u zbornicima skupova:
Karačić, A., Đermić, E.,Vončina, D., Ivanković, M. ( 2014). Pojava virusa iz
kompleksa uvijenosti lista vinove loze (GLRaV) na autohtonim kultivarima u
Hercegovini, Stručni skupu HDBZ RH u Opatiji.
Kohnić, A., Karačić, A., Rozić, A., Gašpar, M., Kraljević, M., Kozina, I., Marinović,
I., Prce Ž., Palameta Z., Ivić D. (2014). Osvrt na problematiku zaštite bilja u
hercegovini u sezoni 2013./2014., Jedanaesti simpozij zaštite bilja u Bosni i
Herecegovini, Teslić.
Delić, D., Afechtal, M., Djelouah, K., Lolić, B., Karačić, A. (2014). Molecular
identification of Citrus tristeza virus, International Symposium (III) and Scientific
Conference (XIX) of Agronomists of Republic of Srpska, Trebinje.
Delić, D., Đurić, Z., Jović, J., Lolić, B., Toševski, I., Karačić, A.(2013). Bois noir
phytoplasma and Auchenorryncha species in Bosnia and Herzegovina vineyards, II
international symposium and XVIII scientific conference of agronomists of republic of
srpska, Trebinje.
Lasić, V., Karačić, A., Gašpar, M., Kojić, A., Blesić, M., Kraljević, M. (2010).
Nazočnost virusa GFLV, ARMV, GLRAV-1 i GLRAV-3, na autohtonim kultivarima
Žilavka i Blatina na lokalitetu Lopate u mostarskom vinogorju, 21st scientific-expert
conference in agriculture. and food industry. Neum. September 29 – October 2. 13-
131.
Kohnić, A., Karačić, A., Prce, Ž., Kraljević, M., Marinović, I., Gašpar, M. (2009).
Pojava paleži grožđa u mjesecu srpnju 2009. godine i mogući uzroci te pojave. Šesti
simpozij o zaštiti bilja u Bosni i Hercegovini, Tuzla.
Karačić, A., Petrović, D. (2008). Lisna nematoda krizanteme u Hercegovini, Peti
simpozij o zaštiti bilja u Bosni i Hercegovini, Sarajevo.
Petrović, D., Karačić, A., Kovačević, Z., Kohnić, A., Herceg, N. (2008). Značaj
korova kao domaćina štetne entomofaune i nematode, Peti simpozij o zaštiti bilja u
Bosni i Hercegovini, Sarajevo.
Životopis
157
Izvan nastavne aktivnosti
Sudjelovanje na radionici Communication in Science-Writing and Speaking about
your Research, 3. – 14. svibnja 2010, Sveučilište u Zagrebu. (1 ECTS)
Obuka ECDL Start.
Diplomski rad:
Karačić A. (2003). Štetna i korisna entomofauna u nasadu jabuke ekstenzivnog
uzgoja. Sveučilište u Zagrebu, Agronomski fakultet. Mentorica: prof. dr. sc. Božena
Barić.
Individualni project unutar PSD:
Karačić A. (2007). Monitoring and control of stone fruit fungal diseases in an
experimental plot. CIHEAM-MAI, Integrated Pest Management of Mediterranean
Fruit Crops, Bari, Italija. Mentor: dr. sc. Thaer Yassen. (60 ECTS)
Član Hrvatskoga društva biljne zaštite RH i Društva za zaštite bilja Bosne i Hercegovine.
