Single Chromatin StreSingle Chromatin Strettching ching Reveals Physically Reveals Physically

Distinct Population of Distinct Population of DisDisasassembly Eventssembly Events

L. H. Pope, M. L. Bennink, K. A. van Leijenhorst-Groener, D. Nikova, J. Greve, und J. F. Marko

wird präsentiert von Anil Demirata

Gliederung

Hintergrundwissen und Einführung

Material und Methoden

Ergebnisse und Diskussion

Zusammenfassung und Ausblick

GrundkenntisseGrundkenntisse

DNA + Proteine Chromatin Kompaktierung: 104 – 105

Grundeinheit: Nukleosom Es besteht aus:

NCP: nucleosome core particle

Linkerhistonen Linker DNA

Höher geordnete Chromatin Strukturen

http://micro.magnet.fsu.edu/cells/nucleus/images/chromatinstructurefigure1.jpg

Nukleosom

NCP: ist ein Oktamer 1x (H3-H4)2 Tetramer 2x (H2A-H2B) Dimere DNA: ~146 bp um 1,65 mal

Linkerhiston: bindet ein/ausgehende DNA(~160 bp)

Linker DNA: Abstandhalter: (~200 bp)

Chromatin Breite: 11 nm

http://www.bio.miami.edu/dana/104/nucleosome.jpg

http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/Stryer/Stryer_F37-08.jpg

Höher geordnete Chromatin Strukturen

Auch 30 nm-Fiber genannt Zwei Modelle

Reguläre Spirale Irregulärer Zick Zack

Aktive Form

Dynamisch für Rekombination Transkription Reparationsmaschinerie

http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/seitz-stefanie-2004-10-20/HTML/seitz_html_21996ee1.png

wird erreicht durch...

Posttranslationale Modifikationen an den Ausläufern von Histonen: acetyliert (A) phosphoryliert (P) Ändert NCP-NCP

Wechselwirkung (WW) der Grad der

Kompaktierung ist regulierbar durch Schlüsselenzyme

http://chemistry.gsu.edu/faculty/Zheng/nucleosome.jpg

wird erreicht durch (2)...

Änderungen in Ionenkonzentrationen Linkerhistone

die Abschirmung der negativen Ladung des DNA-Rückgrats auch durch basische

nicht-Histon Proteine: HMGs

Polyamine in Chromatin

http://academic.brooklyn.cuny.edu/biology/bio4fv/page/molecular%20biology/dsDNA.jpg

EinführungEinführung

Vorteil der Forschung mit einzelnen Molekülen Untersucht werden

Struktur, Dynamik, Kinetik und Mechanik

von DNA-Protein WW in Zusammenhang mit DNA-Kompaktierung mit den Methoden: AFM, Optical Tweezer und

flow generated forces

drei wichtige Studien Extrahierte individuelle

Chromatinfäden Native

Chromatinfäden Untersucht wird

mechanische Eigenschaften

Bei verschiedenen Salzkonzentrationen

Weniger kompaktes Chromatin in niedrigeren Salzkonzentrationen

Rekonstruierte Chromatinfäden

präzis und reproduzierbar

Strukturelle Informationen

Stretching Zerreißen von

einzelnen Nukleosomen

Individuelle DNA MoleküleDefinierte kurze NukleosomenarrayKeine Linkerhistone

Nukleosomen werden schrittweise gespaltet

Ziel dieser Arbeit

Bestehende Frage: “Wie wird der genetische Code organisiert und zugegriffen?”

Erwartungen: Die Stretching-Bedingungen beeinflussen Zerreißkraft

Hier: bestimmt wird Zerreißkraft (F) und Längenunterschied (ΔL)

jeweils pro mechanisches Zerreißen von Chromatinfaden (Event)

Zerreißkraft Energiebarrieren Längenunterschied Typ des Nukleosomsunterbrechen

Ziel dieser Arbeit (2)

Bestehende Frage: “Wie wird der genetische Code organisiert und zugegriffen?”

Überlegung: DNA-Protein WW müssen irgendwie geändert und/oder unterbrochen werden

Durch Kraftgenerierende Motoren: Polymerasen

MaterialMaterial

12 bp Überhänge von λ-DNA werden ergänzt in der PCR mit bio-11-dUTP und bio-14-dATP Streptavidin bekleidete Polystyrene beads

(Ø=2,6μm)

Methode Methode

1 DNA Molekül zwischen 2 Beads + Xenopus Oozytenextrakt Kompaktion von DNA von 16,4 μm zu 2 μm

Optical trapping 1064 nm

Infrarotlaser O

Micropipette: erlaubt das Bewegen von nicht “getrappten” bead

piezzo-Streckung

Quadrant Detektor: notiert Ablenkung des transmittierten Laserlichts

Kraft ist Direkt proportional zu Δx

Optical trapping

ErgebnisseErgebnisse

Vergrößerung: Einzelne Events

(DNA-Protein WW) ΔL Indiz: welche WW ist

unterbrochen(später)

Hier: Dabei steigt die Kraft F steigt stetig an und dann fällt plötzlich ab

Genereller Verlauf: 1.& 2. Streckung von

rekonstutierter Chromatinfaden

Kraft / Extensions-Kurve Plateau bei 65pN

(wie bei nackten DNA)

Fig2

Statistik

Kraft-Extensions-Kurven mit verschiedenen Chromatinfasern Mit verscheidenen Piezo-

Streckgeschwindigkeiten

Zerreißkraft (F) und Längenunterschied (ΔL)

Analyse

ΔL pro Event Histogramme Multi Gauss Fitting

3 peaks bei 30, 59, und 117 nm

30nm Abwickeln halbes Nukleosoms 59nm und 117nm 1-2 Nukleosom Abwickeln

Fig 3

Applied Dynamic Force Spectroscopy Theory

Betrachtungen: Für jedes Zerreißen: dF/dt aus

dF/dx und Streckgeschwindigkeit v Chromatin: Kette von N in Serie

geschalteten Ereignissen folgende Strecken:

weniger Ereignisse mit höherer Kraft sichtbar

3 Energiebarrieren

Fig 4

Alle

WeitereStrecken

ErstesStrecken

Korrelationen

Um eine Korrelation zwischen Energiebarrieren und Typ von Zerreißen der Nukleosome zu bestimmen

Daten (F) werden sortiert Für korrespondierende Energiebarrieren Graphen F vs ΔL

Eine kleine Korrelation sichtbar

Fig5

25 kBT

28 kBT

DiskussionDiskussion

Chromatin DNA + Xenopus Oozytenextrakt Hier: statt somatischem Linkerhiston H1

embryonisches Linkerhiston B4 Weniger basisch im C-Terminus geöffnete aktive Form

in vitro : physiologisch angeordnete Nuckleosomen (mit 62 nm Abstand)

Längenunterschied korreliert nur mit Abwicklung der Nukleosomen

Warum zwei verteilte Kräfte?Warum verschwindet eine nach der ersten Strecken?

schrittweise 1. B4 sehr mobile, schwach gebundene Proteine 2. H2A-H2B Dimere 3. (H3-H4)2 Tetramer

Höhere Kraft im ersten Strecken: alle Linkerhistone eine Energiebarriere (28kBT)

Niedrige Kräfte 2 Energiebarrieren (25kBT & 20kBT)

gleiche Anzahl von Events für hohe und niedrige Kraft in Natur 28kBT und 25kBT Barrieren möglich

Differenz: 3kBT: Energiebeitrag von B4

Abwicklung von DNA

60 nm: ganzes Nukleosom

30 nm:partielle Abwicklung

3 Modelle

ändert die Konturlänge zwei diskräte ΔL: bei 30nm und 60nm

neues Modell

zuerst: Linkerhiston und schwachgebunde Teile der NCP

dann: übrige Oktamere

zweites Modell

zuerst: Linkerhistone und (H2A-H2B) Dimer dann: übriges Hexamer

K. Klenin, T. Wocjan, J. Langowski (2006)K. Klenin, T. Wocjan, J. Langowski (2006)

zusätzlich

Zuerst Chromatinfaden vollständig strecken (bis auf nackte DNA-Länge)

dann Relaxation, Chromatinfaden zieht sich auf intermediäre Konturlänge zusammen

NCP-Teile nicht vollständing abgelöst

keine Korrelation in der Abfolge der 30nm und 60 nm-Schritte

ZusammenfassungZusammenfassung

Abwicklung von Nukleosomen verläuft in Schritten

30 nm “Halbschritte” in rekonstutiertem Chromatinfaden (hier) und kurzen Nukleosomenarrays (Brower-Toland et al.)

3 Energiebarrieren Für folgende Streckzyklen: Events zu 28kBT Energiebeitrag des B4 Linkerhistons: 3kBT

Zusammenfassung 2

diese Barrieren Hindernis beim Zugriff auf den genetischen Code

kraftausübende Motoren (Polymerasen) Torsionkräfte auf DNA durch Polymerasen

können zum Öffnen des Chromatins beitragen

Nukleosomen können abgewickelt und dann wieder hergestellt werden.

Traskription ist bei (H3-H4)2 nicht gestört

AusblickAusblick

Ersetzen oder Ausnehmen von Faktoren im Extrakt

B4 gegen H1 tauschen oder “abschalten” Rekombinante Histone

Effekte von (A) & (P) vortäuschen Histone ohne Ausläufer(tails) Effekt von HMGs? Studien mit einzelnen Molekülen: erweitert den

Einblick

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