Sinteza DNA se zaène z vezavo nukleotidov na 3? OH konec s ... · MOLEKULARNA GENETIKA Jadranka Ajković, Katarina Aleš, Barbara Černe, Živa Fišer, Maja Gračner, Vesna Hodnik,

MOLEKULARNA GENETIKA Jadranka Ajković, Katarina Aleš, Barbara Černe, Živa Fišer, Maja Gračner, Vesna Hodnik, Natalija Kamenšek, Živa Krelj, Metka Škrlj

MOLEKULARNA GENETIKA

1


STRUKTURA DNA DNA ima več struktur: enojni, dvojni ali trojni heliks je levo- ali desnosučen, linearna ali krožna. Najpogostejša oblika je B desnosučni heliks, ki je iz dveh komplementarnih polinukleotidov. Ogrodje molekule tvorita sladkor in fosfat, ki sta povezana s 3`-5`fosfodiestersko vezjo. Glede na to vez sta verigi nasprotni: ena 3`-5`, druga 5`-3`. Na sredini so baze, ki predstavljajo genetsko informacijo(str. 70, sl.33 in 9-1). Glikozidni vezi, ki vezeta komplementarni bazi na sladkorja, nista v isti ravnini, zato tudi fosfodiesterski vezi nukleotidnega para nista v isti ravnini. Posledica tega je, da celotno ogrodje (sladkor in fosfat) ni enakomerno vzdolž molekule.

TAVTOMETRIJA

Vodiki na bazah se lahko spontano ali inducirano premaknejo na drugo mesto na isti bazi. Tako so možne spremembe funkcionalnih skupin v bazah: amino-imino, keto-enol, veliko pogostejše pa so amino- in keto- skupine. Za normalno delovanje DNA je pomembno , da vodiki ne spreminjajo položaja, ker bi lahko prišlo do napačnega parjenja baz.

DENATURACIJA IN RENATURACIJA DNA denaturira, ce spremenimo pH, povišamo T,… Denaturacija je posledica pretrganja vodikovih vezi med bazami. Tiste molekule, ki imajo višje odstotek CG baznih parov, denaturirajo kasneje, kot tiste z več AT pari, ker je pri prvih prisotnih več H-vezi. DNA lahko tudi renaturira, ker se zaradi komplementarnosti verigi zopet povezeta.

ENOJNA DNA

Enojno DNA imajo nekateri dovolj majhni bakteriofagi (QX174, S13, f1, M13). DNA je enojna le v fagu, ko fag okuži celico, se podvoji. V večceličnih organizmih enojna DNA ne bi normalno delovala. Ko se DNA pred mitozo podvoji, omogoča dvojni heliks natančno podvojevanje oz. uspešne popravljalne mehanizme. Če bi bila DNA enojna, bi pri podvojevanju lahko prišlo do številnih napak in hčerinski celici ne bi imeli enake informacije. Značilnost enojne dNA je, da je bolj zavita kot dvojna. Pri enojni DNA pride na nekaterih mestih do tvorbe dvojnega heliksa (sl.9-6), drugje po verigi pa ni vodikovih vezi, zato delujejo Van der Waalsove vezi (sile), ki atome v molekuli približajo bolj, kot pa bi jih H-vezi.

OBLIKE DVOJNEGA HELIKSA Bazi, ki tvorita bazni par, nista v isti ravnini, temveč se obrneta (propeller twist) tako, da je med njunima ravninama kot (sl. 9-7). Purini tako pridejo preblizu, kar se kompenzira s

2


premikom purinov iz osrednje lege ali pa se spremeni kot med sosednjimi baznimi pari. Tko različne DNA molekule nimajo nikoli čisto enake oblike.

OBLIKA DNA Desnosučni obliki (purini in pirimidini vedno anti)

1.) A: krajša, debelejša, med sosednjima baznima paroma 2.7 A, bazni pari 30° iz osi Desnosučni obliki (purini in pirimidini vedno anti)

heliksa, globok in ozek veliki jarek, mali jarek ozek in širok 2.) B: dolga, tanka, razdalja med sosednjima baznima paroma 3.4A, bazni pari približno v osi heliksa, širok veliki jarek, ozek mali jarek A oblika nastane,če je okrog molekule malo vode. Takšna je kristalizirana DNA. Podobna je tudi RNA. Levosučna oblika: Z cik-cak izgled, daljša in tanjša kot B, med sosednjima baznima paroma 3.8 A, zelo ozek in globok mali jarek. Z oblika nastane iz B oblike: 1.) če je v molekuli izmenično purin-pirimidin in se gvanin zavrti iz ant v sin obliko. To se zgodi ob dovolj visoki koncentraciji kationov (sl. 9-10) 2.) če pride do metilacije citozina na mestu 5`(5-metilcitozin) Količina Z oblike v celici ni znana.

METILACIJA IN HEMIMETILACIJA Encim metilaza metilira baze, ko so že vključene v molekulo: citozin na mestu 5; nastane 5-metilcitozin ( pri evkariontih in prokariontih), adenin na mestu 6; nastane 6-metiladenin. Pri evkariontih se metilirajo le tisti ogljiki, ki so na mestu 5`CG3`. Metilacija indirektno vpliva na ekspresijo genov, olajša prehod B oblike v Z obliko in stabilizira DNA, ker metilne skupine tvorijo hidrofobni ovoj. Metilacija DNA je pomembna tudi kot zaščita pred lastnimi restriktazami, encimi, ki režejo DNA (opisani v tem poglavju).Metilaze prepoznajo specifična mesta za lastne restriktaze in jih metilirajo (sl.9-37). Tako preprečijo delovanje lastnih restriktaz, ne pa tudi ostalih, ki režejo na drugih mestih. Dovolj je tudi, če encimi metilirajo prepoznavno mesto samo na eni verigi DNA, to je hemimetilacija.

SPONTANE DEFORMACIJE DNA je zelo plastična struktura. Lahko se upogiba, zvija, steguje, zanka. Do tega pride zaradi prekinjanja in nastajanja vodikovih vezi, ter zaradi rotacij kovalentnih vezi, ob tem pa se porabi malo energije. DNA ima posebna zaporedja, ki omogočajo pregibe in s tem tvorbo bolj kompaktne strukture. Takšno specifično zaporedje je npr. …CAAAAATGTCAAAAATAGGCAAAAATGCCAAAAAT…

3


TROJNI HELIKS Na nastanek trojnega heliksa vpliva encim RecA (opisan v poglavju o rekombinaciji), trojni heliks pa je stabilen tudi, ko encim ni več prisoten. Enojna DNA po nekem mehanizmu (ne po komplementarnosti) prepozna dvojni heliks, se veže s purini (z G, A v dvojnem heliksu) in se vleže v veliki jarek, nastane trojni heliks. To omogoča zaščito DNA (pred restriktazami) in blokado nekaterih genov.

LINEARNA IN KROŽNA DNA Krožno DNA imajo nekateri virusi in večina bakterij. Linearna DNA je v evkariontskih celicah in nekaterih virusih. Plazmidi so lahko krožni ali linearni. Linearna DNA mora biti na obeh koncih zaščitena pred eksonukleazami (sl.9-19). V fagu je DNA linearna, ko pa pride fag v celico, se konci povežejo in DNA je krožna. Fagi imajo lahko na 5` koncih za zaščito posebne proteine, na koncih so lahko zanke, nekateri fagi pa imajo na obeh koncih identična zaporedja.

SUPERNAVITOST DNA DNA je zelo fleksibilna struktura, njena oblika se spreminja. Linearna oblika DNA lahko prosto rotira zato, da kompenzira spremembe v številu navojev molekule. Pri krožni DNA pa je število navojev točno določeno. Če se spremeni povprečno število baznih parov v navojih dvojnega heliksa, se formira ustrezno število supernavojev, ki kompenzirajo spremembe. Supernavitost pomeni nadaljnje zavijanje dvojnega heliksa DNA. Odvijanje verig vodi v supernavitost v negativni (levosučni) smeri, posledica čezmernega zavijanja DNA pa je pozitivna (desnosučna) supernavitost (sl. 9-20). Supernavita DNA je manj stabilna, kot navadna krožna (relaksirana) DNA. Rezanje ene same verige povzroči, da se supernavita DNA spremeni v relaksirano (se odvije), krožno obliko (sl.9-21). Relaksirana DNA ima daljši čas sedimentacije in daljši čas potovanja po agaroznem gelu pri gelski elektroforezi (sl. 9-22).

LOKALNA DENATURACIJA

Posledica stresa ob negativnem supernavijanju DNA (na mestih s T-A pari) je lahko lokalna denaturacija, pri kateri se komplementarni verigi ločita, supernavita DNA pa preide v relaksirano obliko (sl. 9-23). Če denaturirani deli verige vsebujejo homologne sekvence, potem tvorijo Zanke v obliki križa, ki so energetsko stabilnejše (sl. 9-24). Zaenkrat še ni dokazano, da takšne zanke nastajajo tudi v živi celici.Kinetično so take zanke neugodne. Lažji prehod iz B oblike v Z obliko dvojnega heliksa.

4


KOMBINACIJA DNA-PROTEINI V celicah prokariontov in evkariontov se praktično vsa DNA nahaja kot negativno supernavita s specifičnimi proteini (DNA-binding proteins). To strukturo imenujemo kromatin. Najpomembnejši proteini pri evkariontih so histoni; relativno majhni proteini ki vsebujejo arginin in lizin.Združujejo se v histonske sredice. Okoli vsake sredice se dvakrat negativno supernavije segment DNA (200 baznih parov), nastane nukleosom (sl.9-26 in 9-28). Histoni imajo pomembno strukturno vlogo. Ostali proteini še niso popolnoma raziskani. Večina DNA je povezane s proteini. Kjer proteinov ni, delujejo encimi, tukaj se začne podvojevanje. Tudi prokariontske celice vsebujejo histonom podobne proteine, vezane na DNA (histonlike DNA-binding proteins) .Eden takšnih proteinov je DNA binding protein II, ki nastopa kot dimer (sl.9-29).

TOPOIZOMERAZE

Topoizomeraze so skupina encimov, ki izomerizirajo eno tpoploško obliko DNA v drugo, tako da povzročijo spremembo navoja DNA (tabela 9-2). So esencielni encimi. Ene topoizomeraze zavijajo DNA molekule, npr. topoizomeraza II (giraza) pri prokariontih, ki tvori negativni supernavoj, pri tem porablja energijo ATP. Druge tpopizomeraze delujejo nasprotno, torej odvijajo supernavito DNA in tvorijo energetsko ugodnejšo, relaksirano obliko DNA, npr. topoizomeraza1. topoizomeraza1 supernaviti ----------------------------------> relaksirani topoizomerazaII dvojni heliks --------------------------------> dvojni heliks Topoizomeraze delujejo tako, da katalizirajo prekinitev in ponovno tvorbo fosfodiesterskih DNA vezi. Najprej odvijejo dvojni heliks, nato prekinejo vez v eni polinukleotidni verigi in se vežejo na proste konce (terminalne fosfatne skupine). Tako preprečijo prosto rotacijo heliksa in ohranijo energijo fosfodiesterskih vezi. Nato spremenijo zavoj tako, da ob konformacijski spremembi encima potegnejo DNA verigo skozi začasno prekinitev (topoizomeraza1) oz. prekinitvi (topoizomeraza2) in zopet povežejo proste konce. Pri topoizomerazi1 tako nastane DNA z enim negativnim supernavojem manj, pri topoizomerazi2 pa z dvema supernavojema več (sl.9-31 in 9-32).

RESTRIKTAZE

Restrikcijski encimi ali nukleaze, so encimi ki režejo fosfodiesterske vezi v polinukleotidni verigi.Endonukleaze prekinjajo notranje vezi v DNA in so specifične. Eksonukleaze delujejo na koncih DNA molekule (sl.9-34). Restriktaze delujejo kot obrambni mehanizem, saj razgrajujejo tujo DNA. Razlikujejo lahko med nativno DNA, nastalo v lastni celici, in tujo DNA drugih vrst. Njihova glavna naloga je, da uničijo tujo DNA, preden se ta vključi v lastno kromosomalno DNA. Restriktaze napadajo specifično in simetrično zaporedje dolgo 4-6 nukleotidov.

5


Le redki encimi prepoznajo zaporedje osmih nukleotidov. Rez ne poteka nujno po sredini simetričnega zaporedja, lahko je pomaknjen v eno ali drugo stran (sl.9-35). Danes je poznanih več kot 100 endonukleaz različnih prokariontov, medtem ko jih pri evkariontih še niso našli. Specifično zaporedje 6 nukleotidov se pojavi samo na vsakih nekaj 1000 baznih parov zato po delovanju restriktaz nastanejo fragmenti značilne dolžine. Encim EcoRI prepozna zaporedje 6 baznih parov, ki se pojavi v DNA faga SV40 (5243 baznih parov) samo enkrat.Encim sestavljata dve simetrični polipeptidni podenoti, ki se ovijeta okoli dvojnega heliksa (sl.9-36). Rez poteka med G in A specifičnega zaporedja. Encim Hin dIII prepozna kot specifično zaporedje 6 baznih parov: AAGCTT TTCGAA Rez poteka med adeninoma. Fag SV40 ima 5 takšnih zaporedij,zato ga Hin dIII petkrat prereže. Encimi metilaze (jih metilirajo in tako inaktivirajo) prepoznavajo ista specifična zaporedja kot restriktaze, vendar ni nobene očitne homologije v sestavi njihovih polipeptidov in tudi geni, ki jih kodirajo so popolnoma različni.

REPLIKACIJA DNA

UVOD Pomembna ugotovitev v genetiki je bila, da DNA sama funkcionira kot matrika za sintezo novihverig DNA. S tem je bil rešen problem, kako se geni podvajajo. Replikacija celo najenostavnejših molekul je komplicirana (multiencimski procesi).

PREDPOGOJ ZA PODVOJEVANJE JE LOČITEV DVOJNEGA HELIKSA Tudi v najmanjših DNA molekulah sta verigi dvojnega heliksa večkrat naviti druga okoli druge in se morata odviti, da se podvajanje lahko začne (sl. 10-1).Pri tem se morajo ločiti H-vezi med organskimi bazami.Te vezi so zelo specifične, relativno šibke in noben encim ni potreben za njihovo ločitev ali nastanek.H-vezi imajo pomen tudi pri specifični vezavi matrike in njene komplementarne verige (replike). Povprečna energija H-vezi je okoli 3Kcal/mol.

PARJENJE BAZ MORA OMOGOČATI NATANČNO REPLIKACIJO

Purinske in pirimidinske baze tvorijo različno število H-vezi. H-vezi so visoko specifične, za razliko od van der Waalsovih vezi, ki so manj specifične in šibkejše. Replikacija para GC je še bolj natančna kot para AT, ker sta GC povezana s tremi H-vezmi, AT pa le z dvema. Občasno (približno enkrat na 10000) pride do napačnega parjenja baz. Encim DNA polimeraza zelo poveča specifičnost parjenja baz (proofreading, glej naslov Rast verige v obeh smereh).

6


Ogranske baze lahko tvorijo enako močne H-vezi tudi z atomi H in O iz vode. Molekule vode pa se ne morejo kemično povezati z rastočo polinukleotidno verigo, zato se zelo hitro odstranijo z difuzijo in jih nadomestijo primerni nukleotidi. Ni še popolnima jasno zakaj se dve purinski ali dve pirimidinski bazi ne vežeta med sabo. Taka vezava bi uničila sladkorno-fosfatno hrbtenico.

DELNA DENATURACIJSKA MAPA

Od zaporedja baz so odvisne fizikalne lastnosti DNA. Kratko izpostavljanje linearne DNA denaturacijskim pogojem (visoka T, visok ali nizek pH, reagenti ki cepijo H-vezi) prej odvije odseke DNA z AT baznimi pari, odseki z mnogo močnejšimi GC baznimi pari pa ostanejo intaktni – to je delna denaturacijska mapa. Če take delno denaturirane molekule tretiramo s formaldehidom, se enoverižne DNA (na mestu denaturacije) stabilizirajo, ker se formaldehid veže s prostimi amino skupinami adenina in prepreči nastanek AT baznih parov. Na mestu denaturacije se pojavijo mehurji, ki se nahajajo na točno določenih mestih. S pomočjo teh mest lahko dobimo denaturacijsko. Denaturacijska mapa nam omogoča, da ločimo en konec linearne DNA od drugega in s pomočjo tega lahko opredelimo mesto začetka replikacije (sl.10-2).

PODVAJANJE LINEARNE DNA Dokaj enostavno je izolirati DNA med procesom podvajanja in to predstaviti pod elektronskim mikroskopom. To so prvič naredili pri linearni T7 virusni DNA .Pričakovali so da se bo replikacija začela na začetku enega ali obeh koncev DNA. Presenetljivo pa so ugotovili, da se replikacija začne »notranje« vedno v isti točki = origin of replication; ni histona a so drugi proteini (približno 15% stran od levega konca molekule).Ko se podvajanje začne poteka v obeh smereh. Najprej je videti kot -o- struktura, nato se spremeni v Y obliko, ko leva stran replikacijskih vilic doseže konec DNA. Taka struktura razveljavi mnenje o podvajanju DNA v dveh korakih, pri katerem naj bi se obe parentalni verigi popolnoma odvili in bi šele nato začel nastajati dvojni heliks. Hčerinska polinukleotidna veriga je sintetizirana praktično takoj, ko se starševski verigi ločita.

REPLIKACIJA KROŽNE DNA Z θ (THETA) VMESNO OBLIKO Pri podvajanju krožne DNA ohranjata starševski verigi ves čas krožno obliko. Zavzameta pa theta obliko ki se pojavi na začetku replikacijskega mehurčka na mestu origin (sl.10-4). Replikacijski mehurček se povečuje na obe strani na ta način, da se starševski verigi odvijata.To pa povzroči supernavitost v nasprotni smeri, kar kasneje ustavi rast replikacijskega mehurčka, ker nadaljna supernavitost ni več možna.Tako ustavljen mehurček lahko ponovno raste če topoizomeraza I naredi rez ene verige in tako spreobrne visoko supernavite odseke, ki se ne podvajajo v sproščeno konfiguracijo Obstajata topoizomeraza I in II. Topoizomeraza I relaksira DNA (odvija), tako da neredi enoverižen rez.Topoizomeraza II (giraza) pa zavija DNA in povzroča supernavoje.

7


RAST VERIGE V OBEH SMEREH OD 5`--- 3` IN 3`--- 5` Nasprotna usmerjenost obeh verig (5`---3` in 3`---5`) dvojnega heliksa pomeni, da mora tudi sinteza obeh hčerinskih verig teči v nasprotni smeri. Ena veriga mora rasti v smeri 5`---3`, druga pa v smeri 3`---5` (sl.10-6). DNA polimeraza, edini poznan encim ki lahko dodaja nukleotidne prekurzorje na DNA, dela to le v smeri 5`---3`. Kemična reakcija, ki jo katalizira ta encim omogoča nukleozid trifosfatom, da reagirajo le s 3ÒH koncem rastoče polinukleotidne verige (sl. 10-7). Postavilo se vprašanje, če obstaja šeen encim, ki bi priključeval na prostem 5` koncu. Takega encima niso našli.

OKAZAKIJEVI FRAGMENTI, LEADING IN LAGGING VERIGA

Rešitev podvajanja v smeri 3`---5` je prišlo s spoznanjem, da deoksiribonukleotidni substrati niso vedno priključeni direktno na dolgo hčerinsko verigo. Namesto tega se združujejo hkrati v kratke fragmente DNA = okazakijevi fragmenti, ki se kasneje združijo z rastočo hčerinsko verigo s pomočjo DNA ligaze. Danes je jasno, da so okazakijevi fragmenti prekurzorji v sintezi le ene od obeh hčerinskih verig.Ta razlika v načinu rasti 3`---5` in 5`---3` nitko producira kratke odseke enoverižne starševske DNA v replikacijskih vilicah (sl.10-9). Okazakijevi fragmenti se začnejo sintetizirati le na točno določenih točkah enoverižne starševske DNA. Med temi točkami (signali) je razdalja, ki določa povprečno dolžino okazakijevih fragmentov.

REPLIKACIJA IN VITRO Danes znajo ustvariti razmere, ki popolnoma posnemajo stanje v rastočih celicah.Tudi sinteza DNA je možna in vitro – produkti so pogosto enaki tistim, ki nastanejo in vivo (intracelularno). Ekstrakti E. coliso služili za ugotovitev narave in načina delovanja encimov vključenihv replikacijske procese. Ustvarili so natančne pogoje za in vitro spreobrnitev enoverižne DNA (virusov thetaN174 inM13 ) v njihov dvoverižni replikativni intermediat.Encimi ki sodelujejo pri tem so drugačni pri enem kot pri drugem virusu. To pomeni da so posamezni replikacijski geni bakterijske DNA potrebni za replikacijo enega virusa, ne pa tudi za replikacijo drugega. Očitno različne DNA molekule uporabljajo različne modele replikacije.

TRIJE TIPI DNA POLIMERAZ

Najprej so odkrili le eno polimerazo, danes imenovano DNA polimeraza I. Kasneje so ugotovili da obstajajo tri različne DNA polimeraze. Za dve od teh je danes poznana dokajnatančna vloga pri replikaciji. Dolgo so mislili, da je DNA polimeraza I glavni encim, ki združuje skupaj deoksiribonukleotide v resnici pa ima pri polimerizaciji glavno vlogo najkasneje odkriti encim DNA polimeraza III. DNA polimeraza I se uporablja predvsem za polnenje vrzeli med majhnimi okazakijevimi fragmenti. Za DNA polimerazoII še ni dokazana specifična vloga pri replikaciji.Celice mutante, ki imajo malo ali pa sploh nimajo molekul DNA polimeraze II lahko preživijo.Zato je mogoče ta encim nebistven in njegovo vlogo je težko definirati.

8


POPRAVLJANJE NAPAK PRI 3`---5` EKSONUKLEAZNI FUNKCIJI

Isti encim (velja za vse tri DNA polimeraze)ki ima polimerazno funkcijo ima tudi 3`-5` eksonukleazno aktivnost. Vsaka molekula DNA polimeraze ima sposobnost ponovno zrezati nastajajoče polinukleotide, ravno tako, kot jih lahko tudi združuje. Vendar je sinteza prevladujoča nad degradacijo. Na prvi pogled nima degradacijska funkcija nobenega pravega pomena. Njena navzočnost pa se pokaže za zelo pomembno, ko pride do napačnega dodajanja baz.Če se napačna baza doda na koncu 3` rastoče verige, je velika verjetnost, da bo odstranjena preden se bo priključila naslednja baza (3`5` eksonukleazna aktivnost da v tem primeru kontrolno sposobnost). To da replikaciji DNA veliko večjo natančnost, kot bi jo imela, če bi bila selekcija le rezultat začetnega dodajanja baz. Stalna potreba po kontroliranju prepisovanja je mogoče razlog, da ni encima, ki bi dodajal deoksiribonukleotide na 5` konec. Če bi rast potekala v tej smeri bi bil rastoči konec vedno zaključen s trifosfatno skupino katere visoko energetske vezi so potrebne za vezavo naslednjega nukleotida.Odstranitev nazadnje priključenega deoksiribonukleotida iz take s trifosfatom zaključene molekule med proofreadingom bi tu oblikoval z 5`-monofosfatom zaključeno verigo, ki bi bila energetsko neprimerna za delovanje DNA polimeraze.

DNA POLIMERAZA DELUJE POSTOPOMA

Ves čas polimerizacije (ko DNA polimeraza dodajanukleotide za podaljševanje verige DNA) je encim DNA polimeraza povezan z DNA. Povezan je vse dotlej, dokler ne pride do stop signala. DNA polimeraza je tridimenzionalna struktura. DNA polimeraza ima na karboksi-terminalnem koncu Klanow fragment, ki ima polimerazno aktivnost in 3`---5` eksonukleazno aktivnost, ki ureja napačno sparjene nukleotide. Ta fragment vsebuje dva različna predela: večji predel je 20A dolga razpoka, v katero se veže DNA manjši predel, kjer se vežejo nukleotidi. Ko se DNA veže v razpoko se ta zapre in začno se nalagati nukleotidi. DNA lahko drsi naprej ali nazaj skozi to odprtino. Če pa se v DNA vstavi napačna baza = ne tvorijo se pravi bazni pari = nastane detormirana oblika, ki ne more zdrsniti skozi 20A dolgo dimerno razpoko. Taka DNA gre nazaj. Eksonukleaza pa odstrani napačno bazo – proofreading in s tem lahko gre DNA polimeraza I zopet naprej.

HELIKAZA ODVIJA DVOJNI HELIKS

Polimeraza je omejena v aktivnosti, ker potrebuje encime, da ji zapro dvojni heliks. Verige dvojnega heliksa se na mestu replikacijskih vilic ne razklenejo spontano, ampak za to potrebujejo specifične proteine helikaze, ki se vežejo na ATP in enojno verigo DNATe helikaze potrebujejo za cepitev vezi vzdolž DNA energijo, ki jo dobijo s cepitvijo ATP na ADP. Ponavadi sodelujeta dve različni helikazi. Ena helikaza (II ali III) se veže na lagging verigo in se pomika v smeri 5`---3`. Druga helikaza (rep. prot) se veže na leading verigo DNA in se pomika v obratni smeri 3`---5`. Glede na DNA gre vsaka v svojo smer; topografsko pa gresta obe v isto smer. Cepitev vezi ATP v ADP, vodi do konformacijskih sprememb, ki poganjajo helikaze vzdolž verige, na katero so se vezale.

9


STABILIZACIJA IZPOSTAVLJENE ENOJNE VERIGE DNA Z SSB PROTEINI

Ko se DNA razpre zaradi helikaz je na teh mestih enojna veriga. Ta mesta takoj zaščitijo SSB proteini (single-stranded binding proteins). Pri tem ne uporabljajo ATP in nimajo encimske funkcije kot helikaze. Glavni SSB protein v E. coli je polipeptid iz 177AK, tetramerne oblike in pokrije 32 sosednjih nukleotidov na enojni verigi DNA. Vezava enega SSB tetramera olajša vezavo drugih SSB proteinov v njegovi bližini (kooperativna vezava). Enojna veriga DNA je tesno prekrita z SSB, s tem ji je onemogočeno gibanje (postane rigidna = ne more tvoriti zank, ne more se upogibati). Ta rigidna konformacija je osnova za delovanje DNA kot templeta; osnova na kateri nastaja komplementarna DNA. To olajša DNA polimerazi, ki lahko sama dodaja baze.

NASTANEK OKAZAKIJEVIH FRAGMENTOV S POMOČJO RNA PRIMERJEV:

PRIMAZE, PRIMOSOMI DNA polimeraza lahko sama vstavlja nukleotide v nastajajočo polipeptidno verigo, ne more pa začeti sinteze DNA. Sinteza DNA se začne z RNA, ki je evolucijsko starejša. Začetno mesto sinteze DNA ne prepozna DNA polimeraza, ampak encim (RNA polimeraza), ki prepisuje DNA v RNA verigo. Ta služi kot primer (RNA). RNA polimeraza, celični encim, ki normalno prepisuje matično DNA v RNA, naredi majhne RNA fragmente. Primerje za okazakijeve fragmente naredijo posebne RNA polimeraze, imenovane primaze, ki prepoznajo specifična zaporedja enojne verige DNA. Primaza E. coli je enojen peptid iz 60kdal. Prisotna v 50-100 kopijah na celico.Primaza sama zase (očiščena) je le delno aktivna. V povezavi s 6 proteini pa tvori agregat imenovan primosom. Primaza s temi encimi pa je polno aktivna (holoencim). Vsak okazakijev fragment se začne z RNA primerjem, ki ga naredi primosom. Ta se pomika 5`---3` koncu. Primosom začne sintezo RNA primerja na specifičnih sekvencah. Razdalje na teh sekvencah regulirajo velikost okazakijevih fragmentov. Vsi primerji imajo enake sekvence, zato so vsa startna mesta pred okazakijevimi fragmenti enaka. Primosom se pomika po verigi DNA v nasprotni smeri kot kadar katalizira sintezo lastne RNA. To razlaga dejstvo, zakaj se sintetizirajo le kratki RNA primerji, dolgi nekaj nukleotidov (3bp pri E. coli, 5bp virus, 9bp živalska celica). DNA polimeraza I zapolni razpoke med okazakijevimi fragmenti in hkrati odstranjuje RNA primer na 5` koncu sosednjega fragmenta. DNA polimeraza je hkrati eksonukleaza za smer 3`---5` in 5`---3`, zato lahko odstrani deoksiribonukleotide kot tudi ribonukleotide in ni omejena le na RNA primer.Odstrani lahko tudi poškodovane dele DNA. Da so RNA primerji nujno potrebni za začetek sinteze cele DNA ima pomen, ker se na ta način zaščitijo številne letalne napake na mestih začetka sinteze. Vezava prvih nukleotidov vzdolž matrike DNA Je tako lahko veliko bolj natančna, kot če bi se nukleotidi dodajali vzdolž dolgega dela že formiranega dvojnega heliksa. Zato so velike selektivne prednosti tega iniciacijskega mehanizma, ki omogoča razlikovati in pozneje odstraniti začetne nukleotidne sekvence. Lipaza naredi zadnjo fosfatno vez med fragmentoma DNA.

DNA POLIMERAZA III JE AGREGAT SEDMIH RAZLIČNIH POLIPEPTIDOV Za polno aktivnost DNA polimeraze III mora biti prisotnih vseh 7 polipeptidov.Proteini, ki sestavljajo DNA polimerazo III so: gama-1x, alfa, beta, epsilon, theta, T-2x.Proteinaza ima

10


funkcijo polimeizacije in eksonukleazno funkcijo v smeri 5`---3`, medtem ko ima polipeptid epsilon le eksonukleazno funkcijo v smeri 3`---5`.Ostali proteini imajo druge funkcije, kot so vezava na ATP molekulo, ki je potrebna, da DNA polimeraza III začne sintezo na koncu primerja.Število DNA polimeraz v celici E. coli je majhno. Na replikacijskih vilicah sta dve molekuli holoencima DNA polimeraze III. Dvojni agregat bi lahko vršil simultano sintezo na lagging in leading verigi. To se zgodi, če se lagging veriga zvije (okoli polimeraze) in postane enako orientirana kot leading (glede na encim). Glede na to shemo, se lagging veriga vleče skozi holoencimski kompleks in doseže primer, ki ga je sintetiziral primosom. Okazakijev fragment raste in ko doseže začetek že prej sintetiziranega okazakijevega fragmenta, se zanka sprosti – ni več pritrjena na holoencim.Sinteza leading verige naredi na razpolago novo raztegnitev nesparjene lagging verige, ki se bo zavila nazaj in sodelovala v nastanku naslednjega okazakijevega fragmenta na lagging verigi.Po takem mehanizmu sinteza leading verige ne bo nikoli preveč prehitevala sintezo lagging verige.Še več, primosom se bo avtomatsko pomikal vzdolž podvojevanja DNA z enako hitrostjo, kot DNA polimerizacijske komponente DNA polimeraze III. Podvojevalni kompleks proteinov – replisom :

- DNA polimeraza III - Primosom - helikaza

Replisom je najpomembnejši del, ki vodi podvojevalni proces. SKICA 1

11


ZAČETEK PODVOJEVANJA NA MESTU ORI Začetek podvojevanja je oddaljen od začetka okazakijevih fragmentov. Bakterijska in virusna DNA vsebuje le eno ORI mesto (mesto začetka podvojevanja). Pri E. coli je to mesto omejeno na 245 baznih parov, ki ležijo med geni za sintezo asparagina in sintezo, ki vrši kontrolo ATP sistetaze. Mutageneza in vitro je pokazala, da je samo del baz na ORI mestu bistvenih za podvojevanje. Morda so to tiste baze, ki jih prepoznajo proteini vključeni v procesu nastanka replikacijskih vilic.Ključni dogodek je začetek sinteze leading verige. Tej sintezi sledi kmalu sinteza lagging verige po prej opisanem mehanizmu.Najprej pride do transkripcije ORI mesta leading verige DNA s pomočjo RNA polimeraze.

a) za nekatera ORI mesta (plazmid coI E) lahko služijo te RNA verige kot primerji za leading vrvico. Rna verigo, ki ni več potrebna pa razgradi encim Rna-sa H (H = hibrid), primer odstrani Rna-sa N.

b) Pri večini RNA veriga, ki jo sintetizira RNA polimeraza nima funkcije primerja, ampak odpre heliks na ORI mestu. Tja se veže primosom, ki naredi pravi primer v obratno smer.Proces imenujemo transkripcijska aktivacija.

Ni pomembno, na kakšen način nastane primer. Prisotnost RNA primerja še ne pomeni, da se bo DNA avtomatsko sintetizirala, ker se ponavadi RNA veriga takoj loči od DNA. Posledica tega je da se ločeni verigi DNA zopet združita v dvojni heliks.Za to morajo biti prisotne posebne molekule, ki preprečijo ponovno vezavo v dvojni heliks. Začetek leading vrvice v mnogih primerih zahteva še prisotnost dodatnih proteinov, ki sodelujejo le med iniciacijo. Med temi proteini je dnaA (E. coli) in O protein (fag), ki se povežeta s štirimi seti, po 9 baznih parov, ki so v različnih sistemih ohranjeni v zaporedju. Informacija za sam začetek sinteze je kodirana v DNA.

LOČITEV DVEH STARŠEVSKIH VERIG ZAHTEVA SODELOVANJE ENCIMA

TOPOPIZOMERAZE II Pri podvojevanju krožne DNA nastane vrzel, ko se odstranijo RNA primerji. Vrzel se zapolni z nukleotidi. Krožna DNA se podvaja obojesmerno vse dotlej, da se nasprotni replikacijski vilici ne srečata. To se zgodi približno 180° od začetka replikacije. Končno ločitev dveh hčerinskih dvojnih heliksov ni avtomatska.Po koncu replikacije sta hčerinska dvojna heliksa povezana še z 20-30 zavoji, druga okoli druge.In vitro topoizomeraza II katalizira ločitev teh dveh hčerinskih dvojnih heliksov. Topoizomeraza cepi in spaja DNA. Brez nje bi nastali supernavoji. Njena značilnost je, da lahko katalizira na obeh koncih DNA (5ìn3`), medtem ko DNA polimeraza le na koncu 3ÒH.

MODEL ODVIJAJOČEGA SE KROGA PRI KROŽNI DNA (SKICA 2)

Na ta način se podvajajo plazmidi, virusna DNA, amplifikacija genov. Po tem modelu

se podvaja DNA med konjugacijo pri bakterijah.Sinteza DNA se začne s prekinitvijo na ORI mestu vrvice starševske DNA. Na ta način dobimo dva prosta konca polinukleotida, ki se kemijsko razlikujeta. Na enem koncu je na ostanku sladkorja prosta 3ÒH skupina, na drugem pa prosta 5` fosfatna skupina. 5` konec je izpodrinjen in se v obliki repa odvija v dolžino. Na repu se zbirajo SSB proteini.

12


Sinteza DNA se začne z vezavo nukleotidov na 3′ OH konec s pomočjo DNA polimeraze III. Ta proces je mogoč, če se istočasno cel obroč vrti okoli svoje osi. Imenuje se _________, ker je odvijanje prostega konca omogočeno s kroženjem DNA okoli svoje osi. To odvijanje ne predstavlja nobenega topografskega problema, ker se obroč drži s pomočjo ene same polinukleotidne verige.

DNA se tako stalno odvija, sproti se delajo fragmenti, zato topoizomeraze niso potrebne. V donorski celici se DNA odvija, v recipientski pa se podvojuje z Okazakijevimi fragmenti. Celici sta skupaj. 5′ konec v obliki repa se v gostitelju hitro podvojuje v dvojni heliks DNA. Primaza, vključena v primosom, naredi RNA-primer-je. Nato pa rastejo Okazakijevi fragmenti.

Sila, ki odvija 5′ konec, verjetno ni posledica polimerizacije na 3′ koncu, ampak pomik DNA polimeraze III – primosomskega kompleksa (replisom), ki ga poganja lastna helikaza. DNA faga lahko ostanejo linearne ali pa tvorijo obroč s pomočjo svojih enoverižnih komplementarnih koncev. Linearna in krožna DNA sta med seboj interkonvertibilni.

PODVOJITEV KROŽNE ENOJNE VERIGE DNA V DVOJNI HELIKS

Za podvojitev enojne DNA virusa M13, 64, ∅X174 v replikativno formo (RF), ki se podvoji v dvojni heliks (+/-), so potrebni RNA-primerji. Podvajanje virusne DNA se začne po infekciji + verige, ki vstopi v gostiteljsko celico in postane pokrita z SSB proteini. RNA polimeraza katalizira sintezo kratke RNA verige. Ta omogoči sintezo – verige. Po sintezi se primerji odstranijo, zato ostanejo majhne vrzeli, ki jih zapolni polimeraza I, ki tudi odstrani RNA primer.

V celici je vedno dvojna DNA virusa, ven gre pa zopet enojna.

SINTEZA KROŽNE + VERIGE PO SINTEZI RF (+/-)

Vse RF enojne verige DNA fagov uporabljajo »rolling circles« za produkcijo njihovih lastnih kopij in produkcijo + verige. Kako se to zgodi, je najbolj raziskano pri fagu ∅X174. Ta ima protein A, ki reže verigo in je nujen za začetek »rolling circle«. Ta encim prepozna ORI mesto na kovalentno zaprti RF, jo na tem mestu prereže in ostane vezan na 5′ koncu DNA. 5′ konec + verige ima vezan tudi replisom, ki opravlja funkcijo replikacijskih vilic. SINTEZA IN PRENOS ENOJNE DNA MED PARJENJEM BAKTERIJE

Pri parjenju bakterije se moška DNA prenese v žensko bakterijo v enoverižni obliki.

DNA se sintetizira po »rolling« mehanizmu. Sinteza se začne s cepitvijo ene verige moškega kromosoma. Ta veriga se podaljšuje na svojem 3′ koncu, 5′ konec pa se izpodriva. Encimi, ki režejo dvojno DNA na specifičnem mestu, so podobni encimom, ki ______ »rolling circle«. Encimi ostanejo vezani na 5′ koncu in vodijo enojno verigo DNA v žensko celico. Ko je moška DNA znotraj recipienta, se podvoji v normalno dvojno vijačnico. Ta DNA lahko v procesu rekombinacije izmenja gene s prvotnim ženskim kromosomom. (SLIKA 3)

13


LINEARNE VIRUSNE DNA, KI SE PODVAJAJO BREZ UPORABE PRIMERJEV (str.304)

Številni virusi (od katerih se nekateri množijo v prokariontskih, drugi pa v

evkariontskih celicah) imajo linearne DNA, katerih sinteza ne uporablja RNA primerjev. Najbolj poznane so linearne DNA faga ∅29 in tiste, ki so jih našli v adenovirusih (skupina virusov, ki inficirajo vretenčarske celice). Te linearne DNA se ne začnejo podvajati »notranje« na ori mestu. Namesto tega se replikacija vedno začne na enem izmed koncev DNA. Z enako verjetnostjo se lahko začne na enem ali drugem koncu. Vsaka taka linearna DNA molekulama na svojih koncih istovrstne sekvence, vendar je ta odsek orientiran v nasprotni smeri. Tako njihovo podvajanje DNA ne more proizvajati »concatamer« med replikacijo.

Med replikacijo ne pride do tvorbe dveh komplementarnih verig, od katerih bi vsaka služila kot matrika. Namesto tega 3′→5′ orientirana veriga služi kot matrika, druga 5′→3′ orientirana starševska veriga pa se pomakne (imenujemo jo tudi enoverižni rep). Ta veriga (5′→3′) tvori H-vezi med komplementarnimi sekvencami na svojem 3′ in 5′ koncu. Pri tem nastane zanka. Ta veriga (rep) nato služi kot matrika za 5′→3′ hčerinsko verigo.

Vsi 5′ konci adenovirusnih verig vsebujejo specifičen protein, pritrjen na končni citozin nukleotid. Preden se replikacija začne, se ta terminalni protein kovalentno veže s 5′ fosfatom deoksicitidin monofosfata. Ti procesi zahtevajo edinstveno od virusa kodirano DNA polimerazo, ki uporabi terminalni protein______kompleks kot primer.

Kompletna replikacija zahteva delovanje topoizomeraze, ki odstrani supernavitost, ki je nastala pri premestitvi. To je primer, ko se tudi linearna DNA, ki ima sicer proste konce, ne more podvajati brez delovanja topoizomeraze I.

Adenovirus kodira ta protein, ki se veže na enojno DNA. Ta protein nastaja med multireplikacijo adenovirusa in ima podobno funkcijo kot helikaza.

REGULACIJA SINTEZE DNA (str. 305) Zaenkrat še niso popolnoma raziskani razlogi, ki omejujejo DNA replikacijo na

določene omejene periode znotraj celičnega cikla. Ne moremo tudi zagotoviti, da se origin uporabi samo enkrat skozi cikel kromosomske replikacije. Mogoče ključni začetni proteini (kot npr. dnaA protein pri E. coli) nekako modificirajo DNA na katero se vežejo, tako da se origin-i ne morejo znova uporabiti kot štartna mesta za sintezo DNA, dokler se ne modificirajo nazaj do njihovega originalnega stanja (npr. metilacijsko-demetilacijski cikel). Vendar za take modifikacije še ni dokazov.

Zelo zanimiv odgovor lahko pride z analizo plazmidne DNA. Podvajanje plazmida ColE1 pri E. coli je regulirano vsaj v odseku pri sintezi RNA molekul, ki se prepišejo v nasprotni smeri od tistih DNA sekvenc, ki dajo signal RNA primerjem za sintezo »leading« verige. Taka RNA blokira primerjev začetek sinteze DNA. Enako važna informacija lahko pride iz študij evkariontskih plazmidnih DNA, ki se podvajajo samo enkrat v celičnem ciklu. Tudi tu pride verjetno do ovire origin mesta, da bi lahko funkcioniral več kot enkrat na celični cikel.

14


ALI SO MEMBRANE VKLJUČENE V DNA REPLIKACIJO IN LOČITEV (str. 306)

Vprašanje, kako se lahko DNA molekule (kromosomi) pravilno ločijo med mitozo,

tako da vsaka hčerinska celica dobi enega od starševskih kromosomov., še nima jasnega odgovora. Dolgo so domnevali, da gre za zvezo med celično (ali jedrno) membrano in specifično regijo kromosoma.

Danes je jasno, da nobena stopnja v replikaciji DNA ne potrebuje navzočnosti katerekoli komponente membrane. To dejstvo pa ne pomeni, da se membrana in DNA ne vežejo specifično druga z drugo. Kakor dolgo bo tako težko ločiti celično membrano od ostalih celičnih partiklov, na o vprašanje ne bo možno zagotovo odgovoriti.

FUNKCIONALNE POSEBNOSTI DNA POLIMERAZ PRI EVKARIONTSKIH CELICAH (str. 306)

Težko je ugotoviti, kako poteka replikacija DNA na encimskem nivoju pri evkariontskih celicah. Karakterizirane so tri različne DNA polimeraze: α, β in γ.

α DNA polimeraza ima tako vlogo, kot jo ima DNA polimeraza III pri bakterijah. Kot polimeraza III je tudi α polimeraza holoencim, sestavljen iz različnih polipeptidov.

Še vedno pa je nekoliko nejasna funkcija veliko manjše β DNA polimeraze. Domnevajo, da sodeluje pri popravljanju DNA

Precej bolje je raziskana γ DNA polimeraza. Ta je locirana _______ (in mogoče v kloroplastih). Tu sodeluje pri podvajanju mitohondrijske DNA. Katalizira dislokacijski tip sinteze (slika 10-27), v katerem se najprej kopira le ena veriga ( H ). Šele ko naredijo replikacijske vilice pol poti okoli, se začne kopiranje na drugi ( L ) verigi.

Po pričakovanjih so v mitohondrijih našli tudi topoizomeraze. Te katalizirajo zapiranje in rezanje, ki da možnost odvijanja starševskih verig in kasnejšo ločitev hčerinskega dvojnega heliksa.

REKOMBINACIJA DNA (str.313)

Rekombinacija je proces, pri katerem se genetski elementi več različnih genomov združijo v eno enoto. Rekombinantna DNA molekula tako vsebuje DNA iz različnih virov. Genetska izmenjava poteka konstantno in je vzrok veliki variabilnosti. Najbolj očitna je pri mejozi (crossing over med homolognimi kromosomi).

Zaporedje genov je relativno stabilno, občasno pa lahko pride do sprememb vrstnega reda genov. To omogočajo transpozicijski elementi, ki imajo določeno samostojnost. So nosilci enega ali več genov, lahko vplivajo na ekspresijo drugih genov.

Rekombinacija ni naključna, temveč gre za reguliran encimatski proces. Posledice rekombinacije so variabilnost, pridobitev izgubljenih sekvenc, regulacija genske ekspresije, v zadnjem času pa služi kot orodje za usmerjeno manipulacijo z geni.

15


Homologna rekombinacija (str. 264)

Generira jo crossing over. Pojavi se med dvema regijama DNA, ki vsebuje identične ali skoraj identične sekvence. Ponavadi so te sekvence na ekvivalentnih regijah homolognih kromosomov, vendar lahko crossing over poteka tudi med homolognimi segmenti v neekvivalentnih regijah. Posledica je nastanek duplikacij in delecij v kromosomu (sl. 7-25).

Ker je dvojna DNA neaktivna, je pogoj za začetek rekombinacije prekinitev H-vezi vsaj v eni nitki. Prekinitev omogoča dostop nukleazam, ki degradirajo eno od verig, ali encimom, ki razvijejo dvojno DNA. Končna posledica je izpostavljena enojna DNA. Več prekinitev pomeni večjo frekvenco rekombinacije. Tak efekt povzročajo UV in X žarki ali mutacije genov za DNA polimerazo in DNA ligazo.

RecA protein pari enojno DNA verigo in komplementarno sekvenco v tarčnem kromosomu. Je produkt gena RecA v E. coli. Encimatske lastnosti RecA proteina omogočajo rekombinacijo prekinjene DNA. Mehanizem delovanja (sl. 11-5): • RecA specifično prepoznava enojno DNA, nanjo se veže v fiksnem razmerju (1 polipeptid

na 5 nukleotidov), nastane DNA proteinski filament. • RecA vezan v filamentu išče od zunaj komplementaren del dvojne vijačnice (evkarionti:

pri iskanju homologije sodelujejo še drugi proteini) • ko najde homologen del, odvije dvojno vijačnico

• ATP omogoča parjenje v smeri od 5′ proti 3′ glede na enojno vijačnico • Ko se stvori nov DNA hibrid, RecA protein odpade Vmesna struktura pri parjenju je trojni heliks (sl. 11-7) Primer vezave enojne krožne in dvojne linearne DNA (sl. 11-6).

Heterodupleksi (sl. 11-12) so tiste regije na rekombinantnih DNA molekulah, kjer pride do parjenja različnih verig – območje, kjer baze niso komplementarne. So kratkoživi, obstajajo do naslednje podvojitve rekombinantnih DNA molekul. Pri tej ločitvi (segregaciji) heterodupleksov in nadaljni sintezi nove verige pride do sprememb zaradi popravljalnih mehanizmov.

Pri rekombinaciji dveh dvojnih DNA vijačnic se pojavi intermediat s prekrižanimi verigami, imenovan Holliday-ev mostiček (sl.11-8). Obe dvojni DNA sta na kratkem delu denaturirani. Na mestu stika prihaja do parjenja baz. Prosta rotacija osi DNA molekule dopušča, da se na mestu Holliday-evega stika prehaja enojna veriga iz ene dvojne vijačnice na drugo vijačnico in obratno.Ta premik poteka brez izgube parov in tvorbe neustreznih vezi. Ko je ta prečna povezava vzpostavljena, lahko potuje vzdolž molekul kot zadrga. Pri tem pride do zamenjave obsežnega dela verige, dobimo druge dele hibridne DNA, ki lahko vsebujejo heterodupleksne regije (sl. 11-9).

Druga lastnost Holliday-eve strukture je zmožnost izomerizacije. Sterične preureditve povzročijo spremembo položaja posameznih vrvic. Na koncu nukleaza prekine prečno povezavo, sprostita se dve izomeri (sl. 11-10). Drugi proteini pri rekombinaciji: • Nukleaza (neidentificirana) reže Holliday-eve stike in s tem sprošča rekombinantne DNA

molekule • nekateri proteini DNA sinteze

16


• RecBC protein (2 podenoti, Mr=300 kD, produkt genov RecB in RecC v E. coli). Če je ta protein defekten, je frekvenca rekombinacije po konjugaciji 100X manjša. Ima dvojno aktivnost: deluje kot nukleaza in razvija dvojno DNA. Posledica teh aktivnosti je izpostavitev enojne DNA z enim prostim koncem. S tem je omogočena vezava RecA proteina.

Mehanizem delovanja (sl.11-17): RecBC začne razvijati verigo samo, če ima DNA prosti konec. Potrebuje energijo ATP, da lahko potuje vzdolž ene vijačnice. Pri tem zavija in razvija DNA. Ker je hitrost odvijanja večja od hitrosti zavijanja, nastaneta dve enoverižni zanki (»zajčja ušesa«). Zanki raseta, dokler RecBC ne razvije mesta χ (= hi, specifična sekvenca nukleotidov 5′ GCTGGTGG 3′). Ob tem mestu protein deluje kot nukleaza in reže vrvico. χ mesto je v E. coli zelo pogosto (okoli 1000 takih mest). Rec BC protein deluje tudi na bakteriofagno DNA.

Nerecipročne rekombinacije Pri genski konverziji (zamenjavi) pride do izgube enega alela, drugi je podvojen (str. 325, sl. 11-18). Do izgube pride pri nastanku heterodupleksa, kjer popravljalni encimi izrežejo nekomplementarni bazi in nastane nerecipročna rekombinacija.

Insercije in delecije zaradi napak pri crossing over-ju

Pri crossing over-ju pride včasih do nastanka heterodupleksa (sparjeni verigi nista čisto homologni). To lahko vodi do insercije in delecije večjih blokov nukleotidov, kar ponavadi izvrši RecA protein (str. 326, sl.11-29). Rekombinacijski popravljalni sistem poškodovane molekule DNA

Poleg tega, da je crossing over vzrok za gensko raznolikost, ima tudi pomembno vitalno vlogo pri popravljanju DNA. 1. Del ene nitke dvojnega heliksa je poškodovan oz. manjka Mehanizem popravljanja (str. 324, sl. 11-16) a) RecA protein zapolni poškodovano mesto , prisotna je še homologna DNA za to mesto. b) Nukleaze cepijo nepoškodovano homologno DNA, ki zapolni poškodovano mesto oz.

vrzel, dvojna heliksa sta povezana. c) Vrzel se premesti na drugi heliks, ki ga dogradijo DNA polimeraze. Rekombinacija kot popravljalni mehanizem pride v poštev , če sta dva T-T dimera blizu skupaj ali pa če pride do navzkrižne vezave C-C zaradi delovanja mitomicina, saj se podvojevanje ob takšnih mestih ustaviin potrebna je rekombinacija s homologno DNA. 2. Del dvojnega heliksa je poškodovan (vzrok so lahko X-žarki). Mehanizem popravljanja temelji na uporabi nepoškodovanega homolognega dvojnega heliksa DNA (sl.11-20):

17


a) Nukleaze izpostavijo odtrgana konca , RecA protein zapolni vrzel. b) Homologni nitki se izmenjata in pride do tvorbe dvojnega rekombinacijskega skupka. c) Vrzeli zapolnijo DNA polimeraze z nukleotidi. d) Dvojna heliksa se ločita. (SKICA 4)

18


Mestoma specifična rekombinacija

To je rekombinacija med določenimi mesti, delno homolognimi. Na teh mestih so sekvence za encime, ki katalizirajo rezanje in ponovno združevanje. Velikokrat je rezultat drugačno izražanje genov.

Primer: Bakteriofag λ in E. coli: rekombinacija med mestoma att.P (na fagu) in att.B (na bakteriji) (str. 329, sl.11-21). Za ta primer, kot tudi na splošno, velja: izmenjava je recipročna, ohranja DNA in se pojavlja na specifičnih nukleotidih brez kratke homologne regije fagne in bakterijske DNA. Bakteriofag λ kodira encim λ integrazo, ki usmerja vključitev faga λ v E. coli in rekombinacijo. Na mestu att.B sedi protein IHF.

Mehanizem rekombinacije: λ integraza cepi ob mestih att.P in att.B in vgradi fag v bakterijski kromosom, fag pa postane neaktiven profag. Integraza deluje podobno kot topoizomeraza II. Isti mehanizem velja tudi za umetno narejen plazmid, ki vsebuje oba – att.P in att.B.

Integraza prepozna iz 250 baznih parov sestavljen att.P, vzdolž katerih potekajo ločena oprijemalna mesta za integrazo in IHF (str. 330, sl. 11-23). Att.B pa sestavlja okoli 20 baznih parov. Obe mesti imata nekakšno jedro, ki je homologni del iz 15 baznih parov. Tu poteka crossing over in je tudi oprijemališče za integrazo.

Reverzibilni proces je ekscizija, fagna in bakterijska DNA sta spet ločeni. Profag λ ima gen za ekscizionazo, ki skupaj z integrazo omogoči obratno reakcijo.

Mestoma specifična rekombinacija regulira gensko ekspresijo –

rekombinacija med mestoma na isti DNA molekuli

Pri takšni rekombinaciji sta lahko dve mesti glede na orientacijo rekombinantnih mest (str.331, sl.11-24): 1. Če sta rekombinantni mesti nesprotno obrnjeni, pride do inverzije vmesno ležečega

segmenta. 2. Če sta rekombinantni mesti enako obrnjeni, pride do ekscizije oz. odstranitve vmesnega

segmenta. Pogosto se takšna rekombinacija uporablja za regulacijo prisotnosti oz. odsotnosti zunanjega proteina, ki ima lahko vlogo površinskega antigena. Takšen je flagelarni antigen Salmonelle, sestavljen iz dveh proteinov: H1 in H2, ki se izražata alternativno. (SLIKA 5)

19


Transpozoni prenašajo gene na nova, nedoločena mesta (str. 332)

Pri rekombinaciji se vrstni red genov na kromosomu običajno ohrani. Eksperimentalno pa so ugotovili, da povsem nepričakovano prihaja tudi do prestrukturiranja kromosoma. Najbolj nazoren primer genskega premeščanja je bakterijska rezistenca proti antibiotikom, kot je tetraciklin (Tc), penicilin,…

Geni bakterijske rezistence proti antibiotikom se lahko prenašajo s plazmidi, ki niso homologni bakterijskemu kromosomu.

V celici, ki vsebuje plazmid z informacijo za rezistenco, se geni za rezistenco občasno pojavijo v bakterijskem kromosomu ali v genu inficirajočega faga, z rekombinacijo, povsem brez homologije.

Po vključitvi genov za rezistenco v nov genom, se ti geni lahko ponovno prenesejo (iz bakterijske DNA v kak drug plazmid), vendar so taki primeri redki. TRANSPOZIBILNI ELEMENTI (TE) so specifična zaporedja DNA, ki se lahko premikajo z enega mesta v genomu na druga, brez homologije. Znani TE so dolgi od 700 do 40 000 baznih parov. Te so lahko:

• Enostavni = insercijske sekvence (IS) Ti vsebujejo le informacijo za transpozicijo. Nimajo specifične funkcije v celici, vendar z insercijo lahko spreminjajo gensko aktivnost.

• Kompleksni = transpozoni (Tn) Kompleksni transpozoni poleg informacije za transpozicijo vsebujejo še od enega do nekaj genov za lastnosti, kot so: rezistenca na antibiotike, produkcija toksinov,…

Na konceh kompleksnih Tn so IS ali pa vsaj ostanki IS. To pomeni, da se Tn verjetno formira, kadar se IS hkrati vključijo na obe strani gena, IS tako postaneta del celote kompleksnega transpozona in se ne moreta več samostojno premikati, temveč se cela skupnost prenaša vezano. Transpozoni s naravno prisotni v vseh organizmih. Faktorji prenosa rezistence sestojijo pretežno iz transpozonov in

lahko določajo rezistenco za več antibiotikov hkrati (str. 335) Multiplo rezistentne bakterije predstavljajo resen medicinski problem. Patogena bakterija lahko postane rezistentna na več antibiotikov hkrati, ko v svoj genom vključi plazmid z informacijo za rezistenco na vsakega od teh antibiotikov. Informacije za rezistenco se v plazmidu nahajajo na ločenih genih.

Razvoj multiplo rezistentnih plazmidov je omogočila sposobnost transpozonov, da se rekombinirajo brez homologije in tako združijo v en sam plazmid, katerega obstanek je zagotovljen z redno uporabo kombinacije antibiotikov.

Kompleksen plazmid R1 je naravni element. Sestavljen je iz transpozonov z informacijo za rezistenco na kloramfenikol (Cm) in konamicin (Cn). Poleg tega vsebuje še Tn4 z informacijo za rezistenco na sulfonamid (Su), streptomicin (Sm) in amplicin (Ap) (stran. 334, sl. 11-26).

Sam Tn4 pa vsebuje še ločen, samostojen transpozon Tn3, ki vsebuje le informacijo za rezistenco na Ap.

20


Celotna skupina genov za rezistence (=r-determinanta), je povezana z ostalimi zaporedji, ki vsebujejo informacijo za replikacijo in prenos plazmida. Produkti teh genov zagotovijo kontakt donorja z recipientom, kar omogoči prenos plazmida iz ene celice v drugo.

Transpozoni vsebujejo gene, ki usmerjajo in regulirajo njihovo transpozicijo (str. 334)

Geni za rezistenco na antibiotike so le dodatna informacija v transpozonski DNA. Njena osnovna informacija služi usmerjanju in reguliranju frekvence lastnega gibanja. Za vedenje transpozonov sta bistveni dve lastnosti: 1. Obrnjene ponovitve (IR):20 do 40 nukleotidov iz enega konca je skoraj identično

ponovljenih na drugem koncu Tn, le z obratno orientacijo. 2. Gene, ki kodirajo transpozazo (to je encim,ki katalizira insercijo kromosoma na novo

mesto). Koncentracija transpozaze v celici je zelo nizka, zato je transpozicija redka.

Primer za Tn10: v povprečju se sintetizira manj kot ena molekula transpozaze v vsaki generaciji. Taka količina encima omogoči transpozicijo Tn10 enkrat v 107 celičnih generacijah. Pri višjih koncentracijah transpozaze se število transpozicij poveča do 1000X. Zelo verjetno je število naravnih transpozicij regulirano s koncentracijo transpozaze.

Pred nedavnim so odkrili pomemben dejavnik za ekspresijo in delovanje transpozaze. Promoterji za delovanje transpozaze pri Tn10 in nekaterih drugih transpozazah imajo GATC zaporedje baz v DNA. Komplementarna sekvenca sekvenci GATC je ravno GATC (smer 5′→3′). Na tem mestu sta metilirani obe verigi DNA. Pod takimi pogoji je promoter relativno neaktiven. Po podvojitvi DNA adenin v novo sintetizirani verigi v zaporedju GATC kratek čas ni metiliran. To je hemimetilirano stanje, v katerem je promoter mnogo bolj aktiven, zato se majhen del transpozaze sintetizira takoj po replikaciji.

Podobno tudi mesto v Tn10, na katerega deluje transpozaza, vsebuje GATC zaporedje. Transpozaza je mnogo bolj dovzetna za to zaporedje, dokler še ni metilirana. Zato Tn10 teži k temu, da bi prišlo do transpozicije takoj po replikaciji DNA. Ni še znano, ali tudi drugi dejavniki v celici vplivajo na metilacijo in tako tudi na število transpozicij.

Nekateri transpozoni vsebujejo tudi informacijo za encim resolvazo. Ta katalizira

drugo stopnjo transpozicije (str. 336, sl.11-29). Pri Tn10 ima resolvaza še dodatno funkcijo, ki je neodvisna od prve: je represor lastnega gena in gena za transpozazo (str.335, sl.11-27). Veže se na transpozon med gen za resolvazo in gen za transpozazo in ju tako inhibira. Zato imata oba gena v normalnih pogojih nizko stopnjo ekspresije.

Potek prenosa transpozonov (str.335) 1. Znano je, da je prenos transpozona izredno natančen. Prenese se celotno zaporedje baz Tn

in niti delček iz DNA pred in po koncu transpozona. To omogoča encim (najverjetneje kar sama transpozaza), ki prepozna oba konca Tn. Konca sta običajno identična, saj imata isto vezavno mesto na transpozazi.

21


2. Na mestu vključitve transpozona v tarčno DNA se tvori natančna podvojitev 3-12 baz tarčne DNA (odvisno od transpozona) (str.335, str.11-28). Med transpozicijo mora torej priti do sinteze DNA, da se lahko tvori kopija tarčnega mesta. (To je bistvena razlika med transpozicijo in mestoma specifično rekombinacijo pri λ integraciji).

3. Večina transpozonov se lahko vključi v kateri koli del novega genoma, čeprav se ne vključujejo povsem naključno. Raje vdrejo v določena zaporedja v DNA. Nekateri, podobno kot restrikcijski encimi, napadajo specifična 4 ali 6 b.p. simetrična zaporedja.

Delovanje transpozaze • Transpozaza poveže oba konca Tn s tarčnim mestom na DNA. • Nato transpozaza izreže Tn: en konec zareže na notranji verigi donorske DNA, drugi

konec pa na zunanji verigi.

• Pri tem topoizomeraza poveže osvobojena konca transpozona z začetkom oz. koncem tarčnega zaporedja. Sedaj sta DNA molekuli povezani na vsakem koncu z eno verigo originalnega transpozona.

Nadaljnje faze so odvisne od tega, ali gre za enostavno ali za replikativno transpozicijo. Pri enostavni transpoziciji pride še do dveh rezov, ki ločita transpozon od donorske DNA.

Transpozon se tako v celoti prenese v DNA recipienta, v DNA donorja pa ostane praznina, ki je za celico smrtna. DNA polimeraza vstavi nekaj nukleotidov in tako dokonča kopijo tarčnega mesta. Enostavna transpozicija je konservativen proces za prenos transpozona na novo mesto. Pri replikativni transpoziciji pa pride do podvojitve kromosoma. Ena kopija Tn se prenese

v recipienta, ena pa ostane v donorju. V tem primeru ostane donorska DNA neprizadeta. Namesto da bi prišlo do reza, DNA polimeraza sintetizira ob obeh starih verigah še novi. Nastane kointegrat.

V reakciji, podobni λ integraciji, encim resolvaza katalizira mestoma specifično

rekombinacijo preko obeh kopij transpozona. Končni produkt sta obe ločeni molekuli DNA, ob katerih vsaka vsebuje po eno kopijo transpozona.

V primeru, da encima resolveraze ni:

- kointegrat je končni produkt - kointegrat se nepravilno deli v 2 neodvisni, spremenjeni DNA molekuli Transpozicija na drugo mesto v isti DNA povzroči inverzijo ali delecijo, ker bistveno spremeni strukturo kromosoma. Novejše raziskave so pokazale, da poteka transpozicija pri višjih organizmih bistveno drugače kot na bakterijskih transpozonih. Gre predvsem za Tn, sorodne retrovirusom. Pri kvasovkah se Ty elementi najprej prepišejo v RNA, to pa nato encim reverzna transkriptaza prepiše v DNA. DNA kopija se nato rekombinira na novo mesto gostiteljskega kromosoma z dosedaj še neznanim mehanizmom.

22


REPARACIJSKI MEHANIZMI 1.) FOTOREAKTIVACIJA NEKATERI DNA REPARACIJSKI ENCIMI SPOZNAVAJO IN SPREMINJAJO SPECIFIČNE PRODUKTE OKVAR DNA: FOTOLIAZA IN O6 METILGVANIN METILTRANSFERAZA Čeprav večina okvar zahteva radikalne posege, se lahko dve pogosti leziji (okvari) DNA popravita direktno z encimi, ki enostavno obrnejo kemijsko spremembo. Pirimidinski dimeri so tarča univerzalnega encima fotoliaza, ki se veže na dimer in katalizira drugo fotokemično reakcijo, tokrat z uporabo vidne svetlobe. V procesu fotoreaktivacije spremeni ciklobutanov obroč nazaj v pirimidinske baze. Drugi tip poškodb je rezultat alkiliranja prenosa metilnih ali etilnih skupin na reaktivna mesta baz in na fosfate v DNA verigi. Alkilirajoče kemikalije vsebujejo nitrozamin in zelo močna laboratorijska mutagena sredstva metilnitrozogvanidin. Eno od najbolj ranljivih mest alkiliranja je baza gvanin, ki je posebno ranljiva za metiliranje na kisiku šestega ogljikovega atoma. Produkt O6 metilgvanina se pogosto napačno spari s timinom, spreminjajoč GC v AT v procesu podvojevanja DNA. Ta okvara se odstranjuje s celičnim encimom O6 metilgvanin-metiltransferaza, katerega kodira gen ada, ki v dvojni verigi DNA prepozna O6 metilgvanin in odstrani metilno skupino s prenosom le-te na AK encima. Isti encim prav tako odstranjuje mogoče moteče metilne skupine s fosfatov DNA verige. Nenavadnost te reakcije je, da ne obstaja sredstvo, s katerim je možno regeneriranje nemetiliranega encima- za vsako odstranjevanje metilne skupine se porabi nova encimska molekula. Če se rastoče E.coli izpostavijo nizki in relativno nenevarni koncentraciji nitrozogvanidina, so potem mnogo bolj rezistentne proti mutagenim in toksičnim efektom kemikalij. Ta inducirana odpornost je imenovana adaptivni odziv in je posledica 100- kratnega porasta vsebine O6 metilgvanin-metiltransferaze v celici in od istočasne indukcije glikozilaze, ki odstranjuje alkilirane baze iz DNA verige. Indukcija ?????? blokirana z mutacijami ada gena, čigar produkt je zaradi tega istočasno encim (transferaza) in pozitivni regulator samega sebe in glikozilaze. Ni znano, kako regulacija deluje, menimo pa, da je inducirajoči signal metilirana DNA in da transferazna aktivnost z metilnimi skupinami inicira ta pomemben regulatorni efekt. VEČINA DNA POPRAVKOV JE ODVISNA OD INFORMACIJE V KOMPLEMENTARNI DNA VERIGI Dvojna veriga DNA je tista, ki omogoča popravilo skoraj vsake okvare ne glede na to, kakšna je kemična sprememba. Potrebna informacija za obnovo poškodovanega segmenta je prisotna v komplementarni verigi. Seveda to velja, če je poškodba omejena samo na 1-2 komplementarni bazi. Glavnem se dogaja, da sta v verigi poškodovani le 1-2 sosednji bazi, tako da je možnost izgube obeh komplementarnih parov majhna. Težko si je predstavljati, kako bi lahko obstajali stabilni kompleksni genomi brez dvojne informacije, ki jo omogoča dvojna vijačnica. Genomi, sestavljeni iz enoverižne DNA, morajo preživeti brez te prednosti. Eden izmed takšnih je fag

23


2.) EKSCIZIJSKO POPRAVLJANJE Obstaja več načinov, kako se pokvarjena baza ali segmenti DNA odstranijo z ekscizijskim popravilom. Bodisi da je prišlo do prekinitve v enem od delov DNA verige ali pa do razpoke v DNA, je na mestu poškodbe vedno isti intermediat: 3 hidroksilni konec, za katerega lahko DNA polimeraza inicira sintezo za popravilo poškodovanega dela. Celice mutirane v DNA polimerazi I genu kažejo pomanjkljivost v ekscizijskem popravljanju; ta encim je sam zadosten in mobilen za izpolnjevanje manjših razpok. Drugače pa je encim DNA polimeraza III velik in kompleksen in ostaja vezan na replikativno vilico za daljši čas in je prisoten samo v nekaj kopijah v celici. Drugi pogosti esencielni encim je DNA ligaza, ki zapečati razpoko po delovanju DNA polimeraze I. 2.a) UvrABC – UvrAB C ENDONUKLEAZA ODSTRANJUJE SEGMENT IZ 12-tih BAZ, KI OBKROŽAJO POŠKODOVANO MESTO. Izoliranje mutantov je bilo bistveno za razumevanje popravljalnih mehanizmov. Poleg mutacij v fotoliaznem genu phr, se mutacije v E. coli, povzročene z UV-svetlobo, nahajajo v glavnem v treh genih: uvrA, uvrB, uvrC. Za razliko od fotoreaktivacije, reparacijski sistem, ki ga ti geni kodirajo, ni specifičen za UV poškodbe, temveč odkriva vsako resnejšo poškodbo, ki inducira spremembo oblike DNA heliksa. Trije geni kodirajo podenote enega encima, ki odstranjuje poškodovani DNA segment z rezanjem verige, ki ga vsebuje. Mnogo let so menili, da encim, ki ga kodirajo ti geni, dela en rez v DNA in da je translacijska aktivnost DNA polimeraze tista, ki odstranjuje poškodovani del. Nekateri fagni encimi dejansko delujejo na ta način. S kloniranjem treh uvr genov je določeno, da se njihovi polipeptidni izvodi proizvedejo v obilni količini. Ko so pomešani in preizkušeni in vitro na DNA, ki vsebuje pirimidinske dimere, se je odkrila bolj kompleksna aktivnost, odvisna od vseh treh proizvodov: uvrABC encim. Reže na obeh straneh dimera (okvare) in s tem loči 12-bazni oligonukleotid, ki vsebuje okvaro. Za sabo pušča 12-bazno razpoko, ki se polni z delovanjem DNA polimeraze in končno za?????? DNA ligazo (slika 12-8). Iz aktivnosti na različnih vrstah poškodb je jasno, da uvrABC nukleaza ne zaznava nobene poškodbe direktno, ampak prepozna odsotnost normalne DNA oblike. 2.b) POŠKODONVANE BAZE LAHKO ODSTRANI GLIKOZILAZA Celice tudi na drug način izključujejo poškodovane baze. Ta način se začenja z encimom glikozilaza, ki zazna posamične nenaravne baze in jih odstranjuje z deoksiriboze, pri tem pa ohranja nepoškodovano vez sladkor-fosfat. Luknja, ki nastane, se imenuje AP mesto (AP SITE), in je kratica za apurinske (manjka A ali G) ali apirimidinske (manjka C ali T) luknje. Te luknje lahko nastanejo tudi pod naravnimi fiziološkimi pogoji pri spontani hidrolizi glikozidne vezi.. Luknjo prepozna AP endonukleaza, ki prekine fosfodiestrsko vez med sladkorjem in fosfatno skupino poleg manjkajoče baze. DNA polimeraza začne sintezo tako, da nadomesti poškodovani nukleotid in še nekaj sosednjih nukleotidov.. Ko DNA polimeraza veže prosti konec, njena 5'-3' eksonukleazna aktivnost povzroči izrez nekaj nukleotidov pred manjkajočo bazo in njena polimerizacijska aktivnost zapolni celotno luknjo z nekaj nukleotidi. Proces, kjer DNA polimeraza simultano polimerizira novo DNA in degradira DNA pred rastočim mestom se imenuje NICK TRANSLATION. DNA ligaza nato zalepi razpoko.

24


Obstaja mnogo različnih glikozilaz, ki odstranjujejo specifične okvare, predvsem metilirane baze. URACIL DNA GLIKOZILAZA popravlja napako povzročeno z naravno nestabilnostjo citozina. Deaminacija citozina se v DNA pojavlja spontano in daje uracil. Glikozilaza prepozna in zamenja ostanke uracila v DNA, s čimer omogoča citozinu, da ga DNA polimeraza nadomesti. Ta reparacijski sistem ne deluje, če je citozin metiliran na 5C-atomu, kar se pojavlja pri sekvencah, ki so zavarovane pred restrikcijskimi endonukleazami. 5-metilcitozin se normalno pari v DNA, toda njegova deaminacija nam da timin in ne uracil. Timin je naravna baza in uracil DNA glikozilaza ga ne zamenja. Namesto tega ostane v paru z adeninom in povzroči porast mutacij. Zato so 5-metilcitozin vroča mesta (HOT SPOTS) za spontane mutacije. 2.c) MISMATCH KOREKCIJA ODSTRANJUJE NAPAKE, KI SE IZMAKENJO ODČITAVANJU (=PROOF-READING) Nekatere napačno sparjene baze se izognejo celo proof-reading aktivnosti bakterijskih DNA polimeraz. DNA polimeraza pusti približno eno napako na 10 podvojenih baznih parov, vendar se celo te ne pojavljajo kot mutacije, ker je stopnja merjenih mutacij najmanj ena napaka na 10 nukleotidov. V E.coli je za določeno stopnjo točnosti odgovoren mismatch korekcijski encim, kodiran z mutH, mutL in mutS geni. Encim nadzira novo replicirano DNA zaradi napačno sparjenih baznih parov in odstranjuje enoverižni segment, ki vsebuje napačni nukleotid. S tem omogoča DNA polimerazi vključitev pravilne baze, ki zapolni vrzel. Problem, ki pri tem nastaja je, kako določiti, katera baza iz napačno spojenega para je napačna, saj sta obe naravni komponenti DNA. Če bi baze iz napačno sparjenih parov odstranjevali po principu slučajnosti, bi v polovici primerov odstranili pravilno bazo namesto napačne. S tem bi samo potencirali mutacije namesto da bi jih preprečili. Zato specifičen signal, kontroliran s časovnim mehanizmom, usmerja mismatch ekscizijski sistem vedno proti novo sintetizirani verigi. Korekcijski encim odstranjuje DNA, ki vsebuje napačno bazo edino iz verige, v kateri je tudi zaznal zaporedja GATC (slika 12-11). Če metilaza, kodirana z dam genom, najprej modificira adenin v GATC sekvenci v N6 –metiladenin, korekcijski encim ne more delovati in ne pride do ekscizije. Večina GATC zaporedij (sekvenc) v celici se modificira po svoji sintezi, vendar po kratki zamudi (nekaj sekund do nekaj minut). To je dovolj dolgo, da omogoči mismatch korekcijskem encimu, da se veže tako, da je usmerjan proti novosintetizirani DNA verigi. Korekcijski encim ne zazna samo posamezne napačno sparjene baze, ampak tudi majhne adicije in delecije, tako da reducira napake. 2.d) REKOMBINACIJA POPRAVLJA DNA TAKO, DA V NJO VGRAJUJE NEPOŠKODOVANE VERIGE EKSTRAHIRANE IZ DVOJNE DNA Ekscizijsko popravljanje uporablja komplementarno verigo DNA kot osnovo za zamenjavo poškodovanega dela. Včasih pa ta osnova ni dostopna, kot na primer, ko replikacijska vilica naleti na okvaro (pirimidinski dimer) in takrat oddvoji verigi, preden nastopi ekscizijsko popravljanje. Če manjka dvojni segment, ni možno dvojno popravilo. V tem primeru je vsa informacija izgubljena na mestu poškodbe in se lahko obnovi samo s pomočjo ustreznega DNA segmenta iz druge, vendar identične molekule. To je rekombinacijsko popravljanje. Ustrezen vir DNA je skoraj vedno v celici. Na primer, če sta obe verigi poškodovani v nereplikacijskem območju, ima bakterijska celica pogosto eno ali več dodatnih kopij svojega kromosoma, ki se lahko izkoristijo. Celice višjih organizmov o v glavnem diploidne in nosijo isto ali skoraj isto zaporedje na vsakem kromosomu homolognega para. Ključ za

25


rekombinacijsko popravljanje je encim, ki učvrsti zaporedje na obeh straneh okvare k njegovem komplementarnem delu. V E.coli to vitalno funkcijo opravlja RecA PROTEIN.

INDUCIBILNOST SOS DNA POPRAVLJAJOČIH GENOV Ker c. lahko regulira ekspresijo genov v odvisnosti od potrebe, ni presenetljivo, da so mnogi DNA reparacijski mehanizmi inducirani ob poškodbi DNA; na primer metiltransferaze so inducirane ob abnormalnem alkiliranju DNA v procesu adaptivnega odgovora. Najpomembnejša skupina je sestavljena iz SOS genov, katerih regulacija je opisana v 16. Poglavju. SOS geni so induirani s poškodbo, ki je dovolj močna, da ustavi DNA sintezo. Primer za okvaro, ki inducira SOS je pirimidinski dimer, ki se sploh ne more spariti. Ko replikacijska vilica sreča dimer, se ustavi in nadaljuje svoje delovanje na določeni oddaljenosti od dimera, pri čemer vmes pusti razpoko, na katero se veža rekombinacijski encim RecA PROTEIN. Vezavo na enoverižno DNA aktivira RecA protein, da izvrši encimsko funkcijo, popolnoma ločeno od rekombinacije: da s proteolizno cepitvijo uniči represor za SOS gene (LexA represor). Na ta način RecA protein pomaga obnavljanju istočasno z rekombinacijo in posredno z indkcijo približno 15 SOS genov (tabela 12-1). Nekateri od teh genov so že opisani UvrA, UvrB, UvrC in RecA in vsi so prisotni v zaznavni količini celo brez indukcije, čeprav se po poškodbi DNA mnogo hitreje aktivirajo. Drugi SOS geni kodirajo proteine vključene v DNA sintezo in s tem tudi popravljanje DNA.

BAZE, KI SO PREVEČ POŠKODOVANE ZA PARJENJE, POSPEŠUJEJO MUTACIJE: ERROR-PRONE REPAIR

Čeprav vemo, kako bazni analogi in nekatere modificirane baze povzročajo mutacije, še ni popolnoma jasno, kako se popravljajo mutacije, kadar so baze tako poškodovane, da jih ni mogoče spariti. To je eden od najznačilnejših procesov, s katerim deluje večina naravnih mutagenov in večina karcinogenov. Celice lahko nadaljujejo DNA verigo kljub očitnemu pomanjkanju temeljnih informacij na mestu okvare. Pomembna mutagena struktura te vrste je 6-4 fotoproizvod, induciran z UV-svetlobo, sestavljen iz dveh sosednjih pirimidinskih baz (slika 12-5). Ekstremni slučaj je DNA molekula, ki ji manjka cela baza (apurinsko ali apirimidinsko mesto). Da bi pokazali, da je možno takšno drastično spremembo popraviti, so vzeli apurinsko DNA, napravljeno in vitro s pomočjo kratkotrajnega tretiranja enoverižne x174 DNA s kislino, ki povzroča depurinizacijo samo enega ali nekoliko nukleotidov. Ker x174 DNA lahko okuži protoplast, je možno ugotoviti, če je celica sposobna popravka apurinske DNA. Progeni fagi so obstojni le, če imajo nukleotid na mestu, kjer je DNA, s katero smo inficirali celico, imela luknjo. Celica obnavlja del inficirajoče DNA , vendar pri tem dela mutacijo, ker ne obstaja informacija, po kateri bi izbrala pravilno bazo za popravilo enoverižne DNA. Proces zato imenujemo ERROR PRONE POPRAVLJANJE. Izgleda, da je ta tip popravila absolutno zadnje sredstvo za celico, ki ga uporablja, kadar ne obstaja vzorec za pravilno popravljanje. Bolje je vključiti bazo, ki je verjetno napačna in omogočiti nadaljevanje replikacije, kot pa da sploh ni replikacije. Mutacije so tu zelo številne- tri od štirih. Ironično je to, da je popravilo vzrok za mutacijo.

26


UmuC, UmuD PROTEINA IN RecA SO POTREBNI ZA ERROR PRONE POPRAVLJANJE

Glavni ključ mehanizma error prone je sodelovanje dveh E.coli genov UmuC in UmuD (nemutirana za UV). Ta gena sta prvotno identificirana kot preprečevalca mutageneze z UV žarčenjem.To sta SOS gena, ki delujeta po tretiranju celice z SOS induktorjem (error-pron reparacjo včasih imenujemo SOS repair). Celice, mutirane v enem ali drugem genu, so bolj občutljive na svetlobo kot pa divji sev, kar dokazuje, da UmuC in UmuD omogočata preživetje s popravilom poškodbe. RecA protein je potreben za error-prone reparacijo vsaj indirektno kot mediator indukcije UmuC in UmuD. Genetski eksperimenti nakazujejo, da RecA tudi direktno sodeluje v tej reparaciji. Kako deluje reparacija? Vemo, da so mutacije v glavnem enobazne spremembe na mestu poškodbe in ne na primer večje zamenjave DNA s pomočjo nekega mehanizma, ki cepi in preureja DNA zaporedja. Na nek način UmuC in UmuD povzročata, da se baza vključi v rastočo verigo, čeprav ne obstaja osnovna baza. Proces bi moral biti sicer prepovedan, vendar je v takšnih okoliščinah mogoč. Imenuje se BASE SINTEZA. Po enem izmed modelov, s katerim naj bi razložili to sintezo je, da UmuC in UmuD lahko delujeta tako, da preprečita proof –reading 3'-5' eksonukleaze DNA polimeraze. Drugi pravi, da UmuC in UmuD kodirata popolnoma novo polimerazo, ki lahko dela napake. Kak se v vse to vključuje RecA ni znano. Ena možnost bi bila ta, da se RecA veže na DNA v razpoki , ki jo napravi poškodba in ustavi DNA sintezo. RecA se morda lahko tudi veže na UmuC in UmuD in ju usmeri na mesto, kjer je potrebna error-prone sinteza.

27


MUTACIJE Z razvojem organizmov je neobhodno povezano spreminjanje molekule DNA. Govorimo o mutacijah. Z evolucijskega gledišča se tovrstne spremembe dogajajo dokaj redko. DNA je potemtakem dokaj stabilna molekula, kot tudi mehanizem podvajanja. Ko govorimo o mutacijah, si vedno zamišljamo le negativne posledice. Vsekakor ne smemo pozabiti, da mutacije z razvojnega stališča pomenijo boljšo prilagoditev osebka vdanem okolju in s tem večjo verjetnost preživetja. Za uspešnejši prenos dednih informacij je pomembna natančna izvedba replikacije, za kar je odgovoren encimski kompleks in sposobnost odpravljanja napak, ki bi lahko uničile funkcijo DNA. Mutacije lahko le delno okvarijo gen. Če je funkcionalnost gena popolnoma uničena, govorimo o ničelnih (null) mutacijah. Tovrstne mutacije ne vključujejo le insercij in delecij baz, temveč bolj ekstenzivne insercije in delecije. Tako ničelna mutacija lahko nastane z insercijo transpozona ali s funkcionalno spremembo v procesu rekombinacije. Najenostavnejša oblika mutacije je zamenjava ene baze z drugo. Poznamo dve vrsti genskih sprememb: TRANZICIJE in TRANSVERZIJE. Pri tranzicijah gre za zamenjavo enega purina z drugim oz. za zamenjavo enega pirimidina z drugim, medtem ko se pri transverzijah nadomesti purin s pirimidinom oz. pirimidin s purinom. Najbolj proučen mikroorganizem v molekularni genetiki je E.coli. Odkrili so, da ima ta bakterija 3'-5' eksonukleazno aktivno DNA polimerazo, katere funkcija je zagotavljanje natančno izvedene replikacije DNA. Drugače povedano to pomeni, da je zaradi prisotnosti tega encima število mutacij manjše. Kljub mnogim raziskavam identičnega encima niso našli v celicah evkariontov. Obstoji velika verjetnost o odsotnosti proof-reading sistema in s tem potrditev dejstva o pojavljanju številnih mutacij na mitohondrijskih genomih. Najbolj znano mutageno sredstvo E.coli je mutD. Mut D spremeni specifično podenoto v DNA polimerazi III in tako ovira proces, znan kot proof-reading. S poskusom in vitro so dokazali manjšo 3'-5' eksonukleazno aktivnost že omenjenega encima s spremenjeno specifično podenoto, kot bi le ta bila v primeru odsotnosti mutagenega sredstva. Predhodno smo omenili tip mutacije, pri kateri eno bazo nadomesti druga. Z delecijo ali adicijo lahko zamejamo enega ali več baznih parov. Kot matriko za replikacijo si predstavljajmo enoverižno DNA. Sam proces poteka s pomočjo DNA polimeraze, ki nosi ustrezne baze in s tem omogoča sintezo komplementarne verige. Tekom replikacije lahko pride do delecije matične verige ali adicije komplementarne. Mutacija se na ta način stabilizira. Tako nastala mutirana DNA se normalno replicira naprej. Zaradi nastale mutacije je prekinjena sinteza proteinov. Govorimo o frame shift mutacijah. Mutageni delujejo na dva načina: 1.) direktno vplivajo na DNA 2.) motijo replikacijo, tako da se vgradi napačna baza Poznamo več vrst kemičnih mutagenov:

1.) DNA REAKTIVNE KEMIKALIJE Te spojine vplivajo na kemično strukturo baz. HNO2 kot vzorčni model povzroča deaminacijo baz. V primeru njegovega delovanja bo prišlo do deaminacije adenina. Pri tem bo

28


nastal hipoksantin, ki se bo vezal na citozin namesto na timin. Sprememba kemične strukture baz lahko onemogoči nastanek kemične vezi med njimi, lahko pa pride celo do delecije baze.

2.) ANALOGI BAZ Po svoji strukturi so podobni normalnim bazam, zato se namesto njih vključujejo v DNA tekom normalne replikacije. 5 kromouracil je znan bazni analog timina.

3.) FRAMESHIFT MUTAGENI Znan je proflavin – ta povzroča adicije ali delecije ene ali več baz. Mutirana celica preživi, če je mutacija neškodljiva oz. če ima od mutacije korist. Večina mutacij ni v skladu z zgoraj navedenim stavkom, zato preživijo celice, katerih encimski popravljalni mehanizmi odpravijo smrtonosne poškodbe, kot je npr. citozin spontano deaminiranje uracila. Uracil se tako kot timin veže z adeninom. Potemtakem bazni par GC tekom replikacije postane AT. V primeru razgradnje vezi sladkor-fosfat baze ne bi bile sposobne tvorit baznih parov. Da do takih mutacij ne pride, specifični geni preprečijo nadaljnjo replikacijo DNA, saj se DNA polimeraza v primeru, da ne more tvoriti pravilnih baznih parov, ustavi. Popravljalni encimski mehanizmi imajo pomembno vlogo za molekulo DNA. Včasih nastanejo pirimidinski dimeri, ki preprečujejo nadaljnjo tvorbo baznih parov, zato nastopi encim fotolaza, ki katalizira drugo kemično reakcijo (fotoreaktivacija), katere produkt so individualne piramidske baze, ki se lahko ponovno parijo. Vloga encimov je potrebna pri vezavi metilni oz. etilnih skupin na reaktivna bazna mesta in fosfatne skupine v molekuli DNA. Te alkilirajoče skupine vključujejo nitroamine in potencialne mutagene, metil-nitrogvanidine. Gvaninska baza najpogosteje reagira z alkilirajočimi sredstvi. Nastane produkt O6-metil-gvanin, ki se veže s timinom in tako tekom replikacije spreminja GC v AT. Tako nastalo poškodbo odstrani celularni encim O6-metil-granin metiltransferaza, katerega kodira gen ada. Metiltransferaza prepozna O6-metilgranin na dvojnem heliksu DNA, poleg tega pa prepozna in odstrani tudi metilne skupine na fosfatnih skupinah DNA. Če E.coli izpostavimo nizkim, relativno neškodljivim koncentracijam metil-nitrogranidina, ugotovimo večjo odpornost na mutagene efekte. Govorimo o adaptivni reakciji, ki nastopi kot rezultat dveh konkurenčnih encimov O6-metilgvanin metiltransferaze in glikozilaze, ki odstranjujejo alkilirajoče baze iz DNA. Popravljalni mehanizmi so mogoči zaradi dvojnega heliksa DNA moleule, kajti zelo maajhna je verjetnost, da bi prišlo do mutacije dveh komplementarnih baz. E.coli ima tri gene, ki kodirajo sintezo uvrABC encima: uvrA, uvrB, uvrC. Tovrstni encim najde mutirano mesto, odreže del verige spoškodovanim mestom in tako omogoči polimerazi DNA I, da zapolni nastalo vrzel, medtem ko DNA ligaza resintetizira prinešeni del molekule v DNA verigo.

29


SINTEZA RNA Mehanizma sinteze RNA in DNA sta si na ravni nukleotidov zelo podobna, vendar pa sta biološki funkciji obeh procesov zelo različni. Sinteza DNA služi replikaciji genoma, sinteza RNA pa je transkripcija genoma, namenjena sintezi proteinov. Sinteza RNA vključuje vso kompleksnost genske ekspresije, kontrola te pa se vrši v vseh fazah od transkripcije do strukturnih sprememb proteinov,vključuje tudi časovno komponento (kdaj bo nek gen aktiven). Struktura RNA molekule RNA molekula je vedno enoverižna, informacijo za njeno sintezo pa ji daje DNA matrika, kljub enoverižnosti pa je vedno prisotna neka struktura, ki je odvisna od zaporedja nukleotidov. Skoraj vsaka RNA molekula ima kratke dvoverižne odseke, ki se tvorijo takrat, kadar dva odseka RNA vsebujeta komplamentarna antiparalelno orientirana zaporedja nekleotidov. Nekatere molekule imajo tudi strukture višjega reda npr.tRNA, rRNA(sl.13-1). Vsaka celica vsebuje različne vrste RNA, molekule različnih dolžin (od 50 pa do več 100 nukleotidov), večina molekul je linearne oblike, poznamo pa tudi cirkularne RNA molekule.

Sinteza RNA Posredovana je z genetsko informacijo, ki jo vsebuje DNA v obliki zaporedja nukleotidov, ta pa se prenese na komplamentarno sekvenco RNA nukleotidov. Sinteza RNA je encimska reakcija, ključen encim je RNA polimeraza, potrebni pa so še kontrolni proteini. Celice E.coli imajo 3000 in več molekul RNA polimeraze. Encim poveže dva nukleotida med seboj tako,da tvori 3-5 fosfodiestrsko vez med njima(sl.13-2); deluje vedno le ob prisotnosti DNA , ki mora biti odvita in odprta. Prekurzorji sinteze , so podobno kot pri sintezi DNA, nukleozid trifosfati, energija pa se tvori s hidrolizo dveh fosfatnih vezi. V dvojni vijačnici DNA , je le ena veriga matrika-DNA template-za sintezo.Ta pojav so dokazali s proučevanjem DNA-RNA hibridov, do tvorbe le teh je prišlo vedno samo z eno verigo, nikdar pa z drugo verigo istega dvojnega heliksa(sl.13-3). Vsaka veriga DNA ali RNA molekule ima definirano orienracijo; konec verige s prostim 5-ogljikovim atomom sladkorjaj je 5- konec. Nasprotni konec ima prost 3- ogljikov atom, zato je to 3- konec. Zaradi tega je sinteza tako DNA kot RNA vedno polarizirana in lahko poteka ali v 5-3 ali pa v 3-5 smeri, vendar sinteza vedno poteka v smeri 5-3. To dejstvo so dokazali z inkorporacijo inhibitorja RNA sinteze 3-deoksiadenozin trifosfata. Ta ne vsebuje 3OH in s tem prepreči vezavo naslednjega nukleotida. Če bi sinteza potekala v obratni smeri, se ta sploh ne bi mogel vezati.(sl.13-5).

Zgradba RNA polimeraze Tako kot DNA polimeraza III, ima tudi bakterijska RNA polimeraza zelo kompleksno

zgradbo, sestavljeno z večih podenot. Aktivna oblika encima (holoencim) je zgrajena iz petih polipeptidnih verig.Vse imajo kar precejšno molekulsko maso, verige se med seboj povežejo, vendar ne s kovalentnimi vezmi in tvorijo agregat, ki ima molekulsko težo okoli 450000. RNA polimeraza ima raztegnjeno ovalno-sterično obliko z dolžino, ki pokrije 60 nukleotidov DNA molekule.Vezava ___ podenote ni tako močna, zato lahko zlahka izoliramo _______ agregat, ki ga imenujemo-core enzyme-,ta ima katalitično aktivnost tudi, če ni prisotnega____ faktorja.Katalitični center je po vsej verjetnosti iz β podenot. Tu je tudi vezavno mesto.Antibiotik rifampicin inhibira iniciacijo,ne inhibira pa elongacije.

30


Podenote RNA polimeraze Gen Funkcija β´ proC vezava DNA β proB katalitično mesto RNA polimerizacije σ proD prepoznavanje promotorja,iniciacija α proA ? ω ----- ? Transkripcijski faktorji ρ rho terminacija nusA nusA elongacija, terminacija

Organizacija genov za RNA polimerazo v operonih Geni za podenote RNA polimeraze E.coli (razen za podenoto ω,za katero še ne vedo, kateri gen kodira), se nahajajo na treh operonih σ, β, α. Ti operoni vsebujejo tudi esencialne gene za sintezo DNA in proteinov (sl.13-7). Ekspresija teh genov poteka v korelaciji s stopnjo rasti celice. Regulacijski mehanizem same ekspresije še ni popolnoma pojasnjen, vendar pa vedo, da delovanje operona σ, ki vsebuje dva promotorska mesta, regulira molekula ppGpp.(gvanin z dvema pirofosfatnima skupinama). Transkripcija genov poteka neenakomerno, vendar regulacija omogoča, da so elementi vedno v ravnotežju. Genomi, ki kodirajo ribosomalne proteine na operonih σ in β, sledijo t.i.-atenuatorji-, to so občasno aktivne terminatorske sekvence. Atenuatrji prepuščajo RNA le občasno, in s tem omogočajo neenakomerno transkripcijo genov. Tako se v celici nahaja 3000 molekul RNA polimeraze in več kot 20000 ribosomalnih proteinov. Do neenakomerne ekspresije genov za DNA primazo in σ podenoto pride tudi v operonu sigma,čeprav se oba gena nahajata za atenuatorskimi mesti. Verjetno je mRNA molekula DNA primaze veliko bolj nestabilna kot mRNA sigma podenote, posledica tega je, da je v celici tudi do 60 krat več sigma podenote kot DNA primaze.Sigma operon se aktivira tudi ob -heat shocku-, regulacija pa je veliko bolj kompleksna.

RNA polimeraza prepoznava specifične startne sekvence v DNA promotorje

σ podenota sama po sebi nima katalitične funkcije, prepoznava specifična startna zaporedja DNA molekule, ki jih imenujemo promotorji. S poskusi in vitro so pokazali,da je -core enzyme- sam zmožen sinteze RNA molekule, vendar pri tem pride do sinteze na napačnih mestih »zmotne sinteze«. Prisotnost je torej nujno potrebna za pravilem začetek sinteze. RNA polimeraza s sigma faktorjem prepoznava specifično konformacijo promotorskega mesta, podobno kot encim prepoz nava svoj substrat. Ko so med seboj primerjali več kot 100 promotorskih zaporedij so ugotovili, da jih večina vsebuje dve skupni sekvenci šestih nukleotidov na mestih oddaljenih 10 in 35 baznih parov od mesta začetka sinteze. V skladu s pravili numeriranja DNA nukleotidov so jih označili kot -10 in -35 začetek sinteze , -10 in -35 so mesta , ki jih imenujemo tudi konsenzusna zaporedja.(sl.13-8). Specifična konfiguracija teh mest je razpoznavno mesto za RNA polimerazo. Konsenzusna zaporedja se nahajajo vedno na eni verigi dvojnega heliksa in so bogata z AT baznimi pari. RNA polimeraza se nanje veže precej močno in obstajajo mesta, kjer se začne encim ovijati okrog DNA verige.

31


V celici se nahajajo razllični σ faktorji, ki prepoznavajo različne promotorske sekvence, pri bakt erijah pa so našli tudi sigma faktorje, ki vplivajo na delovanje drugih predominantnih sigma faktorjev in preusmerjajo sintezo RNA molekul. σ70 bakterije Bacillus subtilis usmerja ekspresijo genov za sintezo proteinov, ki sodelujejo pri sporulaciji. σ32 faktor E.coli regulira ekspresijo genov ob -heat shocku-.

Promotorske sekvence se med seboj razlikujejo po frekvenci iniciacije RNA sinteze, to je po pogostosti vezave in tvorbe začetnega kompleksa. Ta razlika je ena izmed temeljev regulacije stopnje ekspresije genov. Stopnja ekspresije ni fiksna, ampak je odvisna od pogojev rasti. Nanjo lahko vplivajo različni proteini, ki se vežejo v bližini promotorjev. Represorji so proteini, ki ob vezavi preprečijo vezavo RNA polimeraze in s tem inhibirajo transkripcijo, frekvenca iniciacije sinteze pa se zniža. Aktivatorji se vežejo na RNA polimerazo in stimulirajo njeno aktivnost, frekvenca iniciacije pa se poveča. Protein, ki je represor nekega promotorja, je lahko hkrati aktivator nekega drugega in obratno.Tabela (13-3, str373)-regulacijski proteini, ki vplivajo na aktivnost RNA polimeraze - promotorja.

Vpliv strukture DNA na aktivnost promotorja

Čeprav sta -10 in -35 sekvenci nujni za vezavo in aktivnost RNA polimeraze, lahko tudi bližnje sekvence DNA vplivajo na aktivnost promotorja, zlasti pomembne so sekvence med 50 in 150 nukleotidom - (minus) od začetka sinteze RNA. Če pride do delecije ali do zamenjave teh sekvenc, se frekvenca iniciacij močno zniža, povečanje pa stimulira DNA, bogata z AT baznimi pari. Mehanizmov vpliva je več, vsi pa še niso dokončno pojasnjeni. Nekateri odseki so: vezavna mesta za efektorske proteine, atrakcijski centri za encim topoizomerazo, ki favorizira lokalno stanje - supercoiling- DNA ,s tem postane DNA bolj dostopna za RNA polimerazo. RNA mora pred iniciacijo sinteze oviti DNA molekulo, dejavniki, ki vplivajo na to, pa lahko povečajo aktivnost encima. Eden izmed njih je encim DNA giraza; ta povzroča negativno supernativnost DNA, to pa omogoča boljšo vezavo RNA polimeraze (ne velja pa to za vse promotorje). Nasproten učinek ima topoizomeraza, saj relaksira negativno supernativnost. Potek sinteze RNA molekule

Predpogoj za vsako sintezo je odvita DNA , takrat se lahko veže RNA polimeraza in tako nastane iniciacijski kompleks. Na mestu tega kompleksa pride do odprtja dvojnega heliksa. Prvi nukleotid , ki se veže , je ponavadi pppA ali pppG, redko kdaj pa se veže pppC ali pppU. Po sami sintezi RNA, začnejo delovati endonukleaze, ki odcepljajo fragmente novo nastale RNA molekule.Takoj ob vezavi prvega nukleotida in začetku elongacije, se od RNA polimeraze odcepi sigma faktor, predvsem zaradi tega, ker pri nadaljnih procesih ne igra nobene vloge več(slika 13-11), sproščeni sigma faktor se uporabi v drugih sintezah. Holoencim se veže na DNA veliko močneje kot sam - core enzyme-, odcepitev sigma faktorja omogoča rahlejšo vezavo RNA polimeraze in s tem boljše drsenje ob sami DNA verigi, hkrati pa onemogoča vezavo RNA polimeraze na druga promotorska mesta. Med elongacijo je dolžina odprte verige 17 baznih parov ,sam hibrid RNA/DNA , pa je dolg 12 baznih parov (slika 13-12). Hkrati s tem RNA molekula raste tako, da pride do polimerizacije RNA prekurzorjev, možno pa je tudi simultano dogajanje sinteze RNA in sinteze proteinov na isti

32


RNA. Drsenje poteka nemoteno, ko pa pride kompleks do specifičnih terminatorskih sekvenc, se elongacija hitro ustavi. Dvojni heliks se takoj zapre, encimski kompleks razpade , RNA polimeraza in novo nastala RNA molekula pa se sprostita.

Vloga transkripcijskih faktorjev pri sintezi RNA

Na delovanje RNA polimeraze vplivajo akcesorni proteini (sl.13-11), delimo pa jih na dve skupini: 1)proteini-faktorji, ki preprečijo predčasno terminacijo 2)faktorji, ki sodelujejo pri terminaciji

Protein, ki prepreči terminacijo je nusA protein, njegovo funkcijo pa so proučevali na λ bakteriofagu, kjer preprečuje terminacijo transkripcije genov faga. Njegova vezava na RNA polimerazo je reverzibilna in ima manjšo afiniteto od vezave sigma faktorja, na encim se veže po sprostitvi sigma podenote in ostane vezan med elongacijo.

Protein, ki sodeluje pri terminaciji, je ρ faktor.Terminatorji, ki so odvisni od njega, imajo dve lastnosti: -prisotnost diadne simetrije na DNA verigi, oddaljene 15-20 nekleotidov od konca (sl. 13-14) -konec DNA -templete- s šestimi A, ki se prepišejo v 6 U zaporedje na RNA t.i. poliA-poliU struktura. Transkripcija diadne simetrije omogoiča nastanek stebrička(hairpin loop) v RNA. Ko pride RNA polimeraza do terminatorjev, se tvorita stebriček in poliU struktura. Vezava med njima se v RNA zrahlja, hibrid poliU/DNA pa je zelo nestabilen, zato se RNA sprosti. Vloga ρ pri tem še ni pojasnjena, obstaja pa več namigov: vezan na RNA molekulo hidrolizira ATP, kar omogoči sprostitev le-te ,vpliva na aktivnost RNA polimeraze ob terminaciji, omogoča normalno delovanje šibkih stebričkov, ki nastanejo zaradi mutacij v DNA.

RNA polimeraza evkariontskih celic

V evkariontskih celica obstajajo tri vrste polimeraz, vsaka pa ima specifično funkcijo. RNA polimeraza I (pol I ) tvori ribosomalno RNA, pol II tvori mRNA, pol III pa tRNA in manjše RNA molekule(5S rRNA.....).Vse tri so zelo kompleksne in sestavljene iz večih podenot, poleg njih pa so v evk.celici še spec. RNA polimeraze v mitohondrijih in kloroplastih. Za vse tri obstajajo specifični promotorji in terminatorji, ki regulirajo njihovo aktivnost. V gensko ekspresijo je najbolj vključena pol II, ki tvori mRNA. Na njihovo delovanje vplivajo še posebni proteini. Regije DNA , ki vplivajo na transkripcijo, so veliko dajše, kot pri prokariontih in jih imenujemo - enhancer- mesta, mehanizem regulacije pa še ni poznan. VPLETENOST RNA V SINTEZO PROTEINOV (OSNOVE ZA

PROTEINSKO SINTEZO)

tRNA

Aminokisline nimajo posebne afinitete za direktno vezavo na mRNA, zato so za tako vezavo potrebne molekule (adapterji), ki se na aminokisline pred tem kovalentno vežejo in jih

33


tako kemijsko spremenijo. Tak adapter se za tem veže na mRNA. Vezava specifičnega adapterja na aminokislino je veliko bolj ekonomična kot bi bila kemijska modifikacija stranske verige aminokisline (za to bi bilo potrebno veliko število encimov).

Specifični encimi prepoznajo specifične aminokisline Za vezavo specifičnega adapterja in specifične aminokisline je potreben specifičen aktivatorski encim (aminoacil tRNA sintetaza ), ki prepozna tako aminokislino kot adapter. Najprimernejsši encimi za to so proteini, ker se njihove polipeptidne verige brez težav oblikujejo tako, da tvorijo specifičen kalup, kamor se prilega stranska skupina odgovarjajoče aminokisline. Primer: Tirozin tRNA sintetaza veže tirozin. Ta encim ima v svojem aktivnem centru nek specifičen atom, potreben za nastanek vodikove vezi z -OH skupino. Pri tem se sprosti 4-5 kcal/mol energije. Ker tirozin -OH skupino ima, fenilalanin pa ne, je 1000 krat večja verjetnost, da se bo na encim vezal tirozin, kot pa fenilalanin.

Tudi adapterji sami so RNA molekule

Osnovna zahteva uporabnosti nekega adapterja je njegova sposobnost, da se specifično veže na baze enoverižne mRNA. Zato ni presenetljivo, da so tudi adapterji sami enoverižne molekule RNA (tRNA). Njihove baze se povežejo s komplementarnimi bazami na mRNA preko vodikovih vezi. Adapterske molekule imajo za vezavo vseh 20 različnih aminokislin posebne strukture. Vsak tak adapter pa je tudi specifično prilagojen za vezavo z različnim nizom nukleotidov na mRNA. Zato obstaja veliko število različnih tipov tRNA. Vse pa imajo v osnovi enako obliko.

Zgradba tRNA tRNA vsebuje veliko neobičajnih baz (to so vse , ki niso A,G C, U ), ki so za razliko od običajnih , metilirane (sl.14-3-, str.385). Metilne skupine so dodane encimatsko šele po tem, ko se nukleotidi povežejo z 3-5 fosfodiestrskimi vezmi. Funkcija neobičajnih baz še ni popolnoma razjasnjena, nekatere pa imajo pomembno vlogo v funkciji tRNA. tRNA je zelo majhna molekula. Sestavlja jo okrog 75 (73-93) nukleotidov, ki so med seboj povezani s kovalentnimi vezmi v enojno polinukleotidno verigo (slika 14-1, str.384). 3 konec verige se vedno končuje z -CCA. Zadnji nukleotid na 5 koncu pa je pogostokrat G (slika 14-2,str.385). Čeprav je tRNA iz enojne verige, je veliko baz med seboj povezanih z vodikovimi vezmi. Tiste baze, ki pa niso sparjene, lahko kopulirajo z bazami drugih molekul. ZGRADBA: -akceptorski pecelj: na 3 koncu je vedno -CCA + četrti variabilni nukleotid. Aminokislina se vedno pritrdi na adenin na 3 koncu. -Če se pomikamo proti 5 koncu, pridemo do prve zanke, ki se imenuje po prvi bazi - psevdouridin = ψ. Sestavlja jo 7 nesparjenih baz. Skoraj vedno ima sekvenco 5´-TψCG-3. Ta se pritdi na 16S rRNA v 30S podenoti ribosoma. - naslednja je variabilna zanka, ki ima zelo variabilno dolžino.

34


- antikodonska zanka vsebuje 7 nesparjenih baz, med temi predstavljajo tri sosednje baze antikodon. - dihidrouridinska zanka (D loop) je razpoznavno mesto za encim aminoacil sintetazo. Je delno variabilen del z 8-12 nesparjenimi bazami. Ugotovljena je trodimenzionalna oblika tRNA, kar pomeni , da je bila predstava o tRNA v obliki deteljice pomanjkljiva: Poleg interakcij med komplementarnimi bazami deteljice, obstajajo še dodatne H- vezi med nesparjenimi bazami (včasih so povezane tudi po tri baze), ki upognejo deteljico v stabilno tercialno strukturo. Ta je približno v obliki črke L (sl.14-4,14-6,14-7, str.386 ) Večina H-vezi , ki formirajo terciarno strukturo je drugačnih kot normalne AT in GC pri DNA. Terciarna struktura se stabilizira še dodatno: -stacking (nalaganje ): skoraj vse baze v molekuli so orientirane tako, da se naložijo ena zraven druge in tako omogočijo maksimalno interakcijo med hidrofobnimi površinami..Tako je omogočena fizična stabilizacija. -dodatne vezave med bazami metilgvanin-gvanin na 22., 46. In 13. poziciji. - trojne vezave UAA, GGC. Obratna polarnost: 1. Nukleotid v antikodonu bere 4. nekleotid v kodonu. Opotekavi ( nasipan ) nukleotid: je 1. nekleotid v antikodonu. Ima določeno sterično svobodo. Npr.: U v opotekavem stanju lahko prepozna G. Izoakceptorske tRNA : Skupo ima vsaj 20 različnih tRNA, ki lahko sprejme isto aminokislino.

rRNA Ribosomalna RNA ne nosi genetske informacije. Leta 1960 je bilo ugotovljeno, da

nima informacijske vloge. mRNA se reverzibilno veže na ribosome. Le 2 do nekaj % RNA v celici je mRNA. Reverzibilno se veže na površino manjše podenote ribosoma.

Poznamo tri velikostne tipe rRNA

Vsak bakterijski ribosom ima dve veliki in eno majhno molekulo rRNA. V nasprotju z mRNA so rRNA integralne komponente ribosoma in ne morejo biti odstranjene brez porušenja ribosomalne strukture. Primer E. coli: 30S podenota ribosoma ima 16 S rRNA z 1542 nekleotidi; 50 S podenota pa 23 S rRNA z 2904 in 5 S rRNA z 120 nukleotidi. Opomba urednikov: Vsi organizmi imajo tri velikostne tipe rRNA , vsako v velikostnem razredu 5S, 16 S in 23S. Ni pa nujno, da so S vrednosti tudi enake vrednostim pri E. coli. Primer: V istem velikostnem razredu sta 12S rRNA goveda in 16S rRNA E. Coli, zato sta primerljivi med seboj. Vse rRNA so v obliki enojne verige. Imajo neenake količine G in C ter A in U. Vseeno pa je dovolj ekvivalentnih parov, ki tvorijo z H- vezmi zavoje, podobne kot pri tRNA. Dvojni heliksi so na strogo določenih mestrih (taka zaporedja ne variirajo ). Še to : Molekule RNA, ki so si podobne morfološko, so si tudi funkcionalno.

35


Primerjava strukture 16S rRNA E. Coli in goveje mitohondrijske rRNA. (Sl.14-15,str.397)

Splošna oblika rRNA velikostnega razreda 16S za vse organizme , je iz štirih sektorjev (I-IV) Goveja mitohondrijska rRNA je manjša : 12S z 954 nukleotidi. Po obliki pa sta si zelo podobni. Mesta dvojnih heliksov so v posameznih sektorjih na podobnih mestih. Primerjave molekul rRNA med različnimi bakterijskimi vrstami so pokazale, da so regije dvojnih heliksov ohranjene, četudi zaporedja nekleotidov niso. Če primerjamo posamezne tipe rRNA med različnimi organizmi ugotovimo podobno obliko (sl.14-16, str.399 ). Najmanj razlik v strukturi je pri 5S rRNA (uporaba v študiju evolucije).

Funkcija rRNA še ni popolnoma znana 16S rRNA ima zaporedje baz komplementarno zaporedju na tRNA. To omogoča pritrditev tRNA na 30S podenoto ribosoma = iniciacijski kompleks. Verjetno je tudi, da vezi med molekulami rRNA pomagajo pri povezavi obeh podenot ribosoma (70S ) v času translacije. Kot bomo videli pozneje, nekatere baze blizu 3 konca 16S rRNA formirajo začasne bazne pare z mRNA. Kljub poznanim RNA-RNA interakcijam sva še vedno daleč od razumevanja funkcij stotin nesparjenih nukleotidov na rRNA. Pri bakterijah se tRNA in rRNA sintetizirata natanko tako kot mRNA., s pomočjo RNA polimeraze, na osnovi informacij na DNA. Čeprav tRNA in rRNA skupaj predstavljata 98 % vse RNA v celici (mRNA pa 2 % ), je na DNA manj kot 1% informacij za njuno sintezo (obratna sorazmernost s količino ). To je zato, ker so zrele tRNA in rRNA precej stabilne, medtem ko mRNA ni obstojna.

Pre-tRNA in pre-rRNA

tRNA in vse tri rRNA se prepišejo z DNA kot večja kratkotrajna prekurzorska molekula (pre-tRNA in pre-rRNA), ki zori v zrelo tRNA oz.rRNA. 16S , 23S in 5S rRNA se v takem zaporedju prepišejo v eno samo 30S pre-rRNA. Ta vsebuje dodatne sekvence na obeh koncih verige (imenovane leaden in trailer regions) in tudi sekvence med vsemi tremi rRNA deli (spacer regions). Ena pre-tRNA je lahko prekurzor za eno do sedem različnih tRNA.

Zorenje tRNA

Za zorenje (izrezovanje nekaterih sekvenc ) pre-tRNA v zrelo tRNA so potrebni encimi =RNaze. Najbolj znan encim je ribonukleaza P (RNaza P ).Je endonukleaza, ki reže pre-tRNA na 5 koncu (1.rez)-(sl.14-18,str.401). Ta encim prepozna trodimenzionalno obliko tRNA in ne kakšne posebne sekvence. Ta encim ni čist protein. Je kompleks majhne molekule RNA (377 nukleotidov) in majhnega proteina. Obe komponenti prispevata k aktivnosti encima. 2.Rez opravi encim RNaza D . Je eksonukleaza. Odreže odvečne nukleotide na 3 koncu tako, da prepozna sekvenco -CCA. Rezultat rezov so molekule tRNA.

36


Pre-rRNA molekule vsebujejo tudi tRNA

Načeloma kodirata 30-40 različnih molekul pre-tRNA le ena ali dve specifični regiji na kromosomu E.coli. Nasprotno pa so regije pre-rRNA kodirane s sedmimi različnimi seti genov; lociranimi na ločenih mestih kromosoma (imenujejo se rrn operoni). Bržčas je tako število potrebno za zagotovitev velikih količin ribosomalne RNA, ki je potrebna za rapidno rast bakterije. Deli pre-rRNA , ki pozneje postanejo 16S, 23S in 5S rRNA, se med rrn operoni razlikujejo le na malo mestih (cca. 1%nukleotidov). Leader, trailer in spacer regions pa se lahko zelo razlikujejo v dolžini in sekvencah. Vzrok za to je, da so v rrn operonih odkrili poleg genov za molekule rRNA tudi gene za melekule tRNA. Na pre-rRNA sta tako v spacer regiji med 16S in 23S rRNA ena ali dve molekuli tRNA, v trailer regiji (za 5S rRNA ) pa je lahko od 0-2 tRNA (sl.14-20,str.404). Zakaj so molekule tRNA vsidrane v pre-rRNA , ni jasno. Jasno pa je, da to zahteva skupno in usklajeno delovanje encimov za procesiranje (rezanje) tRNA in rRNA.Kot pri zorenju pre-tRNA, tudi pri pre-rRNA odreže RNaza P na 5 koncih tRNA.

Pre-rRNA se najprej cepi na dvojnih regijah (procesiranje pre-rRNA)

Prekurzor 30S pre-rRNA , ki vsebuje 16S,23S in 5S rRNA, kakor tudi 1-3 sekvence tRNA , je navadno zelo kratkotrajen. Za procesiranje pre-rRNA je potreben encim ribonukleaza III (RNaza III). Karakterizirana je bila kot endonukleaza, specifična za dvojne regije RNA. Zato so predvidevali, da bodo analize leader, trailer in spacer regij pre-rRNA odkrile sosednje komplementarne sekvence, zmožne upogniti se v zanke, ki bi jih lahko odrezala RNaza III. Vendar pa so bile komplementarne sekvence na pre-rRNA najdene tisoče nukleotidov narazen (sl.14-20),str.404). Baze na leader sekvencah pred 16S regijo se lahko parijo z bazami sekvenc med 16S in spacer regijo, kjer je tRNA. Podobno so baze med spacer tRNA in začetkom 23S regije komplementarne bazam med 23S in 5S rRNA. Te regije se med seboj približajo in tvorijo dve pecljasti strukturi (sl.14-20 in 14-21, str.404,405). Vsaka taka struktura se konča z veliko zanko, v kateri je cela 16S oziroma 23S rRNA. RNaza III potem odreže na dveh določenih mestih vsakega peclja (1.=poševni rez). Tako odreže 16S in 23S rRNA molekulo (glej omenjeni sliki). 2.Rez: Eksonukleaza odgloda ostanek. Mnogi ribosomalni proteini se v tem času sestavljajo ali pa so že sestavljeni. Potrebni so za dozorevanje intermediatov pre-16S rRNA in pre-23S rRNA in za korake procesiranja, ki dajo zrelo 5S rRNA iz 3 kosa, ki ga je odrezala RNaza III (sl.14-21). Zato pri E.coli procesiranje pre-rRNA in sestavljanje ribosomalnih proteinov poteka sočasno.

mRNA molekule so zelo različno velike tRNA in rRNA imajo natančno določene velikosti (molekulske mase) tRNA : 2,5X10000 5S rRNA : 4X10000 16S rRNA : 5X10000 13S rRNA : 1000000 V nasprotju z njimi, molekule informacijske RNA (mRNA ) močno variirajo v dolžini verige in s tem v molekulski masi. To pogojuje dolžina polipeptidne verige. Večina polipeptidnih verig vsebuje več kot 100 aminokislin, zato mora večina mRNA molekul

37


vsebovati 100x3 nukleotidov. Nadaljne variacije pridejo od neenakih dolžin leader sekvenc na 5 koncu in trailer sekvenc na 3 koncu mRNA. Te sekvence ne kodirajo aminokislin, temveč so potrebne za pravilno sintezo in delovanje mRNA. Primer E.coli : Leader beta -galaktozidaze mRNA (na 5 koncu) je dolg 38 nukleotidov, medtem ko jih ima leader triptofan mRNA 162. Na 3 koncu : triptofan mRNA sega še 35 nukleotidov za regijo kodiranja Pri E.coli torej molekule mRNA , ki kodirajo povprečno velike polipeptide (300-500 AK), vsebujejo med 1000-2000 nukleotidov. Š e več heterogenosti v velikosti molekul mRNA prinese dejstvo, da nekatere mRNA kodirajo več kot en polipeptid. Poleg leader in trailer sekvenc, vsebujejo take mRNA še intergenske regije, ki so lahko dolge tako kot leader sekvence.

Ribosomi razpadejo v podenote med sintezo proteinov

Večina ribosomov konstantno razpada v podenoti in se spet združuje na določeni stopnji sinteze proteinov.

SINTEZA POLIPEPTIDNE VERIGE Dokončana polipeptidna veriga ima na enem koncu AK s prosto karboksilno skupino (C konec), na drugem koncu pa AK s prosto amino skupino (N konec). Proteinska sinteza vključuje postopno dodajanje posameznih AK, ki se začenja na N in končuje na C koncu.

BAKTERIJSKA POLIPEPTIDNA VERIGA Začetna AK v sintezi skoraj vseh bakterijskih polipeptidov je N-formil metionin (f-Met). Je modificiran metionin, ki ima formilno skupino (-CHO) vezano na amino skupino. Slika 14-25 Taka blokirana AK je lahko uporabljena le na začetku prot. sinteze, ker odsotnost proste AK preprečuje vključitev tekom elongacije. Formilna skupina se encimatsko doda k Met po tem, ko se Met veže na svojo t- RNA. Imamo dva tipa met-t-RNA:

- tRNAFMet (nemodificiran A)

- tRNAMMet (modificiran A)

Samo tRNAF

Met dovoljuje reakcijo s formilom, t-RNAMMet pa kodira Met v verigi. Obe imata

enako antikodonsko sekvenco (AUG). Encim DEFORMILAZA odstranjuje formilne skupine kmalu po začetku sinteze iz rastoče verige, v nadaljevanju pa AMINOPEPTIDAZA odstranjuje terminalni Met iz mnogih proteinov. Kljub temu pa ima veliko število bakterijskih proteinov Met na N koncu.

1. INICIACIJA Začne se z nastankom iniciacijskega kompleksa med 30S podenoto ribosoma, f-Met-tRNAF in m-RNA. Potrebni so še najmanj trije proteini, ki so rahlo vezani na ribosom: IF 1, IF 2 in IF 3. To so iniciacijski faktorji. Ti faktorji se vežejo na 30S podenoto. GTP stabilizira njihovo vezavo in je verjetno direktna vez z IF 2.

38


IF 3 preprečuje združitev 30S s 50S podenoto, kar povzroča komaj opazne spremembe v strukturi 30S podenote in pomaga m-RNA pri vezavi. IF 1 pomaga pri vezavi IF 2 in IF 3. V naslednjem koraku se f-Met-tRNAF in mRNA vežeta na IF-30S GTP agregat. Ko je kompleten 30S inicialni kompleks formiran, se IF 3 sprosti, priključi se 50S podenota, kar vodi do hidrolize GTP. Sprostita se tudi ostala dva IF. Končni kompleks je 70S INICIACIJSKI KOMPLEKS. Analiza približno 30 nukleotidov dolgih fragmentov, zaščitenih z ribosomom (slika 14-28), je pokazala, da je AUG blizu sredine, sledijo nukleotidi, ki kodirajo prve 3 ali 4 AK. Pred tem v 5' polovici fragmenta je skupina 3-9 purinskih nukleotidov, ki so pomembni za ribosomsko vezavo. Skoraj vsa ribosomalna vezavna mesta imajo sekvence kot sta AGGA in GAGG približno 8-13 nukleotidov stran od inicialnega kodona. Te sekvence tvorijo bazne pare s komplementarnimi ostanki, ki so v sekvencah, bogatih s pirimidinom na 3' koncu 16S rRNA. Ta paritev prinese inicialni AUG (GUG) kodon na pozicijo, da se lahko veže z antikodonom inicialne t-RNA vezane na 30S podenoto. Mutacije, ki spremenijo s purinom bogato regijo veznega mesta na mRNA, znižajo učinkovitost translacije. SMER BRANJA: Ko je inicialna regija mRNA pravilno vezana na ribosom, se vedno premika v isti smeri med proteinsko sintezo. Najprej je prebran 5' konec, ki je tudi prvi sintetiziran.

2. ELONGACIJA 16S r-RNA–mRNA bazni pari morajo disociirati in m-RNA postane prosta ter se lahko giblje čez ribosomalno površino. Vsak ribosom ima dve vazavni mesti za t-RNA. To sta P (peptidil) in A (aminoacil) mesti. Vsako je sestavljeno delno iz 30S podenote, delno iz 50S podenote. Oblika je specifična za dano AA-tRNA (=aminoacil-tRNA) s pomočjo določenega m-RNA kodona. f-Met-tRNA mora biti na mestu P. Katera AA-t-RNA bo prišla na A mesto, je odvisno od tega, kateri kodon mRNA se nahaja na mestu A. Potreben je EF-Tu. Ta reagira z GTP in AA-tRNA in tvori se AA-tRNA-EF-Tu-GTP kompleks. EF-Tu lahko veže vsako AA-tRNA razen f-Met-tRNA. AA-tRNA komponenta se prenese na ribosomalno A mesto, kjer se sprosti EF-Tu-GDP in fosfat. A mesto pa zahteva tudi uporabo EF-Ts, ki nadomesti GDP iz EF-Tu in tvori z njim kompleks. Ko ta kompleks naleti na GTP, se formira spet GTP-EF-Tu kompleks, sprosti se EF-Ts. EF-Tu-GTP pa lahko veže novo AA-tRNA in cikel se ponovi. Dve molekuli GTP sta hidrolizirani za vsako AK, ki je dodana rastoči verigi. Nastal je kompleks, kjer je AA-t-RNA na mestu A, f-Met-tRNA pa na mestu P. S pomočjo peptidil transferaze (je integralni del 50S podenote) nastane dipeptidil tRNA. Na mestu P se nahaja nenabita tRNA, na mestu A pa dipeptidil -RNA.

TRANSLOKACIJA Deacilirana tRNA zapusti mesto P, peptidil tRNA se premakne z mesta A na mesto P. Za peptidil tRNA translokacijo je potreben elongacijski faktor G (translokaza). Najprej se formira EF-G-GTP ribosomski kompleks. Poznejša sprostitev EF-G zahteva hidrolizo GTP do GDP in fosfata, kar je nujno za vstop ribosoma v naslednji elongacijski ciklus. mRNA se premakne za dolžino treh nukleotidov. Rezultat: naslednji antikodon se bo namestil na

39


položaju, kjer ga bo prebrala določena AA-tRNA. mRNA se ne premika po ribosomu sama, ampak je povezana s procesom, ki premika peptidil tRNA iz A na P mesto.

INHIBICIJA DOLOČENIH STOPENJ Z ANTIBIOTIKI PUROMICIN: vloga: moti elongacijo. Njegova struktura je podobna 3' koncu nabite tRNA in lahko vstopa na ribosomsko A mesto in kompetitivno inhibira normalen vstop AA-tRNA prekurzorja. KLORAMFENIKOL in PASOMICIN (slika 14-33) inhibirata peptidil transferazno reakcijo. Oba se specifično vežeta na 50S podenoto. STREPTOMICIN: veže se na 30S podenoto in je močan inhibitor iniciacije verige.

SPONTANO ZVITJE VERIGE S SINTEZO Rastoča veriga proti koncu sinteze, preden se nekaj AK doda, prevzame večino končne tridimenzionalne strukture s tvorbo sek. vezi.

3. TERMINACIJA Za zaključek protein. sinteze sta potrebna dva pogoja:

• prisotnost STOP kodonov, ki dajo specifičen znak za končanje proteinske elongacije (UAA, UGA, UAG)

• prisotnost faktorjev sproščanja (release factor), ki prepoznavajo STOP kodone: RF1 in RF2.

Vezava tega faktorja na terminacijski kodon na mestu A na nek način aktivira peptidiltransferazo, tako da hidrolizira vez med polipeptidom in tRNA na mestu P. Faktor sprostitve menja specifičnost peptidiltransferaze tako, da kot akceptor za aktiviran polipeptidni ostanek prihaja H2O in ne AK. Polipeptidna veriga zapusti ribosom. 70S ribosom razpade na 50S in 30S podenoto.

VLOGA GTP Igra ključno vlogo v nekovalentnih vezeh v različnih translacijskih faktorjih (IF2, EF-Tu, EF-G) na ribosomalni površini. Vezavni procesi zahtevajo prisotnost GTP, medtem ko reakcija GTP –> GDP da signal za sprostitev vezavnih faktorjev. Vezava GTP povzroči spremembo oblike translacijskih faktorjev, ki je potrebna za vezavo na ribosom. Poznejša hidroliza pa vodi do prvotne proste konfiguracije in odcepitve faktorjev s površine ribosoma. Pomembna funkcija GTP je tudi točnost translacije. 'Proofreading' zmanjšuje delež napak z zavračanjem nepravilno izbranih AA-tRNA. To pa zahteva dodatno energijo.

TVORBA ppGpp NA RIBOSOMU Če po pomoti nenabita tRNA zavzame A mesto, se polipeptidna rast začasno preneha, popačen ribosom pa uporablja ATP kot donor P-P za spremembo pp5'-G-3'OH(GDP) v nenavaden guanidinski nukleotid pp5'-G-3'pp = 'magic spot'. Večja količina ppGpp se akumulira med AK stradanjem. ppGpp daje signal za specifično ustavitev sinteze rRNA in tRNA ('stringent response'). Igra vlogo kontrolne molekule, ki obvaruje celice pred potratno produkcijo ribosomov (več kot je aktivnih).

40


SIMULTANO PREVAJANJE mRNA Del mRNA, ki je v kontaktu z ribosomom, je relativno kratek (približno 30 nukleotidov). To dopušča, da se mRNA premika preko površine nekaj ribosomov naenkrat in funkcionira kot matrica za nekaj identičnih polipeptidnih verig. Ribosomi, ki so vezani na posamezno mRNA, so poliribosomi. Dolžine polipeptidnih verig, vezanih na zaporedne ribosome v poliribosomih se razlikujejo v razmerju mRNA, ki jo je ribosom že prebral. (slika 14-34) V vsakem trenutku se polipeptidna veriga producira po celotni dolžini mRNA, najkrajši je 5' konec, najdaljši pa na 3' koncu. Velika variabilnost je v velikosti polisomov, ki je odvisna od velikosti mRNA in od tega, kako skupaj so ribosomi pakirani.

EKSPORTNI PROTEINI Njihova vloga zahteva lokalizacijo na ali pred membrano (proteini vključeni v energetski metabolizem, transport nutrientov, receptorji za bakteriofage,...). Večina izvoznih proteinov je sintetizirana v obliki prekurzorjev: 15-30 običajno nenabitih, hidrofobnih AK, dodanih na N koncu = SIGNALNA SEKVENCA. Njihova funkcija je povezava nastajajočega polipeptida z membrano. Signalna sekvenca in ostanek AK se zvijejo v dve helikalni vijačnici (lastnosti te vijačnice so idealne za vključitev v hidrofobno lipidno plast). N konec se zasidra v membrani, nadaljnja sinteza pa povzroči prehod novega peptida na drugo stran membrane. N terminalna sekvenca se običajno odstrani s specifično signalno peptidazo. Ko je sinteza končana, C terminalni konec prodre skozi membrano in zvit protein je sproščen v periplazmatski prostor. (slika 14-35)

RIBOSOMSKE STRUKTURE 50S podenota je podobna hemisferi s tremi izrastki. 30S podenota je bolj ploščata in ločena na zgornjo tretjino in spodnji dve tretjini s platformo (ploščo).

1. Vezno mesto mRNA in 3' konca 16S rRNA ter iniciacijskih faktorjev je na plošči med zgornjim in spodnjim delom 30S podenote.

2. Dve vezni mesti tRNA sta v zgornji tretjini 30S (v razcepu). 3. Peptidil transferazni center leži v dolinici med dvema izrastkoma 50S podenote. 4. Izhod rastoče polipeptidne verige je skoraj nasproti peptidiltransferaznega centra na

50S. 5. Mesto vezave 50S podenote na membrano je blizu mesta izhoda polipeptida. 6. Dve ribosomski podenoti se združita: 30S platforma in površina 50S, ki vsebuje

peptidiltransferazni center.

GENSKI KOD

Obstaja 64 različnih kodonov: 61 jih kodira aminokisline, 3 pa so nonsense kodoni = STOP kodoni (UAA, UAG, UGA).

41


DEGENERIRAN GENSKI KOD Mnoge AK kodira več kot en sam kodon. Serin kodira 6 kodonov (UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC). To so referenčni kodoni, ki povzročajo različno frekvenco kodiranja iste AK. Čeprav je razmerje AT/CG v DNA v različnih organizmih lahko različno, so kljub temu proteini podobni zaradi degeneracije genskega koda. Ta degeneracija omogoča manjšo odvisnost genskega koda od mutacij. Rezultat neke mutacije je lahko kodon, ki je sicer mutiran, vendar še vedno lahko kodira podobno, če ne isto AK. Primer: mutiran kodon UCU (serin) na tretjem mestu (UCU - > UCC, UCA, UCG) kodira še vedno serin. Če je v kodonu na drugem mestu pirimidin, so rezultat hidrofobno AK, če pa je na tem mestu urin, pa taki kodoni kodirajo predvsem bipolarne AK (tabela 15-4, str. 437). Ker so tranzicije (glej poglavje: mutacije) 20-x bolj pogoste mutacije kot transverzije, bo rezultat spremembe na drugi poziciji kodona največkrat podobna AK (npr. hidrofobna AK bo zamenjana s hidrofobno AK, ne pa z bipolarno AK). Tudi v primeru transverzije je v 50% primerov rezultat ugoden. To so t. im. sense mutacije. Degeneracija genskega koda se je v evoluciji verjetno razvila kot varnostni mehanizem.

OPOTEKAVA (WOBBLE) FAZA Včasih so domnevali, da za vsak kodon obstaja specifični antikodon na tRNA. Za to bi bilo potrebnih najmanj 61 različnih molekul tRNA, verjetno pa še nadaljnje 3 tRNA za stop kodone. Kot pa so odkrili, lahko ena tRNA spozna več različnih kodonov. To temelji na ugotovitvi, da ima baza (opotekava baza) na 5' koncu antikodona določeno sferično svobodo in lahko tvori vodikove vezi s katerokoli od baz na 3' koncu kodona.Vendar vse kombinacije niso možne (možne povezave: glej tabelo 15-5 na str. 438). Primer: - U se v opotekavem stanju lahko veže z A ali G - G se v opotekavem stanju lahko veže z U ali C - I (inozin, ki nastane z deaminacijo A) pa se lahko veže z U, C ali A (sl. 15-6, str. 439) - C in A se ne moreta opotekati, dočim je I ekstremen primer, ki lahko tvori vodikove vezi

z vsemi tremi bazami

RAZLIČNE KOLIČINE tRNA Včasih imajo tRNA z različno kemijsko zgradbo enak antikodon. Pogosto je ene od teh veliko več kot drugih (celo 11x več) – torej ena od teh dominira. Primer: pri E. coli sta dve tirozinski tRNA, ki imata antikodon 3' – AUG – 5'. Ena od teh je dominantna in je je 11x več kot druge. Kodirani sta na različnih genih. Verjetno ima tRNA, katere je manj, regulatorno funkcijo. Kljub temu, da več različnih kodonov kodira isto AK, pa vendar niso vsi enako zastopani. Določeni kodoni se prečitajo bolj frekvenčno kot drugi in to je lahko omejujoči faktor sinteze proteinov. Za sintezo proteinov, za katere je velika potreba v celici (Rec A protein in ribosomski proteini), je manj omejujočih faktorjev.

42


Sintezo proteinov v bakterijah začne N-FORMIL-METIONINSKA TRANSFERAZA Eksperimentalno je dokazano, da se translacija ne začne neposredno na 5' koncu mRNA. Prvi prevedeni antikodon se običajno nahaja najmanj 25 nukleotidov pred 5' koncem. Zraven tega so mnoge mRNA policitronske, kar pomeni, da nosijo informacijo za dva ali več polipeptidov. Tako lahko pri E. coli ena molekula mRNA (dolga okoli 7.000 nukleotidov) nosi informacijo za 5 encimov, ki sodelujejo v sintezi triptofana. Značilno pa je, da so informacije na mRNA za vseh 5 proteinov med sabo ločene. Vsaka informacija za vsakega od teh petih proteinov je označena s svojim začetkom in koncem. Sinteza proteinov pri bakterijah se začne z N-formil-metioninom (fMet). Obstaja specialna tRNA, ki prenaša fMet na ribosom, da bi se tako lahko začela sinteza proteinov. To je iniciacijska tRNA (tRNAf), ki pa ni identična tRNAm, ki prenaša metionin, kateri se veže v sklop polipeptidne verige. Simbol 'f' označuje, da se metionin vezan na tRNAf lahko formilira, dočim se vezan na tRNAm ne more formilirati.

1. INICIACIJA Startni signal je AUG ali GUG na mRNA, kamor se vežejo iniciacijske tRNA. Pred startnim kodonom pa so še regije bogate s purini, ki omogočajo vezavo mRNA na 16S rRNA. Primer: 5' GGUAACCAGGUAACAACCAUGCGAGUGUUG 3' E. coli thrA I I I I parijo se s 16S rRNA parijo se z iniciacijsko tRNA 3' 5' OH G A A U 3' konec 16S rRNA U C UCCUCCA : : : : : : : 5' GAUUCCUAGGAGGUUUGACCU I AUG I CGA I GCU I UUU 3' mRNA fMet --- Arg --- Ala --- Phe --- polipeptid Sinteza proteinov se začne z združevanjem mRNA, 30S podenote ribosoma in N-formil-metionil-tRNAf in tako nastane 30S iniciacijski kompleks. Za nastanek tega kompleksa so potrebni GTP in trije proteinski faktorji, t. im. IF-1, IF-2 in IF-3. To so iniciacijski faktorji. IF-3 ima vlogo pri vezavi mRNA na 30S podenoto ribosoma. IF-3 preprečuje tudi spajanje 30S in 50S podenote, pri čemer bi nastal neproduktivni 70S kompleks. IF-1 in IF-2 pomagata pri vezavi iniciacijske tRNA na kompleks mRNA s 30S podenoto ribosoma.

2. ELONGACIJA Ko se 50S podenota ribosoma veže na 30S iniciacijski kompleks, nastane 70S iniciacijski kompleks. Pri tem se hidrolizira GTP. 70S iniciacijski kompleks je pripravljen za fazo

43


elongacije. Molekula f-Met-tRNAf se nahaja na mestu P (peptidilno mesto). Drugo mesto na ribosomu za vezavo tRNA, mesto A (aminoacil mesto), pa je prosto. f-Met-tRNA je nameščena tako, da je njen antikodon sparjen z iniciacijskim kodonom AUG (ali GUG) na mRNA. Pri tem je s specifično interakcijo ribosoma in fMet-RNAf odrejena smer branja šifer. Proces elongacije v sintezi proteinov je sestavljen iz treh korakov:

1. vezava aminoacil-tRNA (prepoznavanje kodona) 2. nastanek peptidne vezi 3. translokacija

Cikel se začne z vnosom določenih aminoacil-tRNA na prazno mesto A na ribosomu. Katera aminoacil-tRNA se bo vnesla, je odvisno od kodona molekule mRNA, ki se v tistem trenutku nahaja na mestu A. Komplementarno aminoacil-tRNA prinese v mesto A proteinski faktor elongacije, t. im. EF-Tu. Pri nameščanju aminoacil-tRNA na ribosom, se hidrolizira molekula GTP, vezana na EF-Tu. GDP ostane trdno vezan s EF-Tu. Na ta kompleks (GDP + EF-Tu) se veže še drugi elongacijski faktor EF-Ts. Nastane kompleks faktorjev Tu in Ts, kateri se cepi z vezavo GTP. Tako ponovno nastane kompleks Tu-GTP. (SLIKA 6)

44


Tako je nastal kompleks, v katerem se aminoacil-tRNA nahaja na mestu A in fMet-tRNA na mestu P ribosoma.Tako je pripravljena možnost za nastanek peptidne vezi. To reakcijo katalizira encim peptidiltransferaza, ki je integralni del 50S podenote ribosoma. Aktiviran formil-metionin se iz fMet-tRNA (na mestu P) prenese na amino skupino aminoacil-tRNA (na mestu A) in nastane dipeptil-tRNA. Sledeča faza elongacije je translokacija. Potrebni so trije premiki:

1. daecilirana tRNA zapusti mesto P 2. peptidil-tRNA se pomika z mesta A na mesto P 3. mRNA se pomakne za dolžino treh nukleotidov

Za translokacijo je potreben faktor EF-G, imenovan tudi translokaza. Hidroliza GTP omogoča faktorju EF-G sproščanje z ribosoma, tako da lahko deluje katalitično. Po translokaciji ostane mesto A prosto in lahko veže drugo aminoacil-tRNA in tako začne nov cikel elongacije.

3. TERMINACIJA V primeru, ko so v mestu A stop kodoni UAA, UGA ali UAG, pa se aminoacil-tRNA na to mesto ne more vezati. Normalne celice nimajo takšnih tRNA, ki bi imele antikodone komplementarne tem stop kodonom. Stop kodone prepoznajo faktorji sproščanja, ki so po svoji kemijski sestavi proteini. Eden od teh faktorjev sproščanja, RF1, prepozna kodona UUA in UAG, drugi, RF2, pa prepozna kodona UAA in UGA. Vezava RF faktorjev na terminacijski kodon v mestu A na nek način aktivira peptidiltransferazo, tako da ta hidrolizira vezi med polipeptidom in tRNA v mestu P. Faktor sproščanja menja specifičnost peptidiltransferaze. Polipeptidna veriga zapusti ribosom. 70S ribosom disocira v 30S in 50S podenoti, kar predstavlja predigro sintezi naslednje molekule proteina. Če se mora sinteza res ustaviti, se pojavi zaporedje več stop kodonov.

SUPRESORSKE MUTACIJE (supresija: zamaskiranje nekega efekta z dodatno spremembo) Popravljajo nonsense mutacije.

1. INTRAGENSKE MUTACIJE: so na nivoju genskega koda v samem genu. Če pride do delecije (ali insercije) baze, se cel sistem pokvari. Pride do premika čitalnega okvirja in informacije se popolnoma spremenijo. Če je prva mutacija delecija in če tej sledi insercija, obe skupaj tvorita funkcionalni protein (druga drugi predstavljata supresorski mutaciji) => FRAME SHIFT SUPRESIJA.

2. INTERGENSKE MUTACIJE: nonsense mutacije nastale v genih se z intergenskimi mutacijami zamaskirajo nekje drugje, vendar pa ne v istem genu, v katerem je že prišlo do prve nonsense mutacije. Gre za napačno odčitavanje napačnega zapisa.

- če je nonsense mutacija v okviru genskega koda, obstajajo za vse nonsense tRNA, ki te nonsense preberejo kot sense. Kar pomeni, da se v polipeptid vstavi tudi na tem nonsense mestu določena AK. tRNA lahko prepozna nonsense kot sense, ker je prišlo do spremembe v antikodonu (tRNA je mutirana).

45


- FRAMESHIFT SUPRESIJA: pomeni vrivanje ali izpad baz. V tem primeru gre za supresijo tRNA. V primeru, ko se baze vrinejo, je kodon iz 4 baz, tRNA se suprimira in ima tako 4 baze v antikodonu.

- Proteini, ki so v podenotah ribosoma, vplivajo na natančnost sinteze. Primer: delovanje streptomicina na protein S12 v 30S podenoti ribosoma: Dodatek streptomicina v celice, ki na njega niso rezistentne, privede do masovnega napačnega branja informacij. Mutacija, s katero pa dosežemo rezsitentnost na streptomicin, ker se spremeni zaporedje AK v proteinu S12, pa povzroči, da se napake redkeje pojavljajo.

UNIVERZALNOST GENSKEGA KODA

Določen gen kodira isti protein tako pri bakterijah kot pri sesalcih. To kaže, da se genetski kod med evolucijo ni spreminjal. Obstajajo izjeme.

SPREMENJEN GENSKI KOD PRI MITOHONDRIJIH SESALCEV

Genski kod mitohondrija se rahlo razlikuje od 'univerzalnega koda'. Večina proteinov v mitohondriju, vključno s tistimi, ki so nujni za RNA in proteinsko sintezo, so kodirani v jedrni DNA. Ti proteini se nato transportirajo preko mitohondrijske membrane. Mitohondrij pa vsebuje tudi lastno dvojno krožno DNA, ki se, presenetljivo, krajša z razvojem od nižjih proti višjim evkariontom (My DNA gliv je 5x večja kot človeška). Mitohondrijski genom kodira dve rRNA molekuli, nekaj proteinov in njim ustrezne tRNA. Geni My DNA so blizu skupaj, vmes so le 1 ali več tRNA kot spacerji. Razlike med 'univerzalnim' in My kodonom:

• UGA ni stop kodon, ampak kodira triptofan, prepozna pa ga ista tRNA, ki prepoznava tudi UGG (= univerzalni kodon za triptofan)

• Notranje metionine kodirata AUG in AUA • Iniciacijske metionine pa AUG, AUA, AUU in AUC • AGA in AGG ne kodirata arginina, ampak sta stop kodona; torej so skupno 4 stop

kodoni: UAA, UAG, AGA in AGG Mitohondrij potrebuje za branje svojega koda le 22 tRNA (pri univerzalnem kodu je potrebnih najmanj 32 tRNA), številne tRNA so nenavadnih oblik.

PREKRIVAJOČI SE GENI Pri večini genomov virusov in bakterij, ki so jih sekvencionirali pred letom 1977, so si ustrezno sledili signali, specifični za posamezne stopnje genske ekspresije. Leta 1977 so odkrili gen, ki je v celoti ležal znotraj nekega drugega gena. To kaže, da ista sekvenca DNA lahko služi večim namenom. Primer: (glej sl. 15-20 na str. 457) Fag φX174-enojna DNA. Gen E se pretvarja v +1 okvirju glede na gen D, znotraj katerega leži v celoti. Gen A se pretvarja v okvirju –1 glede na gen A, gen K pa delno prekriva gen A in gen C.

46


Pred vsakim genom mora biti razpoznavno mesto za 16S rRNA in inicijacijski kodon AUG. Torej sekvenca »matičnega« (parent gene) vsebuje

a) sekvence za sintezo lastnega proteina b) sekvence za vezavo ribosoma, iniciacijo in terminacijo prevajanja proteina

čezenj ležečega gena Popolnoma prekrivajoče se gene so našli le pri virusih. Prekrivanje nekaj nukleotidov pa je značilno tudi za bakterijsko mRNA (policitronska mRNA). Sl. 15-22 na str. 458 Tudi pri E. coli so promoterji pogosto znotraj protein kodirajočih genov. Ni še popolnoma razjasnjeno, na kakšen način se prevajajo prekrivajoči se geni: - ali ribosomi dekodirajo polisom istega gena (ena sama mRNA) v različnih bralnih

okvirjih - ali pa nastaja za vsak produkt svoja mRNA Frameshift so odkrili pri fagu MS2; glej sl. 15-23 na str. 458. Gen za litični protein tega faga delno prekriva gen za protein plašča. Ugotovili so, da nekaj % ribosomov pri prevajanju genov za proteine plašča naredi 'translokacijsko napako' (frameshift) nekje pred začetkom gena za litični encim. Tako naletijo na nonsense kodone pred geni za litični encim in se sprostijo. Tedaj se lahko začne prevajanje litičnega gena na AUG. Na tak način tudi nekateri drugi manjši genomi povečajo svoj potencial kodiranja.

KONTROLA Vsa dogajanja v celici so povezana in kontrolirana. Primer: E. coli na definiranem gojišču sintetizira približno 800 proteinov, ki ji omogočajo preživetje. Če bi bilo prisotnih vseh 4 000 proteinov (v DNA je inf. za njih), bi celica propadla. Hiperprodukcije ni, saj je to odvečno trošenje energije. Nekateri sistemi so inducibilni, drugi pa represibilni. Inducibilni sistem: večinoma vsi proteini. Se sintetizirajo, če je treba nekaj razgraditi. Primer: beta-galaktozidaza = encim, ki cepi disaharid laktozo v galaktozo in glukozo. Količina encimov za razgradnjo in sintezo je v ravnotežju s tistim, kar ima celica na razpolago. (slika) Graf 1 Graf 2 Če narašča koncentracija aminokisline (prolin), bo encimov malo, ker jih ni treba narediti, bodo reprimirani (represibilni sistem). Celica običajno živi v srednjih pogojih. Vsi encimi niso kontrolirani na isti način.

47


Kontrola: laktozni represor kontrolira sintezo beta-galaktozidaze. Nivo represorja se regulira s frekvenco čitanja m-RNA: odvisno od moči m-RNA in promotorja. Če je represibilnih molekul malo, ni kompliciranih kontrolnih mehanizmov - slabša kontrola, vendar še vedno obstaja (konstitutivna kontrola). Za transkripcijo je potreben promotor (začetno mesto), ki je različno močen. m-RNA je pri bakterijah zelo labilna - bakterije so prilagodljive. Adaptacija: sposobnost hitrejšega reagiranja v okolju s sintezo m-RNA. Represor kontrolira ekspresijo genov - količino določenih proteinov. So negativni in pozotivni regulatorji. Represorski gen (negativen): če je represorski gen defekten ali inaktiviran, pride do konstituktivne sinteze. Aktivatorski gen (pozitiven): inaktivacija - ni sinteze. Represorji so proteini: večina se poveže z DNA in deluje na nivoju transkripcije. Z DNA se poveže na določenem mestu = operator. Operator je sekvenca baz na DNA, ki jo spozna specifični represorski protein in nima informacije za protein (ni gen). Dolg mora biti najmanj 10-12 baz in dovolj specifičen, da ga prepozna represor. Če se zmanjša število baz, se zmanjša specifika operatorja. Ko je dolžina primerna, se tudi represor primerno močno veže in ostane vezan dokler ne pride do indukcije (inaktivacija represorja), ki jo sproži sinteza m-RNA za beta-galaktozidazo. FOOT PRINTING METODA: za določanje mesta kamor se veže represorski protein. DNA je markirana in fragmentirana na dve populaciji: z represorjem zaščitena DNA pred delovanjem endonukleaz in brez represorja (brez zaščite = je kontrolni vzorec). + na represor, - na aktivator Represor je aktiven, če ni induktorja. Korepresor - sproži represorsko aktivnost. laktoza = induktor glc zavira c-AMP Gelska elektroforeza: kjer je represor ni vidnih fragmentov, ker endonukleaza ni mogla delovati - lahko določijo mesto represorja in proteinov, ki se specifično vežejo na DNA. Mesto na DNA, ki ima funkcijo povezave s proteinom, ima običajno palindronsko zaporedje - obratna simetrija. Obratna simetrija ima smisel, ker je tudi protein dimer (simetričen) in lahko sede na DNA. Primer: lambda-represor. Aminoterminalni konec se uleže v zavoju DNA. Za vezavo so potrebni alfa-heliksi N-terminalnega konca. Razdalja med alfa-heliksom ene in druge polovice proteina je 34 A (armstrongov) - 1 obrat DNA. Fosfati se najbolj direktno povežejo z DNA, imajo neko osnovno zgradbo, ne glede na njihovo funkcijo. Represor fizično prepreči vezavo aktivnega dela RNA polimeraze. ________________ RNA pol. promoter ____________________________________________________

48


Operator je del, ki ga zasede represor. Je prepoznavno mesto, ki nima informacij za sintezo RNA. Represor zasede mesto, kamor so se vezale RNA polimeraze. RNA polimeraza se lahko usede na konsenzurna zaporedja, vendar se ne more usesti na aktivni del, ker je tam nek represor. Represorji: 1. KATABOLNI: aktivni laktozni represor + induktor beta galaktozid = indukcija 2. pri ANALOGNEM sistemu se represor reprimira, ko je dovolj triptofana v okolju.

Triptofan kot korepresor se poveže z represorjem in sistem je reprimiran. Represor + korepresor = inhibicija (konec sinteze) Represorji kontrolirajo več genov. Promotorska in operatorska zaporedja se prekrivajo. Regulatorno zaporedje: promotor + operator + strukturni geni. Vsak represor kontrolira serijo genov = operon. Operon = en strukturni gen ali več (celotna delovna skupina genov). Primer: laktozni operon 1.Če inaktiviramo represorski gen, ni represije in pride do konstitutivne sinteze. Isti efekt dobimo, če dodamo beta galaktozide (represorske). Dobimo konstitutivne mutante na katere represor ne deluje. 2.Fenotipsko lahko dobimo isti defekt, če mutiramo mesto na DNA, kamor se veže represor - operatorske konstitutivne mutante. Lac operon je pod negativno kontrolo. Če je laktoze dovolj, vse poteka, ker se laktoza veže na represor in ga inaktivira (stereokemično spremeni). Na promotor se veže RNA pol - prepis strukturnih genov - beta galaktozidaza. Če laktoze ni, je represor aktiven in blokira sintezo. Glc indirektno zavira na transkripcijskem nivoju cAMP. cAMP pa ne deluje sam po sebi, ampak potrebuje še nek protein in to je CAP (CRP) protein. Glc - zavira cAMP CAP - prepozna zaporedje; pomaga pri vezavi RNA - poli na promoter cAMP - aktivira CAP ara - induktor laktoza - induktor SLIKA C prot - aktivira BAD operon CAP + cAMP = funkcionalen kot pozitivni faktor, ki omogoči vezavo RNA-pol na promotor. Za produkt beta galaktozidaze ni potrebna le laktoza (inaktivira represor), temveč tudi CAP + cAMP, ki omogoči vezavo RNA-pol. Protein CAP (dimer) prepozna neko zaporedje na DNA. Usede se na konsenzusno zaporedje.

49


SLIKA CAP + cAMP se lahko fizično poveže z RNA-pol. –Lahko se cAMP vrine v DNA in jo v razdalji enega para deformira v prostor, da se RNA-pol vrine in nadaljuje odvijanje. cAMP brez induktorja ne deluje, šele kompleks z XXXX CAP + RNA-pol sproži sintezo m-RNA. Represorji so specifični z določeno operatorsko sekvenco (npr. Lac represor). Ta represor kontrolira ekspresijo več genov na DNA. Primer: LexA reprimira 15? Genov, ki so različno razporejeni. SOS mehanizem: indukcija se sproži masovno z UV žarki. CAP protein je pozitiven regulator in je dosti nespecifičen. Posreduje signal za pomanjkanje glc mnogim operonom v celici, ne le laktoznemu operonu. Začne se proizvajanje še ostalih encimov za razgradnjo drugih sladkorjev. Obenem z njim delujejo specifični regulatorji: arabinozni operon, geni C, encim, S A D operon (ima encim za razgradnjo arabinoze). Gen C je pozitivni regulator. Arabinozni operon ima informacijo za razgradnjo arabinoze. SLIKA

Za BAD sintezo so proteini: induktor (arabinoza) + ara c + cAMP + CAP. Ara C protein se veže na tri mesta: ara I, ara O1 in ara O2. C protein reprimira lastno sintezo (je negativni regulator za lastno sintezo) in pozitivni regulator za razgradnjo arabinoze. Če ni C proteina, ni razgradnje arabinoze, ker ni aktiviran BAD operon. Če je premalo cAMP, pride do povezave ara O2 in ara I = ni nič (nastane zanka). Če je prisotno vse kar rabimo, se cAMP usede v zaporedje, zanka se razpre, ara O2 je spredaj, arabinoza se veže na ara I. prisotna je še RNA-pol. Rabimo specifičen pozitiven regulator C protein, cAMP in arabinozo - tedaj pride do razgradnje.

ATENUACIJA Je regulacija proteinske sinteze na nivoju transkripcije. Primer na sintezi triptofana.

Zgradba Trp operona m-RNA (slika 16/21, 16/22) Po vrstnem redu si sledijo naslednji deli: 1. VODILNI DEL: 5’ konec Trp operona m-RNA je sestavljen iz 161 nukleotidov. Ta

vsebuje naslednja zaporedja: a) vezno mesto za ribosom b) informacija za kratek vodilen peptid iz 14 aminokislin z dvema zaporednima Trp. Ta omogoča prehod preko mehanizma atenuacije.

50


c)komplementarno zaporedje 1 in 2, ki tvorita stebriček 1, 2. Zaporedje 1 se pokriva s končnim delom zaporedja informacije za izgradnjo vodilnega peptida. Ker je drugo zaporedje komplementarno tretjemu, lahko tvorita stebriček 2, 3, ta pa omogoči prehod RNA polimeraze preko atenuatorskega mesta. d) atenuatorsko mesto = translacijski terminator leži blizu konca vodilnega dela, pred trp E

genomom. Sestavljata ga dve komplementarni zaporedji 3 in 4, ki tvorita terminacijski stebriček 3, 4. Za tem leži zaporedje osmih uracilov, ki je tudi končni del atenuatoskega mesta.

2. 5 STRUKTURNIH GENOV: trp E, trp D trp C, trp B, trp A. Ti so odgovorni za sintezo petih encimov, ki sintetizirajo Trp.

Regulacija sinteze (slika 16/23) Trp m-RNA po iniciaciji ne raste avtomatično do celotne dolžine, ampak se večinoma sinteza te prekine pred prvim trp genom (trp E). 1.Prenizka koncentracija Trp v celici: Ribosom prepozna zaporedje in se usede na genom za vodilni peptid. Ustavi se tam, kjer bi moral vgraditi dva Trp v peptid. To je na mestu prvega zaporedja. Tako ostane drugo zaporedje prosto in se poveže s tretjim. S tem je onemogočen nastanek stebrička 3, 4. Tako RNA polimeraza lahko zdrsne mimo atenuatorskega zaporedja do prvega strukturnega gena trp E in omogoči sintezo Trp. 2.Zadostna koncentracija Trp v celici: Če je dovolj Trp-ja se ribosom pritrdi na vodilni peptid in zdrsne mimo trp kodona. Ustavi se na drugem zaporedju. Tako se lahko tvori stebriček 3, 4, s tem pa je onemogočen prehod RNA polimeraze do strukturnih genov. Sinteze encimov ni. 3.Če se translacija ustavi pred trp kodonom zaradi delovanja drugih mehanizmov so vsa štiri zaporedja prosta; tako se lahko tvorita oba stebrička 1, 2 in 3, 4. Sinteze ni. Vodilni protein je pomemben le za ureditev lege ribosoma med sintezo. Takoj po končani sintezi pa se razgradi. Trp operon ima tudi represorsko poleg atenuacijske regulacije. Sam Trp deluje kot represor. S tem je omogočena preciznejša regulacija koncentracija Trp v celici. Tudi vodilni peptidi drugih genov imajo v svojem zaporedju iste aminokisline kot te, ki jih regulirajo. To so aminokislinski operon za sintezo (tab. 16/2): -histidina; ima sdem His v zaporedju -leucina; štiri Leu v zaporedju. Histidinski in leucinski operon imata le atenuacijsko regulacijo, brez represorjev, kot pri Trp. Zato je v vodilnem peptidu prisotnih več aminokislin, ki ju regulirata.

HEAT SHOCK PROTEINI

Represorji in aktivatorji regulirajo razpoložljivost ali zmogljivost promotorjev. Nikoli pa se ne spremeni aktivnost m-RNA polimeraze, ta ostane uporabna za proste operone. Drugače je, če pogoji zahtevajo preusmeritev genske ekspresije. Npr. pri nenadnem povečanju temperature (heat shock) se spec. proteini (17 pri E. coli) sintetizirajo mnogo hitreje kot

51


običajno. Nastajajo v velikih količinah. Če povišana T ni previsoka (42°C za E. coli), celica sintetizira heat shock proteine, vendar se nadaljuje sinteza normalnih proteinov. Pri T, ki je za rast previsoka (50°C za E. coli), pa se sintetizirajo samo heat shock proteini, celica preneha rasti. Nekateri heat shock proteini različnih divjih vrst so si zelo podobni, celo med prokariontskimi in evkariontskimi vrstami. Npr. gen za Dna K pri E. coli (66 kDa) ima identično skoraj polovico nukleotidov z genom za Hsp 70 pri Drosophili (70 kDa). Pri E. coli sta heat shock proteina še Gro EL in Gro ES, ki sta potrebna za sestavljanje fagnih partiklov lambde. Dna K je potreben za sintezo DNA lambde. Znano je, da so heat shock proteini potrebni za fagno rast, vendar ne poznamo njihove natančne funkcije. Skupno vsem je, da so esencialni za zaščito celice pred nenadnim porastom T ali pred drugim stresnim ravnanjem (npr. dodajanjem etanola kulturi). Bistvo je, da je lahko ves model genske ekspresije nenadno spremenjen. Za spremenjen transkripcijski model odgovarja nov sigma faktor. Promotorje za heat shock proteine prepozna edinstvena oblika RNA polimeraznega holoencima, ki vsebuje σ32 (32 kDa). Programiran je v rpo H (= htp R) genu. Je manjši od navadnega σ70 (70 kDa). Holoencim s σ32 deluje izključno na promotorje heat shock proteinov. Ustrezno temu imajo heat shock promotorji različne sekvence od standardnih promotorjev. Posebno v -10 segmentu, ki ga lahko prepozna σ faktor. Še vedno so nepojasnjeni dogodki prepoznavanja heat shock promotorjev, pa tudi prenehanje delovanja σ32 na te promotorje, ko se celica prilagodi na zmerno povečanje T. Drugi σ faktorji kontrolirajo tudi sporulacijo pri B. subtilis, fagno rast pri B. subtilis in E. coli. Heat shock inducira tudi sintezo proteinov, ki povzročijo »puffing« na politeničnem kromosomu Drosophile.

TRANSDUKCIJA

Je prenos genske informacije (DNA ali RNA) iz ene celice v drugo (bakterijske, eukariontske) s pomočjo virusnih vektorjev. Vektor specialne transdukcije: genska informacija je lahko pripojena virusna DNA. Vektor splošne transdukcije: ni več virusne DNA, virus je samo proteinski plašč, v katerem pa je lahko bakterijska DNA.

SPLOŠNA TRANSDUKCIJA Je prenos katerega koli gena donorja (bakterija na kateri so se fagi namnožili) v recipienta (inficirana bakterija). Transdukcija je iz dveh procesov: 1.Pakiranje gostiteljeve DNA v fagne glave. 2.Stabilna vključitev DNA v genom gostitelja. P22 / S. typhtmurium Na konceh ima ponovitvi dolgi 2% fagnega genoma. Ponovitev je rezultat mehanizma pri pakiranju DNA v glavo. Po infekciji se DNA zaokroži, tako je omogočeno podvojevanje po modelu »rolling circle« in zaščita pred eksonukleazami.

52


Pri navadnem fagnem razmnoževanju se fagna DNA prereže na mestu pac in se začne basati v glavo. Tako je v vsaki glavi nekaj več kot cela fagna DNA. SLIKA P22 ne razgradi gostiteljeve DNA, zato je DNA potencialni substrat za pakiranje v glave. Packing sistem na njej prepozna 10 do 15 mest podobnih pac mestom in jih spakira v glave. To pakiranje je manj efektivno kot fagno pakiranje. Efektivnost pada z oddaljenostjo od pac mesta, zato frekvenca transduciranih genov varira sto do tisoč - krat. Če naredimo delecijo ali insercijo v kromosomu, bakteriofage zbližamo ali oddaljimo. S tem spremenimo frekvenco pakiranja in transdukcije. Mutanta HT P22 ima 104-krat višjo frakvenco transdukcije, ker je manj izbirčna za pac mesta, tako da več fagov lahko prenaša gostiteljevo DNA. P1 / E. coli se transducira z dvakrat večjo frekvenco kot P22, a z manjšo variabilnostjo. V glave spakira do 2% gostiteljeve DNA; P22 pa 1% (slika 7-32). Po infekciji: 1.se lahko virusna DNA s homologno rekombinacijo vključi v kromosom 2.lahko ostane neintegrirana v cy: 2.1.če nima mesta za podvajanje, ga razgradijo eksonukleaze 2.2.če se fragment ni vključil v kromosom, ga niso razgradile eksonukleaze se v naslednji generaciji izgubi. To je abortivna transdukcija. Intenziteta infekcije in s tem frekvenca transdukcije je odvisna od razmerja virus / bakterija (optimum je 0˙1/1). -malo virusov + veliko bakterij niso vse bakterije inficirane -veliko virusov + malo bakterij bakterija dobi poleg normalne DNA še virusno DNA, če je virusov več pride do efekta liziranja. S splošno transdukcijo lahko ugotavljamo medsebojno lego genov na kromosomu. Če se dva markerja kotransducirata (prenašata skupaj), sta blizu na kromosomu. Če se nikoli kotransducirata je razdalja med njima vsaj dolžina bakteriofagnega genoma.

53


SPECIALIZIRANA TRANSDUKCIJA Pomeni prenos specifične genske informacije. Značilna je za določene tempirane fage, ki se podvajajo z lizogenim ciklom (lambda, 080 / E. coli, SPbeta / B. subtilis, P22 / S. typhimurium) in imajo specifična mesta vključitve. Imajo informacijo za encima: l posreduje informacijo za integracijo v bakterijo σ posreduje informacijo za ekscizijo Pravilna ekscizija: ekscizira se le bakteriofagni genom. Nepravilna ekscizija: ekscizira se tudi del bakterijskega genoma. Lambda je prototip specifične transdukcije. Na konceh ima enojne repe iz dvanajst baz, to je, cos mesto, kjer pride do spojitve, cirklarizacije. Lambda prenaša informacijo (mesto attB med GAL in BIO, ki je homologno mestu attP na fagu), ki je najbližje mestu za integracijo faga. Vsakih 106 ekscizij se naredi napaka. Fag si odščipne del gostiteljskega genoma in se kovalentno poveže z gostiteljskim genomom. Skupaj se namnožita in spakirata v glavo. Kapaciteta glave je 35 000 do 55 000 baznih parov. Stopnja defektivnosti bakteriofagov je določena s sposobnostjo formiranja plakov.

RETROFEKCIJA Retrofekcija je prenos celične m-RNA iz ene celice v drugo z retrovirusi kot vektorji. Genom retrovirusa je sestavljen iz dveh enakih, enojnih RNA molekul. Virusna Rna se lahko po infekciji s pomočjo encima reverzna transkriptaza prepiše v DNA, ta pa se lahko integrira v katerikoli del gostiteljevega genoma. Iz integrirane DNA se prepisujejo nove virusne RNA, ki dobijo cap in poli A rep. Te se pakirajo v virusno kapsido. Lahko se zgodi, da se v kapsido spakira celična m-RNA (ta je prav tako zaščitena s cap na 5´ in poli A repom na 3´ koncu), ki tako pride iz celice ter se z infekcijo prenese v drugo celico. Tu se z reverzno transkriptazo, ki se je prav tako prenesla z virusom, prepiše v DNA, ta pa se lahko vključi v genom te druge celice. Dedna informacija se je prenesla iz ene celice v drugo, v kateri pa prepis te informacije ni pod nobeno kontrolo: če na ta način pride v novo celico neugodna informacija, lahko to vodi v nastanek zločestih novotvorb oreko vzburjenja onkogenov, ali pa sama informacija (oziroma protein, ki ga kodira) v novi sredini predstavlja onkogen. Proces prenosa se v tej celici ustavi, to pomeni, da se v njej ne tvorijo virioni, ki bi nosili to informacijo. Tak prenos je možen tudi med različnimi organizmi in zato predstavlja gonilo evolucije. SLIKA

54


TRANSFORMACIJA Je sprejem in vključitev proste DNA v genom recipienta. Celice sposobne sprejema imenujemo kompetentne celice. Gre za najbolj razširjen način razširjanja informacij. Prosta DNA se pojavi z razpadom celic in večino razgradijo endo / eksonukleaze, nekaj pa je vendarle ostane in ta se lahko prenaša . Transformacijo kontrolirajo mehanizmi kodirani v DNA. Ima velik pomen za evolucijo. Pogoji za uspešno transformacijo: ♦ potrebna je minimalna velikost Dna, 0.5 kbaz = 50 baznih parov (optimalno veliki

fragmenti 20 – 30 baznih parov) ♦ potrebnih je 100 – 200 fragmentov DNA na celico, ker je vsa DNA, ki pride v celico,

izpostavljena obrambnim mehanizmom v celici (endonukleaze, restriktaze), poteg tega: - na vsakem fragmentu ni ustreznega gena, ki ga hočemo transformirati

- veliko je že poškodovanih fragmentov - verjetnost rekombinacije ni povsod enaka - DNA se ne lomi na optimalno velike fragmente.

KOMPETENCA Naravno (prehodno fiziološko stanje rasti) ali umetno inducirana: Do nje pride v normanlnih, optimalnih in suboptimalnih pogojih (v subopt. pogojih so največje vrednosti – da se jo kvantificirati). Celica postane kompetativna, ko se sproži SOB oz. SOS sistem. Za samo kompetenco so pomembni specifični proteini z bolj ali manj regulacijsko funkcijo (protein recA se intenzivno sintetizira ob začetku kompetence, pri tem se podvajanje DNA preneha).

G+ bakterije Večina G+ bakterij je naravno kompetitivnih, niso pa kompetitivno konstitutivne (konstitutiven mehanizem kompetence ima npr. Naisseria, ko torej sprejema DNA le iz organizmov, ki so ji sorodni). G+ bacili kompetenco regulirajo s kompetenčnimi faktorji – proteini, ki jih izločajo v okolje, pomembnejši pa so v notranjosti. Večina sinteze kompetitivnih faktorjev je v povezavi s SOB mehanizmi. Časovno je omejena in sinteza Dna se zelo upočasni. Transpozicijski element lahko vsebuje tihi gen (brez promotorja), ki se ne izrazi dokler ne pride pred funkcionalni promotor (če Tn917 prenese tihi gen IacZ v celico, pride do aktivnih promotorjev, ki so sicer aktivni v SOS / Sob sistemu, izrazi se beta – galaktozidaza). Nekateri promotorji se aktivirajo le aerobnih oz anaerobnih pogojih. SOB sistem pa lahko aktiviramo z dodatkom etanola, z obsevanjem ali s toplotnim šokom. Lastnosti G+: sporulacija, kompetenca, popravljalni mehanizmi – šoka.

G- bakterije Ne sporulirajo in so brez naravne kompetence, torej mora biti umetno izzvana. Nastopi pri celicah , ki so v fazi eksp. rasti. Prenesemo jih na tako gojišče, da prenehajo rasti. Blokada sproži kompetenco. Za večjo prepustnost c. membrane jih obdelujemo s Ca ioni in

55


temperaturnim šokom. Nekatere imajo v membrani ali c. steni posebne vezikle – transformasomi, v katerih so proteini, specifični za transformacijo.

POTEK TRANSFORMACIJE

1) DNA se uleže na površino celice (ne glede na kompetenco, ker je DNA negativno nabita, celice na površini pa pozitivno nabita). Čas trajanja je 5 – 10 sekund. Na celico se uleže aktivna – dvojna DNA, na površini celice še neobčutljiva na endonukleaze. Pri prehodu v celico se DNA odvija in v notranjost pride le enojna DNA. Zunanja nitka se hidrolizira – sprostijo se oligonukleotidi – in pri tem se sprosti energija, ki je potrebna za transport druge nitke v celico. Na razdalji 6 kbaz se na nitki pojavijo razpoke.

2) Nastanek eklipsnega kompleksa. Enojna DNA se skompletira s proteini, ki so v zvezi s kompetentnostjo in so v celici. Čas eklipsnega kompleksa je kratek.

3) Prehod eklipsnega kompleksa v bližino gostiteljeve DNA 4) Substitucijahomolognega dela kromosoma in nastanek heterodupleksa – kovalentan

povezava obeh DNA. Pri tem ima ključno vlogo protein recA. Pri eukariontih pa obstajajo mehanizmi , ki obidejo zahtevo po homologiji, torej pride do rekombinacije brez homologije. Do le-te mora priti le na koncih fragmentov.

5) Podvojitev, izgubi se heteroduplex; sledi ekspresija Frekvenco transformacije povečamo: - s polietilen glikolom (odstrani peptidoglikansko plast) - z elektroporacijo (elektrošok) - biolistika (uporaba volframovih projektilov oblečenih v 6 – 8 molekul DNA s premerom

0,5 mikrometra, ki jih Izstrelimo v celice). - pri višji temperaturi pride do denaturacije DNA (pri E. coli neha kolonija rasti pri 45°C) - efektivnost transformacije je direktno odvisna od koncentracije DNA.

TRANSFEKCIJA Vrsta transformacije, ko se DNA vključi v genom sesalčje celice.

56


KONJUGACIJA

S poskusi na E.coli so ugotovili, da obstajata pri bakterijah dva vrsti celic, moške in ženske celice. Prenos genetskega materiala poteka iz moške v žensko celico, nikoli pa obratno. Moške in ženske celice se med seboj ločijo po prisotnosti plazmida – F faktorja. Če je v celici prisoten, je celica F+ /moška/, če pa ni prisoten, je celica F- /ženska/. F+celica je donor, sposobna je prenesti gene v F- celico, F-celica pa je recipient, sposobna je sprejeti gene od F+celice. Plazmid je samostojna, dodatna enota DNA v celici. Lahko je krožna ali linearna. Lahko ima informacijo le za prenos DNA ali pa je nosilec še kakšne dodatne informacije, ki je za gostitelja običajno koristna (rezistenca…). Plazmidi se lahko nahajajo prosti v citoplazmi ali pa se interirajo v kromosom gostitelja. So najbolj razširjena oblika subcelularnega življenja, se samostojno podvojujejo in poskrbijo za lasten prenos, tudi med nesorodnimi celicami. Za plazmid zadostuje, da je sposoben preživetja in ne, da je koristen. F-faktor je krožna, dvojna DNA molekula, v celici je prisotna v eni kopiji. Ima 94 x 103 baznih parov, to je 1/ 40 vse genetske informacije, ki jo nosi E.coli. Konjugacija poteka tudi med nesorodnimi celicami in tudi med prokarionti in eukarionti. Pogoji za konjugacijo: ♦ Celica mora biti sposobna narediti kontakt z drugo celico / določena gostota celic/. ♦ Vsaj nekaj donorjeve DNA se mora dati mobilizirati. Običajno konjugacija poteka med večjimi bakterijami, tvori se konjugacijski agregat. Prenos DNA steče, ki je konjugacijski par stabiliziran. Do rekombinacije DNA je stopnja zigote. Če se prenese le plazmid, ni potrebno, da se zrekombinira z DNA. Po končani konjugaciji govorimo o transkonjuganti. Sorodni plazmidi so inkompatibilni. Za prenos DNA je odgovorna tra – regija. Prenos se začne na ori T mestu. V tra – regiji je najmanj 23 genov, ki so zadolženi za prenos DNA (slika 7-15). Gene tra M in tra J imata samostojno mRNA. Vsi ostali geni tvorijo tra – operon. Tra J gen deluje kot antiterminator, pozitivno kontrolira gen tra M, negativno pa kontrolira gen fin O in fin P. Fin O gen nosi in formacijo za protein, ki ga F – faktor nima. Fin P gen pa je kontrapisna RNA. Prepiše RNA v drugo smer, ki je komplementarna tra J mRNA. Povezovanje genov fin P in tra J zavira translacijo, s tem se regulira količina gena tra J. Taka regulacija je še prisotna pri transpozazi, transpozonih,… Donorska celica ima na površini 1-3 F pile. Informacija za delovanje pilov je v praoperonu. Narejeni so iz proteina pilina. Informacijo za pilin pa nosi gen tra A. pilina je narejen iz prekurzorja, ki ga dokončno obdela gen tra Q. Za funkcionalno obliko pilina pa je potrebno še 11 drugih genov. Konjugacijski pari nastajajo tako, da se F pilus donorja poveže s specifičnim receptorskim mestom, na površini recipienta. Receptorske celice so iz lipopolisaharidov. Za njihovo normalno delovanje so potrebni cinkovi ioni in proteini zunanje membrane ( slika 7-16).

57


Predpogoj za prenos DNA je stabilizacija konjugacijskega para. Za stabilizacijo so potrebni geni tra G, tra N in tra D. Konjugacijo med dvema donorjema preprečujeta gena tra S in tra T. Tra S je na notranji strani celice, tra T pa na zunanji strani. Do konjugacije med dvema donorjema lahko pride le, če je donor v stacionarni fazi, ko gena nista tako izrazita. Do prenosa pa lahko pride le med celicama, ki imata nesorodne plazmide. Drugi predpogoj za prenos DNA je mobilizacija donorjeve DNA. Med samo konjugacijo poteka nadomestna sinteza DNA ali DCDS. Pri tej sintezi sodeluje 4-5 genov. Prenos se začne s prekinitvijo DNA na ori T mestu. Za prekinitev je odgovorna endonukleaza, informacijo za endonukleazo nosita gen tra I in tra Y, Do prekinitve pride tudi ko ni konjugacijskega para, potreben je le kontakt med celicami. Ob prekinitvi se aktivira gen tra M, ki začne podvojevanje. Protein I deluje kot helikaze, odvija DNA molekulo. Odvijanje DNA molekule pa začne kompleks tra Y-I. Podvojevalni stroj je na stičišču obeh celic. Prenaša se le enojna DNA. Konjugacijski pari se začno ločevati po 60 minutah. Za prenos celotnega bakterijskega kromosoma pa je potrebno 100 minut pri 37°C.

Z integracijo F faktorja b bakterijski kromosom nastanejo Hfr (high frequency of recombination) celice. F faktor se lahko integrira na različna mesta. Hfr je donorska celica, ki lahko aktivira bakterijski kromosom, da se prenaša. Prenos se začne na ori T mestu, ki je v sredini plazmida. F faktor lahko vključuje tudi transpozone (IS3, IS2,..).

Razlike med konjugacijami:

a) Prenaša se le F DNA: F+ x F - F+

Večina na novo nastalih celic je F+ ( slika 7-17)

b) Prenaša se cel bakterijski kromosom: Hfr x F- Hfr Večina receptorskih celic ostane F- (slika 7-19), najmanj na novo nastalih celic je

Hfr. Hfr celice se pojavijo najkasneje in najredkeje. Tra geni postanejo Hfr geni, prenašajo se najkasneje, s padajočo frekevnco, zato

so Hfr celice najredkejše. Kompleten prenos bakterijskega kromosoma je redek, saj se konjugacijski pari

pogosto prekinejo, preden je konec prenosa (slika 7-20). Če se konjugacijski par prekinejo kmalu po združitvi , se prenesejo le geni, ki so blizu sprednjega konca.

KONSDUKCIJA Konsdukcija je mobilizacija enega plazmida z drugim. V celici sta lahko dva

plazmida, F faktor in px plazmid. F faktor se prenaša, px plazmid pa ne. Z združitvijo obeh (kointegracija) nastane integrat, ki se pri konjugaciji prenaša iz ene celice na drugo. Če je ta integrat stabilen, dobimo kot rezultata konjugacije nove celice, ki vsebujejo integrat. Če pa integrat ni stabilen, pri konjugaciji razpade in dobimo nove celice z dvema plazmidoma.

58


TRANSPOZICIJSKI ELEMENT (TE) Transpozicijski element je fragment ( sekvenca) DNA, ki je deloma samostojen.

Transpozicijski elementi so mobilni elementi, ker se lahko intracelularno selijo iz ene molekule v drugo. ta prenos imenujemo transpozicija.

Nekateri TE se premikajo iz ene na drugo lokacijo v kromosomu, ne da bi pri tem

prišlo do replikacije DNA verige. DNA se na nekem mestu prekine, saj se TE izreže, TE pa se nato vstavi v vrzel, narejeno nekje drugje na kromosomu. Transpozicija pa lahko vključuje tudi rekombinacijo in replikacijo DNA. Rezultat le-teh sta dve hčerinski kopiji originalne TE. Ena ostane na prejšnjem mestu v genomu, druga pa je vključena na nekem novem poljubnem mestu v genomu.

Bakterijske TE smo razdelili v dva glavna razreda:

1. Preprosti TE: to so insercijske sekvence. Nosijo le genetsko informacijo za transpozicijo. Ključne komponente IS sta specifična terminalna odseka DNA, ki sta identična, a obrnjena in obdajata sekvence, ki kodirajo encim transpozazo, ki konca prepozna.

2. Kompleksni TE: so imenovani transpozoni. Končni sekvenci obdajata gene, ki niso v zvezi s transpozicijo.

V sklopu s transpozonom lahko jtako specifičen gen pridobi veliko več možnosti za premik iz ene molekule DNA na drugo. Gene, ki prenašajo rezistenco na antibiotike, so pogosto našli vključene v transpozone.

Mnogi Te naj nebi obstajali izven gostiteljevega kromosoma. Transpozaza, ki

katalizira premik TE, deluje, ko je TE še vključen v gostiteljev genom. Transpozaza povezuje kratki obrnjeni sekvenci na konceh TE tako, da konca drži blizu skupaj in katalizira kasnejšo rekombinacijo. Mutacije lahko nastanejo, če se TE vključi ali pa izreže iz gena, da bi se lahko premaknili drugam. Prisotnosti TE povzroči, da je stabilnost strukture DNA dosti manjša. Izgleda, da so odgovorni za mnogo evolucijskih sprememb organizmov.

59


Vsi znani TE povzročijo kratko duplikacijo tarčne DNA. Ko se izrežejo, ponavadi pustijo za sabo del te duplikacije ali del svojega kromosoma. Tako pri premikanju povzročijo število kratkih adicij ali delecij nukleotidnih sekvenc. (skica 1) Če se dva TE enakega tipa vključita v kromosom v bližini, lahko transpozicijski mehanizem uporabi terminalni konec enega in hkrati terminalni konec drugega TE. Posledica je, da se na novo mesto premakne DNA med tema dvema koncema. Pride do duplikacije in premika eksonov, ki pomagajo kreirati nov gen. (skica 2)

V povezavi z lastnim premikom lahko TE povzročijo delecijo sosednjih nukleotidov ali pa jih celo prenašajo na druga mesta. Insercija TE v promotor korenito poveča ekspresijo prvotno ˝spečihˇgenov. Stranske sekvence TE namreč vsebuje močne promotorske elemente, ki producirajo dosti bolj učinkovite in včasih manj regulirane startne signale za transkripcijo. Ugotovili so, da je fag Mu posebno dolg transpozon, ki kodira ne le transpozazo, ki ga vključi na poljubno mesto v kromosomu E. coli, pač pa tudi ogromno število proteinov, ki gradijo proteinske kapsule, ki obdajajo virusne kromosome. Svoj življenski cikel začne z insercijo v kromosomu E.coli. Na mestu insercije pride pogosto do inaktivacije genov, zato je bil Mu sprva posebej znan pa mutacijskih posebnostih. Ty je retrotranspozon (skica 4) Najbolj poznan TE v kvasovkah (prevod je vprašljiv) je Ty1. Je v sorodu z genomi retrovirusov, ki se množijo v vretenčarskih celicah. Terminalni sekvenci vsebujeta promotorkse lemente in sekvence, ki jih prepoznajo transpozicijski encimi. Centralna regija kodira reverzno transkriptazo. Transpozicija se začne s transkripcijo celotnega Ty, pri čemer nastaja RNA kopija, dolga 6000 baznih parov. Reverzna transkriptaza potem prepiše RNA v komplementarno DNA verigo . Ko nastane dvojna, se končno vključi v gostiteljski kromosom. Ty1 se torej ne premika kot bakterijski transpozoni (s premikom inf. iz DNA direktno na DNA), pač pa sledi ˝sistemu˝ retrovirusov. Podatki o TE: TE so dolgi nekaj 100 pa do 10000 b.p. in so po navadi prisotni v celici v več kopijah. Lahko jih imamo za drobne ˝parazite˝ skrite v kromosomih . Vsak TE se občasno premakne iz enega mesta DNA na drugo v isti celici. To je transpozicija, katalizirana s specifičnimi encimi. Večina TE se premakne zelo redko (1-krat na 105 generacij). Ni znano, kaj nenadoma povzroči njihov premik. Naj bi zavzemali 10 % evkariontskega genoma. Opozorilo: O TE na splošno smo med predavanji povedali dosti manj. V svojem prevodu nisem omenila, da se sinteza transpozaze, ki ima svoj represor, je regulirana in prepozna tarčna zaporedja, začne s promotorjem pIN in pOUT se prekrivata. Dvojna pIN DNA se prepiše v drugo. Promotor pOUT pa je kratka kontraprepisna DNA. Tu je vezavno mesto za ribosomom. Če je p IN sparjena s pOUT, sinteze transpozaze ni. Več je transpozaze, bolj pogosta je transpoticija (po zapiskih).

60


MOLEKULARNI MEHANIZEM TRANSPOZICIJE IN NJENA KONTROLA povzetki iz članka Ronalda H. A. Plasterka (Cell, vol. 74, Sept. 1993)

Transponibilni elementi:

so samostojne replicirajoče enote. Vsebujejo en gen, ki je na koncih navadno omejen s kratkimi ponavljajočimi se odseki DNA. Gen nosi informacijo za protein TRANSPOZAZO, ki lahko sproži podvajanje elementa in njegovo razširjanje znotraj večjega gena ali celo med geni. Razširjanje Tr. elementov po gostiteljevem genomu pa mora biti vsaj toliko regulirano, da zagotavlja vsaj minimalno ˝zdravje˝ gostitelja. Lahko pa so transpozoni za gostitelja tudi koristni, saj včasih predstavlja več 10% njegovega genoma. Zanimiv dokaz o tem, kako hitro se transpozoni širijo je primer P-elementov pri vsrti Drosophila melanogaster. Enemu primerku te vrste je bil vstavljen transpozon P iz genoma druge vrtse (D. willistoni). Po 50-letih imajo P transpozon vse prosto živeče mušice vrste d. melanogaster. Zanimiv je tudi zaključek, da so torej vse prostoživeče mušice potomke ene same drozofile, ki je bila s P-elementom okužena horizontalno. Horizontalen prenos: je sprejem genetskega materiala iz ˝nestarševskega˝ vira. To bi bila lahko tudi razlaga za odstopanja med evolucijskimi drevesi vrst in drevesi, sestavljenimi na podlagi sorodnosti DNA. Prisotnost istih ali podobnih trans. ele. ni povezana s sorodnostjo. Alternativna hipoteza: Predniki so imeli kopije različnih trasponibilnih elementov, od katerih so se nekatere sčasoma izgubile – hitrost evolucije je bila pri različnih vrstah različna. Vendar pa najnovejše raziskave dajejo močne argumente v prid horizontalnemu prenosu. Ugotovili so, da se nekateri tr. ele., ki so odsotni v celih delih evolucijskih dreves, nato pojavijo pri vrstah, ki so se ločile pred 200 milijoni let, z več kot 95% enakih nukleotidov. Dokazali so tudi, da se transpozoni lahko prenesejo celo s hrano: neke mušice so se okužile s transpozonom, ker so njihove ličinke hranili z ekstrakti že okuženih mušic. Ta poskus kaže, kako nejasna je meja med transpozoni in virusi.

TRANSPOZICIJA IN REPLIKACIJA Transpozon lahko skače po genomu, vendar to ni dovolj za njegovo razširjanje. Mora se tudi podvojevati pogosteje kot preostanek genoma. Zato obstajajo številni mehanizmi. Primer: transpozaza P-elementov odreže dele dvojne DNA na koncih transpozona. S tem osvobodi P-element. Gostiteljevi encimi popravijo donorsko DNA – navadno jim za model služi DNA homolognega kromosoma ali sestrske kromatide, ki pa pogosto tudi sama vsebuje P-elemet. IZBIRA CILJA: Mobilen segment imenujemo transpozon, če se lahko regenerira na različnih mestih genoma. Vendar pa ni nujno, da se transpozon integrira enakomerno na vsa mesta. Dokazali so, da imajo transpozoni tako imenovana preferenčna mesta, kamor se raje vstavljajo. Kako pa prepoznajo ta mesta? To vprašanje zaenkrat ostaja nepojasnjeno. Dokazali pa so, da preferenčna mesta niso strukturno označena (npr. z zavoji, zankami,…), saj so sekvence različnih p-mest istega transpozona zelo različne ( nepojavijo se kakšni značilni vzorci)

61


ENCIMOLOGIJA TRANSPOZAZE: Naloga tega transpozonovega encima je, da spravi skupaj konce transpozona in tarčno DNA. Transpozaza je verjetno oligomer, aktivni del pa sestavljajo štiri podenote, ki zagotavljajo pravilno rezanje ˝donorja˝ in DNA in se nanje specifično veže. REGULACIJA: Za regulacijo navadno skrbi represor, ki je prav tako kot transpozaza zakodirana v DNA transpozona. Pri prenosih P-elementovmed oploditvijo pa lahko celo isti P-elemet (od samca) deluje kot represor ali kot transpozaza, odvisno od citoplazme oocite. Ni dokazano kaj v resnici P-represor je, niti kako deluje na transpozazo: ali direktno na njen promotor, ali posredno z aktivacijo drugih faktorjev. TRANSPOZONI PRI LJUDEH: Najbolj znan je retrovirus HIV, kise prenaša hotizontalno. Veliko raziskav danes posvečajo njegovi transpozazi kot potencialni tarči za antivirusno terapijo. Manj znani so še LINE in Alu transpozoni, ki pa so tudi pogosto krivci za nekatere znane bolezni, npr. hemofilija, tumor, mišično distrofijo. Transpozoni so tudi precej pogost razlog za mutacije pri človeku.

RETROVIRUSI

Genom vključuje dve identični enojni plus – verigi RNA. Intermediat v replikaciji je dvojna DNA, ki se integrira v gostiteljev genom. Govorimo o provirusu, ki je osnova za transkripcijo novih virusnih genomov. V virionu je prisotna reverzna transkriptaza, ki je ključen encim. Virioni brstijo iz celice in jo ne lizirajo. Retrovirusi nimajo popravljalnih mehanizmov.

Sem spadajo: Rous sarcoma virus (RSV), morine leukemia virus, HTLV I (rak T limfocitov), HTLV II, HTLV III (=HIV, povzroča AIDS).

Geni, ki jih vključuje genom enostavnejših retrovirusov: - gag (informacija za grupno specifičen antigen). - pol (inf. za reverzno transkriptazo in integrazo). - env (inf. za prekurzorski protein ovojnice).

Nekateri imajo še specifične gene; npr. HTLV I in II imata tak gen (aktivator transkripcije), veliko jih ima onc gene, ki so sposobni inducirati raka.

RNA virusa vsebuje na obeh koncih regije (U3 ali U5 in R), ki se ne prevajajo, ampak vključujejo signale potrebne za replikacijo in transkripcijo. Provirus je daljši od RNA, ker ima na vsakem koncu dodane sekvence U3 oziroma U5. Te sekvence se dodajo med sintezo DNA. Tako pride do nastanka LTR (long terminal repeat) na vsakem koncu DNA provirusa. LTR= U3–R-U5 in vključuje signale za začetek transkripcije z RNA polimerazo II in za cepitev na 3′ koncu ter poliadenilacijo prepisane DNA molekule (priloga 1). Ti signali so: enhancer transkripcije, CCAAT in TAATA.

Sinteza DNA začne s sintezo minus-verige DNA, ki se prepisuje z virusne RNA. Tu gre za reverzno transkripcijo. Sledi sinteza komplementarne plus-verige, torej nastane dvojna DNA. Potek (priloga 2, sl. 24-28): - gostiteljeva t RNA je primer, veže se na pbs mesto blizu 5′ konca virusne RNA; - sinteza do 200 nukleotidov dolgega DNA oligonukleotida. Gre za prepis U5 in R;

62


- RNAza H (del reverzne transkriptaze) degradira RNA v DNA-RNA hibridu; - sintetizirani del DNA se lahko spari s homologno R regijo na 3′ koncu virusne RNA. To

je 1. preklop (= jump ali verižni transfer); - nadaljuje se elongacija DNA; - RNaza H cepi RNA blizu 3′ konca takoj za regijo ppt (polypurine tract), tako lahko 3′

konec ppt regije tvori primer za sintezo plus-verige DNA; - Po prepisu U5 in pbs regije pride do 2. preklopa. Pbs regija na 3′ koncu minus-verige

DNA se spari s komplementarno pbs sekvenco na plus-verigi DNA; - RNaza H odstrani RNA; - Sledi dokončna sinteza komplementarnih DNA verig, tako da dobimo linearno dvojno

vijačnico DNA z LTR na obeh koncih. 4 funkcije reverzne transkriptaze: - od RNA odvisna DNA sinteza, - degradacija RNA v DNA-RNA hibridu - od DNA odvisna DNA sinteza - specuifična cepitev RNA na 5′ koncu U3 regije

Nastala DNA se transportira v jedro. Celični encimi združijo konce, nastane ccc

oblika, ki predstavlja prekurzor za integracijo v gostiteljev genom. Integracija poteka s pomočjo inegraze. Pri tem provirus izgubi 2 nukleotida na vsakem koncu, celični DNA pa se na mestu vključitve podvoji 4-6 nukleotidov dolga sekvenca (Sl. 24-29).

Integriran provirus je stabilen, ne pride do ekscizije. Izgubi se lahko le z delecijo. Je matrica za direktno sintezo virusnega genoma in proteinov (Sl. 24-31).

Če je provirus vključen v genom spolne celice in se prenaša na hčerinske celice skupaj s celičnimi geni in se ne prepisuje, govorimo o endogenem provirusu.

GENETSKE SPREMEMBE RETROVIRUSOV Imajo veliko stopnjo spreminjajnja. Zelo pogosto rekombinirajo. Velika variacija

bazira na številnih napakah, ki nastanejo pri reverzni transkripciji. Velik vpliv na to ima zlasti potreba po dvojni preklopitvi pri nastajanju provirusa.

-substitucija baznih parov nastopi zaradi delovanja reverzne trankriptaze kot polimeraze, pride do misinkorporacije, določeni deli so dovzetnejši za mutacije-hot spots;

-sprememba bralnega okvira je posledica adicije ali izpada 1 nukleotida med replikacijo retrovirusa, frekvenca teh mutacij je večja, čim daljše so regije, ki vključujejo samo eno vrsto nukleotida (9-10 T skupaj ali 9-10 A skupaj);

-delecije pri katerih gre za odstranitev nukleotidov med manjšimi direktnimi ponovitvami, povzroči pa jih lahko tudi nepravilna vključitev baze (misinkorporacija)

-delecije z insercijami – tu se na mesto delecije vrine skupina nukleotidov. To se zgodi pri 1. preklopu, ker rev. transkriptaza ne preklopi na isto ampak na drugo RNA, pri enem od naslednjih preklopov pa se rev. transkriptaza vrne na prvotno RNA;

-rekombinacija med dvema RNA molekulama predstavlja prednost, ker omogoča popraviti prekinitve in izmenjavo sekvenc nukleotidov. Retrovirusi nimajo molekul potrebnih za rekombinacijo, ampak jim RNA dimer zagotavlja substrat zanjo.

Homologna rekombinacija se pojavi med sintezo minus-verige DNA. Izvira iz preklopa na identično sekvenco druge RNA molekule dimera.

63


Nehomologna rekombinacija se pojavi, če virion vsebuje nevirusno RNA in pride do preklopa na to RNA. Nastane himerična RNA. Na ta način so nastali onkogeni virusi (vključujejo celične protoonkogene sekvence).

5′ r - u5 – pbs e gag pol env ppt – u3 – r – p(A) 3′

RNA LTR LTR

U3 R U5 E gag pol env U3 R U5 DNA PBS PPT

r - u5 – pbs e gag pol env ppt – u3 – r – p(A) RNA

PRILOGA 1: RNA in DNA genoma enostavnega retrovirusa. Inficirana virusna RNA se prepisuje v nasprotni smeri kot virusna DNA, ki je prepisana za tvorbo potomske virusne RNA. gag, pol and env so geni za proteine viriona. (Ostali imenovani geni nastopajo v cis in so opisani v tekstu). p(A) je poliadenilski konec, ki ni nasprotno transkriptiran. /??? The tRNA primer is shown annealed to pbs. V virionu sta dve kopiji genomske RNA. r – u5 – pbs // ppt – u3 – r – p(A) r – u5 – pbs // ppt – u3 – r – p(A) R – U5 – pbs // ppt – u3 – r – p(A) R – U5 – pbs // ppt – u3 – r – p(A) U3 - R – U5 – pbs // ppt – u3 – r – p(A) // PBS U3 - R – U5

64


– pbs // ppt // PBS U3 - R – U5 U3 - R – U5 // PBS U3 - R – U5 U3 – R – U5 U3 – R – U5 // // U3 – R – U5 U3 – R – U5 PRILOGA: Sinteza retrovirusa DNA. Črte brez puščic – RNA, črte s puščicami – DNA.

MAJHNA RNA JE LAHKO TRANSLACIJSKI REPRESOR Vezavna mesta na ribosomu so lahko blokirana,če so bazno sparjena s

komplementarnimi RNA, ki preprečujejo ribosomski privlak tako, da prikrijejo kritične sekvence.

Primer:

TRANSPOZAZA: encim, ki omogoča transpozicijo transponibilnega elementa. Tnl0 Dva sosednja promoterja, ki sta na začetku gena za transpozazo se imenujeta pIN in pOUT in sta pomembna za regulacijo (Sl. 16-26a). Promoter pIN uravnava sintezo transpozazne m-RNA. Iz pOUT pa nastaja RNA v nasprotni smeri in vsebuje 35 obrnjenih nukleotidov pIN. Tako je prvih 35 nukleotidov od pOUT ravno komplementarnih sekvencam na začetku transpozazne m-RNA. Te delno prekrivajoče se sekvence, ki prekrivajo začetne dele transpozaze, preprečujejo vezavo ribosomalnih partiklov (Sl. 16-26b). Posledica je, da je ekspresija transpozaze nizka in da se transkripcija redko zgodi.

Prednost: 1. Pred translacijsko represijo: celica je tako zavarovana pred izpustitvijotranspozaznega

gena pri transkripciji iz zunanjosti transpozona. 2. Tudi če je naenkrat narejeno preveč transpozazne m-RNA, bo RNA represor zmožen

inhibirati presežek translacije. Pomen:

Z genskim inženiringom je možno konstruirati plazmid, ki dela RNA, ki je komplementarna translacijski regiji znanega gena. S tem preprečimo ekspresijo določenih genov in tako umetno manipuliramo z gensko ekspresijo v celici.

65


RAZLIKE MED PROKARIONTSKO IN EVKARIONTSKO mRNA

Značilnosti obeh: - translacija je istosmerna 5’→ 3’ - obe sta metilirani oz. modificirani (za zaščito pred nukleazami) Značilnosti le evkariontske mRNA: - transkripcija in translacija nista simultani - mRNA se procesira - mRNA ima poli-A rep na 3’ (IEO-200A) za stabilizacijo (zaščito pred eksonukleazami) na 5’ je CAP (G-ppp) pri vseh mRNA, ki omogoča translacijo in zaščito, razen pri evkariontih kratke nukleolarne RNA nimajo CAP (cepljena heteronukleolarna RNA ima CAP in poli-A).

BAKTERIOFAG λ Je profag (λ-ina DNA se vgradi v bakterijsko DNA) v lizogenem ciklu. Prepis in prevajanje potekata simultano. Ima krožno, dvojno DNA. Je temperirani bakteriofag na E. coli (to pomeni, da lahko deluje v litično in lizogeno smer). LITIČNO (ob ugodnih pogojih za E. coli) - podvojevanje λ DNA - sinteza fagnih partiklov - sestavljanje virusa - liza celice in sproščanje λ virusa v okolje

LIZOGENO (ob neugodnih pogojih za E. coli) - represija λ genov, razen tistih potrebnih za

integracijo λDNA v kromosom in tistih, ki omogočajo, da tam tudi ostane

- integracija λDNA v kromosom E. coli (gostitelja).

(če iz neugodnih pogojev nastanejo ugodni) + proteaza (gostiteljeva), integraza, ekscizionaza (fagna) Začetna pot za litični in lizogeni cikel je skupna: 1. Infekcija: λ virus se pritrdi na gostiteljsko celico (E. coli) in se vanjo injecira. 2. RNA pol gostitelja se usede na promoterja PL in PR in začne prepis zgodnjih genov, s PL

v levo, s PR v desno smer.

66


3. Na levi se prebere in prevede N protein, ki omogoča RNA pol, da zdrsne preko terminatorskih zaporedij in tako nadaljuje prepis v levo in desno (je antiterminator). Na desni se sintetizirata: proteina CRO in C2, ki usmerjata v litično ali lizogeno smer, nekaj proteina O in P, ki sta zadolžena za začetek replikacije fagne DNA. Od tu dalje se pot cepi na litično ali lizogeno, odvisno od tega, kateri od dveh proteinov nadvlada (CRO ali C2).

LIZOGENA POT (nadvlada C2 protein) 4. C2 se veže na promoterje:

- PI, kjer aktivira sintezo integraze (prepis v levo) - PRE, kjer aktivira sintezo represorja C1 (prepis v levo) - PAQ, kjer zavre sintezo poznih genov (ni prepisa v desno)

5. C1 se veže na operatorja OL in OR in deluje kot represor na sintezo genov levo od OL in genov desno od OR. C1 (v celici ga še ni veliko) deluje na OR kot aktivator za RNA pol na promoterju PRM in s tem sproži še več lastne sinteze (prepis v levo). Edini protein, ki se še sintetizira, je C1.

6. Ko se nakopiči v celici dovolj velika koncentracija C1, deluje C1 na OR kot represor za lastno sintezo (prepisa v levo ni več). Ni več sinteze nobenega fagnega proteina.

7. Integraza povzroči, da se fagna DNA integrira v kromosom E. coli. LITIČNA POT (nadvlada CRO protein ) 4. CRO (v celici ga še ni veliko ) se veže na CL in tu deluje kot represor za prepis v levo, in

na OR, kjer reprimira prepis v levo (ni sinteze C19 ter aktivira sintezo genov desno od OR in s tem še več lastne sinteze, prepišejo in prevedejo se tudi proteini: - O in P, potrebna za replikacijo DNA (naredi se veliko kopij fagne DNA) - Q protein, ki deluje kot aktivator na PR΄ promoter in začne s tem sintezo poznih genov

(prepis v desno), ki kodirajo lizocim, proteine glave in repa. Q deluje tudi kot antiterminator na TR΄ terminator.

5. Ko se v celici nakopiči dovolj CRO proteina, deluje kot represor na OR in konča se prepisovanje genov desno od OR.

6. Lizocim povzroči lizo celice.

DELOVANJE C1 IN CRO PROTEINA

1. Če se CRO in C1 vežeta na OL, delujeta nanj kot represorja. 2. C2 je ob prisotnosti glukoze v celici manj aktiven, tedaj nadvlada CRO in virus gre v

litično smer. Če glukoza ni prisotna je aktivnost C2 velika in ni nadvlade CRO, fag gre v lizogeno smer. OR je iz treh podenot: OR1, OR2, OR3. Vsaka enota ima na koncih palindrom. Na eno podenoto se veže ena molekula C1 ali CRO. OR je operator za PR in PRM. RNA pol ima

67


večjo afiniteto za PR kot za PRM, zato se ob odsotnosti CRO in C1 veže na promotor PR in začne sintezo v desno (skupna pot za litični in lizogeni cikel). a) LIZOGENA POT C1 represor ima večjo afiniteto za mesti OR1 in OR2 kot za mesto OR3. Na OR2 in OR1 sta dimera C1 v kooperativni interakciji (sta povezana). To omogoča trdnejšo vezavo na PR. Ker se RNA pol ni mogla vezati na PR, se tedaj veže na PRM. Začne prepis gena C1. Količina C1 v celici naraste in ta se tedaj veže tudi na OR3 mesto. To pa prepreči vezavo RNA pol tudi na PRM (ni sinteze). b) LITIČNA POT CRO ima večjo afiniteto za OR3 kot za OR1 in OR2 in ga zato tudi zasede. (CRO proteina je malo). Prepreči RNA pol dostop na PRM. RNA pol se veže na PR in s tem omogoča prečitanje zgodnjih desnih genov, med njimi tudi lastnega. Količina CRO v celici naraste in ta se veže tudi na OR1 in OR2. To pa prepreči vezavo RNA pol tudi na PR (ni sinteze).

VEZAVA C2 NA PROMOTERJE

Promoter PRE ima konsenzusni zaporedji na –10 in –35. Na levi in desni –35 sekvence sta identični zaporedji (3΄ CGTT΄ ), kamor se veže C2 in prekrije mesto –35, kamor se običajno veže RNA pol. S tem usmeri delovanje RNA pol v levo (prepis C1). Podobno je zgrajen tudi promoter PI, zato se tudi nanj veže C2. Delovanje C2 na promoter PAQ še ni znano.

ANTITERMINATORSKO DELOVANJE N IN Q PROTEINA N deluje antiterminatirsko na terminatorje TR1, TR2 in TL. Q deluje antiterminatirsko na terminator TR. Za delovanje antiterminatorja mira biti kakih 60 do 200 baznih parov pred terminatorjem AUT (antiterminatorsko UT) mesto. V nadaljnjem je opisan primer za delovanje N na TRI, vendar je princip povsod enak. AET se v našem primeru imenuje NUT. NUT je iz boxA, boxB in boxC sekvence. BoxB ima palindrom. RNA pol z vezanim NusA proteinom (gostitelja) prepiše NUT. Sintetizira se mRNA, ki ima prav tako boxa, boxb in boxc. Boxb ima palindrom in zato tvori hair-pin zanko, kamor se veže N dimer. N se na drugi strani veže z NusA. Povezava boxb-N-NusA modificira RNA pol tako, da ta sedaj lahko zdrsne preko terminatorja TR1 (kontrola na nivoju transkripcije). Simultano s prepisom poteka tudi prevajanje. NusB protein (gostitelja) se poveže z boxa (mRNA) in S10 (protein male ribosomske podenote) in omogoči, da steče prevajanje preko boxb zanke (kontrola na nivoju translacije). O IN P INICIACIJSKA FAKTORJA ZA REPLIKACIJO VIRUSNE DNA O protein prepozna ORI mesto n λ-ini DNA. (je analog DNAa proteinu pri E. coli). P protein se veže z O in drugimi replikacijskimi proteini gostitelja (je analog DNAc proteinu pri E. coli). Nastane replisomu podobna struktura, kamor se veže tudi RNA pol. λ-ino ORI mesto je

68


znotraj gena O in ga sestavljajo štiri skoraj enake palindromske sekvence DNA. λDNA replikacija teče le v primeru, če se hkrati prepisuje ORI mesto ali njegova okolica.

DNA SINTEZA

1. Krožna λDNA se najprej podvojuje običajno od ORI mesta v obe smeri ( način s θ

strukturo) in nastaja več krožnih DNA. 2. Kasneje se sintetizira DNA po rolling circle mehanizmu z dvema posebnostima:

- 5´ konec, ki se odmakne, se sproti podvojuje. - DNA, ki se na novo sintetizira, se ne cirkularizira, ampak nastajajo dolga tandemska

zaporedja novih DNA molekul (=kontramera) Pred pakiranjem DNA v glave se mora ta cirkularizirat. Kontramero razreže terminaza

(kodirana v fagnih genih NUI (reže) in A (cirkularizira)) na COS mestih (dobimo sticky end-e) in nato dvojne linearne DNA, ki imajo vso fagno informacijo, cirkularizira.

Le krožne DNA podvojene z rolling circle mehanizmom podvojevanja se lahko

pakirajo v fagne glave ne pa tudi krožne DNA narejene z običajnim podvajanjem.

PREHOD IZ LIZOGENE V LITIČNO SMER Encima integraza in ekscizionaza izrežeta λ-ino DNA (lizogena oblika) iz bakterijske

DNA in ta se nato cirkularizira (litična oblika). Da se to zgodi, je potrebna proteaza, ki veže in deaktivira represor C1 in s tem

osvobodi opratorje in da možnost, da se v prisotnosti glukoze virus usmeri v litično pot. Podobno deluje na C1 tudi antirepresor lambdoidnega fqgq??, ki veže nase represorje in s tem osvobodi operatorje. ___________________________________________________________________________ Prevedeno po knjigi: Watson & Hopkins: Molecular Genetic Of The Gene (4th edition) OPOZORILO! Verjetno se je od prvega prevoda (leto 1994) tudi že kaj spremenilo (saj veste – genetika gre pač naprej) in za to ne odgovarjamo. "Skripta" ni napisana po predavanjih, zato gre včasih v podrobnosti, verjetno pa tudi kaj manjka. Ne odgovarjamo za napake, še manj pa za slabe ocene na izpitu. Prostovoljne prispevke (kavice v Vivotu ali iz avtomata) lahko dostavite direktno zgoraj omenjenim prepisovalcem. Ljubljana, 13.3.2002

69

Documents

Sinteza DNA se zaène z vezavo nukleotidov na 3? OH konec s ... · MOLEKULARNA GENETIKA Jadranka Ajković, Katarina Aleš, Barbara Černe, Živa Fišer, Maja Gračner, Vesna Hodnik,