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SERODIAGNÓSTICO DE RICKETTSIOSIS POR PRUEBA ELISA E

INMUNOFLUORESCENCIA IFI IGM

MINISTERIO DE SALUDINSTITUTO NACIONAL DE SALUDCENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA

2007

BLGO. ELIZABETH ANAYA RAMÍREZDRA. CECILIA MORÓN CORTIJO

BLGO. PATRICIA ARIAS PAREDEST.M. JOHANN CHAUCA TORRES

TÉC. LAB. RAÚL ROMÁN CUÉLLAR

SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº65

SERODIAGNÓSTICO DE RICKETTSIOSIS POR PRUEBA ELISA E INMUNOFLUORESCENCIA IFI IGM

I. IDENTIFICACION

Código del proyecto OGITT: 2-01-05-03-073

Centro de Referencia: Centro Nacional de Salud Pública

Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas

Título del Proyecto: “Serodiagnóstico de Rickettsiosis por prueba ELISA e Inmunofluorescencia IFI IgM”

Autores:

Blgo. Elizabeth Anaya Ramírez

Dra. Cecilia Morón Cortijo

Blgo. Patricia Arias Paredes

T.M. Johann Chauca Torres

Téc. Lab. Raúl Román Cuéllar

Lugar de ejecución:

Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas del Instituto Nacional de Salud

Año de ejecución: 2005 - 2006


II. RESUMEN

Objetivo: Implementar y validar una prueba ELISA e IFI IgM para rickettsiosis, demostrar la detección

temprana de anticuerpos IgM en pacientes agudos y contribuir con el diagnóstico diferencial de etiologías con

cuadro febril indiferenciado. Material y Método: Para éste estudio se aplicó una modificación del método IFI

utilizado en el Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas del Instituto Nacional de Salud, descrito en el Manual

de Referencia del Laboratorio de Enfermedades Infecciosas UTMB (1) y una modificación del método ELISA

descrito en McDade et al, 1988 (2). Se tomaron 55 sueros negativos y 100 sueros positivos de pacientes

procedentes de la seroteca 2005-2006 del Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas del INS. Finalmente se

seleccionaron 15 sueros de pacientes con diagnóstico serológico confirmado para otras enfermedades

bacterianas como brucelosis, leptospirosis y sífilis. Se utilizó como antígeno para la prueba ELISA un lisado

total del referencial Rickettsia akarii cepa Kaplan y para la prueba IFI fueron células Vero infectadas con R.

akarii cepa Kaplan proporcionadas gentilmente por el Dr. D.Walker del UTMB-Galveston-Texas-EUA.

Resultados: La prueba ELISA indirecta IgM mostró una Sensibilidad de 78% (78/100), una Especificidad de

80% (44/55), un VPP de 87.6% (78/89), un VPN de 66.7% (44/66) y una reacción cruzada con otras etiologías

bacterianas de 20% (3/15), mientras que la prueba de Inmunofluorescencia IFI IgM mostró una Sensibilidad

de 82% (82/100), una Especificidad de 90.9% (50/55), un VPP de 94.3% (82/87), un VPN de 73.5% (50/68) y

una reacción cruzada con otras etiologías bacterianas de 13.3% (2/15). Conclusiones: El método ELISA

indirecta IgM estandarizado en el presente trabajo no es una prueba útil para ser aplicado en el diagnóstico de

rickettsiosis debido a su limitada sensibilidad y especificidad, sin embargo; la prueba IFI IgM presenta una

mejor sensibilidad (82%) y especificidad (90.9%) lo que indica que puede ser utilizada en estudios

epidemiológicos y en la vigilancia de la Rickettsiosis en el Perú.

.


III. INTRODUCCION

La rickettsiosis es una enfermedad causada por una bacteria coco bacilar gram – negativa, intracelular

obligatoria y pertenece al grupo de las patologías bacterianas metaxénicas porque dentro del ciclo biológico

está involucrado un artrópodo (3,4). La bacteria pertenece al género Rickettsia y se caracteriza por ser

intracelular obligatoria. Estos microorganismos mueren al separarlos de la célula huésped (4,5). En la última

edición del Manual de Bergey (6), las rickettsias están clasificadas de la siguiente manera: Phylum BXII

Proteobacteria phy. nov, Orden II Rickettsiales, Familia I Rickettsiaceae, Genero I Rickettsias.

El género Rickettsia está clasificado es base a proteínas de superficie inmunodominantes rOmpA y rOmpB

(proteínas externas de membrana A y B) permite la diferenciación de dos grupos; el grupo de las fiebres

manchadas (SFG) y el grupo tifus (TG). El gen que expresa rOmpA se ha identificado en casi todas las

especies del SFG y no se ha encontrado en el TG (3,4,7). Los vectores involucrados en la transmisión de la

enfermedad son las garrapatas, ácaros, piojos corporales humanos y pulgas, estos artrópodos son

ectoparásitos de animales asociados con el hombre como animales domésticos y roedores (3,4,5).

La enfermedad está relacionada a las condiciones en que habita el ser humano, esto se refleja en ocurrencia

de epidemias explosivas de tifus epidémico cuando las condiciones socio culturales son precarias como en

época de guerra, pobreza, hacinamiento, etc (3,8,5).

Perú reporta mas del 50 % de los casos notificados de Tifus epidémico a nivel mundial procedentes de zonas

endémicas de la sierra sur y central, en los departamentos de Cuzco, Apurimac, Ayacucho, Puno y Arequipa

confirmados por exámenes de laboratorio (9,10), teniendo como causas principales: las condiciones precarias

en que viven los pobladores de nuestras provincias y las deficientes medidas del control de brotes o endemias

(11), estudios posteriores han determinando la importancia de las pulgas, piojos, garrapatas y ácaros en la

transmisión de las rickettsiosis (12). Desde 1999 se ha reportado casos de rickettsiosis en nuevas zonas de

Perú (13,14) que incluyen zonas de altura, áreas tropicales y semitropicales. Anticuerpos de clase IgM

pueden ser detectados a partir de la primera semana de fase aguda de la enfermedad por lo cual es


necesario contar con métodos apropiados de diagnóstico como IFI y ELISA IgM, procedimientos altamente

sensibles y específicos (15,16).

Rickettsiosis es una enfermedad metaxénica emergente y reemergente en diferentes zonas de Perú, con

cuadro febril indiferenciado por lo que es importante que sea considerado como un diagnóstico diferencial de

etiologías como, dengue, leptospirosis, bartonelosis, influenza entre otras, donde es necesario considerar el

incremento de febriles negativos a etiologías endémicas de la zona, así como la presencia de vectores

potencialmente infectivos para la transmisión de rickettsiosis (piojos, pulgas, garrapatas y ácaros). La

detección de anticuerpos IgM por ELISA e IFI aún no ha sido implementada en el país para la captación de

casos agudos de rickettsiosis, debido a que los anticuerpos IgG presentes en la muestra sérica actúan

competitivamente con los anticuerpos IgM dando como resultado falsos positivos, por lo que se hace

necesario aplicar sistemas de pre tratamiento óptimos a los sueros a fin de evitar falsos positivos (21).

Las enfermedades asociadas a Rickettsias como por ejemplo Grupo Tifus y Grupo de Fiebres Manchadas,

constituyen causas importantes de morbi-mortalidad alrededor del mundo. En México, en un brote de una

enfermedad febril aguda no determinada al inicio, que parecía compatible con dengue, se realizo una

investigación que demostró la existencia de una infección por Rickettsias del Grupo Fiebre Manchada (17,18).

La presentación clinica de Rickettsiosis del Grupo Tifus y sobre todo Fiebre Manchada es poco especifica lo

que puede llevar a confusion en el diagnostico diferencial con otras infecciones que existen en áreas

endémicas del país como dengue, leptospirosis, influenza, fiebre tifoidea, etc. Los síntomas y signos del tifus

y en general de las demás rickettsiosis son variados y dependen del órgano afectado asi como de la

liberación de citoquinas en el torrente sanguineo. Fiebre, tos, cefalea, escalofríos, mialgias, artralgias,

anorexia, vómitos y dolor abdominal ocurren en diferentes proporciones en los pacientes afectados por tifus.

Otros síntomas y signos incluyen la presencia de brotes cutáneos maculopapulares, purpúricos y petequiales;

síntomas asociados con el SNC tales como convulsiones, ataxia, fotofobia; hepato/esplenomegalia e ictericia

también se pueden presentar. Todos estos síntomas son inespecíficos, y por tanto el diagnóstico preciso

descansa en criterios claves clínicos y epidemiológicos, los cuales son confirmados por el laboratorio (19).


El diagnóstico de laboratorio del tifus se ha basado históricamente en la serologia, inicialmente con la

aglutinación con Proteus vulgaris cepa OX-19 cuya sensibilidad y especificidad es muy baja. Pruebas

serológicas más específicas incluyen la inmunofluorescencia indirecta (IFI), e inmunoperoxidasa,

consideradas como “ gold standard” para el diagnóstico serológico de tifus y rickettsias en general.

Un título de 1:64 es considerado el valor mínimo para diagnóstico presuntivo de infección por rickettsia.

Criterios para un diagnóstico de infección reciente por rickettsia son: (a) un aumento del título serológico al

cuádruple del valor obtenido con la primera muestra; (b) un título mayor o igual de 1:256 en la etapa aguda.

El número real de casos de tifus no se conoce debido en parte a la dificultad en el diagnóstico clínico, puede

ser confundida con otras enfermedades como influenza, dengue, fiebre tifoidea, malaria, leptospirosis,

arbovirus, enterovirus, arenavirus, entre otros. Aún en áreas en donde infecciones por tifus son bien

conocidas por la comunidad médica, el diagnóstico clínico correcto inicial de tifus se hace solo en 5 a 10% de

casos (20).

La prueba de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) es la prueba “gold estándar” de las pruebas serológicas,

permite detectar anticuerpos IgG, IgM o ambas. Las infecciones por Rickettsias del SFG y TG no son

diferenciadas por esta prueba; existe reacción cruzada entre ambos grupos. La prueba demostró tener una

especificidad del 100% y una sensibilidad del 84.6% (22).

Otra técnica descrita para el diagnóstico de rickettsiosis, es una ELISA de tipo indirecta (23,24,25,26), donde

la mayor complejidad radica en la producción del antígeno (8), debidoa que los métodos descritos, exigen

separación total de Rickettsias de la célula huésped por métodos de separación con gradiente de densidad

con Renografina (27,28,29). La Renografina es un compuesto formado por diatrozoato de meglumina,

diatrozoato de sodio utilizado para dar un contraste idóneo en radiografías a las vías urinarias y exploraciones

angiografías (30), también ha sido utilizado para el aislamiento de clamidias y mitocondrias (28). Este método

logra separar 3.3mg por huevo embrionado, 0.27mg por frasco de cultivo celular de Rickettsia typhi y

Rickettsia prowazekii del huésped eucarionte, y resulta sumamente costoso (29).


Las técnicas de separación con gradiente de sucrosa también han sido probadas, la eficiencia del método es

nula debido a que en el proceso se pierde la capacidad antigénica de la bacteria (27,29). Por otro lado,

técnicas menos sofisticadas de separación no han sido probadas.

Este mismo problema esta presente en la purificación de varios tipos de virus, es por eso que se han

publicado técnicas basadas en centrifugaciones progresivas a diferentes gravedades, las cuales logran

separar parcialmente el virus del huésped eucarionte para luego usar este extracto purificado utilizado en

inmunoensayos como la prueba ELISA (31).

Los ELISA que usan antígeno purificado presentan una alta sensibilidad a diluciones de suero de hasta

1/10000, además de ser mas sensible que técnicas como Micro aglutinación (MA) y Fijación de Complemento

(CF) por solo necesitar una concentración de 0.5 ug/mL de antígeno (24), también se reporta que aunque

ELISA es más sensible, la prueba IFI es más específica (23, 25, 32).

Si bien existe una prueba ELISA para diagnostico de Rickettsiosis, aún no se ha probado con antígeno total

lo cual reduciría enormemente el costo de la prueba.

Las técnicas en nuestro país para el diagnostico de esta enfermedad son poco desarrolladas y no se ha

realizado la estandarización de una prueba ELISA indirecta ni IFI IgM con antígeno crudo total.

Es importante resaltar que el presente trabajo tiene importancia en la epidemiología de la enfermedad,

además de reforzar la vigilancia en zonas endémicas del país.


IV. MATERIAL Y METODOS:

Material biológico: La cepa de Rickettsias utilizada en el estudio es de una Cepa Referencial de Rickettsia

akarii del Laboratorio Referencial de la UTMB (University Texas Medical Branch)

Sueros: Se seleccionó 100 sueros positivos de pacientes con rickettsiosis de diferentes áreas geográficas

del Perú y remitidos al Instituto Nacional de Salud, procedentes de la seroteca del Laboratorio de Metaxénicas

Bacterianas (INS). Todos fueron diagnosticados positivos para anticuerpos IgTotal (IgM+IgG+IgA) contra al

antígeno rickettsial con la prueba de Inmunofluorescencia indirecta (IFI). Los sueros negativos (n=55) fueron

seleccionados de pacientes que fueron negativos para IFI tanto para anticuerpos IgTotales como para IgG

contra antígeno rickettsial.

Conjugado: Conjugado Anti-human IgM (u cadena específica) elaborado en cabra ligado a peroxidasa

(SIGMA) para la prueba ELISA y conjugado Anti-human IgM (u cadena específica) elaborado en cabra ligado

a isotiocianato de fluoresceína-FITC (CALBIOCHEM) para la prueba IFI.

Producción de antígeno rickettsial: Se utilizó cultivos celulares VERO incubados a 37°C (incubadora,

MEMMERT) en frascos para cultivo celular de 75 cm2 (FALCON) con una monocapa formada en un 80% (ver

Fig. Nº1) enriquecida con medio EMEM (Medio Mínimo Esencial con sales de Earles, GIBCO) y 10% de suero

bovino fetal (SBF). Se retiró el medio y se añade una suspensión de antígeno Rickettsia akarii reconstituida

en un 1ml de agua destilada estéril y diluida 1:15 en buffer sucrosa – fosfato – glutamato estéril o, cultivos

positivos criopreservado. Incubar a 34°C por 1 hora, agitando suavemente cada 15 min., agregar medio

EMEM con 5% SBF sin antibiótico e incubar a 34°C por 7-10 días (3). Monitorear el cultivo con ayuda de

un microscopio de luz invertida (CARL ZEISS) hasta observar efecto citopático (ECP) en 90-100% (ver Fig.

N°2), desprender las células infectadas con tripsina (GIBCO), y centrifugar por 10minutos a 5000 rpm,

recuperar el pellet, resuspender en PBS y centrifugar. Repetir el proceso 2 veces mas (5). Finalmente el pellet

se diluye en PBS 1X y se hace un conteo de células en microscopio de luz invertida (400x) con Cámara de

Neubauer (ver Fig. N° 3).


El antígeno rickettsial crudo fue procesado según Cruz y col. (31), sin embargo, la ruptura celular fue

realizada por sonicación con seis toques de 10 segundos cada uno con intervalos de 10 segundos a 4 ºC.,

centrifugar a 2000 rpm, separar el sobrenadante para inmufluorescencia y determinación de concentración

proteica por método de Lowry (33).

Fig.N°1: Cultivo normal de células VERO. A 400x. Fig.N°2: Cultivo infectado de células Vero con Rickettsia akarii. A 400x.

Figura N°3. Cámara de Neubauer usada para conteo celular.

Titulación de antígeno: Se prepararon diferentes diluciones de antígeno con PBS pH 7.2 y se utilizaron

microplacas para ELISA Polysorp (NUNC NALGENE) de 8 x 12 pocillos de fondo plano, donde se dispenso

100μL de las diluciones del antígeno. Se incubaron 24 horas a 4°C (23,24). Luego de la incubación se

elimino el excedente de las diluciones y se guarda a -20°C.

Titulación del suero: Se diluyó los sueros controles con PBS Tween-20 al 3% de leche descremada. Las

diluciones se dispensaron 100 μL a cada pocillo. Se incubaron por 30min. a 37°C y se lava por 6 veces (24).

Titulación de conjugado: Se prepararon las diluciones con buffer PBS Tween-20 al 3% de leche

descremada (24), se incubaron por 30min.a 37°C y se lavaron seis veces, se agregó el sustrato o –


fenilendiamina (OPD) con peroxido de hidrógeno diluido en buffer citrato y se incubaron 15min.a temperatura

ambiente (24). Se agregó solución de parada ácido sulfúrico 1M y se leyó a 490nm en un lector para ELISA

ThermoLabsystem.

Prueba de Inmufluorescencia Indirecta IgM: Descongelar las láminas 30 min. antes de realizar la prueba.

Diluir el suero del paciente en buffer PBS 1:4, tomar un volumen de ésta dilución y diluir 1:4 con el reactivo

Diluyente IgM PreTreatment (FOCUS), incubar a temperatura ambiente por 15min, centrifugar y diluir 1:4 con

PBS + skim milk 3% y agregar 10ul del suero diluido a cada círculo de la lámina e incubar en cámara húmeda

a 37 °C por 30min. Retirar las laminas de la cámara húmeda y lavar 3 veces con PBS pH 7.2 por 10 minutos

cada vez, dejar secar a temperatura ambiente o por 5 min. a 37°C, una vez seco agregar 10μL del conjugado

(diluido 1:10) por cada circulo de la lamina incubar por 30min. en cámara húmeda a 37°C.

Retirar las laminas de la cámara húmeda y lavar 3 veces con PBS pH 7.2 por minutos cada vez. Dejar secar

y realizar el montaje para observar al microscopio de inmunofluorescencia con objetivo 40x (LEICA DMLS).

Ensayo ELISA IgM: Se diluyeron los sueros en buffer diluyente (ver anexo), se dispenso 100 μL en cada

pocillo de la placa (Polysorb, NUNC nalgene) y se incubaron por 30 min. a una temperatura de 37°C, lavar

seis veces con 300 μL de buffer de lavado (ver anexo) por cada lavado en un lavador automático

(Thermolabsystem). Se agrego 100μL de conjugado diluido en buffer diluyente, se incubo por 30 min. a una

temperatura de 37°C (24). Finalmente, agregar 100μL de sustrato, incubar por 15 min. a temperatura

ambiente y agregar la solución de parada (ver anexo)(24). Se leyó a 490nm en un lector ELISA

Thermolabsystem.

ANALISIS DE DATOS: Obtenidas las lecturas, se procedió a analizar los datos para obtener los valores de

Especificidad, Sensibilidad, Valor Predictivo Positivo, Valor Predictivo Negativo de la prueba, aplicando las

siguientes fórmulas:


PRUEBA REFERENCIA (IFI IgTotal)

PRUEBA (ELISA IgM

/ IFI IgM) POSITVO NEGATIVO TOTAL

POSITIVO a b a+b

NEGATIVO c d c+d

TOTAL a+c b+d n

Tabla Nº 1. Modelo de Tabla para la comparación de la prueba referencial (IFI IgTotal) y la prueba a estandarizar ELISA IgM e IFI IgM.

Sensibilidad (Se): Es la probabilidad de que la prueba de resultado positivo cuando la enfermedad esta

presente (34,35).

cnegativosfalsosapositivos

apositivosSe

Especificad (Sp): Es la probabilidad de que la prueba de resultado negativo cuando realmente no existe la

enfermedad (34,35).

bpositivosfalsosdnegativos

dnegativosSp

)(

Valor Predictivo Positivo (VPP): Es la probabilidad de presentar la enfermedad cuando es positivo a la

prueba (34,35).

bpositivosfalsosapositivos

apositivosVPP


Valor Predictivo Negativo (VPN): Es la probabilidad de estar sin la enfermedad cuando eres negativo a la

prueba .(34,35)

dnegativosfalsoscnegativos

cnegativoVPN

)(

Valor de Corte ( VC ): Se procedió a realizar el cálculo del Valor de corte en base a las lecturas de los

controles negativos y positivos obtenidos, aplicando la siguiente fórmula: VC= XCN + 2DS


V. RESULTADOS

V.1. Producción del antígeno Rickettsial: se observó que lisar las células con sonicador es mejor que

siguiendo el protocolo original shock térmico (31). Para elegir la dilución de antígeno apropiada se obtuvo

70.37µg/mL de concentración proteica con una producción en masa de antígeno de R. akarii.

V.2. Titulación del antígeno y suero: Se probaron 3 diferentes diluciones seriadas (Tabla Nº2), de las

cuales se obtuvieron valores de densidad óptica (OD) del pool de sueros positivo y del pool de sueros

negativos. Para determinar la mejor dilución se dividió el valor del OD del pool de sueros positivos entre el

valor del OD del pool de sueros negativos, y obtener el valor (ratio) que represente la dilución optima a la cual

el valor del OD del pool positivo se separa mas del valor del OD del pool negativo, reportándose que la

dilución optima del antígeno fue 1/50 con un ratio de 3.27 con una dilución de suero de 1/50. (Tabla Nº2).

DILUCIONES DE SUERO

1/100 1/50 1/25

1/25 1.80 2.75 2.67

1/50 3.01 3.27 2.70

DILUCION

ANTIGENO

ELISA IgM 1/100 2.36 1.97 2.01

Tabla Nº 2. Titulación de antígeno a diferentes concentraciones de suero, el conjugado se trabajo a dilución 1/1000. Los resultados están expresados en ratios, OD del pool positivo entre OD del pool negativo. Esta resaltado el mayor valor de ratio.

V.3. Titulación del conjugado y suero: Los datos también son representados con ratios, además

también se probaron distintas soluciones la mismas diluciones del pool de sueros positivo y negativo (Tabla

Nº3). La dilución óptima de conjugado fue 1:1000 con un ratio de 4.93 (Tabla Nº3 )

.


DILUCIONES DE SUERO

1/100 1/50 1/25

1/1000 2.77 4.93 3.51DILUCION

CONJUGADO

ELISA IgM 1/2000 2.74 4.17 4.38

Tabla Nº 3 Titulación del conjugado a diferentes diluciones de suero. El antígeno se trabajo a una dilución de 1/50. Los resultados están expresados en ratios, OD del pool positivo entre OD del pool negativo. Esta resaltado el mayor valor de ratio

V.4. Análisis de datos: Después de encontrar la dilución óptima del antígeno, del suero, y del conjugado

se procesaron por la prueba ELISA IgM e IFI IgM los sueros controles y los casos confirmados por IFI IgTotal,

y se halló el punto de corte con lo que se calculó la sensibilidad, especificidad , VPP, VPN para cada prueba,

tal como se muestra en la Tabla N°4, 5 y 6.

PRUEBA REFERENCIAL IFI IgTotal

PRUEBA (ELISA IgM) INFECTADOS NORMALES TOTAL

POSITIVO a 78 b 11 a+b 89

NEGATIVO c 22 d 44 c+d 66

TOTAL a+c 100 b+d 55 n 155

Tabla Nº 4. Tabla para la comparación de la prueba referencial (IFI IgTotal) y la prueba a estandarizar ELISA IgM en rickettsiosis. k=0.83


PRUEBA REFERENCIAL IFI IgTotal

PRUEBA (IFI IgM) INFECTADOS NORMALES TOTAL

POSITIVO a 82 b 05 a+b 87

NEGATIVO c 18 d 50 c+d 68

TOTAL a+c 100 b+d 55 n 155

Tabla Nº 5. Tabla para la comparación de la prueba referencial (IFI IgTotal) y la prueba a estandarizar IFI IgM en rickettsiosis. k=0.88

RESULTADO FINALABREV. VALOR (%)

ELISA IgM

VALOR (%)

IFI IgM

VALOR DE CORTE VC 0.51 1/ 64

SENSIBILIDAD Se 78 82

ESPECIFICIDAD Sp 80 90.9

VALOR PREDICTIVO POSITIVO VPP 87.6 94.3

VALOR PREDICTIVO NEGATIVO VPN 66.7 73.5

Tabla N°6: Resultado de las evaluaciones realizadas para las pruebas ELISA IgM e IFI IgM para rickettsiosis hallados en el presente trabajo.

Se observa en la Tabla N°6 que la prueba IFI IgM para detectar anticuerpos y estandarizada en el presente

trabajo presentó una mejor especificidad y sensibilidad, en comparación con la prueba ELISA IgM..

En la Tabla N°4 y 5 se muestran los resultados de ELISA e IFI IgM y se compara ambas pruebas con índices

de concordancia como el índice Kappa que con una valor de 0.83 y 0.88 nos indica que hay una mejor

concordancia para la prueba IFI IgM.


VI. DISCUSION

El antígeno producido en el presente trabajo (31) es un extracto crudo, lo que indica que puede presentar

reacción no especifica en la prueba (34). Muchos protocolos de purificación de antígeno utilizan Renografina

para hacer una gradiente de separación y obtienen hasta una cantidad de 3.3 mg de Rickettsias purificadas

por frasco de cultivo celular (27, 28, 29), nuestros resultados muestran que a partir de 05 frascos de cultivo

celular (24mL aproximadamente con una concentración 1.5 x 107 células/mL) es posible obtener una

concentración de antígeno rickettsial de 70.37 µg. La cantidad de antígeno purificado con Renografina es

mucho mayor que la obtenida en el presente trabajo, sin embargo; la diferencia en los costos es muy

significativa. Es importante señalar que debe utilizarse un mismo lote de preparación de antígeno para

estandarizar y validar la prueba (34).

La estandarización de la prueba ELISA (24) fue adaptada a las condiciones de laboratorio relacionadas al tipo

de placa, buffer de sensibilización, agente bloqueador, y conjugado. La placa de elección fue NUNC polysorb,

por ser una placa de baja adherencia que solo se enlaza con partículas hidrofóbicas, al trabajar con un

antígeno parcialmente purificado esta selección en el enlace es un ventaja porque hay menos probabilidad

que se adhiera proteínas que den reacción no especifica (36). En relación al buffer de sensibilización se

selecciona al que más se aproxime al punto isoeléctrico de la proteína que se va adherir al plástico (34). En

nuestro trabajo, el antígeno utilizado tiene una mixtura de proteínas y por lo tanto no se puede calcular el

punto isoeléctrico, por ello se requiere un buffer neutral como PBS a un pH 7.2 (34).

Se han probado antígenos mas específicos como con LPS (lipopolisacaridos de membrana) con costos

elevados y donde se reportan 100% de sensibilidad y 87.5% de especificidad (25), sin embargo; en el

presente estudio se muestra una aceptable sensibilidad y especificidad con una producción de antígeno a

menor costo.

La sensibilidad y la especificidad fueron calculadas por el método de análisis de casos, el mas conocido es el

punto de corte que se halla calculando el promedio de los seis negativos mas tres desviaciones estándar (34)

y necesita 30 casos como mínimo para su evaluación (35) pudiendo resultar una limitante para otros estudios.


La prueba IFI IgM presenta los mejores resultados en la evaluación tanto en sensibilidad (82%), especificidad

(90.9%) y concordancia en relación a la prueba “gold estandar” IFI IgTotal utilizada en el INS (k=0.88) y

teniendo en cuenta la menor complejidad que requiere para su implementación (20,21,22) por lo que sería de

gran utilidad en estudios epidemiológicos de zonas endémicas para rickettsiosis y mejorando aún más su

especificidad podría ser de aplicación en el diagnóstico.


VII. CONCLUSIONES

La lisis del antígeno rickettsial con ultrasonido (sonicador) ofrece mejores resultados que la

producida con shock térmico.

La concentración de antígeno para revestir el pocillo de la microplaca de ELISA IgM es de

1.4μg/mL (1/50), mientras que en la IFI IgM se requiere 103 células/ml sin aplicación de lisis

celular.

La dilución del conjugado anti-human IgM (u cadena especifica) sintetizado en cabra y ligado

con peroxidasa fue 1/1000, mientras que la dilución del conjugado anti-human IgM ligado a FITC

fue de 1/100.

La sensibilidad y especificidad detectada para la prueba IFI IgM fue mayor que la encontrada en

la prueba ELISA IgM,


VIII. BIBLIOGRAFIA

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SOLUCIONES Y BUFFER

Buffer salino fosfato (PBS al 1M)

Cloruro de sodio (NaCl) 8g

Cloruro de potasio (KCl) 0.2g

Fosfato monobásico de sodio anhídrido (Na2HPO4) 0.91g

Fosfato monobásico de potasio anhídrido (KH2PO4) 0.14g

Agua bidestilada 1 L

Regular hasta pH 7.2 con Ácido Clorhídrico 1M y con Hidróxido de sodio 1M

Buffer de lavado Buffer de dilución

Buffer PBS Buffer PBS

Tween 20 al 0.5% Skim milk al 2.5%

Tween 20 al 0.5%

Buffer citrato

Ácido cítrico (C6H8O7) 5.1g

Fosfato monobásico de potasio anhídrido (Na2HPO4) 7.47g

Agua destilada 1L

Preparación de sustrato Reactivo parada:

Buffer citrato 12.5 mL Ácido sulfúrico (H2SO4) al 1N

Pastilla de OPD (1 unidad) 5 mg Ácido sulfúrico (H2SO4) 53 ml

Peroxido de hidrogeno H2O2 5 µL Agua destilada 100 ml


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