Bull. Acad. Vét. de France, 2002, J 55, 283-294

Surveillance des résidus d'antibiotiques. Apport des méthodes de spectrométrie de masse

à l'identification des contaminants

par Michel LAURENTIE 1, Catherine CREFF-FROGER 2,

Valérie GAUDIN 2

RÉ UMÉ

r idu de médicaments vétérinaire est réglementée dir tiv ur pé nne dan laquelle ont définies les méthodes

pour la dét ti n et la confirmation de résidus. Le méthodes biologique (mi r biol gique ou immunologique ) sont largement utilisées en routine pour effi tuer un dépi tage de antibiotiques dans les échantillons prélevé . La confirmation de échantillon positifs est effectuée au moyen de méthode analytique ba ée ur la chromatographie liquide haute performance a ociée à de détecteur de masse (SM).

Le a antage propo é par cette technologie sont nombreux. La préparation de échantillon e t implifiée, ce qui se traduit par des gains de temp d'analy e, mai également par une augmentation de la fiabilité des ré ultat .

Un autre point majeur e t l'identification sans discussion de la molécule trouvée. La réglementation européenne a défini pour cette technologie des critère impie et précis permettant une identification des molécules autori ée ou interdite .

Cette technologie e t applicable à tout type de matrice, quelles soient complexe (grai e, mu cle, foie, miel, etc.) ou non. De même, cette technique peut être utili ée pour rechercher des résidus d'antiparasitaires, des hormones et bêta-agoniste , d'anti-inflammatoire non stéroïdien et de pesticides.

En conclu ion, la pectrométrie de masse est un outil majeur dans la surveillance de ré idu . Elle permet de confirmer sans discussion la pré ence de ré idu et de déterminer i leur concentration est supérieure à la LMR.

1 Unité pharmacocinétique-pharmacodynamie. �Unité contaminants médicamenteux - Secteur microbiologie - Laboratoire d'études et de recherches sur les médicaments vétérinaires et les désinfectants - AFSSA Fougères - BP 90203 - 35302 Fougères Cedex.

284

SUMMARY

BULLETIN DE L'ACADÉMIE VÉTÉRINAIRE DE FRANCE

ANTIBIOTIC RESIDUE SURVEY. CO TRIBUTION OF MASS ANALYTICAL

METHODS TO IDE TIFICATION OF CO TAMINANTS

Antibiotic residue surveys are defined by a European legi lation where analytical methods for screening and confinnatory re idue analy e are codified. For screening antibiotic residue , mainly biological method uch as microbiological (fourth plate method) or immunological (Bio en or method) methods are used. In terms of confirmation of re idue ample , positive samples are confirmed by a method ba ed on liquid chromatography with MS Mass spectrometry detection.

These methods offer many advantage . One advantage i that extraction of residues from biological sample i implified, reducing the c t of analysis and increasing the reliability of the re ult .

Another advantage is the identification of the antibi tic c mp und which leads to residues. The European community ha defined clear-cut criteria that allow identification of authorised and banned compound .

The methods can be u ed in any biological ti ue or matri (fat, mu 1 ,

liver, honey). Residues of many different compound can be d t t d and identified by these methods uch a in the ca e of antipara itic drug , hormones, beta-agonists, NSAID or pe ticide .

In conclusion, we make the ca e that e pecially MS i a main t 1 in performing drug residue surveys. It can identify the pre ence of re idue in positive samples and quantify if the level pre ent i above the autori ed MRL (maximum residue lirnit).

INTRODUCTION

La surveillance des résidus de médicaments vétérinaires e t régle­mentée par une directive européenne (DIRECTIVE 96/23, 1996) dan laquelle sont définies les méthodes utilisables pour la détection et la confir­mation des résidus. L'existence de ces méthodes est un préalable à la mi e en place des plans de contrôle définis au sein de la communauté européenne. Les méthodes microbiologiques sont largement utilisées en routine pour effectuer un dépistage des antibiotiques dans les échantillons prélevé , la confirmation des échantillons positifs est effectuée au moyen de méthode analytiques basées sur la chromatogographie liquide haute performance (CLHP) associée à des détecteurs de masse (SM). Grâce à lévolution de systèmes chromatographiques dans les années 80 et lévolution de détec­teurs de masse dans les années 90 le couplage de ces deux techniques (LC­SM) s'est considérablement développé dans le domaine de lidentification et de la confirmation de la présence de résidus dans les denrées d'origine ani­males (DELEPINE et al., 2002).

Après un rappel des définitions en matière de résidus et de LMR, cet article présentera les é volutions en matière de méthodes analytiques de confirmation et des exemples d'applications seront fournis.

COMMUNICATIONS 285

RÉSIDU, LMR ET TEMPS D'ATTENTE

La définition de résidu est codifiée dans une directive européenne (DIRECTIVE 81 /851, 1981 ). Les résidus sont définis comme toutes sub­stance actives phannacologiquement actives qu'il s'agissent de principes

actif , d'excipients, ou de métabolites présents dans les liquides et tissus des animaux aprè J'admini tration des médicaments et susceptibles d'être retrouvés dan le denrées alimentaires produites par ces animaux.

À cette notion de ré idus est ajouté la notion de Limite Maximale de Ré idu . La LMR corre pond à la concentration maximale en résidus, résultant de l'utili ation d'un médicament vétérinaire sans risque sanitaire pour le con ommateur et qui ne doit pas être dépassée dans ou sur les denrée alimentaire . Le règlement 2377/90/CEE (1990) définit la pro­cédure qui p rmet d'établir le LMR dans les denrées d'origines animales. Le princip en t le uivant: pour chaque ubstance pharmacologiquement active, un é aluati n de a t xicité et de e effets pharmacologiques est réali é à partir d tude. � urnie par le pétitionnaire dont les principes

ont défini. par 1 Jign dir ctrice . A partir de résultats de ces études, une do e an ef� t (D ), c'e t-à-dire une dose qui ne montre pas d'effets toxicologiqu u pharmacologique dan le différentes études est déter­minée. Pui c tt DSE e t divi ée par un facteur de sécurité selon le profil toxicologiqu de la molécule pour aboutir à la Dose Journalière Admissible (DJA).

En tenant compte d'une répartition théorique des consommations quo­tidienne de différente denrées d'origine animale (foie, rein, graisse, mu cle, peau, lait, œuf , miel) connue sous le nom de "panier de la ménagère" et sur la base des informations pharmacocinétiques disponibles sur le devenir de la ub tance dans les espèces animales de destination, les expert de J' Agence européenne de !'Évaluation du Médicament proposent les limite maximale de résidus à la Commission européenne. Les sub­stance sont alor cla sées dans différentes annexes (tableau 1).

En ré umé, le LMR sont établies au niveau européen pour chaque sub­stance pharmacologiquement active selon une procédure bien établie afin de déterminer le quantités résiduelles ingérables lors de la consommation des différente denrée d'origine animale.

Cependant la LMR n'est pas directement utilisable par l'éleveur ou par le vétérinaire praticien qui emploie des médicaments vétérinaires car ils ne peuvent pas estimer la concentration résiduelle dans les tissus ou dans le lait (LAURENTIE et SANDERS, 2002). En effet, celles-ci sont influencées par plusieur facteur liés à la pécialité tel que la composition (émulsion, sus­pension, etc.), les condition d emploi (posologie, voie d'administration, etc.), mais également à la variabilité animale (état phy iologique, race, etc.). Il faut déterminer le temps pour lequel le concentrations résiduelles dans les ti u sont inférieure aux LMR aprè la dernière administration de la

286 BULLETIN DE I..:ACADÉMIE VÉTÉRINAIRE DE FRANCE

spécialité. Ce temps correspond au temp d'attente (DIRECTIVE 81 /851,

1981). Le respect de ce temps d'attente garantit, pour le con ommateur, qu'à l'abattage la majorité des animaux traités auront de concentration en résidus proches ou inférieures à la LMR.

Annexe

II

III

IV

Tableau/. Annexes réglementaires pour I' in cription de ub tance

pharmacologiquement active .

Définitions ombre de ub tance

Substances dont les LMR ont été établies 139

Substances ne nécessitant pa de LMR 09

Substances pour lesquelles des LMR 25 provisoires ont été établie

Substances pour lesquelles Il il n'a pas été po ible d'établir des LMR

SURVEILLANCE

in rite

La communauté européenne au travers de la Directive 96/23 ( 1996) a définie la surveillance des résidus. La urveillance 'effectue au niv au de abattoirs mais également dans tous les lieux où ont manipulé de produit d'animaux. Les plans de surveillance ont été remplacé par de plan de contrôle qui ont pour objectifs de permettre une évaluation de la contami­nation des denrées alimentaires d'origine animale préjudiciable à la anté publique. En France, c'est le Ministère de I' Agriculture via la Direction Générale de I' Alimentation, qui a la charge de mettre en place ce plan de contrôle. Les prélèvements sont effectués par les agent de Service Vétérinaires et analysés par les Laboratoire Vétérinaires Départementaux (LVD).

Les méthodes mises en œuvre pour rechercher les ré idus sont divi ées en deux groupes: les méthodes de dépistage et les méthode de confir­mation.

Les méthodes de dépistage sont des méthode qualitatives qui ont pour but de discerner les échantillons positifs des échantillons négatifs. Ensuite, pour les échantillons positifs, une confirmation est nécessaire.

Les méthodes de dépistage sont soit basées ur des techniques physico­chimiques, tel que la chromatographie en couche mince, la chromatographie en phase liquide ou la chromatographie en phase gazeuse, ou des technique immunologiques (FERGUSSON et al., 2002) ou microbiologiques.

Cette dernière technique est très largement utilisée particulièrement sous la forme de la méthode des quatre boîtes [MYLLYNI Ml et al. (2002),

COMMUNICATIONS 287

CREFF-FROGER (2000), AERTS et al. (l 995)). Le principe de cette méthode repo e ur la mi e en évidence d'une zone d'inhibition autour de l'échan­tillon. En France, la méthode officielle utilise deux bactéries et plusieurs pH: Bacillus subtilis à pH 6; 7,2 et 8 et Micrococcus luteus à pH8. Le tableau II ré urne en fonction de pH et des milieux de culture les résidus mi en évidence par la méthode de quatre boîtes. Cette technique permet de mettre en évidence de échantillon po itifs sans toutefois pouvoir discerner le principe actif pré ent ni connaître la concentration dans l'échantillon et fonc de avoir i celle-ci e t upérieure ou inférieure à la LMR.

Ce méthode de dépi tage doivent être complétées par des méthodes je confirmation qui doivent identifier la molécule à un niveau au moins deux foi inférieur à la LMR. Ce méthodes ont principalemet aujourd'hui je méthode phy ico-chimique tel que la chromatographie couplée à la ;pectrométri de mas ( M).

PH

Ré idu

identifié

Tableau Il. Résidus mis en é idenc par la méthode de quatre boîtes.

Micmcoccm /111eus T 9341

Bêta-la lamines

Macrolide

Micro-organi me

Bacil/u subtilis B.G.A.

6 7,2 + triméthoprime

Bêta-lactamine - Sulfamides

tétracycline

SPECTROMÉTRIE DE MASSE ET IDENTIFICATION DES RÉSIDUS

8

Aminosides

De nombreu e revue ont établi l'état de l'art en matière de spectro­métrie de ma e [KENNEDY et al. (1998), NIESSEN et TINIŒ (1995)]. Le principe de ba e en e t le uivant: une substance est identifiée par ses ions caractéri tique qui ont générés dans une source. Les ions obtenus et leurs ratios par rapport à l'ion majoritaire sont caractéristiques de la molécule car il ont fonction de la structure moléculaire dans des conditions définies (DELEPINE et al., 2002).

Ce méthode ont apparues récemment dans le domaine de l'analyse et de la recherche de ré idu .

En effet, ce n'e t qu'à partir de années 1990 que la possibilité de coupler la CLHP avec de détecteur de masse quadripolaire a rendu pos­sible leur utilisation (NIES EN et TINKE, 1995). Les premiers couplages tel que le "thermospray" et le "particule beam" ont permi de rechercher des résidus de princip actifs qui n pouvaient être do és jusqu'alors. Ces tech-

288 BULLETIN DE �ACADÉMIE VÉTÉRINAIRE DE FRANCE

niques de couplage sont aujourd'hui délai ée car leur champs d'inve ti­gation sont faibles (quelques familles d'antibiotique et ma e moléculaire faible< 1 500 daltons). Actuellement l'utili ation de ource à pre ion atmo­sphérique a augmenté le domaine d'application (figure l ).

100000 APl-Electrospr•y

10000

! ëi '3 1000 �

APCI

0 E � 100 • en "'

2

10

Non polaire Polarité de l'analyte Très polaire

Figure/. Domaine d'application de la spectrométrie de masse pour de ource d'ioni ation

à pression atmosphérique de type électro pray et APCI.

Deux sources d'ionisation sont principalement utili ée : l'électro pray (ESI) et l'ionisation chimique à pression atmo phérique (APCI). L'ESI permet de rechercher des composés polaire facilement ioni able et de masses moléculaires élevées (de l'ordre de 10000 dalton ). Au contraire, l' APCI permet d'identifier des composés peu polaire et de poids molécu­laires inférieurs à 1 500 daltons. Le potentiel de cette technologie a été aug­menté par l'utilisation de masse en tandem (SM/SM) permettant ainsi d'at­teindre des quantifications compatibles avec le LMR. Cet atout e t d'autant plus important lorsque J'analyse concerne la recherche de ubstance inter­dites ou la confirmation doit être univoque.

La décision européenne 657 /2002/CE (2002) définit l'en embJe de cri­tères de détection et de confirmation. Dans le cas de méthodes de dépi tage, un seuJ signal peut être utilisé. En revanche, pour une méthode de confir­mation il faut fournir un ensemble de trois points d'identification pour une molécule appartenant au groupe B de l'annexe 1 de la directive 96/23 (molé­cules ayant une LMR) et quatre points pour les molécule interdites (groupe A de directive 96/23).

Un exemple de nombre de points requi selon Je techniques utili é s est définit dans le tableau III.

COMMUNICATIONS 289

En complément du nombre de points, lintensité relative des ions par rapport à l'ion majoritaire era fournie. Ces intensités relatives devront être identique à celle obtenu pour un standard de calibration. Comme l'in­ten ité relative peut varier entre l 0 et l OO% il a été défini un niveau de tolé­rance. Le tableau III ré urne, en fonction du niveau d'intensité relative, les tolérance admi e .

Tableau J/I. Exemple de nombre de point appliqué pour l'identification des molécules

en pectrométrie de mas e et tolérances admises.

Identification Tolérance admi e

Technique mbre dïon Points d'identification lnten ité Tolérance

LC/M n n

>50% ±20%

L /M /M 1 précurseur 4 20% - 50% ±25% et 2 produit

10%- 20% ±30%

L /M /M 2 précurseurs 5 � 10% ±50%

et cha un 1 produit

EXEMPLES D'APPLICATION

Les molécules interdites

L'utili ation du chloramphénicol est interdite chez les animaux de rente. Il faut toutefoi être capable de rechercher et d'identifier cette sub­stance dan le denrée d origine animale. La figure 2 présente le chroma­togramme et le pectrogramme associés, d'une supplémentation de lait par chloramphénicol à la concentration de l µg/L. Un standard interne est utilisé (chloramphénicol deutéré) de façon à pouvoir quantifier et valider les étapes du proce us d'extraction. Trois transitions sont retrouvées pour le chloram­phénicol et une pour le tandard interne. Sur la base des transitions et du temps de rétention obtenu dan les conditions de séparation chromatogra­phique, l'identification du chloramphénicol est réalisée. Aujourd'hui, tous les pays de l'Union Européenne doivent être capable de détecter et de confirmer la présence à des concentrations inférieures à la limite de perfor­mance minimale requi e qui a été fixée à 0,3 µg/kg ou L par la Commission européenne.

Les molécule ayant une LMR

Le po ibilit offerte par la pectrométrie de masse sont intéres­sante dan 1 ca où de molécule ont un temps de rétention identique.

_2_90 ______ BU_LLETI __ N_D_E_I..:_' A_C_ADÉMIE VÉTÉRJNAJRE DE FRANCE

Avec des systèmes de détection da ique (UV), le pic corre pondant ont superposés sur un chromatogramme. En effet, ce molécule ont de ma e moléculaires différentes et l'ioni ation qu'elle ubi ent vont donner de spectrogrammes différents ce qui permettra de le identifier. Ceci e t illu tré par la figure 3a qui montre l'analy e imultanée de 6 ulfamide et de 6 macrolides dans le lait. Les concentration ont de 50 µg/L pour le deux composés, les LMR étant respectivement de 1 OO µg/L pour le ulfamide et comprises entre 40 et 200 µg/L pour le macrolide . L'inten ité de pic observés entre 5 et 10 minutes e t forte (20 000 à 120 000 cp ) et corre pond aux sulfamides. Entre 9 et 10 minute de faible pic ont ob ervé . La figure 3b correspond au chromatogramme de ce faible pic et qui ont 6 macrolides dont l'intensité est plu faible (500 à 2 500 cp ). Cette faible intensité reste toutefois suffisante pour di cerner le pic du aux macr lide du bruit de fond généré par la méthode et l'appareil.

i .2. � .. c ! .!:

300 - 270 !. 240 .2. 210 � 180 ïi 150 c 120 f 90 - 60

30 0

b

1600

1400

1200

1000

800

600

400

200

0

a 0

321/159

4,30

2 • 6 8 Tempe de� (min)

321/194 3211257

T,.nsitlona

Figure 2.

3251157

Chromatogramme (a) et spectrogramme (b) d'un échantillon de lait supplémenté

avec du chloramphénicol à la concentration de 1 µg/L. La transition 3251157 correspond au chloramphénicol d utér .

COMMUNICATIONS 291

Ainsi chaque molécule est identifiée spécifiquement et est associée à une quantification de a teneur dans la matrice. Compte tenu de cette spéci­ficité de l'analy e, l'extraction peut être simplifiée ce qui diminue le coût analytique et augmente la rapidité de l'analyse. Ainsi dans l'exemple présenté l'identification et la quantification de 12 composés de familles différente ont réalisées en une dizaine de minutes.

(a) SQX-SMX

-

SDX

(b)

SDZ SMZ

Temps de rétention (min)

Neospjramycine�

Spiramycine----------.

·�����������������.&.llolUJL....lo....��--l 0

Temps de rétention (min)

Figure 3. a) Chromatogrammes obtenu aprè analy e d'un lait contenant 6 sulfamides et 6 macro­

lides par spectrométrie de ma e en tandem. SDZ: Sulfadiazine, SMZ:

Sulfadiméthoxypiridazine, SQX: Sulfaquinoxaline, SMX: Sulfadiméthoxine, SOM:

Sulfadimérazine, DX: Sulfadoxine. b) Spectrogramme de 6 macrolide .

292 BULLETIN DE L'ACADÉMIE VÉTÉRI AIRE DE FRANCE

Application dans le cadre de la confirmation

Les méthodes microbiologique ont peu pécifique . La méthode de quatre boîtes permet d'identifier de famille d'antibiotique mai an pouvoir discerner le compo é actif. Par exemple, la boîte en emencée avec Micrococcus luteus met en évidence le échantillon contenant de bêta­lactamines ou des macrolide (tableau Il). Dan le ca d'échantillon positifs, il faut confimer la pré ence du ré idu • l'identifier et le quantifier pour s'assurer si la concentration pré ente e t au-de u ou en de ou de la LMR.

Le tableau IV présente le ré ultat obtenu pour de échantill n de muscles trouvés positifs par la méthode de quatre boîte et, confirmer en utilisant la spectrométrie de ma e en tandem.

Les échantillons M 1, M2 et M3 ont po itif re pectivement sur diffé­rentes boîtes. L'échantillon M3 pré ente la particularité d'être p . itif ur 3 boîtes caractéristiques des bêta-lactamine /tétracyclin s, des sulfamid s et des aminosides. Sur la ba e de cette analy e, il e t imp . sibl d c nnaîtr la nature du résidus et a teneur. L e ré ultat de l'analy. d c nfirmati n sont fournis dans le tableau IV. L e troi échantill n , nt nfirmé positifs. Le délai de l'analy e montre que l'échantill n onti nt d l'amoxicilline à une concentration de 50 µg/kg c'e t-à-dir un valeur id n­tique à la LMR. L'échantillon M2 contient de la tétracycline à un c ncen­tration de 180 µg/kg, valeur qui est upérieure à la L MR ( 1 OO µg/kg). L'échantillon M3 contient de la sulfadiméthoxine à une teneur de 650 µg/kg mais également de lacide oxolinique à 9 000 µg/kg. Ce valeur ont trè largement supérieures à la LMR fixée pour ce molécule qui e t de 100 µg/kg dans le muscle. Ces derniers ré ultat oulignent l'imp rtance de

réactions croisées et l'absence de spécificité de la répon e microbiologique. En effet, la zone d'inhibition d'un diamètre élevé (> 12 mm) e t certai­nement due à la présence d'acide oxolinique en forte concentration.

Tableau IV.

Confirmation, identification et quantification d'échantillon de mu cle

trouvés positifs par la méthode de quatre boîte .

Dépistage (Microbiologie)* Confirmation (HPLC SM/SM)

(diamètre en mm)

Matrice BS 6 BS 7,2 BS 8 ML8 Identification Concentration

(µg/kg)

Ml 8/8 Amoxicilline 50

M2 2.512.5 Tétracycline 180

M3 14114 13,5113 12/12 ulfadiméthoxine 650

Acide oxolinique 9000

BS: Baci/111.1" .mbtilü. ML: Micrococcus lute11s. M: M11scle.

*:dans le cas d'échantillons positifs (diamètre> 2 mm) les écha111il/011s sont dosts en double.

COMMUNICATIONS 293

CONCLUSION

La spectrométrie de masse est un outil indispensable à la confirmation des échantillon trouvés positifs par les méthodes de dépistage. Cependant l'inve ti ement pour acquérir ces équipements reste élevé (de l'ordre de 200 000 euro ).

Le avantage proposés par cette technologie sont nombreux. Dans de nombreux ca , la préparation des échantillons est simplifiée ce qui se traduit par de gain de temp d'analyse, mais également par une augmentation de la fiabilité de ré ultat .

Un autre point majeur est l'identification sans discussion de la molécule trou ée. La réglementation européenne a défini pour cette techno­logie de critère impie et préci permettant une identification des molé­cule aut ri ée. ou interdite .

Cett t chn 1 gie e t applicable à tout type de matrice queJles soient complexe. (grai. se. muscle, foie, miel, etc. ou non [CODONY et al. (2002), KAUFMA t al. (2002) J. D même, cette technique peut être utilisée pour rechercher de. ré idu d'antipara itaire (WU et al., 2001 ), des hormones et bêta-agoni t [DR 1 1 et al. (2000), JONES et al. ( 1999)), d' anti-inflam­matoire n n t 'roïdien ( LARK et al., 2002) et de pesticides (FERNANDEZ et al., 2001 ).

En conclu ion, la pectrométrie de masse est un outil majeur dans la surveillance de ré idu . Elle permet de confirmer sans discussion la pré­sence de ré idu et de déterminer si leur concentration est supérieure à la LMR.

Le per pective en matière de développement de cette technologie se situe au niveau de la mi e en place dans les laboratoires de contrôle de routine. La capacité à analyser un grand nombre d'échantillon, la simplifi­cation des étapes d'extraction devraient inciter les laboratoires départe­mentaux à s'équiper de ce type de matériel.

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294 BULLETIN DE L'ACADÉMIE VÉTÉRI AJRE DE FRANCE

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