Steroid

Steroid merupakan terpenoid yang dikenali dengan karbon siklopentano-perhidro-

penantrenskeleton dengan 4 cincin siklik, bentuk susunannya 6-6-6-5.

Gambar Struktur dasar steroid

Struktur dasar hidrokarbon dari steroid adalah a) gonane, estran, androstan; b) pregnan; c)

Kolan; d) Kolestan.

Gambar Struktur dasar hidrokarbon steroid

Steroid terdiri sintetik dan alami/ endogen dengan aksi farmakologis yang sangat luas. Baik

sebagai regulator suatu sistem atau sebagai sarana untuk terapi penyakit.

Pada bab ini bahasan akan focus di oral kontrasepsi sintetik golongan progestagen, dan

estrogen.

Progestagen

Steroid kelompok progestagen terdiri dari steroid progestagen alami C21, progesterone(4-

pregnen-3,20-dione), dan metabolitnya, serta steroid sintetis, norgestrel noretisterone (NE) dan

medroksiprogesterone asetat yang memiliki aktivitas progestasional.

Gambar Struktur kelompok senyawa Progestagen

Metode-metode penetapan kadar progestagen dan estrogen

1. Spektrofotometri UV dan Visibel

Metode spektrofotometri UV dipakai untuk menetapkan kadar progestagen pada panjang

gelombang 240 nm. Hal ini karena keberadaannya gugus kromofor dari ikatan3-okso inti

steroid. Namun metode ini lama, tidak praktis dan tidak sensitive. Derivatisasi pada gugus 3-

okso untuk membentuk dinitrofenil hidrazone tiosemikarbazone atau asam isonikotinik

hidrazon dapat mengatasi permasalahan yang timbul tadi. Hasil reaksinya adalah senyawa

berewarna. Metode ini tidak mampu mendeteksi kadar progesterone di bawah 0,1-0,5 mg.

Levonorgestrel yang merupakan progestin sintetis dan etinilestradiol (merupakan golongan

estrogen) dalam sediaan tablet juga dapat ditetapkan juga dengan metode spektrofotometri

derivatif. Prosedur kerjanya sederhana, tidak memerlukan proses pemisahan. (Berzas, et al.,

1997).

Metode lain adalah pembentukan warna yang didasarkan pada reaksi reduksi garam

tetrazolium oleh α-keto steroid. Garam tetrazolium yang dapat dipakai adalah 2,3,5-

trifeniltetrazolium (memberikan λmax, 490 nm), 3,3’-dianisole-bis-4,4’-(difenil)-fenil-3-(p-

iodofenil) tetrazolium klorida (tetrazolium biru, λmax, 510 nm). Metode ini cukup spesifik dan

interferensi dari gula, asam askorbat, sistein, asam glukoronat dan asam lemak tidak jenuh

dapat diatasi dengan penambahan etanol atau dengan penambahan yang lain.

Bebawy, et al. 2001, melaporkan bahwa gestoden dan ciproteron dapat ditetapkan dengan

kolorimetri dengan sebelumnya direaksikan dengan isoniazid pada suasana asam, pembacaan

pada panjang gelombang 378 nm dan 400 nm untuk gestoden dan ciproteron. Tetrazolium

dalam kondisi basa menghasilkan warna merah yang dibaca pada panjang gelombang 515 dan

520 nm untuk gestoden dan ciproteron.

Reaksi pembentukan warna kuning antara INH dengan gestoden

Prosedur penetapan steroid dengan spektrofotometri vis

Larutan Pembanding

Timbang seksama sejumlah Baku Pembanding FI, seperti yang tertera pada monografi,

yang sebelumnya telah dikeringkan menurut cara yang tertera pada monografi, larutkan dalam

etanol P. Lakukan pengenceran hingga kadar lebih kurang 10 g per ml. Pipet 20ml larutan ke

dalam labu bersumbat kaca.

Larutan Uji

Buat larutan uji menurut cara yang tertera pada masing-masing monografi

Kedalam 2 labu yang masing-masing berisi Larutan Uji dan Larutan Baku, dan kedalam labu

ketiga yang berisi 20,0ml etanol P sebagai blangko, tambahkan 2,0ml larutan yang dibuat

dengan melarutkan 50mg biru tetrazolium P dalam 10ml metanol, campur. Kemudian pada

masing-masing labu tambahkan 2,0ml campuran etanol P - tetrametilamonium hidroksida LP

(9:1), campur, biarkan dalam gelap selama 90’. Ukur serapan pada 525nm. Kadar steroid

dihitung dengan rumus yang tertera pada masing-masing monografi. C adalah kadar baku

pembanding g/ml, Au dan As serapan larutan uji dan larutan baku (FI).

2. Spektrofluorometri

Metode spektrofluorometri memberikan keunggulan spesifitas tinggi dan interferensi yang

rendah. Untuk mendapatkan agar progestagen berfluoresensi maka dapat digunakan KOH/

asam sulfat. Metode ini dapat mendeteksi 50 ng progestagen. Konversi progesterone menjadi

20-hidroksi-pregn-4-ene-3-one secara enzimatik untuk mendapatkan fluoresensi. Metode

enzimatik ini mampu mendeteksi 3-5 ng progesterone.

3. Derivatisasi dengan Isotop ganda

Metode ini penetapan kadarnya berdasarkan pelabelan senyawa progestagen dengan suatu

isotop yang kemudian radioaktifnya dideteksi. Oleh karena itu metode ini menggunakan reagen

suatu radioaktif. Radioaktif yang ditambahkan ke dalam sampel adalah 3H atau 14C, setelah itu

kemudian diekstraksi dan dipurifikasi. Steroid terlabel dan tak terlabel diderivatisasi dengan

reagen yang mengandung isotop berbeda. Metode ini tidak cocok untuk analisis rutin sampel

serum karena prosedur purifikasi yang membutuhkan waktu lama.

4. RIA (Radio Immuno Assay)

Norgestrel merupakan campuran rasemik dari D dan L dari 13β-etill-17α-etinil-17β-

hidroxigon-4-en-3-one. Hanya enansiomer D yang aktif secara biologis, dan ini dikenal dengan

nama levonorgestrel. Penelitian dengan metode RIA pada d-norgestrel atau levonorgestrel

memberikan hasil yang spesifik (Cameron, et al., 1975). Hal yang sama juga dikembangkan oleh

Munro, et al. (1996) yang menggunakan metode EIA.

5. Kromatografi Gas Cair (GLC-MS)

Kromatografi gas dapat digunakan untuk penetapan kadar progestagen jika termostabil dan

mudah menguap. Secara umum progestagen merupakan senyawa yang tidak mudah menguap

oleh karena itu maka perlu dilakukan derivatisasi. Derivatisasi akan menghasilkan suatu

senyawa yang mudah menguap, termostabil, meningkatkan pemisahan dan menaikkan respon

detector. Teknik derivatisasi yang paling banyak dipakai adalah sililasi. Sililasi adalah suatu

reaksi antara gugus silil dengan atom hydrogen labil atau logam. Sililasi membuat menaikkan

kelarutan senyawa derivate dalam pelarut non polar dan volatilitasnya. Mekanisme reaksi

sililasi adalah subtinusi nukleofilik.

Gambar mekanisme reaksi sililasi

Reagen sililasi dipakai dalam tunggal dan campuran. Bentuk campuran reagen ini dilakukan

agar mendapatkan hasil yang sempurna dalam sililasi. Parameter yang dioptimasi adalah

reagen, waktu reaksi, dan suhu reaksi. Teknik untuk meningkatkan derivatisasi sililasi adalah

sonifikasi, pemanasan microwave, dan penambahan pelarut. Reagen yang terbaik untuk

derivatisasi steroid adalah campuran BSTFA/TMCS atau MSTFA. Kondisi optimum reaksi

derivatisasi adalah 30 menit pada suhu 700C dan 500C. dan untuk pelarut yang dapat dipakai

untuk meningkatkan reaksi derivatisasi adalah DMF, piridin dan asetonitril dengan

perbandingan 1:1. Teknik lain peningkatan reaksi derivatisasi adalah dengan pemanasan

microwave memberikan hasil yang lebih baik disbanding pemanasan biasa dan sonifikasi.

Gambar Reagen-reagen umum untuk sililasi

Rekapitulasi beberapa penelitian yang mengaplikasina metode GLC untuk menetapkan

kadar hormone terdapat pada table di bawah ini

Dalam analisis steroid baik dalam matriks biologis, lingkungan (air, tanah, dll), sediaan

farmasi melalui tahap preparasi sampel.

Beberapa tahap preparasi sampel adalah : (contoh detail pada table di bawah)

a. Filtrasi

Filtrasi merupaka tahap awal agar terjadi pemisahan antara senyawa yang larut dan tidak

terlarut. Prose filtrasi dilakukan dengan bantuan kertas saring.

b. Ekstraksi

Proses ekstraksi dilakukan untuk mendapatkan hormon yang jumlahnya sedikit dari sampel.

Teknik yang sering dipakai adalah ekstraksi cair-cair. Sebelum proses ekstraksi maka jika

sampelnya adalah darah atau daging maka proses pertama adalah deproteinasi. Proses

deproteinasi bertujuan agar protein yang akan menggangu dihilangkan dan protein yang

mengikat hormon dapat terlepas. Deproteinasi dapat menggunakan pelarut organic, TCA (Tri

Chlor Acetat Acid) atau reagen lainnya.

c. Purifikasi/ sample clean up

Hasil proses ekstraksi hanya mendapatkan suatu larutan yang bebas dari senyawa tidak

larut dan meminimalkan interferens. Oleh karena itu maka untuk menghilangkan

interferensinya dilakukan tahap clean up. Teknik clean up yang paling banyak dipakai adalah

ekstraksi fase padat dengan memvariasikan jenis kolom dan fase geraknya.

d. Evaporasi

Evaporasi bertujuan untuk menghilangkan pelarut sehingga akan didapatkan kadar yang

lebih besar. Jika sampel yang akan dievaporasi jumlahnya banyak maka dapat menggunakan

teknik rotary evaporator, dan jika jumlahnya sedikit dapat menggunakan gas nitrogen.

e. Derivatisasi

Derivatisasi ditujukan untuk menghasilkan suatu senyawa yang termostabil dan volatile.

Tujuan lain dari proses ini adalah meningkatkan sensitivitas detector terhadap analit. Jenis

reaksi yang dipilih untuk derivatisasi sangat tergantung dari struktur kimia senyawa dan sifat

fisika kimianya.

6. LC MS

Liu, et al., 2008 menyatakan bahwa deteksi hormon dalam sampel biologis lebih baik

digunakan spektrofotometri massa karena lebih sensitif dan spesifik. Perbedaan dalam

beberapa penelitian adalah metode fragmentasinya. Beberapa contoh metode fragmentasinya

adalah ESI (Electro Spray Ionization), EI (Electron Impact), CI (Chemical Ionization), APCI, dll. Hal

tersebut seperti dilaporkan oleh Diaz-Cruz, et al, 2003 yang meneliti endocrine disruptors

dalam sampel lingkungan.

Beberapa penelitian mengenai aplikasi metode LC MS, lebih detail seperti pada table di

bawah ini

Daftar Pustaka

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi 4, Depkes RI, Jakarta

Bebawy, L, I., Mostafa, A, A., and Refaat, H, H., 2001, different methods for determination of gestodene and cyproterone acetate in raw material and dosage form, Journal of Pharmaceutical And Biomedical Analysis, 25, 425-436

Berzas, J. J, Juana Rodríguez and Gregorio Castañeda,1997, Simultaneous Determination of

Ethynilestradiol and Levonorgestrel in Orasl Contraceptives by Derivative Spectrophotometry, Analyst, 122, 41 - 44, DOI: 10.1039/a604558h

Bowden, J, A., Colosi, D, M., Mora-Montero, D, C., Garrett, T, J., and Yost, Y, A., 2009,

Enhancement of chemical derivatization of steroids by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS), Journal of Chromatography B, 877 (2009) 3237–3242

Diaz-Cruz, M, S., de Alda, M, J, L., Lopez, R., and Bacelo, D., 2003, Determination of estrogens

and progestogens by mass spectrometric techniques (GC/MS, LC/MS and LC/MS/MS), JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY, 38: 917–923, DOI: 10.1002/jms.529

Higuchi, T, 1961, Pharmaceutical Analysis, Interscience publisher, New York Kashutina, M, V., Ioffe, S.L., and Tartakovskii, V.A., 1975, Silylation of Organic Compounds,

Russian Chemical Reviews, 44 (9), 737-747 López, M, J., and Barceló, A, D., 2001, Review of analytical methods for the determination of

estrogens and progestogens in waste waters, Fresenius J Anal Chem (2001) 371 :437–447, DOI 10.1007/s002160101027

Liu, F., Xu, Y., Liu, A., Hu, W., guo, Q., 2008, LC-Tandem-MS Validation for Quantitative Analysis

of Levonorgestrel in Human Plasma, Chromatographia, 68, 707-712, DOI:

10.1365/s10337-008-0773-5, 0009-5893/08/11 Neil D. Danielson, N, D., Gallagher,P, A., and Bao, J, J.,2000, Chemical Reagents and

Derivatization Procedures in Drug Analysis, in Encyclopedia of Analytical Chemistry, Jhon Wiley & Sons, Chochester, pp. 7042–7076

Prasad, S, D., Reddy, G, C., Prasad, P, S, S., and Mukkanti, 2004, Simulatneous HPLC Estimasion

of Levonorgestrel and Ethinylestradiol from tablets, Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 231-234, www.ijpsonline.com

Wood, P. J, and Gower, D.B., 2010, Steroid Analysis, Springer, London