Diagnostic biologique du paludisme

par

Marie-Ange Rason, MD

7ème édition du cours international “Atelier Paludisme”25 Mars 2009 – Institut Pasteur de Madagascar

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ter Cycle biologique de Plasmodium sp

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ter Cycle biologique de Plasmodium sp

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ter

• Diagnostic microscopique (frottis mince et goutte épaisse)

• Bandelette réactive

• Biologie moléculaire (en milieu de recherche principalement)

• Quantitative Buffy Coat malaria-test ou QBC test

Principaux moyens de diagnostic biologique du paludisme

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Diagnostic Biologique du Paludisme par Microscopie

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ter Diagnostic microscopique : technique de

référence

• frottis mince et goutte épaisse

• diagnostic d’urgence

• objectivant un parasite (forme asexuée / forme sexuée)– identifier l’espèce plasmodiale– évaluer la parasitémie

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ter Diagnostic Biologique du paludisme

Les étapes

1- Prélèvement du malade2- Préparation et coloration des frottis sanguins3- Examen microscopique des frottis sanguins à la recherche

des plasmodies– négatif : confirmation– Positif : suivre l’étapes suivantes

4- Identification d’espèces de Plasmodium5- Estimation de la densité parasitaire

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ter Confection de la goutte épaisse

Piqûre au bout du doigt (avec une lancette stérile, à usage unique)

Confection d’une goutte épaisse

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Confection de l’étalement sanguin : frottis mince

Piqûre au bout du doigt (avec une lancette stérile, à usage unique)

Confection d’un frottis mince

OUI

NON

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3

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Méthodes de coloration

Coloration de May Grunwald-Giemsa

Coloration de Giemsa

Coloration rapide ou panoptique (kit commercial type Kit Ral® ou Dade®)

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ter Plasmodium sp infectant l’homme

P. falciparum

P. malariae P. ovale

P. vivax

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ter Plasmodium know lesi

(www.cdc.gov/eid) False-colour electron micrograph of a rhesus red blood cell infected with a mature segmented schizont-stage P. knowlesi malaria parasite, which is about to release its invasive merozoite stages.

A thin blood smear stained with Giesma from a fatal human case of P. knowlesi malaria

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ter Identification des espèces plasmodiales

sur un frottis mince

Aspect de l’hématie parasitée (taille de l’hématie parasitée)

Aspect du parasite (noyau et cytoplasme)

Aspect du cytoplasme de l’hématie parasitée(tâches, granulations)

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ter Identification des espèces plasmodiales

sur un frottis mince

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Examen de frottis mince

Examen de goutte épaisse

Plasmodium falciparum

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ter Plasmodium vivax

Examen de frottis mince

Examen de goutte épaisse

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ter Plasmodium ovale

Examen de frottis mince

Examen de goutte épaisse

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ter Plasmodium malariae

Examen defrottis mince

Examen de goutte épaisse

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ter Calcul de la densité parasitaire

Sur la goutte épaisse 8000 globules blancs (leucocytes) par µl de sang

Compter les parasites (forme asexuée) pour 500 leucocytes

Nb parasites relevés X 8000

Nb de leucocytes comptés

Nb parasites/µl de sang =

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ter Calcul de la densité parasitaire

Sur le frottis mince:

Compter le nombre d’hématies parasitées dans 100 champsde bonne qualité sans chevauchement des hématies, sansespace libre entre les hématies, au niveau de la queue dufrottis

Estimer le % d’hématies parasitées

Ramener la densité par µl de sang si nécessaire (Supposeravoir 5 000 000 d’hématies par µl de sang)

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Autres méthodes de diagnostic Biologique du Paludisme

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Détection des antigènes de plasmodies par immuno-chromatographique

migration d’un prélèvement de sang sur une membrane

Antigènes capturés par des anticorps monoclonaux fixés sur la membrane

révélation par de nouveaux anticorps monoclonaux couplés à un particule colorée révélatrice.

Bandelette réactive

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ter Test de Diagnostic Rapide: illustration

(http://www.diamedchina.com)

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ter Polymerase Chain Reaction (PCR)

• Amplification d’un segment de l’ADN par la réaction enzymatique répétée (PCR endpoint ou PCR en temps réel)

Avec besoin en :• Équipement (thermocycleur …)• Personnel formé• …

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ter Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR Classique

- Préparation du mix- Amplification du mix- Migration sur gel agarose- Prise en photos du gel- Interprétation des résultats suivant la taille des bandes attendues

PCR en temps réel(RT-PCR)

- Sonde fluorescente- Quantification et caractérisation de l’amplicon formé à chaque cycle- Préparation du mix- Amplification- Interprétation des résultats suivant la température de fusion

(http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/principe.htm)Mangold K. et all,2005. Real time PCR for Detection and Identification of Plasmodium spp. J. Clin. Microbiol, 5: 2435-2440.

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Illustration : résultat de diagnostic d’espèce par PCR classique

M 1 2 3 4 5

100pb

200pb

Légendes: M: marqueur moléculaire, 1: témoin négatif ; 2 et 4: P. falciparum (176 pb); 3 et 5: P. vivax (120 pb); 5: P. malariae (145 pb); pour P.ovale(780 pb) non figuré.

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Illustration d’un diagnostic d’espèce par RT-PCR

Courbe d’amplification Température de fusion (°C)

Contrôles positifs

Présente 74,8 +/- 0,1 P. falciparum

Présente 73,2 +/- 0,2 P malariae

Présente 76,5 +/- 0,1 P. ovale

Présente 77,7 +/- 0,2 P. vivax

Diagnostic biologique du paludisme

par

Marie-Ange Rason, MD

7ème édition du cours international “Atelier Paludisme”25 Mars 2009 – Institut Pasteur de Madagascar