5/3/2008

Sekundarni metaboliti

~IN VITRO~

Dragoljub Dimitrijevic BI020088

Metaboliti

Primarni - neophodni za fotosintezu, respiraciju, transport, sintezu proteina, shecera …

-Sheceri

-Amino kiseline

-Nuleotidi

-Lipidi

*Prisutni su u svim biljkama

______________________________________________________

Sekundarni - nemaju direktnu ulogu u rastu i razvicu

- za zashtitu

- atraktanti

- sredstvo kompeticije

*Nisu prisutni kod svih vrsta

Podela sekundarnih metabolita

- Terpeni

- Fenoli

- Azotna

jedinjenja

Terpeni (terpenoidi, izoprenoidi)

- Od izoprenskih jedinica

(monoterpeni C10, diterpeni C20, triterpeni C30, politerpeni (C5)n )

- Uloga u razvicu

giberilini (diterpeni),brasinosteroidi (triterpeni), steroli(membrana),

abscisinska kiselina, karotenoidi, fitol u hlolofilu…

Zashtita od herbivora

piretroidi, esencijalna ulja, limonoidi,

fitoekdizoni,kardenolidi, saponini

Fenoli

- Od fenilalanina

(PAL aktivnost, put shikimata*, glifosfat)

- Osobine:

- Fototoksichnost UV-A (furanokumarini)

- Alelopatija

- Chvrstina (lignin)

- Privlache zivotinje (antocijanini)

-Shtite od UV zrachenja (flavonoidi A.T. Li et al. 1993)

-Antimikrobna svojstva (izoflavonoidi, rotenoidi,

anti-estrogeni efekat)

-Tanini (nezrelo voce, endotelin-1 Corder et al. 2001)

Azotna jedinjenja

-Sintetishu se od obichnih AK uglavnom

-Tipovi: Alkaloidi, cijanogeni glikozidi, glukozinolati neproteinske AK

-15,000 vrsta alkaloida u 20% vrsta, N-heterocikli, Lys,Thy,Trp, farmakoloshko dejstvo

-Cijanogeni glikozidi HCN (metaboliti i enzimi prostorno razdvojeni)

-Glukozinolati (nitrili i izotiocijanat)

-Kanavanin (Arginin) nefunkcionalni proteini, posebni enzimi za prepoznavanje

* Zanimljivosti *

Proizvodnja sekundarnih

metabolita samo u simbiozi

-veci rast, bolja odbrana

Fitoaleksini

Samo prilikom infekcije

Samo na mestu infekcije

Kratki istorijat

-1956 Routienn i Nickell predlozili kulturu tkiva u zamenu za cele biljke

-Otkrivene i nove supstance

-1956 patentiran prvi biljni bioreaktor

-1983 Mitsui petrochemical Industries proizvodi shikonin

(Lithospermum erythrorhizon) (x1000$/L)

-1980-ih celije duvana i koren ginseng-a, 20k L bioreaktori

- Niska stopa sek.metabolita u pochetku

Primeri sekundarnih metabolita

proizvedenih u kulturi tkiva

Kafein Coffea arabica

Saponini ginsenga Panax ginseng

Shikonin Lithospermum erythrorhizon

Ubiquinon 10, nikotin Nicotiana tabacum

Atropin, skopolamin Atropa belladonna

Berberin Coptis japonica

Taksol Taxus brevifolia

Kultura organa - koren

- Vece koncentracije sek.metabolita u korenu nego u nediferenciranom tkivu (Yamada i Hashimoto,1990)

- Raste bujno uz auksine ili transformacijom Agrobacterium rhizogenes

- Korenje chvrsto fiksirano u bioreaktorima

- Uspeshna proizvodnja saponina ginsenga 20k L, strujanjem vlaznog vazduha

- Transformacijama veca iskorishcenost i uvodjenje novih gena

Kultura organa - izdanak

- Kod vrsta sa vecom produkcijom s.m. u listovima i izdancima

- Digitalis izdanak, proizvodnja srchanog glikozida bolja nego u kulturi celija ili korena

- Razmnozavanje izdanka je teshko ostvarljivo na technoj podlozi

Metode

- Slichne metodama u mikrobiologiji

- Faze: 1) Izbor divlje/kultivisane biljke

2) Visokoproduktivna biljka (in vitro)

3 ) Pochetni kalus i klonska selekcija

4) Stabilna linija sa visokom proizvodnjom

5) Visokoproduktivna linija u optimalnim

uslovima

6) Bioreaktor

Prinosi sekundarnih metabolita

- U pochetku male kolichine – selekcija

(Coffea arabica, Panax ginseng, Coptis japonica)

- Nediferencirano stanje = slaba produktivnost ?

- Terpeni – uljne zlezde, mofin i kodein – mlechne cevi

- Proizvodnja izvodljiva i u nediferenciranom stanju, moze biti

priblizno jednaka in vivo (retko)

- Razlike in vitro i in vivo kvantitativne ali i kvalitativne

- 1973 prvi radovi in vitro > in vivo (Coptis japonica)

- Vremenska podela prema kolichini prinosa (do 1973)

- Do 1973 rad na hranljivim podlogama

- Posle 1973, 5-100x veci prinosi in vitro od in vivo (Nicotiana

tabacum, Daucus carota, Catharanthus roseus)

Parametri proizvodnje

Genotip biljke

- Proizvodnja zavisi od genotipa biljke

- Razlichite linije imaju razlichitu proizvodnju (kolichina serpentina kod Catharantus-a Zenk i sur., 1977)

- Razlichita i brzina rasta kulture

- Nemoguce predvideti proizvodnju

- Potreban veliki broj genotipova u startu

- Nestabilnost kultura – vremenom opada proizvodnja (chuvanje “dobrih” linija)

Parametri proizvodnje Ishrana i fizichko-hemijski uslovi

- Regulatori rasta, ugljeni hidrati, kiseonik…

- Ne postoji jedinstven pristup !

- Uslovi za brz rast kulture nisu najbolji za produkciju sekundarnih metabolita

- Dvofazne kulture (shikonin, Fujita 1982)

- Dodavanje prekursora (Trp za Catharantus)

- Izlaganje stresnim uslovima (gljive)

- Elicitori (Heinstein, 1985)

- Imobilizacija alignatom (L-tirozin u L-DOPA)

- Auksini i citokinini, giberelini (IAA,NAA, 2,4-D) (10-8 M Gib –Berberin)

- Prinosi zavise od vrste auksina, 30x veca produkcija antrakinona zamenom NAA sa 2,4D kod Morinda citrifolia ( Zenk i sur., 1975); 0 prinosa naftokinona Lithospermium-a sa IAA, samo sa 2,4D (Tabata i sur., 1974)

- Slichno je i za konc. i vrstu ugljenih hidrata u podlozi, pH, soli metala…

- Ostali fizichki uslovi – bez pravila (, temperatura, UV,mehan.oshtecenja)

Razlichiti prinosi celija

- Klonovi daju razlichite prinose

- Variranja do 30x kod Nicotiana rustica (Ogino i sur., 1978)

- Heterogenost pre i posle kulture

- Kloniranje celijskih kultura – 2 nachina

- Mikrokulture i replica-plating (na kalusu i podlozi)

- Izbor klonirane linije – “brute force”

- Izbor “pregledanjem” : vizuelno, fluorometrijsko, hemijska analiza ekstrakata, specifichna bojenja, radio-imunoloshki testovi…

Rast u bioreaktorima

Problemi: - spor rast kulture

- osetljivost (stres)

- izbacivanja sek.met. iz celije (DMSO)

- meshanje (flat bed turbine impellers)

- ochuvanje “dobrih” linija (techni azot)

- imobilizacija

Zakljuchak

- Veliki potencijal i isplativost

- Nova, do sada nepoznata jedinjenja***

Potrebno je unaprediti:

- Metode oslobadjanja sek.met. iz celija

- Znanje biohemijskih mehanizama formiranja i regulacije produkcije sek.met

- Chuvanje “dobrih” linija

- Sastave hranljivih podloga

Literatura

• Plant physiology 4th ed. Taiz&Zeiger

• Kultura biljnih stanica i tkiva Sibila Jelaska

• In Vitro Culture of Higher Plants R.L.M.Pierik

• Transgenic crops for improved pharmaceutical products

Kirsi-Marjs Oksman-Caldentey

hFala na paznji : - )

Bonus : berberin detaljno

• 7.1.1.2 Berberine Berberine is an isoquinoline alkaloid which is distributed in roots of Coptis japonica and cortex of Phellondendron amurense. Berberine chloride is used for intestinal disorders in the Orient and it takes 5 to 6 years to produce Coptis roots as the raw material.

• Furuya at Kitasato University (154) and Yamamoto at Nippon Paint (155) have investigated the production of berberine by Coptis japonica cell cultures since 1970's and Yamada et al. at Kyoto University (156) selected a high berberine producing cell line of C. japonica which was transferred to a Japanese company, Mitsui Petrochemical.

• Mitsui Petrochemical has improved the productivity, and Hara et al. (157) found that addition of 10-8 M gibberellic acid into the medium stimulated berberine productivity up to 1.66 g per L of the medium. Using a cell sorter and protoplasts of C. japonica, they selected many higher alkaloid-producing cell lines. Thus, the Mitsui group produces berberine in a large scale at a level of 1.4 g per L of their optimized medium within 2 weeks. Furthermore, they established a "high-density cell culture" process to produce berberine much more efficiently. In order to achieve a cell mass of 70 g/L on a dry weight basis, stirring without damaging the cells, supply of sufficient amounts of oxygen, and that of appropriate nutrients were optimize. As a result, the yields reached 70 g per L of cell mass and 0.45 g/day of berberine. The continuous culture with high cell density was also conducted successfully.

• Addition of a polyamine, spermidine, was found to stimulate the production of berberine by Thalictrum minus cell suspension cultures by Hara et al. in Tabata's laboratory (158) although other polyamines such as cadaverine, putrescine and spermine were ineffective. They indicated that spermidine effected an increase of ethylene generation which was associated with activation of berberine synthesis. The maximum stimulative effect was obtained by addition of 2 mM spermidine.