Studiul genelor

7/24/2019 Studiul genelor

1/46

Sindrom plurimalformativ

Dismorfie cranio-facial Hidrocefalie Despictur palatin, an. mandibulei

Erupie congenital a dintelui Anomalii sceletice

Scolio! "ertebre sacrale concrescute Anomalii ale oaselor ba!inului,

#icior str$mb congenital, polidactilie Hirsutism #seudoermafroditism Anomalii viscerale


2/46


3/46


4/46


5/46

Sindrom plurimalformativ

Dismorfie cranio-facial Hidrocefalie Despictur palatin, an. mandibulei Erupie congenital a dintelui

Anomalii sceletice

Scolio! "ertebre sacrale concrescuteAnomalii ale oaselor ba!inului, #icior str$mb congenital, polidactilie

Hirsutism #seudoermafroditism Anomalii viscerale %ariotip &',((

) *bservaie de sindrom Cornelia de Lange


6/46

Sindrom Cornelia de Lange

Gena NIPBL 5p13.1-14.2 Mutaii diferite

del Missens ra!es"ift Non-sens

#efe$te de spli$ing %ste ne$esar un test N pentru a identifi$a

!odifi$area geni$' $are a produs sCdL sau ae($lude sCdL


7/46

%um identificm gena +#

#ire$t !olarea AD+-ului pacientului /i secvenierearegiunii genomice 0p12.1-1&.3

#%4 cu primeri specifici fiecrui tip de mutaie

cunoscut a genei +# 45#s cu E4 specifice secvenei genei +# /idepistarea mutaiilor ce afectea! S4

5SH cu sonde complimentare genei +#

Anali!a A4+m /i6sau proteinei +#Indire$t #%4 cu primeri specifici mini- sau microsateliilor

7nvecinai cu gena +#

45#s


8/46

Metode deMetode de anali)'anali)'a genelora genelor


9/46

&nali)a genelor

*e$+eniere

PC,

*out"ern-lot

iridare in situ

N Proteine&,N

Nort"ern-lot

,/0PC,

iridare in situ

estern-lot

*e$+eniere

&nali)a fun$iei

&nali)a"isto$"i!i$'


10/46

tili)area te"ni$ilor de anali)' atili)area te"ni$ilor de anali)' aa$i)ilor nu$lei$i n !edi$in'a$i)ilor nu$lei$i n !edi$in'

&nali)a N depistarea mutaiilor genice 8 diagnostic precis al bolilor genetice

9prenatal, postnatal precoce:;

identificarea polimorfismului individual 8 depistarea predispo!iiei

la anumite boli;

identificarea polimorfismului individual 8 dactiloscopie genomic9anali!a filiaiei:;

depistarea AD+ strin 9bacterian, viral: 8 diagnosticul bolilor

infecioase /i gradului de infectare.&nali)a &,N!

anali!a e


11/46

inerea , 0 frag!entelor de restri$ie prin a$iuneaspe$ifi$' a %, 6en)i!elor de restri$ie7


12/46

RFLPs polimorfismul FR la dou persoane X i Z


13/46

8i)uali)area N

Colorarea spe$ifi$' 8i)uali)are $u sonde !ar$ate

u(in'a)i$'

6in situ7

Bro!ur' de

etidiu69n geluri7

luores$ente6re$i7

,adioa$ti+e6$alde7

Sunt necesare

cantiti mari de AD+

Este necesar de /tiut

structura secvenei

AD+ de cercetat


14/46

/e"ni$i de anali)' a genelor/e"ni$i de anali)' a genelor

PC,PC, *out"ern - lot*out"ern - lot *e$+enierea N*e$+enierea N

Prin$ipii de a)'Prin$ipii de a)'

%tapele prin$ipale%tapele prin$ipale Co!ponente ne$esare 6la general7Co!ponente ne$esare 6la general7 Indi$aii :i li!iteIndi$aii :i li!ite


15/46

PC,PC,

rrea$iaea$ia $$i$li$' dei$li$' de ppoli!eri)areoli!eri)arePrin$ipiile PC,Prin$ipiile PC, $lonarea$lonarea in vitroin vitro; a!plifi$are; a!plifi$are ,epli$are se!i$onser+ati+',epli$are se!i$onser+ati+'< repetat'< repetat'

*pe$ifi$itatea*pe$ifi$itatea pri!erilorpri!erilorsinteti$i pentrusinteti$i pentru gena0gena0int'int' iridi)areairidi)area N-int' 0 pri!erN-int' 0 pri!er =

$o!ple!entar$o!ple!entar #enaturare ter!i$' a N - de $er$etat#enaturare ter!i$' a N - de $er$etat

Modifi$area $i$li$' a te!peraturiiModifi$area $i$li$' a te!peraturii #enaturare#enaturare ,enaturare,enaturare *inte)'*inte)'


16/46

%omponentele necesare pentruclonarea in vitro9#%4:=

- AD+ de cercetat- #rimeri specifici secvenei de clonat complimentari secvenelor flancante

- >a?-polimera!a AD+-polimera! termostabil- De!o#:

- Instalaie de !odifi$are $i$li$' a te!peraturii- t> de denaturare N

- t> de renaturare 6N?pri!er7- t> de poli!eri)are 6elongarea $atenelor

noi de N7


17/46


18/46

%(tragerea N Preg'tirea $o!ponentelorpentru PC,

&!plifi$area N-int'

%le$trofore)a

produ:ilor PC,

Colorarea :i +i)uali)area

produ:ilor PC,

&utoradiografia :iinterpretareare)ultatelor


19/46

&+antaEele PC,&+antaEele PC,

Metod' rapid'Metod' rapid'Metod' ieftin'Metod' ieftin'tili)area $antit'ilor !i$i de !aterial anali)attili)area $antit'ilor !i$i de !aterial anali)atNu ne$esit' i)otopi radioa$ti+iNu ne$esit' i)otopi radioa$ti+i

Interpretarea u:oar' a re)ultatelorInterpretarea u:oar' a re)ultatelor#e)a+antaEele PC,#e)a+antaEele PC,

Ne$esitatea $unoa:terii se$+enei nu$leotidi$eNe$esitatea $unoa:terii se$+enei nu$leotidi$ea!plifi$atea!plifi$ateNe$esitatea pri!erilor sinteti$i< spe$ifi$iNe$esitatea pri!erilor sinteti$i< spe$ifi$ise$+enei anali)atese$+enei anali)ate


20/46

tili)area PC,tili)area PC,Identifi$area inseriilorFdeleiilor nu$leotidi$eIdentifi$area inseriilorFdeleiilor nu$leotidi$eIdentifi$area !utaiilor pun$tifor!e 6sustituiileIdentifi$area !utaiilor pun$tifor!e 6sustituiile

nu$leotidi$e7nu$leotidi$e7Identifi$area e(presiei geni$e 6Identifi$area e(presiei geni$e 6RT-PCRRT-PCR77#a$tilos$opia geno!i$' 6filiaie7#a$tilos$opia geno!i$' 6filiaie7Identifi$area agenilor infe$io:iIdentifi$area agenilor infe$io:iIdentifi$area gradului de infe$ie 6Identifi$area gradului de infe$ie 6quantitative PCRquantitative PCR77

#iagnosti$ pre$is :i rapid a olilor !onogeni$e

#epistarea predispo)iiei geneti$e la olile $o!une

&nali)a filiaiei

#iagnosti$ul pre$is :i rapid al olilor infe$ioase :i

stailirea gradului de infe$tare a pa$ientului


21/46

Identificarea inseriilorIdentificarea inseriilor //deleiilordeleiilor


22/46

Identificarea mutaiilor punctiformeIdentificarea mutaiilor punctiforme


23/46

Identificarea agenilor infecioiIdentificarea agenilor infecioi


24/46

Stabilirea paternitii filiaiei!Stabilirea paternitii filiaiei!


25/46

Optimizarea condiiilor de desfurare a PCR

"ependena cantitii de produse amplificate de concentraia #"$ genomic utili%at &n P'R(S)a utili%at #"$ &n cantitate de* + ,-. g- 0 ,-0. g- 1 ,-+ g- 2 ,-,0 g

Con$entraiile $riti$e ale sustanelor pentru in"iarea a$ti+it'ii /a-poli!era)ei

Substana 'oncentraia critic

SDS >0.005% m!"#

$enol >0.% "!"#

&tanol >'% "!"#

(sopropanol >'% "!"#

C)*COO+a >5 m,

+aCl >5 m,

&D- >0.5 m,


26/46

Optimizarea condiiilor de desfurare

a PCR

Cara$teristi$a pri!erilor utili)ai n PC,

3ena Sec4ena Lungimea- ba%e 5 36' 7m- o'

#'85/C-111CCC-CCC-CC---C-*/ 2 52 53

5/1-1-11CC-CC--C1-C1-*/ 5 24 54

#7+ R5/C-11C-CC--1C-11-1-11*/ 0 5 54

5/111C1C1------C-11-1*/ * 24 55

$9S5611C111C1-11-11*6 55 57

56CCC1-C-CCC---11-1C-C*6 2 52 53

"ependena cantitii produselor P'R de temperatura de renaturare a primerilor(:n condiiile P'R s)a utili%at* + to' optimal ).o'; 0 to' optimal; 1 to' optimal 6.o'(


27/46

Optimizarea condiiilor de desfurare a PCR

"ependena cantitii produselor P'R de concentraia ionilor


28/46

naliza polimorfismului (!D pentru 8ena C&

#nali%a electroforetic &n gel de agaro% de 05 a produselor P'R re%ultate din amplificarea #"$ umancu primeri corespun%tori genei #'8(

< marc=er al lungimii; + genotip I/"; 0 genotip "/"; 1 genotip I/I(

I

D


29/46

naliza polimorfismului 1!- pentru 8ena +OS

, ' % *

Re%ultatele amplificrii #"$ uman cu primeri corespun%tori genei $9S(< marc=er al lungimii; + genotip 3/3; 0 genotip 7/7; 1 genotip 3/7(

G

T


30/46

naliza polimorfismului !C pentru 8ena -' R

Re%ultatele amplificrii #"$ uman cu primeri corespun%torigenei #7+ R digerate cu a>utorul en%imei "de I(

< marc=er al lungimii; + genotip #/#; 0 genotip #/'

A

C


31/46

-e9nica RealtimePCR


32/46

/e"ni$a

*out"ern-lot a!at pe 45#s

Hibridi!are cu sonde marcate %u transferul 54 din gel-electrofore!

pe un suport solid 9pe membrane de

nitrocelulo!:


33/46

iridarea a$i)ilor nu$lei$iiridarea a$i)ilor nu$lei$inirea $o!ple!entar' a frag!entelornirea $o!ple!entar' a frag!entelor6!ole$ulelor7 de a$i)i nu$lei$i6!ole$ulelor7 de a$i)i nu$lei$i

N de $er$etat $uN de $er$etat $usonda oligonu$leotidi$'sonda oligonu$leotidi$'

9n rea$ie parti$ip' !ole$ule !ono$atenare9n rea$ie parti$ip' !ole$ule !ono$atenareMole$ulele N-int' sunt fi(ateMole$ulele N-int' sunt fi(ateMole$ulele-sonde sunt !ar$ate radioa$ti+ sauMole$ulele-sonde sunt !ar$ate radioa$ti+ sau

fluores$entfluores$entIdentifi$area $o!ple(elor "iride se reali)ea)'Identifi$area $o!ple(elor "iride se reali)ea)'prin inter!ediul autoradiografieiprin inter!ediul autoradiografiei


34/46

7e=nica Sout=ern)blot7e=nica Sout=ern)blot

8?tragerea #"$8?tragerea #"$ Restriia #"$Restriia #"$ 8lectrofore%a #"$8lectrofore%a #"$

"enaturarea i"enaturarea itransferul #"$transferul #"$pe membranepe membrane

#utoradiografia#utoradiografia@ibridare cu sonda@ibridare cu sonda

Ai%uali%area iAi%uali%area iinterpretareainterpretarea

re%ultatelorre%ultatelor

tili t " i iitili t " i ii


35/46

tili)area te"ni$iitili)area te"ni$ii*out"ern-lot*out"ern-lot

Identifi$area inseriilor F deleiilor !ariIdentifi$area inseriilor F deleiilor !ariIdentifi$area !utaiilor pun$tifor!e $eIdentifi$area !utaiilor pun$tifor!e $eafe$tea)' *,afe$tea)' *,#a$tilos$opia geno!i$' ,LPs#a$tilos$opia geno!i$' ,LPs

45# i li ti l i


36/46

45#s /i anali!a genotipului

Electrofore!a 54 a 2 persoane A, /i %

Alela +ormal cu 2 S4 Alela mutant cu 3 S4, mutaie 7n S43

B 6N!7B 6N!7C 6!!7C 6!!7

& 6NN7& 6NN7


37/46

Ne$esit' $unoa:terea "'rii de restri$ie aNe$esit' $unoa:terea "'rii de restri$ie agenei int'genei int'

Ne$esit' $antit'i !ari de !aterial iologi$Ne$esit' $antit'i !ari de !aterial iologi$Metod' ndelungat'< $u !ulte etapeMetod' ndelungat'< $u !ulte etapeNe$esit' i)otopi radioa$ti+iNe$esit' i)otopi radioa$ti+iNe$esit' !ateriale $ostisitoareNe$esit' !ateriale $ostisitoare

#e)a+antaEele *out"ern-lot#e)a+antaEele *out"ern-lot

&+antaEele *out"ern-lot&+antaEele *out"ern-lot

%ste !etod' foarte pre$is'%ste !etod' foarte pre$is'Nu ne$esit' $unoa:terea se$+enei nu$leotidi$eNu ne$esit' $unoa:terea se$+enei nu$leotidi$eanali)ateanali)ateNu ne$esit' pri!eri sinteti$iNu ne$esit' pri!eri sinteti$i

/ " i/ " i


38/46

/e"ni$a/e"ni$aNort"ern-lotNort"ern-lot

%(tragerea &,N din esutul int'%(tragerea &,N din esutul int'

%le$trofore)a &,N n $ondiii de%le$trofore)a &,N n $ondiii dedenaturaredenaturare

/ransfer pe !e!ran' de/ransfer pe !e!ran' denailonnailon

iridarea $u sonda !ar$at'iridarea $u sonda !ar$at'

&utoradiografia&utoradiografia


39/46

7e=nica $ort=ern)blot7e=nica $ort=ern)blot

8?tragerea #R$8?tragerea #R$ 8lectrofore%a #R$8lectrofore%a #R$

transferul #R$transferul #R$pe membranepe membrane

#utoradiografia#utoradiografia@ibridare cu sonda@ibridare cu sonda

Ai%uali%area iAi%uali%area iinterpretareainterpretarea

re%ultatelorre%ultatelor


40/46

tili)area te"ni$iitili)area te"ni$iiNort"ern-lotNort"ern-lot

Identifi$area e(presiei geni$e n anu!iteIdentifi$area e(presiei geni$e n anu!iteesuturi< anu!ite $ondiiiesuturi< anu!ite $ondiii

Identifi$area +ariantei deIdentifi$area +ariantei de splicingsplicinga pro&,N!a pro&,N!

Identifi$area ni+elului de e(presieIdentifi$area ni+elului de e(presie

Identifi$area agenilor infe$io:i 6rio+irusuri7Identifi$area agenilor infe$io:i 6rio+irusuri7


41/46

Identifi$area ni+eluluiIdentifi$area ni+eluluide e(presie :i a +arianteide e(presie :i a +arianteidede splicingsplicing


42/46

*e$+enierea N*e$+enierea N*tailirea se$+enei de nu$leotide*tailirea se$+enei de nu$leotide

Metoda $"i!i$' 6te"ni$a Ma(a!-Gilert< 1@7Metoda $"i!i$' 6te"ni$a Ma(a!-Gilert< 1@7

Metoda dideo(i 6te"ni$a *inger< 1@7Metoda dideo(i 6te"ni$a *inger< 1@7

Metoda auto!at' 6$u utili)area agenilor fluores$eni7Metoda auto!at' 6$u utili)area agenilor fluores$eni7

-


43/46

@

9@: 0/&&&/GGC/&/&&&/GGC/&.......29-:


44/46

iridareairidareain situin situ

Preg'tireaPreg'tireapreparatelor depreparatelor de$ro!o)o!i$ro!o)o!i

#enaturarea N#enaturarea Niridarea $u sondairidarea $u sonda!ar$at'!ar$at'

8i)uali)area la8i)uali)area la!i$ros$opul opti$!i$ros$opul opti$


45/46

iridareairidarea in situin situ $u$uutili)area preparatelorutili)area preparatelor

de $ro!o)o!i !etafa)i$ide $ro!o)o!i !etafa)i$i

iridareairidarea in situin situ $u$uutili)area preparatelorutili)area preparatelor

$u nu$lei interfa)i$i$u nu$lei interfa)i$i

iridareairidarea in situin situpentrupentrudepistarea se$+enelor Ndepistarea se$+enelor N


46/46

,olul pra$ti$ al te"ni$ilor de anali)' aa$i)ilor nu$lei$i

1. Cer$etare 0 se$+enierea N< for!area iliote$ilor degene< studiul e(presiei geni$e< studiul !e$anis!elor dereglare< studiul $onse$inelor !utaiilor.

2. #epistarea persoanelor purt'toare de !utaii - prenatal

sau postnatal< $u s$op de pre+enire a na:terii $opiilor $uano!alii geneti$e sau !anifest'rii unor patologii se+ere.

3. /erapie geni$' 6alegerea genei int'< $onstruirea+e$torilor de gene et$.7.

4. #epistarea N str'in 6+iral sau a$terian7 ndiagnosti$ul olilor infe$ioase.

5. Identifi$area poli!orfis!elor indi+iduale n anali)a

Documents

Studiul genelor