FAKULTET KEMIJSKOG INŽENJERSTVA I TEHNOLOGIJE

Andrijana Meščić

SINTEZA NOVIH ACIKLIČKIH PIRIMIDINSKIH NUKLEOZIDNIH ANALOGA S POTENCIJALNOM

PRIMJENOM U POZITRONSKOJ EMISIJSKOJ TOMOGRAFIJI

DOKTORSKI RAD

Zagreb, 2014.

FACULTY OF CHEMICAL ENGINEERING AND TECHNOLOGY

Andrijana Meščić

SYNTHESIS OF NOVEL PYRIMIDINE NUCLEOSIDE ANALOGUES WITH POTENTIAL

APPLICATION IN POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY

DOCTORAL THESIS

Zagreb, 2014.

FAKULTET KEMIJSKOG INŽENJERSTVA I TEHNOLOGIJE

Andrijana Meščić

SINTEZA NOVIH ACIKLIČKIH PIRIMIDINSKIH NUKLEOZIDNIH ANALOGA S POTENCIJALNOM

PRIMJENOM U POZITRONSKOJ EMISIJSKOJ TOMOGRAFIJI

DOKTORSKI RAD

Mentor: Prof. dr. sc. Silvana Raić-Malić

Zagreb, 2014.

FACULTY OF CHEMICAL ENGINEERING AND TECHNOLOGY

Andrijana Meščić

SYNTHESIS OF NOVEL PYRIMIDINE NUCLEOSIDE ANALOGUES WITH POTENTIAL APPLICATION IN

POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY

DOCTORAL THESIS

Supervisor: Prof. dr. sc. Silvana Raić-Malić

Zagreb, 2014.

Bibliografski podaci:

UDK: 547.854:615.84-7(043.3) Znanstveno područje: prirodne znanosti Znanstveno polje: kemija Institucija: Sveučilište u Zagrebu, Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologije,

Zavod za organsku kemiju Voditelj rada: Prof. dr. sc. Silvana Raić-Malić Broj stranica: 176 Broj slika: 45 Broj tablica: 6 Broj shema: 26 Broj literaturnih referencija: 122 Datum obrane: 14. ožujka 2014. Sastav povjerenstva za obranu: Doc. dr. sc. Tatjana Gazivoda Kraljević (FKIT),

Izv. prof. dr. sc. Irena Škorić (FKIT) Prof. dr. sc. Miroslav Bajić (Veterinarski fakultet)

Rad je pohranjen u: Nacionalnoj i sveučilišnoj knjižnici u Zagrebu, Hrvatske bratske zajednice bb; Knjižnici Fakulteta kemijskog inženjerstva i tehnologije u Zagrebu, Marulićev trg 20; Knjižnici Sveučilišta u Rijeci, Dolac 1; Knjižnici Sveučilišta u Splitu, Livanjska 5 i Knjižnici Sveučilišta u Osijeku, Europska avenija 24.

Tema rada prihvaćena je na sjednici Fakultetskog vijeća Fakulteta kemijskog inženjerstva i

tehnologije Sveučilišta u Zagrebu održanoj 11. srpnja 2011. te odobrena na sjednici Senata

Sveučilišta u Zagrebu održanoj 22. studenoga 2011.

ii

Zahvaljujem mentorici prof. dr. sc. Silvani Raić-Malić na predloženoj temi, znanstvenim

raspravama, savjetima i stručnoj pomoći koju mi je pružila tijekom izrade doktorskog rada.

Hvala prof. dr. sc. Simonu Ametameyu što mi je omogućio znanstveni boravak na ETH

Zürich, na njegovoj pomoći, i uključivanju u eksperimentalni rad te hvala Thomasu Betzelu

na upoznavanju s radiokemijom i B-labosom (...for his german supervision and swiss

equipment...)

Zahvaljujem prof. dr. sc. Leonardu Scapozzi što mi je omogućio znanstveni boravak na

Fakultetu znanosti Sveučilišta u Ženevi, na njegovim savjetima i pomoći te Lucile Pernot na

pomoći prilikom izvođenja testa fosforiliranja.

Zahvaljujem prof. dr. sc. Janezu Plavecu na dvodimenzijskim i PP19F spektrima NMR te na

konformacijskoj analizi molekula.

Hvala prof. dr. sc. Mariu Cetini s Tekstilno tehnološkog fakulteta na određivanju kristalnih

struktura.

Zahvaljujem doc. dr. sc. Sandri Kraljević Pavelić i njezinoj istraživačkoj grupi na Odjelu

za biotehnologiju Sveučilišta u Rijeci na ispitivanju antitumorske aktivnosti

priređenih spojeva.

Hvala prof. dr. sc. Davorki Završnik, te Amaru Osmanoviću i Mirsadi Salihović na ugodnoj

suradnji.

Hvala kolegicama dr.sc. Svjetlani Krištafor, doc. dr. sc. Tatjani Gazivoda Kraljević i Silviji

Maračić na pomoći te brojnim savjetima i idejama.

Veliko hvala mojim kolegicama na nesebičnoj pomoći, savjetima i vremenu koje su odvojile

za mene tijekom izrade ovog rada.

Hvala svim članovima Zavoda za organsku kemiju Fakulteta kemijskog inženjerstva i

tehnologije na ugodnoj radnoj atmosferi i dobrom društvu.

Istraživanje u doktorskom radu je provedeno u okviru švicarskog projekta SCOPES 2009-

2012 (SNF) 'Development of novel C-5 fluoroalkyl N-acyclic pyrimidine nucleoside analogs

as PET tracer for in situ monitoring of gene and cell-based therapies using HSV1-TK as a

reporter gene'.

iii

SAŽETAK

Sintetizirani su novi pirimidinski aciklički nukleozidni mimetici kao potencijalni 'lažni'

supstrati enzima timidin-kinaze virusa herpes simpleks tipa 1 (HSV1-TK). Novi spojevi su

pripravljeni s ciljem pronalaska molekule radiotragača za praćenje enzimske aktivnosti

HSV1-TK u tumorskim stanicama primjenom pozitronske emisijske tomografije (PET).

Sintetizirani su C-5 supstituirani 2-hidroksietilni derivati pirimidina koji sadrže lanac poput

poznatih prolijekova aciklovira, ganciklovira, penciklovira i 2,3-dihidroksipropilni lanac u

položaju N-1 pirimidina, te je promatran utjecaj acikličkog glikona na reakciju fosforiliranja

pomoću enzima HSV1-TK. Provedeni su različiti sintetski putevi u višestupnjevitim

sintezama produkata kako bi se dobilo veće sveukupno iskorištenje ciljanih produkata. Tako

su provedene reakcije N-alkiliranja N-anionskog 5-supstituiranog pirimidinskog derivata kao

prekursora i reakcije sililiranja. Alkiliranje 4-metoksipirimidin-2-ona odvijalo se u N-1 i O-2

položaju pirimidinskog prstena, pa su u toj reakciji izolirani N-aciklički i O-aciklički

pirimidinski regioizomeri. Nadalje, pripravljeni su konformacijski ograničeni pirimidinski

derivati u kojima se nezasićeni izobutenilni lanac koji zamjenjuje šećernu komponentu nalazi

na položaju C-6 pirimidina. Fluoralkenilni nukleozidni mimetik može se koristiti kao modelni

spoj za razvoj molekule tragača u metodi PET. Pripravljeni su i 5-alkinilni derivati pirimidina

Sonogashira-inom reakcijom N-acikličkog 5-joduracilnog derivata s odgovarajućim

terminalnim alkinima pomoću paladijevog katalizatora. Nasuprot tome, derivati pirimidina s

heteroarilnim supstituentom u položaju C-5 pirimidina pripravljeni su Stille-ovom reakcijom

povezivanja organokositrovih intermedijara s nezasićenim organskim elektrofilom pomoću

paladija kao katalizatora.

Testovi fosforiliranja su pokazali da se 5-supstituirani N-aciklički pirimidin s

penciklovirnim lancem u položaju N-1 (5-HEU-PCV) djelotvorno i specifično fosforilirao

pomoću enzima HSV1-TK. Pored toga, spoj nije bio toksičan na normalne fibroblaste

čovjeka. Spoj 5-HEU-PCV je, dakle, zadovoljio osnovne preduvjete za njegovu primjenu u

praćenju enzimske aktivnosti i izabran je kao predvodni spoj za razvoj molekule PET-tragača.

Kako bi se provelo radiooznačavanje tog spoja izotopom 18F, pripravljen je njegov prekursor s

odgovarajućim zaštitnim skupinama. Potom je provedeno označavanje tosilnog prekursora

radionuklidom 18F te je markirana molekula praćena in situ kod miševa sa zloćudnim

tumorom. Radiosinteza s visokim radiokemijskim iskorištenjem (45 % ± 4, n = 4) je

provedena u dva stupnja, nukleofilnom supstitucijom prekursora s kompleksom [18F]KF i

kriptofiksaRR2.2.2 te uklanjanjem 4-metoksi i izopropilidenske zaštitne skupine.

iv

Zatim je provedeno praćenje in vivo i biodistribucija označene molekule kandidata, HHB-

5-[18F]FEP, u tumorskim stanicama kod miševa. Rezultati ispitivanja in vivo nove molekule

su uspoređeni s poznatim PET-tragačem, [18F]FHBG. U usporedbi s [18F]FHBG novi je spoj

pokazao manju selektivnost. Nasuprot tome, prednost novog spoja u odnosu na poznati PET-

tragač je njegova niža radioaktivnost u području abdomena. Spoj je također pokazao

stabilnost, odnosno nisku vrijednost defluoriranja in vivo.

Ključne riječi: aciklički nukleozidni analozi; C-5 supstituirani pirimidini; timidin-kinaza

virusa herpes simpleks tipa 1 (HSV1-TK); pozitronska emisijska tomografija (PET); reakcije

unakrsnog povezivanja katalizirane paladijem.

v

SUMMARY

Synthesis of novel acyclic pyrimidine nucleoside analogues with potential application in

positron emission tomography

A series of novel acyclic pyrimidine nucleoside analogues was synthesized as potential

fraudulent substrates of herpes simplex virus type 1 timidine kinase (HSV1-TK). New

compounds were prepared with the aim of finding a radiotracer for monitoring HSV1-TK

enzyme activity in tumor cells using positron emission tomography (PET). C-5 substituted 2-

hydroxyethyl pyrimidine derivatives bearing 2,3-dyhydroxypropyl and acyclovir-,

ganciclovir- and penciclovir-like side chains were prepared and the influence of the acyclic

glycone on their phosphorylation ability with HSV1-TK was observed. In order to obtain

better overall yield of the target compounds, different synthetic routes were used during multi

step syntheses. Therefore, N-alkylation of N-anionic 5-substituted pyrimidine derivatives as

precursors and silylation reaction method were used. Alkylation of 4-methoxypyrimidin-2-

one derivative occurred both at TTN-1 and O-2 position of pyrimidine ring resulting in N-

acyclic and O-acyclic pyrimidine regioisomers. Furthermore, a new series of

conformationally restricted pyrimidine derivatives bearing isobutenyl side chain that mimics

the sugar moiety at C-6 position of pyrimidine has also been prepared. The novel

fluoroalkenyl pyrimidine nucleoside mimetic can be used as a model compound for

development of a PET tracer molecule. Alkynyl pyrimidine derivatives were obtained via

Sonogashira cross-coupling of N-acyclic 5-iodouracil derivative with corresponding terminal

alkynes using palladium as a catalyst. On the contrary to this, heteroaryl pyrimidine

derivatives were prepared by Stille cross-coupling of organostannane intermediates with

unsaturated organic electrophile using palladium catalyst.

The phosphorylation assays showed that the C-5 substituted N-acyclic pyrimidine with a

penciclovir-like side chain at N-1 (5-HEU-PCV) was efficiently and selectively

phosphorylated by HSV1-TK. Besides, this compound was not cytotoxic to normal human

fibroblasts. Therefore, this acyclonucleoside was selected as a leading compound for the

development of a PET radiotracer. In order to perform radiolabelling, a precursor with

corresponding protecting groups was prepared. Radiolabelling of the tosyl precursor with

radionuclide 18F was performed and the resulting compound was used for in situ imaging in

tumor bearing mice.

A high yield radiosynthesis (45 % ± 4, n = 4) was accomplished in two steps by

nucleophilic substitution on a tosylate leaving group of the precursor using [18F]fluoride-

cryptate complex and subsequent removal of the 4-methoxy and isopropylidene protecting

vi

groups. In vivo assay and biodistribution assay of the radiolabelled candidate molecule,

TTHHB-5-[18F]FEP, in tumor bearing mice was also performed.

In vivo results of the new molecule were compared to [18F]FHBG which is considered to

be the gold standard for HSV1-tk gene visualization. In comparison with [18F]FHBG, HHB-5-

[18F]FEP showed to be less selective. On the contrary, a clear advantage of the novel

radiotracer is the lower abdominal radioactivity. The novel compound also showed stability

and low defluorination rate in vivo.

Keywords: acyclic nucleoside analogues; C-5 substituted pyrimidines; herpes simplex

virus type 1 thymidine kinase (HSV1-TK); positron emission tomography (PET); palladium-

catalysed cross-coupling reactions.

vii

SADRŽAJ

1. UVOD .............................................................................................................................. 1

2. OPĆI DIO......................................................................................................................... 5

2.1. Aciklički nukleozidni analozi..................................................................................... 6

2.1.1. Uvod .................................................................................................................. 6

2.1.2. Aciklovir............................................................................................................ 8

2.1.3. Ganciklovir...................................................................................................... 10

2.1.4. Penciklovir ...................................................................................................... 11

2.1.5. (S)-9-(2,3-dihidroksipropil)adenin .................................................................. 11

2.1.6. Sinteza acikličkih nukleozidnih analoga ......................................................... 12

2.2. Pozitronska emisijska tomografija ........................................................................... 14

2.2.1. Uvod ................................................................................................................ 14

2.2.2. Osnovni princip dobivanja PET-slike ............................................................. 16

2.2.3. Izbor radionuklida ........................................................................................... 17

2.2.4. PET-tragači za praćenje stanične proliferacije tumora ................................... 18

2.2.4.1 [18F]FLT ....................................................................................................... 19

2.2.4.2 [18F]FDG ...................................................................................................... 20

2.2.5. Praćenje ekspresije HSV1-tk pomoću metode PET ........................................ 22

2.2.5.1 Radiooznačeni nukleozidni analozi za praćenje ekspresije HSV1-tk .......... 24

2.2.5.2 C-6 supstituirani derivati pirimidina kao potencijalni netoksični

PET-radiotragači za praćenje ekspresije HSV1-tk ....................................... 27

2.3. Suicidalna genska terapija ........................................................................................ 32

2.3.1. Novi pristup selektivnom uništavanju tumorskih stanica ............................... 32

2.3.2. Citozin-deaminaza i 5-fluorcitozin.................................................................. 33

2.3.3. HSV1-TK/prolijek u suicidalnoj genskoj terapiji: put od antivirusnog do

antitumorskog lijeka........................................................................................ 34

2.4. Reakcije unakrsnog povezivanja katalizirane paladijem ......................................... 38

2.4.1. Sonogashira-ina reakcija ................................................................................. 38

2.4.2. Stille-ova reakcija............................................................................................ 39

3. REZULTATI I RASPRAVA ......................................................................................... 43

3.1. Uvod ......................................................................................................................... 44

viii

3.2. C-5 supstituirani hidroksietilni derivati pirimidina s 2,3-dihidroksipropilnim

lancem i lancem poput aciklovirnog, ganciklovirnog i penciklovirnog u

položaju N-1 pirimidina ........................................................................................... 46

3.2.1. Sinteza C-5 supstituiranih N-acikličkih pirimidinskih nukleozidnih

analoga (2338)............................................................................................... 46

3.2.2. Fosforiliranje hidroksietilnih N-acikličkih derivata pirimidina pomoću

enzima HSV1-TK............................................................................................ 55

3.3. Nukleozidni analog s lancem poput ganciklovirnog u položaju N-1 pirimidina

i 2-hidroksietilnim supstituentom u položaju N-3.................................................... 60

3.3.1. Sinteza N-1-[(1,3-dihidroksi-2-propoksi)metil]-N-3-(2-

hidroksietil)pirimidin-2,4-diona (46) .............................................................. 60

3.3.2. Fosforiliranje spoja 46 pomoću enzima HSV1-TK......................................... 61

3.4. Sinteza fluoriranog referentnog spoja HHB-5-FEP (52) i prekursora za

radiooznačavanje 53 ................................................................................................. 62

3.5. Radiokemija ............................................................................................................. 64

3.5.1. Radiosinteza spojeva HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) i [18F]FHBG (56) .............. 64

3.5.2. Ispitivanje in vitro ulaska spoja HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) u

transducirane stanice ....................................................................................... 66

3.5.3. Ispitivanje antitumorskog djelovanja in vitro spojeva 5, 7, 8, 10, 11, 18,

23−38, 49, 50, 52 i 53...................................................................................... 66

3.5.4. Praćenje aktivnosti HSV1-TK pomoću spoja HHB-5-[18F]FEP ([18F]52)

i [18F]FHBG (56) metodom PET..................................................................... 67

3.5.5. Biodistribucija ................................................................................................. 67

3.6. Strukturna analiza N-1 alkiliranih i O-2 alkiliranih regioizomera C-5

hidroksietilnog derivata pirimidina .......................................................................... 70

3.6.1. Analiza spektara 1H i 13C NMR ...................................................................... 70

3.6.2. Kristalna i molekulska struktura 5-(2-acetoksietil)-4-metoksipirimidin-2-

ona (10) ........................................................................................................... 71

3.7. Z- i E-izomeri fluoriranih C-6 izobutenilnih N-metilnih derivata timina i

prekursora za reakciju radiooznačavanja ................................................................. 73

3.7.1. Sinteza C-6 izobutenilnih N-metilnih derivata timina..................................... 73

3.7.2. Spektroskopska analiza1H, 13C i 19F NMR Z-/E-izomera spoja 69 i spoja

70 ..................................................................................................................... 76

ix

3.7.3. Ispitivanje antitumorskog djelovanja in vitro C-6 izobutenilnih derivata

timina............................................................................................................... 78

3.8. N-aciklički 5-supstituirani heteroarilni i alkinilni pirimidinski derivati .................. 79

3.8.1. Sinteza spojeva 7685 reakcijama unakrsnog povezivanja kataliziranih

paladijem ......................................................................................................... 79

3.8.2. Fosforiliranje N-acikličkog 5-(furan-2-il)pirimidinskog derivata 77

pomoću enzima HSV1-TK.............................................................................. 82

3.8.3. Kristalna i molekulska struktura spojeva 77, 80 i 85g .................................... 83

3.8.4. Ispitivanje antitumorskog djelovanja in vitro za spojeve 77, 81, 84ad,

85a i 85b.......................................................................................................... 85

4. EKSPERIMENTALNI DIO........................................................................................... 87

4.1. Opće napomene ........................................................................................................ 88

4.2. Reakcija fosforiliranja .............................................................................................. 89

4.2.1. Analiza HPLC produkata reakcije fosforiliranja............................................. 89

4.3. Pročišćavanje radiooznačenih spojeva HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) i [18F]FHBG

(56) ........................................................................................................................... 90

4.4. Rentgenska strukturna analiza.................................................................................. 90

4.5. Ispitivanje in vitro ulaska radiooznačenog spoja u transducirane stanice................ 91

4.6. Praćenje aktivnosti HSV1-TK in vivo metodom PET.............................................. 92

4.7. Biodistribucija HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) i [18F]FHBG (56) ex vivo ..................... 92

4.8. Antitumorska ispitivanja in vitro.............................................................................. 93

4.9. Pregled sintetiziranih spojeva................................................................................... 94

4.9.1. Pregled sintetiziranih 5-hidroksietilnih N- i O-acikličkih derivata

pirimidina i prekursora za njihovu sintezu...................................................... 94

4.9.2. Pregled sintetiziranih N-3-hidroksietilnih derivata pirimidina s lancem

poput ganciklovirnog u položaju N-1 i prekursora za njihovu sintezu ........... 95

4.9.3. Pregled sintetiziranih C-6 acikličkih derivata timina i prekursora za

njihovu sintezu ................................................................................................ 96

4.9.4. Pregled sintetiziranih N-acikličkih C-5 supstituiranih heteroarilnih i

alkinilnih derivata pirimidina .......................................................................... 97

4.9.5. Pregled zaštitnih skupina s označenom numeracijom atoma .......................... 98

4.10. Postupci za pripravu spojeva.................................................................................... 99

5. ZAKLJUČAK .............................................................................................................. 135

6. LITERATURA............................................................................................................. 139

x

xi

7. PRILOZI.............................................................................................................................

ŽIVOTOPIS ..............................................................................................................................

1. UVOD

UVOD

Pozitronska emisijska tomografija je neinvazivna dijagnostička i znanstvena metoda kojom

je moguće kvantitativno mjeriti različite fiziološke, biokemijske i molekulske procese u živim

tkivima koristeći molekule označene pozitron-emitirajućim radionuklidima. Te molekule su

dio biološkog procesa koji se prati te ih nazivamo molekulama tragačima1,2. Metoda PET se

primjenjuje u onkologiji, kardiologiji i neurologiji te ima važnu ulogu u razvoju lijekova.

Primjena metode PET u današnjoj onkologiji je ključna za dijagnozu i terapiju tumora.

Najčešće korišteni PET-radiotragač je analog glukoze, TT2'-deoksi-2'-[18F]fluor-D-glukoza

([18F]FDG), koji se klinički primjenjuje za detekciju tumora u ranoj fazi jer se akumulira i

radioaktivno raspada u stanicama koje su veliki potrošači glukoze kao što su stanice raka. No,

u kliničkoj primjeni [18F]FDG uočeni su i nedostatci, prije svega njezino nespecifično

nakupljanje u nemalignim stanicama, poput inflamatornih stanica, pa to može navesti na

pogrešno tumačenje rasta tumora. U odnosu na [18F]FDG, primjena nukleozida obilježenih

radioizotopima povoljnija je i specifičnija metoda za praćenje proliferacije tumorskih stanica.

Rak je jedan od najvećih zdravstvenih problema današnjice. Značajan napredak u razvoju

novih lijekova i terapija postignut je posljednjih 60 godina, a zahvaljujući otkriću lijekova kao

što su cisplatin, taksani i derivati dušikova iperita, uspješno se liječe neki oblici bolesti, iako

pacijenti moraju trpjeti neželjene nuspojave. Naime, tek su posljednjih godina postignuti

uspjesi u razvoju „ciljanih“ lijekova i terapija koje pokazuju manja popratna djelovanja.

Primjerice otkriće imatiniba (glivek) koji se primjenjuje u liječenju kronične mijeloične

leukemije (CML) navijestilo je početak novog razdoblja razvoja necitotoksičnih agensa koji

djeluju specifično (ciljano) na određene biološke mete.3 Usprkos tim postignućima, liječenje

mnogih vrsta tumora ostaje problematično, a stopa smrtnosti razočaravajuće visoka.4

Problemi kod liječenja tumora uspoređuju se s problemima pri odstranjivanju korova. Stanice

raka se mogu odstraniti kirurški, toksičnim kemikalijama ili radijacijom, ali teško je odstraniti

baš svaku stanicu. Kirurški se ne mogu ukloniti sve stanice raka, a lijekovi koji ubijaju stanice

raka štetni su i za normalne stanice. Ako i samo nekoliko stanica raka zaostane, one mogu

proliferirati, uzrokovati povratak bolesti, a za razliku od normalnih stanica, često postaju

otporne na citotoksične lijekove kojima se tretiraju.

Bitno je naglasiti da je liječenje tumora, bilo kirurški ili radiološkim tretmanom, obično

jedino moguće ako tumor nije metastazirao. Kako obično 55 % malignih tumora metastazira

prije nego se dijagnosticiraju, važna je rana dijagnoza tumora.

Jedan od novijih intenzivno istraživanih pristupa u liječenju raka je genska terapija tumorskih

stanica sa suicidalnim genom. Značajna je uloga metode PET za praćenje ekspresije gena za

timidin-kinazu virusa herpes simpleks tipa 1 (HSV1-tk) koji je najviše proučavani suicidalni

2

UVOD

gen u genskoj terapiji raka. Pristup se zasniva na unošenju gena HSV1-tk u tumorske stanice

pomoću odgovarajućeg nosača. Stanica u kojoj je izražen gen HSV1-tk proizvest će enzim

HSV1-TK. Tumorsko tkivo koje ima aktivnost enzima HSV1-TK tretira se s izabranim

prolijekom, netoksičnim antivirusnim spojem, kojeg virusna HSV1-TK prevodi u toksični

metabolit koji uzrokuje smrt stanice. Najčešće se rabi kombinacija enzima HSV1-TK i

prolijeka ganciklovira.5

Praćenje ekspresije HSV1-tk metodom PET je moguća preko interakcije produkta

spomenutog gena, enzima HSV1-TK, s odgovarajućom radiooznačenom molekulom tragačem

koja je supstrat spomenutog enzima.6,7

Kada se supstrati HSV1-TK označe pozitron-emitirajućim radioizotopom, najčešće 18F,

njihovi negativno nabijeni fosforilirani metaboliti ostaju zarobljeni u tumorskoj stanici jer ne

mogu prijeći kroz negativno nabijenu staničnu membranu, pri čemu emitiraju gama-zrake

koje se mogu detektirati PET-detektorom. Tako je moguće kvantitativno pratiti prostornu

raspodjelu molekule PET-tragača.

Sintetizirani su brojni radiooznačeni supstrati enzima HSV1-TK, kao molekule tragači s

potencijalnom primjenom u praćenju aktivnosti tog enzima primjenom metode PET, koji se

mogu svrstati u dvije osnovne skupine: analozi timidina koji je prirodni supstrat timidin-

kinaze, označeni radionuklidom 124I ili 18F i aciklički purinski nukleozidni analozi poput

ganciklovira ili penciklovira označeni izotopom 18F u pobočnom lancu ili na položaju C-8

purinske jezgre.8,9

Obećavajući kandidati za razvoj netoksičnih molekula tragača za praćenje ekspresije

HSV1-tk su derivati pirimidina u kojima se lanac koji zamjenjuje šećernu komponentu nalazi

na položaju C-6 pirimidina.10 Za vizualizaciju ekspresije HSV1-tk koriste se pirimidinski i

purinski analozi nukleozida, a za vizualizaciju stanične proliferacije najviše se koriste

pirimidinski derivati timidina. Pirimidinski nukleozidni analozi općenito su pokazali znatno

manju citotoksičnost u odnosu na purinske nukleozidne analoge.

Purinski analog [18F]FHBG se smatra zlatnim standardom u kliničkim ispitivanjima za

vizualizaciju HSV1-tk metodom PET. Negativna strana njegove uporabe je nakupljanje u

području abdomena jer se izlučuje putem jetre i žuči, a u usporedbi s pirimidinskim

derivatima manje je osjetljiv na HSV1-TK. Potreba za novim molekulama tragačima koji

nemaju nedostatke postojećih PET-tragača, kao što su nepovoljna farmakokinetika i

citotoksična nuzdjelovanja, rezultirala je pripravom novih supstrata enzima HSV1-TK.

Istraživanja su pokazala kako prisutnost atoma fluora u organskoj molekuli povećava

elektrostatske interakcije i može pridonijeti boljem vezanju fluoriranih molekula na aktivno

3

UVOD

4

mjesto enzima.11 Tako od ukupnog broja lijekova odobrenih za kliničku primjenu, 20–25 %

lijekova sadrži barem jedan atom fluora u svojoj strukturi. S obzirom da je atom fluora malen,

uvođenje fluora u molekulu ima zanemarive steričke utjecaje. Međutim, fluor utječe na

fizikalno-kemijska i konformacijska svojstva molekula. S obzirom da je fluor

najelektronegativniji element, njegovo uključivanje u strukturu molekule utječe na kiselost,

odnosno bazičnost susjednih funkcionalnih skupina, što ima za posljedicu odgovarajuću

bioraspoloživost molekule. Fluor, pored toga, utječe i na lipofilnost molekule.

Monofluoriranje ili trifluormetiliranje zasićenih alkilnih skupina smanjuje lipofilnost zbog

snažnog elektron-odvlačećeg utjecaja fluora, dok fluoriranje aromata, polifluoriranje, te

fluoriranje atoma u čijem susjedstvu se nalaze atomi s π vezom povećava lipofilnost

molekule. Dobro preklapanje 2s ili 2p orbitala fluora s odgovarajućim orbitalama ugljika čini

vezu C-F slabo polariziranom, a to pridonosi povećanoj lipofilnosti molekule. Uvođenje

fluora u molekulu također povećava otpornost molekule prema metaboličkoj razgradnji.

2. OPĆI DIO

OPĆI DIO

2.1. Aciklički nukleozidni analozi

2.1.1. Uvod

Aciklički nukleozidni analozi su sintetski analozi prirodnih nukleozida u kojima je šećerni

prsten zamijenjen acikličkim dijelom, lancem koji oponaša dio ili cijeli prsten. Imaju važnu

ulogu u modernoj medicini prvenstveno kao snažni antivirusni lijekovi.12 Neki od

najpoznatijih acikličkih nukleozidnih analoga za liječenje infekcija uzrokovanih herpes

virusima su (S)-9-(2,3-dihidroksipropil)adenin ((S)-DHPA), te N-9-aciklički derivati gvanina:

aciklovir (9-(2-hidroksietoksimetil)gvanin, ACV), ganciklovir (9-(1,3-dihidroksi-2-

propoksimetil)gvanin, GCV) i penciklovir (9-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]gvanin, PCV)

(TTslika 1). Navedeni su nukleozidni analozi prolijekovi jer se njihovo antivirusno djelovanje

zasniva na konverziji in vivo u aktivni trifosfatni oblik, lijek. Trifosfatni aciklički nukleotidi

se ne mogu primijeniti jer u takvom obliku ne mogu proći kroz staničnu membranu.

Mehanizam djelovanja acikličkih nukleozidnih analoga sastoji se u inhibiciji virusne DNA-

polimeraze, što uzrokuje prekid replikacije DNA-lanca tj. daljnje umnažanje virusa i njegovo

inficiranje zdravih stanica.13 Virusna DNA-polimeraza je enzim koji ima važnu ulogu u

replikaciji virusa i izgradnji lanca DNA od odgovarajućih nukleotida. Da bi inhibirali

spomenuti enzim, većina acikličkih nukleozidnih analoga zahtijeva konverziju in vivo u

trifosfat. Konverziju acikličkih nukleozidnih analoga u monofosfat kataliziraju virusne

kinaze. Kinaze su enzimi koji kataliziraju prijenos γ-fosfatne skupine s adenozin-trifosfata

(ATP) na 5'-OH skupinu nukleozida, - ili β-fosfatnu skupinu nukleotida. Postoje dvije

poznate timidin-kinaze u sisavaca, mitohondrijska i citoplazmatska.

Stanica zaražena s herpes virusom proizvodi virusnu timidin-kinazu koja nije toliko

strukturno selektivna kao timidin-kinaza iz čovjeka (hTK). To znači da virusna timidin-kinaza

može, osim prirodnog supstrata timidina, fosforilirati i mnoge pirimidinske i purinske

nukleozidne analoge. Fleksibilnost lanca acikličkih nukleozidnih analoga omogućava im da

zauzmu konformaciju pogodnu za interakciju s enzimom, kao supstrati ili inhibitori.14 Kao

'lažni' supstrati, aciklički nukleozidni analozi kompetitivno inhibiraju fosforiliranje timidina i

smanjuju količinu timidinskog nukleotida u zaraženoj stanici.15 Daljnje fosforiliranje u di- i

trifosfat kataliziraju stanične kinaze čovjeka. U trifosfatnom obliku aciklički nukleozidni

analozi inhibiraju DNA-polimerazu, natječu se s prirodnim supstratima za ugradnju u rastući

lanac DNA i ugrađuju se u lanac DNA, pri čemu dolazi do terminacije lanca ili usporavanja

produljenja lanca virusne DNA. Kako acikličke nukleozidne analoge može fosforilirati u

6

OPĆI DIO

monofosfatni derivat samo virusna timidin-kinaza, oni će antivirusno djelovanje pokazati

samo u stanicama zaraženim virusom, i to je razlog njihovog selektivnog djelovanja.

HN

N

N

O

H2N N O

OH

OH

2'-deoksigvanozin(dG)

N

HN N

N

O

H2N O OH

OH

1'2' 3'

4' 5'

N

HN N

N

O

H2N O OH

OH

N

HN N

N

O

H2N OH

OH

aciklovir; ACV ganciklovir; GCV penciklovir; PCV

N

N N

N

NH2

O

OH

OH

OH

N

N N

N

NH2

O OH

OHHO

adenozin (S)-DHPA

Slika 1. Strukture izabranih acikličkih nukleozidnih analoga. Radi usporedbe s prirodnim

nukleozidima 2'-deoksigvanozinom i adenozinom isprekidanim linijama je označen dio šećera

koji nije dio strukture acikličkih nukleozidnih analoga.16

7

OPĆI DIO

2.1.2. Aciklovir

Interes za sintezu acikličkih nukleozidnih analoga započeo je 70-tih godina prošlog

stoljeća kada je prvi put objavljeno antiherpesno djelovanje aciklovira, koji je poslužio

znanstvenicima kao modelni spoj za razvoj strukturno sličnih spojeva. U usporedbi s

prirodnim purinskim nukleozidom, 2'-deoksigvanozinom, kod aciklovira je ciklička 2'-

deoksiriboza zamijenjena 2-hidroksietoksimetilnim lancem (slika 1 i 2).

GOHO

HO

GOHO

HO

G = gvanin

aciklovir; ACV 2'-deoksigvanozin

Slika 2. Usporedba strukture ACV i 2'-deoksigvanozina.16

Djelovanje aciklovira na herpes viruse je selektivno, a istovremeno je slabo toksičan za

nezaražene stanice, stoga se otkriće aciklovira smatra početkom novog doba selektivnog

pristupa antivirusnoj terapiji.17,18 Smatra se zlatnim standardom za liječenje infekcija

uzrokovanih herpes simpleks virusima tipa 1 i 2 (HSV1, HSV2), varicella zoster virusom

(VZV) i citomegalovirusom (CMV).

Antiherpesno djelovanje aciklovira proizlazi iz toga da virusni enzim timidin-kinaza (TK)

fosforilira aciklovir do monofosfatnog derivata ACV-MP. Stanični enzim TK dalje fosforilira

ACV-MP u di- (ACV-DP) i na kraju u trifosfatni derivat (ACV-TP). Trifosfatni derivat se,

kao zamjenski supstrat, ugrađuje u rastući lanac virusne DNA, inhibira DNA-polimerazu

herpes virusa i uzrokuje terminaciju DNA-lanca (slika 3).19 Naime, iako je aciklovir

strukturno sličan prirodnom nukleozidu, nema 3'-OH skupinu pa se nakon njegove ugradnje u

rastući lanac DNA daljnji nukleotidi ne mogu dodavati u lanac DNA čime je njegova

replikacija završena. Kako ACV-TP pokazuje znatno veću inhibiciju virusne DNA-

polimeraze u odnosu na staničnu α-DNA-polimerazu, aciklovir ima selektivno djelovanje.

8

OPĆI DIO

HN

N N

N

O

H2N OHO

HSV1-TK

HN

N N

N

O

H2N OHO

O

kompetitivnainhibicija virusne DNA polimeraze

ugradnja u DNA

HN

N N

N

O

H2N

OP

OH

-OO

OP

OH

OOP

OH

-OO

O

HN

N N

N

O

H2N

OP

OH

O

OP

OH

OOP

OH

-OO

O

HN

N N

N

O

H2N

OP

OH

O

ACV

ACV-MP

ACV-TP

ATP

ADP

stanica u kojoj nema

virusne TK

Slika 3. Prikaz mehanizma djelovanja aciklovira kao inhibitora DNA-polimeraze.13

Nedostatak aciklovira je njegova slaba oralna bioraspoloživost, kratko zadržavanje u

citoplazmi i slaba topljivost u vodi. S ciljem dobivanja spojeva s boljim svojstvima,

sintetizirano je nekoliko esterskih derivata aciklovira: L-valilni ester aciklovira (valaciklovir),

glicil–aciklovir i alanil–aciklovir (slika 4). Valaciklovir se u oralnoj terapiji primjenjuje kao

prolijek aciklovira. Hidrolizom in vivo prevodi se u aciklovir.20

HN

N N

N

O

H2NO

ONH2

O

alanil-ACV NH3

HN

N N

N

O

H2NO

ONH2

O

valaciklovir

HN

N N

N

O

H2NO

ONH2

O

glicil-ACV

Slika 4. Strukture esterskih derivata aciklovira i aminokiselina.

9

OPĆI DIO

2.1.3. Ganciklovir

Ganciklovir (GCV) se strukturno razlikuje od aciklovira jer u lancu koji imitira šećer ima

OH skupinu ekvivalentnu 3'-OH skupini u prirodnom 2'-deoksigvanozinu (slika 1).21

TTPrvenstveno se koristi u liječenju bolesti uzrokovanih citomegalovirusom (CMV) u osoba

s oslabljenim imunološkim sustavom. Kako je oralna bioraspoloživost GCV slaba,

primjenjuje se valilni ester GCV, valganciklovir (slika 5).20

HN

N N

N

O

H2N

ONH2

O

valganciklovir

OH

Slika 5. Struktura valilnog estera ganciklovira.

Mehanizam selektivnog djelovanja ganciklovira u stanicama zaraženim virusom CMV i

HSV sličan je mehanizmu djelovanja aciklovira i temelji se na procesu fosforiliranja koji se

provodi u tri stupnja djelovanjem odgovarajućih enzima. Prvi stupanj fosforiliranja katalizira

virusna timidin-kinaza. Prevođenje u di- i trifosfatne derivate (GCV-DP i GCV-TP) katalizira

stanična gvanilat-kinaza, a potom nekoliko staničnih kinaza, među kojima je i fosfoglicerat-

kinaza. S obzirom da je GCV-TP analog prirodnog purinskog nukleotida 2'-deoksigvanozin-

trifosfata (dG-TP), GCV-TP postaje supstrat DNA-polimeraze koju kompetitivno inhibira u

odnosu na prirodni supstrat. GCV-TP se umeće u rastući lanac DNA. Iako GCV ima

hidroksilne skupine analogne 3'- i 5'-hidroksilnim skupinama koje se nalaze u prirodnom

nukleozidu i koje omogućuju produljenje lanca DNA, nedostatak potpunog šećernog prstena

čini GCV-TP lošim supstratom za produljenje lanca DNA.21,22

10

OPĆI DIO

2.1.4. Penciklovir

Penciklovir (PCV) je strukturno srodan gancikloviru, međutim u lancu koji imitira šećer

umjesto atoma kisika nalazi se metilenska skupina (slika 1).23 Pokazao je aktivnost na viruse

HSV1, HSV2, VZV i Epstein Barr virus (EBV).

Konverzijom odgovarajućim kinazama nastaje penciklovir-trifosfat (PCV-TP) koji

kompetitivno inhibira DNA-polimerazu u odnosu na prirodni supstrat dG-TP. Ugrađuje se u

lanac DNA, ali zbog nedostatka cikličkog šećera smanjuje brzinu sinteze DNA. Iako je

konverzija PCV učinkovitija od konverzije ACV u odgovarajući monofosfatni derivat

pomoću virusne TK, ACV-TP je, kao inhibitor HSV DNA-polimeraze, aktivniji od PCV-TP.

S obzirom da PCV pokazuje slabiju oralnu bioraspoloživost od ACV, sintetiziran je oralni

prolijek penciklovira 9-[4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butil]-6-deoksigvanin, famciklovir, koji

konverzijom in vivo pomoću enzima koji kataliziraju deacetiliranje i oksidaciju purinskog

nukleozida daje PCV (slika 6).

N

N N

NH2N

OAc

famciklovir

OAc

Slika 6. Struktura prolijeka penciklovira, famciklovira.

2.1.5. (S)-9-(2,3-dihidroksipropil)adenin

(S)-9-(2,3-dihidroksipropil)adenin ((S)-DHPA) je antivirusni lijek širokog spektra

djelovanja koji pokazuje podjednako djelovanje protiv DNA- i RNA-virusa. Spoj su prvi

sintetizirali E. de Clercq i A. Holy sredinom sedamdesetih godina prošlog stoljeća.24 Struktura

DHPA je temeljena na adeninu na koji je u N-9 položaju vezan aciklički dihidroksipropilni

lanac (slika 1). Pokazao se djelotvornim protiv infekcija uzrokovanih virusima HSV. Svrstava

se u skupinu inhibitora S-adenozilhomocistein-hidrolaze (SAH).25 Mehanizam djelovanja

DHPA sličan je djelovanju ostalih acikličkih i karbocikličkih analoga adenina, a zasniva se na

inhibiciji enzima SAH-hidrolaze, pri čemu je onemogućeno cijepanje molekule SAH u dvije

komponente, homocistein i adenozin. Posljedica toga je nakupljanje molekule SAH u stanici.

11

OPĆI DIO

S obzirom da je SAH i produkt reakcije metiliranja virusne mRNA primjenom S-

adenozilmetionina (SAM), kao donor metilne skupine, dolazi do inhibicije te reakcije i na taj

način do prekidanja replikacije virusa jer je reakcija metiliranja bitna za stabilnost i

funkcioniranje mRNA virusa (slika 7).

Slika 7. Prikaz mehanizma djelovanja inhibitora SAH-hidrolaze.25

Timidin-kinaza virusa herpes simpleks (HSV1-TK) posljednjih se godina pokazala

značajnom kao suicidalan gen u genskoj terapiji malignih tumora, a kako fosforilirani

metaboliti antivirusnih spojeva ostaju zarobljeni u stanici jer su negativno nabijeni kao i

stanična membrana, radiooznačavanje takvih antivirusnih spojeva s pozitron-emitirajućim

izotopom može se iskoristiti za praćenje aktivnosti virusne timidin-kinaze primjenom metode

PET.

2.1.6. Sinteza acikličkih nukleozidnih analoga

Sinteza acikličkih nukleozidnih analoga uglavnom se sastoji od sinteze odgovarajućeg

lanca te potom povezivanja tog lanca s odgovarajuće supstituiranom purinskom ili

pirimidinskom bazom. Zbog prisutnosti više dušikovih atoma u nukleozidnoj bazi obično

nastaje smjesa regioizomera što stvara probleme prilikom pročišćavanja. Aciklonukleozidi se

mogu sintetizirati reakcijom nukleozidne baze s -klormetilnim eterima u prisutnosti jake

baze26 ili reakcijom sililiranih nukleozidnih baza s aktiviranim aglikonom i uz Lewisovu

kiselinu kao katalizator (Vorbrüggen-ova sinteza).27,28 Ostali pristupi uključuju

transglikoziliranje katalizirano kiselinom,29,30 te oksidaciju pentoze nukleozida.31

Pirimidinske baze se mogu pripraviti Shaw-ovom sintezom, dok se purinske baze obično

12

OPĆI DIO

sintetiziraju Traube-ovom sintezom koja uključuje povezivanje amino supstituiranih

pirimidina, a potom ciklizaciju s mravljom kiselinom.32

Jedan od načina sinteze spoja GCV je alkiliranje trimetilsililirane gvaninske baze (2), te

acikličkog klormetilnog etera (4) koji je pripremljen klormetiliranjem 1,3-dibenziloksipropan-

2-ola (3) (shema 1) uz tetrabutilamonijev fluorid kao katalizator.33 Nastaje smjesa N-7 (5) i N-

9 (6) izomera u omjeru 2 : 1, koji se mogu uspješno odvojiti prekristalizacijom u etanolu.

Nakon uklanjanja zaštitnih skupina u N-9 alkiliranom izomeru izolira se GCV (7).

HN

N NH

N

O

H2N

A) B)

NH(SiMe3)2

HN

N N

N

O

H2NO

PhH2CO

PhH2CO

N

N N

N

OSiMe3

Me3SiNSiMe3

PhH2CO

PhH2COOH

PhH2CO

PhH2COOCH2Cl

HN

N N

N

O

H2N

O

OCH2PhOCH2Ph

HN

N N

N

O

H2NO

HO

HO

(CH2O)nHCl (g)

Bu4NF

Pd

C)

7, GCV

1

2

3

4

5 6

EtOH

Shema 1. Sinteza GCV. A) modifikacija purinske baze; B) sinteza odgovarajućeg lanca; C)

reakcija alkiliranja i uklanjanje zaštitne skupine.

13

OPĆI DIO

2.2. Pozitronska emisijska tomografija

2.2.1. Uvod

PET je neinvazivna metoda molekulske vizualizacije kojom je moguće kvantitativno

promatrati biološke procese u živim organizmima koristeći molekule označene pozitron-

emitirajućim radionuklidima, molekule tragače, koje su dio biološkog procesa koji se prati.1,2

Jedna je od najnaprednijih metoda za praćenje molekulskih interakcija in vivo, distribucije,

farmakokinetike i farmakodinamike molekula. Metoda PET koristi radiofarmaceutike u vrlo

malim količinama (mikrogrami i pikogrami) pri čemu oni imaju zanemarive farmakološke

utjecaje i toksičnost.

U posljednja tri desetljeća raste interes za primjenu metode PET u medicinske svrhe, kao i

u znanstvenim i kliničkim ispitivanjima različitih oboljenja. Tako se danas ova metoda

uspješno primjenjuje u onkologiji, kardiologiji34,35 i neurologiji36 te ima važnu ulogu u

razvoju lijekova i procjeni njihovog djelotvornog djelovanja. Bitne informacije o

farmakokinetici i metabolizmu lijeka mogu se dobiti radiooznačavanjem kandidata lijeka.37

Pirimidinski analog 5-fluoruracil (5-FU) najčešće je korišteni lijek za liječenje raka dojke,

raka gastrointestinalnog trakta i raka jetre.38 5-FU inhibira enzim timidilat-sintazu koji

sudjeluje u sintezi DNA. Primjenom dinamičkog PET-a objašnjena je farmakokinetika i

metabolizam tog lijeka u zdravom i malignom tkivu.39 Metoda PET ne razmatra samo jednu

izdvojenu funkciju ili metabolizam već dobivena slika ovisi o radiotragaču i njegovom

metabolizmu. Mnoge biološki važne molekule mogu se izabrati za radiooznačavanje.

Najčešće korišteni PET-radiotragač je [18F]FDG koji se koristi u onkologiji za promatranje

metabolizma glukoze jer je on uglavnom povećan u neoplastičnom tkivu u odnosu na

normalno tkivo. Osim metabolizma glukoze, u tumorskom su tkivu promijenjeni i mnogi

drugi metabolički putevi što se može pratiti uz odgovarajuće PET-tragače (tablica 1).

14

OPĆI DIO

Tablica 1. Metabolizam i funkcije koje su promijenjene u neoplastičnom tkivu i PET-tragači

koji se koriste za njihovo praćenje.

funkcija/metabolizam PET-tragač

metabolizam glukoze [18F]fluordeoksiglukoza (FDG)

replikacija DNA/stanična proliferacija [11C]timidin

[18F]fluortimidin (FLT)

sinteza proteina, transport aminokiselina [11C]metionin (MET)

[18F]fluoretiltirozin (FET)

[18F]fluormetiltirozin (FMT)

[18F]fluordihidroksifenilalanin (F-DOPA)

sinteza membranskih lipida [18F]fluoracetat

[11C]kolin

[18F]fluorkolin (FCH)

hipoksija [18F]fluormisonidazol (FMISO)

apoptoza [18F]fluoraneksin V

angiogeneza [18F]fluorgalakto-RDG

reporterski geni pirimidinski i purinski derivati označeni

izotopima 18F ili 124I (FIAU, FEAU, FHBG)

kontrola terapije tumora [18F]fluoruracil (FU)

vezanje za estrogenski receptor [18F]fluorestradiol (FES)

vezanje za somatostatinski receptor [68Ga]galij-DOTATOC/DOTANOC

Za razliku od metoda MRI (Magnetic Resonance Imaging), CT (Computed Tomography)

ili rentgenskog snimanja koji daju slike anatomije (veličine i položaja) pojedinih organa, PET

prati biokemijske promjene u tkivima koje se pojavljuju prije vidljivih znakova bolesti

uočljivih drugim metodama i smatra se najpreciznijom metodom za kvantitativnu analizu

dinamičkih biokemijskih procesa in vivo, poput stanične proliferacije, enzimskih reakcija,

interakcija liganda i receptora i staničnog metabolizma. Dok se primjenom metode CT, MRI i

rentgenskog ili ultrazvučnog snimanja mogu vidjeti promjene u veličini tumora do kojih može

doći tjednima ili mjesecima nakon antitumorskog tretmana, PET omogućuje promatranje

metaboličkih promjena u tumoru koje uslijede odmah nakon antitumorskog tretmana.40

15

OPĆI DIO

Poseban izazov navedenog molekulskog praćenja je, osim razvoja odgovarajućih

instrumenata koji omogućuju vizualizaciju bioloških procesa detekcijom signala molekule

tragača, izbor molekula tragača koje su uključene u biološki proces koji se prati.

Razvoj novih molekula tragača složeni je interdisciplinaran pristup koji se sastoji od

organske sinteze, radiooznačavanja molekule tragača te bioloških ispitivanja in vitro i in vivo

radiooznačenog spoja.

2.2.2. Osnovni princip dobivanja PET-slike

Metoda PET se zasniva na detekciji γ-zračenja koje se emitira iz tijela pacijenta u koje je

unešen pozitron-emitirajući radiofarmaceutik. -zračenje je rezultat raspada nestabilnih

jezgara pozitron-emitirajućih izotopa. Na osnovu informacija o detektiranim γ-zrakama,

računalo daje prostornu raspodjelu radiotragača unutar pacijenta (slika 8).2 Pozitron je

protučestica elektrona koja ima istu masu i spin kao elektron, ali suprotan električni naboj.

Pozitron putuje 1 do 2 mm u tkivu i nailaskom na elektron susjednog atoma dolazi do

anihilacije (međusobnog poništavanja) i emisije dviju γ-zraka (fotona energije 511 KeV) koje

su međusobno pod kutom od 180° (slika 8).

Slika 8. Dobivanje PET-slike. A) Nakon sudara pozitrona i elektrona nastaju dva fotona

jakosti 511 KeV; B) PET-skener detektira γ-zrake nastale raspadom radionuklida.2

Kada γ-zrake istovremeno dođu do scintilacijskog detektora, nastaje signal. Fotonska

energija koju apsorbira detektor ponovno se emitira kao vidljiva svjetlost koju detektira

fotomultiplikator koji svjetlosni signal konvertira u strujni signal koji je proporcionalan

energiji fotona. Detektirani signali oblikuju se kao prikaz prostorne raspodjele radioaktivnosti

u organizmu i mogu biti prikazani kao presjeci (tomografija) ili se oblikuju u trodimenzijsku

16

OPĆI DIO

sliku. PET je kvantitativna metoda koja mjeri prostornu koncentraciju radiotragača u tkivu s

visokom točnošću (u pikomolarnoj razini). Detekcija γ-zraka omogućuje rekonstrukciju slike i

otkrivanje položaja i veličine tumora svega nekoliko milimetara.

Osim slikovnog prikaza raspodjele radiofarmaceutika, potrošnja radiofarmaceutika u

određenom području može se kvantificirati te usporediti s ostalim dijelovima organizma.

Uzimajući u obzir težinu, visinu i površinu tijela pacijenta te dozu radiofarmceutika,

izračunava se metabolička aktivnost pojedine regije, a izražava se u tzv. SUV-indeksima

(Standardized Uptake Values).

koncentracija radioaktivnosti u tkivu (MBq/g) SUV =

unesena radioaktivnost (MBq/masa tijela (g))

2.2.3. Izbor radionuklida

Kako pozitron-emitirajući radionuklidi kao što su 11C, 13N i 15O mogu zamijeniti stabilne

analoge u lijekovima i biomolekulama, moguće je sintetizirati PET-tragač s istim kemijskim i

biološkim svojstvima koje ima odgovarajući neoznačeni analog. Izbor radionuklida ovisi o

njihovim fizikalnim i kemijskim svojstvima, dostupnosti i vremenu poluživota radionuklida

koje bi trebalo omogućiti radiosintezu molekule tragača (ponekad su radiosinteze dugotrajne),

te o trajanju promatranog biološkog procesa. Emisija pozitrona je karakteristika jezgre koja je

osiromašena neutronima. Radionuklidi kao što su 68Ga i 124I emitiraju pozitrone velike

energije što rezultira smanjenom rezolucijom konačne slike jer je doseg pozitrona u tkivu

prije anihilacije s elektronom velik. Radionuklidi koji se najčešće koriste u pozitronskoj

emisijskoj tomografiji su 11C (t1/2 = 20,4 min), 13N (t1/2 = 9,9 min), 15O (t1/2 = 2 min), 68Ga (t1/2 = 68 min), 18F (t1/2 = 109,8 min), 64Cu (t1/2 = 12,7 h) i 124I (t1/2 = 4,12 d).34

Radiooznačavanjem spoja izotopom 11C nastaje radiotragač sa svojstvima koja se ne

razlikuju od odgovarajuće neoznačene molekule, osim u malim kinetički izotopnim efektima.2

Radiosinteza spojeva označenih izotopom 11C mora biti jednostavna i kratka s obzirom na

njegovo kratko vrijeme poluživota, a spojevi označeni s ovim izotopom mogu se primijeniti

za praćenje ranih faza u metabolizmu.

Izotop 18F je zbog svojih dobrih kemijskih i nuklearnih svojstava najčešće korišteni

radionuklid u dijagnostici i farmakološkim istraživanjima primjenom metode PET. Prvi je put

proizveden 1936. godine i četiri godine kasnije primijenjen u istraživanju adsorpcije fluorida

17

OPĆI DIO

u kostima i caklini. Danas se ovaj radionuklid uspješno koristi u kliničkoj onkologiji s

radiofarmaceutikom [18F]FDG.

Osim najčešće primjenjivanog [18F]FDG-a, ostali radiofarmaceutici obilježeni izotopom 18F u čestoj komercijalnoj primjeni jesu [18F]kolin (FCH), [18F]tirozin (FET) i [18F]DOPA.

Dobro svojstvo izotopa 18F je da se može proizvesti u dobrom iskorištenju čak i u

ciklotronu niže energije. Relativno dugo vrijeme poluživota ovog izotopa (109,7 min)

omogućava zahtjevniju radiosintezu, dopremanje tragača s udaljenih mjesta proizvodnje, a

istraživanja bioloških procesa mogu trajati duže. Radionuklid 18F ima nisku energiju β+

pozitrona od 635 keV što omogućuje visoku rezoluciju slike PET, jer je linearni doseg

pozitrona u tkivu mali (1–2 mm), kao i male doze radijacije prema pacijentima prilikom

primjene [18F]radiofarmaceutika. Izotop 18F prostorno može, također, zamijeniti atom vodika

jer su Van der Waals-ovi polumjeri ovih atoma slični, ali se razlikuju u elektronskoj gustoći.

Najčešći i najučinkovitiji način proizvodnje izotopa 18F visoke molarne aktivnosti je iz

vode obogaćene izotopom 18O koja se koristi kao meta u ciklotronu uz protonsku zraku

relativno male energije (oko 18 MeV). Kemijske reakcije za uvođenje izotopa 18F u molekulu

primjenjive su za 'hladnu' kemiju i radiokemiju. Provođenje radiokemije zahtijeva, iz

sigurnosnih razloga, primjenu zaštićenih prostora u kojima se te reakcije odvijaju (hot cells).

Same reakcije uvođenja nuklida 18F mogu se podijeliti na reakcije elektroflne i nukleofilne

supstitucije, među kojima su reakcije nukleofilne supstitucije zastupljenije.

2.2.4. PET-tragači za praćenje stanične proliferacije tumora

Radiooznačeni nukleozidni analozi istražuju se i primjenjuju kao molekule tragači u

metodi PET za vizualizaciju proliferirajućih tumorskih stanica kako bi doprinijeli

učinkovitosti primijenjene radioterapije i kemoterapije. Ti se spojevi mogu, također, koristiti

za praćenje ekspresije gena i genske terapije kako bi se dobile informacije o položaju stranog

gena u organizmu, odnosno o njegovoj ekspresiji.41

Brzina proliferacije upućuje na to da li je tumor benigni ili maligni (invazivni) i bitna je za

karakterizaciju malignih tumora. Sadašnje metode koje procjenjuju proliferaciju tumora su

uglavnom invazivne i temelje se na uzimanju uzorka tumorskog tkiva biopsijom.41

Neinvazivne metode procjene proliferacije tumorskog tkiva omogućile bi praćenje utjecaja

terapije antitumorskim lijekovima i lijekovima koji su u razvoju na tumore.42 Jedna od takvih

neinvazivnih metoda je metoda PET. Mnoge se istraživačke skupine bave sintezom PET-

tragača s potencijalnom primjenom u praćenju proliferacije tumora. Jedan takav potencijalni

18

OPĆI DIO

PET-tragač je analog timidina, 3'-deoksi-3'-[18F]fluortimidin ([18F]FLT) (slika 9) koji je

ispitan klinički na pacijentima s rakom pluća, malignim gliomom, rektalnim rakom te

limfomom.35,43

2.2.4.1 [18F]FLT

[18F]FLT ima veliki afinitet za TK1, izoenzim timidin-kinaze koji se nalazi u citoplazmi.44

Fosforiliranje FLT-a se odvija na skupini 5'-OH (slika 9). Kako se na položaju 3' timidina

umjesto OH skupine nalazi elektron-odvlačeći atom fluora koji stabilizira glikozidnu vezu C-

N, [18F]FLT je otporan na metaboličku razgradnju pomoću enzima timidin-fosforilaze i

pucanje glikozidne veze što je prednost za praćenje in vivo.45

OO

HN

N

18F

OHO

HN

NO

[18F ]FLT

18F

O

OOP-O OOH

[18F]FLT-MP

TK1

Slika 9. 3'-Deoksi-3'-[18F]fluortimidin ([18F]FLT) i njegovo fosforiliranje pomoću enzima

TK1.

Za razliku od drugih nukleozidnih molekula tragača, [18F]FLT se gotovo ne umeće u lanac

DNA jer fluor na položaju 3' šećera inhibira njegovu ugradnju u rastući lanac DNA, a njegovo

zadržavanje u stanici ovisi uglavnom o aktivnosti enzima TK1.40 Količina enzima TK1 ovisi o

staničnom ciklusu i visoka je tijekom faza S (replikacija DNA), G2 (priprema za mitozu) i M

(mitoza stanice), a niska tijekom faza G0 (mirovanje stanice) i G1 (rast stanice) staničnog

ciklusa. Može se zaključiti da je enzimska aktivnost TK1 odraz sinteze DNA. Istraživanja su

tako pokazala da se sinteza TK1 poveća 10 puta kada stanica uđe u fazu sinteze DNA u

odnosu na fazu G1.46 Lokalizirano nakupljanje radioaktivnosti ([18F]FLT-fosfata) odraz je,

dakle, sinteze DNA odnosno umnažanja stanica tumora i na taj se način može pratiti dinamika

proliferacije malignih stanica. [18F]FLT prati i normalnu proliferativnu aktivnost stanica

19

OPĆI DIO

koštane srži koje se često dijele pa je vizualizacija tumora u tom predjelu kao i u području

jetre otežana.

Radiotragač 1-(2'-deoksi-2'-[18F]fluor-β-D-arabinofuranozil)timin ([18F]FMAU) prati

aktivnost enzima TK2 koja je pojačana prilikom sinteze DNA u mitohondrijima (slika 14).

Nakupljanje [18F]FMAU u tkivu nije mjera stanične proliferacije, ali je pokazatelj ukupne

mase mitohondrija u tkivu.47

2.2.4.2 [18F]FDG

Najznačajniji i najčešće primjenjivan radiofarmaceutik u kliničkoj primjeni je analog

glukoze, [18F]FDG, obilježen pozitron-emitirajućim izotopom 18F koji zamjenjuje OH

skupinu na položaju 2' u glukozi (slika 10). [18F]FDG se koristi u onkologiji za dijagnostiku i

praćenje rasta tumora.42,48

OOH

[18F]FDGD-glukoza

HO

HOOH

OH

OOH

HO

HO 18FOH

Slika 10. Strukture [18F]FDG i D-glukoze prikazane kao β-D-glukopiranoza.

Jedan od načina sinteze [18F]FDG-a je reakcijom nukleofilne supstitucije s 18F– ionom.

Kriptofiks2.2.2. (K2.2.2.) je krunasti eter koji se koristi kao katalizator za povećanje

nukleofilnosti fluoridnih iona jer stvara kompleks s kalijevim ionima i čini fluoridni ion

reaktivnijim (slika 11).

Slika 11. Princip djelovanja kriptofiksa. Krunasti eter kompleksira s ionima K+.

20

OPĆI DIO

Kao odlazeća skupina u reakciji s fluoridnim ionom koristi se triflatna skupina, a

hidroksilne su skupine prevedene u acetilne. Nakon fluoriranja uz [18F]KF i kriptofiks2.2.2. te

kisele ili bazne hidrolize, izolira se [18F]FDG (shema 2). Za kliničku primjenu [18F]FDG-a,

sinteza ovog spoja potpuno je automatizirana.49

[18F]KF, K2.2.2. H3O+ (HCl)O

OAc

[18F]FDGD-Glukoza

AcO

AcO OTfOAc

OOAc

OAc

OOH

AcO HO

AcO 18F HO 18FOAc

Shema 2. Dobivanje [18F]FDG-a reakcijom nukleofilne supstitucije.

Nakon intravenozne primjene [18F]FDG se nakuplja u stanicama kao i neoznačena glukoza.

Ekspresija proteinskog transportera za glukozu (Glu1) omogućuje da [18F]FDG uđe u stanicu.

Enzim heksokinaza koji prevodi glukozu u glukozu-6-fosfat fosforilira i [18F]FDG u

[18F]FDG-6-fosfat unutar stanice.42 Slike PET [18F]FDG-a odražavaju tako aktivnost enzima

heksokinaze. Kako je za daljnju glikolizu potrebna hidroksilna skupina na položaju 2',

negativno nabijena radiooznačena molekula nakuplja se u stanici, radioaktivno se raspada i

tako šalje signale iz stanica s povećanom potrošnjom glukoze, uglavnom tumorskih stanica

(slika 12). Pomoću kamere PET registrira se raspodjela [18F]FDG-a u organizmu, a pomoću

računalnog sustava dobiva se prikaz metaboličke aktivnosti tkiva cijelog organizma s

mogućnošću tomografskog (slojevitog) prikaza. Iako je unos tog radiofarmceutika povećan u

malignim stanicama, nakupljanje [18F]FDG-a nije uvijek selektivno samo za stanice tumora

jer se potrošnja glukoze može povećati i kod upala, infekcija i drugih benignih procesa što

može dati lažan rezultat.50

21

OPĆI DIO

Slika 12. Usporedba metabolizma [18F]FDG i glukoze.

S obzirom na manju selektivnost radiofarmaceutika [18F]FDG i njegovu manju osjetljivost jer

se ne mogu detektirati metastaze manje od 10 mm, potrebno je razviti nove osjetljivije metode

za detekciju tumora. Stoga je nužno primijeniti druge radiofarmaceutike koji bi mogli

učinkovitije dijagnosticirati pojavu tumora i karakterizirati njegova biološka svojstva.

2.2.5. Praćenje ekspresije HSV1-tk pomoću metode PET

PET je vrlo važna metoda za praćenje ekspresije gena HSV1-tk u suicidalnoj genskoj

terapiji. Ekspresija gena HSV1-tk indirektno se promatra preko interakcije genskog produkta

enzima HSV1-TK i radiooznačene molekule koja je supstrat tog enzima. HSV1-tk je u

kombinaciji s prolijekom, primjerice ganciklovirom, terapijski gen, a u kombinaciji s

odgovarajućom radiooznačenom molekulom reporterski gen.6,7

Praćenje ekspresije HSV1-tk metodom PET sastoji se od nekoliko stupnjeva (slika 13):

1. prijenos gena HSV1-tk pomoću odgovarajućeg vektora u ciljano tkivo (transfekcija,

odnosno transdukcija),

2. transkripcija gena HSV1-tk i translacija mRNA na ribosomu u protein, genski produkt

enzim timidin-kinazu HSV1-TK ,

3. radiooznačena molekula uštrcava se u bolesnika, ulazi u genetički promijenjene stanice

gdje je enzim HSV1-TK fosforilira. Radiooznačena molekula je tako zatočena u genetički

modificiranoj stanici tumora jer ne može prijeći kroz negativno nabijenu staničnu membranu,

koncentrira se unutar stanice i emitira signal s mjesta na kojem je izražen HSV1-tk.

22

OPĆI DIO

Koncentracija radiooznačene molekule, koja se vidi prema razini radioaktivnosti, odraz je

aktivnosti HSV1-TK, odnosno ekspresije HSV1-tk.51 Položaj i koncentracija molekule tragača

(intenzitet signala) stoga su direktno povezani s međudjelovanjem molekule tragača i enzima

HSV1-TK.

Slika 13. Shematski prikaz vizualizacije ekspresije HSV1-tk s molekulom tragačem

[124I]FIAU. Reporterski gen se transkripcijom i translacijom prevodi u genski produkt, enzim

HSV1-TK. Enzim selektivno prevodi molekulu tragača u metabolit koji je zarobljen u

transduciranoj, genetički promijenjenoj stanici.42

Sintetizirani su mnogi radiooznačeni supstrati enzima HSV1-TK kao molekule tragači s

potencijalnom primjenom u praćenju ekspresije tog enzima primjenom metode PET. Također

su istraživani prednosti i nedostatci njihove primjene.52,53

Molekule tragači trebaju zadovoljiti sljedeća svojstva:54

1. trebaju biti djelotvorni i selektivni supstrati HSV1-TK ,

2. ne smiju biti citotoksični za normalne stanice i stanice u kojima je izražena aktivnost

HSV1-TK,

3. trebaju imati strukturu prikladnu za radiooznačavanje,

4. trebaju imati povoljna farmakokinetička svojstva koja uključuju i brz izlazak iz krvi

kako bi se smanjila pozadinska aktivnost u krvi,

5. ne smiju ulaziti u stanice u kojima nije izražena aktivnost HSV1-tk,

6. trebaju biti stabilni in vivo i ne smiju stvarati metabolite koji otežavaju kvantitativnu

procjenu koncentracije radiotragača.

23

OPĆI DIO

Molekule tragači koji se koriste u metodi PET mogu se svrstati u dvije osnovne skupine:

analozi timidina (npr. FLT, FMAU, FIAU, FEAU) označeni radionuklidom 124I ili 18F i

aciklički nukleozidni analozi poput ganciklovira i penciklovira označeni izotopom 18F u

pobočnom lancu, primjerice [18F]FHBG ili na položaju C-8 purinske jezgre (slika 14).8,9

O O

HN

N

HHOH H

H F18OHO

R

O

R = IR = CH3R = CH3CH2

[18F]FIAU

[18F]FMAU

[18F]FEAU

HN

N N

N

H2N X OH

F18[18F]FHBG[18F]FHPG

X = CH2X = O

Slika 14. Strukture izabranih PET-tragača.

2.2.5.1 Radiooznačeni nukleozidni analozi za praćenje ekspresije HSV1-tk

9-[4-[18F]fluor-3-(hidroksimetil)butil]gvanin ([18F]FHBG) (slika 14) ima dobra

farmakokinetička svojstva i smatra se, uz 1-(2'-deoksi-2'-fluor-1-β-D-arabinofuranozil)-5-

[124I]joduracil ([124I]FIAU), zlatnim standardom za praćenje ekspresije HSV1-tk u kliničkim

ispitivanjima.7,55 S obzirom na slab prolazak krvno-moždane barijere spoj se ne može koristiti

za vizualizaciju ekspresije gena HSV1-tk u mozgu, niti za praćenje ekspresije HSV1-tk u

području abdomena zbog njegovog izraženog nakupljanja u tom području vjerojatno zbog

izlučivanja putem jetre i žuči.56 Jednostavan način sinteze [18F]FHBG-a je iz penciklovira

(PCV) (8), kao početnog spoja. Uz metoksitritilnu zaštitnu skupinu i tosilatnu skupinu koja je

dobro odlazeća skupina, fluoriranjem s [18F]KF uz kriptofiks2.2.2. nastaje radiooznačeni spoj

11 koji nakon uklanjanja zaštitne skupine uz kiselinu daje ciljani spoj 12 (shema 3).

24

OPĆI DIO

HN

N N

N

O

H2NOH

OH

HN

N N

N

O

H2NOMTr

OH

HN

N N

N

O

TrMHNOMTr

OTS

HN

N N

N

O

TrMHNOMTr

18F

HN

N N

N

O

H2N

OH

18F

MTrCl TsCl

kriptofiks 2.2.2.

HCl

12, [18F]FHBG

8 9 10

11

[18F]KF

Shema 3. Radiosinteza spoja [18F]FHBG.

[124I]FIAU se u usporedbi s [18F]FHBG više akumulira u HSV1-TK preobraženim

stanicama. Stoga je spoj osjetljiviji na HSV1-TK, ali je istovremeno manje specifičan zbog

djelomičnog fosforiliranja pomoću timidin-kinaze iz čovjeka što otežava detekciju slabije

ekspresije gena (slika 15).57 Dugo vrijeme poluživota radioizotopa 124I (t1/2 = 4,2 dana)

omogućava vizualizaciju kroz duži vremenski period iako je [124I]FIAU podložan dejodiranju

in vivo. Iskorištenja reakcije radiooznačavanja izotopom 124I su relativno visoka (70–80 %),

ali je iskorištenje dobivanja pozitron-emitirajućeg izotopa 124I nisko (oko 20 %) u usporedbi s

reakcijom dobivanja izotopa18F.

O

HN

N

I124

OHOO

OH

F

[124I]FIAU

Slika 15. Radiotragač [124I]FIAU.

Pokazalo se da uvođenje elektronegativnog fluora u položaj 2' ili 3' šećera, stabilizira

glikozidnu vezu nukleozida. 1-(2'-deoksi-2'-[18F]fluor-D-arabinofuranozil)-5-joduracil

25

OPĆI DIO

([18F]FIAU) i 1-(2'-deoksi-2'-[18F]fluor-D-ribofuranozil)-5-joduracil ([18F]FIRU) imaju dobra

svojstva kao PET-tragači.51

U posljednje se vrijeme 5-etil-2'-[18F]fluor-1-β-D-arabinofuranoziluracil ([18F]FEAU)

pokazao kao potencijalni molekulski tragač sa superiornim svojstvima, tj. povećanom

selektivnošću i osjetljivošću za stanice u kojima je izražena aktivnost HSV1-tk.51 Pirimidinski

radiotragači imaju neka bolja svojstva u odnosu na acikličke gvanozinske derivate, veći

afinitet za HSV1-tk i smanjeno nakupljanje radioaktivnosti u području abdomena pa je

pozadinska aktivnost u tom području manja. Naime, put izlučivanja pirimidinskih nukleozida

je renalni, a purinskih kao što je [18F]FHBG hepatobiliarni.6,56 Usporedba [18F]FEAU s

drugim PET-tragačima, radiooznačenim FHBG, FHPG, FIAU, FMAU i FLT pokazala je da

[18F]FEAU ima veću selektivnost i najveći omjer nakupljanja u stanicama s aktivnošću

HSV1-TK u odnosu na nakupljanje u netransduciranim stanicama.7 S obzirom na veći afinitet

za HSV1-TK, FEAU ima i manju citotoksičnost na normalne stanice. [18F]FEAU je, pored

toga, metabolički stabilan in vivo. Sintetski se može dobiti povezivanjem zaštićenog šećernog

prstena s ugrađenim izotopom 18F (15) i trimetilsililiranog pirimidina (16). Selektivno N-1

alkiliranje je postignuto reakcijom sililiranja 5-etiluracila s heksametildisilazanom (HMDS).

Nakon uklanjanja zaštitnih skupina u bazičnim uvjetima, dobiva se [18F]FEAU (18) (shema

4).

OTMSO

RO OR'

ORRO

R = benzoatR' = triflat

MeCN18F-

O

RO

ORRO 18F

CH2Cl-CH2Cl

HBr/AcOH

O

RO

RO 18FBr

N

NTMSO

CH2Cl-CH2Cl

HN

N

O O

OO

RO

18FRO

CH3OH

NaOCH3

HN

NOO

HO

18FHO

18, [18F]FEAU

13 14 1516

17

Shema 4. Sintetski put dobivanja spoja [18F]FEAU. Referentni neoznačeni spoj FEAU može

se pripraviti primjenom analognog sintetskog puta.51

26

OPĆI DIO

Radiosinteza radionuklida označenih izotopom 18F u položaju 2' šećera ([18F]FEAU,

[18F]FIAU) je znatno složenija, višestupnjevita i time dugotrajna (> 180 min) pa se takva

radiooznačena molekula tragač dobiva u niskom iskorištenju.

2.2.5.2 C-6 supstituirani derivati pirimidina kao potencijalni netoksični PET-radiotragači za

praćenje ekspresije HSV1-tk

Pirimidinski derivati u kojima se lanac koji zamjenjuje šećernu komponentu nalazi na

položaju C-6 pirimidina, a ne na položaju N-1 predstavljaju obećavajuće kandidate za razvoj

netoksičnih molekula tragača.10 Pored toga, pokazalo se da uvođenje dvostruke veze u lanac

daje molekulama blagu rigidnost što se pozitivno odražava na njihovu interakciju s

fosforilirajućim enzimima.58,59

Pirimidinski derivat s 2-fluor-3-hidroksipropilnim lancem na položaju C-6 timina (23)

(shema TT5) je pokazao veći afinitet vezanja za HSV1-TK od prolijekova ganciklovira i

aciklovira.10 6-(3-benziloksi-2-hidroksipropil)-2,4-dimetoksitimin (21) je pripremljen

reakcijom litiranja 5,6-dimetil-2,4-dimetoksipirimidina (19) i potom reakcijom

organolitijevog intermedijara s benziloksiacetaldehidom (20). Fluoriranjem uz

dietilaminosumporov trifluorid (DAST), kao reagens za fluoriranje, i uklanjanjem benzilne

skupine uz borov triklorid (BCl3) i acetil-klorid (AcCl), dobiven je spoj 23 (shema 5).

Pripravljen je i odgovarajući radiooznačeni analog, fluoriranjem zaštićenog prekursora s

[18F]tetrabutilamonijevim fluoridom, ali je iskorištenje reakcije bilo vrlo nisko (1 %).

N

N

CH3

OCH3

H3CO

N

N

CH3OCH3

H3CO CH2Li

BnOO

H

HN

NH

CH3O

O CH3

OH

N

N

CH3

OCH3

H3CO

F

HN

NH

CH3

O

O

F

OBnOBn

OH

1. POCl32. NaOCH33. n-BuLi octena

kiselina DAST

1. AcCl, H2O2. BCl3

18 19

20

2122

23

Shema 5. Sintetski put dobivanja spoja 23.

27

OPĆI DIO

6-(2,3-dihidroksipropil)-5-[18F]fluormetilpirimidin-2,4-dion ([18F]fluormetil-HHT) (slika

16) je kao lažni supstrat HSV1-TK uspješno locirao melanom stanične linije B16F1 kod

miševa i selektivnije se nakupljao u tumorskim stanicama od poznatog PET-tragača

[18F]FHBG.60

HN

NH

O

CH218F

O

OH

OH[18F]fluormetil-HHT

Slika 16. Struktura spoja [18F]fluormetil-HHT.

U usporedbi s [18F]FHBG, spoj [18F]fluormetil-HHT se također manje nakupljao u

abdomenu. Nedostatak tog spoja bilo je njegovo defluoriranje in vivo i nakupljanje fluoridnih

iona u kostima miševa pa se pristupilo optimiranju strukture kako bi se prevladali navedeni

nedostatci.

S ciljem povećanja stabilnosti in vivo spoja [18F]fluormetil-HHT, izotop 18F je ugrađen u

pobočni lanac na položaju C-6 timidina. Sintetiziran je C-6 dihidroksiizobutilni derivat timina

(DHBT) koji se pokazao kao dobar supstrat enzima HSV1-TK.61 Kako se DHBT u reakciji

fluoriranja ciklizirao, pripravljen je njegov N-metilirani derivat, 6-(1,3-dihidroksiizobutil)-N-

metiltimin (N-Me-DHBT) (slika 17, shema 6).62

Slika 17. Strukture spojeva DHBT i N-Me-DHBT.

HN

NH

CH3

O

O

OHOH

DHBT

HN

N

CH3

O

O

OHOH

CH3

N-Me-DHBT

28

OPĆI DIO

Ciljani spoj N-Me-DHBT (29) dobiven je sintezom prikazanom na shemi 6. Spoj 25

pripravljen je adicijom organolitijevog intermedijara s ketonom, 1,3-bis(benziloksi)propan-2-

on (24).

N

N

CH3

OCH3

H3COOH

OBnOBn

N

N

CH3OCH3

H3CO CH3

BnOO

OBn

N

N

CH3

OCH3

H3COO

OBnOBn

C CO

OCH3

O

N

N

CH3

OCH3

H3CO

OBnOBn

N

N

CH3

OCH3

O

OBnOBn

CH3

HN

N

CH3

O

O

OHOH

CH3

29, N-Me-DHBT

LDATHF metil-oksalil-klorid

DMAP

Bu3SnHAIBN

1. BCl3 CH3I

2. AcCl

19

2425

26

2728

Shema 6. Sintetski put dobivanja spoja N-Me-DHBT.

Dobiveni je spoj u reakciji s metil-oksalil-kloridom u prisutnosti 4-dimetilaminopiridina

(DMAP) dao oksalat 26. Iz oksalata je, potom, u radikalskoj deoksigenaciji s

tributilkositrovim hidridom (Bu3SnH) uz 2,2'-azobis(izobutilnitril) (AIBN) sintetiziran spoj

27. Metiliranje položaja N-1 je provedeno uz metil-jodid. Benzilna zaštitna skupina je

uklonjena s BCl3, a demetiliranje položaja 4 pirimidina s AcCl pri čemu je dobiven ciljani

spoj 29.

Oba su spoja, DHBT i N-Me-DHBT, imala bolji afinitet vezanja za enzim HSV1-TK od

aciklovira i ganciklovira.61 Kristalna struktura kompleksa N-Me-DHBT i HSV1-TK prikazana

je na slici 18.

29

OPĆI DIO

Slika 18. Interakcije N-Me-DHBT s aminokiselinama u aktivnom mjestu enzima HSV1-TK.

Molekule vode su prikazane kao crvene kuglice, a vodikove veze kao crvene isprekidane

linije.

Kristalna struktura pokazuje kako N-metilna skupina stabilizira aciklički dio molekule.

Pirimidinski prsten je učvršćen između Met128 i Tyr172 i tvori kompleks nalik sendviču.

Timinski je dio dodatno stabiliziran vodikovim vezama s karboksamidom Gln125 te s

pobočnim lancem Arg176 i dvije molekule vode. Dihidroksiizobutilni lanac s vodikovim

vezama nalazi se unutar aktivnog dijela enzima. Hidroksilna skupina je vodikovom vezom

povezana s Arg163, posebno značajnom aminokiselinom u katalitičkoj domeni za stvaranje

interakcija, i sa sulfatnim ionom.

Pripravljen je i prekursor za radiooznačavanje u kojem su dvije primarne hidroksilne

skupine zaštićene tosilnom i metoksitritilnom skupinom. Fluorirani derivat spoja N-Me-

DHBT, N-Me-FHBT, i njegov radiooznačeni analog, N-Me-[18F]FHBT, sintetizirani su prema

shemi 7.62

30

OPĆI DIO

HN

N

CH3O

O

OHOH

CH3

29, N-MeDHBT

HN

N

CH3O

O

OMTrOH

CH3

HN

N

CH3O

O

OMTrOTs

CH3

HN

N

CH3O

O

OHF

CH3

HN

N

CH3O

O

OH

CH3

18F

33, N-Me-[18F]FHBT

32, N-Me-FHBT

MTrCl TsCl DAST

1. [18F]KF2. HCl

DMAP

30 31

Shema 7. Sintetski put dobivanja spoja N-Me-FHBT i njegovog radiooznačenog analoga N-

Me-[18F]FHBT.

Reakcija [18F]radiooznačavanja je provedena pomoću fluorirajućeg reagensa [18F]KF uz

kriptofiks 2.2.2.. Nakon kisele hidrolize radiooznačenog spoja, dobiven je ciljani spoj 33.

Rezultati in vitro pokazali su izraženiju akumulaciju N-Me-[18F]FHBT u stanicama u

kojima je izražena aktivnost TK (HEK293TK+) u odnosu na netransducirane stanice. N-Me-

[18F]FHBT je u usporedbi s [18F]FHBG pokazao smanjeno nakupljanje u području abdomena,

ali manju selektivnost jer se više u odnosu na [18F]FHBG nakupljao u netransduciranim

stanicama (slika 19).

Slika 19. PET-slike miševa s ksenograftovima u koje su injektirani N-Me-[18F]FHBT i

[18F]FHBG. U desnom ramenu miševa nalazi se HEK293TK+ ksenograft, a u lijevom

HEK293 kontrolni ksenograft.

31

OPĆI DIO

2.3. Suicidalna genska terapija

2.3.1. Novi pristup selektivnom uništavanju tumorskih stanica

Standardne metode za liječenje raka uključuju kirurško odstranjivanje tumora,

kemoterapiju, te liječenje ionizirajućim zračenjem. Standardni kemoterapijski agensi i

ionizirajuće zračenje temelje se na tome da se tumorske stanice dijele brže nego normalne

stanice pa je toksičnost tretmana za tumorske stanice veća nego za normalne stanice, iako su

toksični utjecaji izraženi i u normalnim stanicama.63

Napredak u molekulskoj biologiji i poznavanju ljudskog genoma rezultirao je novim

pristupom terapiji tumora te se za liječenje zloćudnih tvorevina koristi unos stranih gena u

tumorsku stanicu. Genska terapija tumora omogućuje direktni tretman tumorskih stanica

mijenjanjem njihovog fenotipa ili unosom suicidalnih gena u tumorsku stanicu. Dosadašnja se

istraživanja na području genske terapije tumora mogu podijeliti u četiri osnovna područja64,65:

1. unos gena kako bi se pojačao odgovor imunološkog sustava na tumorske stanice,

2. unos tumor-represorskih gena,

3. transfer gena odgovornih za otpornost na lijekove i

4. unos suicidalnih gena.

Jedan od obećavajućih pristupa u terapiji tumora je suicidalna genska terapija gdje se

selektivno u tumorske stanice ugrađuje virusni ili bakterijski gen čiji produkt, enzim, može

netoksični prolijek prevesti u toksični metabolit, odnosno aktivni kemoterapijski agens. Cilj

suicidalne genske terapije je selektivno uništenje stanice tumora bez toksičnog utjecaja na

normalne stanice, dakle kemoterapija je usmjerena direktno na tumorske stanice.66 Geni koji

se najčešće koriste u suicidalnoj genskoj terapiji su: gen za timidin-kinazu virusa herpes

simpleks tipa 1 (HSV1-tk), gen za citozin-deaminazu (CD), gen za timidin-kinazu virusa

varicella zoster (VZV-tk), gen za nitroreduktazu, gen za ksantin-gvanin-

fosforiboziltransferazu (Escherichia coli gpt), Escherichia coli Deo gen (tablica 2).67

32

OPĆI DIO

Tablica 2. Najčešće korišteni suicidalni sustavi za gensku terapiju raka.

enzim prolijek aktivni lijek

HSV-TK ganciklovir ganciklovir-trifosfat

VZV-TK 6-metoksipurin-arabinozid adenin-arabinozid-

trifosfat

citozin-deaminaza (CD) 5-fluorcitozin 5-fluoruracil

nitroreduktaza 5-(aziridin-1-il)-2,4-

dinitrobenzamid (CB1954)

5-(aziridin-1-il)-4-

hidroksilamin-2-

nitrobenzamid

ksantin-gvanin-

fosforiboziltransferaza

(XGPRT)

6-tioksantin 6-tioksantin-monofosfat

purinska nukleozidna

fosforilaza (PNP)

6-metilpurin-deoksiribozid 6-metilpurin

2.3.2. Citozin-deaminaza i 5-fluorcitozin

Kombinacija enzima citozin-deaminaze (CD) i 5-fluorcitozina, kao prolijeka, je intenzivno

istraživana.66 Naime, enzim CD katalizira hidrolitičko deaminiranje citozina u uracil. Ovom

reakcijom se netoksični 5-fluorcitozin (5-FC) prevodi u toksični kemoterapijski agens, 5-

fluoruracil (5-FU).

CD je enzim koji je karakterističan za stanice bakterija i gljivica, ali ne i stanice čovjeka pa

su normalne stanice otporne na toksična djelovanja 5-FC. Citotoksični učinci 5-FU se

ispoljavaju nakon konverzije 5-FU u 5-fluor-2'-deoksiuridin-5'-monofosfat (5-FdU-MP). 5-

FdU-MP je ireverzibilni inhibitor timidilat-sintaze i tako inhibira sintezu deokistimidin-

trifosfata što uzrokuje inhibiciju sinteze DNA (slika 20).

33

OPĆI DIO

N

NH2

O NH

F

enzim citozindeaminaza

HN

O

O NH

F

5-FC 5-FU

HN

O

O NO

OH

H HH H

O P O-

O-

O

5-FdU-MP

Slika 20. Transformacija netoksičnog 5-FC-a u 5-FU i 5-FdU-MP koji je ireverzibilni

inhibitor timidilat-sintaze.

Provedena su ispitivanja in vitro i in vivo enzima CD i prolijeka 5-FC na različitim

tumorima (karcinom crijeva,68 rak gušterače,69 rak dojke,70,71 rak potrbušnice72) koja su

pokazala visoke koncentracije 5-FU koji je nastao konverzijom iz 5-FC. 5-FU se koristi kao

lijek u klasičnoj kemoterapiji raka za liječenje raka dojke, raka gastrointestinalnog trakta i

jetre. Međutim, potrebne su velike koncentracije tog toksičnog lijeka kako bi se postigla

regresija tumora. Kao i kod drugih metoda suicidalne genske terapije dostava gena u tumorske

stanice omogućuje lokaliziranu konverziju prolijeka u toksični metabolit što isključuje

toksično nuzdjelovanje na zdrave stanice. CD se izolira iz bakterije E. coli ili iz gljivica.

Klinička ispitivanja ukazala su na neke nedostatke primjene ovog enzima i prolijeka kao što

su konverzija 5-FC u 5-FU u normalnim stanicama koje imaju aktivnost CD ako se u tim

stanicama nalazi enterobakterija. Još jedan nedostatak ove metode je nedovoljna pretvorba 5-

FC u 5-FU u transduciranim, genetički promijenjenim stanicama.

2.3.3. HSV1-TK/prolijek u suicidalnoj genskoj terapiji: put od antivirusnog do

antitumorskog lijeka

Obećavajući i najviše istraživan sustav suicidalne genske terapije koji je ušao u fazu III

kliničkog ispitivanja je suicidalna genska terapija s kombinacijom gena HSV1-tk i prolijeka

ganciklovira.5 Mogućnost primjene ove metode prvi je put opisana 1986. godine.73 Kao što je

prije rečeno, gen HSV1-tk kodira enzim HSV1-TK koji netoksični prolijek metabolizira u

toksični produkt. Ova metoda koristi manju selektivnost virusne timidin-kinaze naspram

timidin-kinaze čovjeka. Tumorske se stanice biokemijski transformiraju transfekcijom s HSV-

DNA fragmentima.74

34

OPĆI DIO

Kako bi se strani gen unio u stanicu, koriste se različiti virusni i nevirusni nosači ili

vektori. Kako su virusi razvili prirodni mehanizam za unos svog genoma u stanicu, oni su

izvrsni nosači za unos strane DNA. Ovi vektori nastali su zamjenom gena odgovornih za

replikaciju i patogenost virusa sa stranim terapeutskim genom. Izbor virusnog vektora ovisi o:

vrsti tumorske stanice u koju treba unijeti terapeutski gen i terapeutskoj strategiji koja će se

primijeniti. Najčešće korišteni virusni vektori su adenovirusi, retrovirusi, vakcinia virus,

poksivirus, virusi povezani s adenovirusima, herpes simpleks virus i lentivirusi.75 Vektori

transduciraju samo stanice koje su mitotički aktivne pa na taj način selektivno djeluju na

tumore koji su u fazi replikacije, a ne na stanice u blizini tumora koje se ne dijele.76

Danas oko 70 % protokola odobrenih za klinička ispitivanja genske terapije koristi viruse

kao nosače jer su virusni, u usporedbi s nevirusnim vektorima, bolji u unosu gena u stanicu.67

U nevirusne vektore ubrajaju se gola DNA, kationski liposomi i kationski polimeri.

Tretmanom genetički promijenjenih stanica s prolijekom, nekim antivirusnim agensom

nastaje citotoksični produkt jer ga virusna TK fosforilira do monofosfata (slika 21), a daljnjim

fosforiliranjem pomoću TK čovjeka, nastaju trifosfatni derivati koji se ugrađuju u DNA i

inhibiraju DNA-polimerazu što rezultira prekidanjem daljnje izgradnje lanca DNA pri čemu

tumorska stanica umire. Stanice u kojima nije izražena aktivnost virusne timidin-kinaze ostaju

netaknute. Na taj način, npr. antivirusni lijek ganciklovir u tumorskim stanicama s HSV1-TK

prelazi u citotoksični ganciklovir-trifosfat i uništava tumorske stanice.

Slika 21. HSV1-TK fosforilira ganciklovir u ganciklovir-monofosfat (GCV-MP). A) dimerna

struktura HSV1-TK; B) ganciklovir smješten u aktivno mjesto HSV1-TK; vodikove veze

označene su isprekidanim linijama.77

35

OPĆI DIO

Enzim HSV1-TK 1000 puta djelotvornije monofosforilira ganciklovir u usporedbi s TK

čovjeka.78 U koncentracijama koje se koriste u ispitivanju, GCV nije toksičan na stanice koje

nisu genetički promijenjene s genom HSV1-tk.

Prolijek mora ispunjavati nekoliko uvjeta da bi se koristio u genskoj terapiji raka

enzim/prolijek:79

1. mora prolaziti kroz staničnu membranu stanice tumora,

2. razlika u citotoksičnosti prolijeka i odgovarajućeg metaboliziranog aktiviranog

toksičnog lijeka mora biti što veća,

3. prolijek mora biti dobar supstrat enzima izraženog u stanici,

4. aktivni lijek treba biti jako citotoksičan,

5. poželjno je da aktivni lijek prelazi u druge stanice difuzijom ili na neki drugi način kako

bi se postigao 'bystander' učinak.

F.L. Moolten i J.M. Wells su 1990. godine primijetili da genetički promijenjene stanice u

koje je unešen gen HSV1-tk i, potom, tretirane s GCV izazivaju osjetljivost susjednih

netransduciranih stanica.80 Citotoksično se djelovanje, dakle, prenosi i na susjedne stanice,

koje ne sadrže HSV1-TK ('bystander' učinak) (slika 22).

Slika 22. Shematski prikaz genske terapije primjenom HSV1-tk.74

Zahvaljujući navedenom učinku GCV pokazano je da je za neke stanične kulture potrebno

transducirati samo 10 % stanica i tretirati ih s GCV kako bi se postigla 100 % smrt stanica. U

modelu in vivo je potvrđeno da samo 10–50 % stanica transduciranih s HSV-tk pri tretmanu s

36

OPĆI DIO

GCV uzrokuju potpunu regresiju tumora.81 Jedan od predloženih mehanizama ovakvog

djelovanja je da GCV-TP prelazi iz transducirane stanice u susjednu genetički nepromijenjenu

stanicu pomoću propusne veze odnosno kanala prisutnih u staničnoj membrani u zrcalnoj

simetriji koji