6
Serum protein pro®les of patients with pancreatic cancer and chronic pancreatitis: searching for a diagnostic protein pattern A. Valerio 1 *, D. Basso 2 , S. Mazza 2 , G. Baldo 3 , A. Tiengo 1 , S. Pedrazzoli 3 , R. Seraglia 4 and M. Plebani 2 1 Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Padova, Italy 2 Department of Laboratory Medicine, University of Padova, Italy 3 Department of Medical and Surgical Sciences, University of Padova, Italy 4 CNR, CSSRCC, Padova, Italy Received 24 July 2001; Revised 22 October 2001; Accepted 24 October 2001 In this study, 13 sera from patients with pancreatic cancer, 9 from chronic pancreatitis and 10 from healthy subjects were analyzed by matrix-assisted laser desorption/ionization MALDI) mass spec- trometry. The MALDI mass spectra revealed the presence of several low molecular weight peptides, among which some were detected only in the sera from both pathological conditions. On the other hand many peptides were observed only in control sera, and were absent in the sera from the two diseases. Therefore, MALDI analysis of the low molecular weight fraction <10 000 Da) of sera from patients with pancreatic diseases enabled us to identify the presence of some disease-related signals and also some signals characteristic of normal subjects. Copyright # 2001 John Wiley & Sons, Ltd. It is well known that an altered serum protein pattern is a common feature associated with malignant or acute and chronic inflammatory diseases. 1±3 Typical serum markers are associated with several diseases: they can be `new' proteins, normally not observed in control sera, or they can be normally present at low concentrations in healthy subjects while being abnormally high in diseased patients. 4 An open question in this regard is the identification of serum markers useful for the diagnosis of pancreatic cancer PC) and for the differential diagnosis of this malignancy from chronic pancreatitis CP). 5 These two diseases are in fact very difficult to distinguish from one another especially in their first stage of develop- ment. In previous papers 6,7 we demonstrated, in in vitro experiments, the presence of a low molecular weight peptide in the culture medium conditioned from a pancreatic cancer cell line, able to cause an impaired glucose metabolism in isolated and perfused rat hepatocytes. We hypothesized that pancreatic cancer cells can release bioactive peptides, possibly passing into the systemic circulation. The MALDI mass spectrometric approach is useful to identify and characterize the primary structural features of serum peptide profiles, as demonstrated by Clauser et al. 8 and Ferrari et al. 4 The aim of the present study was therefore to analyze by MALDI mass spectrometry the serum peptide patterns of patients with pancreatic cancer and chronic pancreatitis, in comparison with those obtained from control subjects, in order to search for a marker that allows the characterization of these two pathological conditions and to verify the clinical usefulness of an altered protein profile. MATERIALS AND METHODS Subjects Fasting serum samples were obtained from a total of 32 subjects. Thirteen patients 6 males, 7 females, age range 55±71 years) had pancreatic cancer, histologically confirmed on surgical specimens. Nine patients 8 males, 1 female, age range 41±64 years) had a diagnosis of chronic pancreatitis made on the basis of positive results from at least two of the following approaches: plain abdomen X-ray for pancreatic calcifications, pancreatic ultrasonography, computed axial tomography, and endoscopic retrograde cholangio pancrea- tography. The control group consisted of 10 healthy controls 5 males, 5 females, age range 30±55 years). Methods MALDI mass spectrometry measurements were performed using a REFLEX time-of-flight instrument Bruker-Franzen Analytik, Bremen, Germany) equipped with a SCOUT ion source, operating in positive linear mode. Ions formed by a pulsed UV laser beam nitrogen laser, l 337 nm) were accelerated to 25 kV. Pulsed ion extraction PIE) was em- ployed, by applying a voltage of about 23.25 kV to the second grid for 250 ns. Sinapinic acid Sigma Chemicals, St Louis, MO, USA) saturated solution in acetonitrile/water 50:50 v/v containing 0.1% trifluoroacetic acid) was used as matrix. Before analysis by MALDI-MS all serum samples were diluted 1:3 with saline solution before two steps 30 000 and 10 000 Da) of ultrafiltration with centrifugal filter devices Amincon, Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). The *Correspondence to : A. Valerio, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Via Giustiniani 2, 35128 Padova, Italy. E-mail: [email protected] DOI:10.1002/rcm.528 Copyright # 2001 John Wiley & Sons, Ltd. RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY Rapid Commun. Mass Spectrom. 2001; 15: 2420±2425

Serum protein profiles of patients with pancreatic cancer and chronic pancreatitis: searching for a diagnostic protein pattern

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Serum protein profiles of patients with pancreatic cancer and chronic pancreatitis: searching for a diagnostic protein pattern

����� ����� ������ �� ����� ��� �������� ������� ����� �������� � ������ ��� � ���� ������� ������

A. Valerio1*, D. Basso2, S. Mazza2, G. Baldo3, A. Tiengo1, S. Pedrazzoli3, R. Seraglia4

and M. Plebani21Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Padova, Italy2Department of Laboratory Medicine, University of Padova, Italy3Department of Medical and Surgical Sciences, University of Padova, Italy4CNR, CSSRCC, Padova, Italy

�������� �� �� � �� ������� �� ������� � �� �������� �� ������� � �

� �� ����� �� ��� ���� ����� ��� �������� ������ � ���� ����� �������� �� �� ����

������� ������ ���� ������� �� ���� !� ��� �� �� �� �����"����� #$%&'�( �� ���!

��������) *�� $%&'� �� ������ ��+����� ��� ��� ��� �� �+���� ��� ��������� ����� ������ �

���� ���� ��� ���� �������� ��� ��� ��� ���� ���� ����������� ����� ) , ��� �����

��� ��� ������ ���� �� ��+�� ��� ������ ���� �� ���� �� �� ��� ��� ���� ��� ���

� �� � ) *��������� $%&'� ���� �� ��� ��� ��������� ����� ������ #������ '�( �� ��� ����

����� ��� �������� � �� � ������ � �� ����� ��� ��� ��� �� ��� � �� �!������� ���

�� �� � ��� ��� ��������� �� �� ����� ������ ) -������� � .��� /�� 0��� 1 �� � &��)

�� �� ���� ����� ���� �� ������� ���� ������� ������� �� �

������ ������ ���������� ���� ���� ���� �� ���� ���

������� ������������ ��������!�"# $������ ���� �������

��� ���������� ���� ������� ��������% ���� ��� �� &���'

��������( �������� ��� �������� �� ������� ����( �� ���� ���

�� �������� ������� �� ��� �������������� �� ������� ��)����

����� ���� ���������� �� � �� �������� ��������!� �� ����

*������ �� ���� �� ��� �� ��� �������������� �� �����������

���� ��� ��� ��� ����� �� ���������� ������ +,-. ��� ���

��� ������������ ��� ����� �� ���� ���� ����� ���� �������

������������ +-,.!/

$���� ��� �������� ��� �� ���� ���� �������� �� ������ ���

���� ��� ������� ���������� �� ����� ����� ��� � �� �������0

����! �� ������� ������1(2 �� ������������( �� �� �����

�3���������( ��� �������� �� � ����������� ��� �� �������

�� ��� ����� ����� ����������� ���� � ���������� ������

���� ����( ���� �� ���� �� �������� ����� ���������� ��

�������� ��� ������� ��� �����������! 4� ���������5�� ����

���������� ������ ����� ��� ������� ��������� ��������(

�������� ������ ���� ��� �������� ����������!

$�� 6�78� ���� ������������� �������� �� ���� ��

�������� ��� ����������5� ��� ������� �������� ������� ��

���� ������� ��������( �� ������������ �� -����� �� �9

��� :������ �� �� $�� ��� �� ��� ������� ���� ��� ���������

�� �����5� �� 6�78� ���� ������������ ��� ���� �������

�������� �� �������� ���� ���������� ������ ��� �������

������������( �� ���������� ���� ����� �������� ���� �������

��)����( �� ����� �� ������ ��� � ������ ���� ������ ���

����������5����� �� ����� ��� ������� ���� ���������� ��� ��

������ ��� �������� �������� �� �� ������� ������� �������!

$%*23�%&� %4' $2*5,'�

������� :����� ���� ������� ���� �������� ���� � ����� �� #�

��)����! $������� �������� +1 �����( 2 �������( � � ��� �

//"2� �����. ��� ���������� ������( ������� ������ ���������

�� �� ���� ���������! ;��� �������� +9 �����( � ������( � �

��� � ��"1� �����. ��� � ��� ����� �� ������� ������������

���� �� ��� ����� �� �������� ������ ���� �� ����� ��� �� ���

�������� ����������% ����� ������� <0��� ��� ����������

��������������( ���������� �������� �����( ������� �3���

���� �����( ��� ���������� ����� ���� ������ �� �������0

�� �����! $�� ������� ��� ��������� �� � ������� ��������

+/ �����( / �������( � � ��� � # "// �����.!

$����� 6�78� ���� ������������ ����������� ���� ���������

��� � �=:7=< ����0��0��� �� ��������� +>����0:���5��

��������( >�����( ?������. �*����� ���� � @-�A$ ���

�����( �������� �� �������� ������ ����! ���� ������ ��

� ����� AB ����� ���� +����� �� �����( � ##2 ��. ����

����������� �� �/ �B! ,���� ��� �3�������� +,�=. ��� ��0

������( �� ������� � ����� � �� ���� �#!�/ �B �� ��� ������

��� ��� �/ ��! @�������� ���� +@� �� -��������( @� 7���(

6�( A@�. +�������� ������� �� ������������C����� / %/

�C� ��������� !�D �������������� ����. ��� ��� �� �����3!

>����� �������� �� 6�78�06@ ��� ���� ������� ����

������ �%# ���� ������ ������� ������ ��� ����� +# ���

� 8�. �� �������������� ���� ������� �� ������ �������

+�������( 6�������� -����������( >������( 6�( A@�.! $��

*������ ������� ��% �! B������( 8����������� �� 6������� -������� @�����������( B�� ?��������� �( #/��9 ,�����( �����!=0����% ����!�������E����!��

8��%� !� �C���!/�9 -����� �� � � � ��� 4���� F @���( 7��!

��,�8 -�66A;�-�$��;@ �; 6�@@ @,=-$��6=$�G

�� �� ������ ���� � ������ � �� �6% ��� "���/

Page 2: Serum protein profiles of patients with pancreatic cancer and chronic pancreatitis: searching for a diagnostic protein pattern

Figure 1. MALDI spectrum of sera from (a) healthy subject (sample 2), (b) a chronic pancreatitis patient (sample 15), and (c) apancreatic carcinoma patient (sample 30) of �10000 Da protein fractions.

-����� �� � � � ��� 4���� F @���( 7��! �� �� ������ ���� � ������ � �� �6% ��� "���/

@��� ������� ���H��� ��� ���������� ������ ��� ������� ������������ ����

Page 3: Serum protein profiles of patients with pancreatic cancer and chronic pancreatitis: searching for a diagnostic protein pattern

Tab

le1.

Pro

tein

profi

leof

sera

from

heal

thy

(1–1

0),c

hron

icpa

ncre

atiti

s(1

1–19

)an

dpa

ncre

atic

carc

inom

a(2

0–32

)su

bjec

ts(s

eete

xtfo

rde

tails

)

-�������

-������������������

,���������������

��

#�

/1

29

I�

����

�#��

�/�1

�2�9

�I�

����

�#��

�/�1

�2�9

�I#

#�#�

� 2/

���

33

33

33

3333

3333

�� I

���

33

33��#9

���

33

333

333

33

333

333

33333

3333

333

333

33333

333

3333

333

��/9

���

333

33

333

��21

���

333

333

333

�#�

���

333

3333

3333

333

3�#�/

���

33

33

333

333

333

33

�#�2

���

333

333

���9

���

33

333

3�/��

���

333

333

33

�1��

���

333

33

3�19/

���

33

33

3�22�

���

33

33

333

3333

3333

333

333

3333

333

33

3� ��

���

333

33

333

33

33

333

333

33

33

333

3333

333

33333

3333

333

33� �9

���

333

33

33

333

333

3333

��#/

���

333

33

333

33

3333

33

333

333

3��I2

���

33

33

3�# 2

���

333

33

3�#I/

���

33

333

33

3333

333

333

33333

3333

3333

3333

3333

333

333

333

3333

333

3����

���

33

33

33

3333

333

333

33

33�/�1

���

33

3333

333

333

33�//#

���

333

33

33

33

333

3333

333

333

33

3333

333

3333

333

33�/9/

���

3333

3333

3333

3333

�1 �

���

33

3333

33

33

333

3333

�1�2

���

33

�2�1

���

33

33

33

33

33

33

333

333

333

33�211

���

33

3333

333

333

33

�I#�

���

333

33

33

333

�I9�

���

33

33

33

33

# �#

���

333

33

# #�

���

333

# 9�

���

3#���

���

33

33

33

33

333

33

33

333

333

33#�/I

���

33

33

333

33#�2/

���

33

33

33

3333

333

333

#�I

���

33

33

33

333

333

3333

33

3##9�

���

33

33

33

#/I�

���

33

33

333

33

33

333

33

333

33#192

���

3333

#2I#

���

33

33

#9�/

���

33

33

33

33

33

33

33

3333

333

333

#I2#

���

33

33

33

333

333

� 19

���

33

333

33

33

33

333

333

3���

���

33

33

333

33

33

33

333

333

333

33

33��9#

���

33

33

333

333

333

��II

���

333

33

33

333

33

333

33/ #

���

33

33

33

333

333

333

33

33

3333

333

333

333

333

-����� �� � � � ��� 4���� F @���( 7��! �� �� ������ ���� � ������ � �� �6% ��� "���/

���� �! B������ �� �

Page 4: Serum protein profiles of patients with pancreatic cancer and chronic pancreatitis: searching for a diagnostic protein pattern

������� ���� ���� �����5�� ��� � � ��� � 6�������� ������

+���� ��5� !�/ ��. +8�����( �������.! @����� ������� +/ �7.��� ��3�� ���� / �7 �� �����3 ������� ��� � �7 �� ���

������� ��3���( ��������� �� ��� ��������� ����� ������

������( ��� ������� �� ��� ������ ����������� ���� ��� ����

������������! =3������ ���� ����������� ��� ���� ��� ���

J6�KL� ��� J6� �KL�� ���� �� ������ ������ �� ��� /2#�

��� �912( ������������! $���� ����������� 6�78� ����

����������� ���� ���� ��� ���� ������ �� ����� �� ������

��� �3���������� ���������( ����� ��� ������ �� ��� ��� �

!�" !/D!I"��

���� ���� ���� $�� ����������� �������� �� ���� ��� ���� ��� ��� ��0�*���� ���� ��������� �� G����!�� $�� G���� ���������� ��

�������� ��� ���� � �� � ������ ���� ����� �� ����5�� ��

���� ���� ������ �������� ������������ �� ��� ���� ��

������� �� ���� ������ ����! � ����������� ���� ���� /D ���

���������� �� ��������!

32�7&*� %4' '��-7���,4

� 6�78� ���� ������� �� ���� ���� �� ������� ��)���

+�°�.( ��� ��� ������� �������� ���� �������� ��� �� �����

���� � 8�( �� �������� �� :� ! �+�.! :� ��� �+�. ��� �+�.

���� ��� 6�78� ���� ������� �� ���� ���� � �������

������������ +-,. ������� +�°�/. ��� ���� � ������� ����

���������� ������ +,-. +�° # .! 6��� ����� +��� �22�( � ��(

�#I/( / #. ���� ������� �� ��� ������� �� ��� ���� �� ��� ���

��)����! $�� 6�78� ���� ������� �� ������� ��)����

������ ������� ����� +��� �����. �� � ����� ���� ��� � +���

�� I"�19/.( ��� �������� �� ������ -, �� ,- �������! �� ���

����� ����( ���� ����� +��� �#� ( ��#/( ����( �/9/( #/I�(

#I2#( ��II. ���� ������� ���� �� ��������' �� ��� �� �������

�������! $�� 6�78� ���� ������� ���� ���������� ������

��� ������� ������������ �������� ���� ������ �� ����� �������

���� ����� ���� ������� ��)����! $���� � ������� ��� ��������

��������� �� ��� ����� ������� �������� �� ��� ������� ����

��� �� ��)����! $���� �������� ��������� ���� ������� ����

����� ������� 3 M �"# D( 33 M #�"1 D( ��� 333 M 1�"� D! ��

����� �� $���� �( ���� �������� ���� ������� ���� �� �

�������� �� ��� ��� �������( ����� ������ ��� ������� ������

�� �������� ���� �� �� ��� ��� �������� ����! @��� �����

������� ��� �������� �� ���� � ��� ������� ��� ��� ����

����������� �� � ��������! $�� ����� �� ��� �� I( ��/9(

��21( ���9( �/��( �1��( ��� �19/ ���� ��� �3������� �� ���

��������( ���� �� ���������� ���������� ���� ��� ��������'

���� +$���� � ������� �� �*���� �����.! �� ��������( ��� ������� ��� �#� ( ��#/( ����( �/9/( #/I�( #I2#( ��� ��II ����

������� ���� �� �������� ��� ��� �� ��������!

:� �� � ������5�� ��� �������� � �� ��)���� �3�������

������� ����� �� ����� ����� ��� ��� ����� ��������� �������

��� ����� ���� ���� �� �������� ��� �� �������� +�3�������

�� �������� � �� ��)���� ������� ������ ���� ��� ����.�

������ ����� ����� ���� ���� �� ��������( ��� ��� ���� ���

������ ���� ��� ����� ���� ���� �� ��������' ����!

8������ ��� ��������� �� ������� ������ �������� ��

������� �������� ��� �� ��������( ����� �� �� �� ���

������� �� ������� ����������( ���� ���� ��� ��������

��� �� ����� +��� ��19/. ���� ���� ���� �� �������� ���

��� �� ��������( ����� �� ��� �� ��� �������� ��� �� ��� �

+� �� ��� �# �.( �������0������� �������� ���� ��������! ��

��� ������� ��������( �� ����0 �� ������������0��������

�������� ���� ���������� �� ���� ��� � �� �������� ��� ���!

K������( ��� ���������� �� ��� ����� ����� �� ��� ��� � ��

�����3!��� � # "# ������� �� ��� ��� ����� +:� ! �. ��� ���

�������� �������� �� ���� ��� ����� �� �������� �� ��� ��

,- ���� �� -, +$���� �.! $���� ����������� ���� ������

��������( �� ����� ��� ����� ����( �����������( ���

������� �� ��� �������� ��� ��� ���� ��� ��������� ��

�������! $���� ������ � ��� ������� ���� ����������

������ ��� ������� ������������ ����� ������� �����������

������ �� ��� ������� �� ��� ���� �� ������ ������� ��� 0

�����( �������� ����������� ������������ �������! $��

��)����� �� ����� ��� ����� ���� �������� ��������� �� ���

�� ���������� ������ ���� �� ������� ������������ ��������( ��

�������� �� ��� 6�78� ���� ������� �� ��� ������� ����

+$���� �.� ��������( ���� ���� ������� �� � �� ��� ���0

����� � �� �������� ���� ,- ���� ���� -, +:� ! �( ������ ���

������.!

A��3��������( ���� ��� �������� ��� �� ������� ��� 0

�����( ����� ���� �� ��������( ���� ���*����� ��� ����0

����� �������� �� ������ ��)����! 4� ���� ���� ���������5�

���� ��� ����� ��� ����� ��������� ������� �� ��������

�������! $�� ��������� �������� ���� ������� ��������

��� ������ ��)���� �� �� �� ��� ����� �� � �������0����0

������ �� �������� �������( �� �� � ��������� �������� ��

����������������� ��������!�#(��

�� ���������( 6�78� �������� �� ��� ��� ��������

��� �� �������� +�� 8�. �� ���� ���� �������� ����

���������� �������� +���������� ������ ��� ������� �������0

�����. ������� � �� ��������% +�. ��� �������� �� ���� &�������0

������� ��� �����'� ��� +�. ��� �������� �� ���� �����

&������0��)���0������� ��� �����'! A�����������( �� 6�70

8�06@ ��������( ��� �3��� ����������� ����� ��� ��������

���� ����� �� ����� ��� ����� ���� ��� ����������! �� �����

�� ���� � � �������� �������� ��� ������ ����� �� ����� ���0

�����( �� ���� ������ ������� ������ �� ����� �������(

���������( �� ������ ��� ��������� ����!

Table 2. Yates corrected �2 for the presence of any associationbetween disease state and reported peptide fragments.Pancreatic cancer and chronic pancreatitis patients wereconsidered as a single group and compared with controls

:�� ���� ��� G���� ��������� �� � ��

�� I �!#I � ! #1�

��/9 �#! 2 � ! #

��21 I!I� � ! �1

�#� #!9� � ! �I9

�#�1 �!�# � ;!@!

���9 2! / � ! 2I

�/�� I!I� � ! �1

�1�� 2! / � ! 2I

�19/ I!I� � ! �1

��#/ � !�� � ! ��

���� � !�� � ! ��

�/9/ #!� � ! 29�

#/I� �#!/# � ! �

#I2# �!12 � ! # 9

��II 2!1/ � ! /2

-����� �� � � � ��� 4���� F @���( 7��! �� �� ������ ���� � ������ � �� �6% ��� "���/

@��� ������� ���H��� ��� ���������� ������ ��� ������� ������������ ���#

Page 5: Serum protein profiles of patients with pancreatic cancer and chronic pancreatitis: searching for a diagnostic protein pattern

Figure 2. Histograms showing: (top panel) peptide species common both to healthy and diseasedsubjects; (second panel) peptide species found only in controls; (bottom two panels) peptidespecies found only in diseased patients. For each group of subjects the results are expressed aspercentage of patients with a positive finding for the observed fragment.

-����� �� � � � ��� 4���� F @���( 7��! �� �� ������ ���� � ������ � �� �6% ��� "���/

���� �! B������ �� �

Page 6: Serum protein profiles of patients with pancreatic cancer and chronic pancreatitis: searching for a diagnostic protein pattern

3282324-2�

�! 7���� @:! ���� ���� �II#� �.9% ��#/!�! :����� N-K( >�����68( :������� @( 6�6����� 8-( ���� �(,������ $! ���� � ���� �III� .�% /9�!

#! �'�������� 6?( :������� @( 6��� �� ( :����� N-K( �����! ��� � ���� �III� �6% 9�#!

�! :������ 7( @��� ��� �( ����� -�( >����55� �( 7��� 6( ���� �� ?($����� ,! �� �� ������ ���� � ������ � � �:% ���I!

/! ,������ 6( >���� 8( ,���55� 6,( :� �� ,( 8�� :����� ?(;�������� �! ��� � ��� ������� �II/� ��% �9I!

1! >���� 8( B������ �( >�� ��� 7( ,���55� 6,( 6���� 6( 7���$( A)�� :( O�������� 6( ��� ��� �( ,������ 6! ������� �II2��6% �#�!

2! B������ �( >���� 8( >�� ��� 7( -������� ?( >���� ?( $��� � �(,������ 6! ������� ��� �!� ��� ������ �III� .6;% 1��!

9! -����� N�( K��� @-( @���� 86( 4��� 4( ������� 7=($��� K6( =������ 7>( >���� ��� �7! ��� "�� ���� ���#�� �II/� �.% / /�!

I! N���� 6( >��� A( ?������� A!���� � ������ ��� �II�� ��%##/!

� ! K��������� :( N���� 6( >����� �-( -���� >$! ��� �����II�� <�% ��I#�!

��! >����� �-( -���� >$! ��� "�� ���� ��� #�� �II � 9;% 192#!��! ������ >! �� $���������� �% �������������( ,4@ ,��������%

7�����( �I91� # �"#�/!�#! :����� -( >���� 8( ;�������� �! � ��� &����������� �II�� �:%

�9�!��! ?�� G7( < ?6( K�� 48( -��� 7>! � ���� ���� � �

;�% I/!

-����� �� � � � ��� 4���� F @���( 7��! �� �� ������ ���� � ������ � �� �6% ��� "���/

@��� ������� ���H��� ��� ���������� ������ ��� ������� ������������ ���/