STUDIO DELLE PROTEINE - biologia.campusnet.unito.it · Le proteine ricombinanti vengono spesso espresse come proteine di fusione in vettori specifici. Il vettore possiede un sito

Purificazione delle proteinePurificazione delle proteine1. cromatografia2. determinazioni quantitative concentrazione 3. elettroforesi4. determinazione della massa

STUDIO DELLE PROTEINE

Purificazione delle proteinePurificazione delle proteine

1. Cromatografia:Gel filtrazioneScambio ionicoInterazioni idrofobicheAffinità


Principi della separazione cromatografica

• La separazione delle macromolecole e in particolare delle proteine in cromatografia si basa sull’ equilibrio di ripartizione tra:– una FASE MOBILEFASE MOBILE, costituita dal solvente nel quale

è presente la miscela di proteine e contaminanti– una FASE STAZIONARIAFASE STAZIONARIA (associata ad un

supporto o MATRICEMATRICE), che può avere caratteristiche differenti (carica, idrofobicità, presenza di liganti specifici, porosità…), in modo tale da consentire l’interazione selettiva e preferenziale di alcune macromolecole o proteine rispetto ai contaminanti e consentirne così la purificazione.

•• Coefficiente di ripartizioneCoefficiente di ripartizioneR=R=CCSS / / CCM M dove CCSS corrisponde alla concentrazione della proteina di interesse nella fase stazionaria e CCMM nella fase mobile

Quale tecnica cromatografica? Criteri di scelta

Schema del processo

A: tampone di eluizioneB: miscelatore o formatore di gradienteC: sistema di pompaggioD: colonna cromatograficaE: rivelatoreF: plotter per cromatogrammaG: raccoglitore di frazioniH: rubinetto a tre vie o loop di iniezione

H

Matrici per CROMATOGRAFIALa matrice è il substrato solido La matrice è il substrato solido

della fase stazionaria.della fase stazionaria.La matrice può essere modificata

tramite reazioni chimiche per coniugare gruppi con differente funzionalità:

Es. – gruppi carichi positivamente o negativamente- metalli (zinco, rame, nichel)- molecole idrofobiche (C4-C18)-ligandi specifici (coenzimi, anticorpi)

Uno stesso gruppo funzionale può essere coniugato a differenti matrici, che conferiscono diverse caratteristiche chimico-fisiche.

Dettaglio matrici cromatografiaCellulosaCellulosa:E’ un polisaccaride lineare, formato da MONOMERI di GLUCOSIO con legame β1-4. [figura 1].La presenza di 3 GRUPPI IDROSSILICI

per monomero rende la matrice MOLTO IDROFILA e facile da derivatizzare.

AgarosioAgarosio:E’ un polisaccaride ottenuto dall’agar (estratto da alghe).E’ composto da catene del disaccarise AGAROBIOSO (D-GALATTOSO e 3,6-ANIDRO-1 GALATTOSO). [figura 3]Struttura: gel IDROFILO MOLTO POROSO ottenuto per raffreddamento di soluzioni 2% w/v. [figura 4].

Fig.1: Cellulosa: Struttura chimica

Fig.2: Trattamento della cellulosa asciutta (a) con NaOH: effetti (b)

Fig.3: Agarosio: Struttura chimica

Fig.4: Struttura del gel

Dettaglio matriciDestranoDestranoE’ un POLISACCARIDE EXTRACELLULARE prodotto dal batterio Leuconostoc mesenteroides.

E’ formato da catene di GLUCOSIO con legame α 1-6.E’ meno stabile della cellulosa all’idrolisi acida ma regge il trattamento con 0.1 M di HCl fino a 2 ore. Stabile a pH 2-12.

Cross-linking: EPICLORIDRINA

PoliacrilamidePoliacrilamide

Si ottiene per polimerizzazione dell’ ACRILAMIDE. L’agente che permette il cross-linking è la N,N’ METILEN-BISACRILAMIDE. La matrice che si ottiene è adatta soprattutto alla gel-permeation. E’ autoclavabile e ha buona stabilità chimica tuttavia il monomero dell’acrilamide (tossico) può essere lentamente rilasciato.

Unità ripetitiva Unità ripetitiva della della poliacrilamidepoliacrilamide

Separazione in base alla Separazione in base alla dimensione/taglia dimensione/taglia

molecolare: molecolare: CROMATOGRAFIA DI GEL CROMATOGRAFIA DI GEL

FILTRAZIONE O FILTRAZIONE O ESCLUSIONE ESCLUSIONE MOLECOLAREMOLECOLARE


Cromatografia di gel filtrazione(o esclusione molecolare)

Teoria: ripartizione e costante di avanzamento (Kav)

Ciascuna molecola presenta in cromatografia di gel filtrazione un comportamento caratteristico dettato dalla

sua taglia molecolare e descritto da un coefficiente di distribuzione (Kd) tra fase mobile e fase stazionaria.

Kd Kd rappresenta la frazione della fase stazionaria rappresenta la frazione della fase stazionaria disponibile per la diffusione di una determinata disponibile per la diffusione di una determinata

molecolamolecola

Operativamente tuttavia si preferisce definire una COSTANTE DI AVANZAMENTO Kav che è facilmente

determinabile e come Kd descrive il comportamento della molecola durante la separazione

Teoria: ripartizione e costante di avanzamento (Kav)

Kav Kav = (Ve = (Ve ––Vo) / (Vo) / (Vt Vt –– Vo)Vo)

Ve = volume di Ve = volume di eluizioneeluizioneVo = volume vuotoVo = volume vuotoVt Vt = volume totale= volume totale

Rispetto alla Kd si effettua una semplificazione considerando (Vt-Vo) invece di Vi=Vt-Vo-Vmatrice(volume dei pori dentro la matrice disponibile per la diffusione libera di piccole molecole)

Vo Vt-Vo Vt

L’efficienza di una colonna si valuta in base al numero di piatti teorici per metro:N=5.56x(Ve)2/ Vh x 100/Ldove:Ve: volume di eluizioneVh: volume a ½ altezza del piccoL: lunghezza della colonna in cm

Separazione 1% acetone

Separazione in base alla Separazione in base alla carica superficiale: carica superficiale:

CROMATOGRAFIA A CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICOSCAMBIO IONICO

(scambio (scambio cationico cationico per per proteine basiche o proteine basiche o anionicoanionico

per proteine acide)per proteine acide)


Cromatografia di scambio ionico (IEXC)

Sito carico sulla matrice della resinaProteina o molecola carica da separareIone del sale che compete con il legame

La Ion EXchange Chromatography:separa in base a differenze di carica superficiale

Schema IEXC (scambio anionico)

A: colonna equilibrata con bassa concentrazione di NaClB: le macromolecole cariche interagiscono con la matrice spostando i controioni associati (Cl - )C: aumentando la concentrazione di sali le macro-molecole meno acide vengono eluiteD: ad elevata concentrazioni di sali vengono eluite anche le molecole molto acide

SCAMBIO ANIONICO

SCAMBIO CATIONICO

MATRICI FUNZIONALIZZATE

Per le proteine i gruppi principali coinvolti sono:

+ Lys (pKa= 10.5), Arg (pKa= 12.5), His (pKa= 6), N-terminale (pKa= 9-11)

- Glu, Asp (pKa= 2-5), Cys (pKa= 8.3), Tyr (pKa= 10)

pI: pH al quale la carica netta della proteina è nullapH < pI< pH+ -

Visto il tipo di interazione è necessario che la proteina sia carica e quindi la separazione si effettua ad un pH che sia almeno 1 unità maggiore o minore del pI. NB: interessa la carica SUPERFICIALE e LOCALE anche se pH=pILa cromatografia a scambio ionico prende il nome di:SCAMBIO ANIONICO -SCAMBIO CATIONICO +in base alla carica del CONTROIONE che può associarsi e dissociarsi dalla fase stazionaria carica.

Effetto del pH

+

-

pH acido pH basico

Carica

pro

teina

tempo

Conc

. el

uent

e

Eluizione

L’eluizione può essere:ISOCRATICA: la composizione dell’eluente non cambia

CON GRADIENTE A SCALINI: la composizione viene cambiata in modo discontinuo almeno una volta, per eluire selettivamente.

CON GRADIENTE CONTINUO: il gradiente varia in modo continuo, incrementando gradualmente le condizioni favorevoli alla dissociazione delle molecole di interesse dalla colonna

tempo

Conc

. el

uent

e

tempo

Conc

. el

uent

e

Dopo l’applicazione del campione le colonne (ad eccezione dei quelle per gel-filtrazione) vengono solitamente lavate con un volume dello stesso tampone utilizzato per equilibrarle; questo per rimuovere i contaminanti non legati.

Esempi di effetto del gradientePendenza del gradiente:Un gradiente RIPIDO (“STEEP”) permette di ottenere picchi più stretti (la coda del picco è eluita ad una velocità leggermente maggiore del fronte perché sottoposta all’effetto di una maggiore concentrazione dell’eluente). Tuttavia la risoluzione può essere diminuita perché la selettività (= distanza tra i picchi) è minore.Diminuendo la pendenza del gradiente (“SHALLOW” gradient) di ha un maggior effetto di allargamento delle bande e i picchi sono più larghi e spesso scodati ma si possono risolvere meglio. In alcuni casi, se si ha a disposizione un formatore di gradiente automatico, si possono programmare in modo alternato segmenti di gradiente lineare a diversa pendenza.

Separazione in base alla Separazione in base alla idrofobicitàidrofobicità superficiale: superficiale: CROMATOGRAFIA DI CROMATOGRAFIA DI

INTERAZIONE INTERAZIONE IDROFOBICAIDROFOBICA


Cromatografia di interazione idrofobica (HIC): teoria

Si basa sull’interazione idrofobica tra la superficie della resina (che porta gruppi octile o fenile) e quella della proteina (o macromolecola) da separare.La proteina possiede sulla superficie un film di molecole d’acqua in struttura ordinata in corrispondenza delle regioni idrofobiche. L’ interazione di queste regioni con altre della stessa natura è favorita da un ∆S > 0: la rimozione di queste molecole d’acqua ordinate aumenta l’entropia del sistema. Il ∆G = ∆H -T ∆S risulta negativo e la reazione è perciò spontanea (∆H è piccolo).

Separazione in base a Separazione in base a caratteristiche di funzione:caratteristiche di funzione:

CROMATOGRAFIA DI CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’AFFINITA’


Cromatografia di affinità:

Utilizzata per purificare biomolecole che si assorbono in modo SPECIFICO e REVERSIBILE ad un ligando immobilizzato sulla matrice.

P+L PL

KL= [P] [L][PL]

[L] = [PL]KL [P]

Se [PL]=95[P] 5

allora KL deve essere 1/100 della [L] (es. [L] = 1mM allora KL deve essere 10 –5 M

Range utile:KL=10 –4 10 –8M

1: condizione ideale, il ligando e la biomolecola non vengono alterati2: si promuove un cambiamento di conformazione di P e L3: competizione con molecola simile a P, L rimane bloccato4: competizione con molecola simile a L, P rimane bloccato

Cromatografia di affinità: tabella ligandi utilizzati

Le proteine ricombinanti vengono spesso espresse come proteine di fusione in vettori specifici.

Il vettore possiede un sito di inserzione della sequenza codificante “in FRAME” con la traduzione sequenza che codifica per una proteina o un frammento di proteina all’N o al C terminale dellaproteina da purificare.Questo TAG o FLAG è una “etichetta” o “bandierina” di riconoscimento che può essere selettivamente legata ad anticorpi, ligandi o recettori specifici per cromatografia di affinità.

Il frammento FLAG viene poi rimosso per azione di una proteasi specifica, il cui sito di riconoscimento viene anch’esso progettato sul vettore in modo da risultare nella posizione adatta ad ottenere la proteina di interesse nella forma integra e nativa.

Riconoscimento di “TAG” e “FLAG” in proteine ricombinanti

Resina coniugata all’avidina per proteine ricombinanti Biotin-TAG

Maltose-binding-protein

Proteine di fusione conGlutatione-S-transferasi

(GST)-TAG

Acido cis-cis muconicoCatecolo

Cat1,2DO

O2

5

43

1

2

6

COOH

COOHOH

OHOH

OHOH

OH

: CATECOLO 1,2 DIOSSIGENASI

Proteine di fusione conGlutatione-S-transferasi

(GST)-TAG:

proteine contaminanti di E.coli

FASE 1: caricamento del campioneFASE 2: lavaggio per rimuovere i contaminanti

FASE 3: eluizione specifica della proteina di fusione con glutatione libero

PRINCIPIO: Il glutatione libero in eccesso compete con il glutatione coniugato alla matrice e pertanto spiazza la proteina legata che si ritrova nella fase mobile e viene raccolta nell’eluato

Cromatogramma

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

1,7

1,81,9

2

2,1

2,2

2,3

2,4

2,52,6

2,7

2,82,9

3

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

frazione

Abs

280

nm

Numero frazioni ASSORBANZA 280 nm 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Purificazione delle proteinePurificazione delle proteine2. Determinazione quantitativa

della concentrazione


Determinazione della concentrazione di proteine totali

METODIMETODI

IndirettiIndirettiMetodo di Kjeldahl (determinazione dell’azoto totale)

DirettiDirettiSpettrofotometria UV (280 nm e lontano UV)Metodo del BiuretoMetodo di LowryMetodo di Markwell (o Lowry modificato)Metodo di Bradford (o del legame con coloranti)Metodo dell’acido bicinconinico (BCA)Metodo Silver-binding

Metodi Metodi spettrofotometricispettrofotometriciPremessaPremessa: tutti i metodi diretti di dosaggio delle proteine si basano sulla rilevazione spettrofotometrica e quindi sull’analisi quantitativa dello spettro UV/visibile.

I0 = intensità luce incidenteI = intensità luce trasmessaI0 I

∆x

Trasmittanza: T = I/I0 (I0=100)Assorbanza. A = = log 1/T

A=Log I0/IT varia tra 0-100A varia tra 0-∞ (max. 2-4)

∆I

∆x

−∆I= ∆x I K -dI=I K dx-dI/I=Kdx∫I dI/I =-K∫x dxI0 0

ln I0/I =Kx

Legge di Lambert-BeerSe ln (I0/I) ∝ A risulta che A=Log I0/I = Kx/2.303= K’ xcon K’= ε c

A=A=εε c xc xε =ε = A/cx in M-1 cm-1

Spettrofotometria UVLa maggior parte delle proteine presenta un massimo di assorbimento a

280 nm, dovuto al gruppo fenolico della tirosina e al gruppo indolicodel triptofano.

Il coefficiente di estinzione molare ε può essere espresso come ε2801%

o ε2801 mg/ml e varia in modo significativo da proteina a proteina, a

seconda della composizione aminoacidica e della struttura. Il range è 0.4-1.5 con estremi a 0 (parvalbumina e proteine leganti il calcio correlate) e 2,65 (lisozima).

Il metodo è quindi poco accurato e viene utilizzato solo quando l’ ε ènoto e la calibrazione è stata effettuata contro uno standard della stessa proteine, possibilmente pesata (peso secco).

La sensibilità è relativamente bassa e richiede 0.05-2 mg di proteina/ml.

Inoltre è sensibile alle interferenze di altri composti che assorbono nella stessa regione dello spettro UV, in particolare acidi nucleici (260 nm). In questo caso si può applicare la formula di correzione:

PROTEINA (mg/ml) = 1.55 A280 – 0.76 A260

Si utilizzano cuvette in quarzo

Il metodo è rapido e NON DISTRUTTIVO

Metodo di Bradford

Questo metodo si basa sull’interazione con il colorante Coomassie Brilliant Blue G250. Il legame con le proteine causa uno shift della assorbanza massima da 465 a 595 nm.

Molto sensibile: 0.2-1.4 mg prot./ml (5-100 µg /ml microassay)

E’ molto dipendente dalla composizione in aminoacidi: SI LEGA AGLI AMINOACIDI BASICI (soprattutto arginina) e AROMATICI (interazioni idrofobiche).

00,10,20,30,40,50,60,70,80,91

1,11,21,31,41,51,61,71,81,92

0 5 10 15 20 25

Concentrazione (µg/ml)

Ass

orba

nza

595

nm

Volume totale(ml)

Concentrazione proteine (mg/ml)

Proteine totali(mg)

Attività per 50 µl di campione(∆Abs/min)

Attivitàtotale (∆Abs/min)

Attivitàspecifica(∆Abs/min/mg proteina)

Attivitàspecifica(∆conc M /min/mg proteina)

Fattore di purificazione

Resa %

EG 1 100

C1,2DO


3. Elettroforesi:

elettroforesi su gel di poliacrilamideSDS-PAGE


ElettroforesiIn generale, si tratta di un processo mediante cui molecole cariche si

separano, in presenza di un campo elettrico, in base alla loro diversa mobilità.

La mobilità o velocità di migrazione v dipende da:E: intensità del campo elettricoz: carica netta superficiale della particellaf: coefficiente di forza contraria alla migrazione

La relazione è la seguente:

anche se si preferisce definire non le velocità di migrazione assoluta(v = distanza / tempo) ma la mobilità relativa (Rf = distanza percorsa dalla particella d’interesse / distanza percorsa da un colorante - traccia anionico ad elevato rapporto carica:massa):

fz E v =

fEz Rf =

Mobilità elettroforetica• viene definita come:

µ = v/E = z/f

• NB: Il coefficiente frizionale f dipende dalle dimensioni, dalla forma e dallo stato di solvatazione della molecola carica che migra nel campo elettrico

• IN PRATICA LA MOBILITA’ DIPENDE DAL RAPPORTO CARICA/MASSA

Elettroforesi su gel poliacrilammide (PAGE e SDS-PAGE)

OSO3 Na +

sodio dodecil solfato

Proteina

L’SDS conferisce un eccesso di carica negativa alla proteina e ne promuove lo srotolamento

In questo sistema il campione caricato nel pozzetto viene concentrato all’interfaccia tra stacking e running gel e la separazione effettiva avviene nel running gel con migliore risoluzione

SDS-PAGE: sistema discontinuo

pH=6.8Acrilamide 4%

pH=8.8Acrilamide 12%

pH=8.2


4. determinazione della massatramite SDS-PAGEtramite cromatografia di esclusione

molecolare


976645

31

21

14kDa

Lf: Distanza migrazione del fronte (colorante)Lc: Distanza migrazione del campione (proteina)

Lf

Lc

Rf= Distanza migrazione del campione

Distanza migrazione del fronte

In SDS-PAGE esiste una relazione lineare tra Rf e log MW

CROMATOGRAFIA DI GEL FILTRAZIONE:Esiste una relazione lineare tra la Kav e il logaritmo della taglia molecolare

Separazione di campioni proteici a massa molecolare nota

Log MW(variabile x)

Kav = f(log MW)0<Kav<1

Kav(variabile y)

Log MW di campioni standard noti

Kav determinata per campioni standard noti

Per un campione di MW ignota si misura la Kav e si risale al MW

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