Spectroscopie infrarouge impulsionnelle appliquée au transfert de ligands dans les

hémoprotéines

Thèse Présentée parThomas Polack

préparée auLaboratoire d’Optique et Biosciences

Directrice de thèseAntigoni Alexandrou

• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Différentes approches expérimentales

• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation

• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience

• Conclusions et Perspectives

Plan de la présentation

• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales

• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées

• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation

• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience

• Conclusions et Perspectives

Plan de la présentation

F. Schotte, M. Lim, T. A. Jackson, A. V. Smirnov, J. Soman, J. S. Olson, G. N. Phillips Jr., M. Wulff, P. Anfinrud, Science 300, 1944 (2003).

Transfert de ligands

• Transport, stockage, catalyse enzymatique, détection de ligands

• Liaison du ligand à l’hème→ fonction de la protéine

• Dynamique du transfert du ligandsite de liaison ↔ extérieur

• Sonder le transfert :• rayons X• absorption transitoire visible

→ transitions électroniques de l’hème• absorption transitoire infrarouge

→ vibration du ligand

400 600 800 1000 1200

0

50

100

150

200

500 550 6000

5

10

15

Coef

ficie

nt d

'exct

ictio

n (m

M-1 c

m-1)

longueur d'onde (nm)

Sans CO

Avec CO

Motivations

• Compréhension du processus de transfert entre la poche de l’hème et l’extérieur de la protéine

→ Premières étapes du transfert

• Accès aux caractéristiques vibrationnelles du ligand aux temps courts

• Détection du champ émis : intervention de mouvements concertés dans le processus de transfert

Olson et al.Biochemistry(1994)

Elber et al.Biophys. J.(1998)

CO lié à l’hème

CO au docking-site

TransfertCO

Côté proximal

Côté distal

B1

Myoglobine : de l’hème au docking-site

Dissociation déclenchée par une impulsion pompe visibledans la bande de Soret à 400 nm.

CO lié à l’hème

CO sur le docking-site

Anfinrud et al., Nat. Struct. Biol. (1997)

Anfinrud et al. J. Chem. Phys.(1995)

┴

║

Δα

B1 B2

Caractéristiques infrarouges du transfert

Δα

Ligand CO

• Vibration en dehors du continuum des autres modesvibrationnels de la protéine• Forte absorption

Modification de la vibration

• 1945 → 2130 cm-1 • Diminution force d’oscillateurd’un facteur 30• Changement d’orientation

• Temps de déphasage ~1ps

Effets de polarisation perturbée• T2 ~1ps• Délai pompe-sonde négatif• Polarisation perturbée par la pompe• Oscillations spectrales

• Dynamique aux temps courts

• Transmission différentielleintégrées spectralementintégrées spectralement → signal faible

• Détection du champ émis

M. Joffre et al.Opt. Lett. 1988.

Domaine temporel

Domaine spectral

Polarisation P

Polarisation perturbéepar la pompe

P

• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales

• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées

• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation

• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience

• Conclusions et Perspectives

Plan de la présentation

Montage expérimental

Signal

Idler

RegACoherent

MiraCoherent

200 kHz, 150 fs4 µJ

Regen. Amp.

Oscillator

RegACoherent

MiraCoherent

200 kHz, 150 fs4 µJ

Regen. Amp.

Oscillator

RegACoherent

VitesseCoherent

100 kHz, 150 fs

OPA

1.2-2.4 µm 100 nJ

6 µJ

Amplificateur Régénératif

80 MHz, 100 fs800 nm, 5 nJ

Oscillateur

BBO BBO

Verdi 10 W

Translation-Rotationde l’échantillon

Pompe400 nm200 fs250 nJ

AgGaS2

BBO

Délai pompe-sonde

/2

DétecteurHgCdTe

IR

Interféromètre

Différence de fréquence

3-18 µm, 250 fs, 40 pJ

= 100 cm-1

• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales

• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées

• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation

• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience

• Conclusions et Perspectives

Plan de la présentation

• Intégration spectrale• Faible signal

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4

Délai pompe-sonde (ps)

T/T x 105

Premiers résultats expérimentaux

Nécessité d’améliorer du rapport signal à bruit

Montage expérimental

Signal

Idler

RegACoherent

MiraCoherent

200 kHz, 150 fs4 µJ

Regen. Amp.

Oscillator

RegACoherent

MiraCoherent

200 kHz, 150 fs4 µJ

Regen. Amp.

Oscillator

RegACoherent

VitesseCoherent

100 kHz, 150 fs

OPA

1.2-2.4 µm 100 nJ

6 µJ

Amplificateur Régénératif

80 MHz, 100 fs800 nm, 5 nJ

Oscillateur

BBO BBO

Verdi 10 W

Translation-Rotationde l’échantillon

Pompe400 nm200 fs250 nJ

AgGaS2

BBO

Délai pompe-sonde

/2

DétecteurHgCdTe

IR

Interféromètre

AgGaS2

DétecteurHgCdTe

IR

Détection différentielle infrarouge• Hacheur mécanique haute fréquence• Intensité de référence

Echantillon

Faisceau pompe 50 kHz

Intensité sonde transmise

Intensité de référence

Laser (100 kHz)

Détectionsynchrone

• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales

• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées

• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation

• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience

• Conclusions

Plan de la présentation

nombre d’onde ( cm-1)

1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300

CO sur ledocking site

CO liéà l’hème

12

3

1945 2130 cm-1 Nombre d’onde

Inte

nsité

(uni

tés

arbi

traire

s)Sondes Infrarouges et absorption du ligand

Sonde = 100 cm-1

x 10-4

Délai pompe-sonde (fs)-1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

┴

║

║

Fréquence initiale1945 cm-1

Fréquence finale2120 cm-1

Fréquence intermédiaire

2060 cm-1

-ΔT/T

Aucun signal observé dansdeoxymyoglobine

1945 2130

12

3

Transmission différentielle dans MbCO

Pompe 400 nmSonde IR

Absorption différentielle

Angle MagiquePompe 400 nmSonde IR

Fréquence initiale

Fréquence finale

-4

• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales

• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées

• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation

• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience

• Conclusions

Plan de la présentation

Modèle Phénoménologique :

• Polarisation induitelinéairement par la sonde• Modèle à 2 niveaux équations de Bloch• Variation

• fréquence• force d’oscillateur• temps de déphasage• orientation

Simulations

1900 2000 2100 2200Nombre d’onde (cm-1)

)())'()'(*(')()()( )''('')''('' ttteedtittt tdttdtit

baab

EP

Changement instantané de force d’oscillateur

→ Changement abrupt de la force d’oscillateur n’est pas compatible avec l’expérience

Fréquence initiale

Fréquence finale

-4ExpérienceSimulation

Changement progressif de force d’oscillateur

→ Temps caractéristique de la diminution de la force d’oscillateur : 400 fs

Fréquence initiale

Fréquence finale

-4

ExpérienceSimulation

Changement de fréquence vibrationnelle progressif

→ Moins bon accord avec les expériences

Fréquence initiale

Fréquence finale

-4

ExpérienceSimulation

Effet d’un élargissement spectral

→ Influence faible pour un élargissement inférieur à la largeur du spectre de sonde

Fréquence initiale

Fréquence finale

-4Avec élargissementSans élargissement

0 700 1400

Sonde à la fréquence finale

Sonde à la fréquence initiale

Tran

smis

sion

diff

éren

tielle

-T/

T (a

. u.)

Délai pompe-sonde (fs)

2145 cm-1

1945 cm-1

Expériences intégrées spectralement• Changement de fréquence quasi-instantané• Diminution progressive de la force d’oscillateur• Faible influence de l’élargissement spectral

• Nouvelle observation• Compatible avec les résultats

de Anfinrud et al• Indicateur de la distance Hème-CO• Nécessité de calculs de force d’oscillateur

→ Utilisation de la force d’absorption comme sonde du transfert

• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales

• Expériences pompe-sonde intégrées spectralement

• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation

• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience

• Conclusions

Plan de la présentation

ET = EI + ER t

EIncident

ERayonné

Champ émis ER

Transmission |ET |2

ETransmis

Champ transmis et Champ rayonné

Expériences de détection du champ émis

Eexcitation

EPOMPE

Eréférence

Nécessité d’un contrôle de la phase refexc

• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales

• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées

• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation

• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience

• Conclusions

Plan de la présentation

Montage expérimental

Signal

Idler

RegACoherent

MiraCoherent

200 kHz, 150 fs4 µJ

Regen. Amp.

Oscillator

RegACoherent

MiraCoherent

200 kHz, 150 fs4 µJ

Regen. Amp.

Oscillator

RegACoherent

VitesseCoherent

100 kHz, 150 fs

OPA

1.2-2.4 µm 100 nJ

6 µJ

Amplificateur Régénératif

80 MHz, 100 fs800 nm, 5 nJ

Oscillateur

BBO BBO

Verdi 10 W

Translation-Rotationde l’échantillon

Pompe400 nm200 fs250 nJ

AgGaS2

BBO

Délai pompe-sonde

/2

DétecteurHgCdTe

IR

Interféromètre

Montage expérimental

AgGaS2

DétecteurHgCdTe

échantillon

AgGaS2

• Deux générations IR• Phase relative difficile à stabiliser

Modification de la configuration expérimentale

HeNe

PZT

Microcontrôleur

Montage expérimental

AgGaS2

DétecteurHgCdTe

échantillon

• Impulsion de référence engendrée dans le même cristal• Interferomètre asservi → Impulsions vérouillées en phase• Impulsion de référence engendrée dans le même cristal• Impulsion de référence engendrée dans le même cristal• Interferomètre asservi → Impulsions vérrouillées en phase• Détection synchrone à la somme de fréquence fpompe + fexcitation

Détection synchrone

fpompe

fexcitation

Deux approches possiblesDétection homodyne référencée

Détection homodyne auto-référencée→ facilité de mise en oeuvre

)'(' tdtexcitation

• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales

• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées

• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation

• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience

• Conclusions et Perspectives

Plan de la présentation

-1000 -500 0 500 1000

-60

-30

0

Délai (fs)

GaAs =0 /2

Expérience de détection du champ émis

-1000 -500 0 500 1000

-0.50-0.45-0.40-0.35-0.30-0.25-0.20-0.15-0.10-0.050.000.050.100.150.20

Délai (fs)

Imag -Real -Imag Real

pompe

référenceexcitation

t

pompe

référenceexcitation

t

500 fs

Expériences de détection du champ émis

• Changement avec la phase• Contribution pompe-sondeImpulsion excitatrice

• Transfert de ligands dans les hémoprotéines• Approches expérimentales

• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées

• Résultats expérimentaux• Analyse et Interprétation

• Détection du champ émis • Mise en oeuvre• Expérience

• Conclusions et Perspectives

Plan de la présentation

Conclusions• Expériences pompe-sonde spectralement intégrées

• Mesure l’absorption intégrée et le décalage en fréquence • Expérience adaptée aux grands changements de fréquence > 100 cm-1 (myoglobine)

• Mise en évidence d’une décroissance non-instantanée de la force d’oscillateur, c’est une nouvelle observation• Utilisation de cette force d’oscillateur comme sonde du transfert

• Expériences de détection du champ émis• Démonstration expérimentale• Expérience adaptée aux faibles changements de fréquence et transfert cohérent

• Etude du transfert de ligand dans diverses hémoprotéines à l’aide des méthodes développées• Expérience de détection du champ émis dans la cytochrome c oxydase

Perspectives

Ursula Liebl and Gérard Lipowski and Michel Négrerie and Jean-Christophe Lambry and Jean-Louis Martin and Marten H. Vos, Nature 401 (1999)Fe=cm-1 → Cu=2062 cm-1