Embed Size (px)
Citation preview
RAPORTARE ŞTIINŢIFICĂ
RAPORTUL ŞTIINŢIFIC ŞI TEHNIC (RST)
ETAPA DE EXECUŢIE NR. 2
Certificarea autenticităţii şi a calităţii igenice a laptelui materia primă şi a
brânzeturilor maturate (telemea, caş) prin metode inovatoare, dezvoltate şi
testate in premieră în Romania. Dezvoltarea, implementarea şi integrarea
componentelor platformei web.
Proiect PCCA nr. 153/2014
Director proiect: Conf. dr. Dan Sorin Daniel
1
CUPRINS
CUPRINS ..................................................................................................................................................... 1
1. OBIECTIVELE FAZEI DE EXECUTIE .......................................................................................................2
2. REZUMATUL FAZEI ..............................................................................................................................2
3. DESCRIEREA ŞTIINŢIFICĂ ŞI TEHNICĂ ..................................................................................................3
3.1. Dezvoltarea metodei de extractie si analiza a rapoartelor 13
C/12
C si 15
N/14
N din cazeina din
branza.....................................................................................................................................................3
3.2. Aplicarea metodelor dezvoltate în analiză probelor de lapte şi brânză colectate trimestrial în
amprentarea izotopică şi moleculară. Amprentarea izotopică preliminară a laptelui în raport cu
pulsul izotopic vara – toamna. Validarea structurilor de date specifice. ..............................................4
3.3. Dezvoltarea şi testarea metodei de determinare cantitativă a concentraţiilor de metale grele în
laptele materie primă. Validarea structurilor de date specifice. ...........................................................6
3.4. Determinarea NTG, NCS, izolarea bacteriilor din genurile Staphyloccocus, Escherichia,
Bacillus si confirmarea prin tehnica moleculara ..................................................................................8
3.4. Dezvoltarea protocolului PCR pentru autentificarea produsului finit .........................................11
3.5. Dezvoltarea, implementarea şi integrarea componentelor platformei Web. ................................13
CONCLUZII ................................................................................................................................................20
DISEMINAREA REZULTATELOR ..................................................................................................................21
BIBLIOGRAFIE ...........................................................................................................................................21
2
1. Obiectivele fazei de executie
1. Dezvoltarea metodei de extracţie şi analiză a rapoartelor 13C/12C şi 15N/14N din cazeină din brânză.
2. Aplicarea metodelor dezvoltate în analiză probelor de lapte şi brânză colectate trimestrial în
amprentarea izotopică şi moleculară. Validarea structurilor de date specifice.
3. Dezvoltarea şi testarea metodei de determinare cantitativă a concentraţiilor de metale grele în laptele
materia prima. Validarea structurilor de date specifice.
4. Determinarea NTG, NCS şi a prevalenţei bacteriilor din genurile Staphyloccocus, Escherichia,
Bacillus şi confirmarea prin tehnică moleculară. Validarea structurilor de date specifice
5. Analiză preliminară a concentraţiilor de metale grele din laptele materie prima şi conţinutul de
microelemente din hrană animalului în vederea stabilirii eventualelor corelaţii.
6. Dezvoltarea protocolului PCR pentru autentificarea produsului finit.
7. Amprentarea izotopică preliminară a laptelui în raport cu pulsul izotopic vara - toamna.
8. Dezvoltarea şi implementarea platformei web. Integrarea componentelor specifice şi popularea
bazelor de date.
9. Rapoarte tehnice şi financiare de etapă. Diseminarea rezultatelor.
2. Rezumatul fazei
În cadrul acestei etape obiectivele urmărite au fost: a) dezvoltarea metodelor de extracţie şi analiză
a rapoartelor izotopice ale 13C/12C şi 15N/14N din cazeină, extrasă din brânză; b) identificarea
markerilor care pot diferenţia atât originea geografică a probelor de lapte cât şi speciile (vacă, oaie); c)
validarea analizei cantitative a urmelor de metale din lapte utilizând că tehnică Spectrometria de Masă cu
Plasmă Cuplată Inductiv (ICP-MS) şi aplicarea acestei metode probelor de lapte colectate de la cele trei
ferme pilot; d) evaluarea conformităţii laptelui crud prin determinarea NTG, NCS, izolării şi confirmării
moleculare a bacteriilor din genurilor Staphyloccocus, Escherichia, Bacillus; e) dezvoltarea metodei PCR
pentru autentificarea brânzeturilor; f) dezvoltarea şi implementarea platformei web. Integrarea
componentelor specifice şi popularea bazelor de date.
Au fost analizate 77 de probe (lapte, apă, iarbă şi furaj) din punct de vedere izotopic şi al
conţinutului de metale. Rezultatele obţinute au fost supuse analizei statistice cu ajutorul cărora s-au putut
dezvoltă două modele: i) pentru identificarea markerilor care dau amprenta de identificare a zonei şi de
asemenea; îi) pentru diferenţierea speciei animale. Rezultatele obţinute au arătat faptul că asocierea
optimă de markeri pentru identificarea originii geografice este dată de coroborarea rapoartelor izotopice
ale carbonului şi oxigenului cu elementele Mn şi Sr. Modelul propus pentru identificarea geografică a
laptelui, atribuie corect în proporţie de 90.9% originea geográfica a unei probe de lapte de vacă provenită
de la una dintre cele trei ferme. Diferenţierea dintre laptele provenit de la cele două specii se face cu
ajutorul combinaţiei de markeri: rapoarte izotopice ale hidrogenului şi concentraţia de Sr. Astfel, modelul
obţinut poate face o clasificare corectă în proporţie de 96.4% a laptelui provenit de la cele 2 specii.
Validarea metodei de determinare cantitativă a urmelor de metale prin ICP-MS a fost efectuată în cadrul
acestei etape, parametrii de performanţă ai metodei fiind determinaţi.
În vederea evaluării calităţii igienice a laptelui crud materie prima s-au prelevat 45 probe recoltate
în intervalul februarie-decembrie 2015 de la fermele luate în studiu (zona montană, zona ses şi zona deal).
Pentru identificarea şi izolarea bacteriilor obţinerea unor rezultate concludente s-au folosit metode
standardizate, care au fost ulterior confirmate prin metode rapide, de biologie moleculară, folosind
protocoale de lucru originale, dezvoltate în cadrul laboratorului de Producţii animaliere şi siguranţă
alimentelor din cadrul FMV Cluj Napoca. În urmă prelucrării statistice (program Origin 8.5, test
ANOVA) a rezultatelor obţinute s-a constatat că NTG şi NCS, în cazul probelor de lapte de vacă
prelevate de la unităţile de producere luate în studiu s-au încadrat în limitele impuse de legislaţia UE. În
cazul probeleor de lapte de oaie, 18.5% din probele individuale au prezentat depăşiri ale limitelor
maxime. Rezultatele obţinute în urmă investigaţiilor asupra prevalenţei germenilor patogeni în laptele
crud de vacă au relevat o incidenţa crescutǎ a bacteriilor din genul Staphylococcus spp. şi E.coli, prezenţa
confirmată şi prin tehnică PCR.
3
Protocolul de autentificare a speciei în cadrul brânzeturilor analizate (telemea şi cas de vacă şi
oaie) a fost dezvoltat şi optimizat cu succes, fiind posibilă cuantificarea ADN-ului de amestec pe baza
etalonului creat şi a tehnicii de amplificare descrise.
Pentru implementarea acestei platforme Web au fost folosite tehnologii Microsoft care includ:
mediul de dezvoltare Visual Studio 2010, limbajul C#, mediile de lucru .NET 4.0 şi ASP.NET 4.0,
sistemul de gestiune al bazelor de date SQL Server 2008 R2 Express, componentele din ADO.NET,
precum şi unele pachete şi biblioteci de funcţii şi pachete de componente suplimentare. Procesul de
testare a fost derulat intranet pentru această etapă, va fi finalizat pentru toate funcţionalităţile şi va fi
reluat, complet, în Internet în etapă a-3-a.
Obiectivele prevazute pentru etapa de execuţie nr. 2 au fost realizate in totalitate.
3. Descrierea ştiinţifică şi tehnică
3.1. Dezvoltarea metodei de extractie si analiza a rapoartelor 13
C/12
C si 15
N/14
N din cazeina
din branza
În vederea extracţiei cazeinei din probe de brânză, pentru analiză izotopică, a rapoartelor 13C/12C şi
15N/14N, s-a elaborat următoarea procedura:
- Se cântăresc 2 g din proba de brânză şi se pun în flaconul utilizat pentru centrifugare;
- Peste proba de brânză cântărită se adaugă 15 ml de amestec de eter de petrol şi etil eter în
proporţie 2:1;
- Timp de 5 min se omogenizează amestecul cu ajutorul unui omogenizator;
- După omogenizare, proba împreună cu amestecul de solvent se centrifughează 4 min la 4000
rpm;
- Se colectează amestecul de solvenţi într-un alt recipient, se adaugă un amestec nou de solvenţi
peste proba şi se repetă operaţia de omogenizare şi centrifugare de încă 2 ori;
- După ce s-a înlăturat a treia oară solventul, se adaugă 10 ml de apă ultrapura peste reziduul
de cazeină rămas;
- Se centrifughează amestecul de cazeină şi apă ultrapura timp de 8 min la 4000 rpm, apoi se
aruncă apă;
- Se repetă încă de 2 ori operaţia de “spălare” a probei de cazeină prin adăugarea apei
ultrapure şi centrifugare;
- După cea de a treia centrifugare, se aruncă apă şi proba de cazeină rămasă se îngheaţă în
congelator până a două zi, pentru a putea fi liofilizată;
- După liofilizare, proba de cazeină se păstrează la temperatura camerei până la analiză
izotopică.
Analiză rapoartelor izotopice ale 13C/12C şi 15N/14N din cazeină extrasă din brânză se
efectuează cu ajutorul spectrometrului de masă pentru rapoarte izotopice, IRMS DELTA V
Advantage, Thermo Scientific cuplat cu un Analizor Elemental (Flash EA1112 HT, Thermo
Scientific). Procedura experimentală on-line, bazată pe folosirea analizorului elemental conţine
următorii paşi:
a) Plasarea probei în capsule:
b) Verificarea şi ajustarea analizorului elemental şi a spectrometrului de masă:
c) Măsurarea unui set de probe Tabel 1. Rezultatele izotopice ale probelor de cazeină
Nr. Cod proba Descriere Ferma δ13
CVPDB (‰) 15
Nair (‰)
1 969-CO cas oaie III -27.3 6.5
2 969-TO telemea oaie III -27.7 5.5
3 969-TV telemea vaca III -22.4 5.8
4 969-CV cascaval vaca III -22.0 5.7
5 970-CV cascaval vaca II -26.7 5.3
4
6 970-TV telemea vaca II -28.1 6.2
7 973-CO cas oaie I -28.2 7.0
8 973-TO telemea oaie I -28.5 7.7
9 973-CV cas vaca I -25.0 4.4
10 973-TV telemea vaca I -28.0 4.3
Pentru asigurarea controlului calităţii rezultatelor obţinute, la începutul fiecărei secvenţe sunt
analizate câte trei standarde de lucru iar din fiecare proba se măsoară cel puţin trei replicate. Că şi
standard de control s-a folosit materialul de referinţă certificat NBS-22 (ulei), având o valoare certificată
δ13C=-30.03‰ versus PDB (Pee Dee Belemnite). Cu ajutorul metodelor dezvoltate s-au analizat 10
probe de brânză, colectate de la cele trei ferme pilot, rezultatele izotopice fiind prezentate în tabelul 1.
3.2. Aplicarea metodelor dezvoltate în analiză probelor de lapte şi brânză colectate
trimestrial în amprentarea izotopică şi moleculară. Amprentarea izotopică preliminară a
laptelui în raport cu pulsul izotopic vara – toamna. Validarea structurilor de date specifice.
În vederea identificării celor mai eficienţi markeri pentru stabilirea originii geografice a laptelui că
materia prima, s-a folosit programul de prelucrare statistică a datelor SPSS STATISTICS 20. Astfel, că şi
date de intrare s-au folosit 77 de probe (apă, iarbă, furaj şi lapte) provenite de la cele trei ferme, implicate
în acest studiu pilot. Aceste probe au fost investigate din punct de vedere izotopic şi al profilului
elemental.
Analiză izotopică
Primul test statistic utilizat a fost ANOVA, care s-a efectuat pe o matrice care conţine rapoartele
izotopice ale: hidrogenului - 2H/1H – notat cu (D); oxigenului 18O/16O- notat cu (O) şi carbonului
13C/12C – notat cu (C), determinate în cele 77 de probe. Criteriile de clasificare utilizate au fost: i) zona
geográfica - cele trei ferme, situate în: zona montană – Fermă 1; zona de ses - Fermă 2 şi zona de deal –
Fermă 3 şi îi) specia animală (vacă, oaie). S-a observat că, parametrii care separă fermele sunt: raportul
izotopic al hidrogenului (D) din iarbă, pentru care s-a obţinut un p=0.00; raportul izotopic al oxigenului
(O) din iarbă – p=0.005 dar şi (D) din apă (p= 0.023). Corelaţia mai slabă obţinută pentru raportul
izotopic al hidrogenului din apă (D) comparativ cu cel din iarbă este dată de faptul că, apă din vegetaţia
provenită dintr-o anumită zona reflectă în mod direct precipitaţiile care au căzut în zona respectivă, fiind
parametru ce da amprenta izotopică a zonei geografice. În cazul apei folosite pentru adăparea animalelor,
această poate să provină dintr-un foraj a cărui arie de reîncărcare se află într-o altă zona geografică,
reflectând astfel amprenta izotopică a zonei respective şi nu a locului în care apă a fost captată.
În ceea ce priveşte separarea celor trei ferme cu ajutorul rapoartelor izotopice ale carbonului (C) s-a
observat că acesta este puternic corelat cu zona geografică pentru cazul carbonului din iarbă (p= 0.008) şi
mai puţin corelat cu (C) din furaj. Corelaţia mai slabă a furajului comparativ cu iarbă, în ceea ce priveşte
parametrul C, poate fi explicată prin faptul că, furajul folosit provine şi din alte zone geografice, spre
deosebire de iarbă care este specifică zonei în care se află fermele.
Pentru laptele, obţinut în cele trei unităţi de producţie, s-a observat că diferenţierea acestor probe în raport
cu originea geografică se face cu ajutorul parametrilor (D) - p= 0.003 respectiv (O) – p = 0.043; raportul
izotopic al carbonului nefiind un parametru semnificativ în acest caz. Pentru a evidenţia diferenţele care
apar între probele de lapte de vacă, prelevate de la cele trei ferme, s-a aplicat din nou testul ANOVA de
această dată, luându-se că şi variabile rapoartele izotopice ale: oxigenului, hidrogenului şi carbonului.
Parametrii care au semnificaţie statistică în această clasificare sunt: oxigenul (p= 0.039) şi carbonul
(p=0.001). De asemenea, pentru diferenţierea laptelui în funcţie de specie, s-a observat că separarea se
face prin toate cele trei rapoarte izotopice: oxigen (p=0.000); hidrogen (p=0.000) şi carbon (p=0.002).
Compoziţie elementala:
Compoziţia elementala a celor 77 de probe a fost determinată cu ajutorul Spectrometriei de Masă
cu Plasmă Cuplată Inductiv. Astfel, au fost determinate atât concentratiile macroelementelor (Că, Na, Mg,
K, P) cât şi a microelementelor (Fe, Cu, Mn, Sr, Rb, Cr, Se, Li, Cd, Aş, Pb etc). Prin aplicarea testului
ANOVA probelor de apă, lapte, iarbă şi furaj s-a obţinut o separare pe ferme (zona geografică) cu ajutorul
5
parametrilor: Li (p= 0.000), Cr (p= 0.020) şi Rb (p= 0.000). În diferenţierea produslului final, lapte de
vacă, în funcţie de fermă de provenienţă, s-a aplicat testul ANOVA probelor de lapte de vacă colectat din
cele trei locaţii. S-a observat că separarea, în raport cu originea geografică a laptelui, se face cu ajutorul
următoarelor elemente: Cr (p=0.05); Mn (p=0.012); Rb (p=0.030); Sr (p= 0.013) şi Cs (0.025).
Diferenţia în raport cu specia (vacă, oaie) s-a făcut tot cu ajutor analizei ANOVA, obţinându-se că
parametrii semnificativi: Li (p=0); Sr (0.043) şi Se (0.020).
Coroborarea markerilor izotopici şi elementali pentru identificarea originii geografice şi
diferenţierea speciei
În vederea identificării originii geografice a laptelui de vacă, s-a pornit de la coroborarea
markerilor izotopici şi elementali cu semnificaţie statistică în urmă analizei ANOVA.
S-a obţinut o matrice cu următorii parametrii: rapoartele izotopice ale oxigenului şi carbonului şi
concentratiile de Cr, Mn, Rb, Sr, şi Cs, măsuraţi pentru fiecare proba de lapte de vacă. Acestei matrici i s-
a aplicat analiză statistică “Canonical Discriminant Analysys”, obţinându-se un model care atribuie corect
în proporţie de 90.9% originea geografică a unei probe de lapte de vacă provenită de la una dintre cele trei
ferme. Asocierea optimă de markeri pentru identificarea originii geografice este dată de coroborarea
rapoartelor izotopice ale carbonului şi oxigenului cu elementele Mn şi Sr (Fig. 1). Pentru diferenţierea
laptelui, în funcţie de specie, analiză statistică “Canonical Discriminant Analysys”, s-a aplicat pe o
matrice formată din rapoartele izotopice ale: carbonului, oxigenului şi hidrogenului şi concentratiile de:
Li, Sr şi Se pentru toate probele de lapte (vacă şi oaie).
Fig. 1 Diferentiarea probelor de lapte (vaca) in functie de originea geografica
Diferenţierea optimă dintre laptele provenit de la cele două specii se face cu ajutorul combinaţiei
de markeri: rapoarte izotopice ale hidrogenului şi concentraţia de Sr. Astfel, modelul obţinut poate face o
clasificare corectă în proporţie de 96.4% a laptelui provenit de la cele 2 specii (Fig. 2).
Fig. 2 Diferentiarea
probelor de lapte de vaca vs. lapte de oaie
Amprentarea izotopica preliminara a laptelui în raport cu pulsul izotopic vară - toamna
6
În această etapă au fost dezvoltate metodele de extracţie şi analiză a rapoartelor 13C/12C şi
15N/14N din cazeină din brânză. Cu ajutorul acestora, s-au amprentat izotopic 10 probe de brânză de
vacă şi oaie (telemea şi cas). Prelucrarea statistică a datelor izotopice şi a conţinutului de metale au
condus la următoarele concluzii: identificarea originii geografice este dată de coroborarea rapoartelor
izotopice ale carbonului şi oxigenului cu elementele Mn şi Sr; diferenţierea dintre laptele provenit de la
cele două specii (vacă şi oaie) se face cu ajutorul combinaţiei de markeri: rapoarte izotopice ale
hidrogenului şi concentraţia de Sr.
Amprentarea moleculară
În vedererea amprentării moleculare a laptelui şi produselor obţinute în arealul specific s-a realizat
extracţia de ADN din cadrul a 80 de probe (40 de lapte şi 40 de produse). Probele de ADN au fost
obţinute urmând protocolul original descris mai jos:
Etapa I. Liza celulară:
• 300 μl lapte se pun într-un tub Eppendorf de 1,5 ml;
• Se adaugă 900 μl soluţie de liză celulară şi se amestecă prin răsturnare apoi se incubează 10 min
la temperatura camerei;
• Se centrifughează la 13000xG, 20 secunde;
• Se îndepărtează supernatantul şi se vortexează timp de 20 secunde;
Etapa II. Liza nucleilor şi precipitarea proteinelor:
• Se adaugă 300 μl soluţie de liză a nucleilor şi se omogenizează;
• Se adaugă 100 μl soluţie de precipitare a proteinelor şi se vortexează 20 de secunde;
• Se centrifughează la 13000xG, 3 minute;
• Se transferă supernatantul într-un tub care conţine izopropanol 300 μl şi se amestecă;
Etapa III. Precipitarea şi rehidratarea ADN:
• Centrifugare la 13000xG,1 minut;
• Se îndepărtează supernatantul, se adaugă etanol 70% - 300 μl şi se centrifughează la
13000xG,1minut;
• Se aspiră etanolul şi se lasă la uscat 10-15minute;
• Se rehidratează ADN-ul în volumul corespunzător de soluţie de rehidratare timp de oră la 650C
sau peste noapte la 40C.
Pentru extracţia de ADN din cadrul produselor lactate s-a utilizat un kit comercial de extracţie
Isolate II Genomic DNA (Bioline, Germania). Cuantificarea ADN s-a realizat cu ajutorul
spectrofotometrului Nanodrop ND-1000, la lungimea de undă 260. Raportul obţinut între absorbanţele ʎ
= 260/280 nm care ne arată puritatea probei de ADN.
Rezultatele obţinute la cuantificarea ADN
În urma aplicării protocolului original de extracţie a ADN din lapte s-au observat valori
corespunzătoare realizării tehnicii PCR şi secvenţierii necesare în etapele următoare. S-a înregistrat o
valoare minimă de 18.9 ng/µl şi maximă de 198.4 ng/µl. Şi în cazul extracţiei ADN din produsele lactate
rezultatele au fost asemănătoare, kitul utilizat fiind eficient în obţinerea unor cantităţi şi purităţi de ADN
optime.
3.3. Dezvoltarea şi testarea metodei de determinare cantitativă a concentraţiilor de metale
grele în laptele materie primă. Validarea structurilor de date specifice.
Pentru determinări, a fost utilizat un spectrometru de masă cu plasmă cuplată inductiv de tipul
ELAN DRC(e), produs de firma Perkin Elmer. Tehnica de analiză cantitativă este utilizată pentru a
determina cu precizie concentraţia unor elemente specificate într-o probă necunoscută. Tehnica
furnizează rezultate de mare precizie pe un domeniu larg de concentraţii şi generează rezultate adecvate
pentru certificări. În analizele cantitative, instrumentul este calibrat prin măsurarea de standarde pentru
toate elementele propuse pentru determinare.
7
În vederea validării metodei de determinare de concentraţii de metale (V, Mn, Ni, Zn, As, Sr, Cd,
Ba, Pb, Fe, Cr, Cu) în alimente, au fost utilizate doua materiale de referinţă certificate, IAEA-359
(Cabbage) si NCS ZC 85006 (Tomato), care au necesitat digerare pentru a fi aduse în soluţie. A fost
utilizată apă ultrapură (18 MΩcm-1
) realizată cu un sistem de purificare a apei Millipore şi HNO3 ultrapur
(Merck puritate 60 %). Din probele măcinate şi sitate s-au cântărit 0,1 g, care au fost digerate în amestec
de acizi la presiune şi temperatură ridicată. După răcire, s-au transferat lichidele în baloane cotate de 50
cm3 şi s-au adus la semn cu apă ultrapură. Soluţiile de calibrare au fost preparate prin diluarea succesivă a
unui standard multielement de puritate ridicată (standard ICP-MS 10 mg∙L-1
multielement, matrice 5%
HNO3, PerkinElmer Life and Analytical Sciences).
Parametrii de performanţă ai metodei
Liniaritatea metodei a fost evaluată prin valoarea factorului de corelaţie R, constatându-se o bună
liniaritate pe domeniul de concentraţie investigat (R>0.999).
Tabel 2. Parametrii de performanta ai metodei analitice
Element Coeficient
de
corelatie
Repeta-
bilitate
(%)
LOD*
(mg/kg)
IAEA-359 NCS ZC 85006
Valoare
certificate
[mg/kg]
Valoare
determinata
[mg/kg]
Grad de
recuperare
(%)
Valoare
certificata
[µg/g]
Valoare
determinata
[µg/g]
Grad de
recuperare
(%)
V 0.99963 3.2 0.001 - - - 3.84±±NA 3.867±0.077 100
Mn 0.99958 1.9 0.002 31.9±1.59 34,668±1.766 108 87.100±7.300 84.603±2.262 97
Ni 0.99803 2.7 0.005 1.05±0.05 0.947±0.051 90 2.23±NA 2.345±0.162 105
Zn 0.99624 1.6 0.003 38.6±1.93 23.19±1.65 60 36.200±3.100 17.400±1.220 48
As 0.99958 4.5 0.0005 0.1±0.005 0.09±0.005 90 1.050±NA 0.828±0.025 79
Sr 0.99998 1.4 0.0005 49.2±2.46 38.84±1.87 79 569±NA 534.00±24.520 94
Cd 0.99955 2.6 0.003 0.12±0.006 0.116±0.003 97 0.820±0.090 0.596±0.039 73
Ba 0.99902 1.6 0.0005 11±0.55 9.994±0.281 91 55.2±NA 46.152±1.780 84
Pb 0.99959 4.7 0.0005 - - - 4.970±0.540 3.868±0.407 78
Fe 0.99957 2.1 0.003 148±7.40 145.624±7.193 98 1380±NA 1455±77.349 105
Cr 0.99968 2.1 0.001 1.3±0.06 1.392±0.120 107 - - -
Cu 0.99989 1.8 0.006 5.67±0.28 4.757±0.050 84 21.100±2.500 18.879±0.755 89
NA-nespecificat; *LOD=limita detectie
Limita minimă de detecţie reprezintă cea mai mică concentraţie sau cantitate de analit care poate fi
măsurată cu certitudine statistică rezonabilă. Limita de detecţie s-a calculat după formula:
]/[**3 blankprobaprobablank IIconcSDLOD unde: SDblank - este abaterea standard pentru semnalul
înregistrat pe blank pentru elementul studiat, Concprobă - este concentraţia probei in µg/l, Iprobă, Iblank - sunt
intensităţile de semnal înregistrate pentru probă şi blank respectiv. Precizia metodei analitice care
exprimă gradul de concordanţă între rezultatele unei serii de măsurări a fost evaluata prin deviatia
standard in conditii de repetabilitate. Parametrii de performanta ai metodei analitice sunt prezentati in
tabelul 2. Valorile determinate au fost in acord cu valorile certificate, exceptie fiind la Zn unde s-a
obtinut un factor de recuperare de 60, respectiv 48 %.
Studii privind conţinutul de metale în probe de lapte
Prezentul studiu vizează caracterizarea din punct de vedere al metalelor al unor probe de lapte.
ICP-MS presupune analiză probelor în stare lichidă, că urmare probele au fost uscate şi digerate la
presiune şi temperatura ridicată în amestec de acizi (HNO3 60% ultrapur, HF 40 %). Determinările au
fost realizate cu un spectrometru de masă cuplată inductiv de tip Perkin-Elmer Elan DRC(e) utilat cu un
nebulizator Meinhart. Condiţiile experimentale au fost: flux de argon din nebulizator: 0.86 L/min; flux
gaz auxiliar: 1.2 l/min; flux argon din plasmă: 15 Lmin; puterea de RF în plasmă: 1100 W; CeO/Ce =
0.030; Ba++/Ba+ = 0.025. Tabelul 3 prezintă concentratiile de elemente în probele de lapte analizate,
specificând valorile minime şi maxime ale acestora în funcţie de specia animală.
8
Tabel 3. Concentratii metale in probele de lapte analizate
Element Concentratii metale [mg/kg material uscat]
Probe lapte vaca Probe lapte oaie
Valori minime Valori maxime Valori minime Valori maxime
V <LOD 0.277±0.030 0.035±0.007 0.210±0.013
Mn 0.064±0.006 1.403±0.077 0.230±0.020 0.843±0.023
Ni <LOD 7.622±0.690 0.028±0.005 3.583±0.211
Zn 4.697±0.990 61.724±5.907 11.300±1.021 27.893±1.159
As <LOD 1.007±0.050 <LOD 0.125±0.014
Sr 1.434±0.016 4.836±0.163 1.590±0.035 6.245±0.047
Cd <LOD 0.028±0.002 0.0009±0.001 0.031±0.03
Ba 0.19±0.009 27.249±1.064 0.307±0.017 1.340±0.050
Pb <LOD 0.416±0.044 <LOD
Fe <LOD 162.413±15.591 <LOD 61.393±5.382
Cu 0.125±0.011 20.552±1.057 0.383±0.009 5.078±0.105
Cr <LOD 48.726±3.461 6.535±0.959 24.271±1.450 *LOD=limita detectie
3.4. Determinarea NTG, NCS, izolarea bacteriilor din genurile Staphyloccocus, Escherichia,
Bacillus si confirmarea prin tehnica moleculara
Pentru determinarea numărului total de germeni mezofili aerobi (NTG) s-a utilizat protocolul
descris în cadrul standardului SR ISO 4833/2003. Pe scurt, tehnica de lucru a presupus efectuarea
diluţiilor seriate şi însǎmânţarea din fiecare diluţie pe agar simplu (PCA – Plate Count Agar) (Oxoid,
Anglia). Incubarea s-a realizat la 30ºC timp de 48-72 h. Determinarea numǎrului total de celule somatice
(NCS cel/ml) s-a realizat cu ajutorul aparatului automatizat Fossomatic.
Identificarea şi izolarea bacteriilor E. coli: s-a realizat conform protocolulut în standardul SR ISO
7251/1996. Pe scurt, izolarea s-a realizat printr-o prealabilǎ etapǎ de preîmbogǎţire pe bulion cu triptoză
şi lauril sulfat simplu şi dublu concentrat şi însǎmânţare pe mediu selectiv TBX (tripton – bilǎ – X
gluconorid) ; Tabel 4. Secvenţele primerilor specifici pentru confirmarea speciilor bacteriene
I
Identificarea germenilor Staphylococcus s-a realizat conform standardului internaţional SR EN
6888/1/2002, prin însǎmânţarea la suprafaţa mediului selectiv Baird – Parker (2 plǎci/probǎ).
Din probele de brânzeturi (telemea și caș de vacă, oaie și capră) s-a prelevat o cantitate de 10 g în
suspensie cu 100 ml apǎ peptonatǎ sterilǎ, omogenizate la dispozitivul Stomacher, şi mai apoi efectuate
diluţii zecimale. 1 ml din fiecare diluţie a fost însǎmânţatǎ pe mediul selectiv utilizat. Plǎcile au fost
incubate la temperatura de 37ºC, timp de 24 – 48 ore.
Pentru identificarea bacteriilor Bacillus cereus s-au urmat paşii prevǎzuţi în standardul SR EN
7932/2003, însǎmânţarea realizându-se pe mediul MYP (Merck KgaA, Germania) – Cereus selective agar
base, cu adaos de polimixină şi gălbenuş de ou (Merck pentru mediu MYP), preparat conform
instrucţiunilor de pe ambalaj. Incubarea s-a făcut la 30°C la termostat, iar rezultatele au fost citite la 24 şi
48 de ore.
Metoda PCR de confirmare a bacteriilor
Pentru confirmarea germenilor patogeni prin metoda molecularǎ s-au parcurs etapele esenţiale de
realizare:
Microorganism Secvenţa Primerilor Gena ţinta, (mǎrimea
produsului/pb)
Referinţǎ
bibliograficǎ
E. coli GAAGAGTCCTGGGATTACG (F)
AGCGATGCAGCTATTAATAA (R)
Toxina VT1 subunitatea B
(130)
Pollard şi col. (1990)
Staphyloccocus
aureus
AGCTGTGGATTGTCCTTTGG (F) 23S ARNr (499) Cremonesi (2005)
TCGCTCGCTCACCTTAGAAT (R)
Bacillus cereus
GAGAGTTTGATCCTGGCTCCAG 16S ARNr (468) Selvakumar (2007)
CTACGGCTACCTGTTACGA
9
Extracţia ADN: s-a realizat cu ajutorul unui protocol de extracţie anterior prezentat de Lǎpuşan
(2012). Pe scurt, acest protocol utilizeazǎ un reactiv CHELEX utilizat pentru o eficientizare mai mare a
extracţiei datoritǎ particularitǎţilor acestuia de a lega metalele grele şi astfel potenţialii inhibitori de
reacţie.
Protocolul de amplificare (PCR):
S-au pregătit tuburi Eppendorff de capacitate 200µl în care s-au adǎugat: 12.5 µl MyTaq
(Bioline), 1µl primer Forward; 1µl primer Reverse, 4 µl ADN şi 6.5 µl apǎ purǎ PCR. Volumul final:
25µl. Primerii selecţionaţi pentru confirmarea speciilor bacteriene au fost prelevaţi din articole de
referinţǎ şi precizaţi în tabelul 4.
Evaluarea NTG şi NCS din probele de lapte crud de vacă şi oaie
În lunile februarie-martie, încărcătura medie de germeni din probele de lapte de vacă recoltate a fost de
26.550± 27.507 ufc/ml. În lunile aprilie-mai, încărcătura medie de germeni din probe a fost de 43.921±
75.222 ufc/ml. În lunile iunie-iulie, încărcătura medie de germeni a fost de 84.091± 74.397 ufc/ml. În
lunile august-septembrie media încărcăturii de germeni din probele recoltate a fost de 56.017± 82.037
ufc/ml. În lunile octombrie-noiembrie, media în cazul probelor a fost de 40.681± 48.614 ufc/ml (fig. 3a,
3b).
În privința valorilor NCS și NTg în cazul probelor de lapte de oaie s-au obși NTg în cazul
probelor de lapte de oaie s-au obținut următoarele valori ale mediei geometrice: ianuarie-februarie-martie
NCS 163700±24520 cel/ml, NTG 1.133.000±562000 ufc/ml. în perioada aprlie-mai-iunie valorile NCS
au fost de NCS 1.262.000±356250 cel/ml, iar pentru NTG de 747.000±256000 ufc/ml. valori mai scazute
au fost determinate în intervalul iulie-august-septembrie, de 89000±15600 cel/ml, respectiv
516000±154200 ufc/ml în privința NTG. În ultima perioadă evaluate, octombrie-noiembrie valorile NCS
au fost de 74000±35600 cel/ml iar a NTG de 594000±298000 ufc/ml. Din cele 44 probe individuale de
lapte de oaie analizate, 16.5% au deposit limitele maxime admise de Reg. CE 853/2004.
Feb-Mar Apr-Mai Iun-Iul Aug-Sep Oct-Noi Dec
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
110000
120000
130000
140000
150000
160000
40681
7206756017
84091
43921
Num
ăr/m
l
Fig. nr. 6.12. Valorile medii ale NTG în perioada februarie - decembrie pentru laptele crud (n=8)
26550
Limita maxima admisă
Feb-Mar-Apr Mai-Iun-Iul Aug-Sep-Oct Noi-Dec
0
100000
200000
300000
400000
500000
252709
146470
211000
Num
ăr/m
l
Fig. nr. 6.13. Valorile medii ale NCS în perioada februarie - decembrie pentru laptele crud (n=8)
76470
Limita maxima admisă
Figura 3a, b. Valorile medii ale NTG şi NCS în intervalul februarie – decembrie pentru laptele crud de vacă
Din analiza datelor obţinute pentru perioada februarie-decembrie 2015, s-a constatat că rezultatele
au fost următoarele: astfel în lunile februarie-martie-aprilie valorile au fost cuprinse între 8.000-221.000
cel/ml, cu valoarea medie de 76.470±60.188 cel/ml. În lunile mai-iunie-iulie valorile au fost cuprinse
între 22.000-1.058.000 cel/ml, cu valoarea medie de 211.000± 201.383 cel/ml. Datele obţinute în
următoarele luni august-septembrie-octombrie au fost cuprinse între 8000-492.000 cel/ml, cu valoarea
medie de 146.470± 134.045 cel/ml. În ultimele două luni luate în studiu, noiembrie şi decembrie valorile
au fost cuprinse între 17.000-831.000 cel/ml, cu valoarea medie de 252.709± 172.371 cel/ml prezentând
depăşiri ale valorii maxime admise.
10
Evaluarea prevalenţei germenilor din genurile: Staphyloccocus, Bacillus şi Escherichia coli
Rezultatele obţinute în urma investigaţiilor asupra prevalenţei germenilor patogeni în laptele crud
de vacă au relevat o incidenţa crescutǎ a bacteriilor din genul Staphylococcus spp. Astfel, din totalul de 45
de probe de lapte crud examinate, izolate pe mediu selectiv Baird Parker şi mai apoi confirmate prin PCR,
un total de 15.5% (7 probe) au fost pozitive (Fig. 4). Prevalenţa S. aureus în laptele de vacă este
comparabilă cu datele menţionate în literatura de specialitate şi raportate de alţi cercetǎtori (Normanno şi
col., 2007; Mork şi col., 2010; Shuiep şi col., 2009). Contaminarea intramamara a animalelor crescute
pentru producţia de lapte este probabil cea mai frecventǎ cauzǎ a incidenţei acestei bacterii în lapte şi
produse lactate. Contaminarea poate sǎ aparǎ de asemenea şi în timpul operaţiunilor de rǎcire, depozitare
şi procesare. Deşi S. aureus este o bacterie cunoscutǎ ca fiind patogenǎ la om şi animale, puţine informaţii
sunt disponibile în momentul de faţǎ asupra incidenţei şi potenţialului toxinogenic al acestor specii de
bacterii în laptele de vacă din arealul studiat. Din moment ce Staphylococcus aureus este un potenţial
patogen în concentraţii de peste 104
ufc/ml, dezvoltarea coloniilor de S. aureus trebuie prevenitǎ pentru a
evita un potenţial risc.
Fig. 4. Profilul electroforetic al fragmentului de 499 pb corespunzǎtor Staphyloccocus aureus ; M – etalon
(100 perechi de baze) ; 1-proba martor pozitiv (ADN – tulpinǎ de referinţǎ Staphyloccocus aureus; 2 – proba
martor negativ (apǎ purǎ); 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 – probe pozitive lapte de vacă
Cel mai crescut procent (73.33%) în cazul incidenţei bacteriilor patogene în laptele de vacă l-a
reprezentat E.coli cu un total de 33 probe pozitive din cele 45 examinate. Probele de lapte crud au relevat
prin urmare o contaminare crescutǎ cu coliformi. Contaminarea laptelui cu bacterii coliforme este
datoratǎ în mare parte deficienţelor în cadrul procesului de mulgere şi condiţiilor precare de igienǎ. E. coli
este una din bacteriile care existǎ în microflora normalǎ a tractului intestinal la om şi animale, ea fiind
factorul cauzator al simptomului de diaree şi alte boli relaţionate cu consumul de alimente contaminate
sever cu tulpini de E. coli producǎtoare de toxine.
Fig. 5. Colonii caracteristice de B. cereus izolate pe mediul selectiv MYP şi confirmarea prin PCR (1-
proba martor pozitiv; 2-5; 8-10 – probe negative; 6,7 – probe pozitive)
499 pb
M 1 2 3 4 5 6 M 7
8 9
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 M
11
Incidenţa germenilor B. cereus în lapte a fost scǎzutǎ în laptele de vacă, doar 2 probe din totalul de
45 au fost pozitive. Izolarea bacteriilor s-a realizat pe mediul selectiv MYP iar confirmarea s-a realizat
prin evaluarea caracteristicilor coloniilor (Fig. 5), examen microscopic şi tehnici moleculare (PCR).
Staphylococcus aureus în schimb este o bacterie incriminatǎ frecvent în toxiinfecţiile alimentare.
În cazul laptelui crud de vacă prezenţa acestei bacterii este îngrijorǎtoare. Variabilitatea prevelenţei S.
aureus a fost raportatǎ şi în alte studii. Aceastǎ variaţie este în mod obişnuit atribuitǎ schimbǎrilor
condiţiilor de management şi utilizǎrii diferitelor teste analitice ce uneori nu depisteazǎ mamitele
stafilococice la aceste specii. Incidenţa ridicatǎ a bacteriilor Staphylococcus şi E. coli poate fi atribuitǎ
faptului cǎ producǎtorii analizaţi, de capacitate micǎ, deţin o probabilitate mai crescutǎ de contamminare
încrucişatǎ prin manipularea mai precarǎ, neigienizarea recipientelor, sursǎ de apǎ neigienicǎ etc.
3.4. Dezvoltarea protocolului PCR pentru autentificarea produsului finit
Protocolul de lucru aplicat în vederea autentificarii produselor lactate a urmat paşii standard ai
protocolului molecular. Kitul utilizat în vederea extracţiei a fost Isolate II (Bioline), urmându-se în
conformitate paşii indicaţi de producǎtor.
Tehnica PCR
Pentru a putea evidenţia cu ajutorul tehnicii PCR prezenţa ADN bovin în produsele lactate s-au
preluat primeri specifici ambelor specii din studiul realizat de Sachinandan şi col. (2011). În cadrul
acestei cercetǎri setul de primeri specifici s-a obţinut în aşa manierǎ încât primerul Forward sǎ fie comun
ambelor specii (bovin şi caprin/ovin). Aceşti primeri ar trebui sǎ producǎ un amplicon de mǎrimea a 126
pb la ADN de vacǎ şi de 332 la ADN de caprǎ, respectiv 430 la ADN de oaie. Prezenţa ADN-ului de vacǎ
în amestecuri de lapte şi brânzeturi s-a realizat prin amplificarea secvenţei ţintǎ a ADNmt cu primerii
specifici de vacǎ (Primeri 1 şi 3) descrişi în tabelul nr. 5.
În paralel s-au efectuat determinǎri PCR de control, cu primeri specifici de caprǎ (Primeri 1 şi 2)
care au fost utilizaţi pentru a identifica diferitele concentraţii de lapte în amestec. Toate amplificǎrile PCR
s-au realizat într-un volum final de reacţie de 25 µl. Pentru a evita orice amplificare nespecificǎ s-a
realizat un protocol iniţial de amplificare în gradient pornind de la o temperaturǎ de aliniere a primerilor
de 60ºC, gradual redusǎ cu 1ºC pânǎ la atingerea temperaturii de 54ºC. La 54ºC, s-au realizat 35 de
cicluri. În fiecare ciclu temperatura de aliniere a fost urmatǎ de un pas de elongaţie la 72ºC timp de 30 de
secunde. Extensia finalǎ s-a realizat la 72ºC timp de 10 min.
Tabel 5. Secvenţele de primeri utilizaţi în cadrul aplicǎrii tehnicii PCR simplex şi multiplex
Secvenţa (5’- 3’) Lungime Temperatura de
topire
Specificitate
specie
Primer 1: ACTAGATCACGAGCTTGA
TCACCATGC
27 pb 60.2 comun
Primer 2 GCATCGAGACCTTGATCG
CAGTAGTCG
25 pb 59.2 caprǎ
Primer 3 ATGCCTCCTAAAATTCATT
AATATGCG
27 pb 60.1 vacǎ
Primer 4 GCTACAGGGCATAGATTT
CGATGCATGACT
27 pb 60.1 oaie
PCR duplex s-a realizat prin coamplificarea atât a segmentului ţintǎ din cadrul ADN de vacǎ cât şi
a celui de caprǎ/oaie. Parametrii utilizaţi în protocolul de amplificare au respectat în conformitate pe cei
descrişi de Sachinandan (2011).
Protocolul PCR a urmǎrit urmǎtorii paşi:
Etapa I: Pregătirea probelor pentru PCR simplex:
S-au pregătit tuburi Eppendorff de capacitate 200µl în care sau adǎugat: 12 ,5 µl MasterMix, 1µl
primer Forward; 1µl primer Reverse, 4 µl ADN şi 6,5 µl apǎ purǎ PCR. Volumul final: 25µl.
Etapa II: Pregătirea probelor pentru PCR duplex:
12
S-au pregătit tuburi Eppendorff de capacitate 200µl în care sau adǎugat: 12 ,5 µl MasterMix, 1µl
primer Forward; 1µl primer Reverse Vacǎ, 1µl primer Reverse Bivol, 4 µl ADN şi 5,5 µl apǎ purǎ PCR.
Volumul final: 25µl.
Etapa III: Amplificarea probelor:
Amplificarea probelor s-a realizat cu ajutorul unui termocycler (G-STORM).Aceastǎ etapǎ
presupune supunerea probelor la diferite temperaturi pentru a reconstitui fragmentul de ADN amplificat.
În cadrul programului de amplificare s-a urmărit pentru realizarea PCR simplex protocolul următor:
Denaturarea: 1x95°C→5 minute; Alinierea primerilor în mai multe stadii: 35x95°C→1 minut,
35x54°C→1 minut (primeri de vacǎ), 35x62°C→1 minut (primeri de caprǎ/oaie), 40x72°C→1 minut;
Elongaţia finală: 1x72°C →10 minute.
În cadrul programului de amplificare s-a urmărit pentru realizarea PCR multiplex protocolul
următor: Denaturarea: 1x95°C→5 minute; Alinierea primerilor în mai multe stadii: 35x95°C→1 minut,
35x58,5°C→1 minut, 40x72°C→1 minut; Elongaţia finală: 1x72°C →10 minute.
Etapa IV: Obţinerea profilelor electroforetice:
S-a realizat prin migrarea probelor de ADN amplificat într-un gel de agaroză de concentraţie
1,2%, iar pentru colorarea şi vizualizarea produşilor s-a folosit RedSafe (1,7µl – 35 ml/gel; 7µl – 140
ml/gel). Gelul de agaroză a fost introdus într-o cuvă de electroforeză iar citirea şi interpretarea reacţiei s-a
realizat cu ajutorul unui transiluminator BioRad.
Rezultate parţiale din urma testării
În cadrul activităţii s-a confirmat specificitatea primerilor, prin obţinerea amplificǎrilor
caracteristice, fǎrǎ a obţine rezultate fals pozitive. Primerii specifici (Primerul 1 şi 2) a amplificat un
fragment de 332 pb din ADN de caprǎ fǎrǎ a amplifica şi ADN de vacǎ. În mod asemǎnǎtor, amplificarea
doritǎ s-a obţinut şi în cazul speciei bovine prin utilizarea primerilor 1 şi 3 ce au produs un fragment de
126 pb pentru vacǎ.
Fig. 6: Rezultatele obţinute la amplificarea probelor prin PCR simplex şi testarea primerilor
M: marker de ADN (100 de perechi de baze);
1 – proba martor pozitiv pentru ADN de caprǎ;
2 – proba martor negativ din ADN de vacǎ;
3, 4, 5, 6 – probe pozitive la amplificarea cu primeri specifici de caprǎ;
8- proba martor pozitiv ADN de vacǎ;
9, 10, 11, 12 – probe pozitive pentru ADN de vacǎ identificate din produse lactate de caprǎ.
Dupǎ cum se poate observa din figura 6, în cazul produselor lactate de caprǎ, prin tehnica aplicatǎ,
s-a putut amplifica prin tehnica PCR simplex ADN de vacǎ. Probele care au fost amplificate în prima
jumǎtate a imaginii doar cu primerii 1 şi 2 specifici de caprǎ au fost amplificate separat şi cu primerii 1 şi
3 pentru vacǎ. În vederea testǎrii probelor lactate de oaie s-a testat acelaşi protocol PCR simplex doar cǎ
primerii desigur utilizaţi au fost specifici pentru oaie şi pentru vacǎ. Dupǎ cum se poate observa şi din
figura 7 la amplificarea cu primeri specifici de oaie, aceştia au fost foarte specifici neamplificându-se şi
produşi secundari de reacţie.
M 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10
11 12
332 pb
126 pb
13
Fig. 7 : Rezultatele obţinute la amplificarea probelor prin PCR simplex şi testarea primerilor de oaie şi de
vacǎ
M: marker de ADN (100 de perechi de baze) ;
1 – proba martor pozitiv pentru ADN de oaie (436 pb) ;
2 – 6 – probe pozitive la amplificarea cu primeri specifici de oaie;
7- proba martor pozitiv ADN de vacǎ ;
8 – probǎ negativǎ pentru ADN de vacǎ ;
9 – probǎ pozitivǎ la ADN de vacǎ.
Pentru a putea aproxima concentraţiile posibile de ADN de vacǎ din amestecul în produsele
lactate studiate, am realizat diluţii de ADN de vacǎ/caprǎ şi ADN de vacǎ/oaie, dupǎ care probele s-au
amplificat (fig. 8). Aceastǎ testare a concentraţiilor se realizeazǎ direct din ADN-ul extras pur de vacǎ şi
caprǎ dupa care probele sunt amplificat iar interpretarea se realizeazǎ dupǎ intensitatea benzilor
amplificate. Deşi nu este o tehnicǎ recunoscutǎ ca fiind sigurǎ în estimarea concentraţiilor totale de ADN
din amestec, ea a mai fost testatǎ si de cǎtre alţi cercetǎtori ce susţin acurateţea ei. Am dorit sa testǎm
acest lucru prin prisma faptului cǎ ADN-ul de vacǎ este acceptat în produsele lactate de altǎ origine în
concentraţie de sub 0.1%. Urmele de ADN de vacǎ sunt acceptate datoritǎ faptului cǎ acest lucru poate sǎ
se întâmple mai ales în unitǎţile mari de producţie datoritǎ contaminǎrii încrucisate sau utilizǎrii aceloraşi
echipamente în procesarea laptelui. Chiar dacǎ se utilizeazǎ dezinfectanţi şi se igienizeazǎ desigur
utilajele, în mod curent nu folosesc şi soluţii de decontaminare ADN.
Figura 8. Amplificarea probelor amestec de concentraţii cunoscute: 1- ADN vacǎ <0.1%; 2 – ADN vacǎ
<0.5%; ADN vacǎ – 10%; ADN vacǎ >10%.
Prin urmare am constituit patru probe martor de concentraţie <0.1% ADN, ADN < 0.5%, ADN -
10% şi ADN >10%. Aşa cum se poate observa din figura 7, la amplificare am constatat cǎ proba 1 de
concentraţie <0.1% avea o vizibilitate mai scǎzutǎ în gel, proba 2 de <0.5% o bandǎ la fel de vizibilǎ,
proba de concentraţie 10% şi peste 10% prezenta o bandǎ vizibilǎ, strǎlucitoare.
3.5. Dezvoltarea, implementarea şi integrarea componentelor platformei Web.
Platforma Web realizată pentru proiectul TRADFOOD-2014 are rolul de a permite participanţilor
la proiect să introducă, stocheze, prelucreze şi să prezinte rezultatele activităţii de cercetare întreprinse în
cadrul proiectului. De asemenea, persoanele intersesate să consulte rezultatele obţinute o pot face prin
M 1 2 3 4 5 6 7 8
9 M
436 126 pb
M 1 2 3 4
14
accesarea acestei platforme. Cu alte cuvinte Platforma este o aplicaţie Web de tip “Content Management”
adică de gestiune a conţinutului.
Pentru implementarea acestei platforme Web au fost folosite tehnologii Microsoft care includ:
mediul de dezvoltare Visual Studio 2010, limbajul C#, mediile de lucru .NET 4.0 şi ASP.NET 4.0,
sistemul de gestiune al bazelor de date SQL Server 2008 R2 Express, componentele din ADO.NET,
precum şi unele pachete şi biblioteci de funcţii şi pachete de componente suplimentare, care vor fi
menţionate acolo unde este cazul. În această etapă testarea s-a efectuat într-un mediu local (intranet), ea
urmînd a fi finalizată în Etapă a 3-a a proiectului prin publicarea în Internet. În acest fel platforma va
putea fi accesată de utilizatorii interesaţi. În continuare vor fi prezentate componentele sale principale şi
funcţionalitatea acestora.
3.5.1. Componentele platformei Web
Platforma Web TRADFOOD-2014 este alcatuită dintr-un Portal Web (TRADFOOD-2014) şi din
bazele de date aferente acestuia.
3.5.1.1. Bazele de date
Platforma Web dispune de două baze de date implementate cu sistemul de gestiune al bazelor de
date SQL Server 2008 R2 Express, administrate cu ajutorul SQL Server 2008 R2 Management Studio şi
accesate cu componentele din ADO.NET. Aceste baze de date poartă numele de TFP2014DB şi respectiv
TF2014DB.
Baza de date TFP2014DB
Prima baza de date a platformei Web este cea utilizată pentru configurarea şi structurarea
conţinutului Portalului TRADFOOD-2014 şi pentru administrarea acestuia. Ea poartă numele de
TFP2014DB. Tabelele din TFP2014DB permit stocarea unor informaţii de interes general referitoare la
domeniul de activitate specific proiectului şi/sau facilitează anumite activităţi/funcţionalităţi de tip
“gestiune a conţinutului” aplicabile domeniului şi proiectului de cercetare. Toate aceste informaţii sînt
prezentabile/afişabile în module corespunzătoare amplasate în diversele pagini ale Portalului. Tab. 6. Entitati si tabele din baza de date TFP2014DB:
Entitate Tabel Descriere
Anunt TFP2014_Anunturi pastreaza informatii de tip noutati si anunturi relevante pentru
domeniul de activitate si proiect.
Contact TFP2014_Contacte pastreaza informatii referitoare la persoanele de contact
Document TFP2014_Documente detine informatii despre documente specifice domeniului sau
referitoare la proiect, care sint accesibile prin intermediul
Portalului
Eveniment TFP2014_Evenimente pastreaza informatii referitoare la evenimente interesante pentru
domeniul de activitate si proiect
Forum de
discutii
TFP2014_Forum permite crearea si gestionarea unor schimburi de opinii intre
utilizatorii Portalului
HtmlText TFP2014_HtmlText permite stocarea unor informati de tip text explicativ pentru
diferitele module ale Portalului si formatarea acestora cu ajutorul
limbajului HTML
Legatura TFP2014_Legaturi stocheaza informatii despre legaturi )rapide= cu diverse site-uri de
interes pentru domeniul de activitate si pentru proiect
Rol TFP2014_Roluri memoreaza datele despre rolurile de securitate definite pentru
Portal
Utilizator TFP2014_Utilizatori,
memoreaza datele despre utilizatorii inregistrati pentru accesarea
Portalului
TFP2014_Utilizatori Roluri detine informatii despre asocierea utilizatorilor la rolurile de
securitate definite pentru Portal
Operatiunile de selectare, introducere, actualizare si stergere a inregistrarilor in/din tabelele acestei
baze de date sint efectuate pe baza de proceduri stocate.
Baza de date TF2014DB
15
Cea de a două baza de date a platformei Web este utilizată pentru stocarea datelor de business ale
proiectului TradFood-2014 şi poartă numele de TF2014DB.
Plecînd de la studierea amănunţită a domeniului de activitate – analiză probelor prelevate de la unităţile
de producţie a produselor tradiţionale pe baza de lapte - au putut fi identificate conceptele, terminologia,
obiectele, relaţiile, semnificaţiile şi regulile de operare din domeniu. Ansamblul acestor cunoştinţe care
cuprinde categoriile fundamentale ale domeniului de activitate se constituie într-un model de date pentru
domeniul de activitate vizat.
Principalele categorii ale modelului sînt prezentate, din punct de vedere funcţional, în tabelul de
mai jos, împreună şi alăturat cu tabelele modelului de date, şi însoţite de o descriere succintă, cu
observaţii şi scurte adnotări. Tab. 7. Entitati si tabele din baza de date TF2014DB
Categorie Tabel Descriere
Zona (regiunea) geografica tblR Zona de interes care a fost aleasa pentru culegerea datelor
Unitati de productie tblUP Unitatile de productie participante la proiect
Produs traditional tblPT Produsele traditionale vizate in proiect
tblUP_PT Structura pentru implementarea relariei n-la-n intre unitatile de
productie si produsele traditionale
Elementul analizat (matricea) tblEA Elementele analizate (matricea) in cadrul proiectului
Tipul de analiza tblTA Tipurile de analize efectuabile in cadrul proiectului pentru fiecare
element analizat (matrice)
Parametrul analizabil tblP Parametrii analizabili in cadrul proiectului pentru fiecare tip de
analiza
Valori de referinta tblVRP Valorile de referinta pentru parametrii analizabili in cadrul
proiectului
Caracteristici unitate productie tblCUP Valorile masurate ale parametrilor analizabili pentru diferitele
probe prelevate de la unitatile de productie
Procese verbale tblPV,
tblDPV
Procesele verbale de prelevare a probelor de la unitatile de
productie
Buletine de analiza tblBA,
tblDBA
Buletinele de analiza cu valorile masurate ale parametrilor pentru
probele analizate
Documente tblVBAD
tblVDBAD
Buletine de analiza obtinute si stocate ca documente in format
electronic (.doc, .docx, pdf, ...)
tblVPVD Procese verbale obtinute si stocate ca documente in format
electronic (.doc, .docx, pdf, ...)
Ca exemplu pentru conţinutul tabelelor din baza de date TF2014DB prezentăm:
Tabel 8. Continutul tabelei tblP alcatuit din parametrii analizati in cadrul fiecarui tip de analize:
Denumire Descriere
RI Azot Raport intre izotopii de azot 15 si 14
RI Carbon Raport intre izotopii de carbon 13 si 12
RI Hidrogen Raport intre izotopii de hidrogen 2 si 1.
RI Oxigen Raport intre izotopii de oxigen 18 si 16.
RI Plumb Raport intre izotopii de plumb 206 si 207.
RI Strontiu Raport intre izotopii de strontiu 87 si 86.
Calciu Macroelement – Calciu , Fluor Macroelement - Fluor
Magneziu Macroelement – Magneziu, Potasiu Macroelement - Potasiu
Sodiu Macroelemente – Sodiu, Aluminiu Microelemente - Aluminiu
Bariu Microelemente – Bariu, Cobalt Microelemente - Cobalt
Crom Microelemente – Crom, Cupru Microelemente - Cupru
Fier Microelemente - Fier , Mangan Microelemente - Mangan
Nichel Microelemente – Nichel, Vanadiu Microelemente - Vanadiu
Zinc Microelemente – Zinc, Arseniu Metal toxic - Arseniu
Plumb Metal toxic – Plumb, Cadmiu Metal toxic - Cadmiu
Mercur Metal toxic - Mercur , Acid dezoxiribonucleic
Metoda extractie ADN (identificare specie) din lapte si brinzeturi
Numar total de germeni
Numarul total de germenidin proba analizata
Numar celule somatice
Numarul de celule somatice din proba analizata
Escherichia coli Germenul patogen (bacteria) eschericia coli (E.coli)
Staphilococcus Germenul patogen (bacteria) Staphilococcus
Bacillus Germenul patogen (bacteria) Bacillus
16
Grasime Cantitatea de grasime din proba analizata
Proteine Cantitatea de proteine din proba analizata
Cazeina Cantitatea de cazeina din proba analizata
Lactoza Cantitatea de lactoza din proba analizata
Punct crioscopic Punctul de inghetare al probei analizate
Substanta uscata negrasa (degresata)
Cantitatea de substanta uscata negrasa din proba analizata
Densitate Densitatea probei analizate [kg/m3]
Uree Uree
pH pH
Substanta uscata totala
Cantitatea de substanta uscata totala din proba analizata
Obs.: Descrierea completă a bazelor de date şi procedurilor stocate asociate va fi cuprinsă in manualul
de realizare a platformei web, la finalul etapei a 3-a.
3.5.2. Portalul TRADFOOD-2014
Portalul TRADFOOD-2014 este o aplicaţie de tip Web site implementată cu ajutorul cadrului de
lucru ASP.NET 4.0 şi a limbajului C#, care are menirea să gestioneze conţinutul (datele) aferent
proiectului. În fig. 1 este prezentată o imagine cu prima pagină, după care sunt descrise succint
principalele componente ale portalului Tradfood-2014.
Obs.: Componentele Portalului şi descrierea lor completă vor fi prezentate în manualul de realizare a
platformei, la finalul etapei a-3-a.
Fig. 9. Prima pagina a portalului
3.5.2.1. Componentele pentru accesul la date TRADFOOD-2014
Pentru deservirea Portalului au fost proiectate si implementate două grupe de componente pentru
accesul la date. Ele toate alcatuiesc nivelul de acces la date al aplicatiei.
Componente pentru accesul la datele primare (de “business”) ale proiectului
Pentru accesul la datele primare (de “business”) ale proiectului a fost proiectată şi implementată
câte o componentă pentru fiecare entitate utilizată în baza de date a datelor de “business”. Aceste
componente au fost implementate sub formă unor clase C# purtînd numele generic ServiciuYYY.cs unde
YYY reprezintă numele entităţii pe care o deservesc. Ele sînt stocate în directorul DAL al site-ului.
Fiecare clasa din categoria ServiciuYYY.cs are sarcina de a efectua operaţiile (SELECT, INSERT,
UPDATE şi DELETE) tipice de acces la tabelul corespunzător (şi tabelele corelate acestuia) din baza de
17
date TF2014DB folosindu-se comenzi parametrizate, compuse dinamic şi executate cu ajutorul claselor
din ADO.NET . În cazul execuţiei cu succes a operaţiei cerute rezultatele se regăsesc fie în baza de date
fie în interfaţă utilizator corespunzătoare (controale din paginile Portalului). În cazul unui eşec, datorat
unei erori, această se înregistrează în jurnalele de evenimente ale sistemului şi sînt raportate şi în interfaţă
cu utilizatorul din paginile Portalului.
Componente pentru accesul la datele de configurare, de continut si de administrare ale
portalului
Pentru accesul la datele de configurare, de continut si de administrare ale portalului a fost
proiectata si implementata cite o componenta pentru fiecare entitate utilizata in baza de date a Portalului.
Ele sint stocate in directorul Componente al site-ului.
3.5.2.2. Componente pentru preluarea de la utilizator a datelor primare
Datele obţinute în cadrul proiectului sînt preluate de la utilizator şi constituie datele de baza,
primare, pe care le putem numi datele de “business” ale proiectului. Pentru preluarea datelor primare s-au
proiectat şi implementat componente pentru fiecare entitate de “business” a proiectului. Acestea pot fi
grupate după cum urmează:
a) componentă pentru gestionarea zonelor/regiunilor geografice şi a unităţilor de producţie
b) componentă pentru gestionarea articolelor comerciale (produse tradiţionale)
c) componentă pentru gestionarea parametrilor analizabili, care este compus din următoarele
module:
• modulul pentru gestionarea elementelor analizate (matrici)
• modulul pentru gestionarea tipurilor de analize
• modulul pentru gestionarea parametrilor analizabili
• modulul pentru gestionarea valorilor de referinţă pentru parametri analizabili
• modulul pentru gestionarea valorilor măsurate pentru parametri analizabili
Obs: Conform specificaţiilor proiectului aceste entităţi vor fi relaţionate în aşa fel încît vor rezultă
“restricţii” de utilizare a anumitor parametri, tipuri de analize şi elemente analizate.
d) modul pentru gestionarea proceselor verbale de prelevare probe de la unităţile de producţie
e) modul pentru gestionarea buletinelor de analiză a probelor prelevate
Fiecare componentă este alcătuită din seturi de subcomponente, iar acestea, la rîndul lor, din
module care poartă nume generice de formă XXX.ascx[.cs], EditXXX.aspx[.cs], respectiv
LoadXXX.aspx[.cs]. Ele sînt localizate în directorul ModulePC al site-ului Web şi sînt responsabile, pe
de o parte, pentru preluarea (introducere), validarea şi transmiterea datelor primare către nivelul de acces
la bazele de date, iar pe de altă parte, pentru extragerea, la cerere, a acestora, transferarea lor către
componentele de prelucrare şi analiză şi, în final, pentru prezentarea lor în diverse formate.
3.5.2.3. Componente pentru gestionarea documentelor proiectului
Documentele utilizate in cadrul proiectului TRADFOOD-2014 (procese verbale, buletine de
analiza si detalii pentru buletinele de analiza) pot fi pastrate, in cadrul Portalului, cu ajutorul componentei
pentru gestiunea documentelor, in diverse formate: Microsoft Office Word, Adobe PDF sau scanate in
format imagine (binar).
Aceasta componenta permite incarcarea documentelor pe server (in folderul uploads), gestiunea versiunilor
documentelor si afisarea continutului acestora.
3.5.2.4. Componente pentru administrarea Portalului si a securitatii acestuia
Administrarea Portalului este efectuata de utilizatorii inregistrati si asociati rolului de
administrator. In vederea administrarii Portalului si a securitatii acestuia a fost proiectata si implementata
18
cite o componenta pentru gestionarea fiecarei entitati implicate in configurarea si administrarea
Portalului. Aceste componente sint localizate in directorul Admin al site-ului.
Functiile indeplinite de componentele pentru administrarea Portalului se impart in urmatoarele categorii:
stabilirea parmetrilor Portalului,
gestiunea (adaugare/modificare/stergere) paginilor cu eticheta,
gestiunea conturilor de utilizator si a rolurilor de securitate,
gestiunea modulelor pentru continut ale Portalului,
afisarea inregistrarilor jurnalului de erori.
3.5.3. Planul de testare pentru Platforma Web-Portalul TradFood-2014
3.5.3.1. Planul de testare a cerintelor functionale pentru Platforma Web-Portalul TradFood-
2014
In acest capitol este prezentat planul de testare a cerintelor de functionalitate pentru Platforma
Web (Portalul TRADFOOD-2014) asa cum au fost ele identificate in specificatia cerintelor de
functionalitate pentru Portalul TRADFOOD-2014. Procesul de testare cuprinde zeci de proceduri de test
prin care se demonstreaza indeplinirea functiilor proiectate. Descrierea lor completa, cu rezultatele
obtinute, va fi cuprinsa la finalul proiectului in manualul de realizare al platformei. In continuare
enumeram cateva categorii de teste, pentru care s-a inceput validarea functionala in aceasta etapa (tabel
9).
Tabel 9. Plan de testare a cerintelor de functionalitate – exemple de proceduri de testare
Id
Test
Functionalitate
Id
Accep-
tanta
Descriere Obs.
TF01 Accesarea portalului Folosind browserele cel mai uzuale (vezi
Tabelul X) se incearca accesarea primei pagini
a TradFood-2014.
OK
….
TF19 Atribuie rol pentru
utilizator
Atribuie un rol nou unui utilizator existent in
baza de date a portalului. Atribuirea a fost
efectuata?, in caz contrar la eroare mesaj: ”rolul
nou nu a putut fi atribuit utilizatorului”
Admins
OK
….
Alte teste cuprinse in plan: Listare tipuri de analize, Listare parametri analizabili, Lista valorilor de
referinta pentru parametrii analizabili, Lista caracteristicilor (valori masurate) pentru unitatea de
productie, Lista zonelor /regiunilor studiate, Lista proceselor verbale (PV) de prelevare probe, Lista
produselor traditionale aflate in studiu, etc.
TF… Lista buletinelor de
analiza (BA) a
probelor
Obtine lista tuturor BA a probelor OK
3.5.3.2. Planul pentru testele nefunctionale
Urmatoarele teste au fost folosite pentru testarea cerintelor nefunctionale ale aplicatiei Portal
TradFood-2014.
Test ID Functionalitate Descriere Obs.
TNF01 Testarea „browser”-
elor
Este posibila folosirea fara probleme a
diferitelor „browser”-e mai populare?
Vezi nota de mai
jos
TNF02 Vizibilitatea Vizibilitatea continutului este buna, usor OK
19
… paginilor, a
formularelor si a
rezultatelor
de citit, fara suprapuneri intr-o pagina
complet populata?
Nota: Pentru testare s-au utilizat urmatoarele “browser”-e:
Test\Browser Internet Explorer
9.1, 11.0
Netscape
Navigator
9.0.0.6
Mozilla Firefox
41.0.2
Acces si
conectare in rol
de administrator
OK, OK, OK,
3.5.3.3. Executia testelor de functionalitate
3.5.2.5. Componente pentru prelucrarea, analizarea si prezentarea datelor primare (de
“business”) ale proiectului si a rezultatelor obtinute
Obs.:Componentele pentru prelucrarea, analizarea si prezentarea datelor primare (de “business”) ale
proiectului urmeaza sa fie proiectate si implementate in etapa urmatoare a proiectului.
3.5.3.3.1. Testul de accesare a portalului TradFood-2014
Testul de accesare a portalului se executa de pe alt calculator decit cel care gazduieste aplicatia
Portal TradFood-2014 si foloseste un “browser” Web.
Figura 10. Conectarea la pagina de start a portalului TradFood
Pentru testul de conectare la aplicatia Portal TradFood-2014 se
introduce in cimpul “Adresa” al “browser”ului sirul de caractere:
http://<url>/WebSite_TFP_2014/PaginaStart.aspx
Rezultatul este afisarea paginii de start a portalului (Prima pagina), a carei
aspect este prezentat in figura urmatoare.
3.5.3.3.2. Teste pentru administrarea portalului
20
Teste pentru gestiunea utilizatorilor, a securitatii si a confidentialitatii datelor
Testul de înregistrare a unui utilizator al portalului
Pentru executarea testului se accesează portalul, se da click pe link-ul Înregistrare şi apoi se introduc
valorile necesare pentru definirea unui utilizator (nume, adresa de e-mail şi parolă cu reconfirmare). În
final, se da click pe link-ul “Înregistrează şi conectează acum”. Modulul de administrare afişează
avertismente la introducerea unor valori incorecte sau neconforme cu standardele, prin mesaje afişate cu
culoarea roşie, după cum se vede în figurile de mai jos.
Verificarea înregistrării cu succes a utilizatorului se face prin faptul că în antetul primei pagini a
portalului apare link-ul cu mesajul de “Bun venit:” urmat de adresa de e-mail a utilizatorului înregistrat,
iar faptul că s-a executat conectarea cu succes a utilizatorului prin apariţia link-ului Deconectare.
Notă: Verificarea se mai poate face şi prin vizualizarea directă a tabelului TFP2014_Utilizatori din baza
de date pentru portal, folosind SQL Server Management Studio.
Testul de conectare la portal
Pentru executarea testului se accesează portalul, se introduc valorile necesare pentru conectarea unui
utilizator (adresa de e-mail şi parolă), apoi se da click pe “link”-ul Conectare. Modulul de administrare
verifică existenţa unui utilizator înregistrat, avînd adresa de e-mail indicată şi dacă acesta este găsit în
baza de date execută conectarea. În caz contrar, sau dacă parolă nu a fost introdusă corect, modulul
afişează, cu culoare roşie, un mesaj de “Conectare ratată”.
Testul de deconectare de la portal
Pentru executarea testului se accesează portalul, se introduc valorile necesare pentru conectarea unui
utilizator (adresa de e-mail şi parolă), apoi se da click pe link-ul Conectare. Se verifică faptul că
utilizatorul este conectat (vezi paragrafele anterioare), apoi se da clic pe link-ul Deconectare aflat în
partea greapta a antetului portalului. Modulul de administrare execută deconectarea utilizatorului, şi
afişează prima pagină a portalului. Verificarea se face prin observarea dispariţiei linkurilor Bun venit:
<adresa e-mail> şi Deconectare din antetul portalului, cît şi a afişării primei pagini a portalului.
Testul de memorare a conectării
Pentru executarea testului se accesează portalul, se introduc valorile necesare pentru conectarea unui
utilizator (adresa de e-mail şi parolă), apoi se activează casetă Ţine minte conectarea şi în final da clic pe
link-ul Conectare. Se verifică faptul că utilizatorul este conectat (vezi paragrafele anterioare), apoi se
opreşte browser-ul. Se reporneşte browser-ul şi de accesează portalul. Verificarea funcţionalităţii se face
prin observare faptului că utilizatorul a rămas conectat, în ciuda opririi browser-ului.
Testul de gestionare a rolurilor pentru securitate
Administrarea rolurilor pentru securitate se face de către administratorul portalului (sau de un utilizator
care deţine rol de administrare) folosind pagină de administrare. Accesul la această pagină afişează (între
altele) lista rolurilor definite.
Notă: Verificarea se poate face şi prin accesarea tabelelor bazei de date a portalului folosind SQL Server
2008 R2 Express Management Studio.
Teste pentru gestiunea conţinutului (publicare-adăugare/actualizare/ştergere)
Obs.: Gestiunea şi analiză conţinutului va continuă şi în Etapă a 3-a/2016. Descrierea completă a compo-
nentelor şi procedurilor de testare va fi cuprinsă în manualul de realizare prezentat la finalul etapei a -3-a.
Concluzii
1. Identificarea originii geografice este dată de coroborarea rapoartelor izotopice ale carbonului şi
oxigenului cu elementele Mn şi Sr;
2. Diferenţierea dintre laptele provenit de la cele două specii (vacă şi oaie) se face cu ajutorul
combinaţiei de markeri: rapoarte izotopice ale hidrogenului şi concentraţia de Sr.
3. S-a validat metodă de determinare cantitativă a urmelor de metale prin ICP-MS determinându-se
parametrii de performanţă ai metodei.
21
4. Diferenţele izotopice observate în lapte şi care sunt datorate pulsului izotopic vara-toamna, au fost de
aproximativ 3‰ pentru (δ18O) respectiv 6‰ pentru (δ13C). Aceste diferenţe au apărut, atât datorită
variaţiilor naturale ale compoziţiilor izotopice a apei consumate de animale în cele două anotimpuri
cât şi aportului diferit de iarnă şi furaj uscat din dietă acestora.
5. Deşi încărcătură totală de germeni a înregistrat valori individuale neconforme în cazul a 23.52%,
majoritatea înregistrându-se în perioada iunie-septembrie, ceea ce sugerează posibile deficienţe ale
instalaţiei de răcire, iar celulele somatice au prezentat valori neconforme în cazul a 8.82% din totalul
probelor individuale examinate, în cursul trimestrelor ÎI şi IV, toate probele examinate s-au încadrat
în limitele maxime conform Reg. 853 (CE)/2004.
6. Extracţia de ADN în vederea amprentării moleculare a produselor obţinute în cadrul arealului studiat
poate fi aplicată cu succes, protocolul original de extracţie fiind testat şi optimizat în vederea
obţinerii unor cantităţi şi purităţi ADN corespunzătoare.
7. Rezultatele obţinute în urmă investigaţiilor asupra prevalenţei germenilor patogeni în laptele crud de
vacă au relevat o incidenţa crescutǎ a bacteriilor din genul Staphylococcus spp. şi E.coli, prezenţa
confirmată şi prin tehnică PCR.
8. Protocolul de autentificare a speciei în cadrul produselor lactate a fost dezvoltat şi optimizat cu
succes, fiind posibilă cuantificarea ADN-ului de amestec pe baza etalonului creat şi a tehnicii de
amplificare descrise.
9. Componentele Tradfood de acces la date au fost implementate sub formă unor clase C#, folosindu-se
comenzi parametrizate, compuse dinamic şi executate cu ajutorul claselor din ADO.NET. Procesul de
testare a fost derulat intranet pentru această etapă, va fi finalizat pentru toate funcţionalităţile şi va fi
reluat, complet, în Internet în etapă a-3-a.
Diseminarea rezultatelor
Rezultatele obţinute au fost prezentate în cadrul unor simpozioane naţionale cu participare
internaţională, fiind publicate în reviste de specialitate indexate ISI (3 articole, din care două acceptate
spre publicare, iar unul în evaluare), BDI (2 articole publicate), precum şi în cadrul unor conferinţe
internaţionale (2 postere). În prvinţa rezultatelor obţinute în ultimul trimestre, membrii echipei au în lucru
un material care va fi trimis pentru publicare la o revistă indexată ISI.
Bibliografie
1. Ammann, A.A. (2007). Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS): a versatile tool
Journal of Mass spectrometry 42: 419-427
2. Becker J.S., Dietze H.J. (2003) State of-the art in inorganic mass spectrometry for analysis of high –
purity materials, International Journal of Mass Spectrometry 228, 127-150
3. F. Camin et al., (2012). H, C, N and S stable isotopes and mineral profiles to objectively guarantee the
authenticity of grated hard cheeses, Analytica Chemica Acta, 711, 54-59
4. Mørk T., Kvitle B., Mathisen T., Jørgensen H.J., 2010, Bacteriological and molecular investigations of
Staphylococcus aureus in dairy goats. Vet. Microbiol. 141, 134-141.
5. Normanno T.G., La Salandra A.G., Dambrosio N.C., Quaglia M., Corrente A., Parisi G., Santagada A.,
Firinu E., Crisetti G., Celano V., 2007, Occurrence, characterization and antimicrobial resistance of
enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolated from meat and dairy products. Int. J. Food Microbiol.
115, 290-296.
6. Sachinandan De, 2011, Simplex and duplex PCR assays for species specific identification of cattle and
buffalo milk and cheese, Food Control 22(2011) 690-696;
7. Shuiep E. S., Kanbar T., Eissa N., Alber J., Lämmler C., Zschöck M., El Zubeir I. E. M., Weiss R., 2009,
Phenotypic and genotypic characterization of Staphylococcus aureus isolated from raw camel milk
samples. Res. Vet. Sci. 86, 211-215.
8. *** Regulamentul (CE) nr. 853/2004 al Parlamentului European şi al Consiliului din 29 aprilie 2004
de stabilire a unor norme specifice de igienă care se aplică alimentelor de origine animală.
