Click here to load reader

r;o..;;z;!;;poznania zakażenia - · PDF fileStr. 6 Borelioza z Lyme, laboratoryjne metody rozpoznania zakażenia. Polega ona na oznaczeniu w pierwszym etapie poziomu przeciwciał

  • View
    213

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of r;o..;;z;!;;poznania zakażenia - · PDF fileStr. 6 Borelioza z Lyme, laboratoryjne metody...

  • ) r Borelioza z Lyme, laboratoryjne metody'-~ ...;r...;o..;;z;!;;poznania zakaenia

    )Borelioza z Lyme, laboratoryjne metody rozpoznania zakaeniaTomasz Chmielewski, Stanisawa Tylewska- Wierzbanowska,Samodzielna Pracownia Riketsji, Chlamydii i Krtkw OdzwierzcychPastwowy Zakad Higieny, Warszawa

    Borelioza z Lyme jest najczciej wystpujc na wiecie chorobzakan, przenoszon przez kleszcze. Zakaenie to ma charakterwieloukadowy, w ktrym mona wyodrbni kolejne stadia. Wpocztkowym okresie, we wczesnej fazie (I stadium), po kilku dniach lubtygodniach od chwili zakaenia, pojawia si rumie wdrujcy, ktremumog towarzyszy objawy grypopodobne.Nastpnie dochodzi do zakaenia wielu narzdw i ukadw (II stadium);pojawiaj si dolegliwoci ze strony orodkowego lub obwodowegoukadu nerwowego, ukadu kostno-stawowego lub ukadu krenia.Pna borelioza z Lyme charakteryzuje si nieodwracalnymi zmianamistawowymi, uszkodzeniem ukadu nerwowego w postaci encefalopatiilub uszkodzeniem nerww czaszkowych, obwodowych, a takeprzewlekym zanikowym zapaleniem skry. Wielopostaciowochoroby wymaga diagnostyki rnicowej i czsto sprawia trudnoci wprawidowym rozpoznaniu.Dla uatwienia identyfikacji zakae jak i dla celw epidemiologicznychwprowadzono definicj przypadku boreliozy z Lyme. Pierwsz definicjsformuowano w 1991 roku w USA. Obejmowaa ona chorych zrumieniem wdrujcym oraz chorych z co najmniej jednym objawemboreliozy pnej i potwierdzeniem rozpoznania klinicznego badaniemlaboratoryj nym [l). Europej ska definicj a wprowadzona w 1996 roku jestszersza ni amerykaska ze wzgldu na wystpowanie w Europie, conajmniej trzech chorobotwrczych dla czowieka genogatunkw B.burgdorferi sensu lato, tj. B. burgdorferi sensu stricto, B. garini oraz B.afzeli i zwizane z tym wiksze zrnicowanie objaww choroby [18).W Europie najczciej wystpuj B. garini i B. afzeli, podczas gdy B.burgdorferi sensu stricto znacznie rzadziej i zwykle w Europiewschodniej. Zrnicowanie szczepw wywoujcych zakaenia nanaszym kontynencie musz by brane pod uwag przy opracowywaniunowych testw diagnostycznych, jak PCR oraz antygenwdiagnostycznych do bada serologicznych. Jest to bardzo waneponiewa w ostatnim czasie wykryto w Europie kolejne, nowechorobotwrcze genogatunki, B. valaisiana iB. spielmanii.

    Antygeny Borrelia burgdorferi sensu lato w diagnostyce zakaeniaSwoiste dla B. burgdorferi biaka, ktre mog by wykorzystane jakoantygeny diagnostyczne charakteryzuj si znaczn heterogennoci.Wystpujce w Europie trzy chorobotwrcze dla czowieka genogatunkii jeden w Ameryce Pn mona podzieli na przynajmniej siedemserotypw, biorc pod uwag jedynie zrnicowanie wystpujcych napowierzchni komrki swoistych biaek OspA. Odpowiadaj onepodziaowi na genogatunki: B. burgdorferi sensu stricto - serotyp 1, B.afzeli - serotyp 2, B. garini - serotypy od 3 do 7 [23].W przypadku biaka OspC, na podstawie rnic w sekwencjiaminokwasw, wyodrbniono dotychczas 4 serotypy krtkw [24). Jestto biako wysoce immunogenne, odpowiedzialne przede wszystkim zawczesn odpowied humoraln.Jednym z najbardziej immunogennych biaek w komrce B. burgdorferijest flagelina, biako wchodzce w skad wici. Wywouje ono siln iwczesn odpowied humoraln. Biako to w pocztkowym i kocowymodcinku acucha, wykazuje wysoki stopie homologii z sekwencjaminokwasw flageliny Bacillus subtilis (65%) i SalmonellaTyphimurium (56%) [20]. Epitopy charakterystyczne dla gatunku B.burgdorferi zlokalizowane s tylko midzy 129 a 251 aminokwasem.Kocowa sekwencja tego polipeptydu wykazuje a 80% homologii zbiakiem flagelinyT. pallidum [5).Obecnie w diagnostyce wykorzystywane s take wysocekonserwatywne, a jednoczenie immunogenne epitopy w heterogennychbiakach wytwarzanych in vivo, jak np. peptyd C6 w biaku VlsE czyanalog biaka DbpA(p17).Podstaw rozpoznania boreliozy z Lyme jest obecno okrelonychobjaww klinicznych, potwierdzonych badaniem laboratoryjnym,wykrywajcym swoiste przeciwciaa klasy IgM i/lub IgG dla antygenwB. burgdorferi.

    Metody diagnostycznePrawidowe rozpoznanie boreliozy z Lyme zaley od odpowiednio

    dobranych metod i antygenw diagnostycznych, nastpnie odprawidowej interpretacji wynikw.

    Powszechnie stosowane testy ELISA s czue, proste w wykonaniu,gwarantuj szybkie uzyskanie wyniku nie podlegajcego subiektywnymocenom badacza. Niestety ich niska swoisto, wynoszca 29-71 % wzalenoci od zastosowanego antygenu [11], moe prowadzi dobdnych rozpozna.

    Stosowane testy diagnostyczne do wykrywania boreliozy z Lymerni si midzy sob antygenem diagnostycznym. W testach pierwszejgeneracji bya to caa komrka bakteryjna, stosowana w metodachirnrnunoenzymatycznych w formie sonikatu lub caa, nienaruszonakomrka w odczynie immunofluorescencji. Ze wzgldu na bardzo maswoisto, praktycznie testy tej grupy nie sju stosowane.

    Zestawy diagnostyczne ELISA stosowane w badaniachprzesiewowych powinny nalee przynajmniej do drugiej generacji,poniewa w grupie tej zostaa udoskonalona swoisto i w duym stopniuzostay ograniczone krzyowe reakcje. Do tej grupy nale testy, wktrych albo antygenem diagnostycznym s izolowane frakcje biaekalbo stosowana jest wstpna absorbcja krtkami Reitera. Szczepyuywane do produkcji antygenu musz wytwarza biako OspCumoliwiajce wykrycie swoistej odpowiedzi w klasie IgM oraz DbpA(decorin binding protein A, dawniej p17), bdce dominujcymantygenem w odpowiedzi IgG.

    W najnowszej, trzeciej generacji testw, jako antygenydiagnostyczne stosowane s rekombinowane biaka. Dotychczasotrzymano i sprawdzono pod wzgldem przydatnoci w diagnostycebore1iozy z Lyme, biaka p831100 (wskanik pnej fazy choroby), p41(flagelina, p4l int (wewntrzna cz czsteczki flageliny o masie 14 000,nie reagujca krzyowo z flagelin innych gatunkw bakteryjnych),biaka bony zewntrznej OspA i OspC i p39. Ostatnie badania wskazuj,e dziki uzupenieniu antygenu diagnostycznego o rekombinowanebiaka DbpA (P17) i p58, a take p14, p30, p43 mona uzyska wikszczuo testu. Ostatnio z powodzeniem w Stanach Zjednoczonychwprowadzono rekombinowany swoisty antygen VlsE i pochodzcy zniego syntetyczny peptyd C6. Przydatno tych antygenw zdaj sipotwierdza badania surowic pochodzcych od europejskich chorych zrumieniem wdrujcym, ACA i zapaleniem staww. Jednoczeniejednak zwraca si uwag na konieczno ostronego przenoszeniawynikw bada z USA do Europy ze wzgldu na wystpujce tuzrnicowanie genogatunkw i heterogenno immunodominujcychepitopw antygenu VlsE [6).

    W kadym przypadku, powinny by oznaczone przeciwciaaobu klas. Uzyskanie ujemnego wyniku badania serologicznego wewczesnej fazie zakaenia nie przesdza o rozpoznaniu. Zalecane jestpowtrzenie badania z now prbk surowicy po upywie 4 tygodni odwystpienia pierwszych objaww choroby.

    Naley take pamita, e swoiste przeciwciaa wykrywane s takeu osb zdrowych, co moe wiadczy o bezobjawowym przebieguchoroby. W zalenoci od stopnia naraenia na kontakt z kleszczamiodsetek osb z przeciwciaami wynosi od 12% w normalnej populacji(krwiodawcy) do okoo 40% w grupach ryzyka np. wrd lenikw [3,4].Obecno samych przeciwcia, bez objaww zakaenia, nie moe bywskazaniem do leczenia.

    W 2000 roku opublikowano, opracowane przez midzynarodowgrup ekspertw, zalecenia dotyczce prawidowej diagnostykilaboratoryjnej boreliozy z Lyme (angielska wersja ,,MiQ 12 LymeBorreliose" dostpna w internecie na stronie:http://www.dghm.org/red/index).

    Ze wzgldu na liczne nie swoiste reakcje krzyowe i faszywiedodatnie wyniki, ktrych nie mona byo wyeliminowa w powszechniestosowanych testach ELISA, mimo wprowadzania rnych antygenwdiagnostycznych (sonikat caej komrki, izolowane biaka, antygenyrekombinowane), zalecana jest obecnie dwustopniowa diagnostykaserologiczna.

  • Str. 6 Borelioza z Lyme, laboratoryjne metodyrozpoznania zakaenia

    . Polega ona na oznaczeniu w pierwszym etapie poziomuprzeciwcia pilociowymi testami ELISA o wysokiej czuoci.Nastpnie, prbki surowic, z ktrymi uzyskano wynik dodatni lubwtpliwie dodatni s badane jakociow metod Western-blot o wysokiejswoistoci, w celu weryfikacji wczeniejszych rezultatw. Interpretacjawynikw bada ELISA i Western-blot odbywa si wedug cileustalonych kryteriw.

    Western-botJako test potwierdzajcy Western blot powinien charakteryzowa siwysok, nie mniejsz ni 95% swoistoci.Pierwsze kryteria oceny wyniku badania metod Western-bot ustalonezostay przez Center for Disease Controi and Prevention (CDq wAtlancie, USA. Interpretacja uzyskanych wynikw zgodnie z tymikryteriami jest czsto zalecana przez producentw testw i nie rzadkoautomatycznie stosowana na kontynencie europejskim. Moe toprowadzi do bdw w rozpoznaniu.Opracowanie kryteriw oceny wynikw bada metod Westm-blotprzeprowadzonych u chorych z terenu Europy jest bardziej zoone zewzgldu na wystpowanie kilku genogatunkw chorobotwrczych naobszarze tego kontynentu.Analiza wystpowania przeciwcia przeprowadzona w ramach programuEUCALB, wykazaa przydatno nastpujcych 8 antygenw wdiagnostyce zakae B. burgdorferi sensu lato: OspC i p41 dla IgM orazp83/100, p58, p41, p39, OspC, ObpA (P17) dla IgG, jakkolwiekwykazano zrnicowane ich znaczenie. Stwierdzono, bowiem e czuoi swoisto metody zalena jest od genogatunku szczepu uytego jakoantygen diagnostyczny. Wanym elementem jest zastosowanie kryteriwuwzgldniajcych odpowied immunologiczn na antygeny szczepwnajczciej wystpujcych na danym terenie. Ponadto, przyjtainterpretacja wynikw powinna by rwnie powizana zcharakterystyk objaww klinicznych stwierdzanych na danym terenie[13].Aby poprawnie zinterpretowa wynik badania, potrzebnajest informacjana temat czasu trwania choroby, z ktrym cile zwizane jest pojawieniesi przeciwcia dla okrelonych antygenw. We wczesnej boreliozieznaczenie ma intensywno przynajmniej dwch frakcji biakowych(p41 i OspC) i w zwizku z tym konieczne jest stosowanie odpowiednichkontroli wewntrznych, aby oceni badanie pi lociowo.Dostpne s testy, w ktrych rozdziaowi poddano albo lizat caejkomrki albo wyselekcjonowane biaka B. burgdoferi produkowaneprzez komrki E. col i w wyniku manipulacj i genetycznych.Zalet lizatu caej komrki jest moliwo wykrycia wikszej liczbyimmun

Search related