ANALISIS SENYAWA BIOAKTIF ANTIMIKROB BERSPEKTRUM LUAS DARI BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Haliclona sp.

HOKIE AGUNG PERMANA

DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

ABSTRAK HOKIE AGUNG PERMANA. ANALISIS SENYAWA BIOAKTIF ANTIMIKROB BERSPEKTRUM LUAS DARI BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Haliclona sp.. Di bawah bimbingan ARIS TRI WAHYUDI dan DUDI TOHIR. Senyawa antimikrob berspektrum luas dari enam isolat yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp. diekstrak menggunakan pelarut etil asetat. Keenam isolat tersebut adalah HAA-02, HAA-07, HAL-08, HAL-10, HAL-20, dan HAL-23. Ekstrak kasar bakteri tersebut kemudian diuji aktivitasnya terhadap beberapa mikrob patogen dan non patogen. Hasilnya sebagian ekstrak kasar isolat bakteri marin tersebut memiliki aktivitas hambatan terhadap S. aureus, EPEC, B. subtilis, E. coli, P. aeruginosa, dan C. albicans. Konsentrasi hambatan minimum (MIC) dari supernatan bakteri marin tersebut berkisar antara 12,5% hingga 100%. Hasil kromatografi lapis tipis dibawah sinar UV 365 nm menunjukkan bahwa masing-masing isolat bakteri marin memiliki fraksi yang aktif menghambat P. aeruginosa melalui uji bioautografi. Dua dari enam isolat membawa gen poliketida synthase (PKS) dan lima dari enam isolat membawa gen nonribosomal peptide syntethase (NRPS). Kata kunci: bakteri yang berasosiasi dengan spons, senyawa bioaktif, aktivitas antimikrob

ABSTRACT HOKIE AGUNG PERMANA. ANALYSIS OF BIOACTIVE COMPOUNDS AS WIDE SPECTRUM ANTIMICCROBIAL FROM SPONGE ASSOCIATED BACTERIA FROM Haliclona sp. . Under direction of ARIS TRI WAHYUDI and DUDI TOHIR. Wide spectrum of antimicrobial compounds from six bacteria associated with the sponge Haliclona sp. were extracted using ethyl acetate solvent. Those isolates were HAA-02, HAA-07, HAL-08, HAL-10, HAL-20, and HAL-23. Bacterial crude extracts were tested their activities against pathogenic and non pathogenic microbes. The results showed that crude extracts of bacterial isolates had inhibitory activity against S. aureus, EPEC, B. subtilis, E. coli, P. aeruginosa, and C. albicans. Minimum inhibitory concentration (MIC) of bacterial supernatant ranged between 12.5% to 100%. Thin layer chromatography after extract under UV 365 nm indicated that each bacterial isolates had an active fraction inhibited P. aeruginosa through bioautography test. Two out of the six isolates carried genes encoding polyketide synthase (PKS) and five out of six isolates encoding nonribosomal peptide syntethase (NRPS). Key words: sponge-associated bacteria, bioactive compound, antimicrobial activity

ANALISIS SENYAWA BIOAKTIF ANTIMIKROB BERSPEKTRUM LUAS DARI BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Haliclona sp.

HOKIE AGUNG PERMANA

Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

Judul Skripsi Nama NIM

: Analisis Senyawa Bioaktif Antimikrob Berspektrum Luas dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Haliclona sp. : Hokie Agung Permana : G34070026

Menyetujui:

Pembimbing I

Pembimbing II

Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. NIP. 19630705 199103 1 005

Drs. Dudi Tohir, M.S. NIP. 19571104 198903 1 001

Mengetahui, Ketua Departemen Biologi

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. NIP. 19641002 198903 1 002

Tanggal Lulus :

PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul Analisis Senyawa Bioaktif Antimikrob Berspektrum Luas dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Haliclona sp. ini dilakukan mulai Januari 2011 sampai dengan Juni 2011 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, M. Si dan Drs. Dudi Tohir, M. S atas bimbingan dan pengarahan yang diberikan. Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada Yonatan Banoet, S.Si., Rika Indri Astuti, M.Si di Laboratorium Mikrobiologi, serta Pak Eman dan Ibu Nunung dari Laboratorium Kimia Analitik atas bantuan dan saran selama penulis melakukan penelitian ini. Terima kasih juga untuk keluarga tercinta yang senantiasa memberi cinta, doa dan dukungan, serta teman-teman tersayang khususnya di Biologi angkatan 44, Wisma Cibanteng City yang selalu memberikan bantuan, doa, semangat dan kasih sayang. Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Bogor, Oktober 2011 Hokie Agung Permana

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor Jawa Barat pada tanggal 12 Agustus 1988 dari pasangan Uun Gunawan dan Saw Jan Nio. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Penulis lulus dari SMP Negeri 9 Jakarta pada tahun 2004, kemudian melanjutkan pendidikan di SMA Negeri 58 Jakarta dan lulus tahun 2007. Setelah itu, penulis lulus seleksi masuk jurusan Biologi di Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB). Penulis mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum pada mata kuliah Ekologi Dasar, Ilmu Lingkungan, dan Biologi Dasar. Selain itu, penulis pernah aktif berorganisasi di Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) pada tahun kepengurusan 2009 dan 2010, LDK-DKM Al-Hurriyyah pada tahun 2008, SERUM-G pada tahun 2008 serta menjadi panitia di berbagai kegiatan antara lain Biologi Interaktif 2009, Revolusi Sains 2009, Festival Ilmuwan Muslim 2008, dan sebagainya. Penulis juga mendapatkan pendanaan dari Dikti pada tahun 2009 untuk Program Kreativitas Mahasiswa (PKM).

DAFTAR ISIHalaman Daftar Tabel ............. Daftar Gambar . PENDAHULUAN .............. Latar Belakang Tujuan .............. Waktu dan Tempat Penelitian . BAHAN DAN METODE........................................................................................................... Bahan dan Alat Metode . Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC) .. Ekstraksi Senyawa Bioaktif Menggunakan Etil Asetat .......... Bioassay Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob Fraksinasi Ekstrak Etil Asetat. Analisis Aktivitas Antimikrob Senyawa Hasil Fraksinasi (Bioautografi).. Isolasi Genom.. Deteksi Gen Penyandi Domain KS (PKS) dan Domain A (NRPS) dengan PCR . HASIL DAN PEMBAHASAN.. Minimum Inhibitory Concentration................ Bioassay Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob Analisis Kandungan Ekstrak Kasar. Aktivitas Antimikrob Senyawa Hasil Fraksinasi Deteksi Gen Penyandi Domain KS (PKS) dan Domain A (NRPS) dengan PCR.. SIMPULAN SARAN ... DAFTAR PUSTAKA iv iv 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 5 7 8 8 8

DAFTAR TABEL Halaman 1. 2. 3. Minimum Inhibitory Concentration dari supernatan bakteri asal spons Haliclona sp. terhadap bakteri dan cendawan patogen................................................................................ Aktivitas antimikrob ekstrak etil asetat dari bakteri asal spons Haliclona sp.terhadap bakteri dan cendawan patogen............................................................................................... Fraksinasi dan uji aktivitas ekstrak etil asetat terhadap P. aeruginosa... 4 5 6

DAFTAR GAMBAR Halaman Aktivitas antimikrob ekstrak etil asetat dari bakteri asal spons Haliclona sp. terhadap P. aeruginosa.................................................................................................................. 5 Kromatogram dan uji bioautografi ................................................................................ 6 Hasil visualisasi PCR gen penyandi PKS dan NRPS .................................................... 7

1. 2. 3.

PENDAHULUANLatar Belakang Spons merupakan nenek moyang metazoa lebih dari 580 juta tahun lalu. Habitatnya terdapat pada lingkungan tropis dan subtropis tetapi juga ditemukan pada tempat yang lebih tinggi dan pada danau air tawar dan aliran sungai. Sampai saat ini telah ditemukan 15.000 spesies spons, namun keragamannya mungkin jauh lebih besar. Spons sebagai organisme filter feeder mampu mengolah ribuan liter air laut per hari. Pada permukaan tubuhnya terdapat lubang kecil sebagai tempat masuknya air, partikel organik dan sirkulasi kanal tubuhnya. Spons menjadi inang dari berbagai jenis komunitas mikroba secara umum yang dapat mencapai 50-60% dari tubuhnya (Wang 2006). Peran dari mikroba tersebut bervariasi, mulai dari sumber makanan hingga melakukan simbiosis mutualisme dengan spons itu sendiri (Kennedy et al. 2009). Spons berperan sebagai substrat bagi mikroba, menyediakan akses ke matahari bagi mikroba yang berfotosintesis, dan sebagai pensuplai nutrisi. Keuntungan bagi spons dari simbiosis ini antara lain meningkatkan kepadatan spons, menghancurkan zat yang tak dapat larut oleh kolagen spons, dan penggunaan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikrob tersebut sebagai mekanisme pertahanan terhadap kompetitor dan predator (Taylor et al. 2007). Para peneliti menemukan bahwa spons menghasilkan metabolit sekunder sebagai mekanisme perlindungan diri. Penelitian lain juga mengungkapkan bahwa metabolit sekunder ini tidak hanya berperan dalam metabolisme organisme tersebut tetapi juga berperan dalam strategi adaptasi organisme terhadap lingkungannya (Thakur & Mller 2004). Pada species Haliclona sp. lebih dari 190 metabolit dengan aktivitas spektrum luas telah diisolasi (Yu et al. 2006). Senyawa tersebut diketahui sebagai antifouling, antimikrob, antifungi, antimalaria, dan sitotoksik (Fiesler et al. 2004). Senyawa yang diisolasi dari Haliclona sp. mencakup steroid, terpenoid, poliasetilen, alkaloid, peptida asam lemak tak jenuh, dan poliketida (Yu et al. 2006). Isolasi dan identifikasi komponen-komponen senyawa organik yang berpotensi sebagai senyawa bioaktif dapat dilakukan dengan beberapa

cara, salah satunya dengan kromatografi lapis tipis (KLT) KLT merupakan teknik pemisahan senyawa berdasarkan distribusi komponen yang berbeda dari suatu campuran antara fase gerak dan fase diam (Khopkar 1990). Hasil pemisahan senyawa tersebut akan menghasilkan fraksi-fraksi yang terpisah sepanjang pelat KLT berdasarkan tingkat kepolarannya. Setiap fraksi menghasilkan nilai Rf yang merupakan langkah awal untuk memperkirakan jenis suatu komponen senyawa organik yang telah terpisah (Smart 2002; Furniss et al. 1984). Untuk melihat ada tidaknya aktivitas fraksi yang dihasilkan dari uji KLT maka dilakukan uji lanjut yaitu uji bioautografi. Analisis fungsional metagenom telah menghasilkan banyak senyawa baru (Gillespie et al. 2002), polyketide synthase baru (PKS) (Courtois et al. 2003; Moffitt and Neilan 2003), dan fungsi baru seperti sistem asosiasi membran proteolitik (Beja et al. 2000). Polyketide synthase (PKS) dan non-ribosomal peptide synthetase (NRPS) merupakan kompleks enzim multifungsional yang berperan dalam sintesis beragam struktur senyawa bioaktif secara luas, kebanyakan merupakan kepentingan medis (Hutchinson 2003). Berbagai senyawa antimikrob telah diisolasi dari bakteri yang berasosiasi dengan spons. Bakteri yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp. dapat menghasilkan senyawa bioaktif yang menghambat Staphylococcus aureus nonpatogen, S. aureus patogen, Bacillus subtilis non-patogen, EPEC, Pseudomonas, Candida tropicalis, dan C. albicans. Berdasarkan analisis kekerabatannya keenam isolat yaitu HAA-02, HAA-07, HAL-08, HAL-20, HAL-10, HAL-23 menunjukkan homologi dengan genus Bacillus. Aktivitas antimikrob ditunjukkan dengan adanya konsentrasi hambat minimum (MIC) yaitu konsentrasi terendah dari senyawa antimikrob yang akan menghambat pertumbuhan mikroorganismee setelah diinkubasi selama satu malam (Andrews 2001). Pada penelitian ini dilakukan uji MIC, ekstraksi senyawa antimikrob dengan menggunakan etil asetat, analisis kandungan dan aktivitas antimikrob fraksi senyawa ekstrak kasar, serta deteksi gen penyandi domain KS pada polyketide synthase (PKS) dan domain A pada nonribosomal peptide synthetase (NRPS).

1

Tujuan Penelitian ini bertujuan menganalisis senyawa bioaktif antimikrob bespektrum luas dari bakteri yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp.

BAHAN DAN METODEWaktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Januari 2011 hingga Juni 2011 di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah isolatisolat terbaik dari bakteri yang berasosiasi dengan spons hasil penelitian terdahulu yaitu HAA-02, HAA-07, HAL-08, HAL-20, HAL-10, HAL-23 koleksi Pauliasi Tokasaya (2010). Mikrob indikator yang digunakan untuk uji antagonis adalah E. coli, B. subtilis, Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) K.1.1, S. aureus, P. aeruginosa, C. albicans dan C. tropicalis. Media yang digunakan yaitu SWC (Sea Water Complex), NB (Nutrient Broth), NA (Nutrient Agar), PDB (Potato Dextrose Broth) dan PDA (Potato Dextrose Agar). Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi adalah etil asetat. Alat-alat laboratorium yang digunakan adalah pelat KLT (TLC Aluminium sheet silica gel 60F254 produksi Merck) vorteks, laminar (Jouan, Perancis), autoklaf, hot plate, mesin PCR, pipet mikro, cawan, tabung, serta peralatan umum yang digunakan di laboratorium. Metode Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Isolat bakteri marin dikulturkan dalam medium SWC lalu diinkubasi selama tiga hari di suhu ruang. Mikrob target diremajakan kembali dalam media NB untuk E. coli, EPEC, S. aureus, B. subtilis, dan P. aeruginosa atau dalam media PDB untuk C. albicans dan C. tropicalis. Mikrob target tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang kemudian diinkubasi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 30 menit. Filtrat dari hasil sentrifugasi dimasukkan ke dalam 5 tabung reaksi dengan konsentrasi yang berbedabeda masing-masing 6.25%, 12.5%, 25%, 50%, dan 100%. Selain kelima konsentrasi

tersebut, dibuat juga kontrol yang tidak diberi filtrat bakteri. Setelah itu, masingmasing tabung diisi dengan 1 ml bakteri target. Biakan uji MIC tersebut lalu diinkubasi selama 24 jam. Kemudian diamati kekeruhan masing-masing biakan di dalam tabung reaksi. MIC ditentukan berdasarkan kekeruhan biakan dibandingkan dengan kontrol. Ekstraksi Senyawa Bioaktif Menggunakan Etil Asetat Isolat bakteri marin dikulturkan ke dalam 500 ml media SWC cair. Kultur diinkubasi pada mesin penggoyang (100 rpm, 30 C) selama tiga hari. Kemudian ke dalam kultur ditambahkan 500 ml etil asetat, diaduk selama 3 jam, dan dievaporasi. Ekstrak yang dihasilkan disimpan pada suhu 5 C untuk pemakaian selanjutnya (Muller et al. 2004). Bioassay Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob Mikrob indikator dikultur selama 24 jam. Sebanyak 1% kultur mikrob indikator dicampurkan ke media NA dan PDA semi padat lalu dituangkan di cawan. Ekstrak kasar senyawa antimikrob yang telah dilarutkan dengan metanol (100 mg/ml) diteteskan ke kertas cakram masing-masing sebanyak 100 l kemudian diletakkan di permukaan media agar semipadat tersebut. Cawan uji diinkubasi selama 24 jam. Hasil uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening. Fraksinasi Ekstrak Etil Asetat Isolasi dan identifikasi senyawa bioaktif sampel dilakukan dengan KLT terhadap senyawa organik dari ekstrak kasar. Fraksinasi dilakukan pada pelat 25 TLC Aluminium sheet silica gel 60F254. Sebanyak 30 l ekstrak senyawa antimikrob diteteskan dengan pipa kapiler pada pelat yang telah diberi tanda sebagai titik awal. Kemudian pelat dimasukkan ke dalam kotak kromatografi yang berisi eluen n-butanol: etil asetat: akuades (2:3:1) dan n-butanol: etil asetat (3:7) dan telah dijenuhkan selama satu jam. Setelah senyawa bergerak sampai garis batas atas, pelat dikeluarkan dan dikeringkan. Komponen senyawa organik yang terpisah akan berbentuk noda-noda di sepanjang pelat, kemudian dilihat dan ditandai di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 254 dan 365 nm (Zheng et al. 2005). Masing-masing komponen

2

antimikrob kemudian diuji aktivitasnya (bioautografi) untuk mengetahui komponen antimikrob yang dapat menghambat bakteri. Analisis Aktivitas Antimikrob Senyawa Hasil Fraksinasi (Bioautografi) Bahan yang digunakan adalah pelat KLT yang mengandung senyawa yang sudah difraksinasi. Pelat tersebut disterilisasi menggunakan sinar UV selama 30 menit, lalu diletakkan di atas agar nutrien pada cawan petri. Kemudian lapisan tersebut dilapisi oleh media agar cair yang mengandung bakteri uji P. aeruginosa dengan metode agar tuang, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Setelah masa inkubasi, zona bening yang terbentuk diamati, untuk melihat komponen senyawa organik yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri (Zheng et al. 2005). Isolasi Genom Isolat bakteri dikulturkan dalam media kaldu SWC selama 24 jam. Sebanyak 1.5 ml kultur disentrifugasi 10000 rpm selama 10 menit. DNA genom bakteri diekstrak dengan mengikuti metode CTAB (Sambrook & Russell 2001). Deteksi Domain KS dari Gen PKS dan Domain A dari Gen NRPS dengan PCR Reaksi PCR untuk mengamplifikasi domain KS dari gen penyandi PKS dan domain A dari gen penyandi NRPS dilakukan dengan mengikuti metode Schirmer et al. (2005). Reaksi PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dengan masing-masing tahap yaitu predenaturasi selama 1 menit dan denaturasi selama 30 detik pada suhu 94 C, annealing 50 C selama 30 detik, polimerisasi 75 C selama 1 menit 10 detik, dan post PCR dilakukan pada suhu 72 C selama 5 menit. Visualisasi amplikon PKS dan NRPS dilakukan melalui elektroforesis. Isolat yang mempunyai gen penyandi domain keto-sintase (KS) dari PKS menunjukkan terbentuknya pita pada ukuran di sekitar 700 pasang basa (base pair), sedangkan pada deteksi gen penyandi domain adenilasi (A) dari NRPS ditunjukkan dengan munculnya pita pada ukuran sekitar 1000 bp.

sampai 100% Isolat HAL-08 memiliki nilai MIC sebesar 12,5% terhadap S. aureus (Tabel 1). Hal ini merupakan indikasi yang bagus terhadap efek senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh isolat tersebut. HAL10 menghambat paling kuat terhadap P. aeruginosa. HAL-20 menghambat paling kuat terhadap B. subtilis. HAL-23 memiliki nilai MIC yang tinggi yaitu 12,5% terhadap E. coli. Selain itu isolat ini juga memiliki aktivitas hambat yang tinggi terhadap S. aureus dan P. aeruginosa. Isolat HAA-02 memiliki aktivitas hambat terhadap S. aureus dan EPEC dengan konsentrasi sebesar 50%. Sedangkan HAA-07 menghambat EPEC dengan konsentrasi 25%. Berdasarkan uji MIC, semua isolat hanya menghambat pertumbuhan bakteri atau bakteriostatik. Semua supernatan dari bakteri marin tidak memiliki aktivitas terhadap C. albicans dan C. tropicalis. Hal ini karena kedua cendawan tersebut merupakan cendawan patogen yang memiliki dinding sel yang tebal sehingga sulit untuk didegradasi. Selain itu terdapat mekanisme pertahanan dari sel cendawan patogen tersebut yang dapat menghambat atau menghilangkan efek senyawa bioaktif dari supernatan bakteri marin, seperti produksi enzim, perubahan permeabilitas dinding sel, dan jalur metabolik yang menjadi target dari senyawa bioaktif tersebut (Lay 1994). Uji MIC bersifat tidak stabil tergantung dari mikrob uji, ukuran inokulum, komposisi kultur media, waktu inkubasi, dan kondisi inkubasi seperti temperatur, pH, dan aerasi (Tokasaya 2010). Bioassay Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob Bagian selanjutnya dari penelitian ini yaitu ekstraksi senyawa bioaktif dari bakteri dengan menggunakan etil asetat. Proses ekstraksi menghasilkan ekstrak kasar senyawa bioaktif sebagai antimikrob. Hasil yang didapat dari uji bioassay menggunakaan difusi paper disc menunjukkan hasil yang positif terhadap mikrob uji (Tabel 2). Aktivitas positif dari senyawa antimikrob tersebut ditunjukkan dengan adanya zona bening di sekitar koloni (Gambar 1). Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan dari Tokasaya (2010) yang telah dilaporkan bahwa ekstrak kasar dari spons Haliclona sp. bersifat antimikrob. Ekstrak kasar bakteri marin hasil ekstraksi dengan etil asetat menunjukkan bahwa

HASIL DAN PEMBAHASANMinimum Inhibitory Concentration Uji MIC menghasilkan kisaran hambatan yang berbeda, yaitu antara 12,5%

3

Tabel 1 Minimum Inhibitory Concentration dari supernatan bakteri asal spons Haliclona sp. terhadap bakteri dan cendawan pathogen serta bakteri non patogen.MIC (%) Test Strain E.coli * B. subtilis * S. aureus P.aeruginosa EPEC C.albicans C. tropicalis HAL-08 100 100 12,5 100 100 Bs/Fs HAL-10 100 100 100 50 100 Bs/Fs HAL-20 100 50 100 100 100 Bs/Fs HAL-23 12,5 100 50 50 100 Bs/Fs HAA-02 100 50 100 100 50 Bs/Fs HAA-07 50 50 100 50 25 Bs/Fs

Keterangan: Bs/Fs= Bakterostatik/ Fungistatik; *= Non patogen semua ekstrak etil asetat positif terhadap semua bakteri uji, hanya isolat HAA-07 yang tidak memiliki aktivitas hambat terhadap EPEC. C. albicans hanya dapat dihambat oleh HAA-02, HAL-20, dan HAL23. Sedangkan semua ekstrak kasar tidak memiliki aktivitas terhadap C. tropicalis. Hasil penapisan yang diperoleh memiliki perbedaan dengan penelitian sebelumnya. Perbedaan yang dihasilkan disebabkan karena pelarut yang digunakan untuk ekstraksi berbeda.Pada penelitian sebelumnya pelarut yang digunakan yaitu nbutanol. Senyawa bioaktif memiliki kelarutan yang berbeda pada setiap pelarut yang berbeda pula. Perbedaan ini disebabkan karena adanya perbedaan tingkat polaritas. Pelarut polar akan menarik senyawa yang polar sedangkan pelarut yang nonpolar akan menarik senyawa yang nonpolar pula. Aktivitas hambatan dari senyawa antimikrob juga dipengaruhi oleh keberadaan dari senyawa pengotor yang terdapat pada ekstrak kasar bakteri marin. Menurut Lay (1994) besarnya zona hambat yang dihasilkan dari senyawa bioaktif dipengaruhi oleh sifat fisik dan kimia dari senyawa tersebut, salah satunya dalah berat molekul. Semakin besar berat molekul senyawa bioaktif maka akan semakin besar zona hambat yang dihasilkan. Selain itu besarnya konsentrasi senyawa bioaktif juga mempengaruhi laju difusi senyawa bioaktif pada media agar. Semakin besar konsentrasi dari senyawa bioaktif maka akan semakin besar laju difusinya pada media agar. Faktor lain yang mempengaruhi penghambatan mikroorganisme antara lain kepadatan populasi mikroorganisme, kepekaan terhadap senyawa antimikrob, kandungan bahan organik, suhu, dan lama waktu mikroorganisme terpapar bahan antimkrob. Analisis Kandungan Ekstrak Etil Asetat Analisis kandungan senyawa ekstrak etil asetat ini dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis. Isolat HAA-02, HAA-07, dan HAL-08 terfraksinasi oleh eluen n-butanol: etil asetat: akuades (2:3:1) sedangkan tiga isolat lainnya terfraksinasi oleh eluen n-butanol: etil asetat (3:7). Pada isolat HAA-02 dan HAA-07 dihasilkan tiga fraksi, sedangkan pada isolat HAL-08 dihasilkan dua fraksi. HAA-02 memiliki nilai Rf 0,38; 0,45, dan 0,58 (Tabel 3). HAA-07 memiliki nilai Rf masingmasing 0,20; 0,31, dan 0,60. Isolat HAL-08 memiliki nilai Rf 0,44 dan 0,45 Isolat HAL23 memiliki Rf 0,40; 0,54, dan 0,65. Untuk isolat HAL-10 dan HAL-20 memiliki dua fraksi dengan nilai Rf berbeda yaitu 0,38 dan 0,50 dan 0,28 dan 0,44. Penggunaan eluen berbeda pada isolat-isolat tersebut. Isolat HAA-02, HAA-07, dan HAL-08 terfraksinasi dengan eluen yang terdiri dari n-butanol:etil asetat: akuades dengan

4

Tabel 2 Aktivitas antimikrob ekstrak etil asetat dari bakteri asal spons Haliclona sp.terhadap bakteri dan cendawan patogen serta bakteri non patogen.Kode Isolat S. aureus HAA-02 HAA-07 HAL-08 HAL-10 HAL-20 HAL-23 +++ + ++ + ++ ++ P.aeruginosa +++ ++ +++ ++ +++ +++ EPEC ++ +++ +++ +++ +++ B. subtilis* +++ ++ +++ ++ ++ ++ E. coli* ++ + ++ ++ ++ ++ C.albicans ++ ++ ++ C. tropicalis Mikrob Uji

Keterangan : + : diameter zona hambat 6-9 mm; ++ : 10-14 mm ; +++ : 15-19 mm;++++ : 20-24 mm; +++++: > 25 mm ; *: non patogen

Gambar 1 Aktivitas antimikrob ekstrak etil asetat dari bakteri asal spons Haliclona sp. terhadap Pseudomonas aeruginosa dengan kode isolat: (a) HAA-02, (b) HAA-07, (c) HAL-08, (d) HAL-10, (e) HAL-20, (f) HAL-23, dan (g) kontrol negatif. perbandingan 2:3:1. Sedangkan pada tiga isolat lainnya tidak terfraksinasi. Hal ini terjadi karena senyawa yang dikandung oleh masing-masing isolat berbeda, sehingga gatif (g) terhadap P. aeruginosa. polaritasnya pun berbeda. Eluen yang terdiri dari n-butanol : etil asetat : air dengan perbandingan 2:3:1 memiliki tingkat kepolaran yang lebih tinggi. Diduga ketiga isolat lainnya memiliki polaritas yang lebih rendah. Oleh karena itu digunakan eluen lain yang memiliki polaritas lebih rendah yang terdiri atas n-butanol: etil asetat dengan perbandingan 3:7. Pada perbandingan eluen ini ketiga isolat lainnya yaitu HAL-10, HAL-20, dan HAL-23 terfraksinasi. Sedangkan ketiga isolat sebelumnya tidak mengalami fraksinasi. Nilai Rf belum dapat dijadikan sebagai identifikasi dengan komponen senyawa, tetapi hanya untuk melihat jumlah komponen yang terkandung dalam ekstrak senyawa dan sebagai dasar purifikasi pada kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Namun Ismet (2007) berhasil menemukan senyawa organik yang mirip dengan norharman (-carboline, 9H-Pyrido [3,4b] indole) yang dihasilkan dari bakteri yang berasosiasi dengan spons Hymeniacidon perleve. Senyawa tersebut memiliki nilai Rf 0,42 yang dihasilkan oleh spons Aaptos aaptos. Senyawa tersebut diperkirakan sama karena menggunakan pelat KLT, sistem pelarut, dan temperatur sistem yang sama. Aktivitas Antimikrob Senyawa Hasil Fraksinasi Fraksi yang diperoleh dari hasil fraksinasi ekstrak senyawa antimikrob selanjutnya diuji aktivitasnya terhadap P. aeruginosa dengan metode bioautografi. Hasil uji inimenunjukkan ketiga fraksi dari HAL-23 memiliki aktivitas hambat terhadap

5

Tabel 3. Fraksinasi dan uji aktivitas ekstrak etil asetat terhadap Pseudomonas aeruginosa Fase gerak Kode isolat HAA-02 n-butanol:etil asetat:air 2:3:1 Fraksi 1 2 3 1 2 3 1 2 1 2 1 2 1 2 3 Rf 0,38 0,45 0,58 0,20 0,31 0,60 0,44 0,55 0,28 0,44 0,38 0,50 0,40 0,54 0,65 aktivitas + + + + + + + + +

HAA-07 HAL-08 HAL-10

n-butanol:etil asetat 3:7

HAL-20 HAL-23

Keterangan: (+) : ada zona bening disekitar pelat KLT

Rf:0,60

Rf:0,31 Rf:0,20

(a) (b) (c) Gambar 2 (a) Kromatogram dari kromatografi lapis tipis ekstrak metanol ; (b) Hasil uji bioautografi HAA-07 yang positif (Rf 0,20); dan (c) hasil uji bioautografi yang negatif (Rf 0,60) P. aeruginosa, yang ditandai dengan adanya zona bening disekitar pelat KLT (Gambar 2). Sedangkan pada isolat HAL-20, HAL-10, HAL-08, dan HAA-07 hanya fraksi satu saja yang memiliki aktivitas hambat. Isolat HAA_02 memiliki dua fraksi aktif yang dapat menghambat bakteri uji yaitu fraksi satu dan dua (Tabel 3). Beberapa fraksi lain tidak memiliki aktivitas hambat karena tidak muncul zuna bening disekitar pelat KLT. Hal ini dikarenakan fraksi-fraksi tersebut merupakan senyawa pengotor ataupun senyawa aktif yang tidak terdeteksi dengan mikrob uji. Selain itu dapat juga fraksi tersebut merupakan senyawa yang aktif namun tidak sensitif terhadap bakteri uji yang digunakan. (Sudirman 2005). Jadi secara tidak langsung melalui metode bioautografi dapat diketahui berapa banyak senyawa bioaktif yang dapat diisolasi dari setiap ekstrak kasar dari bakteri marin seperti spons Hymeniacidon perleve yang menghasilkan norharman (Zheng et al. 2005). Perbedaan munculnya bercak terjadi karena setiap pendeteksi memiliki fungsi yang berbeda. Selain itu disebabkan juga kekuatan dari tiap pelarut dalam mengelusi sampel.

6

Umumnya pelarut yang memiliki sifat semipolar banyak memunculkan bercak dan yang terdapat dalam bakteri marin bersifat semipolar dapat memisahkan dengan baik. Sehingga dapat dikatakan bahwa senyawasenyawa. Selain itu pola pemisahan senyawa yang diperoleh mencirikan perbedaan komposisi senyawa yang terkandung sehingga dapat dijadikan idetifikasi senyawa apa yang terkandung dalam ektrak tersebut. Sistem pengembangan yang digunakan pada KLT ini berdasarkan prinsip like dissolves like, yaitu memisahkan komponen yang bersifat polar menggunakan sistem pelarut yang bersifat polar dan memisahkan komponen yang bersifat non-polar menggunakan sistem pelarut non-polar. Sistem pengembangan ini akan lebih baik bila ruangan pengembangan telah jenuh dengan uap sistem pelarut (Christian 1994). Deteksi Gen Penyandi Domain KS (PKS) dan Domain A (NRPS) dengan PCR Isolat HAA-02, HAL-08, HAL-10, HAL-20, dan HAL-23 memiliki gen penyandi NRPS, sedangkan gen penyandi PKS hanya dimiliki oleh isolat HAL-08 dan HAL-10 (Gambar 3). Deteksi terhadap gen penyandi domain KS pada PKS menghasilkan pita berukuran 700 pasang basa, sedangkan deteksi gen penyandi domain A pada NRPS memiliki ukuran pita sebesar 1000 pasang basa. 2 8 10 20 23 M

diisolasi dari spons Pseudoceratina clavata telah diidentifikasi sebagai sumber antibiotik baru rifamycin, yang diproduksi oleh PKS (Kim et al. 2006). Karakteristik struktural dari senyawa bioaktif dari bakteri marin merupakan dua senyawa kimia penting yaitu poliketida dan siklopeptida yang dihasilkan oleh kompleks multienzim yaitu polyketide synthase (PKS) dan nonribosomal peptide synthase (NRPS) (Zhu et al. 2009). Domain KS bertanggung jawab atas kondensasi unit extender ke rantai poliketida tumbuh selama biosintesis poliketida, dan terlibat dalam produksi berbagai macam struktural metabolit (Moffitt dan Neilan 2003). Analog dengan modul gen PKS, NRPS biasanya berisi adenylation (A) domain, peptidil pembawa protein domain, dan domain kondensasi (Schwarzer dan Marahiel 2001). Nonribosomal peptida disintesis oleh kondensasi monomer asam amino. Poliketida dibuat dari penambahan dua unit karbon ketida secara berulang yang berasal dari monomer asil-koenzim A, kemudian setiap unit disusun menjadi polimer linier berupa poliketida (Tanovic et al. 2008). Hasil deteksi gen PKS menunjukkan bahwa dua isolat bakteri marin positif menyandikan gen domain enzim ketosintase, yaitu HAL-08 dan HAL-10 (Gambar 3). Ketosintase merupakan salah satu jenis enzim yang berperan dalam sintesis .10000 bp

M

8

10

1000 bp 500 bp 1000 bp 500 bp

700 bp

(a)

(b)

Gambar 3. Hasil visualisasi PCR gen (a) isolat HAA-02, HAL-08,HAL-10, HAL-20, dan HAL-23 (berurutan dari kiri ke kanan) mempunyai gen penyandi NRPS; (b) isolat HAL-08 dan HAL-10 mempunyai gen penyandi PKS. Contoh dapat ditemukan dalam spons Discodermia dissoluta dan Theonella swinhoei, yang telah terbukti untuk menghasilkan senyawa antitumor discodermolide (Gunasekera et al. 1990), onnamide dan theopederin (Piel et al. 2004a). Selain itu, bakteri Salinispora poliketida (Schirmer et al. 2005). Selain itu, deteksi gen NRPS juga menunjukkan hasil positif pada lima isolat, yaitu HAA-02, HAL-08, HAL-10, HAL-20, dan HAL-23. Nonribosomal peptide syntethase merupakan sistem biosintesis yang terkandung dalam jumlah yang besar dalam mikroorganisme.

7

Modul inti pada NRPS dalam produksi senyawa bioaktif pada minimal terdapat adenilat (A) untuk seleksi dan aktivasi monomer asam amino, domain kondensasi (C) untuk mengkatalisis bentuk ikatan peptide dan domain peptidil carrier protein (PCP) dengan grup phosphopantetheiner untuk mentransfer monomer situs katalis. SIMPULAN Keenam isolat bakteri marin yaitu HAA_02, HAA-07, HAL-08, HAL-10, HAL-20, dan HAL-23 merupakan bakteri penghasil senyawa antimikrob dengan spektrum yang luas. Hasil penapisan isolat dan ekstrak kasar isolat bakteri marin tersebut menunjukkan aktivitas antimikrob terhadap E. coli, B. subtilis, EPEC, S. aureus, P. aeruginosa, dan C. albicans. Isolat-isolat ini memiliki konsentrasi hambat minimum yang berbeda-beda berkisar antara 12,5% sampai 100% tergantung dari mikrob uji. Hasil fraksinasi sebagian besar memiliki aktivitas hambat terhadap P. aeruginosa dengan nilai Rf yang berbeda-beda. Isolatisolat tersebut juga terdeteksi mempunyai gen penyandi PKS dan NRPS, yaitu HAL-08 dan HAL-10 untuk gen PKS dan HAA-02, HAL-08, HAL-10, HAL-20, dan HAL-23 untuk gen NRPS.

SARANPerlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mengetahui fraksi senyawa antimikrob murni yang dihasilkan oleh bakteri marin melalui kromatografi preparatif.

DAFTAR PUSTAKAAndrews JM. 2001. Determinations of minimum inhibitory concentration. Antimic Chemother. 48: 5-16. Beja O et al. 2000. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol 2:516529. Blunt JW et al. 2008. Marine natural products. Nat Prod Rep 25: 3594. Cane DE, Walsh CT, Khosla C. 1998. Harnessing the biosynthetic code: combinations, permutations, and mutations. Science 282: 6368.

Christian DG. 1994. Analytical Chemistry. Fifth Edition. USA: University of Washington. John Wiley & Sons. Courtois S et al. 2003. Recombinant environmental libraries provide access to microbial diversity for drug discovery from natural products. Appl Environ Microbiol 69: 4955. Crosa JH, Walsh CT. 2002. Genetics and assembly line enzymology of siderophore biosynthesis in bacteria. Microbiol Mol Biol Rev 66: 223249. Fiesler L, Horn M, Wagner W, Hentschel U. 2004. Discovery of the novel candidate phylum Poribacteria in marine sponges. Appl Environ Microbiol 60: 37243732. Furniss BS, AJ Hannaford, V Rogers, PWG Smith, AR Tatchell. 1984. Vogels Textbook of Practical Organik Chemistry: Including Qualitative Organik Chemistry. Fourth edition. England: English Languange Book Society/ Longman. Gillespie DE et al. 2002. Isolation of antibiotics turbomycin A and B from metagenomic library of soil microbial DNA. Appl Environ Microbiol 68: 43014306. Gunasekera SP, Gunasekera M, Longley RE, Schulte GK. 1990. Discodermolidea new bioactive polyhydroxylated lactone from the marine sponge Discodermia dissoluta. J Org Chem 55: 49124915. Hunt B, ACJ Vincent. 2006. Scale and sustainability of marine bioprospecting for pharmaceuticals. Am Biol 35: 57-64. Hutchinson CR. 2003. Polyketide and nonribosomal peptide synthases: falling together by coming apart. Proc Natl Acad Sci USA 100: 30103012. Ismet MS. 2007. Penapisan senyawa bioaktif spons Aaptos aaptos dan petrosia sp. dari lokasi yang berbeda [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor Kennedy J, Beker P, Piper C, Cotter PD, Walsh M et al. 2009. Isolation and analysis of bacteria with antimicrobial activities from the marine spons Haliclona simulans collected from Irish waters. Mar Biotechnol 11: 384396. Khopkar. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Saptoraharjo, penerjemah. Jakarta: UI Press Kim TK, Hewavitharana AK, Shaw PN, Fuerst JA. 2006. Discovery of a new

8

source of rifamycin antibiotics in marine sponge actinobacteria by phylogenetic prediction. Appl Environ Microbiol 72: 21182125. Lay KM. 1994. The biogeography and phylogeny of unicellular cyanobacterial symbionts in sponges from Australia and the Mediterranean. Microb Ecol 48:167177. Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2006. Brock Biology of Microorganism. Ed ke-8. Prentice Hall International, Inc. Moffitt MC, Neilan BA. 2003. Evolutionary affiliations within the superfamily of ketosynthases reflect complex pathway associations. J Mol Evol 56: 446457. Mller WEG et al. 2004. Oxygen-controlled Bacterial Growth in the Sponge Suberites domuncula: toward a Molecular Understanding of the symbiotic relationships between sponge and bacteria. Appl Environ Microbiol 70: 2332-2341. Peng Z, Zheng Y, You Y, Yan X, Shao J. 2009. Molecular phylogeny and modular structure of hybrid NRPS/PKS gene fragment of Pseudoalteromonas sp. NJ6-3-2 isolatd from sponge Hymeniacidon perleve J Ind Microbiol Biotechnol 19: 229237. Piel J, Hofer I, Hui D. 2004. Evidence for a symbiosis island involved in horizontal acquisition of pederin biosynthetic capabilities by the bacterial symbiont of Paederus fuscipes beetles. J Bacteriol 186: 12801286. Sambrook W, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Ed ke3. New York: Gold Spring Harbor Laboratory. Schirmer A et al. 2005. Metagenomic analysis reveal diverse polyketide synthase gene cluster in microorganisms associated with the marine sponge Discodermia dissoluta. Appl Environ Microbiol 71: 4840-4849. Schwarzer D, Marahiel MA. 2001. Multimodular biocatalysts for natural product assembly. Naturwissenschaften 88: 93101. Smart L. 2002. The Molecular World: Separation, Purification and Identification. Cambridge: The Open University. Stahl E. 1985. Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi. Padmawinata K, penerjemah. Bandung:

ITB. Terjemahan dari: Drug Analysis by Chromatography and Microscopy. Staunton JK, Weissman JK. 2001. Polyketide biosynthesis. Nat Prod Rep18: 380-416. Sudirman LI. 2005. Detection of antimicrobial compounds isolatd from several tropical Lentinus by bioautographic method. Hayati 12:6772. Tanovic A, Samel SA, Essen LO, Marahiel MA. 2008. Peptide synthetase crystal structure of the termination module of a nonribosomal. Science 321: 659-663. Taylor MW, Radax R, Steger D, Wagner M. 2007. Spons associated microorganisms: evolution,ecology and biotechnological potential. Microbiol Mol Biol Rev 71: 295347. Thakur NL, Mller WEG. 2004. Biotechnological potential of marine sponges. Curr Sci 11: 86. Tokasaya P. 2010. Sponge-associated bacteria producing antimicrobial compounds and their genetic biodiversity analysis. [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor Wang G. 2006. Diversity and biotechnological potential of the sponsassociated microbial consortia. J Ind Microbiol Biotechnol 33: 545551. Yu S, Deng Z, Proksch P, Lin W. 2006. Oculatol, oculatolide, and Anor sterols from the sponge Haliclona oculata. J Nat Prod 69:13301334. Zhang H, Lee YK, Zhang W, Lee HK. 2006. Culturable actinobacteria from the marine spons Hymeniacidon perleve: isolation and phylogenetic diversity by 16 SrRNA gene-RFLP analysis. Antonie van Leeuwenhoek 90: 159169. Zheng L, H Chen, X Han, X Yan. 2005. Antimicrobial screening and active compound isolation from marine bacterium NJ6-3-1 associated with the sponge Hymeniacidon perleve. World J Microbiol Biotechnol 21: 201-206.

9