STUDIUL POLIMORFISMULUI LA STRUGURII · deplină, conţinutul strugurilor în zaharuri variază între 14-35% sau 140-350g/l must. Zaharurile aflate în struguri şi must se găsesc

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE

ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ,

CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORALĂ

FACULTATEA DE HORTICULTURĂ

Biolog Trifan Daniela Silvia (Briciu)

STUDIUL POLIMORFISMULUI LA STRUGURII

DE MASĂ ŞI CARACTERIZAREA GENETICĂ A

MUSTURILOR

(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

CLUJ-NAPOCA

2011

Conducător ştiinţific:

Prof. univ. dr. Doru Pamfil

Trifan Daniela Silvia- Rezumat teză de doctorat

I

CUPRINS

INTRODUCERE ............................................................................................................................. 6 CAPITOLUL I ................................................................................................................................ 7 CONSIDERAŢII PRIVIND VIŢA DE VIE ................................................................................... 7

1.1 CALASIFICAREA SISEMATICO-BOTANICĂ A VIŢEI DE VIE ................................... 7 1.2 SISTEMATICA GENULUI VITIS ....................................................................................... 7

1.3 IMPORTANŢA VIŢEI DE VIE ........................................................................................... 7 CAPITOLUL II ............................................................................................................................... 8 CONTROLUL ŞI PREVENIREA FRAUDELOR ......................................................................... 8

2.1 FRAUDELE DIN VINIFICAŢIE DE-A LUNGUL TIMPULUI ......................................... 8 2.2 MIJLOACE ŞI METODE DE FALSIFICARE A SOIULUI ............................................... 8

2.3 METODELE ŞI MIJLOACELE PRIN CARE SE POATE FACE AUTENTIFICAREA

VINULUI DINTR-UN ANUMIT SOI ....................................................................................... 8

2.3.1 Analiza senzorială .......................................................................................................... 8 2.3.2 Metode moleculare aplicate la stabilirea autenticităţii soiurilor ................................... 9

CAPITOLUL III .............................................................................................................................. 9 GENERALITĂŢI PRIVIND MARKERII MOLECULARI ........................................................... 9

3.1 GENERALITĂŢI PRIVIND MARKERII MOLECULARI ................................................. 9 3.2 TIPURI DE MARKERI MOLECULARI UTILIZAŢI ÎN PREZENTA TEZĂ DE

DOCTORAT ............................................................................................................................... 9 3.3 UTILIZAREA AMPRENTĂRII GENETICE ÎN DETERMINAREA

POLIMORFISMULUI LA VIŢA DE VIE ............................................................................... 10

CAPITOLUL IV ........................................................................................................................... 11

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII, MATERIALUL ŞI METODA ............................. 11 4.1 SCOPUL CERCETĂRII ..................................................................................................... 11 4.2 OBIECTIVELE URMĂRITE ÎN CERCETĂRILE AFERENTE TEZEI DE DOCTORAT

................................................................................................................................................... 12 4.3 MATERIALUL BIOLOGIC ............................................................................................... 12

4.4 AMORSELE RAPD UTILIZATE PENTRU AMPLIFICAREA ADN-ULUI .................. 13 4.5 AMORSELE SSR UTILIZATE ÎN AMPLIFICAREA ADN-ULUI ................................. 13 4.6 TEHNICI ŞI METODE CERCETARE .............................................................................. 14

4.6.1 Extracţia ADN-ului în vederea realizării analizelor RAPD şi SSR pentru determinarea

polimorfismului la viţa de vie ............................................................................................... 14 4.6.2 Tehnici şi metode de cercetare utilizate în vederea obţinerii ADN-ului din must ....... 14

4.6.2.1 Obţinerea mustului ........................................................................................ 14 4.6.2.2 Păstrarea mustului ........................................................................................ 14

4.6.2.3 Extracţia ADN-ului din must în vederea realizării analizelor SSR .............. 15 4.6.3 Cuantificarea ADN-ului ............................................................................................... 15

4.7 AMPLIFICAREA ADN-ULUI CU AJUTORUL AMORSELOR RAPD ......................... 15 4.7.1 Componentele amestecului de reacţie RAPD .............................................................. 15 4.7.2 Amplificarea PCR ........................................................................................................ 16

4.8 AMPLIFICAREA ADN-ULUI CU AJUTORUL AMORSELOR SSR ............................. 16 4.8.1 Componentele amestecului de reacţie PCR ................................................................. 16

4.9 ANALIZAREA IMAGINILOR .......................................................................................... 18 CAPITOLUL V ............................................................................................................................. 18

REZULTATE ŞI DISCUŢII ......................................................................................................... 18 5.1 REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA ADN-ULUI ŞI ESTIMAREA CANTITĂŢII ŞI

CALITĂŢII ACESTUIA .......................................................................................................... 18


II

5.2 REZULTATE PRIVIND AMPLIFICAREA ŞI ELECTROFOREZA PRODUŞILOR DE

REACŢIE RAPD ...................................................................................................................... 19 5.3 REZULTATE PRIVIND ANALIZA IMAGINILOR ŞI INTERPRETAREA DATELOR

OBŢINUTE CU AMORSELE RAPD ...................................................................................... 19

5.4 REZULTATE PRIVIND ANALIZA ŞI INTERPRETAREA DATELOR OBŢINUTE CU

AMORSELE SSR ..................................................................................................................... 20 5.5 REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA ADN-ULUI DIN MUST ŞI ESTIMAREA

CANTITĂŢII ŞI CALITĂŢII ACESTUIA .............................................................................. 24 5.6 ANALIZA SOIURILOR CU AJUTORUL AMORSELOR MICROSATELITICE SSR .. 26

CONCLUZII ................................................................................................................................. 29 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ .................................................................................................... 30 THESIS RESUME………………………………………………….…………………………....33


III

TABLE OF CONTENTS

INTRODUCTION………………………………………………………………………………...6

CHAPTER I…………………………………………………………………………………….....7

CONSIDERATIONS REGARDING THE VINE……………………………………………...…7

1.1 THE SYSTEMATIC BOTANICAL CLASSIFICATION OF VINE………...................7

1.2 VITIS GENDER SYSTEMATICS………………………………………………...........7

1.3 THE IMPORTANCE OF VINE…………………………………………………………7

CHAPTER II………………………………………………………………………………………8

FRAUD PREVENTION AND CONTROL………………………………………………………8

2.1 WINE MAKING FRAUDS OVER TIME……………………………………………….8

2.2 MEANS AND METHODS OF WINE VARIETY FALSIFICATION……………….....8

2.3 METHODS AND MEANS BY WHICH AUTHENTICATION CAN BE DONE FOR A

WINE VARIETY………………………………………………………………………….....8

2.3.1 Sensory analysis……………………………………………………………………..8

2.3.2 Molecular methods applied to determine the authenticity of varieties……………..9

CHAPTER III………………………………………………………………………………...…...9

METHODS OF GENETIC FINGERPRINTING………………………………………………...9

3.1 GENERAL INFORMATION REGARDING MOLECULAR MARKERS…………….9

3.2 DIFFERENT TYPES OF MOLECULAR MARKERS USED IN THIS THESIS……..9

3.3 GENETIC FINGERPRINTING USED IN DETERMINING THE VINE

POLYMORPHISMS………………………………………………………………………..10

CHAPTER IV…………………………………………………………………………………....11

RESEARCH OBJECTIVES AND PURPOSE, MATERIAL AND METHOD………………...11

4.1 RESEARCH PURPOSE………………………………………………………………...11

4.2 OBJECTIVES PURSUED IN THE PHD THESIS RESEARCH WORK……………...12

4.3 BIOLOGICAL MATERIAL……………………………………………………………12

4.4 RAPD PRIMERS USED FOR DNA AMPLIFICATION………………………………13

4.5 SSR PRIMERS USED FOR DNA AMPLIFICATION…...........................................…13

4.6 RESEARCH METHODS AND TECHNIQUES……………………………………….14

4.6.1 Using DNA extraction to achieve RAPD and SSR analysis for determining the vine

polymorphism…………………………………………………………………………....14

4.6.2 Research techniques and methods used to obtain DNA from

must……………………………………………………………………………………....14

4.6.2.1 Obtaining the grape must………………………………………………………...14

4.6.2.2 Must preservation……………………………...………………………………....14

4.6.2.3 Extraction of DNA from must in order to achieve SSR analysis………………...15

4.6.3 DNA quantification………………………………………………………………...15

4.7 DNA AMPLIFICATION WITH RAPD PRIMERS…………………………………...15

4.7.1 RAPD reaction mixture components……………………………………….….…..15

4.7.2 Amplificarea PCR……………………………………………………………….....16

4.8 DNA AMPLIFICATION USING SSR PRIMERS……………………………………..16

4.8.1 PCR reaction mixture components………………………………………………...16

4.9 IMAGE ANALYSIS……………………………………………………………………18

CHAPTER V………………………………………………………………………………….…18

RESULTS AND DISCUSSION…………………………………...………………………….....18

5.1 RESULTS REGARDING DNA EXTRACTION AND ESTIMATION OF THE DNA

QUANTITY AND QUALITY……………………………………………………………...18

5.2 RESULTS REGARDING THE AMPLIFICATION AND ELECTROPHORESIS OF

RAPD REACTION PRODUCTS…………………………………………………………...19


IV

5.3 RESULTS REGARDING THE IMAGE ANALYSIS AND INTERPRETATION OF

DATA OBTAINED WITH RAPD PRIMERS.......................................................................19

5.4 RESULTS REGARDING THE ANALYSIS AND INTERPRETATION OF DATA

OBTAINED WITH SSR PRIMERS………………………………………………………..20

5.5 RESULTS REGARDING DNA EXTRACTION FROM MUST AND ESTIMATION

OF QUANTITY AND QUALITY……………………………………………………….....24

5.6 VARIETY ANALYSIS USING SSR MICROSATELLITE PRIMERS………………26

CONCLUSIONS………………………………………………………………………………...29

SELECTIVE BIBLIOGRAPHY...................................................................................................30

THESIS RESUME…………………………………………………………………………….....33


6

INTRODUCERE

Viţa de vie este una dintre cele mai răspândite culturi horticole, de mare importanţă

economică. Soiurile de Vitis vinifera, împreună cu alte specii ale genului Vitis sunt în studiu

permanent, în sectoarele de cercetare din ameliorare, protecţie a plantelor şi, de curând, din

industria farmaceutică.

Problemele care apar continuu în păstrarea purităţii soiurilor, combaterea ecologică a

bolilor şi a dăunătorilor, obţinerea de soiuri rezistente în condiţii grele de climă şi pedologice,

necesită o foarte bună cunoaştere a bazelor genetice ale acestor caractere fenotipice de

importanţă economică.

Identificarea cultivarelor de viţă de vie se face în mod tradiţional pe baza caracterelor

morfologice. În prezent, markerii moleculari s-au dovedit a fi o alternativă în identificarea

soiurilor de viţă de vie şi pot fi folosiţi în investigarea relaţiilor taxonomice dintre speciile de

Vitis.

Markerii moleculari sunt direct legaţi de genotip şi independenţi de fenotip, fapt ce îi

face să fie utilizaţi în identificarea cultivarelor. Ei pot fi folosiţi în programele de ameliorare şi

mapare a genomului, deoarece sunt linkaţi cu unele gene de interes.

Cercetările de genetică moleculară la viţa de vie sunt orientate în general, spre

identificarea polimorfismului existent în cadrul speciilor de Vitis şi spre stabilirea originii

filogenetice a unor specii sau soiuri.

Viţa de vie este o specie dificil de analizat din punct de vedere genetic datorită

principalelor caracteristici şi anume: durata lungă a generaţiilor, grad înalt de heterozigoţie,

depresia ridicată la consangvinizare.

Tehnologia markerilor moleculari foloseşte secvenţa de ADN, ce este uşor detectată şi a

cărei succesiune poate fi uşor monitorizată. Utilizarea markerilor moleculari se bazează pe

ADN-ul polimorfic. Această tehnică este utilizată pe scară largă în ultimii ani în studii genetice

şi identificarea de soiuri. Identificarea soiurilor de viţă de vie se face cu markeri moleculari,

având la bază reacţia PCR şi folosind ca tehnici moleculare RFLP-ul, RAPD-ul, AFLP-ul şi

SSR-ul.

O altă problemă importantă apărută este autentificarea vinurilor. Vinul, acest “copil

teribil” obţinut din relaţia viţei de vie cu soarele este o adevărată binecuvântare a naturii. Prin

multitudinea componentelor şi a numeroaselor sale principii nutritive, existente într-o

armonioasă cumpănire, vinul, consumat raţional, este o sursă de energie, care poate conferi

omului bună dispoziţie, încântare, înţelepciune şi extaz. Un strop de vin poate constitui un strop

de viaţă adevărată ce poate amplifica bucuria de a trăi. (Cotea, 1995).

Determinarea amprentei genetice la vin este deosebit de importantă atât pentru

producatorii de vin cât şi pentru agenţiile de control guvernamental sau ale protecţiei

consumatorului având în vedere că peste 30 % din vinurile autohtone sunt greşit etichetate. La

ora actuală tehnicile de biologie moleculară (RFLP, RAPD, SSR) sunt folosite pe scară largă

pentru caracterizarea genetică a soiurilor de viţă de vie. Aceste tehnici se pot extrapola şi la

detectarea ADN-lui rezidual din vin. Interesul major pentru acest domeniu a facut ca o serie de

laboratoare să pună la punct diverse metode de amprentare. Din păcate aceste metode nu au fost

până în prezent publicate sau patentate.

Deşi extracţia ADN-ului din ţesuturile vegetale este o tehnică bine cunoscută, în cazul

musturilor şi a vinurilor tinere există puţine referinţe bibliografice în acest sens. Principalele

constrângeri sunt legate de dificultatea obţinerii unui ADN de înaltă calitate pretabil pentru

amplificare, datorită probabil, interferenţei polizaharidelor, taninilor şi polifenolilor din aceste

mixturi, sau degradării ADN-ului ca urmare a acţiunii enzimatice şi biochimice din procesul

tehnologic de fabricare a vinului.


7

CAPITOLUL I

CONSIDERAŢII PRIVIND VIŢA DE VIE

1.1 CALASIFICAREA SISEMATICO-BOTANICĂ A VIŢEI DE VIE

Viţa de vie face parte din familia Vitaceae (Lindl) - Ampelidaceae (Kunth), familie cu

mare număr de taxoni şi soiuri, cu mare arie de răspândire şi valenţă ecologică.

Principalele specii ale genului Vitis s-au format în cadrul ecologic a trei arii geografice

diferite, care au imprimat caracteristici morfologice şi productive diferite.

Vitaceaele sunt reprezentate prin 12 genuri, după cei mai mulţi autori, iar după unii, prin

14 sau chiar 18 genuri şi cca 1100 specii, răspândite pe un areal geografic foarte larg. Dintre

acestea genul Vitis este cel mai important, deoarece cuprinde speciile de viţă de vie care se

cultivă pentru producţia de struguri şi cele care se folosesc pentru portaltoi. Se cunosc 108 specii,

răspândite în zonele temperate, subtropicale şi tropicale din Europa, Asia, America de Nord,

America Centrală, America de Sud. Din cele 108 specii, numai 60 sunt bine identificate: 33

specii americane, 27 specii asiatice, în care se include specia Vitis vinifera (Pop, 2003b).

1.2 SISTEMATICA GENULUI VITIS

Genul Vitis cuprinde aproximativ 60 de specii dioice distribuite aproape uniform între

America şi Asia, acestea reprezentând o resursă considerabilă de gene pentru rezistenţa la

patogeni. (Mullins şi colab., 1992).

Genul Vitis a fost subdivizat de către Planchon în 1887 în două subgenuri sau secţii:

- subgenul Muscadinia, cuprinde speciile de viţe răspândite în regiunile tropicale şi

subtropicale ale Americii de Nord. Strugurii sunt mici, cu gust foxat şi cu boabe puţine,

care se maturează succesiv; boabele slab suculente acumulează cantităţi mici în zaharuri;

seminţele aproape rotunde cu chalază ovală şi încreţită. Numărul de cromozomi este

2n=38

- Subgenul Euvitis (Vitis) cuprinde speciile de viţă adevărate, din zonele temperate ale

Europei şi Asiei, Americii de Nord, Centrale şi de Sud. Strugurii sunt mari cu boabe

numeroase, care se menţin pe ciorchine şi după maturarea lor. Bobul este cărnos sau

zemos, în care se acumuează multe zaharuri, seminţe piriforme cu rostru lung. Numărul

de cromozomi de bază este n=19 şi se cunosc soiuri triploide cu 2n=57, tetraploide

2n=76, considerate ca mutaţii, pentaploide 2n=95, hiperploide 2n=40 (Constantinescu,

1971).

1.3 IMPORTANŢA VIŢEI DE VIE

Dintre fructele comestibile, strugurii sunt foarte mult căutaţi şi apreciaţi. Aspectul lor

atrăgător, gustul placut, dar mai ales valoarea alimentară deosebită, le creează un regim

preferenţial de consum, intrând astfel în categoria fructelor de elită de tip delicatese. Au o

stuctură complexă şi cu implicaţie directă în organismul uman, sub aspect energetic,

reconfortant, vitaminizant, mineralizant, reactivant, la care se adaugă însuşirile dietetice şi

terapeutice. Valoare alimentară prezintă nu numai strugurii ca atare, ci şi mustul şi vinul

consumat raţional.

Strugurii au o compoziţie chimică foarte complexă: pe lângă apă care se găseşte în cea

mai mare proporţie în compoziţia bobului, zaharurile ocupă locul al doilea. La maturitatea

deplină, conţinutul strugurilor în zaharuri variază între 14-35% sau 140-350g/l must. Zaharurile

aflate în struguri şi must se găsesc sub formă simplă - monozaharide. Zaharurile simple sunt

asimilate direct în organism, trec în sânge, şi apoi furnizeză organismului energia cheltuită (100g

struguri proaspeţi furnizează între 60-116 calorii sau 1kg struguri, 700-1200 calorii)

Vinurile de struguri conţin cantităţi minime de vitamine, care nu pot satisface pe deplin

cerinţele organismului. Însă diversitatea şi acţiunea complexă a vitaminelor determină


8

importanţa lor. Vitaminele B1, B2, B6, B12, PP şi acidul pantotenic sunt prezente în cantităţi ce

satisfac aproximativ 10% din necesităţile zilnice ale omului. Biotina şi acidul folic se găsesc într-

o măsură mai mică, iar mezoinozitul- în cantităţi ce corespund aproximativ necesarului zilnic al

omului.

CAPITOLUL II

CONTROLUL ŞI PREVENIREA FRAUDELOR

2.1 FRAUDELE DIN VINIFICAŢIE DE-A LUNGUL TIMPULUI

Trăim într-o vreme când procesul de globalizare, care a inclus numeroase industrii, tinde

să acapareze şi domeniul vitivinicol, când vinuri de pe tot globul se vând pe tot globul, iar

consumatorul modern, mereu în criză de timp, îşi doreşte să se delecteze în sigranţă cu băutura

zeilor, nemuritorul vin. Totodată, profitându-se parcă de beneficiile şi de posibilităţile

prezentului, se găsesc persoane dornice de îmbogăţire prin înşelătorie, eludând legile şi regulile

vitivinicole (Nămăloşanu, I şi colab.2005).

Printre practicile des întâlnite se numără la loc de cinste „botezarea” vinului cu apă,

adăugarea de sulfat de potasiu. Progresele făcute de chimia de sinteză s-au făcut simţite puternic

si în domeniul contrafacerii vinurilor. Astfel, aciditatea vinului este îmbunătăţită cu acid sulfuric,

acidul salicilic poate înetini sau opri total fermentaţia, sulfatul de fier serveşte la ameliorarea

gustului etc. (Ţârdea, 2003).

Alte tipuri de fraude se referă la autenticitatea soiului şi mai ales la arealul de producere.

Consumatorul este dus în eroare asupra anului de recoltă, soiului, categoria de calitate a vinului,

arealului de provenienţă şi chiar modificarea caracteristicilor de compoziţie şi organoleptice.

Aceste falsificări se referă mai mult la vinurile de consum curent, uneori şi la cele de calitate

superioară şi în secial la vinurile aromate.

Viorel Stoian (2001) analizează mecanismul prin care un vin dintr-un soi binecunoscut

„Galbenă de Odobeşti”, a ajuns să se găsească pe piaţă în cantităţi de 3-4 ori mai mari decât se

pot obţine din producţia autohtonă de struguri din acest soi. Adăugarea în reţeta vinului de

struguri din alte soiuri, precum şi apariţia unor sticle clonate cu etichete stranii precum Galbena

Golden sunt consecinţa dorinţei unora de a exploata faima dobândită- mai mult sau mai puţin

meritat- de acest soi în ochii consumatorilor.

2.2 MIJLOACE ŞI METODE DE FALSIFICARE A SOIULUI

Falsificarea soiului se face cu multă uşurinţă. Distingem două situaţii diferite:

- un vin corect, produs dintr-un anumit soi de struguri, sau un amestec de asemenea vinuri,

este pur şi simplu comercializat sub denumirea altui soi, care este mai cerut pe piaţă, sau

aduce un profit mai mare (se vinde la un preţ mai bun)

- un aşa-zis vin falsificat din alte puncte de vedere este vândut ca vin, ba mai mult este

vândut sub denumirea unui soi cunoscut.

La acestea se adaugă şi cazurile de amestecare a vinurilor în diverse proporţii, după cum

are nevoie comerciantul, fără să respecte cerinţele de a avea minimum 85% dint-un soi atunci

când trecem soiul pe etichetă, minimum 85% vin dintr-un anumit an de producţie, atunci când

trecem anul pe etichetă sau ca vinurile să fie din aceeaşi zonă pentru a putea purta denumire de

origine (Antoce, 2005).

2.3 METODELE ŞI MIJLOACELE PRIN CARE SE POATE FACE

AUTENTIFICAREA VINULUI DINTR-UN ANUMIT SOI

2.3.1 Analiza senzorială

Deşi analiza senzorială este subiectivă, ea este uneori mai semnificativă decât analizele

chimice obiective. Un degustător bine instruit va putea, în majoritatea cazurilor să diferenţieze


9

un Cabernet Sauvingnion veritabil de un vin de duzină vândut sub acelaşi nume. Dar, există şi

unele inconveninnte, în sensul că un falsificator are la dispoziţie mijloace performante, de la

arome sintetice „identic naturale”, până la aparate de analiză şi control de ultimă generaţie, cu

ajutorul cărora atinge performanţa de a păcăli chiar unii degustători calificaţi. Cu alte cuvinte,

există şi posibilitatea unor erori în sensul declarării drept autentice a unor vinuri falsificate cu

multă grijă.

2.3.2 Metode moleculare aplicate la stabilirea autenticităţii soiurilor

Pentru a mai echilibra puţin lucrurile, cercetătorii au propus o nouă metodă de lucru,

bazată pe caracterizarea ADN-ului dintr-o probă de vin brută, netratată, provenită dintr-un singur

soi de viţă de vie. Deja această informaţie este disponibilă pentru un număr de peste 600 de

soiuri de viţă de vie. Analiza ADN-ului dintr-un vin oarecare permite, apoi identificarea soiurilor

de viţă din care a fost obţinut acesta. Se întrevăd totuşi unele dificultăţi în acest sens, deoarece

vinul pus în consum este, de obicei purificat şi stabilizat printr-o multitudine de tratamente

fizico-chimice, care afectează ADN-ul conţinut în acesta. Câteva zile de fermentaţie a mustului

sunt suficiente pentru ca ADN-ul din must să fie degradat într-o asemenea măsură încât,

extragerea ADN-ului sa fie dificilă. (Nămăloşanu şi colab, 2005).

CAPITOLUL III

GENERALITĂŢI PRIVIND MARKERII MOLECULARI

3.1 GENERALITĂŢI PRIVIND MARKERII MOLECULARI

Pentru conservarea eficientă a resurselor genetice vegetale este necesară stabilirea cât mai

exactă a variabilităţii genetice a acestora, ce poate fi determinată la două nivele, fenotipică şi

genotipică. Variabilitatea fenotipică se bazează pe analiza morfologiei plantelor, cea genetică pe

markerii moleculari.

Markerii genetici sunt de trei tipuri: markeri morfologici, markeri proteici şi markeri

moleculari. ( Vicente şi colab, 2004)

Markerii morfologici sunt uşor de utilizat, nu necesită echipamente costisitoare, putându-

se efectua o evaluare rapidă a fenotipului cu ajutorul lor. Ca dezavantaje prezintă următoarele: se

găsesc în număr limitat, sunt influenţaţi de condiţiile de mediu şi de stadiul de dezvoltare al

plantei şi necesită evaluarea de către experţi în cunoaşterea speciei respective.

Markerii biochimici (proteici) se bazează pe proprietatea proteinelor de a fi separate în

urma electroforezei. Tipuri de markeri biochimici sunt proteinele rezultate în urma stocării

seminţelor, izoenzimele

Markerii ADN (moleculari) evidenţiază polimorfismul la nivelul ADN-ului nuclear şi

citoplasmatic. Markerii moleculari nu sunt influenţaţi de condiţiile de mediu, fiind o măsură

obiectivă a variabilităţii, există în număr nelimitat, acoperind întregul genom, dar necesită

echipamente complexe de analiză.

Markerii ideali ar fi caracterizaţi de următoarele proprietăţi: polimorfism ridicat,

reproductibilitate mare, codominanţă, distribuţie uniformă în genom, distinctivitate (să

evidenţieze diferenţele între indivizi înrudiţi), neinfluenţaţi de condiţiile de mediu, neutri (alela

prezentă la locusul markerului să fie independentă, fără efect asupra presiunii de selecţie aplicată

individului), necostisitori, uşor de utilizat. (Vicente şi colab, 2004)

3.2 TIPURI DE MARKERI MOLECULARI UTILIZAŢI ÎN PREZENTA TEZĂ DE

DOCTORAT

Markerii RAPD (Random amplified polymorphic DNA - polimorfisme de ADN

amplificate aleator) sunt rezultaţi prin amplificarea PCR a unor segmente necunoscute de ADN

genomic cu ajutorul unei amorse decamere aleatoare (Williams şi colab., 1990). Produşii de


10

amplificare sunt migraţi într-un gel de agaroză şi vizualizaţi prin colorare cu bromură de etidiu

(fluorescentă în lumină ultravioletă) sau azotat de argint. Diversitatea genetică şi relaţiile de

înrudire dintre indivizi se evaluează pe baza prezenţei sau absenţei benzilor, rezultând o

amprentă genetică specifică.

În urma amplificării cu amorsa decameră aleatoare rezultă un număr mare de fragmente

de dimensiuni variabile (300-2000 pb), însă acestea pot prezenta problema co-migrării

(fragmentele cu aceeaşi greutate moleculară pot avea structuri diferite, astfel presupunerea lipsei

polimorfismului pentru banda respectivă fiind eronată). Fiind o metodă simplă, necostisitoare şi

care nu necesită cunoaşterea secvenţei de ADN ţintă, RAPD se utilizează şi astăzi în analizele

genetice, deşi markerii sunt dominanţi iar reproductibilitatea între laboratoare e scăzută. (Karp,

A. şi colab, 1997).

Microsateliţii (ADN înalt repetitiv) cunoscuţi ca şi SSRs (Simple Sequence Repeats) sau

STRs (Short Tandem Repeats) au fost descrişi pentru prima dată de Hamada şi colab. (1984) ca

şi secvenţe scurte de ADN constituite din 1 până la 6 nucleotide repetitive în tandem. Această

clasă de secvenţe simple de ADN se regăseşte sub formă abundentă şi uniformă în genomurile

organismelor eucariote. Aceste secvenţe nu se transcriu în ARN şi, între ampla varietate de

funcţionare care se atribuie se include şi reglarea genetică (Hamada şi colab. 1984) şi de a

acţiona ca semnale pentru conversia genetică şi recombinare (Jeffers şi colab. 1985). Reprezintă

secvenţe scurte (1-10 pb, de obicei 2-3 pb) de nucleotide ce se repetă în tandem, găsindu-se în

proporţie mai mare la nivelul centromerului şi telomerelor (ADN non-informaţional) (Gupta PK

şi colab, 1996). Pentru a putea fi utilizaţi ca markeri trebuie cunoscută localizarea lor în genom.

Polimorfismul apare datorită variaţiei în număr a repetiţiilor în tandem în urma amplificării PCR

cu amorse complementare secvenţelor ce flanchează ADN-ul microsatelit (secvenţe conservate

în cadrul speciei, uneori şi a genului). Produşii de amplificare (benzi de 200-300 pb, ce diferă

între ele ca mărime prin cel puţin 10-20 pb) sunt migraţi în gel de agaroză şi vizualizaţi prin

colorare cu BrEt. Produşii în general sunt migraţi în gel de poliacrilamidă şi vizualizaţi prin

colorare cu azotat de argint sau cu ajutorul izotopilor radioactivi. Produşii se pot secvenţializa

pentru o analiză foarte clară a rezultatelor.

Numărul de repetiţii este variabil şi, în general, gradul de polimorfism creşte cu

longitudinea totală a microsatelitului (Weber,1990) care nu poate fi mai mare de 0.1Kb.

3.3 UTILIZAREA AMPRENTĂRII GENETICE ÎN DETERMINAREA

POLIMORFISMULUI LA VIŢA DE VIE

Viţa de vie este o specie dificil de analizat din punct de vedere genetic datorită

principalelor caracteristici şi anume: durata lungă a generaţiilor, grad înalt de heterozigoţie,

depresia ridicată la consangvinizare.

Perfecţionarea metodelor de analiză a ADN-ului, cum ar fi RAPD, AFLP şi SSR au

deschis noi posibilităţi de caracterizare şi comparare a genotipurilor, independent de fenotip şi,

respectiv, de exprimarea genelor în funcţie de condiţiile de mediu. Utilizarea tehnicilor de

analiză bazate pe PCR au permis detectarea polimorfismului ADN în loci dispuşi randomizat

(RAPD, AFLP) sau specific (SSR) în genom. Utilizarea markerilor ADN a crescut enorm

potenţialul pentru caracterizarea soiurilor cultivate şi a descendenţilor acestora.

Markerii moleculari ca AFLP, RAPD, şi SSR au fost utilizaţi în studii genetice la viţa de

vie. Aceste studii au dus la înţelegerea relaţiei dintre soiuri din aceeaşi regiune sau din regiuni

diferite. Nivelul înalt de heterozigoţie prezent la viţa de vie multiplicată vegetativ permite

diferenţierea între cele mai importante soiuri aproape prin orice tehnică moleculară.

Ca urmare a perfecţionării tehnologiei PCR, a fost dezvoltată tehnica RAPD. Aceasta

este ieftină, rapidă şi uşoară şi a fost aplicată pentru detectarea diferenţelor genetice între diferite

varietăţi, specii de viţă de vie şi portaltoi. Marele dezavantaj al acestei metode este dependenţa

rezultatelor de condiţiile stricte de lucru. Diferite aparate PCR, Taq polimeraze, concentraţii


11

diferite ale amorselor şi ale ADN-ului, precum şi persoana care realizează experimentul

influenţează rezultatele. Stabilitatea rezultatelor poate fi obţinută numai prin respectarea strictă a

condiţiilor standard de realizare a experimentului.

Markerii microsatelitici sunt utilizaţi, începând cu mijlocul anilor 90, pentru

caracterizarea genetică a diferitelor soiuri de viţă de vie cultivate în diverse ţări cu tradiţie

viticolă. Aceasta, deoarece locii microsatelitici oferă un profil genetic unic pentru fiecare soi,

permiţând caracterizarea fără echivoc a oricărei varietăţi (Di Gaspero şi colab, 2000). Thomas şi

colab., 1993 au aplicat pentru prima dată tehnica SSR pentru identificarea varietăţilor de viţă de

vie. Aceştia au demonstrat că secvenţele microsatelitice sunt abundente în genomul viţei de vie şi

sunt înalt informative pentru identificarea varietăţilor de Vitis vinifera. Prin analiza pedigree s-a

demonstrat că acest tip de markeri moleculari este transmis la descendenţi după legile

mendeliene ale eredităţii codominant, confirmând faptul că sunt adecvaţi pentru cartarea genetică

şi investigarea gradului de înrudire genetică.

Determinarea amprentei genetice la vin este deosebit de importantă atât pentru

producatorii de vin cât şi pentru agenţiile de control guvernamental sau ale protecţiei

consumatorului având în vedere că peste 30 % din vinurile autohtone sunt greşit etichetate. La

ora actuală tehnicile de biologie moleculară (RFLP, RAPD, Microsateliţi) sunt folosite pe scară

largă pentru caracterizarea genetică a soiurilor de viţă de vie. Aceste tehnici se pot extrapola şi la

detectarea ADN-lui rezidual din vin. Interesul major pentru acest domeniu a facut ca o serie de

laboratoare să pună la punct diverse metode de amprentare. Din păcate aceste metode nu au fost

până în prezent publicate sau patentate.

Deşi extracţia ADN-ului din ţesuturile vegetale este o tehnică bine cunoscută, în cazul

musturilor şi a vinurilor tinere există puţine referinţe bibliografice în acest sens. Până în prezent

nici un autor nu a raportat reuşita extracţiei ADN-ului din vinuri vechi. Principalele constrângeri

sunt legate de dificultatea obţinerii unui ADN de înaltă calitate pretabil pentru amplificare,

datorită probabil, interferenţei polizaharidelor, taninilor şi polifenolilor din aceste mixturi, sau

degradării ADN-ului ca urmare a acţiunii enzimatice şi biochimice din procesul tehnologic de

fabricare a vinului.

Baleiras-Couto şi Eiras-Dias (2006) au perfecţionat o metoda eficientă de extracţie pentru

ADN rezidual din must şi vinuri, de calitate adecvată pentru amplificarea cu microsateliţi.

Markerii microsatelitici din genomul cloroplastelor au fost utilizaţi pentru caracterizarea ADN-

ului din must şi vinuri în vederea certificării acestuia din viţă de vie. Un studiu recent a

demonstrat că ADN-ul rezidual de la viţa de vie şi de la Saccharomyces cerevisae sunt prezente

în musturi şi vinuri vechi de până la 2 ani, iar acest ADN poate fi utilizat pentru amplificare cu

microsateliţi şi cuantificare la RT-PCR (Savazzini şi colab., 2006).

În cazul musturilor multivarietale, markerii microsatelitici sunt cei care permit

autentificarea vinului prin relaţia dintre proporţia fiecărei varietăţi şi intensitatea semnalului

alelelor specifice fiecărui soi. În plus, se poate cuantifica proporţia fiecărui soi introdus în

procesul de vinificaţie.

CAPITOLUL IV

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII, MATERIALUL ŞI METODA

4.1 SCOPUL CERCETĂRII

În cadrul prezentului studiu scopul propus a fost analizarea la nivel molecular a

polimorfismul genetic la 10 soiuri de viţă de vie pentru strugurii de masă, prin metoda RAPD şi

cea a markerilor microsatelitici (SSR- Simple Sequence Repeats). Pentru fiecare soi de viţă de

vie luat în studiu, vor fi identificaţi loci microsatelitici care pot fi utilizaţi pentru caracterizarea

genetică a acestor soiuri. Majoritatea markerilor SSR sunt constituiţi din repetiţii dinucleotidice

[(AC)n, (AG)n şi (AT)n]. Repetiţiile dinucleotidice (AT)n sunt relativ abundente la plante şi


12

prezintă un grad ridicat de polimorfism. Polimorfismul apare datorită variaţiei în număr a

repetiţiilor în tandem în urma amplificării PCR cu amorse complementare secvenţelor ce

flanchează ADN-ul microsatelit (secvenţe conservate în cadrul speciei, uneori şi a genului).

Un alt scop propus în cadrul acestei teze a fost stabilirea unei metode eficiente de

extracţie a ADN-ului din musturi şi vinuri tinere. S-a urmărit de asemenea şi compararea

profilelor genetice a soiurilor de viţă de vie din musturi monovarietale cu profilele genetice din

frunzele aceluiaşi soi.

Elaborarea de vinuri monovarietale ce prezintă caracteristici conferite de struguri are o

mare relevanţă la nivel mondial. Aceste soiuri sunt reprezentative pentru zonele vitivinicole,

prezentând Denumire de Origine. Acest lucru face să existe un control strict pentru a garanta

autenticitatea lor. De aceea, căutarea metodelor de identificare a soiurilor în vinuri au o mare

importanţă în obţinerea unui produs final de înaltă calitate.

4.2 OBIECTIVELE URMĂRITE ÎN CERCETĂRILE AFERENTE TEZEI DE

DOCTORAT

Cercetările din experimentele realizate în prezenta teză de doctorat au vizat atingerea

următoarelor obiective:

1. Identificarea amorselor RAPD capabile să genereze polimorfisme la nivel molecular între

soiurile studiate

2. Alegerea amorselor SSR capabile să discrimineze soiurile analizate

3. Stabilirea distanţelor genetice apărute între soiurile luate în studiu

4. Extracţia ADN-ului din frunze de viţă de vie şi evidenţierea profilului alelic al soiurilor

analizate. Profilul alelic obţinut va permite identificarea precisă şi discriminarea între

soiurile testate. Pe baza acestui profil va fi analizat ADN-ul extras din must şi vinuri.

5. Stabilirea unui protocol pentru extracţia ADN-ului din must şi vinuri tinere.

6. Realizarea unui studiu privind degradarea ADN-ului pe parcursul procesului de

fermentaţie a mustului şi după terminarea acestuia.

7. Amprentarea genetică a soiurilor luate în studiu cu ajutorul amorselor SSR.

Caracterizarea musturilor şi vinurilor tinere se va realiza prin amplificarea cu markeri

microsatelitici pentru a se evidenţia profilul alelic. Rezultatele obţinute vor permite verificarea

autenticităţii acestora prin compararea ADN-ului extras din must şi vinuri cu ADN-ul obţinut din

frunze al soiurilor de vin utilizate. Acest lucru este de importanţă majoră pentru controlul calităţii

şi protecţia consumatorului, oferind o garanţie ce contribuie la menţinerea valorii soiurilor

folosite şi evitarea utilizării abuzive a numelor prestigioase pe produse false.

4.3 MATERIALUL BIOLOGIC

Materialul biologic utilizat pentru stabilirea polimorfismului la strugurii de masă a fost

constituit din zece soiuri de viţă de vie provenite din două locaţii viticole din România respectiv,

de la Staţiunea Didactică Experimentală USAMV Cluj - Napoca şi Staţiunea Didactică

Experimentală USAMV Iaşi. Recoltarea frunzelor s-a făcut în primăvară, în fenofaza de creştere

a lăstarilor. Au fost recoltate frunze tinere care au fost păstrate în congelator la o temperatură de

-800C. Ulterior din aceste frunze a fost extras ADN-ul, care a fost folosit în reacţiile PCR.

Cercetările experimentale au fost efectuate în cadrul Laboratorului de Biotehnologii

Vegetale al Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj.

În ceea ce privesc analizele efectuate pentru extracţia ADN-ului din must, materialul

biologic utilizat în experienţă a fost format din zece soiuri de struguri pentru vin provenite de la

Staţiunea Didactică Experimentală USAMV Cluj-Napoca. În primăvara anului 2008 am recoltat

frunze tinere de la cele 10 soiuri (minim 5g de frunze/soi). Fiecare butaş de pe care au fost

recoltate frunzele a fost marcat, urmând ca în toamnă de pe acelaşi butaş să se recolteze strugurii.


13

Frunzele au fost păstrate la congelator la –800C până în momentul în care s-a efectuat extracţia

de ADN.

Strugurii recoltaţi în toamnă (sfârşitul lunii septembrie) au fost supuşi procesului de

microvinificaţie, urmând ca mustul şi apoi vinul obţinut să fie utilizat în analizele moleculare.

4.4 AMORSELE RAPD UTILIZATE PENTRU AMPLIFICAREA ADN-ULUI

Diversitatea genetică şi relaţiile de înrudire între indivizi se evaluează pe baza prezenţei

sau absenţei benzilor, rezultând o amprentă genetică specifică. În acest scop, au fost testate un

număr de 30 de amorse RAPD, dintre acestea doar 12 fiind polimorfice. După stabilirea

amorselor care au generat polimorfism, acestea au fost utilizate pentru analiza tuturor soiurilor

din ambele regiuni luate în studiu. Pentru că metoda RAPD este influenţătă de factorii externi,

amplificarea probelor din cele două regiuni s-a realizat în acelaşi thermocycler. În tabelul 4 sunt

redate secvenţele celor 12 amorse care au generat polimorfism.

Au fost realizate câte 2 repetiţii pentru fiecare amorsă, luându-se în calcul doar benzile

vizibile prezente în cele două repetiţii. Fragmentele rezultate prin amplificare cu amorsele

polimorfice au avut lungimea cuprinsă între 150 şi 2000 pb. Notarea benzilor s-a realizat prin

raportare la markerul ADN (100 pb DNA Step Ladder Promega), notându-se cu 1 prezenţa

benzilor şi cu 0 absenţa acestora. Pe baza acestor date s-a recurs la întocmirea dendogramei.

Tabel 1

Secvenţele amorselor RAPD care au generat polimorfism

Nr.

Crt.

No.

Amorsă

Primer

Secvenţa (5`-3`)

Sequence (5`-3`)

1. OPB 09 TGGGGGACTC

2 OPB 17 AGGGAACGAG

3 OPB 18 CCACAGCAGT

4 OPH 12 ACGCGCATGT

5 OPAB 11 GTGCGCAATG

6 OPC 14 TGCGTGCTTG

7 OPD 16 AGGGCGTAAG

8 OPD 19 CTGGGGACTT

9 OPD 20 ACCCGGTCAC

10 OPE 14 TGCGGCTGAG

11 OPF 16 GGAGTACTGG

12 Mic 07 TGTCTGGGTG

4.5 AMORSELE SSR UTILIZATE ÎN AMPLIFICAREA ADN-ULUI

Pentru amplificarea probelor de ADN în vederea evidenţierii polimorfismului genetic la

celor 10 soiuri luate în studiu au fost utilizate un număr de 6 amorse microsatelitice, amorse care

au fost selectate din literatură. Amorsele au fost selectate pe baza a trei criterii: uşor de

amplificat, heterozigoţia prezentă în fiecare locus şi intervalul de mărime al alelelor (pb). Aceste

amorse sunt: VVS 2, VVS29 (Thomas y Scott,1993), VVMD7 (Bowers et al 1996), ssVrZAG

47, ssVrZAG 62, ssVrZAG 79 (Sefc et al 1999).

Pentru amplificarea ADN-ului extras din must şi vin au fost utilizate un număr de 8

amorse, amorse care au fost alese pe baza literaturii de specialitate. Aceste amorse sunt: VVS2,

VVS5, VVS29 (Thomas y Scott,1993), VVMD5, VVMD7 (Bowers et al 1996), ssVrZAG 47,

ssVrZAG 62, ssVrZAG 79 (Sefc et al 1999).


14

Tabel 2

Secvenţele amorselor SSR utilizate în analiza PCR Amorsă

Primer

Secvenţa

Sequence

TM

(0C)

Intervalul de

mărime (pb)

Size range (bp)

Referinţă

Reference

VVS2 f: CAGCCCGTAAATGTATCCATC

r: AAATTCAAAATTCTAATTCAACTGC

52.2

47.7

126-151 Thomas şi

colab. 1993

VVS5 f: ATTGATTTATCAAACACCTTCTACAT

r: TAGAAAGATGGAAGGAATGGTGAT

19.9

52.1

90 – 148 Thomas şi

colab. 1993

VVS29 f: CCCCAAGGCTCTGAAAACAAT

r: TGCAAAGCAAATAAAGCTTCCA

52.2

49.1

168-189 Thomas şi

colab. 1994

VVMD5 f: CTAGAGCTACGCCAATCCA

r: TATACCAAAAATCATATTCCTAAA

51.6

45.3

226 – 246 Bowers şi

colab. 1996

VVMD7 f: AGAGTTGCGGAGAACAGGAT

r: CGAACCTTCACACGCTTGAT

51.6

51.6

233 – 263 Bowers şi

colab. 1996

ssVrZAG

47

f: GGTCTGAATACATCCGTAAGTATAT

r: ACGGTGTGCTCTCATTGTCATTGAC

52.6

57.5

149-172 Sefc şi colab.

1999

ssVrZAG

62

f: GGTGAAATGGGVCACCGAACACACGC

r: CCATGTCTCTCCTCAGTTCTCAGT

62.4

60.8

185-203 Sefc şi colab.

1999

ssVrZAG

79

f: AGATTGTGGAGGAGGGAACAAACCG

r: TGCCCATTTTCAAACTCCCTTCC

59.2

29.2

236 – 260 Sefc şi colab.

1999

4.6 TEHNICI ŞI METODE CERCETARE

4.6.1 Extracţia ADN-ului în vederea realizării analizelor RAPD şi SSR pentru

determinarea polimorfismului la viţa de vie

Atât în cercetările de genetică moleculară, cât şi în cele de inginerie genetică, extracţia

ADN-ului reprezintă un prim pas extrem de important. Izolarea acizilor nucleici din diferite

ţesuturi vegetale, este obligatorie în majoritatea metodelor moleculare utilizate în biologia

moleculară.

Metodele de izolare a ADN-ului au ca şi criterii de bază puritatea, integritatea şi

cantitatea de ADN obţinută. S-a demonstrat că puritatea ADN-ului este unul dintre cei mai

importanţi factori în reproductibilitatea metodei RAPD. Utilizarea matriţei de ADN cu o

puritatea mare asigură reproductibilitate prin metoda RAPD. Amprente RAPD vor fi identice în

repetiţii numai dacă ADN-ul are o calitate adecvată.

Pentru extracţia ADN-ului din frunze s-a utilizat protocolul descris de Lodhi şi colab.

(1994), modificat de Pop şi colab (2003b).

4.6.2 Tehnici şi metode de cercetare utilizate în vederea obţinerii ADN-ului din must

4.6.2.1 Obţinerea mustului

Pentru analizele efectuate în prezentul studiu vinul a fost obţinut printr-un proces de

microvinificaţie. După recoltarea strugurilor, aceştia au fost zdrobiţi, iar mustul a fost pus în

sticle pentru fermentaţie. S-a avut în vedere evitarea contaminării soiurilor, schimbându-se la

fiecare soi mănuşile. După obţinerea mustului (aproximativ 2 l pentru fiecare soi), acesta a fost

pus la fermentat la o temperatură de aproximativ 200C.

4.6.2.2 Păstrarea mustului

După obţinerea mustului, aproximativ 20 ml a fost păstrat la -200C, până în momentul în

care a fost analizat. Acesta a fost împărţit în recipiente de 2 ml pentru a facilita decongelarea.

Restul mustului a fost supus procesului de fermentare.

Pentru a urmări influenţa procesului de fermentaţie asupra ADN-ului, pe parcursul

perioadei de fermentaţie s-au efectuat mai multe extracţii de ADN. Astfel, s-au realizat extracţii

în prima zi de fermentaţie şi apoi tot la patru zile de la începerea fermentaţiei. De asemenea, s-au

efectuat extracţii şi la sfârşitul fermentaţiei (aproximativ la o lună şi jumătate de la începerea


15

fermentaţiei), precum şi din vin, vin care a fost supus procesului de limpezire timp de trei

săptămâni.

4.6.2.3 Extracţia ADN-ului din must în vederea realizării analizelor SSR

Metodele de izolare a ADN-ului au ca şi criterii de bază puritatea, integritatea şi

cantitatea de ADN obţinută. S-a urmărit de asemenea, eliminarea polifenolilor şi a

polizaharidelor care împiedică obţinerea unui ADN de bună calitate, ce poate fi folosit în reacţia

PCR. Deoarece se ştie faptul că extracţia ADN-ului din must şi vinuri ridică probleme din cauza

degradării acestuia pe parcursul perioadei de fermentaţie, au fost testate mai multe metode.

Astfel, pentru extracţia ADN-ului din frunze s-a utilizat protocolul descris de Lodhi şi colab.

1994, modificat de Pop şi colab. 2003b, iar pentru extracţia ADN-ului din must s-au utilizat 3

metode de izolare, cu fiecare metodă fiind realizate câte trei extracţii pentru fiecare soi în parte.

Protocoalele utilizate sunt:

a) protocolul descris de Faria şi colab. (2000),

b) protocolul descris de Lodhi şi colab.(1994) modificat de Pop şi colab. (2003),

c ) protocolul descris de Sambrook şi colab. (1989) modificat de Baileras-Couto şi Eiras Dias

(2006).

4.6.3 Cuantificarea ADN-ului

ADN-ul este considerat suficient de pur, dacă puritatea este cuprinsă între 1,7 şi 2,0.

Valorile mai mici de 1,7 indică impurificări cu proteine, iar cele mai mari de 2,0 indică

impurificări cu alţi contaminanţi. Banda de absorţie a moleculelor biologice în UV este între 200

şi 400 nm, de exemplu proteinele, care constituie contaminantul major al soluţiilor de ADN, au

un maxim de absorţie la 280 nm. Densitatea optică a fost măsurată la rata de absorţie A260nm şi

A280nm, făcându-se raportul dintre cele două rate de absorţie.

După extracţie, cantitatea şi calitatea ADN-ului a fost măsurată cu ajutorul aparatului

Spectofotometru ND-1000 utilizând programul NanoDrop. Acest aparat efectuează măsurători

de absorbţie la lungimile de undă de λ=260 nm, λ=280 nm şi λ=230 nm, fiind capabil să afişeze

nu doar extensiile absorbţiilor, ci şi concentraţia ADN-ului din proba analizată.

De asemenea, s-a realizat o cuantificare a ADN-ului şi în gel de agaroză 0.8%. Calitatea,

cât şi gradul de degradare a ADN-ului au fost evaluate în funcţie de prezenţa unei benzi de

dimensiuni normale, intense. În cazul în care banda nu era intensă, iar degradarea se putea

observa prin prezenţa unor urme, s-a recurs la repetarea extracţiei.

4.7 AMPLIFICAREA ADN-ULUI CU AJUTORUL AMORSELOR RAPD

Unul dintre cei mai importanţi factori în reproductibilitatea metodei RAPD este puritatea

ADN-ului. Utilizarea matriţei de ADN cu o puritate mare asigură reproductibilitate prin metoda

RAPD. Amprentele RAPD vor fi identice în repetiţii numai dacă ADN-ul are o puritate adecvată.

4.7.1 Componentele amestecului de reacţie RAPD

Pentru a realiza o tehnică PCR, au fost necesare următoarele elemente, care formează

amestecul de reacţie:

ADN-ul care conţine secvenţa ce urmează a fi amplificată

Amorsele

Cele patru feluri de nucleozide trifosfat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

ADN polimeraza

Soluţia tampon în care toate aceste componente sunt amestecate.

Pentru amestecul de reacţie s-a utilizat Go Taq Green Master Mix PCR (Promega) care

are următoarea compoziţie:

- 0,05 unităţi/µl Taq DNA polymerase


16

- 4 mM MgCl2

- 0,4 mM dATP, 04 mM dCTP, 0,4 mM dGTP, 0,4 mM dTTP

Amestecul de reacţie a avut un volum final de 25µl/tub: 12,5 µl PCR Mastermix, 2,5 µl

amorsă, 2µl ADN şi 8 µl Nuclease free water (furnizată împreună cu mastermixul PCR).

4.7.2 Amplificarea PCR

Amplificarea s-a realizat în aparatul thermocycler (Corbett Research) după următorul

program:

3 minute la 950C- predenaturare

1 minut la 930C- denaturare

1 minut la 340C- fixarea primerilor

1 minut la 720C- extensie

10 minute la 720C- extensia finală

4.8 AMPLIFICAREA ADN-ULUI CU AJUTORUL AMORSELOR SSR

4.8.1 Componentele amestecului de reacţie PCR

Amestecul de reacţie SSR a avut un volum de 25 μl/tub eppendorf, cu următoarea

compoziţie:

- 50 ng ADN

- 200 μM amestec dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (Promega)

- 0,5 µl amorsă forward

- 0,5 µl amorsă reverse

- 2,5 mM MgCl2

- 2,5 mM 10 x buffer

- 1 U Taq DNA Polymerase (Promega)

- 2% PVP (Sigma)

- apă bidistilată sterilă

În cazul markerilor microsatelitici temperatura de fixare a primerilor poate fi diferită în

funcţie de amorsă. Pentru stabilirea acesteia s-a trecut la amplificarea unei probe de ADN în

gradient de temperatură cu fiecare din primerii SSR. S-au testat temperaturi cuprinse intre 55-

590C. În urma testării au fost stabilite următoarele programe de amplificare:

- pentru amorsele VVS2, VVMD7:

Predenaturare -950C timp de 2 minute

Denaturare -940C timp de 30 de secunde

Fixarea primerilor -560C timp de 45 secunde 30 de cicluri

Extensia -720C timp de un minut

Extensia finală -720C timp de 7 minute.

- pentru amorsele ssVrZAG 47, ssVrZAG 62, ssVrZAG 79:

Predenaturare -950C timp de 2 minute

Denaturare -940C 30 de secunde

Fixarea primerilor -570C timp de 45 secunde 30 de cicluri

Extensia -720C timp de un minut

Extensia finală -720C timp de 7 minute.

În ceea ce priveşte ADN-ul obţinut din must, acesta a fost amplificat cu opt amorse

microsatelitice. De asemenea, amplificarea PCR s-a realizat cu ajutorul aparatului 96 Well

Gradient Palm-Cycler CG1-96 (Corbett Reserch).

Pentru amplificarea probelor cu cele 8 amorse s-au utilizat trei programe de amplifcare,

diferenţa între cele trei programe fiind temperatura de a fixare a amorselor.

45 de cicluri


17

Pentru amorsele VVS 2, VVMD 7 s-a folosit următorul program de amplificare:

Pentru amorsele ssVrZAG 47, ssVrZAG 62, ssVrZAG 79 s-a folosit următorul program

de amlpificare:

În cazul amorselor VVS 5 şi VVMD 5, VVS 29 programul de amplificare a fost

următorul:

Migrarea electroforetică

După stabilirea programelor de amplificare s-a trecut la amplificarea tuturor probelor cu

cele 8 amorse microsatelitice.

Produşii de amplificare obţinuţi cu amorsele RAPD au fost migraţi în gel de agaroză

1,4%. Sursa de putere a fost programată la tensiunea de 80V, respectiv 200 mA iar durata de

migrare a fost de 1 oră şi 30 de minute. Metoda electroforetică se bazează pe separarea diferitelor

specii de particule încărcate electric, prin migrarea diferenţiată sub influenţa unui câmp electric.

Produşii PCR obţinuţi în urma amplificării cu amorsele SSR, au fost migraţi în gel de

agaroză 4%. Soluţia tampon, utilizată în electroforeză, a fost Tris-acetatul (TAE 1x). În gel au

fost încărcaţi 12 μl produs PCR. Deoarece bufferul a fost colorat, nu a mai fost necesar

adăugarea unui alt tip de colorant. Sursa de putere a fost programată la tensiunea de 100V,

respectiv 200 mA iar durata de migrare a fost de 2 ore.

Deoarece gelul de agaroză nu are o putere de rezoluţie aşa de ridicată, el nefiind capabil

să separe fragmente de ADN care diferă printr-o singură pereche de baze, ulterior produşii de

amplificare au fost migraţi în gel de poliacrilamidă, gel cu o putere de rezoluţie mult mai

ridicată.

Predenaturare 950C timp de 2 minute

Denaturare la 950C - 30 de secunde

Fixarea amorselor la 560C - 45 de secunde

Extensia la 720C – 1 minut

Extensia finală 720C – 7 minute

30 de cicluri






30 de cicluri






30 de cicluri


18

4.9 ANALIZAREA IMAGINILOR

În analizarea statistică a imaginilor au fost luate în considerare doar benzile cu o

intensitate luminoasă mare. Benzile au fost detectate cu ajutorul programului Total Lab TL 100.

Cu ajutorul acestui program se stabileşe mărimea fragmentelor de ADN prin compararea

acestora cu un ADN standard (Lader ADN 100pb).

În urma comparării cu ADN-ul standard s-a stabilit mărimea fiecărui fragment amplificat.

Matricea binară a fost utilizată ulterior pentru calcularea distanţelor genetice, pe baza cărora s-a

realizat întocmirea dendogramei. Calcularea distanţelor genetice şi întocmirea dendogramei s-a

realizat cu ajutorul programului FreeTree 0.9.1.50, utilizând coeficientul Nei Li/Dice pentru

distanţele genetice, respectiv metoda UPGMA pentru dendogramă. Programul FreeTree 0.9.1.50

permite optimizarea structurii arborelui şi totodată testarea robusteţii acestuia prin calcularea

valorilor de coeficienţă Bootstrap şi/sau Jackknifing. Prezentarea grafică a dendrogramei s-a

realizat cu programul TreeView.

CAPITOLUL V

REZULTATE ŞI DISCUŢII

5.1 REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA ADN-ULUI ŞI ESTIMAREA CANTITĂŢII

ŞI CALITĂŢII ACESTUIA

În urma extracţiei de ADN de la cele 10 soiuri de viţă de vie recoltate de la Staţiunea de

Cercetări Experimentale Cluj-Napoca, utilizând metoda descisă de Lodhi şi colab. (1994) şi

modificată de Pop şi colab. (2003b) s-au obţinut cantităţi cuprinse între 145 ng/µl şi 1121,79

ng/µl, cu o puritate care a variat între 1,82 şi 2. Au fost realizate câte două citiri pentru fiecare

probă în parte. Cea mai mică cantitate s-a obţinut la soiul Muscat Perla de Csaba (145,33), iar

cea mai mare s-a obţinut la soiul Coarnă neagră (1121,79). Cantitatea a fost corespunzătoare

având în vedere că pentru amplifacare s-au utilizat 50 ng. Astfel, ADN-ul extras a fost diluat cu

apă ultrapură până la concentraţia finală de 50ng/µl (tab 7).

În ceea ce priveşte cantităţile obţinute în urma extracţiei ADN-ului din probele recoltate

de la SDE Iaşi, cea mai mică cantitate s-a obţinut la soiul Napoca şi anume 484,67 ng/μl iar cea

mai mare cantitate a fost de 743,85 ng/μl la soiul Coarnă albă. De asemena purităţile obţinute în

urma efectuării extracţiilor la cele 10 soiuri au variat între 1,82 şi 2.

De asemenea calitatea ADN-ului a fost verificată şi în gel de agaroză 0,8%. Astfel, dacă

banda a avut o intensitate luminoasă ridicată s-a considerat că extracţia ADN-ului din proba

respectivă a fost reuşită. În figura 1 sunt prezentate imaginile obţinute în urma cuantificării

ADN-ului în fel de agaroză. După cum se poate observa, toate probele au prezentat bandă de

intensitate luminoasă ridicată. Prin urmare, cantitatea şi calitatea ADN-ului sunt suficiente pentru

efectuarea următoarelor analize.

Fig 1. Verificarea concentraţiei de ADN a probelor analizate de la SDE Iaşi şi SDE Cluj

Banda de

ADN L Ca CN V TC PC CA Ce N MH CD

L Ca CN V TC PC CA Ce N MH CD


19

5.2 REZULTATE PRIVIND AMPLIFICAREA ŞI ELECTROFOREZA PRODUŞILOR

DE REACŢIE RAPD

Amplificarea probelor s-a făcut în două repetiţii pentru fiecare amorsă. De asemenea,

aceeaşi amorsă a fost folosită pentru amplificarea tuturor probelor din fiecare staţiune în parte,

obţinându-se de fiecare dată acelaşi profil electroforetic. Repetarea amplificărilor, în cazul

metodei RAPD, cel puţin de două ori, este de o importanţă fundamentală datorită sensibilităţii

evidente a metodei. Din totalul celor 30 de amorse utilizate iniţial, s-au obţinut polimorfisme cu

un număr de 12 amorse.

Fragmentele rezultate prin amplificarea cu amorsele polimorfice au avut lungimea

cuprinsă între 150 şi 2000 pb, majoritatea având între 300 şi 1500 pb.

Pentru a evidenţia posibilele diferenţe între aceleaşi soiuri, dar provenite de la staţiuni

diferite, fiecare amorsă a fost amplificată cu probele provenite de la aceleaşi soiuri dar din

staţiuni diferite. Din analiza gelurilor se observă că nu există diferenţe între provenienţele

aceluiaşi soi. Acest lucru se poate explica prin faptul că viţa de vie se înmulţeşte cel mai adesea

vegetativ, prin altoire, soiurile fiind înmulţite în staţiuni sau centre de cercetare unde este

controlată riguros provenienţa acestora.

a b

Fig. 2 Produşii de amplificare obţinuţi cu primerul Mic 07 la cele 10 soiuri de viţă de vie de la

SDE Cluj (a) şi Iaşi (b)

5.3 REZULTATE PRIVIND ANALIZA IMAGINILOR ŞI INTERPRETAREA

DATELOR OBŢINUTE CU AMORSELE RAPD

Un număr total de 114 fragmente de ADN de mărimi diferite au fost vizualizate. Au fost

marcate şi luate în studiu doar benzile clare de ADN amplificate. Din punct de vedere analitic au

fost selectate ca şi prezente doar benzile reproductibile din fiecare gel analizat.

Din totalul de 114 benzi cu mărime cuprinsă între 150 pb – 2000 pb, 97 de benzi au fost

polimorfice şi 17 monomorfice cu un indice al polimorfismului de 85,08%. Numărul de

fragmente polimorfice detectate de o amorsă variază de la 2 (amorsa OPA 09) la 14 (OPD 19). În

ceea ce priveşte procentul de polimorfism, acesta a variat între 100% în cazul amorselor OPAB

11, OPC 14, OPD 16 şi 50 % în cazul amorsei OPA 09.

Polimorfismul obţinut cu amorsele RAPD este mare, reflectând diversitatea accesiunilor.

Distanţele genetice calculate sunt prezentate în tabelul 3. Cu cât valorile distanţelor

genetice sunt mai mici cu atât speciile sunt mai înrudite între ele.

Tabel 3

Distanţele genetice calculate pentru cele zece soiuri luate în studiu

Ca CN V TC PC CA Ce N MH CD

Ca 0.000

CN 0,236 0.000

V 0,159 0,319 0.000

TC 0,183 0,271 0,284 0.000

PC 0,250 0,385 0,244 0,263 0.000

500 pb

1000 pb


500 pb

1000 pb



20

Tabel 3- continuare CA 0,301 0,279 0,341 0,244 0,341 0.000

Ce 0,205 0,297 0,111 0,263 0,244 0,341 0.000

N 0,341 0,386 0,218 0,413 0,356 0,463 0,195 0.000

MH 0,405 0,377 0,474 0,407 0,447 0,352 0,500 0,425 0.000

CD 0,470 0,395 0,365 0,444 0,341 0,375 0,341 0,317 0,465 0.000

Datele din interiorul tabelului 3 arată că cea mai mică valoare a distanţei genetice

(0,4421) s-a înregistrat între soiurile Victoria şi Cetăţuia, ceea ce denotă o strânsă înrudire între

ele, fapt confirmat şi în dendrograma din figura 36. Din puntul de vedere al distanţei genetice

considerăm că cele mai îndepărtate soiuri analizate sunt Cetăţuia şi Muscat de Hamburg,

valoarea distanţei genetice fiind de 0,500.

Apropierea genetică între cele zece soiuri de viţă de vie analizate, stabilită pe baza

matricei distanţelor genetice şi a algoritmului Neighbor Joining Tree sunt prezentate în figura 3

sub forma unei dendrograme.

În cadrul dendogramei s-au evidenţiat două grupuri principale:

Primul grup (A) cuprinde soiurile Coarnă albă şi Coarnă neagră, aceste soiuri situându-se

în acelaşi grup şi din punct de vedere ampelografic, având caractere fenotipice asemănătoare. De

asemenea, ambele soiuri au origine comună (Turcia).

Grupul B cuprinde soiurile Victoria, Cardinal, Cetăţuia, Timpuriu de Cluj, Musat Perla

de Csaba, Napoca. Soiul Victoria provine din încrucişarea soiurilor Cardinal şi Afuz Ali, soiurile

Timpuriu de Cluj şi Cetăţuia au un părinte comun, deci situarea lor în acelaşi grup confirmă acest

lucru. La o distanţă mai mare se află soiurile Chasselas dore şi Muscat de Hamburg. Grupul A

cuprinde la rândul lui alte subgrupuri cum ar fi cel care cuprinde soiurile Victoria şi Cetăţuia. MH

CD

N

PC

TC

Ca

Ce

V

81

35

12

18

18

CA

CN

25

28

58

100

Fig. 3 Dendrograma obţinută la cele zece soiuri de viţă de vie analizate

5.4 REZULTATE PRIVIND ANALIZA ŞI INTERPRETAREA DATELOR OBŢINUTE

CU AMORSELE SSR

Variabilitatea genetică a celor zece soiuri de viţă de vie a fost analizată la nivelul a

6 loci microsatelitici. Toate amorsele utilizate au generat produşi de amplificare şi s-au

dovedit a fi multialelice. Electroforeza produşilor de amplificare s-a realizat în gel de

agaroză de concentraţie 4%.


21

Fig. 4 Profilul electroforetic obţinut cu amorsele VVMD7 şi ZAG 47

După migrarea produşilor PCR obţinuţi cu cele şase amorse în gel de agaroză, aceştia au

fost migraţi şi în gel de poliacrilamidă. Benzile au fost detectate cu ajutorul programului Total

Lab TL 100. Cu ajutorul acestui program se stabileşe mărimea fragmentelor de ADN prin

compararea acestora cu un ADN standard.

Dimensiunile alelelor pentru fiecare locus microsatelitic la soiurile analizate sunt

prezentate în tabelul 4.

Tabel 4

Profilele genetice ale celor 10 soiuri de viţă de vie analizate cu cei 6 loci microsatelitici

(dimensiunea alelelor este exprimată în pb)

Amorsă

Soi

VVS 2 ZAG 79 ZAG 62 ZAG 47 VVMD 7 VVS 29

Cardinal 162

162

249

249

196

186

166

166

245

238

265

265

Coarnă Neagră 167

156

245

245

202

192

174

166

245

235

268

268

Victoria 160

160

238

238

197

187

166

166

245

234

270

270

Timpuiu de Cluj 160

160

238

238

196

186

172

164

243

233

280

281

Muscat Perla de

Csaba

168

158

251

251

186

186

162

162

233

233

280

280

Caoarnă Albă 181

158

273

251

200

182

168

162

239

239

279

276

Cetăţuia 181

157

278

254

190

182

169

162

240

231

278

278

Napoca 159

159

239

239

186

186

164

164

241

231

278

276

Chasselas dore 156

156

266

245

201

192

164

159

247

240

278

278

Muscat de Hamburg 155

155

269

249

192

182

163

159

259

239

280

282

Pentru locusul microsatelitic VVS 2 au fost detectate un număr de 10 variante alelice.

Dimensiunea alelelor este cuprinsă între 155-181 pb. Se remarcă predominanţa soiurilor

homozigote (60%) şi faptul că dimensiunile alelelor detectate depăşesc intervalul de mărime citat

de literatură. Frecvenţa alelelor este cuprinsă între 0,0714 şi 0,1428.

Pentru locusul microsatelitic ZAG 79 au fost detectate tot un număr de 10 variante

alelice. Dimensiunea acestora a fost cuprinsă între 238-278 pb. Dintre soiurile analizate 40%

dintre acestea au fost heterozigote. Şi în cazul acestui locus dimensiunile alelelor detectate

depăşesc intervalul de mărime citat de literatură.

100 pb

300 pb

100 pb

300 pb

L Ca CN V TC PC CA Ce N MH CD L Ca CN V TC PC CA Ce N MH CD


22

Pentru locusul microsatelitic ZAG 62 au fost detectate 10 variante alelice cu dimensiuni

cuprinse între 182 pb şi 202 pb. Se remarcă în cazul acestui locus un grad mare de heterozigoţie,

80% dintre indivizi fiind heterozigoţi. Dimensiunile alelelor detectate se încadrează în intervalul

citat de literatură şi anume: 185-203 pb. Frecvenţa alelelor este cuprinsă între 0,0555 şi 0,1666.

În cazul locusului microsatelitic ZAG 47 au fost detectate 9 variante alelice cu

dimensiunile cuprinse între 159 pb şi 174 pb. Se observă predominanţa indivizilor heterozigoţi,

aceştia fiind prezenţi în procent de 60%. Toate valorile alelice obţinute se încadrează în

intervalul citat de literatură şi anume 149 pb-172 pb. Frecvenţa alelelor este cuprinsă între

0,0625 şi 0,1875.

În cazul locusului microsatelitic VVMD 7 au fost detectate 12 variante alelice cu



intervalul citat de literatură şi anume 233 pb-263 pb. În cazul acestui locus frecvenţa aleleor este

cuprinsă între 0,0588 şi 0,1176.

Pentru locusul microsatelitic VVS 29 au fost detectate 9 variante alelice diferite, cu

dimensiuni cuprinse între 265 pb şi 282 pb. În cadrul acestui locus microsatelitic predominanţi

sunt indivizii homozigoţi, aceştia apărând în procent de 60%.

După cum reiese din datele prezentate mai sus, s-a obţinut un număr total de 60 de alele,

între 9 şi 12 alele/locus, numărul mediu de alele obţinute/locus fiind de 10.

Tabel 5

Parametrii genetici obţinuţi cu amorsele SSR la cele 10 soiuri de viţă de vie studiate

Locus

Locus

Nr. de

soiuri

No. of

varieties

Nr. de alele

detectate

No. of alleles

detected

Heterozigoţia

aşteptată

Expected

heterozygosity

Heterozigoţia

observată

Observed

heterozygosity

VVS 2 10 10 0,926 0,400

ZAG 79 10 10 0,947 0,400

ZAG 62 10 10 0,884 0,800

ZAG 47 10 9 0,879 0,600

VVMD 7 10 12 0,942 0,800

VVS 29 10 9 0,895 0,400

Valoare medie 10 0,912 0,566

Datele obţinute cu amorsele SSR au fost prelucrate într-o matrice binară, pe baza căreia

au fost calculate distanţele genetice între accesiuni pe baza coeficientului de similaritate genetică

Nei-Li/Dice cu ajutorul programului FreeTree (Hampl şi colab., 2001).

Tabel 6

Distanţele genetice obţinute în urma amplificării celor 10 probe cu amorsele SSR

Ca CN V TC PC CA Ce N CD MH

Ca 0.000

CN 0.625 0.000

V 0.625 0.625 0.000

TC 0.666 0.666 0.583 0.000

PC 0.791 0.791 0.875 0.541 0.000

CA 0.708 0.625 0.708 0.625 0.541 0.000

Ce 0.708 0.625 0.708 0.625 0.666 0.458 0.000

N 0.75 0.75 0.833 0.583 0.708 0.666 0.583 0.000

CD 0.75 0.458 0.75 0.625 0.791 0.625 0.416 0.583 0.000

MH 0.708 0.583 0.708 0.583 0.666 0.458 0.541 0.708 0.541 0.000


23

Datele tabelare arată că cea mai mică valoare a distanţei genetice este 0,416 şi se observă

între soiurile Chaseelas dore şi Cetăţuia. Această apropiere este confirmată şi prin dendograma

din fig 5. Aceste două soiuri sunt considerate ca fiind cele mai apropiate din punct de vedere

genetic, deoarece cu cât valoarea dintre două soiuri este mai mucă, cu atât soiurile sunt mai

apropiate din punct de vedere genetic. Cea mai mare distanţă se află între soiurile Muscat Perla

de Csaba şi Victoria (0,875).

Apropierea genetică între cele 10 soiuri din genul Vitis analizate, stabilită pe baza

matricei distanţelor genetice şi a algoritmului UPGMA este prezentată în figura 5 sub forma unei

dendrograme.

Din fig 5 se poate observa că soiurile au fost grupate în două grupuri principale: A şi B.

Grupul A este format la rândul său din alte subgrupuri: subgrupul A1 care cuprinde soiurile

Cardinal şi Victoria. Aceste soiuri sunt foarte apropiate şi din punct de vedere ampelografic,

deoarece, soiul Victoria provine din încrucişarea soiurilor Cardinal şi Afuz Ali, deci situarea lor

pe aceeaşi ramură confirmă acest lucru. Subgrupul A2 cuprinde soiurile Carnă albă şi Coarnă

neagră. Situarea lor în acelaşi subgrup se poate explica prin faptul că aceste soiuri fac parte din

punct de vedere ampelografic din acelaşi sortogrup de soiuri cu caractere fenotipice

asemănătoare alături de Coarnă roşie şi Coarnă neagră selecţionată.

Din grupul B fac parte soiurile Muscat Perla de Csaba, Timpuriu de Cluj şi Napoca.

Situarea soiurilor Timpuriu de Cluj şi Napoca în acelaşi grup s-ar putea explica prin originea

geografică comună a celor două soiuri. Soiurile Muscat de Hamburg şi Timpuriu de Cluj se

găsesc pe aceeaşi ramură în dendogramă, ele făcând parte şi din aceeaşi grupă, cea a soiurilor cu

maturare extratimpurie şi timpurie, fiind apreciaţi mai ales pentru timpurietate. Cardinal

Victoria

44

Coarna Neagra

Coarna Alba

Muscat de Hamburg

39

Cetatuia

Chasselas Dore

43

7

4

9

Napoca

Timpuriiu de Cluj

Muscat Perla de Csaba

32

19

5

Fig. 5 Dendrograma obţinută la cele zece soiuri de viţă de vie analizate cu amorsele SSR


24

5.5 REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA ADN-ULUI DIN MUST ŞI ESTIMAREA

CANTITĂŢII ŞI CALITĂŢII ACESTUIA

După extracţia ADN-ului, cantitatea şi puritatea acestuia au fost măsurate cu ajutorul

aparatului Spectofotometru ND-1000 utilizând programul NanoDrop. În urma citirii cantităţilor

de ADN obţinute obţinute după extracţia efectuată din must, cea mai mică cantitate de ADN s-a

obţinut la soiul Riesling italian (123,33 ng/µl) utilizând protocolul al treilea de extracţie şi anume

cel descris de Sambrook şi colab.(1989), iar cea mai mare cantitate de ADN s-a obţinut la soiul

Muscat Ottonel (1432.65 ng/µl) atunci când s-a aplicat protocolul descris de Faria şi coalb.

(2000). Cantităţile de ADN obţinute prin cele trei metode de extracţie după prima zi de

fermentaţie sunt prezentate în tabelul 7.

Tabel 7

Cantitatea de ADN obţinută prin cele trei metode de extracţie

SOIUL

VARIETY

CANTITATEA DE ADN NG/µL

DNA QUANTITY NG/µL

Protocol A Protocol B Protocol C

Burgund mare 512.79

536.75

543.28

932.84

942.25

925.23

202.41

225.8

197.32

Merlot 569.39

538.25

570.03

697.42

604.5

682.13

146.34

139.5

180.21

Cabernet Sauvignon 607.18

634.15

600.00

856.52

849.34

832.18

287.7

250.41

267.13

Riesling de Rhin 423.67

450.43

413.16

738.86

759.52

736.5

182.59

174.32

187.18

Sauvignon blanc 577.82

596.88

574.18

862.42

867.83

843.24

168.11

161.43

139.52

Riesling italian 384.99

375.25

394.47

540.98

532.83

580.72

123.33

138.45

175.75

Aligote 346.71

338.25

352.18

624.53

625.8

672.84

157.18

185.2

132.63

Muscat Ottonel 519.79

532.24

525.42

1432.65

1282.9

1025.23

342.71

234.85

217.2

Saint Emilion 445.85

460.32

450.54

705.8

775.64

726.3

252.74

225.8

202.34

Pinot gris 623.67

614.18

640.32

877.58

820.25

868.6

311.5

273.63

250.15

În urma analizelor efectuate, recomandăm aplicarea protocolului B de extracţie a ADN-

ului, protocol prin care pe media soiurilor s-au obţinut cantităţile cele mai mari de ADN şi

nivelul cel mai înalt de puritate al acestuia.


25

Pentru a stabili dacă procesul de fermentaţie are vreo influenţă asupra cantităţii şi calităţii

ADN-ului, s-au efectuat extracţii în diferite perioade ale procesului de fermentaţie. Pentru

extracţii s-au luat probe de must din diferite perioade de fermentaţie care s-au păstrat la frigider

până la efectuarea extracţiei. Deoarece, cele mai bune rezultate s-au obţinut prin metoda descrisă

de Faria şi colab (2000), s-a continuat doar cu această metodă.

În general, extracţia ADN-ului din must, a dat rezultate bune pentru probele de must din

orice perioadă a procesului de fermentaţie. Acest fapt s-a putut observa atât în urma analizei

spectofotometrice cât şi în urma migrării în gel de agaroză.

Cantităţile de ADN au început să scadă drastic la sfârşitul perioadei de fermentaţie şi

după ce vinul s-a limpezit iar depunerile au fost înlăturate. Acest lucru se poate explica prin

faptul că în must se află resturi de tescovină (pieliţă, pulpă, etc). Primul pas în extracţia ADN-

ului este centrifugarea lichidului care se doreşte a fi analizat, pentru a obţine resturile celulare

aflate în suspensie şi eliminarea supernatantului. Peste resturile obţinute în urma centrifugării se

adugă un tampon de extracţie care facilitează ruperea membranelor celulare şi nucleare. În acest

fel se obţine o cantitate de ADN adecvată efectuării viitoarelor analize.

Dacă din contră, în mediu nu se află particule în suspensie cum este în cazul unui must

limpezit sau a unui vin filtrat, cum sunt vinurile comerciale, extracţia de ADN prin această

metodă nu este posibilă.

Sinteza cantităţilor de ADN obişnuite pe parcursul perioadei de fermentaţie, precum şi

din vin este prezentată în tabelul 8. Se observă la fiecare soi cum cantităţile de ADN scad pe

parcursul perioadei de fermentaţie, ajungându-se ca în urma extecţiei din vin să nu se mai obţină

cantităţi de ADN.

Tabel 8

Evoluţia cantităţii de ADN pe parcursul perioadei de fermentaţie

Ziua

Soiul

1 4 8 12 16 20 24 28 32 36 70

Burgund

mare

932,84 853,14 727,84 868,11 612,79 502,41 325,15 223,19 127,72 68,11 -2.85

Merlot 697,42 524,32 642,56 537,73 569,39 546,34 294,24 174,45 92,17 37,73 -4.16

Cabernet

Sauvignion

856,52 734,18 663,95 725,18 607,18 637,7 432,43 284,67 123,27 25,18 -6.34

Riesling de

Rhin

738,86 575,18 977,78 667,83 623,67 582,59 350,08 227,38 147,47 67,83 -6.84

Sauvignion

blanc

862,42 703,32 754,95 723,33 576,82 668,11 284,19 197,82 95,63 23,33 -1.77

Riesling

italian

540,98 423,18 687,81 619,6 484,99 523,33 250,35 185,54 85,81 19,23 2.79

Aligote 624,53 655,52 777, 9 531,84 646,71 657,18 324,15 212,32 77,22 31,84 3.82

Muscat

Ottonel

1432,7 837,2 961,81 932,65 519,79 642,71 309,23 224,18 71,63 32,65 -3.09

Saint

Emilion

705,8 673,7 548,67 743,23 745,85 552,74 293,88 152,98 84,27 43,23 -7.42

Pinot gris 877,58 705,58 882,59 723,78 623,67 511,5 324,23 224,17 82,35 23,78 -6.62

În figura 6 sunt prezentate dreapta şi ecuaţia de regresie a cantităţii de ADN pe parcursul

perioadei de fermentaţie. Din prezentarea grafică se observă că rezultatele reale urmăresc destul

de fidel dreapta de regresie, având mici abateri la dreapta sau la stânga acesteia.


26

y = -22,556x + 881,73

R2 = 0,9132

0

200

400

600

800

1000

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34

zile

ca

nti

tate

a d

e A

DN

Fig. 6 Dreapta şi ecuaţia de regresie a cantităţii de ADN pe parcursul perioadei de fermentaţie

5.6 ANALIZA SOIURILOR CU AJUTORUL AMORSELOR MICROSATELITICE

SSR

În efectuarea anlizelor din prezentul studiu s-au utilizat un număr de opt amorse

microsatelitice. Markerii microsatelitici sunt consideraţi cei mai informativi markeri ADN, fiind

utilizaţi, începând cu mijlocul anilor ’90, pentru caracterizarea genetică a diferitelor soiuri de viţă

de vie cultivate în diverse ţări cu tradiţie viticolă, aceştia oferind un profil genetic unic pentru

fiecare soi, ceea ce permite caracterizarea fără echivoc a oricărei varietăţi.

Toate amorsele utilizate au generat produşi de amplificare şi s-au dovedit a fi

multialelice. Electroforeza s-a realizat pentru început în gel de agaroză 4% iar migrarea s-a

realizat la o putere de 100V. Pentru estimarea dimensiunilor fragmentelor, în gel a fost încărcat

un marker ADN de 25 pb (Promega), având fragmente cuprinse între 25 şi 300 pb.

Pentru a urmări dacă ADN-ul extras pe parcursul perioadei de fermentaţie şi din vin este

suficient pentru efectuarea reacţiilor PCR, acesta a fost amplificat cu amorsa ZAG 79, în cazul

soiului Aligote. Se poate observa din imaginea gelului că s-au obţinut benzi în cazul utilizării

ADN-ului extras pe parcursul perioadei de fermentaţie, dar nu s-au mai obţinut benzi cu ADN-ul

extras din vin.

Fig. 7 Produşii de amplificare obţinuţi în urma migrării cu amorsa ZAG 79 la soiul

Aligote

Pentru determinarea cu acurateţe a dimensiunilor produşilor de amplificare, aceştia au

fost migraţi în gel de poliacilamidă, gel care are o putere de rezoluţie foarte mare, putând separa

fragmente de ADN care diferă în mărime şi printr-o singură pereche de baze.

Dimensiunile alelelor pentru fiecare locus microsatelitic, la cele 10 soiuri luate în studiu

sunt prezentate în talelul 9. Benzile au fost detectate cu ajutorul programului Total Lab TL 100.

L 1 4 8 12 16 20 24 28 32 36 70

100 pb

300 pb


27

Tabel 9

Profilele genetice ale celor 10 soiuri de viţă de vie analizate cu cei 8 loci microsatelitici

(dimensiunea alelelor este exprimată în pb)

Pimer

Soi

VVMD 7 VVS 29 ZAG 47 ZAG 79 ZAG 62 VVS5 VVMD5 VVS2

Frunze

Merlot 246

237

178

171

168

159

257

240

187

199

149

149

235

237

132

132

Sauvignon

blanc

250

241

172

172

157

157

251

240

185

187

92

92

233

237

140

140

Riesling

italian

242

142

173

173

158

158

245

240

195

199

92

116

- 136

138

Muscat

Ottonel

253

243

182

174

165

156

261

242

187

203

106

149

231

235

136

136

Pinot gris 253

245

176

176

160

155

269

248

193

203

92

98

235

237

138

140

Riesling de

Rhin

247

247

184

176

164

160

245

238

185

185

98

98

235

239

134

134

Aligote 258

249

184

177

163

153

257

257

199

199

106

116

- 136

136

Saint

Emilion

252

252

184

178

158

158

249

235

193

199

90

92

- 135

135

Burgund

mare

262

251

184

175

160

147

257

257

187

193

98

98

226

231

138

138

Cabenet

Sauvignon

262

254

181

178

163

163

258

258

203

203

98

148

- 140

140

Must monovarietal

Merlot 246

237

178

171

168

159

257

240

187

199

149

149

235

237

132

132

Sauvignon

blanc

250

241

172

172

157

157

251

240

185

187

92

92

233

237

140

140

Riesling

italian

242

142

173

173

158

158

245

240

195

199

92

116

- 136

138

Muscat

Ottonel

253

243

182

174

165

156

261

242

187

203

106

149

231

235

136

136

Pinot gris 253

245

176

176

160

155

269

248

193

203

92

98

235

237

138

140

Riesling de

Rhin

247

247

184

176

164

160

245

238

185

185

98

98

235

239

134

134

Aligote 258

249

184

177

163

153

257

257

199

199

106

116

- 136

136

Saint

Emilion

252

252

184

178

158

158

249

235

193

199

90

92

- 135

135

Burgund

mare

262

251

184

175

160

147

257

257

187

193

98

98

226

231

138

138

Cabenet

Sauvignon

262

254

181

178

163

163

258

258

203

203

98

148

- 140

140

În cazul locusului microsatelitic VVMD 7 au fost detectate 15 variante alelice cu



intervalul citat de literatură şi anume 233 pb-263 pb.


28

În cazul locusului microsatelitic VVS 29 au fost detectate 11 variante alelice cu


aceştia fiind prezenţi în procent de 70%. Dimensiunile alelelor detectate se încadrează în



dimensiunile cuprinse între 147 pb şi 168 pb. În cadrul acestui locus microsatelitic se observă

predominanţa indivizilor heterozigoţi, aceştia fiind prezenţi în procent de 60%. Toate valorile

alelice obţinute se încadrează în intervalul citat de literatură şi anume 149 pb-172 pb.



aceştia fiind prezenţi în procent de 70%. Se observă că aproape toate valorile alelice obţinute se

încadrează în intervalul citat de literatură şi anume 236 pb-260 pb.

Pentru locusul microsatelitic ZAG 62 au fost detectate tot un număr de 6 variante alelice.

Dimensiunea acestora a fost cuprinsă între 185-203 pb. Dinte soiurile analizate 70% dintre

acestea au fost heterozigote. Şi în cazul acestui locus dimensiunile alelelor detectate nu depăşesc

intervalul de mărime citat de literatură.

În cazul locusului microsatelitic VVS 5 au fost detectate 7 variante alelice cu




Pentru locusul microsatelitic VVMD 5 au fost detectate 6 variante alelice diferite, cu

dimensiuni cuprinse între 226 pb şi 239 pb. În cadrul acestui locus microsatelitic toţi indivizii

care au prezentat bandă au fost identificaţi ca fiind heterozigoţi. Şi în cadrul acestui locus

microsatelitic toate valorile alelice obţinute se încadrează în intervalul citat de literatură şi anume

226-246.

Pentru locusul microsatelitic VVS 2 au fost detectate un număr de 6 variante alelice.

Dimensiunea acestora a fost cuprinsă între 132-140 pb. Dinte soiurile analizate 80% dintre

acestea au fost homozigote. Şi în cazul acestui locus dimensiunile alelelor nu detectate depăşesc

intervalul de mărime citat de literatură şi anume 126-151.

În urma analizelor efectuate, s-au obţinut un număr total de 122 de alele cu o medie de

15,25 alele/locus.

Tabel 10

Parametrii genetici obţinuţi cu amorsele SSR la cele 10 soiuri de viţă de vie studiate

Locus

Locus

Nr. de

soiuri

No. of

varieties

Nr. de

alele

detectate

No. of

alleles

detected

Heterozigoţia

aşteptată

Expected

heterozygosity

Heterozigoţia

observată

Observed

heterozygosity

Homozigoţia

aşteptată

Expected

homozigosity

Homozigoţia

observată

Observed

homozigosity

VVMD7 10 16 0,973 0,700 0,026 0,300

VVS 29 10 16 0,926 0,700 0,073 0,300

ZAG 47 10 16 0,931 0,600 0,068 0,400

ZAG 79 10 17 0,921 0,700 0,078 0,300

ZAG 62 10 17 0,852 0,700 0,147 0,300

VVS 5 10 16 0,842 0,600 0,157 0,400

VVMD5 10 12 0,509 0,600 0,090 0

VVS2 10 12 0,847 0,200 0,152 0,800

Valoarea

medie

15,25 0,850 0,600 0,098 0,35


29

Heterozigoţia aşteptată (HetExp) şi observată (HetObs) şi, respectiv, homozigoţia

aşteptată (HomExp) şi observată (HomObs) au fost calculate cu coeficientul de corecţie al lui

Levene, cu ajutorul programului Genepop (Raymond şi Rousset, 1995).

Valorile heterozigoţiei aşteptate au variat între 0,509 (VVMD 5) şi 0,973 (VVMD 7), cu

o medie de 0,850, după cum reiese din tabelul nr. 40. Valorile heterozigoţiei observate au

prezentat o valoare minimă de 0,200 (VVS 2) şi maximă de 0,700 (ZAG 62, VVMD 7, VVS 29,

ZAG 79), cu o medie de 0,6. Cea mai mare diferenţă între valoarea heterozigoţiei aşteptate şi cea

observată (0,273) s-a înregistrat în cazul locusului VVMD 7.

În cazul a şapte loci heterozigoţia aşteptată a dat valori mai mari decât heterozigoţia

observată, iar în cazul locusului VVMD 5 heterozigoţia aşteptată a dat valori mai mici decât cea

observată.

CONCLUZII

Metoda utilizată în acest studiu, şi anume cea descrisă de Lodhi şi colab. 1994,

modificată de Pop şi colab 2003b, a permis obţinerea unui ADN de înaltă calitate.

În urma aprecierii cantităţii şi calităţii ADN-ului la cele 10 soiuri de viţă de vie de masă,

s-a observat faptul că aceşti doi parametri sunt influenţaţi de genotip.

Din totalul celor 30 de amorse RAPD testate, doar 12 au generat polimorfisme cu

fragmente ce au variat între 150 şi 2000 pb.

Faptul că nu s-au observat diferenţe între staţiunile didactice de unde s-au recoltat probele

se datorează înmulţirii vegetative ce a fost şi este riguros controlată atât de centre de

cercetare cât şi de staţiuni.

În urma analizării probelor cu cele 12 amorse polimorfice s-a obţinut o medie a

procentului de polimorfism de 80%. În urma calculării distanţelor genetice s-a obţinut cea

mai mică valoare (0,4421) între soiurile Victoria şi Cetăţuia, iar cea mai mare valoare

(0,500) s-a obţinut între soiurile Cetăţia şi Muscat de Hamburg.

În urma analizelor SSR, dimensiunile alelelor la soiurile analizate s-au încadrat în

intervalul citat de literatura de specialitate, excepţie făcând markeii VVS 2 şi ZAG 79.

În cadrul cercetărilor aferente tezei de doctorat, markerii SSR au fost utilizaţi cu succes în

studierea polimorfismului genetic la viţa de vie, profilele genetice ale soiurilor sugerând

o diversitate genetică la nivel molecular.

Utilizând amorsele SSR am obţinut un număr total de 60 de alele, între 9 şi 12

alele/locus, numărul mediu de alele obţinute/locus fiind de 10.

Valorile heterozigoţiei aşteptate au variat între 0,884 (ZAG 62) şi 0,947 (ZAG 79), cu o

medie de 0,912. Valorile heterozigoţiei observate au prezentat o valoare minimă de

0,400 (VVS 2, ZAG 79, VVS 29) şi maximă de 0,800 (ZAG 62, VVMD 7), cu o medie

de 0,566.

În urma prelucrării datelor obţinute cu amorsele SSR, cea mai mică valoare a distanţei

genetice de 0,416 s-a observat între soiurile Chaseelas dore şi Cetăţuia, fapt confirmat şi

prin dendogramă, iar cea mai mare distanţă se află între soiurile Muscat Perla de Csaba şi

Victoria (0,875).

În urma testării celor trei metode, metoda descrisă de Faria şi colab (2000) a dat cele mai

bune rezultate, prin această metodă obţinându-se cele mai mari cantităţi de ADN.

Din analiza varianţei, aplicată rezultatelor de extracţie a ADN, a reieşit că cei doi factori

experimentali (soiul şi metoda de extracţie), au influenţat distinct semnificativ cantitatea

şi puritatea de ADN obţinute.

Între soiuri există diferenţe asigurate statistic în ceea ce priveşte cantitatea de ADN

obţinută, indiferent de metoda de extracţie aplicată, ceea ce sugerează că genotipul, la


30

viţa de vie, influenţează în mod hotărâtor cantitatea de ADN ce poate fi extrasă prin

metode curent folosite în acest scop.

Metoda de extracţie a avut, de asemenea, o influenţă semnificativă asupra cantităţii şi

purităţii ADN-ului ce se poate obţine, indiferent de localitatea de experimentare.

Procesul de fermentaţie a influenţat în mod negativ cantitatea şi puritatea ADN-ului;

ADN-ul extras din vinul obţinut prin microvinificaţie nu a putut fi utilizat în analizele

moleculare.

În urma comparării profilelor genetice obţinute din must, s-a constatat că acestea au fost

identice cu cele obţinute din frunze.

Cei 8 markeri microsatelitici aleşi pentru acest studiu s-au dovedit a fi informativi şi

eficienţi în identificarea corectă şi analizarea structurii genetice.

În urma prelucrării datelor, s-au obţinut un număr total de 122 de alele cu o medie de

15,25 alele/locus, alele care s-au încadrat în intervalul citat de literatură.

RECOMANDĂRI

Datele obţinute în studiul de faţă se recomandă a fi integrate cu datele morfologice,

fenologice şi biometrice pentru a identifica cu acurateţe cultivarele existente în plantaţiile

viticole. De asemenea se recomandă utilizarea lor pentru protecţia legală a cultivarelor.

Se recomandă continuarea cercetărilor în ceea ce priveşte studierea polimorfismului la

soiurilor de masă, pentru a creşte valoarea informaţiilor.

Se recomandă perfecţionarea metodelor de extracţie din vin pentru ca ADN-ul extras din

acesta să poată fi utilizat în tehnicile moleculare ce urmăresc genotipizarea vinurilor

comerciale.

Metoda SSR poate fi folosită cu succes în laboratoarele acreditate ce urmăresc

amprentarea vinurilor comerciale. Acest lucru fiind foarte important pentru producătorii

de vin, agenţiile de control guvernamental sau ale protecţiei consumatorului.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. ANTOCE A.O, 2005, Condiţionarea, ambalarea şi etichetarea vinurilor. Editura Ceres,

Bucureşti

2. BALEIRAS-COUTO M.M., J.E. EIRAS-DIAS, 2006, Detection and identification of

grape varieties in must and wine using nuclear and chloroplast microsatellite markers.

Analytica Chimica Acta 563, pag. 283-291

3. BOWERS J.E, G.E. DANGL, R. VIGNANI, C.P. MEREDITH, 1996, Isolation and

characterization of new polimorphic simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera

L.) Genome 39, 628-633.

4. CONSTANTINESCU, G., 1971, Viticultură generală, EDP, Bucureşti.

5. COTEA V., 1995, Vinul în existenţa umană- discurs de recepţie. Editura Academiei

Române.

6. DI GASPERO G., E. PETERLUNGER, R. TESTOLIN, K.J. EDWARDS, G.

CIPRIANI 2000, Conservation of microsatellite loci within the genus vitis.

theoretical& applied genetics 101, pag. 301-308

7. FARIA M. A, R. MAGALHAES, M.A. FERREIRA, C.P. MEREDITH, F. FERRIRA

MONTEIRO, 2000, Vitis vinifera must varietal authentification using microsatellite DNA

Analysis (SSR), Journal of Agriculture Food Chem, 48 (4), 1096-1100


31

8. GUPTA M., Y.S. CHYI, J. ROMERO-SEVERSON, J.L. OWEN, 1996, Amplification of

DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-

sequence repeats. Theor.Appl.Genet.89,998-1006

9. HAMADA H., H. LEIDMAN, B.H. HOWARD, C.M. GORMAN, 1984, Enhanced gene

expression by the poly (dT-dG)-poly(dC-dA) sequence. Mol. Cell. Biol., 4: 2622-2630

10. HAMPL V., A. PAVLÍCEK, J. FLEGR, 2001, Construction and bootstrap analysis of

DNA fingerprinting-based phylogenetic trees with a freeware program FreeTree:

Application to trichomonad parasites, International Journal of Systematic and

Evolutionary Microbiology, 51: 731-735.

11. JEFFERS A.J., V. WILSON, S.L. THEIN, 1985, Hypervariable “minisatellite” regions in

human DNA. Nature 314: 67-73

12. KARP A., S. KRESOVICH, K.V. BHAT, W.G. AYAD, T. HODGKIN, 1997, Molecular

tools in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies. IPGRI

Technical Bulletin No. 2. International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy

13. LODHI M.A., Z.GUANG-NING, F.N.F. WEEDEN, B.I. REISCH, 1994, A simple and

efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars, Vitis species and

Ampelopsis, Plant Molecular Biology Reporter 12(1), pag. 6-13.

14. MULLINS M.G., A. BOUQUET, L.E. WILLIAMS, 1992, Biology of the grapevine.

Cambridge University Press, Cambridge

15. NĂMLOŞANU I., ARIANA OANA ANTOCE, 2005, Oenologie-controlul şi prevenirea

fraudelor, Editura Ceres, Bucureşti

16. POP NASTASIA, 2003a, Viticultură generală, Editura Academic Press

17. POP RODICA, M., ARDELEAN, D. PAMFIL, IOANA GABOREANU, 2003b, The

efficiency of different DNA isolation and purification protocols in ten cultivars of Vitis

vinifera. Bul. USAMV Cluj, 59, 259-261

18. RAYMOND M., F. ROUSSET, 1995, GENEPOP (version 1.2): A population genetics

software for exact tests and ecumenicism, J. Heredity, 86:248-249.

19. SAMBROOK J., E.F. FRITISH, T. MANIATIS, 1989, Molecular cloning: A Laboratory

manual, 2nd

ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York USA

20. SAVAZZINI F., L. MARTINELLI, 2006, DNA Analysis in Wines: Development of

Methods for Enhanced Extraction and Real-time Polymerase Chain Reaction

Quantification, Analytica Chimica Acta

21. SEFC K.M, F. REGNER, E. TURETSCHEK, J. GLOSSL, H. STEINKELLNER, 1999,

Identification of microsatellite sequence in Vitis riparia and their applicability for

genotyping of different Vitis species. Genome 42, 367-373.

22. STOIAN V., 2001, Marea carte a degustării vinurilor: degustarea pe înţelesul tuturor. Ed.

Artprint, Bucureşti

23. THOMAS M.R., N.S. SCOTT, 1993, Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA

polymorphisms when analysed as sequence-tagged sites (sts). Theor. Appl. genet. 86,

pag. 985-990

24. ŢÂRDEA C., LILIANA ROTARU, 2003, Ampelografie, vol I şi II, Editura Ion Ionescu

De la Brad, Iaşi

25. VICENTE M.C., C. LÓPEZ, T. FULTON, 2004, Genetic Diversity Analysis with

Molecular Marker Data: Learning Module. International Plant Genetic Resources

Institute (IPGRI), Rome, Italy.

26. WEBER J.L., 1990, Informativeness of human (dC-dA)n-(dG-dT)n polymorphisms.

Genomics, 7:524-530

27. WILLIAMS J.G.K., A. R. KUBELIK, K. J. LIVAK, J. A. RAFALSKI, S.V. TINGEY,

1990, DNA polymorphoisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic

markers. Nuc. Acids Res. 18(22):6531-6535.

Documents

STUDIUL POLIMORFISMULUI LA STRUGURII · deplină, conţinutul strugurilor în zaharuri variază între 14-35% sau 140-350g/l must. Zaharurile aflate în struguri şi must se găsesc