Grupo 2Equipo 7Integrantes: Morn Vzquez Felipe de Jess.Snchez Nexpanco Jonathan.Tizo Canseco ngel

P5. MICOORGANISMOS PATGENOS. Deteccin de Staphylococcus aureus en alimentos.

Objetivo:

Determinar la presencia o ausencia de Staphylococcus aureus en 10g de muestra de Arroz con leche. Comparar resultado con la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MTODO PARA LA DETERMINACIN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN ALIMENTOS. y FDA para decidir si el alimento es aprobado o no.

Etiqueta

Nombre del analista: Morn V. Felipe de Jess, Snchez N. Jonathan y Tizo C. ngel Fecha y hora de compra: 31/03/13 8:45 pmMuestra: Arroz con lecheDescripcin: Un vaso de arroz con leche sometido a refrigeracin 24hrs antes del anlisis10-410-310-2

Tcnica analtica10-1

Realizar disoluciones decimales empleando tubos con 9.0ml de solucin diluyente.1ml1ml1mlHomogenizar la muestra con 90ml de diluyente.Pesar 10g de muestra en zona de asepsia.

Depositar 0.1ml de cada disolucin en Agar Baird Parker.

Incubar 37C/48hrsHomogenizar con una varilla de vidrio estril.

Enriquecimiento:Inocular cada colonia en cada tubo de caldo BHIContar aquellas colonias de color negro con halo. Caracterizar nmero de colonias de acuerdo a Tabla 1.

Incubar 37C/48hrs

Pruebas Bioqumicas para cada tubo de caldo BHI-CoagulasaIncubar 37C/6hrs. Revisando cada hora.

Formacin de coagulo, prueba positiva.0.2ml de cultivo0.2ml de plasma

-CatalasaPrueba positiva: burbujeo.Gota de agua oxgenada.Gota de cultivo.

-Manitol1 asada de cultivo y aceite mineral.

Incubar 37C/48hrs

-TermonucleasaA cada perforacin agregar una gota de cultivo

Agregar HCl 0.1N Azul de o-toloudina.Incubar 37C/48hrsDividir la caja de DNA de acuerdo al nmero de tubos BHI. En cada divisin perforar el agar con ayuda de pipeta pasteur estril. Hervir todos los tubos de BHI durante 15min. Dejar enfriar

Resultados y anlisis de resultadosTabla 1. Nmero de colonias de S. aureus a evaluarCuenta total de colonias sospechosas en una caja representativa.Colonias sospechosas a caracterizar bioqumicamente.

3

5

7

Se realiz una tincin de Gram a una colonia sospechosa para verificar si tena las caractersticas microscpicas de S. aureus Fecha: 3/04/13

Tipo de tincin: Gram

Descripcin: Se observan cocos Gram + en forma de racimos y algunos solos.

La tincin de Gram nos indic que las colonias probablemente son de S. aureus y por lo tanto se continu de inmediato con las pruebas bioqumicas.Conteo de colonias de color negro con halo: 90 UFCTabla 2. Resultados de las placas y caractersticas de las colonias tpicas de S. aureus.Dilucin10-110-210-310-4

# colonias sospechosas >150>150>15090

Caractersticas medioMacroscpicasMicroscpicas

Hagar Baird Parker Colonias color negro con halo blanco alrededor Bacterias Gram +, agrupadas en racimos, unos cuantos en pares e individuales.

De acuerdo a la tabla 1 y tomando en cuenta el conteo total de colonias se caracterizaron 5 colonias.Tabla 3. Pruebas BioqumicasPruebaColonia 1Colonia 2Colonia 3Colonia 4Colonia 5

Termonucleasa+++++

Coagulasa+++++

CMRF+++++

Catalasa+++++

Para estas pruebas bioqumicas las ms importantes y que determinan la presencia de S. aureus son las de termonucleasa y coagulasa, ya que estas dan positivas e indican la presencia de enterotoxina segn la NOM-115-SSA1-1994 y este fu el caso con nuestra muestra.

De las 5 colonias analizadas, las 5 dieron prueba positiva para termonucleasa y coagulasa. Por lo tanto:

Total de colonias sospechosas (UFC/g)90 UFC 0.00001g (caja sembrada con 0.1ml de la disolucin 10-4) X 1g

X = 90x105 UFC/g

Anlisis de resultados

En los medios de Baird Parker se observaron colonias tpicas de S. Aureus, colonias de color negro caracterstico del gnero de staphylococcus, ya que estos reducen el telurito a telurio. Posteriormente se seleccionaron las colonias sospechosas de S. aureus, son aquellas que presentaron un halo blanco alrededor de la colonia debido a la hidrolisis de la lecitina., tomando la placa que contena entre 51-100 UFC para tipificar las 5 colonias, correspondiente a la dilucin 10-4 g muestra/ml, adems se realiz una tincin Gram para observar las caractersticas microscpicas del microorganismo. Cada calonia se inoculo en caldo BHI, despus de incubar a 35C durante 24h, para cada tubo se realizaron las cuatro pruebas bioqumicas.Despus de 24h de haber inoculado en medio BHI, se agreg plasma de conejo a los caldos inoculados para verificar la produccin de coagulasa, los cuatro tubos resultaron positivos para esta prueba despus de 3 horas. En las otras 3 pruebas bioqumicas restantes fueron positivas lo cual nos indica la presencia de S. aureus, a excepcin de la prueba de termonucleasa la cual nos proporciona informacin acerca de la produccin DNAsa, para llevar a cabo esta prueba se necesita inactivar el cultivo calentando en bao Mara con el propsito de liberar DNAsa. y al momento de realizar la prueba con el HCl, la formacin de halo fue percibido porque la formacin excesiva de colonias lo permiti.

Conclusin:

De las 90x105 UFC/g el 100% de las colonias son enterotoxigenicas tomando en cuenta la primera consideracin (prueba de termonucleasa y coagulasa)

Resultado: 90x105 UFC/g de Staphylococcus aureus enterotoxigenica

De acuerdo a los lmites establecidos (106 UFC/g) en la NOM-115-SSA1-1994. Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. Este alimento Arroz con leche es aprobado.

De acuerdo a los lmites establecidos (105 UFC/g) en FDA este alimento Arroz con leche es rechazado por sobrepasar dichos lmites.

Para este caso se tomar en cuenta las especificaciones sealadas en FDA por lo que el alimento es rechazado.

Bibliografa: NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MTODO PARA LA DETERMINACIN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN ALIMENTOS.Catherine M. C. et al. 2008; Micriobiological Analysis of Food Contact Surfaces in Child Care Centers; Appl. Environ. Micriobiol 74(22); 6918-6922