SVEUČILIŠTE U SPLITU

Podružnica

SVEUČILIŠNI ODJEL ZDRAVSTVENIH STUDIJA

PREDDIPLOMSKI SVEUČILIŠNI STUDIJ

MEDICINSKO LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA

Sandra Vujević

IZRAŽAJ GENA RNazeH2A U UROTELNIM TUMORIMA

MOKRAĆNOG MJEHURA

Završni rad

Mentor:

Doc. dr. sc. Vedrana Čikeš Čulić

Split, 2014.

Sadržaj

1. UVOD ....................................................................................................................... 1

1.1. Mokraćni mjehur ................................................................................................. 2

1.1.1. Histološka građa mokraćnog mjehura ......................................................... 2

1.1.2. Zloćudni tumori mokraćnog mjehura .......................................................... 3

1.1.3. Čimbenici rizika za nastanak karcinoma mokraćnog mjehura .................... 3

1.1.5. Stupnjevanje bolesti ..................................................................................... 5

1.1.6. Gradus tumora mokraćnog mjehura ............................................................ 7

1.2. RNaze (Ribonukleaze) ........................................................................................ 7

1.2.1. RNazaH ....................................................................................................... 8

1.2.2. Funkcija RNazaH ........................................................................................ 8

1.2.3. Uloga RNaze H2A i povezanost s karcinomom ........................................ 10

2. HIPOTEZA ............................................................................................................. 12

2.1. Cilj istraživanja ................................................................................................. 13

3. MATERIJALI I METODE ..................................................................................... 14

3.1. Ispitanici i uzorci .............................................................................................. 15

3.2. Postupak izolacije RNA iz tkiva ....................................................................... 15

3.3. Sinteza cDNA ................................................................................................... 16

3.3.1. Postupak sinteze cDNA ............................................................................. 17

3.4. Kvantitativna PCR reakcija u stvarnom vremenu (qRT-PCR) ......................... 17

3.5. Test efikasnosti primera (engl. Primer efficiency test) ..................................... 18

3.5.1. Standardna krivulja efikasnosti početnica RNazeH2A ............................. 18

3.6. Obrada podataka ............................................................................................... 21

4. REZULTATI .......................................................................................................... 22

5. RASPRAVA ........................................................................................................... 25

6. ZAKLJUČCI .......................................................................................................... 28

7. SAŽETAK .............................................................................................................. 30

8. SUMMARY ........................................................................................................... 32

9. ŽIVOTOPIS ........................................................................................................... 34

10. LITERATURA ....................................................................................................... 36

Završni rad izrađen je u Laboratoriju za istraživanje raka medicinskog fakulteta

Sveučilišta u Splitu pod vodstvom mentorice doc. dr. sc. Vedrane Čikeš Čulić.

Zahvala

Najiskrenije zahvaljujem mentorici doc. dr. sc. Vedrani Čikeš Čulić, koja mi je

savjetima, iskustvom i potporom omogućila izradu ovoga završnog rada.

Posebno zahvaljujem prof. dr. sc. Janošu Terziću bez čije podrške, susretljivosti i

strpljenja sve ovo ne bi bilo moguće.

Hvala kolegama s Katedre za imunologiju i medicinsku genetiku.

Najveće hvala mojoj obitelji!

1

1. UVOD

2

1.1. Mokraćni mjehur

Mokraćni mjehur (lat. vesica urinaria) šuplji je mišićni organ koji je smješten u zdjelici,

a služi kao spremnik za mokraću (urin) koja nastaje u bubrezima (Slika 1.). Mokraća iz

bubrega dolazi mokraćovodima (lat. ureter), a iz mjehura odlazi kroz mokraćna cijev

(lat. urethra). Na mokraćnom mjehuru razlikujemo: vrh, bazu i srednji dio. Ispred

mjehura je simfiza preponske kosti, a iza se nalazi zadnje crijevo kod muškarca (lat.

rectum), te maternica i rodnica kod žena.

Slika 1. Shematski prikaz mokraćnog mjehura muškarca.

1.1.1. Histološka građa mokraćnog mjehura

Presjek kroz stijenku mokraćnog mjehura otkriva da je građen od četiri sloja. Unutrašnji

sloj čini tzv. prijelazni epitel ili urotela ispod kojeg se nalazi submukoza (lat. lamina

muskularis) koju čini sloj rahlog vezivno-mišićnog tkiva. Najdeblji dio stjenke

mokraćnog mjehura je mišićni sloj (lat. lamina muskularis propria) kojeg s vanjske

strane prekriva seroza (adventicija) (Slika 2.). Navedena građa stijenke mjehura koristi

se za stupnjevanje malignih tumora i to pri postavljanju dijagnoze, donošenju

terapijskih odluka kao i u prognostičke svrhe (1,2).

3

Epitel mokraćnog mjehura svojim izgledom dijelom podsjeća na nekeratinizirajući

višeslojni pločasti i cilindrični epitel, koji histolozi urotel. Debljina urotela u mnogome

ovisi o stupnju rastegnutosti mokraćnog mjehura, gdje u maksimalno distendiranom

mjehuru urotel sadrži svega 2-3 sloja spljoštenih stanica, dok se u kontrahiranom stanju

nalazi 7-8 slojeva stanica. U kontrahiranom stanju prijelazni epitel može se podijeliti na

sloj površinskih, intermedijarnih i bazalnih stanica (3).

Slika 2. Presjek kroz stijenku mokraćnog mjehura. Vide se slojevi mokraćnog mjehura:

prijelazni epitel, lamina proprija, i glatki mišić. (Preuzeto sa stranice;

http://faculty.une.edu/com/abell/histo/histolab3d.htm)

1.1.2. Zloćudni tumori mokraćnog mjehura

Karcinom mokraćnog mjehura je najčešći maligni tumor mokraćnog sustava (4). U

muškaraca je trostruko češći, te se pojavljuje ranije nego u žena (69 prema 71 godina)

(5). Karcinom mokraćnog mjehura nije homogena bolest već uključuje površinsku,

invazivnu te metastatsku bolest od kojih svaka ima drugačiju kliničku sliku, prognozu i

liječenje.

1.1.3. Čimbenici rizika za nastanak karcinoma mokraćnog mjehura

Najvažnijim čimbenikom rizika za nastanak karcinoma mokraćnog mjehura smatra se

izlaganje određenim kemijskim karcinogenima (anilinskim bojama, benzidinu te

aromatskim aminima). Navedene karcinogene uglavnom susrećemo u kemijskoj

4

industriji, industriji obradi kože i metala, gume, tiskarama, pogonima koji koriste boje,

laboratorijima zubne tehnike, salonima za uljepšavanje itd. Karcinom mokraćnog

mjehura smatra se jednim od najbolje poznatih tzv. industrijskih karcinoma. Vrijeme

djelovanja kemijskog karcinogena potrebno da se razvije maligna bolest (vrijeme

latencije) je vrlo dugo i iznosi 30-50 godina (6). Pored navedenog, kao rizični čimbenik

treba napomenuti i pušenje cigareta koje se dovodi u uzročnu vezu s nastankom raka

mokraćnog mjehura još od 60-tih godina prošlog stoljeća (7). Nasljedni čimbenici

nemaju značajniju ulogu u nastanku raka mokraćnog mjehura. Prema istraživanju

Kiemeney i sur. relativni rizik pojave raka mjehura među islanđanima bio je viši u

drugoj i trećoj generaciji nego u prvoj, što upućuje na malu ulogu nasljednih čimbenika

u ovoj bolesti (8).

1.1.4. Klinička slika i dijagnostika

Dijagnoza se često kasno postavi jer simptomi nalikuju benignim stanjima poput

mokraćnih infekcija, upale prostate ili kamenca, a znaju biti i povremeni. Bezbolna,

spontana pojava krvi u mokraći (hematurija) najčešći je znak tumora mokraćnog

mjehura i u 85% slučajeva predstavlja prvi simptom (4). Sljedeći simptom je bol, koja

nastaje kao rezultat lokalno ili metastatski uznapredovanog tumora i povezana je s

veličinom i lokacijom tumora i/ili metastaza. Smetnje prilikom mokrenja mogu biti

posljedica funkcionalnog smanjenja kapaciteta mjehura, pretjerane aktivnosti mišića,

invazije donjeg dijela mjehura ili začepljenja izlaza mjehura. Ti se simptomi javljaju u

trećine pacijenata, a uključuju: učestalo mokrenje tijekom dana i/ili noći, hitna potreba

za mokrenjem, otežano mokrenje, nekontrolirano mokrenje, isprekidan mlaz mokraće,

noćno mokrenje, slab mlaz mokraće, te osjećaj nepotpunog pražnjenja mjehura. Opći

simptomi su umor, gubitak tjelesne mase, gubitak apetita i obično su znaci

uznapredovale bolesti, te pokazatelji loše prognoze (9). Osim kliničkih znakova i nalaza

mikrohematurije u sedimentu urina, dijagnostika se temelji na citološkom pregledu

sedimenta urina, cistoskopiji i transuretralnoj resekciji (TUR), te patohistološkoj analizi

tumorskog tkiva. Radiološke pretrage uključuju intravensku urografiju koja se

posljednjih godina sve više zamjenjuje kompjutoriziranom tomografijom (CT).

5

1.1.5. Stupnjevanje bolesti

Procjena stadija karcinoma mokraćnog mjehura od strane patologa temelji se na TNM

sustavu objavljenom od Međunarodne organizacije za borbu protiv raka (UICC).

TUMOR

Tx: Tumor se ne može procijeniti

T0: Nema dokaza tumora

Ta: Neinvazivni papilarni karcinom

Tis: Karcinom „in situ“

T1: Invazija tumora u subepitelno tkivo

T2: Invazija tumora u mišićni sloj mjehura

T3: Invazija tumora u perivezikalno tkivo

T4: Invazija tumora u okolne organe ili stjenke zdjelice

NODUS (limfni čvor)

Nx: Regionalni limfni čvorovi se ne mogu procijeniti

N0: Nema metastaza u regionalne limfne čvorove

N1: Metastaze u 1 limfnom čvoru čiji je promjer ≤ 2 cm

N2: Metastaze u ≥ 1 limfnom čvoru s promjerom do 5 cm

N3: Metastaze u ≥ 1 limfnom čvoru s promjerom > 5 cm

METASTAZE

Mx: širenje karcinoma se ne može procijeniti

M0: Nema udaljenih metastaza

M1: Dokazano postojanje udaljenih metastaza

6

Slika 3. Stadiji tumora mokraćnog mjehura (Preuzeto iz CancerHelp Velika Britanija).

Približno 90% svih tumora mokraćnog mjehura su karcinomi prijelaznih stanica

(tranzitocelularni ili urotelialni karcinom, TCC), otprilike 5% otpada na skvamozni

karcinom (SCC) i 2% na adenokarcinom (10). Obično se tumori stadija Ta, Tis i T1

nazivaju površinskima ili onima koji ne prodiru u mišićni sloj. Oko 75-80% bolesnika s

tumorom mokraćnog mjehura ima površinski karcinom dok ostatak boluje od

invazivnog karcinoma. Tako stadij Ta predstavlja neinvazivni papilarni tumor. Tis je

plosnati tumor ograničen na epitel. T1 stadij tumora je ograničen na podsluznicu i/ili

laminu propriju. Od navedenog postotka površinskih karcinoma oko 70% čini Ta stadij,

20% T1 i 10% karcinom in situ (CIS,Tis). Invazivni tumori, tj. oni koji prodiru u

mišićni sloj su T2, T3 i T4 (Slika 3.). T2 stadij tumora prodire u mišićni sloj i ne prelazi

granice mokraćnog mjehura. T3 invadira u okolno perivezivno tkivo, te eventualno u

prostatu u muškaraca ili maternicu i vaginu u žena. Stadij T4 je tumor proširen na

stjenku abdomena ili zdjelice, te eventualno na limfne čvorove i druge udaljene dijelove

tijela, npr. pluća (11).

Porast invazivnosti tumora

Masno tkivo

Mišić

Vezivno tkivo

Prijelazni epitel ili urotel

Masno tkivo

Mišić

Vezivno tkivo

Prijelazni epitel ili urotel

7

1.1.6. Gradus tumora mokraćnog mjehura

Osim sustava TNM, u dijagnostičke, prognostičke i terapijske svrhe koristi se i

određivanje gradusa tumora prema stupnju diferenciranosti, odnosno prema stupnju

nalikovanja na normalno tkivo. Tradicionalno se tumor mjehura klasificira prema

stupnju diferenciranosti (engl. grading) stupnjevanjem po WHO (World Health

Organisation) iz 1973. godine i to u tri stupnja:

G1: dobro diferencirani tumor

G2: srednje diferencirani tumor

G3: loše diferencirani tumor

Tumori mokraćnog mjehura pokazuju ogromne heterogenosti što se očituje različitim

morfološkim i molekularnim promjenama povezanim s fenotipovima te bolesti. U

posljednjih desetak godina identificirani su brojni biomarkeri tumora mokraćnog

mjehura, uključujući razne tumor supresorske gene, onkogene, čimbenike rasta,

receptore za čimbenike rasta, hormonske receptore, biljege proliferacije i apoptoze,

molekule stanične adhezije, stromalne čimbenike i onkoproteine. Opisano je nekoliko

signalnih puteva, poput p53, pRb, PTEN i njihovih interakcijskih proteina, koji

posreduju u razvoju invazivnog karcinoma mokraćnog mjehura (12,13). Ipak, miševi s

urotelnim delecijama p53 i pRb gena razvijaju kasno-nastupajuću hiperplaziju i

isključivo neinvazivne papilarne tumore mokraćnog mjehura niskog gradusa (14). Zbog

ograničenih vrijednosti tih prognostičkih biljega ukazuje se potreba za analiziranjem

novih molekularnih parametara koji bi se koristili u klinici za otkrivanje i praćenje ove

bolesti.

1.2. RNaze (Ribonukleaze)

Ribonukleaze (RNaze) su enzimi koji razgrađuju molekule RNA na manje dijelove.

Dijele se na endoribonukleaze i egzoribonukleaze koje obuhvaćaju više podklasa. Svi

organizmi sadrže RNaze što ukazuje na važnost njihove funkcije. Osim uklanjanja

stanične RNA kada je to potrebno, RNAza ima važnu ulogu i u sazrijevanju različitih

molekula RNA kao što je glasnička RNA koja nosi genski materijal za sintezu proteina i

8

nekodirajuća RNA koja sudjeluje u različitim staničnim procesima. Isto tako,

razgradnja molekula RNA prva je linija obrane protiv RNA virusa.

1.2.1. RNazaH

Enzim RNazaH je nespecifična endonukleaza koja katalizira cijepanje RNA pomoću

hidrolitičkih mehanizama. RNazaH prisutna je u gotovo svim organizmima od Archaea

do bakterija i eukariota. Trodimenzionalna struktura RNazeH prikazuje da se enzim

sastoji od 5 β-nabranih ploča okruženih α-uzvojnicama (Slika 4.). (15).

ribonukleaza H

Slika 4. Trodimenzionalni prikaz RNazeH1 E.coli

Ribonukleazna aktivnost RNazeH očituje se u cijepanju 3'-O-p veze (fosfo-di-esterska

veza) RNA u RNA/DNA hibridu, te nastajanju 3'-hidroksila i 5'-fosfata kao krajnjih

produkata. Neke RNazeH, kao što je ona pronađena u virusu HIV-1, imaju nedostatak

jedne od uzvojnica (c-uzvojnica) dok pozitivno nabijena stršeća α-uzvojnica povećava

kapacitet vezanja supstrata (16).

1.2.2. Funkcija RNazaH

RNazaH specifično razgrađuje RNA u RNA/DNA hibridu i neće razgraditi DNA ili

nehibridiziranu RNA, što se često koristi za uklanjanje RNA početnica prilikom sinteze

cDNA. RNazaH se također koristi za razgradnju specifičnog lanca RNA tijekom sinteze

9

cDNA, te za uklanjanje poli(A) repa iz mRNA (Slika 5.) ili uništavanje određene

nekodirajuće RNA unutar ili izvan žive stanice.

Slika 5. Uklanjanje RNA kalupa tijekom uređivanja RNA i sinteze komplementarne

DNA reverznom transkripcijom.

Eukarioti imaju dvije klase staničnih RNazaH i to tip 1 i 2. RNazaH1 (tip 1 enzima) je

neophodna za replikaciju mitohondrija, dok je RNazaH2 (tip 2) glavni izvor aktivnosti

RNazeH u stanicama sisavaca (17). RNazaH2 je heterotrimer koji se sastoji od

katalitičke podjedinice RNazaH2A i ne katalitičkih podjedinica RNazaH2B i

RNazaH2C (Slika 6.), koji su podjednako važne za funkciju i aktivnost, te zajedno

mogu prepoznati i pocijepati jedan ribonukleotid pogrešno ugrađen u DNA/DNA

kompleks. Ovaj kompleks također ima ključnu ulogu u metabolizmu nukleinskih

kiselina, prevenciji imunoreakcije najvjerojatnije posredovanjem u isijecanju

pojedinačnih ribonukleotida iz RNA/DNA hibrida kao i u uklanjanju zaostalog lanca

Okazakijevih fragmenata tijekom replikacije DNA, u uklanjanju pogrešno umetnutih

ribonukleotida DNA polimerazom i u eliminaciji RNA/DNA hibrida tijekom stanične

smrti (17).

RNazaH

RNazeH

RNazaH

10

Slika 6. Kristalna struktura RNazaH2 enzimskog kompleksa.

Mutacije u humanom genu za RNazuH2 uzrokuju Aicardi-Goutierov sindrom (AGS).

Određena je kristalna struktura RNazaH2 enzimskog kompleksa miša u svrhu boljeg

razumijevanja molekularne osnove RNazeH2 i disfunkcije kod autoimunih bolesti u

čovjeka. Struktura otkriva usku povezanost RNazeH2B i RNazeH2C s RNazomH2A u

kompleksu što je idealno za vezanje nukleinskih kiselina i hidrolizu u interakciji

protein-protein što omogućuje učinkovito sudjelovanje u više staničnih funkcija.

1.2.3. Uloga RNaze H2A i povezanost s karcinomom

Velike preraspodjele kromosoma (GCRs), poput translokacija, delecija, amplifikacija i

aneuploidija, često su prisutne kod različitih tipova humanih tumora. Unatoč njihovoj

važnosti u karcinogenezi, molekularni mehanizmi nastajanja i kontrole preraspodjele

kromosoma slabo su poznati. Pomoću «GCR testa», koji mjeri stopu akumulacije

spontanih GCR-ova u Saccharomyces cerevisiae, Motegi i sur. otkrili su da mnogi

proteini koji sudjeluju u DNA replikaciji, popravku DNA, rekombinaciji DNA, kontroli

staničnog ciklusa, remodeliranju kromosoma i očuvanju telomera, imaju vrlo važnu

ulogu pri nastanku GCR-a (19). Nestabilnost genoma je karakteristika progresije svih

karcinoma, uključujući i rak mokraćnog mjehura (20). Mišićno invazivni karcinom

mokraćnog mjehura karakteriziraju mutacije ili delecije u tumor supresorskim genima,

kao što su TP53 Rb i PTEN koje dovode do genomske nestabilnosti (18). Ipak, mnoga

istraživanja pokazuju da genomska nestabilnost proizlazi iz dvolančanih lomova DNA.

RNazaH2

11

Istraživanja u kvasaca i na stanicama sisavaca pokazala su da se nestabilnost i

dvolančani lomovi mogu pojaviti tijekom poremećene elongacije i prekrajanja RNA

kada nastaju DNA-RNA hibridi. Wahba i sur. objavili su da se kod kvasaca hibridi

spontano stvaraju na mnogim lokusima stanica divljeg tipa, vjerojatno zbog

transkripcijske pogreške, ali se uklanjaju s dvije evolucijski konzervirane RNazeH (21).

Uspjeh novih terapeutskih strategija za maligne tumore temelji se na identifikaciji

ključnih točaka u onkogenim signalnim putevima. Stanice raka podliježu velikim

prilagodbama u svojim signalnim i metaboličkim procesima. Pri tome maligne stanice

mogu postati ovisne o promjenama pojedinih gena koji nisu sami po sebi onkogeni. U

stvari, aktivnost tih gena može ograničavati brzinu razvoja stanica raka. Izraz 'neovisan

o onkogenu je stvoren kako bi opisao taj fenomen. Vjeruje se da inhibicija ključnih

čimbenika unutar signalne mreže inducira pogreške u signaliziranju, a time utječe na

razvoj malignog procesa (22). Kao enzim prisutan u funkcionalno jedinstvenom putu

povezanom s agresivnim tipom karcinoma, RNazaH2A predstavlja idealnu ciljnu

molekulu za liječenje raka i najnovija bioinformatička istraživanja svrstavaju

RNazuH2A među 2% gena koji su pokazali najveći potencijal za antitumorsku terapiju

(23).

12

2. HIPOTEZA

13

Pretpostavka je da će RNazaH2A pokazati pojačanu espresiju (engl. over-expression) u

urotelnom karcinomu mokraćnog mjehura u odnosu na zdravo tkivo. Također, očekuje

se da će ekspresija RNazeH2A korelirati sa stupnjem, gradusom, invazivnošću, brojem

tumora, dobi i spolom kod urotelnog tumora mokraćnog mjehura. Zbog svega

navedenog, RNazaH2A mogla bi biti vrlo koristan biomarker ove bolesti te novi

potencijalni cilj u prevenciji i liječenju ove malignosti.

2.1. Cilj istraživanja

Pomoću qRT-PCR metode odrediti razinu izražaja RNazeH2A u urotelnim tumorima

mokraćnog mjehura pacijenata koji su podvrgnuti transuretralnoj resekciji u usporedbi s

zdravim uzorcima tkiva mokraćnog mjehura, te prikazati moguću povezanost izražaja

RNazeH2A sa stadijem, gradusom, te invazivnošću urotelnog tumora mokraćnog

mjehura.

14

3. MATERIJALI I METODE

15

3.1. Ispitanici i uzorci

Analiza uključuje uzorke pacijenata koji su bili podvrgnuti transuretalnoj resekciju

tumora mokraćnog mjehura (TUR) u Kliničkom bolničkom centru Split. Informirani

pristanak dobiven je od svih ispitanika prije prikupljanja uzoraka, a u skladu s

dopuštenjem Etičkog odbora Sveučilišne bolnice u Splitu (klasa: 500-03/06-01/208,

ur.br: 2181-147-06-01/01-MJ) i Etičkog povjerenstva Sveučilišta u Splitu Medicinskog

fakulteta (klasa: 003-08-10-03/0005, ur.br: 2181-198-03-04/10-10-0011). Patološki

stadij svakog tumora je određen prema TNM sustavu. Tumorski uzorci i uzorci zdravog

tkiva odmah nakon operacije pohranjeni su u tekućem dušiku (na -196° C) do izolacije

molekule mRNA.

3.2. Postupak izolacije RNA iz tkiva

Prvi korak u istraživanju bila je izolacija molekula mRNA iz zdravog i tumorskog tkiva

mokraćnog mjehura. Uzorak iz tekućeg dušika je homogeniziran (engl. tissue

pulverizer) snažnim udaranjem čekićem čime je zaleđeni uzorak zdrobljen u prah (Slika

7.).

Slika 7. Homogenizator tkiva (engl. tissue pulverizer)

Nakon toga uzorak smrvljenog tkiva prebačen je u 1,5 ml tubice bez DNAze i RNAze u

koje je stavljen Qiazol Lysis Reagent (Tablica 1.). Tubice se drže na ledu, a volumen

dodanog tkiva ne smije prelaziti 10% volumena Qiazol Lysis Reagent-a. Korišteno je

~100 mg uzorka na 1 ml reagensa. Uzorak u tubici s Qiazolom je treskan kratko i

ostavljen na sobnoj temperaturi (15-25°C) 5 minuta. U sljedećem koraku dodano je 0,2

ml kloroforma, te je uzorak energično treskan (vorteksiran) 15 sekundi, a zatim

16

inkubiran 2-3 minute na sobnoj temperaturi. Nakon toga slijedi centrifugiranje

12000g/15 minuta/+4°C. Nakon centrifugiranja gornja, prozirna faza u kojoj se nalazi

molekula mRNA prebačena je u novu tubicu i dodano je 0,5 ml izopropanola (na 1 ml

Qiazol Lysis Reagent-a). Uslijedilo je vorteksiranje i inkubacija na sobnoj temperaturi

10 minuta. Nakon toga slijedilo je centrifugiranje 12 000g / 10 minuta /+4°C. Pažljivo

je uklonjen supernatant, a RNA talog vidljiv je kao bjelkasti trag na dnu tubice. Na

kraju je dodan 1 ml 75%-tnog etanola (na 1 ml Qiazol Lysis Reagent-a), te je uzorak

centrifugiran na 7500g / 5 minuta / +4°C. Nakon centrifugiranja uklonjen je

supernatant, a RNA talog ostavljen na sobnoj temperaturi da se posuši. U zadnjem

koraku RNA talog je laganim pipetiranjem otopljen u određenom volumenu DNase,

RNase free vode (30μl). Istim postupkom izolirana je RNA iz sva 72 uzorka (36

uzoraka zdravog i 36 uzoraka tumorskog tkiva istog ispitanika). Uzorci su zatim

pohranjeni na -80°C do postupka sinteze cDNA.

Tablica 1. Materijal korišten za izolaciju molekule mRNA.

Reagens Proizvođač

QIAzol lysis reagent Qiagen, Njemačka

Kloroform J.T. Baker, Nizozemska

Izopropanol T.T.T., Hrvatska

Etanol apsolutni Alkaloid, Skopje, Makedonija

Voda (engl. DNase/RNase free water) Gibco, SAD

3.3. Sinteza cDNA

Izolirana mRNA prevedena je u cDNA enzimom reverznom transkriptazom. Za sintezu

cDNA je korišten kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied

Biosystems). Komponente sadržane u kitu su: 10x RT Buffer, 25x dNTP Mix(100mM),

10xRT Random Primers, MultiScribe™Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor,

Nuclease free voda (Tablica 2.).

Tablica 2. Materijal za sintezu cDNA

Reagens Proizvođač

High-Capacity cDNA Reverse

Transcription Kits

Applied Biosystems, Velika Britanija

17

3.3.1. Postupak sinteze cDNA

Cijeli postupak izvodi se na ledu (sve komponente kita drže se na ledu za vrijeme

cijelog postupka). Postupak započinje miješanjem sljedećih komponenti u tubici: 10x

RT Buffer (2,0 μl), 25x dNTP Mix(100mM) (0,8 μl), 10xRT Random Primers (2,0 μl),

MultiScribe™Reverse Transcriptase (1,0 μl), RNase Inhibitor (1,0 μl), voda bez

nukleaza (3,2 μl), RNA (izračuna se, do 1µg) i doda se voda bez RNaza do 20µL.

Navedena smjesa je dostatna za jedan uzorak, pa je smjesa načinjena za svih 72 uzorka

istovremeno i podijeljena na 72 tubice u koje je naknadno dodana RNA (1µg) u

potrebnom volumenu s vodom bez RNaza do 20µL. Sadržaj tubice je nježno

promiješan. Nakon toga slijede 4 koraka inkubacije: 10 minuta na 25 °C, 120 minuta na

37°C, 5 minuta na 85°C i zadnji korak ∞ na 4°C. Dobivena se cDNA u volumenu od 20

µL razrijedi u 180 µL vode bez RNaza. Konačno je dobiveno 200 µL cDNA koja je

pohranjena na -20°C, a potom korištena za kvantitativni RT-PCR.

3.4. Kvantitativna PCR reakcija u stvarnom vremenu (qRT-PCR)

Kvantitativna PCR reakcija u stvarnom vremenu (qRT-PCR, od engl. Real-time PCR) je

korištena za kvantifikaciju ekspresije gena. Za reakciju je pripremljena mješavina za

svaki uzorak na ledu: Sybr Green master mix (10,0µL), početnice (svaka po 1,0µL) te

po 3µL cDNA i 3µL vode što čini volumen od 15µL (Tablice 3 i 4). Uzorci su potom

inkubirani na programu 50°C/2min, 95°C/10min, 95°C/15sek, 60°C/1min (40 ciklusa),

95°C/15sek, 60°C/1 min, 95°C/15sek, 60°C/15sek. Koristili smo uređaj 7500 Real Time

PCR System.

Tablica 3. Materijali za kvantitativnu PCR reakciju u stvarnom vremenu (qRT-PCR)

Reagens Proizvođač

Sybr Green PCR master mix Applied Biosystems, Velika Britanija

Početnice (engl. primers)

18

Tablica 4. Početnice za kvantitativnu PCR reakciju u stvarnom vremenu (qRT-PCR)

Početnice Sekvenca

h-RNASEH2A

FORWARD: 5-'GCT GTCTCC AAA CCT CAT CTC-3'

REVERSE: 5'-CCT ACG GTG TCC ACG AAT AC-3'

h-RPS 23 FORWARD: 5΄-TGG AGG TGC TTC TCA TGC AA-3΄

REWERSE: 5΄-AAT GGC AGA ATT TGG CTG TTT G-3΄

Tablica 5. Uređaji korišteni u postupku izolacije RNA, sinteze cDNA i qRT-PCR-a

Uređaji Proizvođač

Tissue pulverizer, 10 to 100 mg tissue

capacity (59012N)

Cole-Parmer, SAD

7500 real Time PCR System Applied Biosystems, Velika Britanija

NanoDrop 1000 Spectrofotometar ThermoScientific, SAD

Arktik Thermal Cycler ThermoScientific, SAD

3.5. Test efikasnosti primera (engl. Primer efficiency test)

3.5.1. Standardna krivulja efikasnosti početnica RNazeH2A

Za izradu standardne krivulje efikasnosti korištena su serijska razrjeđenja 1:10 u

rasponu od 107 na predlošku prethodno umnoženom klasičnim PCR-om i upotrebom

početnica za RNazeH2A. Amplifikacijska krivulja prikazana je na Slici 8.

19

Slika 8. Amplifikacijska krivulja efikasnosti početnica gena RNazaH2A. Krivulja

prikazuje Ct vrijednost svakog od serijskih razrjeđenja.

Za izradu standardne krivulje efikasnosti početnice, Ct vrijednosti različitih razrjeđenja

prikazane su u odnosu na razrjeđenje, te je određen pravac linearne regresije kroz točke

(Slika 9.). Efikasnost početnica (E) izračunava se iz koeficijenta smjera pravca linearne

regresije (A) prema formuli:

E = 10(-1/A)

U idealnom slučaju 100% efikasnosti početnica kod serijskih razrjeđenja 1:10,

koeficijent smjera pravca linearne regresije (A) iznosi -3.32. U slučaju RNazeH2A

početnica, koeficijent smjera pravca linearne regresije (A) iznosi – 3.44 (Slika 9), a

pripadna efikasnost početnica (E) jest 95%.

20

Slika 9. Standardna krivulja efikasnosti

početnica za RNazuH2A. Graf označava

pripadne Ct vrijednosti različitih

razrjeđenja predloška kroz koje je

provučen pravac linearne regresije.

Slika 10. Disocijacijska krivulja

početnica za RNazuH2A.

Krivulja disocijacije početnica (Slika 10.) prikazuje specifičnu hibridizaciju početnica i

predloška. Točka disocijacije nalazi se na 73°C. U svrhu dodatnog utvrđivanja

specifičnosti početnica, produkt amplifikacije s početnicama RNazeH2A analiziran je

na agaroznom gelu (Slika 11.), gdje se vidi specifičan produkt od 147 parova baza koji

odgovara veličini očekivanog produkta za RNazaH2A početnice.

Slika 11. Prikaz pet amplifikacijskih produkata RNazeH2A početnica na agaroznom

gelu vizualiziranim etidijevim bromidom.

21

3.6. Obrada podataka

Rezultati dobiveni pomoću qRT-PCR-a predstavljaju Ct vrijednosti (engl. cycle

treshold) koje definiraju ciklus u kojem fluorescentni signal prelazi zadani prag

detekcije. Ct-vrijednost je obrnuto proporcionalna ekspresiji ciljnog gena u uzorku. U

ovom istraživanju mjerene su relativne promjene ekspresije gena RNazeH2A u

tumorskom i zdravom tkivu istog pacijenta, a kao endogena kontrola za kvantifikaciju

korišten je gen RPS 23. Svi uzorci rađeni su u duplikatima. Srednja Ct vrijednost

ciljnog i kontrolnog gena ispitivanog uzorka uspoređena je neparametrijskim

Wilcoxonovim t-testom izračunatih relativnih vrijednosti promjena ciljnog gena u

odnosu na kontrolni gen, za tumorsko i zdravo tkivo (prema formuli 2 (Ct kontrole - Ct ciljanog

gena)). Nakon toga izračunat je omjer relativnih vrijednosti za tumorsko tkivo / relativne

vrijednosti za zdravo tkivo i dobivena promjena (porast ili pad) ekspresije ciljnog gena

u tumorskom tkivu. Omjer > 2 smatran je porastom ekspresije RNazeH2A. Isto tako, u

skupinu s porastom ekspresije svrstani su uzorci kod kojih je Ct-vrijednost RNazeH2A

u zdravom tkivu bila ispod praga detekcije, dok je Ct-vrijednost RNazeH2A u

tumorskom tkivu bila unutar detekcijskog praga. Napravljen je i Hi-kvadrat test kako bi

se utvrdila promjena ekspresije RNazeH2A gena u tumorskom u odnosu na zdravo

tkivo istog pacijenta. Vrijednost od p <0.05 smatrana je statistički značajnom. Izračun

relativnih promjena grupiran je prema stupnju, invazivnosti, gradusu, spolu, dobi i broju

tumora pomoću Kruskal–Wallis jednosmjerne analize varijanci. Izračun relativnih

promjena rađen je u programu Microsoft Office Excel 2007.

22

4. REZULTATI

23

Omjer relativnih vrijednosti promjena Ct-vrijednosti gena za RNazuH2A u odnosu na

kontrolni gen (RPS 23) za tumorsko i zdravo tkivo veća od 2 smatrana je povećanom

ekspresijom RNazeH2A. Gen za RNazuH2A pojačano je eksprimiran u uzorcima

urotelnih tumora mokraćnog mjehura. Povećana ekspresija gena za RNazuH2A u

tumorskom tkivu u odnosu na zdravo tkivo kod istog pacijenta uočena je kod 29/36

parova uzoraka, smanjenje ekspresije uočeno je kod 2/36 uzoraka, a 5/36 parova

uzoraka nije pokazalo nikakve promjene (Slika 12.).

Slika 12. Promjena ekspresije gena za RNazuH2A u tumorskom tkivu u odnosu na

zdravo tkivo kod istog pacijenta. Značajan broj pacijenata ima povećanu ekspresiju

RNazeH2A u tumorskom tkivu. Hi-kvadrat test pokazuje razinu značajnosti P<0.0001.

Nadalje, uzorci su grupirani prema omjeru relativnih vrijednosti promjena Ct-

vrijednosti gena za RNazuH2A u odnosu na kontrolni gen za tumorsko i zdravo tkivo, a

što je prikazano na Slici 13.

Slika 13. Učestalosti pojavljivanja uzoraka s obzirom na omjer relativnih vrijednosti

promjena Ct-vrijednosti gena za RNazuH2A u odnosu na gen za RPS 23 za tumorsko i

zdravo tkivo

0

5

10

15

20

25

30

35

POVEĆANJE SMANJENJE BEZ PROMJENE

BROJ PACIJENATA

0

2

4

6

8

Uče

stal

ost

po

javl

jivan

ja

Relativni porast izražaja RNazeH2A u tumorima

24

Povećana ekspresija RNazeH2A nije dovedena u svezu s dobi pacijenata (P=0.5954),

spolom (P=0.6621), invazivnosti tumora (P=0.3931), stadijem tumora (P=0.8396) kao

ni s brojem tumora (P=0.7511). Kruskal-Wallis t-testom nađena je značajna korelacija

povećane ekspresije RNazeH2A i gradusa tumora mokraćnog mjehura (P=0.0428)

(Tablica 6).

Tablica 6. Prikaz povezanosti varijabli (dobi, spola, invazivnosti, gradusa, stadija, broja

tumora) i povećane ekspresije gena za RNazuH2A u urotelnim tumorima mokraćnog

mjehura.

DOB (god) SPOL INVAZIVNOST GRADUS STADIJ BROJ

TUMORA

35-

65

N=11

65-89

N=25

M

N=7

Ž

N=29

Neinv.

N=20

Inv.

N=16

Niski

N=16

Visoki

N=20

Ta

N=20

T1

N=9

T2

N=6

T4

N=1

1

N=18

>1

N=18

P = 0,5954 P = 0,6621 P = 0,3931 P = 0,0428 P = 0,8396 P = 0,7511

Amplifikacijski produkti qRT-PCR reakcije četiri para uzoraka (tumorsko i zdravo

tkivo) korišteni su u gel elektroforezi za vizualizaciju ekspresiju ciljnog gena. Dobiveni

specifični produkti veličine su 147 parova baza koji odgovara veličini očekivanog

produkta za RNazaH2A početnice (Slika 14.).

Slika 14. Četiri primjerna amplifikacijska produkta uzorka tumorskog i zdravog tkiva

istog pacijenta na agaroznom gelu bojanom etidijevim bromidom.

25

5. RASPRAVA

26

Rezultati istraživanja u kojem smo analizirali razlike u ekspresiji gena za RNazuH2A u

tumorskom tkivu u odnosu na zdravo tkivo, pokazali su da je RNazaH2A statistički

značajno više eksprimirana na razini gena kod urotelnih tumora mokraćnog mjehura u

odnosu na zdravo tkivo (P< 0,0001).

U posljednjih desetak godina identificirani su brojni biomarkeri tumora mokraćnog

mjehura, uključujući razne tumor supresorske gene, onkogene, čimbenike rasta,

hormonske receptore, markere proliferacije i apoptoze, onkoproteine itd. Nekoliko

signalnih puteova, poput p53, pRb, PTEN i njihovih interakcijskih proteina, opisani su

u posredovanju razvoja invazivnog karcinoma mokraćnog mjehura (12,13). Ograničene

vrijednosti tih prognostičkih biljega pridonose potrebi analiziranja novih molekularnih

parametara koji bi se koristili u klinici za otkrivanje i praćenje bolesti. Kompleks

RNazeH2A ima ključnu ulogu u metabolizmu nukleinskih kiselina, prevenciji

imunoreakcije najvjerojatnije posredovanjem u isijecanju pojedinačnih ribonukleotida

iz RNA/DNA dupleksa kao i u uklanjanju zaostalog lanca Okazakijevih fragmenata

tijekom replikacije DNA, u uklanjanju pogrešno umetnutih ribonukleotida DNA

polimerazom i u eliminaciji RNA/DNA hibrida tijekom stanične smrti (17). Velike

preraspodjele kromosoma ( GCRs ), poput translokacija, delecija, amplifikacija i

aneuploidija, često su prisutni kod različitih tipova humanih tumora, te je jasno da su

jako važne u karcinogenezi, ali molekularni mehanizmi nastajanja i kontrole

preraspodjele kromosoma slabo su poznati. Nestabilnost genoma je karakteristika svih

karcinomskih progresija, uključujući i rak mokraćnog mjehura (20). Ipak, mnoga

istraživanja pokazuju da genomska nestabilnost proizlazi iz dvolančanih lomova DNA.

Uspjeh novih terapeutskih strategija za rak temelji se na identifikaciji ključnih točaka

(u smislu molekule) u onkogenim signalnim putevima. Stanice raka podliježu velikim

adaptacijama u svojim signalnim i metaboličkim procesima i mogu postati ovisne o

pojedinim genima koji nisu sami po sebi onkogeni, ali njihova aktivnost može

ograničavati brzinu razvoja stanica raka. Vjeruje se da inhibicija tih ključnih čimbenika

unutar signalne mreže inducira pogreške u signaliziranju malignog puta, a time i

suzbijanje malignog procesa (22). Kao enzim u funkcionalno jedinstvenom putu

povezanom s agresivnim rakom, RNazaH2A predstavlja idealnu metu za liječenje raka i

nedavni bioinformatički probir stvrstao je RNazuH2A među 2% gena koji bi mogli biti

vrlo uspješne mete za antitumorske lijekove (23). Rezultati ovog istraživanja koji

27

pokazuju da urotelni tumori mokraćnog mjehura pojačano eksprimiraju RNazuH2A

svakako potvrđuju tu hipotezu.

Genska ekspresija RNazeH2A ne ovisi o spolu i dobi pacijenata s urotelnim tumorom

mokraćnog mjehura (P=0,6621 i P=0,5954). Također, nisu pronađene statistički

značajne korelacije porasta genske ekspresije RNazeH2A i invazivnosti tumora

mokraćnog mjehura (koja ukazuje na povećanu mogućnost stvaranja metastaza)

(P=0,3931), stadija (P=0,8396), te broj tumora (P=0,7511). Statistički značajna

korelacija pronađena je samo kod povećane ekspresije RNazeH2A i gradusa tumora

(koji upućuje na stupanj agresivnosti tumora) (P=0,0428).

Buduća istraživanja trebala bi uključiti veći broj uzoraka tumora mokraćnog mjehura u

kojima bi se odredila ekspresija gena za RNazuH2A metodom PCR reakcije u stvarnom

vremenu, kao i drugim pokusima koji bi na proteinskoj razini potvrdili naše rezultate.

28

6. ZAKLJUČCI

29

Genski izražaj RNazeH2A značajno je povećana u urotelnim tumorima

mokraćnog mjehura u odnosu na zdravo tkivo.

Povećana genska ekspresija RNazeH2A ne korelira sa spolom i dobi pacijenata s

urotelnim tumorom mokraćnog mjehura, kao ni s invazivnošću i brojem tumora.

Povećana genska ekspresija RNazeH2A značajno korelira s povećanjem gradusa

urotelnog tumora mokraćnog mjehura.

30

7. SAŽETAK

31

Cilj istraživanja: otkriti postoji li značajna razlika u izražaju gena RNazeH2A u

tumorskom tkivu mokraćnoga mjehura u odnosu na zdravo tkivo istog pacijenta, te

prikazati moguću povezanost izražaja RNazeH2A sa stadijem, gradusom, invazivnošću,

brojem tumora, spolom i dobi.

Metode: Na prikupljenim uzorcima provedena je izolacija RNA iz tkiva, nakon čega je

RNA reverznom transkripcijom prevedena u cDNA koja je služila kao predložak za

qRT-PCR. Elektroforezom na agaroznom gelu potvrđena je specifičnost početnica.

Rezultati: Rezultati ovog rada pokazuju da RNazaH2A ima pojačan izražaj u 29 od 36

urotelnih tumora mokraćnog mjehura u odnosu na zdravo tkivo istog pacijenta

(P<0,0001), te pokazuje pozitivnu korelaciju s gradusom tumora (P=0,0428), dok s dobi

i spolom pacijenata, te stadijem, invazivnošću i brojem tumora nema korelacije.

Zaključci: Genski izražaj RNazeH2A značajno je povećan u urotelnim tumorima

mokraćnog mjehura u odnosu na zdravo tkivo i ne korelira sa spolom, dobi,

invazivnošću ni brojem tumora pacijenata s urotelnim tumorom mokraćnog mjehura,

međutim značajno korelira s povećanjem gradusa urotelnog tumora mokraćnog

mjehura. Rezultati ovog rada ukazuju na veliki potencijal RNazeH2A kao biomarkera u

dijagnozi urotelnih tumora mokraćnog mjehura, kao i ciljne molekule u liječenju ove

bolesti.

32

8. SUMMARY

33

Aims: To determine if there is a significant difference in the RNaseH2A expression

between urothelial tumor and healthy tissue of urinary bladder and to show possible

association between RNaseH2A expression and stage, grade, invasiveness, tumor

multiplicity, gender and age.

Methods: RNA was isolated from tissues samples and then converted into cDNA by

reverse transcription. cDNA was used as a template for qRT-PCR. Specificity of the

amplification reaction was verified by agarose gel electrophoresis.

Results: We found that RNaseH2A is over-expressed in 29 of 36 urothelial bladder

tumors (P<0,0001). Moreover, RNaseH2A over-expression correlates with tumor grade

(P=0,0428), whereas no association was found in correlation with age, gender, stage,

invasiveness and tumor multiplicity.

Conclusions: RNaseH2A gene expression was significantly increased in the urothelial

bladder tumors compared to normal tissue, and does not correlate with gender, age, or

number of invasive tumors, but significantly correlates with grade increase of urothelial

bladder tumors. Results of this study indicate a great potential of RNaseH2A as a

biomarker in the diagnosis of urothelial bladder tumors, as well as a target molecule for

the treatment of this disease.

34

9. ŽIVOTOPIS

35

SANDRA VUJEVIĆ

Datum rođenja: 31.10.1974.

Adresa: Put Glavice 14, 21212 Split

Državljanstvo: Republike Hrvatske

e-mail: sandra.vujevic@mefst.hr

Obrazovanje:

1989. – 1993. Zdravstveni obrazovni centar Split, smjer: zdravstveni tehničar-

laborant

2011. – 2014. Sveučilište u Splitu, Odjel zdravstvenih studija, smjer: medicinsko

laboratorijska dijagnostika (preddiplomski sveučilišni studijski program)

Radno iskustvo:

1995.-1997. Laboratorijski tehničar u Domu zdravlja- Brodosplit u Splitu

1998.- 1999. Laboratorijski tehničar u Domu zdravlja Željezničara u Splitu

2001. Laboratorijski tehničar u Privatnoj spec. Ambulanti Primarijusa Mr.sc.dr.

B. Pivalice u Splitu

2002.-2003. Laboratorijski tehničar u Mikrobiološkom laboratoriju spec.dr.sc.

Ozrena Budimira u Splitu

2008. Laboratorijski tehničar u Poliklinici za dječje bolesti- Badem u Splitu

2008-2014. Laboratorijski tehničar na Medicinskom fakultetu, Sveučilišta u

Splitu

Sudjelovanja:

Na projektu Uloga upalnih procesa u nastanku malignnih bolesti MZOŠ pod

voditeljstvom prof.dr.sc.Janoša Terzića

36

10. LITERATURA

37

1. Wein JA. Campbell-Walsh Urology. 9. izdanje. Philadelphia: Saunders, 2007.

2. Sobin LH, Wittekind C. UICC: TNM Classification of Malignant Tumors. 6.

izdanje. New York: Wiley, 2002.

3. Mikuz G. Clinical Pathology of Urogenital Tumors. London: Informa Healthcare,

2007.

4. Babjuk M, Oosterlinck W, Sylvester R, Kaasinen E, et al. EAU Guidelines on non-

muscle invasive urothelial carcinomaof the bladder. Eur Urol 2008;54:303-14.

5. Walsh PC. Campbell's Urology. 6.izdanje, Philadelphia: Saunders, 1992.

6. Hayat MJ, Howlander N, Reichman ME, Edwards BK. Cancer statistics, trends and

multiple primary cancer analyses from the Surveillance, Epidemiology and End

Results (SEER) Program. Oncologist 2007;12:20-37.

7. Pelucchi C, Bosetti C, Negri E, Malvezi M, et al. Mechanisms of disease: The

epidemiology of bladder cancer. Nat Clin Pract Urool 2006;3:327-40.

8. Kiemeney LA, Moret NC, Witjes JA, Schonberg MP, et al. Familial transitional

cell carcinoma among the population of Iceland. J Urol 1997;157:1649-51.

9. Medicina.hr Karcinom mokraćnog mjehura; pristupljeno 02.06.2014.

http://www.medicina.hr/clanci/karcinom_mokracnog_mjehura.htm

10. Heney N. M. Natural history of superficial bladder cancer. Prognostic features and

long-term disease course. Urol Clin North Am 1992;19:429-433.

11. Edge S. B., Byrd D. R., Compton C. C., Fritz A. G., et al. AJCC Cancer Staging

Manual 7th ed. New York. NY Springer:.

12. Cairns P, Proctor AJ, Knowles MA. Loss of heterozygosity at the RB locus is

frequent and correlates with muscle invasion in bladder carcinoma. Oncogene.

1991;6:2305-9.

13. Puzio-Kuter AM, Castillo-Martin M, Kinkade CW, Wang X, Shen TH,Matos T, et

al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes &

evelopment. 2009;23:675-80.

14. He F, Mo L, Zheng XY, Hu C, Lepor H, Lee EY, et al. Deficiency of pRb family

proteins and p53 in invasive urothelial tumorigenesis. Cancer Res. 2009;69:9413-

21.

15. Schmitt TJ, Clark JE, Knotts TA. "Thermal and mechanical multistate folding of

ribonuclease H". J Chem Phys. 2009;131:235101-1-235101-9. Schultz SJ,

38

Champoux JJ. "RNase H activity: structure, specificity, and function in reverse

transcription". Virus Res.-2008;134:86–103.

16. Bubeck D, Reijns MA, Graham SC, Astell KR, et al. PCNA directs type 2 RNase H

activity on DNA replication and repair substrates. Nucleic Acids Res.

2011;39:3652-66.

17. Cheng L, Davison DD, Adams J, Lopez-Beltran A, et al. Biomarkers in bladder

cancer: Translational and clinical implications. Critical reviews in

oncology/hematology. 2014;89:73-111.-

18. Motegi A, Myung K. Measuring the rate of gross chromosomal rearrangements in

Saccharomyces cerevisiae: A practical approach to study genomic rearrangements

observed in cancer. Methods. 2007;41:168-76.

19. Palmeira C, Lameiras C, Amaro T, Lima L, et al. CIS is a surrogate marker of

genetic instability and field carcinogenesis in the urothelial mucosa. Urologic

oncology. 2011;29:205-11.

20. Wahba L, Amon JD, Koshland D, Vuica-Ross M. RNase H and multiple RNA

biogenesis factors cooperate to prevent RNA:DNA hybrids from generating

genome instability. Mol Cell. 201144:978-88.

21. Hoelbl A, Schuster C, Kovacic B, Zhu B, et al. Stat5 is indispensable for the

maintenance of bcr/abl positive leukaemie. EMBO molecular medicine. 2010;2:98-

110.

22. Mayburd AL, Golovscihova I, Mulshine JL, Successful anti-cancer drug targets

able to pass FDA rewiev demonstrate to identifiable signature distinct from the

signature distinct from the signatures of random genes and initially proposed

targets. Bioinformatics 2008;24:389-95.