Nowiny Lekarskie 2008, 77, 6, 407–411

ANNA ZALEWSKA, ZENON J. KOKOT

REOLOGICZNA ANALIZA FIZYCZNYCH WŁAŚCIWOŚCI KWASU HIALURONOWEGO

RHEOLOGICAL ANALYSIS OF THE PHYSIACAL PROPERTIES OF HYALURONIC ACID

Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu

Kierownik: prof. dr hab. Zenon J. Kokot

Streszczenie

Wstęp. Kwas hialuronowy jest naturalnym polisacharydem, wchodzącym w skład płynu synowialnego. Jego właściwości reologicz-ne pochodzą od jego struktury i budowy (długie łańcuchy). Cel. Cel pracy stanowiła analiza reologiczna wodnych roztworów kwasu hialuronowego. Materiał i metodyka. Przeprowadzono analizę właściwości reologicznych kwasu hialuronowego. Jego charakterystykę opisano, korzystając również z matematycznego modelu Szulmana. Wyniki. Analizowane związki kwasu hialuronowego w roztworach wodnych wykazują właściwości nienewtonowskie, pseudopla-styczne, posiadają charakter cieczy rozrzedzonych ścinaniem. Wnioski. Badanie właściwości reologicznych kwasu hialuronowego za pomocą matematycznych modeli stwarza możliwość jego kompleksowej charakterystyki, co jest ważnym czynnikiem w prognozowaniu procesów chorobowych.

SŁOWA KLUCZOWE: ciecze nienewtonowskie, krzywe płynięcia, modele reologiczne.

Summary

Introduction. Hyaluronic acid HA is a natural polysacharide. It plays an important role as a component of the synowial fluid. Its rheological properties originate from its structure. Aim. Rheological analysis of the hyaluronic acid. Material and method. In order to fully use the experimental data of the HA the system was described by mathematical models such as Szulman model. Results. It was concluded that the tested solution of HA, shows properties of non-Newtonian and pseudoplastic fluids. Conclusions. It was found that Szulman model can be treated as good approximations of the real flow of the HA. The knowledge of the rheological parameters has considerable importance in medical analysis of the hyaluronic acid especially in prognosis of the human disease.

KEY WORDS: non-Newtonian fluid, flow curve, rheological model.

Wstęp Reologia farmaceutyczna jak i medyczna, jako nauka

stosowana, musi adaptować dla swoich celów osiągnięcia reologii teoretycznej, formułowanej z punktu widzenia mechaniki ośrodków ciągłych i to zarówno w części meto-dologicznej, jak również wykorzystywanych terminów.

Przez ponad sześćdziesiąt lat rozwoju reologii, za-równo jej zakres tematyczny, jak również dyscyplin naukowych z nią związanych znacznie się rozszerzył. Obecnie przyjmuje się, że jest to nauka interdyscyplinar-na, zajmująca się różnymi aspektami odkształcania ciał rzeczywistych pod wpływem naprężeń zewnętrznych.

Rozwój reologii medycznej, jak i farmaceutycznej na-stąpił głównie wraz z badaniami nad związkami wielkoczą-steczkowymi, wykazującymi złożone właściwości przy opisie których nieprzydatne okazują się parametry stosowa-ne w przypadku roztworów małocząsteczkowych.

Reologia zajmuje się zachowaniem substancji, które w trakcie odkształcania wykazują więcej niż jedną podsta-wową właściwość reologiczną, taką jak sprężystość lub lepkość. Opisuje więc zjawiska, które występują w bardzo

szerokim zakresie pośrednim między stanem stałym i płyn-nym, rozważanym zupełnie odrębnie w mechanice klasycz-nej [1, 2, 3].

Jest to nauka pozwalająca na analizę płynów ustro-jowych wykazujących cechy cieczy nienewtonowskich np. krew, ślina czy płyn synowialny.

Płyn synowialny jest ważnym składnikiem stawów. To-rebka stawowa zamyka jamę stawową, utrzymuje kości w stawie; często jest wzmocniona więzadłami i stanowi miejsce przyczepu ścięgien. Składa się z dwóch warstw: zewnętrznej – włóknistej i wewnętrznej – maziowej. War-stwa zewnętrzna zbudowana jest z włókien kolagenowych, fibroblastów i fibrocytów.

Błona maziowa wyściela jamę stawową, nie posiada błony podstawnej, tworzy fałdy i kosmki, co zwiększa jej powierzchnię (np. w stawie kolanowym powierzchnia ma 110 cm kwadratowych). Błona maziowa obejmuje dwie warstwy:

→ synowialną (stratum synoviale), czyli wyściółko-wą zbudowaną z 2–3 warstw komórek synowialnych = synoviocyty (owalne komórki z wypustkami, z dużym centralnie umieszczonym jądrem; dzieli się je na komórki

Anna Zalewska, Zenon J. Kokot 408

A = M – fagocyty z licznymi lizosomami oraz komórki B = F przypominające fibroblasty, mają zdolność sekrecji białek i kwasu hialuronowego, z rozbudowanym ER, AG). W stanach zapalnych wzrasta ilość komórek A, czyli M.

→ subsynovialną (podwyściółkową) zbudowaną z ko-mórek łącznotkankowych (fibroblasty, histiocyty, komórki tuczne), włókien kolagenowych i sprężystych zatopionych w substancji podstawowej. Do warstwy podwyściółkowej wnikają naczynia krwionośne i limfatyczne.

Jama stawowa wypełniona jest mazią – synovia (nazwę wprowadził Paracelsus). Maź to przesącz osocza krwi (po-zbawiony fibrynogenu). Kwas hialuronowy łączy się z tym przesączem tworząc maź. W stawie kolanowym występuje do 3,5 ml mazi. Lepkość mazi zapewnia mucyna produko-wana przez synoviocyty; pH mazi wynosi 7,2–7,4. Jest płynem klarownym, bezbarwnym lub słomkowym. Odży-wia chrząstkę (dyfuzja, aktywny transport przez chondrocy-ty i wtłaczanie przez ucisk), zmniejsza tarcie, zapewnia przyleganie powierzchni chrzęstnych. Temperatura w sta-wie kolanowym wynosi 34 stopnie Celsjusza. Gdy staw intensywnie pracuje temperatura podnosi się o 1 stopień. W stanach zapalnych temperatura wzrasta do 37 stopni i więcej. Wysoka temperatura przyspiesza niszczenie włó-kien kolagenowych. Ciśnienie wewnątrz stawu jest niższe (ujemne) od ciśnienia atmosferycznego, dzięki czemu po-wierzchnie stawowe przywierają do siebie. Stany zapalne powodują wzrost ciśnienia i uszkodzenie stawu (bóle, obrzęk, wysięk) [4, 5, 6].

Analiza reologiczna płynu synowialnego jest niezwykle ważna ze względu na jego istotną rolę w procesie porusza-nia się. Jego właściwości zmieniają się w zdrowych sta-wach w trakcie poruszania, jak i w stanach chorobowych. Płyn synowialny składa się w 70% z wody, resztę stanowią białka plazmowe, gama globuliny, albuminy, oraz polisa-charydy, takie jak kwas hialuronowy.

Kwas hialuronowy jest naturalnym polisacharydem, jego właściwości reologiczne pochodzą od jego struktury i budowy (długie łańcuchy).

Stężenie tego kwasu, jak i masa cząsteczkowa maleje u ludzi chorych, a jego spadek w płynie synowialnym jest ważnym czynnikiem prognozującym choroby. W stanach chorobowych lepkość kwasu hialuronowego również spada, co może być spowodowane zmianami składu białek [7, 8, 9].

Dlatego też w poszukiwaniu kompleksowej oceny wła-ściwości fizycznych płynu synowialnego, a w szczególnoś- ci kwasu hialuronowego, zwrócono uwagę na metody re-ologiczne, a zwłaszcza analizy reometrycznej, która umoż-liwia ilościowy opis tych złożonych zjawisk, korzystając z modeli matematycznych.

W literaturze podejmowano różne próby opisu krzywej uogólnionego płynu newtonowskiego odpowiednim mate-matycznym modelem reologicznym. Są one bowiem nie-zbędne przy rozwiązywaniu zagadnień związanych z prze-pływem płynów nienewtonowskich [10].

Do najbardziej znanych modeli reologicznych należą model potęgowy Ostwalda-de Waele, model wielomia-nowy, model Ellisa, model Binghama, model Herschela-Bulkleya oraz model Szulmana.

Model potęgowy zaproponowany przez Ostwalda i de Waele opisuje krzywe płynięcia uogólnionych płynów newtonowskich w zakresie pośrednich szybkości ścinania. Został on wyprowadzony ze stwierdzenia, że dla płynów pseudoplastycznych zależność lnτ = f(lnD), gdzie τ – jest to naprężenie ścinające a D – szybkość ścinania daje się czę-sto przybliżyć linią prostą w określonym zakresie szybkości ścinania. Wadą tego modelu jest trudność ekstrapolacji danych doświadczalnych w kierunku mniejszych prędkości ścinania. Również współczynnik k ze względu na swój wymiar, zależy od wykładnika n. Dla różnych substancji może się więc zmieniać nie tylko ilościowo, ale także jako-ściowo, zatem parametry te mają jedynie sens fizyczny tylko wtedy, gdy rozpatrywane są łącznie.

Aby opis danych doświadczalnych był pełniejszy wie-lu autorów zaproponowało stosowanie matematycznych modeli reologicznych o bardziej złożonej budowie niż model potęgowy. Opisują one zależność naprężenia ścina-jącego od szybkości ścinania dla wszystkich płynów reo- stabilnych nie mających granicy płynięcia, zarówno roz-rzedzonych, jak i zagęszczonych ścinaniem, czego przy-kładem może być model wielomianowy, model Ellisa, model Sisko i inne [11, 12].

Właściwości cieczy można opisać matematycznymi modelami reologicznymi, które umożliwiają również wy-znaczenie granicy płynięcia, czyli granicznego naprężenia ścinającego, przy którym układ zaczyna płynąć, lepkości plastycznej badanych układów, a także parametrów n (wy-kładnik płynięcia) i m (wykładnik konsystencji).

Najprostszym modelem opisującym własności reolo-giczne nieliniowych płynów plastycznolepkich jest mo-del Herschela-Bulkelya [13].

Krzywe płynięcia, w zależności od miejsca przecina-nia osi naprężenia ścinającego w punkcie τy, określają wartość granicy płynięcia, którą można również ilościo-wo charakteryzować za pomocą modelu matematyczne-go zaproponowanego przez Binghama.

Istnieje wiele modeli reologicznych opisujących płyny nienewtonowskie. Uważa się jednak, że tylko te przedsta-wione powyżej są na tyle proste, iż mogą być przydatne w zastosowaniach analitycznych.

Na podstawie analizy dużej liczby danych reometrycz-nych różnych autorów Szulman zaproponował uogólniony model. Zaletą tego modelu jest to, że stanowi on uogólnie-nie wielu modeli reostabilnych zarówno mających, jak i nie mających granicy płynięcia. W szczególnych przypadkach bowiem sprowadza się on do modelu Newtona (τy = 0, m = n); modelu Ostwalda-de Waele (τy = 0); modelu Binghama (n = m = 1); modleu Herschela-Bulkleya (n = 1); czy mode-lu Cassona (m = n) [13].

Cel

Cel pracy stanowiła analiza reologiczna wodnych roz-tworów kwasu hialuronowego. W badaniach uwzględniono również wykorzystanie matematycznego modelu reolo-gicznego Szulmana w opisie ich właściwości fizycznych.

Reologiczna analiza fizycznych właściwości kwasu hialuronowego 409

Rycina 1. Zależność naprężenia ścinającego od szybkości ścinania dla kwasu hialuronowego. Figure 1. Shear stress versus shear rate for hyaluronic acid.

Rycina 2. Zależność lepkości dynamicznej od szybkości ścinania dla kwasu hialuronowego. Figure 2. Viscosity versus shear rate for hyaluronic acid.

Materiał i metoda Odczynniki: sól sodowa kwasu hialuronowego otrzy-

mana z flory bakteryjnej Streptococus pyogenes w stęże-niach 0,2%, 0,4%, 0,5% (Calbiochem).

Aparatura: Rheometrics Rotation Fluid Spectrometer RFS II (stożek-płytka), wiskozymetr rotacyjny Rheotest 2-Medingen, stożek – cylinder. Pomiary zostały prze-prowadzone w temperaturze 25 °C, przy szybkości ści-nania od 1,5 do 1312 s-1.

Do opisu właściwości reologicznych badanych roz-tworów zastosowano matematyczny model Szulmana stanowiący uogólnienie wielu modeli płynów reostabil-nych, mających jak i nie mających granicy płynięcia. Z równania tego wyznaczono, za pomocą Solvera, (część programu Microsoft Excel z pakietu Office) parametry reologiczne modelu τy, ηp., n oraz m. Do wyznaczenia tych parametrów zastosowano również algorytmy gene-tyczne, stanowiące programy, które w sposobie rozwią-zywania problemów naśladują procesy ewolucji. Ideą algorytmu jest wybranie metody analitycznej, która jest najlepsza [14, 15, 16, 17].

mpny

n D111

)( ⋅+= ηττ wzór dla modelu Szulmana

Wyniki

Na rycinie 1. i 2. przedstawiono zależność napręże-nia ścinającego od szybkości ścinania, oraz zależność lepkości dynamicznej dla rosnących wartości szybkości ścinania, czyli tzw. krzywe płynięcia i krzywe lepkości badanych roztworów kwasu hialuronowego.

Stwierdzono, że wykazują one przebieg krzywych płynięcia typowy dla układów nienewtonowskich. W miarę wzrostu szybkości ścinania ich lepkość dynamiczna maleje, co jest właściwością cieczy pseudoplastycznych. Przy wzrastających szybkościach ścinania cząsteczki cieczy ustawiają się w kierunku przepływu. Łańcuchowe molekuły mogą się rozplątywać, rozciągać i ustawiać równolegle do działającej siły, co ułatwia im prze- suwanie się względem siebie. Płyny stają się rzadsze. Jest to tzw. drugi obszar przepływu nienewtonowskiego, gdzie lepkość zmniejsza się w wyniku orientacji molekuł.

Anna Zalewska, Zenon J. Kokot 410

Rycina 3. Zależność naprężenia ścinającego od szybkości ścinania dla kwasu hialuronowego, krzywe modelowe. Figure 3. Shear stress versus shear rate for hyaluronic acid, model curves.

Rycina 4. Zależność parametrów reologicznych wyznaczonych z modelu Szulmana od stężenia kwasu hialuronowego. Figure 4. Rheological parameters from Szulman model versus concentration of the hyaluronic acid.

W celu uzyskania pełniejszej analizy reologicznej układów nienewtonowskich wykorzystano modele ma-tematyczne. Na rycinie 3. przedstawiono krzywe modelo-we wyznaczone metodą solvera, które znajduje minimum lokalne z sumy kwadratów naprężenia doświadczalnego i obliczonego oraz metodą algorytmów genetycznych dla 0,5% kwasu hialuronowego. Wykazano, że model Szulma-na dobrze opisuje krzywe doświadczalne. Podobne wyniki uzyskano dla pozostałych stężeń kwasu.

Z równania (wzór 1.) wyznaczono parametry reolo-giczne modelu τy i ηp oraz n i m dla kwasu hialuronowego a następnie wykreślono wykres zależności tych parametrów od stężenia badanej cieczy [18, 19] (Ryc. 4.).

Wyznaczona wartość granicy płynięcia dla kwasu hialuronowego wynosiła 0, co oznacza, że w tym zakre-

sie stężeń badana ciecz nie posiada właściwości tikso- tropowych. Układ charakteryzuje się niskim oporem na działanie zewnętrznych sił mechanicznych.

Stwierdzono również, że wraz ze zwiększaniem się stężenia kwasu w układzie wodnym maleje współczyn-nik n (wykładnik płynięcia), jak i współczynnik m (wy-kładnik konsystencji). Na tej podstawie można wysunąć wniosek, że wraz ze wzrostem stężenia następuje wzrost właściwości pseudoplastycznych układu. Można również wnioskować o wpływie budowy chemicznej na właści-wości reologiczne roztworów. Zmiany wielkości makro-cząsteczek spowodowane zmianami stopnia polimeryza-cji i długości łańcuchów wywierają silny wpływ na te właściwości związków wielkocząsteczkowych, które zależą od wielkości masy cząsteczkowej [19].

Reologiczna analiza fizycznych właściwości kwasu hialuronowego 411

Wykazano również wzrost wartości lepkości plastycznej ze wzrostem stężenia kwasu. Parametr ten określa się również jako współczynnik nachylenia krzywej płynięcia.

Wnioski 1. Analizowane wodne roztwory kwasu hialurono-

wego przy wyższych szybkościach ścinania wyka-zują właściwości nienewtonowskie, pseudoplas- tyczne, posiadają charakter cieczy rozrzedzonych ścinaniem.

2. Stosując matematyczne modele reologiczne uzyska-no dobre dopasowanie krzywych doświadczalnych do modelowych. Metoda wyznaczania wartości funkcji celu z solvera oraz algorytmów genetycz-nych jest metodą dokładną, co umożliwia ich zasto-sowanie w analizie porównawczej wielu modeli re-ologicznych z określonymi parametrami.

3. Wyznaczenie parametrów reologicznych z modeli pozwala na ścisłą charakterystykę fizykochemiczną analizowanych układów, jak również przewidywa-nie właściwości fizycznych cieczy.

4. Badanie właściwości reologicznych kwasu hialuro-nowego za pomocą matematycznych modeli stwa-rza możliwość jego kompleksowej charakterystyki, jak i również charakterystyki płynu synowialnego, co z kolei jest ważnym czynnikiem w prognozowa-niu procesów chorobowych.

Piśmiennictwo 1. Górecki M., Zalewska A.: Reometryczna analiza farma-

ceutycznych układów rozproszonych. Farm. Pol., 2000, 56, 748.

2. Górecki M., Zalewska A.: Reologia farmaceutyczna w ana- lizowaniu układów nienewtonowskich. Farm. Pol., 2001, 57, 417.

3. Remmelgas J., Leal L.G., Orr N.V., Sridhar T.: Viscous and elastic stresses in extensional rheometry. J. Non-Newtonian Fluid Mech., 1998, 76, 111.

4. Syang-Peng Rwei, Saint-Wei Chen, Ching-Feng Mao, Hsu-Wei Fang: Viscoelasticity and wear ability of hyalu-ronate solutions. Biochem. Eng. Journal, 2008, 40, 211-217.

5. Krause W.E., Bellomo E.G., Colby R.H.: Rheology of so- dium hyaluronate under physiological conditions. Biomacro- molecules, 2001, 2, 65-69.

6. Scott D., Coleman P.J., Mason R.M. and Levick J.R.: Concentration dependence of interstitial flow buffering by hyaluronan in synovial joints. Microvasc. Res., 2000, 59, 345-353.

7. Lapcik L. Jr., Schurz J.: Photochemical degradation of hyaluronic acid by singlet oxygen. Coll. Polym. Sci., 1991, 269, 633-635.

8. Rinaudo Marguerite, Rozand Yves, Mathieu Pierre, Con-rozier Thierry: Role of different pre-treatments on com-position and rheology of synovial fluids. Polymers, 2009, 1, 16-34.

9. Barbara M. Praest, Helmut Greiling, Rudiger Kock: As-say of synovial fluid parameters: hyaluronan concentra-tion as a potential marker for joint diseases. Clin. Chim. Acta, 1997,266, 117-128.

10. Byars J.A., Binnington R.D., Boger D.V.: Entry flow and constitutive modelling of fluid S1. J. Non-Newtonian Fluid Mech., 1997, 72, 219.

11. Górecki M., Zalewska A.: Rheometric analysis of physi-cal stability of O/W type emulsion. Pol. J. Med. Phys. Eng., 2001, 7, 317.

12. Passard J., Kouitat N., Perré P.: Unsteady flow in cone and plate geometry: how computation can help rheome-try. Eur. Phys. J. AP., 1998, 3, 321.

13. Zhu H., Kim Y.D., De Kee D.: Non-Newtonian fluids with yield stress. J. Non-Newtonian Fluid Mech., 2005, 129, 177.

14. Moukhtarova S.E., Krivoschepov A.F., Kim V.E.: Appli-cability of rheological models of flow to stearate-stabilized emulsions. Coll. J., 2004, 66, 112.

15. Goldberg D.E.: Algorytmy genetyczne i ich zastoso- wania. WNT, W-wa, 1998.

16. Holland H.: Algorytmy genetyczne. Świat Nauki, 9/92. 17. Mendyk A., Jachowicz R.: Neutral network as a decision

support system in the development of pharmaceutical formulation – focus on solid dispersion. Expert System with Application, 2005, 28, 285.

18. Mitchell M.: An introduction to genetic algorithm, IT, Press, MA, 1998.

19. Zalewska A., Górecki M.: Assessment of physical prop-erties of macromoleclues used in pharmacy using genetic algorithm. Int. J. App. Mech. Eng., 2005, 10, 165.

Adres do korespondencji: e-mail: azalew@amp.edu.pl Tel.: 61 8546608