SELEKSI TANAMAN PADI TRANSGENIK GENERASI T1 DAN T2

YANG MEMBAWA KANDIDAT GEN TOLERANSI ALUMINIUM

FAIZAL KURNIA SYAVITRI

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

ABSTRAK

FAIZAL KURNIA SYAVITRI. Seleksi Tanaman Padi Transgenik Generasi T1 dan T2 yang

Membawa Kandidat Gen Toleransi Aluminium. Di bawah bimbingan MIFTAHUDIN dan TATIK

CHIKMAWATI.

Penggunaan varietas padi toleran aluminium (Al) merupakan salah satu pemecahan

masalah yang dihadapai oleh pertanian tanaman pangan di tanah masam. Pengembangan varietas

padi toleran Al dapat dilakukan melalui rekayasa genetika. Tanaman padi transgenik generasi T1

dan T2 telah diperoleh dari hasil transformasi gen B11, suatu kandidat gen toleransi Al ke tanaman

padi T309 akan tetapi sampai saat ini belum diketahui kebenaran tanaman transgenik tersebut.

Oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk melakukan seleksi dan verifikasi tanaman padi

transgenik generasi T1 dan T2 yang membawa kandidat gen toleransi Al. Hasil seleksi tanaman

padi transgenik generasi T1 dan T2 pada media seleksi antibiotik paromomisin diperoleh beberapa

nomor tanaman padi transgenik yang lolos seleksi. Penggunaan media seleksi paromomisin dapat

menyeleksi tanaman transgenik dari tanaman non transgenik tanpa menyebabkan efek albino

seperti yang terjadi pada seleksi menggunakan antibiotik kanamisin. Hasil analisis PCR

menggunakan primer dari gen nptII menunjukkan adanya pita DNA berukuran 600 pb pada

tanaman transgenik, tetapi tidak dihasilkan pita ukuran tersebut pada non transgeniknya. Karakter

tinggi tanaman dan jumlah anakan dari tanaman non transgenik dan tanaman transgenik tidak

berbeda secara nyata.

Kata kunci: Tanah masam, Toleran aluminium, Padi transgenik.

ABSTRACT

FAIZAL KURNIA SYAVITRI. The Selection of T1 and T2 Generation of Transgenic Rice

Carrying Aluminium Tolerant Gene Candidate. Supervised by MIFTAHUDIN and TATIK

CHIKMAWATI.

The use of aluminum (Al) tolerant rice variety is one of the alternative solutions to solve

the food crop production problem in acid soils. The Al tolerant rice variety can be developed by

genetic engineering. The T1 and T2 generation of transgenic rice has been developed from the

transformation of rice using B11 gene, which was an Al tolerance gene candidate. However the

true transgenic rice carrying the B11 gene has not been confirmed yet. This research was

conducted to select and verify the T1 and T2 transgenic rice which contained the Al tolerant gene

candidate. The result showed that the selection media containing paromomycin antibiotic could

select the putatif transgenic rice without albinism effect that appeared in selection using canamycin

antibiotic. The selection obtained true transgenic lines. The PCR analysis using the primers

developed from nptII gene showed a 600 bp DNA band in the transgenic plant, but it was none in

the wild type. The plant height and number of tiller characters were not significantly different

between the wild type and the transgenic plant.

Keyword: Acid soil, Aluminium tolerant, Transgenic rice

SELEKSI TANAMAN PADI TRANSGENIK GENERASI T1 DAN T2

YANG MEMBAWA KANDIDAT GEN TOLERANSI ALUMINIUM

FAIZAL KURNIA SYAVITRI

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

Judul Skripsi : Seleksi Tanaman Padi Transgenik Generasi T1 dan T2 yang

Membawa Kandidat Gen Toleransi Aluminium

Nama : Faizal Kurnia Syavitri

NIM : G34070067

Disetujui:

Pembimbing I

Dr. Ir. Miftahudin, M.Si

NIP 19620419 198903 1 001

Pembimbing II

Dr. Ir. Tatik Chikmawati, M.Si

NIP 19640306 199002 2 001

Diketahui,

Ketua Departemen Biologi

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.

NIP 19641002 198903 1 002

Tanggal lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya, sehingga

karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul “Seleksi Tanaman Padi Transgenik

Generasi T1 dan T2 yang Membawa Kandidat Gen Toleransi Aluminium” dilakukan mulai

Februari 2011 sampai dengan Juli 2012 di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan, Departemen

Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Miftahudin, M.Si. dan Dr. Ir. Tatik

Chikmawati, M.Si. atas bimbingan dan pengarahan yang diberikan. Penulis juga mengucapkan

terima kasih kepada Dr. Ir. Sulistijorini, M.Si sebagai penguji wakil komisi pendidikan.

Selanjutnya ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan untuk Bapak, Ibu, Zakkie, serta Liba

Silvia atas segala do’a, pengertian serta kasih sayang yang tercurah untuk penulis. Terima kasih

kepada Kak Pam, Kak Andik, Ibu Dasum, Pak Pieter, Pak Aka, Mbak Winda, Mas Kifli, Mbak

Jumi, Sasti, Ari, Ikra, Eka, Adhi, Alma, Irfan, Fibo dan seluruh staf Laboratorium Fisiologi

Tumbuhan Departemen Biologi, serta teman-teman yang selama ini ikut membantu terlaksananya

penelitian ini khususnya di Biologi angkatan 44.

Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu

pengetahuan.

Bogor, September 2012

Faizal Kurnia S

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bojonegoro Jawa Timur pada tanggal 4 Mei 1989 dari pasangan Drs.

Syafi’i dan Dra. Tri Asih W. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Penulis lulus

dari SMP Negeri 1 Kalitidu pada tahun 2004, kemudian melanjutkan pendidikan di SMA Negeri 2

Bojonegoro dan lulus tahun 2007. Pada tahun yang sama, penulis diterima di Departemen Biologi

Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB).

Penulis mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum pada mata kuliah Biologi Dasar,

Fisiologi Tumbuhan Dasar dan Sistematika Tumbuhan Berpembuluh pada tahun 2010-2012. Pada

tahun 20120, penulis melakukan Praktik Lapang di Balai Penelitian Tanaman Serat dan tembakau

dengan topik Toksisitas Gula Hasil Ekstrak Tembakau Terhadap Serangga Hama Penggerek Buah

Kapas Dan Werang Kapas. Pada tahun 2010 penulis juga pernah mengikuti lomba karya tulis

ilmiah di UIN Malang serta lomba inovasi teknologi di ITS Surabaya.

Selama kuliah penulis menjadi anggota organisasi mahasiswa daerah Bojonegoro

“Paguyuban Angling Dharma” (PAD) IPB. Pengalaman kepanitiaan penulis antara lain sebagai

panitia Grand Biodiversity tahun 2010, sebagai pengisi acara pada “Pesta sains 2009”, pengisi

acara “Temu Alumni 2009”. panitia masa perkenalan departemen mahasiswa baru MPD, dan

sebagai ketua pelaksana “Biodiversity III Biologi 44 tahun 2010”.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL...........................................................................................................................viii

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................................................... viii

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................................. viii

PENDAHULUAN ............................................................................................................................ 1

Latar Belakang .............................................................................................................................. 1

Tujuan ........................................................................................................................................... 1

BAHAN DAN METODE ................................................................................................................. 2

Waktu dan Tempat ........................................................................................................................ 2

Bahan dan Alat ............................................................................................................................. 2

Metode .......................................................................................................................................... 2

Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada Media Seleksi Antibiotik. ......................................... 2

Penanaman di Rumah Kaca. ..................................................................................................... 2

Isolasi DNA. ............................................................................................................................. 2

Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR. ................................................................................ 2

Analisis Data. ........................................................................................................................... 3

HASIL ............................................................................................................................................... 3

Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada Media Seleksi Antibiotik. ............................................ 3

Pertumbuhan Tanaman Transgenik. ............................................................................................ 4

Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR. ................................................................................... 5

PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 5

SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................................................. 7

Simpulan ....................................................................................................................................... 7

Saran ............................................................................................................................................. 8

DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 8

LAMPIRAN .................................................................................................................................... 10

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Hasil perkecambahan biji dengan antibiotik higromisin, kanamisin dan paromomisin

pada dua jenis media berbeda …………………………………………………………..........

2 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan 100 mg/L

kanamisin ……………………….............................................................................................

3 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan 25 mg/L

paromomisin …………………….............................................................................................

4 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan antibiotik

kanamisin dan paromomisin.......................................................................................................

5 Karakter pertumbuhan tanaman non transgenik dan tanaman transgenik ………...……..........

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Perkecambahan pada media antibiotik kanamisin ……………………………………….........

2 Perkecambahan biji pada media seleksi antibiotik paromomisin..............................................

3 Perbedaan pertumbuhan kecambah padi pada dua jenis antibiotik ……………………….......

4 Hasil amplifikasi DNA generasi T1 dengan menggunakan primer nptII ………………….....

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Konstruk pGWB5…………………………………………………………………..…..........

2 Konstruk pBIN11………………………………………………………………….....….......

3 Komposisi media MS…………………………………………………………………..........

4

5

5

3

4

3

5

3 6

3

3

3 4

3 5

3 6

3

11 3

12 3

13 3

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Tanaman padi (Oryza sativa L.) termasuk

tanaman pangan penting di Indonesia.

Produksi padi di Indonesia masih tergolong

rendah sebesar 67,31 ton gabah kering giling

(GKG) per hektar, atau jauh di bawah rata-

rata produksi negara lain seperti negara

Australia (BPS 2011). Salah satu upaya dapat

dilakukan untuk meningkatkan produksi padi

adalah dengan memanfaatkan lahan kering

yang tersedia cukup luas di luar Pulau Jawa.

Di Indonesia terdapat sekitar 47,6 juta hektar

(32,4%) lahan kering yang umumnya

didominasi oleh tanah masam podsolik merah

kuning (Karama & Abdurrachman 1993).

Usaha pertanian di tanah masam akan

mengalami banyak kendala, diantaranya

kelarutan aluminium (Al) yang tinggi

(Kochian et al. 1995) yang dapat menghambat

pertumbuhan akar. Ismunadji & Partohardjono

(1985) juga mengatakan akar akan menjadi

pendek dan tebal, percabangan tidak normal,

dan tudung akar rusak. Hal tersebut berakibat

akar padi tidak mampu menyerap air dan

nutrisi dengan baik.

Penggunaan varietas padi toleran terhadap

cekaman Al menjadi salah satu alternatif

pemecahan masalah pertanian pada tanah

masam. Perakitan tanaman padi toleran

cekaman Al dapat ditempuh melalui

persilangan secara konvensional,

memanfaatkan keragaman somaklonal,

induksi mutasi maupun rekayasa genetik

(Purwoko et al. 2000). Dalam rangka

mengembangkan galur padi toleran Al,

Miftahudin et al. (2010) telah melakukan

transformasi kandidat gen toleransi Al pada

padi varietas T309. Saat ini telah diperoleh

generasi T1 dan T2 (Miftahudin et al. 2010).

Karakterisasi tanaman T1 dan T2 perlu

dilakukan untuk memastikan bahwa tanaman

tersebut adalah tanaman transgenik yang

membawa gen toleran Al yang diinginkan.

Diharapkan tanaman transgenik yang telah

terbentuk dapat digunakan untuk

mengembangkan galur padi toleran Al yang

adaptif terhadap tanah masam.

Dalam proses transformasi telah disisipkan

gen-gen yang memiliki ketahanan terhadap

antibiotik sebagai marka penyeleksi yaitu gen

yang umum digunakan adalah neomicin

fosfotransferase II (nptII) dan higromisin

fosfotransferase (hpt). Gen nptII digunakan

untuk ketahanan terhadap antibiotik

kanamisin dan paromomisin. Pemakaian

antibiotik kanamisin atau paromomisin

sebagai agen penyeleksi pada proses seleksi

tanaman hasil transformasi didasarkan pada

asumsi bahwa gen penyandi ketahanan

terhadap antibiotik kanamisin atau

paromomisin tersebut telah terintegrasi ke

dalam kromosom tanaman trnasgenik.

Kanamisin dan paromomisin merupakan

antibiotik aminoglikosida yang berasal dari

sumber yang berbeda. Kanamisin diproduksi

oleh Streptomyces kanamyceticus dan

paromomisisn diproduksi oleh Streptomyces

rimosus, sedangkan gen hpt merupakan gen

penyandi antibiotik higromisin. Higromisin

umumnya lebih toksik dibandingkan

kanamisin. Higromisin mempunyai

kemampuan membunuh sel-sel peka lebih

cepat dan penyeleksi yang lebih disukai untuk

transformasi pada tanaman monokotiledon

terutama graminae (Bashir et al. 2004).

Higromisin merupakan antibiotik

aminoglikosida yang diproduksi oleh

Streptomyces hygroscopicus dan merupakan

sistem marker penyeleksi yang sesuai untuk

sistem tanaman dan hewan. Antibiotik ini

menghambat sintesis protein dengan cara

menggangu translokasi dan menyebabkan

kesalahan translasi pada ribosom 80S (Bashir

et al. 2004).

Seleksi tanaman transgenik dilakukan

dengan menumbuhkan sel, jaringan atau

organ, seperti biji, pada media yang

mengandung antibiotik. Sel, jaringan atau

organ yang hidup atau lolos dari seleksi akan

merupakan tanaman yang berpotensi

membawa gen yang ditransformasikan. Selain

dengan cara seleksi antiobiotik, seleksi

tanaman transgenik juga dapat dilakukan

dengan menggunakan teknik polymerase

chain reaction (PCR) menggunakan primer

yang didesain dari sekuen gen yang

ditransformasikan atau dari sekuen gen

antibiotik yang diintegrasikan bersama-sama

dengan gen interes tersebut (Amirhusin 2004).

Pada penelitian ini telah dilakukan seleksi

dan verifikasi tanaman transgenik generasi T1

dan T2 dengan menggunakan metode seleksi

antibiotik dan PCR.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk melakukan

seleksi dan verifikasi tanaman padi transgenik

generasi T1 dan T2 yang membawa kandidat

gen toleransi aluminium.

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan

Februari 2011 sampai Juli 2012 di

Laboratorium Fisiologi Tumbuhan,

Departemen Biologi, Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB, Bogor.

Bahan

Bahan tanaman yang digunakan adalah biji

padi transgenik generasi T1 no 3.1; 4.1 dan

K4 yang telah ditransformasi dengan kandidat

gen toleransi Al yang dikonstruksi pada

plasmid pGWB5-B11 (Lampiran 1) dan biji

padi transgenik generasi T2 no. 39 dan 44

yang telah ditransfomrasi dengan kandidat gen

toleran Al yang dikonstruksi pada plasmid

pBIN-11 (Lampiran 2) dan biji tanaman non

transgenik.

Metode

Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada

Media Seleksi Antibiotik.

Biji tanaman padi transgenik generasi T1

dan T2 diseleksi pada media seleksi antibiotik

secara aseptik pada media padat dan cair. Biji

disterilisasi dengan merendamnya dalam

larutan Bayclean (20% v/v) ditambah 2 tetes

Tween-80 selama 20 menit, kemudian

dilanjutkan dengan pembilasan dengan air

steril sebanyak 3 kali (Zainati 2010).

Selanjutnya biji ditanam pada media padat

Murashige and Skoog (Lampiran 3) ditambah

25-100 mg/L Kanamisin atau 20 mg/L

Higromisin selama 6 hari. Pada seleksi

menggunakan media cair percobaan dilakukan

dengan merendam biji padi dalam 20 ml

akuades steril ditambah 25mg/L Paromomisin

selama 6 hari. Kemudian biji diinkubasi pada

suhu ruang dengan kondisi pencahayaan 16

jam terang dan 8 jam gelap. Kemampuan

kecambah padi yang tahan terhadap antibiotik

diamati pada hari ke-6. Biji dari tanaman non

transgenik disertakan sebagai pembanding

dalam seleksi. Jumlah biji yang berkecambah

dan tumbuh normal serta biji yang tidak

berkecambah dihitung dan digunakan sebagai

kriteria keberhasilan integrasi kandidat gen

toleransi Al ke dalam tanaman transgenik

generasi T1dan T2.

Penanaman di Rumah Kaca

Sebanyak 31 kecambah tanaman T1 dan

T2 yang tahan antibiotik kemudian ditanam di

rumah kaca pada pot yang berisi media

tanah:kompos dengan perbandingan 3:1 (b/b).

Tanaman dipelihara dengan mengikuti praktek

pemeliharaan padi sawah. Pengamatan

karakter pertumbuhan dilakukan sejak

tanaman berumur 21 hari sampai minggu ke-

8. Peubah yang diamati meliputi tinggi

tanaman dan jumlah anakan.

Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan dengan teknik

isolasi cepat (Miftahudin et al. 2004). Daun

padi muda dan segar berumur 4 minggu

digerus dalam N2-cair. Kemudian ditambah

buffer lisis ( SDS 2%, glisin 0.1M, NaCl

0.05M EDTA pH 8 0.01M) dan disentrifugasi

dengan kecepatan 13000 rpm selama 10

menit. Supernatan dipipet, ditambah PCIAA

(Phenol, Chloroform dan Iso Amyl Alchohol),

dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000

rpm selama 10 menit. Selanjutnya supernatan

dipipet, ditambah CIAA (Chloroform dan Iso

Amyl Alchohol), dan disentrifugasi dengan

kecepatan 13000 rpm selama 10 menit. Lalu

supernatan dipipet kembali dan ditambah

isopropanol, kemudian disentrifugasi dengan

kecepatan 15000 rpm selama 5 menit. Pelet

DNA dibilas dengan Etanol 70% dan

sentrifugasi kemudian dikeringanginkan.

Kuantitas DNA diukur menggunakan

spektrofotometer UV, sedangkan kualitas

DNA diamati dengan menggunakan teknik

elektroforesis pada 1% gel agarose dalam 1x

buffer TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0),

dengan tegangan 65 volt selama 30 menit.

Larutan DNA yang telah diperoleh disimpan

pada suhu -20 oC sampai saatnya digunakan

untuk analisis.

Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR

Analisis PCR dilakukan untuk mengetahui

keberadaan sisipan gen toleran Al yang telah

diintroduksikan pada tanaman transgenik.

Keberadaan sisipan gen tersebut diidentifikasi

secara tidak langsung melalui keberadaan gen

nptII yang menyandikan ketahanan terhadap

kanamisin atau paromomisin. Primer-primer

forward (5’-GAA-CAA-GAT-GGA-TTG-

CAC-GC-3’), reverse (5’-GAA-GAA-CTC-

GTC-AAG-AAG-GC-3’) dari gen nptII

digunakan untuk mengamplifikasi DNA

tanaman T1 dan T2. Reaksi PCR terdiri dari

100 ng DNA padi, 1x penyangga PCR, 0.2

mM masing-masing dNTPs, 0.4 μM masing-

masing primer, 1 Unit Taq DNA Polymerase

dan dH2O sampai volume akhir reaksi 20 μl.

Program PCR yang digunakan adalah 94°C

selama 5 menit (pra-denaturasi), kemudian

dilanjutkan dengan 94°C selama 30 detik

(denaturasi), 56°C selama 30 detik

(penempelan primer), dan 72°C selama 1,5

menit (pemanjangan) yang diulang sebanyak

35 siklus dan diakhiri dengan 72°C selama 10

menit. Hasil PCR dielektroforesis pada 1% gel

agarose dalam 1x buffer TBE dengan

tegangan 70 volt selama 45 menit. Pita DNA

kemudian diwarnai dengan pewarna ethidium

bromide 5 μg/ml dan diamati di atas UV

transluminator.

Analisis Data

Data segregasi biji transgenik dianalisis

menggunakan uji khi-kuadrat pada taraf uji

α=5%

HASIL

Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada

Media Seleksi Antibiotik.

Pada tahap seleksi dengan antibiotik

higromisin dengan menggunakan media padat

(media agar) dan cair, semua tanaman

transgenik dan tanaman non transgenik yang

ditumbuhkan pada media seleksi dengan

konsentrasi 20 mg/L, tidak mampu

berkecambah sampai hari ke 6.

Seleksi berikutnya dilakukan pada media

antibiotik kanamisin dengan menggunakan

media padat dan cair dengan beberapa

konsentrasi dimulai dari konsentrasi 25, 50,

dan 100 mg/L. Media seleksi kanamisin

dengan konsentrasi 25 mg/L dan 50 mg/L,

tidak mamu menyeleksi tanaman putatif

transgenik. Baik transgenik dan non

transgenik mampu berkecambah pada media

kanamisin dengan konsentrasi tersebut.

Peningkatan konsentrasi terus dilakukan

hingga konsentrasi 100 mg/L. Pada tingkat

konsentrasi 100 mg/L dari 364 benih padi

yang terdiri dari 115 tanaman nontransgenik

dan 249 tanaman transgenik terseleksi, namun

terjadi gejala albinisma, sehingga hasil seleksi

tidak dapat digunakan untuk analisis

selanjutnya. Hasil seleksi dengan antibiotik

kanamisin konsentrasi 100 mg/L disajikan

pada Tabel 1 dan 2.

Pada seleksi dengan antibiotik kanamisin

konsentrasi 100 mg/L, tanaman non

transgenik tidak menghasilkan akar (Gambar

1A), sedangkan tanaman transgenik

menghasilkan kecambah normal tetapi

menunjukkan gejala albinisma (Gambar 1B).

Untuk menghindari albinisma pada hasil

seleksi antibiotik, digunakan antibiotik

alternatif yang memiliki fungsi yang sama

dengan kanamisin, yaitu paromomisin.

Tanaman putatif transgenik kemudian

diseleksi dengan antibiotik paromomisin

dengan konsentrasi 25 mg/L. Seleksi dengan

antibiotik paromomisin dilakukan dengan

media cair. Pada teknik ini selain

pertumbuhan kecambah lebih cepat, juga tidak

membutuhkan teknik aseptik. Hasil percobaan

pada media paromomisin menunjukkan bahwa

tanaman putatif transgenik dapat terseleksi

dengan baik. Hanya tanaman yang membawa

gen nptII yang tahan terhadap media seleksi

dan tumbuh normal (Tabel 1).

Sebanyak 74 benih padi yang terdiri dari

16 tanaman non transgenik dan 58 tanaman

transgenik diseleksi pada media cair dengan

menggunakan antibiotik paromomisin dengan

konsentrasi 25 mg/L. Hasil seleksi dengan

antibiotik paromomisin disajikan pada

Gambar 2 dan Tabel 3.

A B

Gambar 1 Perkecambahan pada media antibiotik kanamisin: A. tanaman non transgenik hanya

muncul tunas, tetapi tidak berakar; B. tanaman transgenik menunjukkan kecambah

yang normal. Garis skala =1,5 cm untuk A dan 1 cm untuk B

Tabel 1 Hasil perkecambahan biji dengan antibiotik higromisin, kanamisin dan paromomisin pada

dua jenis media berbeda

Media Antibiotik

Higromisin Kanamisin Paromomisin

Media padat Tidak tumbuh Tumbuh, albino -

Media cair Tidak tumbuh Tumbuh, albino Tumbuh, normal

Tabel 2 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan

100 mg/L Kanamisin

Gambar 2 Perkecambahan biiji pada media seleksi antibiotik paromomisin: A. Non transgenik

tidak berkecambah B. Tanaman transgenik T1 berkecambah normal.

Biji tanaman non transgenik yang

dikecambahkan pada media yag diberi

perlakuan antibiotik paromomisin tidak

mampu berkecambah, sedangkan biji tanaman

transgenik generasi T1 dan T2 berkecambah

(Gambar 2). Pada Gambar 3 terlihat

perbedaan perkecambahan tanaman transgenik

dengan menggunakan antibiotik paromomisin

(Gambar 3A) dan kanamisin (Gambar 3B).

Pada media paromomisin hasil seleksi

menunjukkan perkecambahan normal dengan

tunas yang berwarna hijau, sedangkan pada

media kanamisin terjadi gejala albinisma pada

kecambah.

Hasil uji khi-kuadrat pada Tabel 4

menunjukkan bahwa tanaman T1 nomor 3.1

dan T2 nomor 39 menunjukkan segregasi

model pewarisan gen tunggal dengan rasio

kecambah tahan antibiotik terhadap peka

antibiotik 3:1 (nilai χ2 hitung lebih kecil dari

χ2 tabel).

Pertumbuhan Tanaman Transgenik.

Pertumbuhan tanaman transgenik di rumah

kaca tidak jauh berbeda dengan tanaman non

transgenik (Tabel 5). Data sampai minggu ke-

8 menunjukkan sebagian besar tanaman

transgenik memiliki tinggi tanaman yang tidak

jauh berbeda dari tanaman non transgenik,

meskipun sebagian besar tanaman ransgenik

lebih pendek dari tanaman non transgenik.

Selain itu, jumlah anakan tanaman transgenik

juga relatif sama dengan tipe non transgenik,

bahkan ada beberapa tanaman transgenik yang

memiliki jumlah anakan yang lebih banyak.

No tanaman ∑ biji yang di

uji

∑ biji yang

tahan ∑ biji yang peka

Non transgenik 115 0 115

T1-K4 99 84 15

T1-3.1 59 45 14

T1-4.1 55 41 18

T2-39 18 14 4

T2-44 18 14 4

4

A B

Tabel 3 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan

25 mg/L Paromomisin

Tabel 4 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan antibiotik

kanamisin dan paromomisin

Keterangan : χ 2 tabel(db) ; α= 5% ; χ

2 (3) = 3.81

A B

Gambar 3 Perbedaan pertumbuhan kecambah padi pada dua jenis antibiotik. A Kecambah normal

pada media antibiotik paramomisin, B Kecambah albino pada media antibiotik

kanamisin. Garis skala =0,5 cm untuk A dan 1 cm untuk B

Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR.

Hasil PCR padi transgenik generasi T1

dengan primer spesifik gen nptII disajikan

pada Gambar 4. Visualisasi dengan

elektroforesis menunjukkan pita DNA

tanaman transgenik memiliki posisi migrasi

sama atau sejajar dengan pita hasil PCR

plasmid rekombinan (kontrol positif). Pita

tersebut merupakan hasil amplifikasi gen nptII

dengan ukuran sesuai dengan yang

diharapkan, yaitu 600 pb. Dengan demikian

hasil tersebut menunjukkan bahwa gen nptII

telah berhasil disisipkan ke dalam kromosom

tanaman transgenik. Diharapkan gen toleransi

Al juga telah tersisipkan pada kromosom

tanaman tersebut.

PEMBAHASAN

Miftahudin et al (2010) telah melakukan

transformasi gen B11 (kandidat gen toleransi

Al) dengan metode biolistik (Particle

Bombardment) dan infeksi Agrobacterium

tumefaciens ke tanaman padi. Saat ini telah

mendapatkan generasi T1 dan T2 yang dalam

penelitian ini diseleksi dan diverifikasi

kebenaran tanaman transgenik tersebut.

Dengan menggunakan media seleksi

antibiotik. Efektivitas penggunaan antibiotik

sebagai agen seleksi bergantung pada jenis

dan konsentrasi antibiotik serta tingkat

ketahanan tanaman yang diseleksi. Oleh

karena itu pada penelitian ini dilakukan

optimasi seleksi dengan beberapa jenis

antibiotik dan konsentrasinya

No tanaman ∑ biji yang di

uji ∑ biji yang tahan ∑ biji yang peka

Non transgenik 16 0 16

T1-K4 16 10 6

T1-3.1 5 4 1

T1-4.1 5 2 3

T2-39 16 10 6

T2-44 16 5 11

No tanaman ∑ biji yang

di uji ∑ biji yang tahan ∑ biji yang peka Chi-test (3:1)

Non transgenik 131 0 131 393

T1-K4 115 94 21 6.41

T1-3.1 64 49 15 0.11

T1-4.1 60 43 21 4.21

T2-39 34 24 10 1.96

T2-44 34 19 15 16.96

Tabel 5 Karakter pertumbuhan tanaman non transgenik dan tanaman transgenik

A B C D E F G

Gambar 4 Hasil amplifikasi DNA generasi T1 dengan menggunakan primer nptII : A. Kontrol

negatif; B. Tanaman non transgenik; C. Tanaman transgenik no T1- 3.1; D. T1-4.1; E.

T1-K4; F. Plasmid Pembawa Konstruk Gen; G. Penanda DNA 100 pb.

Dalam seleksi menggunakan antibiotik

higromisin hasil menunjukkan tidak adanya

tanaman yang mampu berkecambah baik

menggunakan media padat (agar) maupun

media cair. Ada beberapa hal yang

menyebabkan tidak terjadinya perkecambahan

biji pada media higromisin. Pertama, bisa

terjadi karena gen hpt, yaitu gen yang

menyandikan antibiotik higromisin tidak

masuk ke dalam tanaman pada saat proses

transformasi sehingga tidak ada gen yang

menyandikan antibiotik pada saat

perkecambahan pada media seleksi. Dalam

proses transformasi ada tiga komponen

penting yang terlibat. Pertama adalah gen

virulen kromosom, yang terdapat pada

kromosom Agrobacterium dan berfungsi

dalam pelekatan bakteri dengan sel tanaman.

Kedua, gen virulen (vir) yang terdapat dalam

plasmid Ti dan menpunyai fungsi untuk

menginduksi dan integrasi T-DNA.

Komponen ketiga adalah daerah T-DNA.

Daerah T-DNA, dibatasi oleh LB (left border)

dan RB (right border) yang mengandung gen

penting bagi Agrobacterium. Proses

transformasi dimulai dengan melekatnya

Agrobacterium pada sel tanaman. Kemudian

gen-gen terinduksi pada daerah vir oleh suatu

signal yang spesifik di dalam sel bakteri

sehingga dihasilkan produk dari ekspresi gen-

gen virulen untuk memproses T-DNA dan

mentransfernya dari dalam sel bakteri. Proses

dan transfer T-DNA dimediasi oleh berbagai

protein yang dikode oleh gen virulen.

Pembentukan T-kompleks berfungsi untuk

menjaga T-DNA dalam perjalanannya menuju

inti sel tanaman inang (Rahmawati 2006).

Kemungkinan hal yang dapat menyebabkan

kesalahan dalam proses transformasi adalah

pada daerah T-DNA yang dibatasi oleh LB

dan RB (daerah yang membawa gen) yang

tidak dapat masuk dalam tanaman sel inang.

Kedua, tanaman transgenik tidak tumbuh

pada media seleksi higromisin bisa

dikarenakan konsentrasi higromisin yang

terlalu tinggi. Faktor ketiga adalah adanya

pembungkaman gen. Pembungkaman gen

merupakan proses transkripsi sehingga

tanaman tidak mampu berkambah. Menurut

Rashid et al. (1996), pembungkaman gen

adalah salah satu fenomena yang

menyebabkan terjadinya kegagalan dalam

mengekspresikan gen. Namun hingga saat ini,

mekanisme yang menyebabkan terjadinya

ketidakstabilan integrasi dan ekspresi gen

masih belum dimengerti.

No tanaman Tinggi tanaman ∑ anakan

Non transgenik 133 3

T1-K4 135 4

T1-3.1 127 4

T1-4.1 129 4

T2-39 115 3

T2-44 120 3

600bp

6

6

Pendapat lain juga menyatakan bahwa

tanaman transgenik yang tidak mampu

mengekspresikan ketahanan higromisin atau

terseleksi dalam media higromisin padahal

tanaman tersebut tidak membawa gen

penyandi hpt akan menunjukkan gejala

nekrotik, serupa dengan tanaman non

transgenik. Pada kasus yang demikian diduga

telah terjadi mekanisme pembungkaman gen

hpt. (Mulyaningsih et al. 2010). Mekanisme

pembungkaman gen dalam proses

transformasi genetik dapat terjadi pada

berbagai proses. Pembungkaman gen dapat

terjadi pada fase transkripsi dan pasca

transkripsi. Pembungkaman pada tahap

transkripsi diidentifikasi oleh ketiadaan

transkrip dari gen tersebut. Sedangkan

pembungkaman gen pada pasca transkripsi

terjadi karena gen tersebut mengandung

sekuen yang homolog (Lucy et al.2000).

Berbeda dengan hasil dari Roslim (2009)

yang melakukan transformasi plasmid

pGWB5-B11 ke tanaman tembakau tidak

menunjukkan adanya gejala albinisma pada

tanaman yang terseleksi. Pada tanaman padi

seleksi kanamisin dengan konsentrasi 100

mg/L memberikan gejala albinisma. Diduga

warna putih pada kecambah yang terseleksi

antibiotik kanamisin disebabkan oleh

penghambatan antibiotik terhadap

metabolisme sel tumbuhan. Penghambatan

proses metabolisme oleh antibiotik

disebabkan oleh pengikatan ribosom 30S yang

menyebabkan terjadinya kesalahan translasi

mRNA. Pada tumbuhan, ribosom 30S berada

pada organel kloroplas dan mitokondria. Pada

kloroplas pengikatan antibiotik pada

ribososm 30S menyebabkan rusaknya klorofil

dan menghambat pembentukan asam amino

(Braun & Bennett 2001).

Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi

kemampuan atau efektifitas bahan kimia yang

digunakan untuk seleksi tanaman adalah

bahan-bahan penyeleksi tersebut bersifat

toksik untuk sel tanaman, sehingga mungkin

hal inilah yang menyebabkan albinisma. Jadi

toksin yang paling efektif adalah toksin yang

menghambat pertumbuhan sel-sel

nontransforman secara berlahan-lahan.

Tekanan seleksi akan optimal apabila

menggunakan konsentrasi toksin yang paling

rendah yang mampu membunuh jaringan

nontransforman. Akan tetapi pada penelitian

ini, seleksi padi transgenik dengan konsentrasi

kanamisin yang rendah tidak mampu menekan

perkecambahan biji padi nontransgenik

(Mulyaningsih et al. (2010).

Daboussi et al. (1989) menyebutkan gen

tahansi antibiotik umumnya mengkode suatu

enzim yang dapat menginaktifkan suatu

antibiotik, sehingga tanaman transgenik yang

membawa gen tersebut menjadi tahan

terhadap antibiotik. Oleh karena itu, salah satu

ciri keberhasilan sisispan gen gen asing yang

umumnya dikombinasikan dengan gen

antibiotik sebagai alat seleksi pada tanaman

adalah apabila planlet atau biji hasil

transformasi menunjukkan tahansi terhadap

antibiotik.

Dalam penelitian ini ditunjukkan bahwa

antibiotik kanamisin tidak sesuai untuk seleksi

padi transgenik. Hail ini juga sesuai yang

dikatakan oleh Jefferson (1999) bahwa

antibiotik kanamisin tidak efektif sebagai

penanda untuk seleksi tanaman kacang-

kacangan dan famili Gramineae, seperti padi.

Seleksi dengan antibiotik paromomisin lebih

baik dalam menyeleksi tanaman transgenik.

Hal ini sesuai dengan Riva et al. (2006) yang

mengatakan bahwa hanya sel yang memiliki

kontruksi plasmid gen penyandi antibiotik

yang dapat tumbuh, sedangkan sel

nontransforman yang tidak memiliki kontruksi

plasmid-gen penyandi antibiotik tidak dapat

tumbuh.

Hasil uji khi-kuadrat (Tabel 4)

menunjukkan bahwa semua nomor tidak

bersegregasi pewarisan gen tunggal, kecuali

nomor T1-3.1 dan T2-39 yang bersegregasi

dengan perbandingan 3:1 untuk sifat tahan

dan peka terhadap antibiotik. Hal ini

mengindikasikan bahwa penyisisipan gen

nptII hanya terjadi satu copy gen dalam satu

tempat kromosom padi. Diharapkan nomor

T1-3.1 dan T2-39 tersebut juga hanya

membawa satu copy gen B11 dan dapat

digunakan untuk analisis selanjutnya sehingga

bisa dikembangkan menjadi galur padi

transgenik yang toleran Al

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Jenis antibiotik yang tepat pada media

seleksi tanaman padi transgenik generasi T1

dan T2 adalah antibiotik paromomisin. Seleksi

dengan antibiotik paromomisin dengan

konsentrasi 25 mg/L menunjukkan hasil yang

lebih baik daripada seleksi dengan higromisin

dan kanamisin. Kandidat tanaman transgenik

yang diseleksi menunjukkan bahwa beberapa

merupakan tanaman transgenik, sedangkan

yang lainnya

7

7

bukan transgenik. Tanaman transgenik

generasi T1 nomor 3.1 membawa satu copy

gen nptII, dan diharapkan juga membawa satu

copy gen B11.

Saran

Perlu dilakukan verifikasi sisipan gen pada

tanaman transgenik dengan menggunakan

kombinasi primer dari promotor 35S dan

primer dari toleran aluminium yang

dintroduksikan ke genom tanaman padi.

DAFTAR PUSTAKA

Amirhusin B. 2004. Perakitan Tanaman

Transgenik Tahan Hama. J Lit Per 23:1-7

Bashir K, Rafiq M, Fatima T, Husnain T, and

Riazuddin. 2004. Hygromycin based

selection of transformants in a local inbred

line of Zea mays (L). Pakistan J Biol Sci

7:318-323.

Braun R, Bennett DJ. 2001. Antibiotic tahance

in genetically modified (GM) crops. EFB

Task Group Pub Prec Biotec 10:1-4.

[BPS] Badan Pusat Statistik. Produksi Padi

Indonesia. 2011. Jakarta: Badan pusat

statistika.

Daboussi MJ, Djeballi A, Gerlinger C,

Blaiseau PL, Bouvier I. 1989.

Transformation of seven species of

filamentous fungi using the nitrate

reductase gene of Aspergillus nidulans.

Curr Genet 15: 453-456.

Ismunadji M, Partohardjono S. 1985. Program

hasil penelitian pengapuran tanah masam

untuk peningkatan produksi tanaman

pangan. Balittan. Puslitbangtan.

Jefferson RA. 1999. Method for selecting

transformed cells. Australia: Patentlens

Kochian LV. 1995. Cellular mechanisms of

aluminum toxicity and resistance in plants.

Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 46:

237-260.

Karama AS dan Abdurachman A. 1993.

Optimasi pemanfaatan sumberdaya lahan

berwawasan lingkungan. Prosiding

Simposium Penelitian Tanaman Pangan.

III. Puslitbangtan. Badan Litbang

pertanian, Departemen Pertanian. Bogor

23-25 Agustus. Hlm. 98-112

Lucy AP, Guo H, Li W, Ding SW. 2000.

Suppresion of post transcriptional gen

silencing by a plan viral protein localized

in nucleus. EMBO J 19:1672-1680

Miftahudin, Scoles GJ, Gustafson JP. 2004.

Development of PCR-based codominant

markers flanking the Alt3 gene in rye.

Genome 47:231-238.Roslim DI. 2009.

Isolasi dan karakterisasi kandidat gen

toleran aluminium pada padi. Makalah

Seminar Sekolah Pascasarjana. Institut

Pertanian Bogor.

Miftahudin, Chikmawati T, dan Pardal SJ.

2010. Pengembangan galur padi toleran

aluminium melalui rekayasa genetika.

Laporan Penelitian Riset Insentif Terapan.

LPPM. IPB.

Mulyaningsih ES, Aswidinnoor H, Sopandie

D, Pieter BF Ouwerkerk dan Loedin IHS.

2010. Pewarisan gen hpt (Hygromycine

phosphotransferase) berdasarkan analisis

PCR dan ekspresinya pada populasi padi

transforman mengoverekpresikan gen HD

ZIP OSHOX-6. Berita Biologi 10: 59-66

Purwoko BS, Hanarida I, Dewi IS, and

Santosa E. 2000. Penggunaan poliamin

untuk meningkatkan regenerasi tanaman

hijau pada kultur antera padi dan

aplikasinya dalam program pemuliaan

padi. Laporan Hibah Bersaing VIII/I.

Depdiknas 23p.

Rahmawati H. 2006. Status Perkembangan

Perbaikan Sifat Genetik Padi

Menggunakan Transformasi

Agrobacterium. Jurnal Agro Biogen 2:36-

44.

Rashid H, Yokoi S, Toriyama K, and Hinata

K. 1996. Transgenic plant production

mediated by Agrobacterium in Indica rice.

Plant Cell 15:727-730.

Riva GA, Cabrera JG, Padron RV, and Pardo

CA. 2006. The Agrobacterium tumefasiens

gene Transfer to Plant Cell. [terhubung

berkala] www.ejbiotechnology.info, [26

Juni 2012].

Roslim DI. 2009. Isolasi dan karakterisasi

kandidat gen toleran aluminium pada padi.

Makalah Seminar Sekolah Pascasarjana.

Institut Pertanian Bogor.

9

Roslim DI. 2011. Isolasi dan karakterisasi gen

toleran aluminium dari tanaman padi

[disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasarjana.

Insitut Pertanian Bogor.

Zainati F. 2010. Induksi Embriogenesis

somatik pada padi varietas IR64 dan Situ

Bagendit. [skripsi]. Bogor: Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam. Insitut Pertanian Bogor.

9

9

9

LAMPIRAN

Lampiran 3 Komposisi larutan MS (Murashige & Skoog) dan vitamin B5

Komposisi larutan MS

Kode Senyawa Konsentrasi stok(mg/L) Final konsentrasi(mg/L)

A NH4NO3 82500 1650

B KNO3 95000 1900

C CaCl2.2H2O 88000 440

D H3BO3

KH2PO4

CoCl2.6H2O

Na2MoO4.2H2O

KI

1240

34000

5.2

50

166

6.2

170

0.026

0.25

0.83

E MgSO4.7H2O

MnSO4.4H2O

ZnSO4.7H2O

CuSO4.5H2O

74000

3010.8

1720

5.2

370

22.3

8.6

0.025

F Na-EDTA

FeSO4.7H2O

74.4

5.56

37.2

27.8

Komposisi vitamin B5

Komponen Konsentrasi stok (mg/L) Final konsentrasi (mg/L)

Myo-inositol 10000 100

Thiamine-HCl 1000 10

Nicotinic acid 100 1

Pyridoxine-HCl 100 1`

13

Lampiran 1 Konstruk vektor pGWB5-B11_573bp (Roslim, 2011)

NptII : gen tahan kanamisin

HPT : gen tahan Higromisin

GFP : reporter green fluorescence protein

LB Tnos Gen B11_573 bp 35S CaMV RB 35S CaMV HPT

Tnos

HindIII

pGWB5 pGWB5

GATEWAY Cassette

SacI

attB1 attB2 GFP

Tnos NptII

Pnos

XbaI

11

Lampiran 2 Konstruk vektor ekspresi pBIN F = pBIN HB_500bp (Pambudi, 2012)

RB Tnos Gen B11_500 bp 35S CaMV LB Pnos Gen nptII

(tahansi kanamisin)

Tg7

AscI

HindIII

ClaI

pBD80 pBD80

PmeI

SalI XbaI

BamHlI

ApaI PspOMI

Acc65I

KpnI

EcoRI PacI

Bsu36I VspI

DraIII

12