UNIVERSITATEA „ALEXANDRU IOAN CUZA”IAŞI FACULTATEA DE BIOLOGIE

PROGRAM IDEI Cod CNCSIS 2100

Tema 1040/2009

STUDIUL COMPLEX AL FILOSFEREI UNOR SPECII DE PLANTE DIN

COLECTIILE GRĂDINII BOTANICE IAŞI

SINTEZA REZULTATELOR - 2009 Filosfera reprezintă un habitat important atât din punct de vedere ştiinţific cât şi economic la nivelul căruia se poate studia

ecologia microbiană. Conceptul de filosferă a fost creat de Ruinen la începutul secolului XX Aceasta reprezintă o microbiocenoză formată pe frunză de miliarde de bacterii, cianobacterii, alge, ciuperci (mai adesea levuriforme), granule de polen şi tot ceea ce poate vehicula

vântul la suprafaţa frunzelor (încă active) de la majoritatea plantelor superioare. Rolul acestei microbiocenoze, mai ales în momentul căderii frunzelor care se vor adăuga litierei preexistente, este preţios şi important. Epifitele sunt implicate în procese la scară largă cum sunt, de exemplu, circuitul carbonului (interceptând compuşi cu carbon eliberaţi direct de către plante sau îndepărtaţi de către unele artropode) şi circuitele azotului (nitrificarea substanţelor poluante ce conţin amoniu interceptaţi de către plante, fixarea azotului), până la

procese ce afectează sănătatea plantelor. Datorită importanţei multor colonizatori microbieni ai filosferei în cadrul sănătăţii plantei, vor exista numeroase aplicaţii practice care sunt rezultatul înţelegerii mai exacte a interacţiunilor dintre microorganisme şi plante cât şi între acestea din urmă. Aceste cunoştinţe avansate pot contribui, de asemenea, la înţelegerea ecologiei bacteriilor patogene de pe suprafaţa

plantelor şi pot asigura noi perspective pentru dezvoltarea prevenirii sau a strategiilor de controlare a contaminării cu patogeni enterici înaintea recoltării culturilor. Filosfera are multe caracteristici care o transformă într -un habitat excelent în care poate fi studiată ecologia microbiană. Frunzele sunt curate iar microorganismele pot fi observate direct pe frunze, permiţând utilizarea unor puternice noi tehnici de microscopie

pentru a măsura identitatea microbiană, activitatea şi expresia genelor. Pentru a testa modelele de comportament microbian, p utem schimba uşor natura condiţiilor habitatului de pe plantele pe care trăiesc bacteriile modificând genetic plantele. Plantele pot creşte fără comunităţi microbiene epifite, permiţându-ne astfel să le manipulăm colonizatorii. Microbiologia filosferei are multe de oferit în cadrul

domeniului ecologiei microbiene şi promite să contribuie la crearea de metode de protecţie a plantelor mai eficiente şi mai puţin dăunătoare pentru mediul înconjurător.

În contextul datelor anterior prezentate, preluate din literatura de specialitate, cercetările iniţiate prin prezentul proiect îşi propun

rezolvarea unor aspecte fundamentale legate de structurarea si funcţionarea filosferei la specii din familia Labiatae. Astfel, urmărim să realizăm un model experimental prin care să putem caracteriza, deopotrivă, plantele gazdă ( Ocimum basilicum L. şi Perovskia atriplicifolia Benth.), cât şi organismele colonizatoare ale organelor lor aeriene, ca parte intrinsecă a filosferei proprii; în acest sens am urmărit :

Prelevarea probelor biologice într-o etapă ontogenetică cât mai apropiată de cea indicată de practică, pentru obţinerea unui material biologic bogat în uleiuri volatile cu proprietăţi fitoterapeutice şi aromatizante evidente.

Realizarea de preparate pentru studiile histo-anatomice, pentru investigaţii clasice (de microscopie optică) şi moderne

(microscopie electronică SEM). Efectuarea de analize biochimice pentru evaluarea cantitativă şi calitativă a uleiurilor volatile produse de organele vegetative

ale plantelor test - tulpini şi frunze - utilizând metode de extracţie prin hidrodistilare a uleiurilor volatile si de analiză a

compoziţiei acestora prin metode gaz cromatografice de analiză, cuplate cu metode de spectrometrie de masă. Derularea de cercetări de factură microbiologică, pentru investigarea efectelor antibacteriene ale uleiurilor volatile extrase

asupra unor tulpini de microorganisme test şi/sau provenind din filosfera proprie plantelor investigate. Ne propunem în acest context, în etapele următoare, continuarea cercetărilor de factură anatomo -histologică, biochimică şi

microbiologică pentru identificarea, izolarea şi caracterizarea unor microorganisme specifice filosferei plantelor investigate aparţinând familiei Labiatae, precum şi pentru studiul efectelor antibacteriene ale uleiurilor volatile extrase asupra unor tulpini de microorganisme test, cât şi studiul caracterelor macro şi micromorfologice ale microorganismelor din filosfera acestor plante.

În contextul celor prezentate, necesitatea studierii compoziţiei şi funcţiilor microbiotei flosferice este legată de rezolvar ea unor aspecte de strictă actualitate:.

Stabilirea exactă a relaţiilor existente între membrii comunităţilor microbiene filosferice şi studiul dinamicii populaţiilor microbiene pe suprafaţa frunzelor trebuie să constituie premisa utilizării în agricultură a microorganismelor modificate gene tic.

La momentul actual există puţine date cu privire la răspândirea unor grupe de microorganisme în filosferă ori referitoare la enzimologia şi diversitatea funcţională a populaţiilor microbiene de pe suprafaţa foliară a plantelor. Tematica de cercetare urmăreşte astfel să consolideze, prin rezultatele practice, conceptele actuale despre filosfera plantelor ,

unanim recunoscută astăzi ca realitate biologică în regnul vegetal, dar evidenţiată strict doar pentru un număr redus de plante.

2

Studiu documentar privind biologia şi comportamentul speciilor Ocimum basilicum L. şi Perovskia atriplicifolia Benth., în raport cu complexitatea interelaţiilor plantă-microorganisme şi a celor dintre comunităţile de microorganisme componente ale filosferei.

Părţile aeriene ale plantelor sunt colonizate în mod normal de o multitudine de bacterii, levuri şi fungi. În timp ce puţine specii

microbiene pot fi izolate din cadrul ţesuturilor vegetale, mult mai multe specii microbiene pot fi izolate de pe suprafaţa plantelor sănătoase. Habitatul aerian colonizat de către aceste microorganisme poartă numele de filosferă, iar colonizatorii săi sunt

microorganismele epifite. Deşi au fost efectuate investigaţii asupra microorganismelor ce colonizează suprafaţa mugurilor şi a florilor, majoritatea studiilor efectuate asupra microbiologiei filosferei s-au axat asupra frunzelor, acestea din urmă reprezentând structurile aeriene dominante ale plantelor. Bacteriile reprezintă de departe cele mai numeroase microorganisme colonizatoare ale frunzelor, de

multe ori găsindu-se în număr de aproximativ 106 până la 107 celule/cm2 (până la 108 celule/g) (Andrews şi Harris, 2000). În comparaţie cu majoritatea altor habitate bacteriene, microbiologia filosferei a fost relativ puţin studiată. Acest lucru este

surprinzător, având în vedere abundenţa plantelor pe Terra şi rolul diferitelor bacterii filosferice în cadrul unor procese importante.

Frunzele constituie un habitat microbian foarte vast. Se estimează că aria suprafeţelor foliare terestre care poate fi colonizată de către microorganisme este de aproximativ 6,4×108 km2. Dat fiind numărul mare de bacterii de pe frunze din zonele temperate ale Globului şi faptul că populaţiile din zonele tropicale sunt probabil şi mai vaste, populaţia bacteriană filosferică planetară poate a tinge un număr de 1026 celule (Morris, şi Kinkel, 2002). În mod clar, în cadrul agregatelor, aceste bacterii sunt suficient de numeroase pentru a putea

participa în cadrul multor procese de importanţă globală, cât şi în cadrul comportamentului plantelor a căror suprafaţă o colonizează. Suprafaţa foliară a fost de mult timp considerată a fi un mediu ostil pentru colonizatorii bacterienei. Suprafaţa foliară este

expusă fluctuaţiilor rapide de temperatură şi umidităţii relative, cât şi alternanţelor repetate între prezenţa şi absenţa umidităţii normale

menţinută de ploi şi rouă. Frunza asigură, de asemenea, resurse nutritive limitate pentru colonizatorii bacterieni. Deşi alte habitate le oferă probabil condiţii extreme (deshidratare, temperaturi extreme etc.), acestea nu prezintă astfel de fluctuaţii rapide extreme ale acestor condiţii fizice diferite. Numeroşi factori pot influenţa microhabitatul întâlnit de către bacterii pe suprafaţa foliară. În p rimul rând, frunza

însăşi este înconjurată de un strat laminar foarte subţire în cadrul căruia umiditatea emisă prin stomate poate fi izolată, micşorând astfel stresul hidric la care sunt expuse epifitele. În al doilea rând, unele celule dintr -o populaţie bacteriană foliară, în special cele din cadrul populaţiilor patogene ale plantelor, nu pot coloniza zonele expuse ale suprafeţei foliare, dar pot invada local interiorul frunzei, evitând stresul de la exteriorul frunzei, colonizând camerele substomatice sau alte locaţii de la interiorul frunzei. Astfel, în timp ce unii fitopatogeni

au posibilitatea de a evita stresul, aparent, majoritatea altor epifite trebuie să-l tolereze (Beattie şi Lindow, 1999). Această problemă ridică întrebarea: La ce ne referim când spunem bacterii epifite, termen care de obicei transmite imaginea colonizatorilor suprafeţelor foliare? În timp ce majoritatea colonizatorilor bacterieni ai plantelor pot fi uşor îndepărtaţi de pe frunze prin spălare sau pot fi omor âţi de agenţi care

nu penetrează frunza, cum sunt peroxidul sau radiaţiile UV (Wilson şi colab., 1999), este probabil mai potrivit ca această colonizare epifită să fie percepută ca fiind tridimensională, în comparaţie cu procesul planar imaginat uneori. Astfel, condiţiile reale la care sunt expuse epifitele pe frunze sunt probabil destul de diferite de cele estimate în urma măsurătorilor la scară largă a iradierii, umidităţii etc.

Frunzele, tulpinile, florile şi fructele plantelor sunt frecvent colonizate de microorganisme epifite (bacterii, fungi, levur i, alge) pentru care aceste organe reprezintă habitate adecvate. Suprafaţa frunzelor verzi sănătoase este populată de o serie de microorganisme saprofite, dintre care unele apar rar în alte nişe ecologice. Mediul natural, reprezentat de suprafaţa frunzelor este expus direct luminii solare, v ariaţiilor de climă şi de temperatură,

umiditate şi uscăciune, precum şi celor legate de vârsta frunzelor. Dispersia microorganismelor din filosferă este favorizată de ploi, de curenţii de aer, de praf, de insecte şi de multe mecanisme proprii (balistospor ii). Bacteriile sunt cele mai numeroase şi includ, în special, ca şi în cazul celorlalte microorganisme, specii cu pigment roşu, v erde,

galben etc., cu rol protector faţă de radiaţiile solare. Actinomicetele, deşi frecvente în sol, sunt prezente doar rar pe frunze. Microfungii, în special levurile, dispun de un mecanism foarte eficient de dispersare de la o frunză la alta, respectiv de balistospori. Numeroase exemple demonstrează că microorganismele saprofite de pe suprafeţele foliare pot controla eficient dezvoltarea patogenilor pentru plante. Acest efect se poate realiza prin competiţie şi în primele stadii de acţiune ale acestora, prin s inteza de

metaboliţi, care le diminuează virulenţa sau stimulează rezistenţa gazdei. Unele microorganisme sintetizează fitoalexine, gibereline, substanţe de tip auxinic etc. Unii fungi endofiţi, ca Acremonium coenophialum, produc substanţe repelente care protejează planta gazdă (Festuca arundinaceea), respingând sau limitând capacitatea

de hrănire a afidelor sau producând tulburări digestive animalelor erbivore. Fungii transmisibili prin seminţe găsesc în planta gazdă adăpost şi nutrienţi, iar aceasta beneficiază prin îndepărtarea consumatorilor potenţiali. Cunoaşterea rolului microorganismelor din filosferă ridică o serie de probleme dificile legate de acţiunea fungicidelor. Acestea

pot avea un efect benefic dacă omoară microfungii lipolitici (Sporobolomyces, Aureobasidium), prin faptul că întârzie fenomenele de senescenţă foliară, menţinând cerurile cuticulare în stare nealterată. Efectul poate fi însă nociv dacă diminuează rezistenţa naturală, prin îndepărtarea microorganismelor saprofite care competiţionează cu cele patogene. Numeroase exemple de microorganisme din filosferă demonstrează că microorganismele saprofite de pe suprafeţele foliare pot

controla eficient dezvoltarea patogenilor pentru plante. Acest efect se poate realiza prin competiţie în primele stadii de acţiune ale acestora, prin sinteza de metaboliţi care le diminuează virulenţa sau stimulează rezistenţa gazdei. Suprafaţa totală a vegetaţiei terestre însumează peste 500 de milioane de km2 (Morris şi Kinkel, 2002). Frunza reprezintă un

habitat pentru microorganismele epifite. Este un habitat efemer care durează doar câteva săptămâni în cazul multor plan te anuale şi până la câţiva ani în cazul speciilor lemnoase perene; este un habitat foarte dinamic, expus unor pronunţate variaţii ciclice şi non ciclice

3

ale condiţiilor de mediu (Andrews, 1996) şi diferit faţă de majoritatea habitatelor în cazul cărora limitele sunt mai mult sau mai puţin arbitrar definite, marginile frunzei delimitând în mod clar graniţa comunităţilor microbiene. Comunităţile epifite sunt supuse unor schimbări rapide şi frecvente ale factorilor de mediu (temperatură, umiditate, viteza vântului, radiaţii), unii dintre aceştia constituind un factor de stres pentru unele bacterii (Hirano şiUpper, 2000).

O caracteristică tipică a populaţiilor bacteriene epifite este variabilitatea ridicată în timp şi spaţiu. Dimensiunile popula ţiilor pot varia enorm chiar şi în cazul unor frunze adiacente, identice la o primă privire, ale aceluiaşi individ (Andrews, 1996).

Nomenclatura speciilor luate în studiu în lucrarea de faţă a fost preluată din principalele lucrări de floristică publicate în ţară şi străinătate. După Flora României (vol. 8), cele două specii din Familia Lamiaceae sunt perene, cultivate în ţara noastră ca plante medicinale sau ornamentale.

●Ocimum basilicum L. (busuioc). Busuiocul este o plantă de un verde deschis, pubescentă, aromatică. Tulpină este erectă, înaltă de 20-60 cm, ramificată de la bază iar frunzele sunt ovate, acute, la bază atenuate în peţiol, lungi de 3 -5 cm, late de 2-2,5 cm, întregi sau

slab dinţate, pe dos cu numeroase glande secretoare şi cu 4-5 perechi de nervuri secundare. Inflorescenţa este întrerupt spiciformă, formată din verticile pauciflore scurt pedunculate, cu câte 4-6 flori scurt pedicelate. Caliciul prezintă un tub foarte scurt, bilabiat, persistent; labiul superior orbicular, de 5-6 mm în diametru, ciliat pe margini, cel inferior cu 4 dinţi (uneori 3) înguşti. Corola este albă sau alburie, cu tubul scurt, bilabiată; labiul superior cu 4 lobi scurţi, rotunjiţi, cel inferior întreg, mai lung decât cel supe rior. Staminele sunt

exserte, cu antere aproape sferice, sprijinite pe labiul inferior al corolei şi uşor curbate în sus; prezintă filamente lungi, cele posterioare cu câte un mic apendice subulat. Stilul este subţire. Sunt prezente 4 nucule, ovoidale, lungi de 1,5 -2 mm, care în mediu umed devin mucilaginoase. Planta prezintă numeroase forme horticole care după Benth. se deosebesc prin mărimea şi grosimea frunzelor, prin

mărimea florilor şi prin pubescenţa pronunţată a frunzelor (Guşuleac, 1961). Genul Ocimum cuprinde plante ierboase anuale şi perene, precum şi arbuşti, provenind din regiunile tropicale şi subtropicale

ale Asiei, Africii, Americii de Sud, şi cu o largă răspândire pe glob. Taxonomia genului este complexă, din cauza hibridării interspecifice şi

poliploidiei. Unii autori (Pushpangadan şi Bradu, 1995, cf. Telci şi colab., 2006; Labra şi colab., 2005) au recunoscut 150 de specii, Paton şi colab., (1999) (cf. Telci şi colab., 2006) a propus doar 65 de specii, pe când alţi autori acceptă existenţa a circa 35 de specii de Ocimum. Cele mai importante specii ale genului sunt Ocimum sanctum L. şi Ocimum basilicum L., ultima specie constituind obiectul nostru de studiu şi asupra căreia vom insista în mod deosebit..

Frunzele plantelor din genul Ocimum produc un ulei esenţial a cărui compoziţie a fost stabilită prin gaz-cromatografie. Acesta conţine eugenol, eugenal, carvacrol, metil-chavicol (estragol), limatrol, cariofilin. Uleiul din seminţe este compus din acizi graşi şi sitosterol, iar mucilagiul are, ca zaharuri, xiloza şi polizaharidele. Speciile cu frunze verzi conţin şi antociani.

Prezenţa eugenolului din frunze îi conferă proprietăţi antimicrobiene şi antiinflamatoare, fiind indicat şi în afecţiunile respiratorii. Menţine sănătatea tractului respirator şi plămânilor, fiind un antiinflamator. Uleiul are proprietăţi insecticide, omorând, de exemplu, ţânţarii şi iInhibă creşterea in vitro a microorganismelor Mycobacterium tuberculosis şi Micrococcus pyogenes var. aureus, datorită, mai ales,

prezenţei eugenolului şi metal-eugenolului. Extractele eterice şi alcoolice din frunze de Ocimum sanctum au demonstrat efecte semnificative împotriva bacteriei Escherichia coli. Uleiurile sale esenţiale conţin substanţe biologic active cu acţiune nematicidă, insecticidă, fungistatică şi antifungicidă (Candida albicans, Penicillium notatum, şi Microsporeum gyseum), antimicrobiană (Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis şi Escherichia coli).

Testarea efectului insecticid al uleiurilor esenţiale de Ocimum basilicum L. asupra coleopterului Callosobruchus maculates a evidenţiat că uleiurile foarte toxice, care au determinat procentaje de 40-100% în mortalitate a insectelor au fost cele care conţineau, ca principal component, eugenolul sau metil chavicolul (Pascual-Villalobos şi Ballesta-Acosta, 2003).

În literatură există relativ puţine referiri la toxicitatea componenţilor chimici ai speciilor genului Ocimum. Totuşi, se cunoaşte faptul că busuiocul comun conţine astfel de substanţe periculoase – safrolul, acidul cafeic, triptofanul, quercetinul. Triptofanul determină, de exemplu, o boală respiratorie la bovine, acidul cafeic (un acid fenolic) poate inhiba digestia la rumegătoare, iar quercetinu l este cocarcinogen al unui papilomavirus bovin.

Concluzia este că, atât la Ocimum sanctum şi Ocimum basilicum, cât şi la celelalte specii ale genului Ocimum, există o mare variaţie intraspecifică, realitate ce deschide perspective favorabile pentru ameliorare şi selecţie.

●Perovskia atriplicifolia Benth. Este originară şi creşte în zonele pietoase din Afganistan şi Pakistan şi este cunoscută pentru proprietăţile sale febrifuge şi utilizată în medicină pentru scăderea febrei, având şi utilizări culinare , dar şi decorative ori de purificare a aerului (efect de tip aerosoli). În Europa este cultivată ca plantă decorativă. (Pourmortazav i, 2003). Este o plantă cu tulpini de culoare gri-

albicioasă şi frunze lobate, adânc dinţate de culoare gri-argintat cu o lungime de 5 cm şi o lăţime de 2,5 cm. Tulpinile mature sunt lemnoase la bază iar cele tinere sunt ierboase, tulpina fiind pătratică în secţiune transversală. Tulpinile şi frunzele emană un miros specific de salvie prin strivire. La sfârşitul verii şi toamna planta produce inflorescenţe cu flori tubulare de culoare albastră sau liliachie.

Inflorescenţele pot atinge o lungime de 30 cm şi rezistă până la 3 luni. Planta creşte sub formă de tufă ce poate atinge o înălţime de 1,5 m şi o circumferinţă de 60 cm (Cox, 2002).

4

Elaborarea şi parcurgerea unui model experimental optim caracterizării filosferei la specii aparţinând genului Ocimum şi Perovskia, cultivate în condiţii naturale.

Stabilirea protocoalelor experimentale pentru analiza specifică a comunităţilor filosferei, prin adaptare la caracteristicile biologice ale speciilor testate. În vederea izolării microorganismelor din filosfera unor specii de Ocimum şi Perovskia au fost utilizate două metode:

1. amprentarea pe agar nutritiv (Tsavkelova et al., 2007): frunze din diferite regiuni ale plantei (bază şi vârf) au fost aşezate în

condiţii sterile pe suprafaţa mediului de cultură, atât pe faţa ventrală cât şi pe cea dorsală; plăcile Petri au fost ulterior incubate 72 o re la 280 C (Fig. 1 - 3).

2. însămânţarea la suprafaţa mediului de cultură (agar nutritiv) a unor diluţii zecimale provenite din suspensii microbiene în apă

distilată sterilă: frunze de Ocimum basilicum, respectiv Perovskia atriplicifolia au fost introduse în baloane cu apă distilată sterilă, agitate apoi la 210 rpm şi 280 C, timp de 30 min; din aceste suspensii au fost obţinute diluţii zecimale seriate care au fost însămânţate prin etalare (Dunca et al., 2004). Ulterior, plăcile Petri au fost incubate 72 ore la 280 C (Fig. 4, Fig. 5).

După cele trei zile de incubare, de pe suprafaţa plăcilor cu coloniile dezvoltate, s-au izolat (pe baza caracterelor macro-morfologice) mai multe tulpini bacteriene. Repicarea s-a făcut cu ajutorul ansei sterile, în eprubete cu mediu de cultură înclinat, având aceeaşi compoziţie cu cea a mediului iniţial folosit pentru izolare. Eprubetele însămânţate prin tehnica descrierii de striuri la suprafaţă au fost incubate la 280 C, timp de patru zile.

Fig. 4 – Colonii bacteriene izolate din filosfera speciei Ocimum basilicum dezvoltate pe agar nutritiv

Fig. 5 – Colonii bacteriene izolate din filosfera speciei Perovskia atriplicifolia dezvoltate pe agar nutritiv

Pentru verificarea purităţii tulpinilor izolate, dar şi pentru descrierea caracterelor micro-morfologice s-au efectuat frotiuri colorate după metoda Gram (Dunca et al., 2004) care au fost supuse examenului microscopic (1000 x).

După întocmirea colecţiei, tulpinile pure s-au păstrat la temperatura de + 40 C, fiind trecute, la intervale regulate de timp, pe mediu proaspăt. Colecţia de microorganisme astfel întocmită a servit studiilor ulterioare.

Izolarea microorganismelor din filosfera unor specii de Ocimum şi Perovskia prin tehnici diferite, pentru alegerea metodei optime de lucru.

Izolarea microorganismelor de pe frunzele de Ocimum basilicum şi Perovskia atriplicifolia s-a realizat pe parcursul anului 2009, în două etape corespunzătoare unor fenofaze diferite (vegetativ şi înflorire). Utilizând cele două metode prezentate anterior au fost izolate un număr de 25 tulpini bacteriene, respectiv 3 tulpini levuriene (Fig. 6) din filosfera speciei Perovskia atriplicifolia şi un număr de

19 tulpini bacteriene (Fig. 7) din filosfera speciei Ocimum basilicum. Toate tulpinile au fost examinate macro- şi micro-morfologic, rezultatele urmând a fi prezentate în etapa următoare, conform planului de realizare al proiectului.

Fig. 1 – Perovskia atriplicifolia - frunze bazale: amprentă pe agar nutritiv

Fig. 2 – Perovskia atriplicifolia - frunze apicale: amprentă pe agar nutritiv

Fig. 3– Ocimum basilicum - amprentă frunză pe agar nutritiv : faţă ventrală

5

Fig. 6 – Aspectul micro-morfologic al tulpinii fb 2-2 izolată din filosfera speciei Perovskia atriplicifolia

(1000 x)

Fig. 7 – Aspectul micro-morfologic al tulpinii fv 1-3 izolată din filosfera speciei Ocimum basilicum

(1000 x)

În scopul optimizării metodei de izolare a microorganismelor filosferice s-au testat cele două metode descrise mai sus:

amprentarea şi însămânţarea la suprafaţa mediului de cultură a unor suspensii în apă distilată sterilă cu microorganisme de pe suprafaţa frunzelor. Deşi a doua metodă utilizată a permis izolarea unui număr mai mare de tulpini microbiene, ne -am propus, pentru activităţile aferente următoarei etape, utilizarea ambelor metode, amprentarea prezentând totuşi avantajul unei localizări mai precise a

microorganismelor la nivelul celor două feţe foliare (ventrală şi dorsală). Rezultatele obţinute prin utilizarea amprentării ca metodă de izolare vor putea fi corelate mai bine cu investigaţiile de microscopie electronică ale limbului foliar ce vor fi realizate pe parcursul etapelor viitoare.

De asemenea, pentru izolările ulterioare, vom testa comparativ utilizarea unui sistem tampon (PBS – tampon fosfat salin) în locul apei distilate la obţinerea suspensiilor cu microorganisme de pe suprafaţa frunzelor de Ocimum basilicum şi Perovskia atriplicifolia.

Caracterizarea filosferei în corelaţie cu particularitătile morfo-anatomice şi fiziologice ale aparatului foliar şi cu producţia de

uleiuri volatile la specii de Ocimum şi Perovskia, în condiţii naturale de cultivare şi/sau condiţii de seră, în ciclul ontogenetic al plantelor.

Evidenţierea caracteristicilor micromorfologice ale suprafeţei limbului foliar la speciile de Ocimum si Perovskia luate în studiu, utilizând tehnica microscopiei de baleaj.

Material si metoda de lucru Pregătirea probelor pentru SEM. Microscopul electronic cu scanare (SEM) produce imagini prin detecţia electronilor secundari, cu energie scăzută, emisii de pe suprafaţa specimenului datorită excitării acestuia de către raza principală de electroni. In cazul SEM, raza de electroni parcurge întreg specimenul, detectorii construind o imagine prin maparea semnalelor detectate la poziţia razei.

În general, rezoluţia TEM este de regulă cu un ordin de mărime mai mare decât cea a SEM, dar, datorită faptului ca imaginea produsă de microscoapele cu scanare se bazează pe procese de suprafaţă şi nu pe transmisie, este capabil să vizualizeze probe mai mari, şi are o adâncime de penetrare mult mai mare, producând astfel imagini care sunt o bună reprezentare tridimensională a probei.

Recoltarea probelor – Prelevarea probelor se realizează de pe exemplare vii, secţionarea ţesuturilor realizându-se direct intr-o picătura de fixator (glutaraldehida). Ţesuturile se secţionează in blocuri mici (pot avea pana la 1 cm2).

Fixarea si deshidratarea - Prima etapa a fixării se realizează în glutaraldehidă 2,5% (2 ore). Probele se spală cu tampon fosfat şi apoi se realizează postfixarea cu tetraoxid de osmiu 2% (2 ore).

Deshidratarea se face în băi succesive de alcool etilic (35% , 50% , 70% , 90% , 95% , câte 15 minute şi alcool absolut – de trei ori, câte 20 minute). După deshidratarea in alcool etilic absolut probele se trec in doua bai de acetona anhidra.

Uscarea la punctul critic al dioxidului de carbon (cu EMS 850 Critical Point Dryer) – este necesară pentru prezervarea detaliilor structurale ale probei analizate. Uscarea la aer poate cauza deformări accentuate ale suprafeţelor materialelor biologice

cauzate, in principal, de tensiunea supeficială a apei. Utilizând uscarea la punctul critic al dioxidului de carbon aceasta tensiune superficială este redusă aproape la 0. În momentul atingerii punctului critic (31,10C la o presiune de 1250 psi) CO2 lichid trece direct in faza gazoasă, iar eliminarea acestuia din probe, odată cu scăderea presiunii se realizează cu păstrarea intactă a

structurilor existente.

Metalizarea probelor uscate (cu metalizorul EMS 550X Sputter Coater) este necesara pentru observarea acestora în camera de vid a SEM. Metalizarea se realizează fie cu aur, fie cu aur -paladiu. Stratul de metal depus are grosimea de 30-60 angstromi (funcţie de detaliile ce se doresc a fi observate).

Analiza probelor s-a realizat cu ajutorul microscopului electronic de baleiaj TESCAN Vega II SBH, la o acceleraţie a electronilor de 30 kV.

Măsurătorile diferiţilor parametri morfologici au fost efectuate cu ajutorul softului de morfometrie NIS – Elements furnizat de firma Nikon.

6

Pregătirea probelor pentru investigaţiile histo-anatomice Materialul vegetal a fost fixat in FEA (formol: alcool etilic 70% : acid acetic glacial 5:5:90) timp de 72 de ore, apoi spălat şi

conservat în alcool etilic 70% . Ulterior, a fost prelucrat fie prin imparafinare (secţiunile fiind colorate cu roşu ruteniu şi albastru de metilen) şi secţionate manual cu briciul botanic (şi colorate cu roşu ruteniu si verde iod). Fotografiile au fost efectuate la microscopul de cercetare

trinocular Olympus BX50 cu camera foto digitala Olympus E 330. Aspecte anatomice si micromorfologice la Ocimum basilicum

Pe frunzele de la Ocimum basilicum se pot observa peri tectori şi peri secretori pe ambele epiderme. Perii tectori sunt uniseriaţi,

formaţi din 1-5 celule cu pereţii îngroşaţi.

Perii secretori sunt de doua feluri (figurile 8, 9, 10) – peri capitaţi cu glanda unicelulară şi peri peltaţi, cu glanda pluricelulară. Perii capitaţi sunt alcătuiţi dintr-o celulă bazală, o celulă picior şi una (mai rar două) celule glandulare. Când există o singură celulă glandulară, aceasta este piriformă sau alungită; când exista două celule glandulare, acestea sunt aşezate una lângă alta (pe orizontală). Perii peltaţi

au o structură asemănătoare, cu deosebirea că glanda este alcătuita din patru celule. Uleiu l volatil produs de celulele glandulare se acumulează, ca la toate speciile de Lamiaceae, între peretele extern al celulelor glandulare şi cuticulă. Aceasta duce la detaşarea cuticulei de celulele glandulare şi la apariţia unui spaţiu de depozitare comun pentru uleiurile volatile. Când spaţiul subcuticular se umple cu produsul de secreţie, perii glandulari, intraţi în faza postsecretoare, degenerează. La perii capitaţi s-a observat doar o uşoară mărire a

spaţiului subcuticular (în acest caz materialul secretat se acumulează în lumenul celulei glandulare (Werker et al, 1993). Perii secretori ajung la maturitate (în faza secretoare) chiar pe frunzele foarte tinere (0,5-1mm lungime). Pe frunzele tinere deja se

pot observa peri secretori în faza post-secretoare. Pe frunzele ajunse la maturitate se pot observa peri în toate stadiile de dezvoltare;

acest fapt sugerează o continuă histogeneza a perilor glandulari pe toată durata dezvoltării frunzelor. Pe frunzele bazale, perii glandulari se pot observa mai ales în etapa post-secretoare, datorita încetării formării de noi peri odată cu diferenţierea completă a celulelor epidermice şi încetarea creşterii în suprafaţă a frunzei.

Fig. 8 – Tipuri de peri glandulari de pe frunze de v ârste diferite de Ocimum basilicum: A – păr peltat în faza pre-secretoare, B – păr capitat în faza pre-secretoare, C – păr peltat în faza pre-secretoare (stânga) şi post-secretoare (dreapta), D – păr capitat cu glanda bicelulară, E, F – peri peltaţi în faza secretoare, G,

H - peri peltaţi în faza post-secretoare şi peri capitaţi în faza pre-secretoare (original)

A

. B

.

C

.

D

.

E

.

F

.

G

.

H

.

Fig. 9 – Aspecte electrono-microscopice (SEM) ale perilor glandulari de pe frunzele

foarte tinere (0,5 – 1mm): A – aspect general al primordiului, cu peri tectori şi secretori, B – detaliu cu un păr capitat cu glanda unicelulară, C – detaliu cu peri capitaţi cu glanda bicelulară ş peri peltaţi cu glanda tetracelulară, D – păr peltat în faza

secretoare, E – vârful primordiului foliar cu peri tectori şi puţini peri secretori (original)

7

Pe ambele epiderme ale frunzelor tinere se întâlnesc peri aflaţi în toate stadiile de dezvoltare (de la peri abia iniţiaţi, în fazele pre -secretoare

şi secretoare, mai puţini în faza post-secretoare). Diametrul glandei secretoare (atât la perii peltaţi cat si la cei capitaţi) este mai mare pe epiderma superioara) (Tab.1). De asemenea, densitatea perilor glandulari este mai mare pe epiderma superioara decât pe cea inferioară.

Tabel 1 – Variaţia diametrului glandei şi a densităţii perilor secretori pe frunze tinere (valorile reprezintă media ± deviaţia standard)

Epiderma inferioară Epiderma superioară

Diametru glanda tetracelulară (μm) 62.29±3.32 32.69±3.34

Diametru glanda unicelulară (μm) 25.09±4.22 23.91±2.43

Diametru glanda bicelulară (μm) 32.75±5.61 16.59±1.4

Densitate peri cu glanda tetracelulară (nr/μm2) 12.3±1.87 42.32±9.76

Densitate peri cu glanda bicelulară (nr/μm2) 17.3±2.32 23.7±2.87

Densitate peri cu glanda unicelulară (nr/μm2) 20.3±1.56 60.43±12.98

Aspecte anatomice şi micromorfologice la Perovskia atriplicifolia

În urma analizei la microscopul fotonic şi la cel electronic cu baleiaj, la nivelul epidermei inferioare şi superioare a frunzei,

precum şi pe sepale, petale şi antere, s-au observat următoarele tipuri de peri (figurile 11, 12, 13, 14): peri secretori cu glanda bicelulară, peri secretori cu glanda tetracelulară, peri secretori cu glanda multicelulară (formată din 10 celule) şi peri tectori pluricelulari ramificaţi.

La nivelul organelor de reproducere, pe petale si sepale am observat aceleaşi tipuri de peri, iar pe stamine doar peri secretori

cu glanda multicelulară. La maturitate, glanda secretoare pluricelulară prezintă un spaţiu subcuticular mare. Această cavitate se va umple cu ulei volatil

odată cu începerea procesului de secreţie. Spaţiul celular care ia astfel naştere se măreşte pe măsură ce uleiul este secretat şi eliberat la

nivelul acestei cavităţi. Produşii de secreţie trec prin membrana plasmatică şi peretele celulelor secretoare şi se acumulează în această cavitate de acumulare a produşilor de secreţie. Atunci când cuticula se rupe, produşii de secreţie sunt eliberaţi. La perii secretori cu glanda pluricelulară acest spaţiu subcuticular depăşeşte în înălţime celulele glandulare propriu-zise.

A

.

B

.

C

.

D

.

Fig. 10 – Aspecte electrono-microscopice (SEM) ale perilor glandulari de pe frunzele tinere: A – epiderma superioară, B –

epiderma inferioară, C – păr glandular capitat de pe epiderma superioară, D – păr peltat de pe epiderma superioară (original)

A.

8

Tabel 2 – Variaţia diametrului glandei şi a densităţii perilor secretori pe frunze tinere (valorile reprezintă media ± deviaţia standard)

Diametrul glandei secretoare este mai mare în cazul perilor de pe epiderma superioară, atât în cazul perilor peltaţi. cât şi a perilor

capitaţi (Tab. 2). Densitatea lor insă este mai mare pe epiderma inferioară. Măsurătorile s-au realizat la frunze situate în treimea mijlocie

a tulpinii. Au fost analizaţi, la microscopul electronic cu baleiaj, perii secretori de pe organele de reproducere. Pe sepale şi petale perii peltaţi

sunt foarte abundenţi atât în epiderma superioară, cât şi în cea inferioară. Perii scurţi, capitaţi sunt prezenţi îndeosebi pe faţa externă a

sepalelor. La petale, perii peltaţi apar de timpuriu, îndeosebi pe faţa externă (inferioară); pe măsură ce tubul corolei creşte, ei devin tot mai numeroşi, îndeosebi la vârful acesteia, atât pe faţa superioară, cât şi pe cea inferioară. De asemenea, perii peltaţi, cu glanda multicelulară sunt vizibili în şanţul anterior al anterelor.

Epiderma inferioară Epiderma superioară

Diametru glanda multicelulară (μm) 48.39±7.23 56.09±4.64

Diametru glanda bicelulară (μm) 17.02± 2.2 18.94± 2.7

Densitate peri cu glanda multicelulară (nr/μm2) 52.56±5.87 44.54±3.65

Densitate peri cu glanda bicelulară (nr/μm2) 92.45±11.34 64.81±9.45

Fig. 11 – Tipuri de peri glandulari de pe frunze de vârste diferite de Perovskia atriplicifolia: A – păr peltat cu glanda multicelulară în faza secretoare, B, C - păr peltat cu glanda multicelulară în faza post-secretoare, D – păr peltat cu glanda tetracelulară în faza secretoare, E - păr capitat cu glanda bicelulară, (original)

Fig. 12 – Aspecte electrono-microscopice (SEM) ale perilor glandulari de pe frunzele din treimea mijlocie a tulpinii: A – epiderma inferioară, B – păr glandular peltat cu glanda tetracelulară de pe epiderma superioară, C – păr glandular peltat cu glanda

multicelulară de pe epiderma inferioară, D – păr glandular capitat de pe epiderma superioară (original)

9

Extracţia şi caracterizarea uleiurilor volatile la diferite specii de Ocimum şi Perovskia prin metoda gaz cromatografică

Deşi proprietăţile antimicrobiene ale uleiurilor volatile şi ale componenţilor lor au fost studiate în trecut, mecanismul acţiunii lor

nu a fost studiat în detaliu. Ţinând cont de numărul mare al diferitelor grupuri de compuşi chimici prezenţi în compoziţia uleiurilor volatile este foarte posibil ca activitatea lor antimicrobiană să nu poată fi atribuită unui mecanism specific ci existenţei unui număr mare de locaţii

ţintă în celulă. Nu toate aceste mecanisme reprezintă ţinte separate, unele reprezintă consecinţe ale altor mecanisme ţintă. O importantă caracteristică a uleiurilor volatile şi a compuşilor lor este hidrofobia, aceasta permiţându-le să afecteze structura lipidică a membranei celulare bacteriene şi să le crească permeabilitatea, celulele pierzând ioni şi alte componente celulare.

Structura chimică a compuşilor individuali ai uleiurilor volatile afectează modul lor specific de acţiune antibacteriană. A fost confirmată importanţa prezenţei grupării hidroxil în cadrul compuşilor fenolici cum sunt carvacrolul şi thimolul. Poziţia acestei grupări în cadrul inelului fenolic nu pare să afecteze mult gradul activităţii antibacteriene. Se pare că acţiunea thimolului asupra speciilor Bacillus

cereus, Staphylococcus aureus şi Pseudomonas aeruginosa este comparabil cu cel al carvacrolului de exemplu.

Fig. 13 – Aspecte electrono-microscopice (SEM) ale perilor glandulari de pe sepale şi petale: A – sepală şi petală, B – păr glandular peltat cu glanda multicelulară de pe petală, C, D – peri glandulari peltaţi cu glanda multicelulară de pe sepale,

(original)

C

.

A

.

B

.

D

.

Fig. 14 – Aspecte electrono-microscopice (SEM) ale perilor glandulari de pe antere şi sepale: A – anteră (ansamblu), B – păr glandular peltat de pe anteră C - păr glandular capitat cu glanda bicelulară, D - păr glandular peltat cu glanda multicelulară de

pe sepale (original)

10

Uleiurile volatile au proprietăţi antibacteriene, antifungice, antivirale, insecticide şi antioxidante, unele uleiuri fiind u tilizate chiar în tratarea cancerului, iar altele în aromaterapie, parfumerie şi pentru conservarea alimentelor. Uleiurile volatile reprezintă o sursă bogată de compuşi biologici activi, proprietăţile antifungice ale extractelor obţinute din plante medicinale, în special cele ale uleiurilor volatile stârnind un interes din ce în ce mai mare. O gamă largă de compuşi vegetali din cadrul acestor uleiuri prezintă activitate antimicrobiană

specifică cât şi generală şi un potenţial efect antibioitic. Uleiurile volatile şi extractele vegetale au fost utilizate de mii de ani în medicina alternativă, industria farmaceutică, te rapii

naturiste şi conservarea alimentelor, aceste uleiuri fiind potenţiale surse de compuşi antimicrobieni noi în special împotriva patogeni lor

bacterieni. O caracteristică importantă a uleiurilor volatile şi a componenţilor lor o reprezintă hidrofobia, proprietate ce le permite să partiţioneze lipidele din cadrul membranelor celulare bacteriene şi din cadrul mitocondriilor, afectând structurile celulare şi făcându-le mai permeabile; pierderea moleculelor şi a ionilor indispensabili va duce la moartea celulelor bacteriene. Alte studii au arătat că bacteriile

Gram-pozitive sunt mai rezistente faţă de efectul uleiurilor volatile decât cele Gram–negative. Au fost efectuate numeroase studii pentru a demonstra eficacitatea uleiurilor volatile ca şi agenţi antimicrobieni cu scopul de a

putea fi folosite ulterior pe scară largă în scopuri comerciale. Unul dintre aceste studii, realizat de către Prabuseenivasan şi colab. în 2006 a avut ca scop testarea efectului antimicrobian a 21 de uleiuri volatile utilizate în medicina tradiţională indiană asupra unui număr de

patru tulpini de bacterii Gram–negative (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeriginosa, Proteus vulgaris) şi două tulpini bacteriene Gram–pozitive (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus). Rezultatele obţinute au arătat faptul că uleiurile selectate au avut activitate antibacteriană diferită. Din 21 de uleiuri volatile 19 au prezentat activitate antibacteriană asupra uneia sau mai multe

bacterii. Uleiurile de scorţişoară, lămâie verde, muşcată, rozmarin, portocală, lămâie şi cuişoare au avut activitate antibacteriană maximă asupra tuturor bacteriilor test, în timp ce uleiurile de anason, eucalipt şi camfor nu au inhibat dezvoltarea nici uneia dintre bacteriile test. Uleiul de busuioc a avut un efect antibacterian moderat. Nu au fost sesizate diferenţe evidente între bacteriile Gram–negative şi cele

Gram–pozitive în ceea ce priveşte susceptibilitatea acestora. Uleiurile volatile care sunt caracteristice plantelor din Familia Lamiaceae nu sunt singurii metaboliţi secundari conţinuţi de către plantele aromatice, compuşii fenolici fiind de asemenea întâlniţi (Cuvelier şi colab., 1996; Van Den Broucke, 1982). Avantaje le pe care le au aceste plante de pe urma metaboliţilor secundari sunt încă intens dezbătute în ciuda recunoaşterii activităţii lor biologice. Atât

terpenele cât şi compuşii fenolici sunt importanţi în apărarea plantelor împotriva insectelor şi a animalelor ierbivore, în încercarea lor de a câştiga spaţiu şi resurse faţă de plantele competitoare (Harborne, 1997; Vakou, 1992) cât şi împotriva microorganismelor patogene (Jenssen şi colab., 1987; Bennett şi colab., 1994).

Metaboliţi secundari ca alcaloizi, izoprenoizi şi acizi fenolici sunt eliminaţi sub formă de exudate de către frunze şi sunt eliminaţi la suprafaţa acestora (Fiala, 1990). S-a arătat faptul că mulţi dintre ei inhibă creşterea fungilor, a bacteriilor şi a virusurilor (Grayer şi Harborne, 1994). De exemplu, s-a arătat că uleiurile volatile produse de către perii glandulari de pe suprafaţa frunzelor sunt active faţă de

un spectru larg de microorganisme (Deans şi Ritchie, 1987). Totuşi, efectele uleiurilor volatile nu sunt întotdeauna negative; în unele cazuri acestea sporesc creşterea microbiană (Vokou, 1999), felul în care diferiţi nutrienţi, metaboliţi primari şi secundari de la nivelul frunzei influenţează colonizarea microbiană la nivelul filosferei rămânând, încă, incomplet elucidată.

Materialul vegetal analizat a fost reprezentat de tulpini şi frunze proaspăt recoltate de la plante aflate în etapa de anteză în cazul speciei Ocimum basilicum L., de frunze proaspăt recoltate de la plante aflate în etapa vegetativă (două populaţii de plante, care au constituit tot atâtea probe de lucru), precum şi de frunze şi flori proaspăt recoltate de la plante aflate în etapa de anteză în cazul speciei

Perovskia atriplicifolia Benth. Metoda de extracţie a uleiurilor volatile

În vederea extracţiei uleiurilor volatile s-a utilizat un dispozitiv de hidrodistilare de tip Clevenger ce se bazează pe recircularea

apei, pentru eliminarea pierderilor de ulei volatil prin dizolvare în apă. Încălzirea s-a realizat la foc direct, instalaţia fiind permanent monitorizată pentru a evita supraîncălzirea vasului de distilare. Materialul vegetal a fost introdus în balonul aparatului după ce a fost cântărit în prealabil, adăugându-se 500 ml de apă, iar distilarea a durat aproximativ 3-4 ore. Analiza cromatografică a uleiurilor volatile

În vederea analizei calitative a uleiurilor volatile s-a utilizat metoda cromatografiei GC-MS (gas chromatography - mass spectrometry). Această metodă presupune separarea şi determinarea componenţilor pe baza distribuţiei acestora între două faze :

staţionară: solid activ sau lichid sub formă de peliculă pe suport solid inert;

mobilă: gaz (are rolul de a traversa componenţii de-a lungul fazei staţionare şi de a-i elua, deplasa sau dezlocui în urma reţinerii). Analiza calitativă a uleiurilor volatile s-a efectuat în cadrul Centrului de Cercetări pentru Studiul Calităţii Produselor Horticole a l

Facultăţii de Horticultură a Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Bucureşti, aparatul utilizat fiind un gas-cromatograf GC-

MS Agilant.

Analiza calitativă a uleiului volatil la speciile de plante aromatice luate în studiu

Ocimum basilicum L. În urma investigaţiilor asupra uleiului volatil la specia Ocimum basilicum L. au fost evidenţiaţi compuşii caracteristici, care dau

proprietăţi specifice fiecărei probe. Nu s-a evidenţiat prezenta metil cinamatului şi a linalolului în nici una dintre cele două probe studiate.

11

Numărul compuşilor identificaţi în materialul biologic investigat este de 28 de compuşi în prima probă şi de 25 de compuşi în ce-a de-a doua probă. Din totalul compuşilor, 17 sunt comuni pentru ambele probe, dintre care 11 ating valorile procentuale cele mai ridicate în ambele eşantioane, dând practic, caracterul comun aromat al uleiurilor respective.

În funcţie de concentraţie, pe primele 5 poziţii, în cazul ambelor probe studiate, se află următorii compuşi ai uleiului vola til:

germacren D (24.103, 10.267% ), β - elemen (14.67, 10.010% ), r - cadiden ( 5.632, 9.095/), α - guaien (5.095, 3.487) şi γ- Elemen (5.915, 1.504% ) (Tab. 3).

Decelarea unor indicatori biochimici şi funcţionali în aprecierea relaţiei plantă gazdă -filosferă.

Testarea in vitro a proprietăţilor bacteriostatice şi bactericide ale

uleiurilor volatile extrase din specii de Ocimum şi Perovskia utilizând microorganisme test de colecţie.

Pentru testarea efectelor antimicrobiene ale uleiurilor volatile extrase din

specii de Ocimum şi Perovskia au fost selectate două bacterii test ce prov in din colecţia de microorganisme a Laboratorului de Microbiologie, Facultatea de Biologie, Universitatea „Alexandru Ioan Cuza” din Iaşi:

Escherichia coli ATCC 25922: bacterie Gram negativă

Staphylococcus aureus ATCC 25923: bacterie Gram pozitivă În vederea ev idenţierii efectelor antibacteriene a fost utilizată metoda

difuzimetrică pe agar nutritiv (Lorian, 2005), cu două variante experimentale: comprimate sterile de hârtie de filtru (ø = 6 mm.) au fost

impregnate cu un volum de 25 μl probă (uleiuri volatile de Ocimum basilicum / Perovskia atriplicifolia în soluţie apoasă 10 % dimetil sulfox id – DMSO; s-au utilizat următoarele diluţii: 1:1, 1:5, 1:10), respectiv un volum de 25 μl martor (soluţie apoasă 10 % DMSO).

în cilindri de oţel inox idabil (ø = 4 mm, 10 mm înălţime) a fost introdus un volum de 250 μl probă (uleiuri volatile de Ocimum basilicum / Perovskia atriplicifolia în concentraţiile menţionate mai sus), respectiv 250 μl martor (soluţie apoasă 10 % DMSO).

Plăcile Petri cu mediul de cultură au fost însămânţate la suprafaţă prin scăldare (anterior depunerii comprimatelor sau cilindrilor metalici) folosind preculturi ale celor două bacterii test (densitate optică – DO la 600 nm = 0,211 pentru Escherichia coli, respectiv 0, 231 pentru Staphylococcus aureus) şi incubate la 370 C timp de 24 ore. În cazul reacţiilor pozitive, în jurul comprimatelor sau cilindrilor metalici, a apărut o zonă de inhibiţie a creşterii al cărei diametru a fost măsurat în mm.

Datorită răspândirii fenomenului de rezistenţă la antibiotice în rândul patogenilor, succesul tratamentelor eficace ale bolilor provocate de microorganisme este pus în pericol. Din acest motiv , în ultimii ani, s-au făcut eforturi masive în încercarea de a identifica tratamente alternative căii clasice reprezentate de antibiotico-terapie. O posibilă soluţie este utilizarea unor produse naturale, aşa cum sunt uleiurile volatile extrase din diferite plante. Aceste uleiuri au fost studiate din perspectiva potenţialului lor antimicrobian şi supuse unui proces de selecţie în vederea utilizării lor ca tratamente alternative a unor infecţii de natură microbiană (Tepe et al., 2004).

Numeroase studii au demonstrat că uleiurile volatile prezintă proprietăţi antibacteriene, antifungice, antiv irale, insecticide şi antiox idante (Burt, 2004). Unele au fost folosite în terapia unor forme de cancer (Sy lvestre et al., 2006), altele în conservarea alimentelor (păstrare activă), sau ca sursă de compuşi biologic activ i. Din aceste motive este de aşteptat ca în compoziţia chimică a uleiurilor volatile provenite de la diferite specii de plante să fie descoperite substanţe cu proprietăţi antimicrobiene având acţiune specifică sau generală asupra microorganismelor (Prabuseenivasan et al., 2006).

Uleiurile volatile (numite şi uleiuri esenţiale) sunt compuşi aromatici obişnuiţş din diferite părţi ale plantelor (flori, muguri, seminţe, mlădiţe, scoarţă, lemn, fructe sau rădăcini). Pot fi obţinute prin fermentaţie sau extracţie, însă cea mai utilizată metodă din punct de vedere comercial este hidrodistilarea. Se estimează că până în prezent se cunosc peste 3000 de uleiuri volatile, din care aprox imativ 300 au importanţă practică în industria parfumurilor. Uleiurile volatile conţin un amestec de compuşi care din punct de vedere chimic sunt derivaţi din terpene sau din compuşii ox igenaţi ai acestora.

Cea mai largă utilizare în Uniunea Europeană a uleiurilor volatile se înregistrează în industria alimentară (condimente), cosmetică şi farmaceutică. Proprietăţile antibacteriene ale uleiurilor volatile sau ale subcomponentelor acestora au fost exploatate sub forma unor produse comerciale diferite cum ar fi: preparate pentru obturarea canalele radiculare dentare, antiseptice (Cox et al., 2000), aditiv i alimentari folosiţi pentru furajarea animalelor.

Uleiurile obţinute din camfor, cedru, scorţişoară, lămâie, mentă, busuioc, portocal, rozmarin, miez de nucă ş.a. sunt folosite de foarte multă vreme în medicina tradiţională a multor popoare, pentru proprietăţile lor: antimicrobiene şi antifungice (rozmarin, busuioc, levănţică), antiinflamatorii (busuioc), antidiabetice (scorţişoară), antitumorale (mentă, portocal), imunomodulatorii (tei), etc.

Busuiocul (Ocimum basilicum) este una din cele mai populare plante utilizate ca şi condiment, având însă aplicaţii extinse şi în industria parfumurilor, produselor de îngrijire orală, etc. Recent, uleiurile volatile extrase din busuioc au devenit agenţi antimicrobieni utilizaţi în domenii de vârf, cum ar fi ambalarea activă a alimentelor, având un risc scăzut pentru consumatori (Miltz et al., 1995).

Tabel 3 - Numărul compuşilor identificaţi în cele două

probe de Ocimum basilicum L.

recoltate în stadiu de anteză

12

Din aceste considerente, prezentul studiu şi-a propus investigarea potenţialului antimicrobian a unor uleiuri extrase din busuioc (Ocimum basilicum) şi Perovskia atriplicifolia utilizabile ca agenţi antimicrobieni în scopuri comerciale.

În acest scop s-a utilizat metoda difuzimetrică pe agar nutritiv (Lorian, 2005), folosind comprimate de hârtie de filtru sau cilindri metalici din oţel inox idabil. Pentru stimularea difuziei uleiurilor testate în mediul de cultură, atât în probă cât şi în martor s-a adăugat Tween 80, 0,5 % v/v (Prabuseenivasan et al., 2006). Ca şi control, pe suprafaţa mediului de cultură au fost adăugate comprimate standard conţinând gentamicină (10 μg/disc) – Fig. 16 şi streptomicină (25 μg/disc). Diametrele zonelor de inhibiţie (exprimate în mm) reprezintă media a trei măsurători succesive.

Analiza uleiurilor volatile extrase din Perovskia atriplicifolia, utilizând ambele variante experimentale, a demonstrat că efectul antimicrobian este exercitat doar asupra bacteriei Gram pozitive testate - Staphylococcus aureus (Fig.15, Fig. 16). Zone de inhibiţie cu diametre medii de aprox. 24 mm au fost ev idenţiate doar în cazul testării uleiurilor diluate 1:1 cu DMSO 10 % în soluţie apoasă, folosind metoda cu comprimate de hârtie. De menţionat faptul că utilizarea unui control reprezentat prin comprimate de gentamicină a permis măsurarea unor diametre ale zonelor de inhibiţie foarte asemănătoare cu cele obţinute în cazul precedent – aprox. 25 mm (Fig. 16). Prin urmare, putem afirma că uleiul extras din Perovskia atriplicifolia, testat în condiţiile noastre experimentale, exercită asupra speciei Staphylococcus aureus un efect antibacterian comparabil cu cel indus de utilizarea antibioticului gentamicină. Aceleaşi efecte asupra bacteriei test, induse de uleiuri volatile extrase din specii ale genului Perovskia (P. abrotanoides), sunt menţionate în literatura de specialitate şi în cazul utilizării altor antibiotice: vancomicină şi eritromicină (Mahboubi et al., 2009).

Zone de inhibiţie ale creşterii au fost ev idenţiate şi în cazul utilizării metodei cu cilindri metalici, atât pentru diluţia 1:1 cât şi pentru 1:5, însă diametrele măsurate sunt mai mici în comparaţie cu cele înregistrate la folosirea comprimatelor de hârtie (Fig. 17). O posibilă explicaţie a diferenţelor înregistrate la utilizarea celor două variante experimentale este legată de gradul mai mare de volatilizare al uleiurilor la folosirea cilindrilor metalici, fapt ce împiedică difuzia probei în mediul de cultură (Burt, 2004). Deşi s-a utilizat o perioadă de predifuzie de 2 ore la 40 C înainte de incubare (Sittiwet, 2009), nu am putut preîntâmpina efectul volatilizării accelerate a uleiurilor testate la temperatura de termostatare (370 C).

Potenţialul antimicrobian al uleiul volatil extras din plantele de Perovskia atriplicifolia poate fi datorat prezenţei unor compuşi al căror efect inhibitor asupra creşterii bacteriei Staphylococcus aureus este demonstrat de literatura de specialitate: α-terpineol (Cosentino et al., 1999) şi carvacrol (Cosentino et al., 1999; Lambert et al., 2001).

La bacteria Escherichia coli, nici o diluţie obţinută din uleiul volatil testat nu a avut efect inhibitor asupra creşterii, în condiţiile utilizării ambelor variante experimentale (Fig, 16 şi Fig. 18). Absenţa efectului antibacterian în acest caz este confirmată şi de rezultatele raportate în literatura de specialitate de alţi specialişti (Basher et al., 1997; Mahboubi et al., 2009).

Rezultatele obţinute în cazul testării uleiului extras din plantele de Ocimum basilicum au ev idenţiat ex istenţa unui potenţial antimicrobian manifestat atât faţă de bacteriile Gram pozitive (Staphylococcus aureus), cât şi faţă de cele Gram negative (Escherichia coli).

Efecte de inhibare a creşterii, cu diferite intensităţi, s-au obţinut la testarea bacteriei Staphylococcus aureus, în cazul tuturor diluţiilor utilizate, cele mai mari zone de inhibiţie înregistrându-se în cazul diluţiei 1:1 (Fig. 19, Tab. 4). Aceste efecte pot fi explicate prin prezenţa, în compoziţia uleiului investigat a unor compuşi ca: α-pinen (Mahboubi et al., 2009), metil cav icol (Baratta et al., 1988) cunoscuţi ca având efecte inhibitoare asupra creşterii stafilococului auriu.

Cel mai important efect inhibitor datorat utilizării uleiului extras din plantele de busuioc s-a înregistrat în cazul bacteriei Escherichia coli. Diametrele zonelor de inhibiţie (aprox. 56 mm), ev idenţiate pentru diluţia 1:1, depăşesc pe cele înregistrate în cazul controlului reprezentat de comprimate standard de streptomicină (25 μg/disc) (Prabuseenivasan et al., 2006) – Fig. 20. Activ itatea antibacteriană maximă a fost ev idenţiată la cea mai mare concentraţie de ulei testată (diluţia 1:1) - (Tab. 4).

Informaţiile din literatura de specialitate demonstrează că acest efect inhibitor este determinat de prezenţa, în compoziţia uleiurilor de busuioc, a unor compuşi ca: linalool, carvacrol, timol, citral şi eugenol (Benchaar et al., 2006; Burt et al., 2007; Helander et al., 1998; Hussain et al., 2008). Nici unul din aceşti compuşi nu a fost identificat în urma analizelor cromatografice efectuate pe probele de ulei obţinute în condiţiile noastre experimentale. Prin urmare, activ itatea antimicrobiană a uleiului de busuioc testat se datorează cu siguranţă altor substanţe al căror potenţial urmează a fi identificat pe parcursul etapelor ulterioare.

Experimentele noastre au demonstrat că uleiurile volatile extrase din busuioc prezintă un efect antimicrobian asupra unui spectru larg de microorganisme (Gram pozitive şi negative), fapt confirmat şi de literatura de specialitate (Suppakul et al., 2003).

Fig. 15 – Efectul antibacterian al uleiului de Perovskia atriplicifolia asupra tulpinii de Staphylococcus aureus – metoda

cu comprimate de hârtie

Fig. 16 – Efectul antibacterian al uleiului de Perovskia atriplicifolia asupra tulpinii de Escherichia coli – metoda cu

comprimate de hârtie

comprimat

gentamicină

1

zonă de inhibiţie a

creşterii

3

4

2

1

3

2

4

13

Fig. 17 – Efectul antibacterian al uleiului de Perovskia

atriplicifolia asupra tulpinii de Staphylococcus aureus – metoda cu cilindri metalici

Fig. 18 – Efectul antibacterian al uleiului de Perovskia

atriplicifolia asupra tulpinii de Escherichia coli – metoda cu cilindri metalici

Fig.19 – Efectul antibacterian al uleiului de Ocimum

basilicum asupra tulpinii de Staphylococcus aureus –

metoda cu comprimate de hârtie

Fig. 20 – Efectul antibacterian al uleiului de Ocimum

basilicum asupra tulpinii de Escherichia coli – metoda cu

comprimate de hârtie Legendă:

1 – martor = DMSO 10 % sol. Apoasă; 2 – ulei v olatil, diluţia 1:1 în DMSO 10 %; 3 – ulei v olatil, diluţia 1:5 în DMSO 10 %; 4 – ulei v olatil, diluţia 1:10 în DMSO 10 %

Tabel 4 – Aprecierea efectului antibacterian al uleiului extras din plante de Ocimum basilicum

Diluţia utilizată Diametrul zonei de inhibiţie a creşterii (mm)

Staphylococcus aureus Escherichia coli

1:1 20 56

1:5 14 31

1:10 12 25

Testarea in vitro a efectelor uleiurilor volatile obţ inute din speciile de Ocimum şi Perovskia asupra microorganismelor

filosferice proprii plantelor gazdă.

O parte din tulpinile bacteriene izolate pe parcursul anului 2009 din filosfera speciilor Perovskia atriplicifolia şi Ocimum

basilicum au fost supuse testării în vederea identificării potenţialului antimicrobian al uleiurilor volatile provenite de la aceleaşi plante. În urma analizelor efectuate, urmând protocolul prezentat anterior, am demonstrat că uleiurile testate nu exercită un efect inhib itor asupra bacteriilor provenite din filosfera plantelor utilizate pentru extracţie (F ig. 21-24). Absenţa activităţii antimicrobiene a unor produşi ai plantelor investigate asupra propriei comunităţi filosferice poate fi explicată prin mecanismele de adaptare la care apelează respectivele

microorganisme pentru a putea supravieţui acestui tip de habitat (Morris et al., 1996).

Fig. 21 – Efectul antibacterian al uleiului propriu asupra tulpinii

izolate din filosfera speciei Perovskia atriplicifolia

Fig. 22 – Efectul antibacterian al uleiului propriu asupra tulpinii

izolate din filosfera speciei Perovskia atriplicifolia

1

3

4

2

1

3

2

1

3

4 2

1

3

4

2

zonă de

inhibiţie a

creşterii

1

3

4

2

1

3

2

4

14

Fig. 23 – Efectul antibacterian al uleiului propriu asupra tulpinii fv 1-

3 izolată din filosfera speciei Ocimum basilicum

Fig. 24 – Efectul antibacterian al uleiului propriu asupra tulpinii fv 1-

3 izolată din filosfera speciei Ocimum basilicum

Legendă: 1 – martor = DMSO 10 % sol. Apoasă; 2 – ulei v olatil, diluţia 1:1 în DMSO 10 %; 3 – ulei v olatil, diluţia 1:5 în DMSO 10 %; 4 – ulei v olatil, diluţia 1:10 în DMSO 10 %

Considerăm deci că: Uleiul extras din Perovskia atriplicifolia exercită asupra speciei Staphylococcus aureus un efect antibacterian comparabil cu cel indus de

utilizarea antibioticului gentamicină. Nu a fost ev idenţiat nici un efect asupra bacteriei Gram negativ testate (Escherichia coli). Efectul inhibitor indus asupra creşterii bacteriei test poate fi pus pe seama prezenţei α-terpineolului şi carvacrolului în compoziţia chimică a uleiului testat. Uleiurile volatile extrase din plantele de Ocimum basilicum au prezentat un potențial antimicrobian manifestat atât faţă de Staphylococcus aureus, cât şi faţă de Escherichia coli. Inhibarea creşterii stafilococului auriu se poate datora α-pinenului şi metil cav icolului, compuşi ev idenţiaţi cromatografic în compoziţia uleiului de busuioc. Activ itatea antimicrobiană a uleiului de busuioc asupra bacteriei Escherichia coli nu se datorează unor compuşi ca linalool, carvacrol, timol, citral şi eugenol. Uleiurilor volatile obţinute din speciile de Ocimum şi Perovskia nu prezintă activ itate antimicrobiană asupra microorganismelor filosferice proprii.

Bibliografie BARATTA, M. T., DORMAN, H. J. D., DEANS, S. G., FIGUEIREDO, A. C., BAROSO, J. G. AND RUBERTO, G. - 1988 - Antimicrobial and antiox idant

properties of some commercial essential oils. FlaVour Fragrance J 13: 235-244. BOSABALIDIS A. M., SKOUL M.- 1998 - A comparative study of the glandular trichomes on the upper and low er leaf surfaces of Origanum × intercedens,

Rech. J. Essent. Oil Res., 10: 277-286.

BASHER, K. H. C., OZEK, T., DEMIRCHAKMAK B., ABDUGANIEV, B. Y., NURIDDINOV, K. R., ARIPOV, K. N., DORIEV, A. S. AND KARATAEVA, C. S.- 1997- Essential oil of Perovskia angustifolia from Ky rgy zy stan. Chemistry of Natural Compounds 33: 296-298.

BENCHAAR, C., PETIT, H. V., BERTHIAUME, R., WHYTE, T. D. AND CHOUINARD, P. Y.- 2006 - Effects of addition of essential oils and monensin premix on digestion, ruminal fermentation, milk production and milk composition in dairy cow s. Journal of Dairy Science 89: 4352-4364.

BOZZOLA J, RUSSELL L. D.- 1998 - Electron Microscopy , 2nd Edition, BIOS Scientific Publishers. BURT, S. - 2004- Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods-a review. International Journal of Food Microbiology 94(3): 223-

253. BURT, S. A., FLEDDERMAN, M. J., HAAGSMAN, H. P., VAN KNAPEN, F. AND VELDHUIZEN, E. J. A. - 2007- Inhibition of Salmonella enterica serotype

Enteritidis on agar and raw chicken by carv acrol v apour. International Journal of Food Microbiology 119(3): 346-350. COSENTINO, S., TUBEROSO, C. I. G., PISANO, B., SATTA, M., MASCIA, V., ARZEDI, E. AND PALMAS, F. - 1999 - In v itro antimicrobial activ ity and

chemical composition of Sardinian Thymus essential oils. Letters in Applied Microbiology 29: 130– 135. COX, S. D., MANN, C. M., MARKHAM, J. L., BELL, H. C., GUSTAFSON, J. E., WARMINGTON, J. R. AND WYLLIE, S. G. - 2000 - The mode of antimicrobial

action of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). Journal of Applied Microbiology 88(1): 170-175. DUNCA, S., AILIESEI, O., NIMITAN, E. AND ŞTEFAN, M. - 2004 - Microbiologie aplicată. Iasi, Editura Tehnopress. HAWKES P W, SPENCE J C.- 2008 - Science of Microscopy , Springer Verlag New York. HELANDER, I. M., ALAKOMI, H.-L., LATVA-KALA, K., MATTILA-SANDHOLM, T., POL, I., SMID, E. J., GORRIS, L. G. M. AND VON WRIGHT, A. - 1998 -

Characterization of the action of selected essential oil components on Gram-negativ e bacteria. Journal of Agricultural and Food Chemistry 46: 3590-3595.

HUSSAIN, A. J., ANWAR, F., SHERAZ, S. T. H. AND PRZYBYLSKI, R. - 2008 - Chemical composition, antiox idant and antimicrobial activ ities of basil (Ocimum basilicum) essential oils depends on seasonal v ariations. Food Chemistry 108 986-995.

LAMBERT, R. J. W., SKANDAMIS, P. N., COOTE, P. AND NYCHAS, G. J. E. - 2001 - A study of the minimum inhibitory concentration and mode of action of oregano essential oil, thy mol and carv acrol. Journal of Applied Microbiology 91: 453–462.

LORIAN, V. - 2005 - Antibiotics in laboratory medicine, Lippincott Williams & Wilkins. MILTZ, J., PASSY, N. AND MANNHEIM, C. H. - 1995 - Trends and applications of active packaging systems. Food and Food Packaging Materials-Chemical

Interactions. P. Ackerman, M. Jagerstad and T. Ohlsson. Cambridge, Roy al Society of Chemistry 201-210. MORRIS, C. E., NGUYEN-THE, C. AND NICOT, P. C. - 1996 - Aerial Plant Surface Microbiology (The Language of Science), Springer .

MRAZ P. - 1998 - The structure and dev elopment of the glandular trichomes of Teucrium montanum (Lamiaceae), Biologia 53 (8), 65–72. PRABUSEENIVASAN, S., JAYAKUMAR, M. AND IGNACIMUTHU, S. - 2006 - In v itro antibacterial activ ity of some plant essential oils. BMC Complement

Altern Med 6: 39. SITTIWET, C. - 2009 - Antimicrobial Activ ity of Essential Oil from Nelumbo nucifera Gaertn. Pollen. International Journal of Pharmacology 5(1): 98-100.

SUPPAKUL, P., MILTZ, J., SONNEVELD, K. AND BIGGER, S. W. - 2003 - Antimicrobial properties of basil and its possible application in food packing. Journal of Agriculture and Food Chemistry 51: 3197-3207.

SYLVESTRE, M., PICHETTE, A., LONGTIN, A., NAGAU, F. AND LEGAULT, J. - 2006 - Essential oil analysis and anticancer activ ity of leaf essential oil of Croton flavens L. from Guadeloupe. Journal of Ethnopharmacology 103(1): 99-102.

TEPE, B., DAFERERA, D., SOKMEN, M., POLISSIOU, M. AND SOKMEN, A. - 2004 - In Vitro Antimicrobial and Antioxidant Activities of the Essential Oils and Various Ex tracts of Thymus eigii M. Zohary et P.H. Dav is. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52(5): 1132-1137.

TSAVKELOVA, E. A., CHERDYNTSEVA, T. A., BOTINA, S. G. AND NETRUSOV, A. I. - 2007 - Bacteria associated w ith orchid roots and microbial production of aux in. Microbiol Res 162(1): 69-76.

VARMA A, ABBOT L., WERNER D., HAMPP R. - 2004 - Plant surface Microbiology. Ed. Springer Berlin, Heidelberg, New y ork, Hong kong, London, Milan, Paris, Toky o:145-157.

10dec. 2009 Director proiect, Prof. univ. dr. Maria Magdalena ZAMFIRACHE

1

3

4

2

1

3

4

2