Embed Size (px)
Citation preview
Raport științific
privind implementarea proiectului în perioada octombrie 2011– octombrie 2014
Acest proiect isi propune sa studieze celulele interstitiale din muschiul scheletic, implicarea lor in regenerarea
musculara si contributia acestora la structurarea si mentinerea nisei celulelor stem rezidente.
Conform teoriei clasice, muschiul scheletic beneficiaza de o capacitate de regenerare endogenă care se realizează pe
seama activării celulelor satelit. Această capacitate de regenerare este însă deseori depășită cum se întâmplă în cazul
unor traumatisme severe sau boli de tipul distrofiilor musculare. De aceea se fac eforturi susținute pentru dezvoltarea
unor strategii terapeutice care ar putea susține și eficientiza acest proces complex de regenerare tisulară. În acest sens,
primul pas ar fi acela de a identifica populațiile celulare implicate precum și de a desluși mecanismele intime care stau
la baza menținerii, activării și diferențierii celulelor progenitoare.
Mai multe studii au prezentat diferite metode de terapie celulară având la bază injectarea acestor celule fie în sânge,
fie direct în organul traumatizat, dar s-a constatat că migrarea lor în țesut și prin endoteliu este foarte limitată. În
ultimii ani, au fost propuse și alte populații de celule stem, rezidente sau migrate din sânge, care ar putea popula nișa
celulelor satelite și ar fi implicate în regenerarea tisulară.
Oricum, indiferent de sursă, regenerarea este un fenomen complex, care presupune intervenția, pe lângă celulele stem,
a numeroase elemente din mediul extracelular. Numeroase studii au arătat că modificarea microclimatului local
poate avea consecințe diferite asupra recuperării funcției musculare, uneori soldându-se cu formare de țesut
nefuncțional, fibrotic sau adipos. Dinamica compoziției acestui microclimat pe parcursul regenerării țesutului normal
sau patologic nu este pe deplin elucidată, însă există studii care arată că aceasta suferă modificări odată cu
îmbătrânirea organismului și poate avea un rol important în cazul distrofiilor musculare (Mann et al. 2011).
Unele dintre componente sunt elemente structurale ce aparțin matricei extracelulare din nișă (Charge and Rudnicki
2004, Kuang, Gillespie et al. 2008), altele sunt factori solubili, eliberați în diferite momente ale procesului, toate însă
fiind produse de către celulele rezidente în interstițiu, celule vasculare (Christov, Chretien et al. 2007), celule imune
(Gopinath and Rando 2008), macrofage (Chazaud, Sonnet et al. 2003), dar şi alte tipuri de celule interstițiale.
De asemenea, un fenomen central în cadrul procesului de regenerare este cel de formare de noi vase de sânge –
fenomen denumit generic angiogeneza, ale cărui mecanisme reprezintă încă subiectul principal al unui impresionant
volum de studii în domeniile biomedicale. Vasele de sânge sunt cele care aduc în țesut nu doar substanțe nutritive, dar
și o serie de hormoni, factori de creștere sau citokine. Aceste molecule sunt implicate în controlul procesului
inflamator care însoțeste regenerearea musculară, dar și în procesul de activare și diferențiere al celulelor progenitoare
(Hoier et al. 2012). La rândul sau, procesul de angiogeneză este orchestrat de un set complex de semnale atât solubile
cât și contacte fizice cu elemente ale matricei extracelulare și celule prezente în interstițiu (Senger and Davis 2011).
Până în prezent, evoluția celulelor conjunctive rezidente nu a fost însă pe deplin încadrată în acest tablou complex de
fenomene celulare în cadrul procesului de regenerare musculară, decât în contextul reparării tisulare ineficiente,
soldate cu formarea de cicatrice, pe seama reorganizării ţesutului conjunctiv (Jarvinen, Jarvinen et al. 2005).
Modularea activității lor poate fi una dintre cele mai eficiente modalități de optimizare a procesului de regenerare
tisulară prin transplant de celule stem.
In vederea indeplinirii scopului propus, primele obiective al acestui proiect au fost acelea de a inventaria tipurile de
celule interstitiale prezente in tesutul conjunctiv al muschiului striat scheletic, in conditii normale, dar și
patologice - în cazul traumatismelor extensive și al bolilor genetice care pot afecta mușchiul scheletic. Pentru
identificare, aceste tipuri celulare trebuiesc caracterizate din punct de vedere morfologic, prin microscopie optica si
electronica si din punct de vedere fenotipic, prin tehnici de imunomarcare și microscopie de fluorescență.
Studiul a debutat cu stabilirea criteriilor de diagnostic ultrastructural si imunofenotipic al populațiilor celulare
rezidente in interstitiul muschiului scheletic, în urma analizei rezultatelor publicate până în prezent în literatura de
specialitate. Aceste date sunt incluse în rezumat în Tabelul 3 și 4.
Pe baza acestor criterii, studiul de față a analizat distributia acestor tipuri celulare în spațiile conjunctive musculare
atât în probele provenite de la animale adulte normale (șoareci CD1) cât și animale homozigote pentru mutația genei
pentru distrofină (Dmdmdx), în condiții fiziologice și pe parcursul procesului de regenerare. O atenție deosebită a
fost acordată relației dintre populațiile de celule interstițiale și celulele nediferențiate identificate în nișa celulelor
satelit sau în alte coordonate ale spațiilor conjunctive din mușchiul striat scheletic.
2
Modelul de traumă musculară. Modelul de traumă musculară a fost efectuat pe 12 loturi de șoareci CD1 și 9 loturi de animale cu mutatie
mutatia spontana mdx (X chromosome-linked muscular dystrophy) a genei ptr distrofina (Dmdmdx) folosite ca modele animale pentru distrofia
musculara Duchenne (The Jackson Laboratory, C57BL/10ScSn-Dmdmdx, 001801) Loturile au inclus animale în vârstă de 10 săptămâni.
Animalele au fost în prealabil anesteziate prin injectare i.m. a 0,02U de Ketamină. Experimentele s-au desfășurat în conformitate cu normele
de etică impuse de Institutul Național de Patologie Victor Babeș și cele acceptate de forumurile internaționale. A fost selectat mușchiul
gastrocnemian stâng, căruia i s-a indus o leziune mecanică prin clampare, timp de 2 min. la 1,5 cm față de articulația distală. În vederea analizei
procesului de regenerare musculară în dinamică, probele au fost recoltate la intervale diferite: 1h, 24h, 48h, 5, 7, 14 si 21 de zile. Drept control, a
fost folosit mușchiul gastrocnemian contralateral si probe recoltate de la animale fara trauma musculara. Modelul a fost validat prin evaluare
histologică. O parte dintre probe, au fost congelate in azot lichid si depozitate la -80C împreună cu serul corespunzător, fiind utilizate pentru
multiplexare proteica si Western Blot dupa lizarea tesutului și pentru fenotiparea in situ.
In vederea analizei ultrastructurale, au fost incluse în studiu trei loturi de animale normale și trei loturi de animale cu distrofie, care au fost
supuse protocolului de inducere a traumei musculare . Au fost recoltate fragmente de 1-2 mm din focarul de leziune și de la distanță. Probele au
fost prelucrate conform protocolului standard pentru miscoscopie electronică, incluse in epon si selectate pe baza evaluarii sectiunilor semi-fine,
colorate cu albastru de toluidina.
Evaluarea fenotipica a celulelor din spatiile conjunctive musculare s-a realizat prin imunomarcare in situ . În acest scop, pe baza analizei și
sintezei datelor publicate și acceptate în literatura de specialitate (Tabelul 2, a fost selectat un set de markeri pe baza cărora să putem
cartografia distribuția acestor populații celulare în țesutul normal și distrofic și să analizăm evoluția lor pe parcursul procesului de regenerare.
Pentru evidențierea expresiei acestor markeri a fost utilizat un set de anticorpi primari corespunzători. După testarea preliminară a specificității și
optimizarea reacțiilor a fost definit un set minim necesar de anticorpi primari care să permită atingerea obiectivului propus. Aceștia sunt cuprinși
în Tabelul 1. În studiu au fost introduse trei loturi de animale normale și trei loturi de animale cu distrofie, care au fost supuse protocolului de
inducere a traumei musculare
Pentru fenotiparea in situ, de la fiecare animal au fost recoltat mușchiul gastrocnemian lezat și contralateral, țesutul a fost congelat în azot
lichid, depozitat la -80ºC și secționat la 4 µm. Imunomarcarea s-a realizat prin metoda indirecta, cu un set de anticorpi primari din setul definit
și anticorpi secundari corespunzători, conjugați cu AlexaFluor 488 sau 546. Nucleii au fost marcați cu 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI),
1.0 μg/mL. Controalele negative au fost realizate urmând același protocol, dar excluzând anticorpul primar și incubare cu seruri non-imune.
Pentru evaluarea fenomenului de apoptoză în situ, a fost aplicata metoda TUNEL. Această evaluare a fost efectuată pe probele recoltate de la
loturile de animale traumatizate, pe care au fost efectuate și experimentele de fenotipare in situ. Secțiunile obținute din probele congelate au fost
tratate cu ApopTag Fluorescein apoptosis detection kit (Chemicon), conform instrucțiunilor producătorului. Nucleii au fost marcați cu 4',6-
diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1.0 μg/mL. Secțiunile au fost montate și păstrate la întuneric, la -20°C până în momentul analizei. Controlul
pozitiv s-a realizat prin pre-tratament cu DNase I 1.0-0.1 μg/mL (Sigma D7291), timp de 1 min./RT. Controlul negativ a fost obținut prin
omiterea tratamentului cu enzima TdT.
Pentru evaluarea proliferarii s-a utilizat kit-ul PCNA (Invitrogen PCNA staining kit), care conține un anticorp anti-PCNA monoclonal
biotinilat.S-a făcut o supracolorare cu hematoxilină pentru vizualizarea tuturor nucleilor (1 minut). Dupa spălări cu PBS și apă distilată, s-au
deshidrat și clarificat secțiunile, apoi s-au montat cu Histomount.
În vederea evaluării nivelului de factori de creștere, au fost introduse în studiu 3 loturi de animale normale și 3 loturi de animale cu distrofie
la care a fost aplicat protocolul de inducere a traumei musculare. De la fiecare animal au fost recoltate la momentele prestabilite muschiul
gastrocnemian lezat, muschiul contralateral, si sangele din care a fost separat serul. Serul a fost pastrat la -20C pana in momentul analizei, iar
țesutul la -80 după congelare în azot lichid. Drept control normal, au fost recoltate probe similare de la 7 animale la care nu a fost indusa trauma
mecanica. Probele au fost decongelate și omogenizate cu tampon MILLIPLEX MAP Lysis suplimentat cu 2% inhibitor de protează (Sigma) în
raport 1:5 (w/v). Lizatele celulare au fost utilizate pentru multiplexare proteică și Western Blot după determinarea nivelului total de protein cu
ajutorul Pierce 660 nm BCA Protein Assay (ThermoScientific, Rockford, IL, USA).
Pentru multiplexare proteică - Luminex xMAP assay – a fost utilizat kit-ul Milliplex MAP Mouse angiogenesis/growth factor magnetic bead
panel kit (EMD Millipore, Billerica, MA, USA), care conține un set complex de bile cuplate cu anticorpi specifici care pot recunoaște 24 de
molecule diferite în aceeași probă. Determinările au fost realizate atât pe lizatul tisular cât și pe probele de ser, conform instrucțiunilor
producătorului. Testul a fost efectuat pe platforma Luminex® 200™ (Luminexcorp, Austin, TX, USA). Achiziția și analiza datelor a fost
executată cu ajutorul programului xPONENT 3.1. Pentru validarea repetabilitatii, fiecare proba a fost lucrata in duplicat.
Analiza si prelucrarea statistica a datelor obtinute a fost realizata prin testul ANOVA urmat de Fisher’s post hoc, utilizand SPSS-17.
Pentru determinarea semicantitativă a moleculelor de interes, a fost optimizat protocolul de Western Blot. Cantitati egale de proteina au fost
incarcate pe gel SDS-poliacril amida (gelul a fost de concetratii diferite, intre 7,5-12%, in functie de greutatea moleculara a proteinei cautate) si
proteinele au fost separate prin electroforeza, la 160 V constant, in functie de greutatea lor moleculara. Transferul s-a facut pe membrana de
nitroceluloza sau PVDF, la 250 mA constant, timp de 60-70 minute. Dupa blocare cu lapte 5% peste noapte, pe agitator, la 40C, s-a facut
imunomarcarea proteinelor de interes. Membrana a fost pusa in contact cu anticorpul primar (Tabelul 2) 1h - 1,30 h, la temperatura camerei, pe
agitator, apoi cu anticorpul secundar, 1h la temp. camerei. Vizualizarea proteinelor s-a facut prin chemiluminiscenta.
Optimizarile concentratiilor anticorpilor utilizati la imunomarcare s-au facut la dilutii diferite si pe tesuturi diferite, in functie de recomandarile
producatorului anticorpului si datelor din literatura.Ca marker de incarcare s-au testat proteinele beta-actina si alfa- si beta-tubulina. Imaginile au
fost prelucrate cu programul Image J. Calculul proteinei de interes s-a facut in functie de proteina marker de incarcare, respectiv α-Actina.
3
MILLIPLEX® MAP Mouse Angiogenesis / Growth Factor Magnetic Bead
Tabelul 1. Anticorpi primari utilizați pentru imunofenotiparea in situ
Antigen Company Code no. Host Dilution
Identification markers
CD34 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA sc-7045 goat 1:50
NCAM/CD56 Antibodies Online, Germany ABIN809963 rat 1:100
Sca-1 Abcam, Cambridge, UK ab51317 rat 1:150
c-Met Santa Cruz sc-161 rab 1:50
CD44 Santa Cruz sc-18849 rat 1:50
CD146 Abcam ab75769 rab 1:50
PDGFRα Santa Cruz sc338 rab 1:20
PDGFRβ Abcam ab32570 rab 1:100
CD90 Santa Cruz sc338 rab 1:20
CD45 Abcam ab25386 rat 1:150
CD31 Novus Biologicals, Littleton, USA NB100-164 rat 1:100
CD105 EDM Millipore 05-1424 mo 1:100
βIII tubulin Sigma T2200 rab
Procollagen Santa Cruz sc 25973 g 1:50
Tcf4 EDM Millipore 05-511 mo 1:50
Vimentin Santa Cruz sc-32322 mo 1:50
c-Kit Santa Cruz sc-5535 rab 1:50
4
CD68 Santa Cruz sc-9139 rab 1:50
F4/80 Abcam ab16911 rat 1:50
Smooth muscle actin Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA MS-113-P mouse 1:100
Laminin Sigma L9393 rabbit 1:150
Growth Factors and Cytokines
Follistatin Santa Cruz sc 30194 rabbit 1:50
PLGF Antibodies Online ABIN343441 rabbit 1:300
EGF Abcam ab171327 rabbit 1:20
Betacellulin Antibodies Online ABIN809963
goat 1:300
Amphiregulin Antibodies Online ABIN958037 goat 1:300
Endothelin Abcam ab117757 rab 1:75
HGF R&D Systems AF2207 g 1:20
KC 18367 rab 1:20
Angiopoietin-2 Abcam ab94684 rab 1:40
VEGF R&D Systems AF-493-NA g 1:100
Tabel 2 Anticorpii primari utilizati pentru WB. Denumire aniticorp primar Concentratie finala
utilizata
Obsetvații
Anti-EGF antibody ab171327, rabbit polyclonal (abcam) 1:150 Semnal bun, rezultate cuantificabile
Anti-Follistatin (H-114): sc-30194, rabbit polyclonal (Santa Cruz) 1:300 Semnal bun, rezultate cuantificabile
Anti-Endothelin 1 antibody ab117757, rabbit polyclonal (abcam) 1:3000 Semnal bun, rezultate cuantificabile
Anti-Endoglin antibody, clone P3D1, 05-1424, mouse monoclonal (Millipore) 1:1000 (in curs de
optimizare)
Semnal destul de bun. In curs de
optimizare.
Anti-Angiopoietin 1 antibody ab94684, rabbit polyclonal (abcam) 1:300 Cantitatea proteinei prea mica in tesut
pentru a putea fi vizualizata prin WB
Anti-Betacellulin (BTC) antibody ABIN958048, goat polyclonal (antibodies
online.com)
1μl/ml – 1.33 μl/ml Anticorp cu specificitate scazuta, semnal
nespecific puternic, benzi multiple.
Anti-Amphiregulin (AREG) antibody ABIN958037, goat polyclonal (antibodies
online.com)
1μl/ml – 1.33 μl/ml Anticorp cu specificitate scazuta, semnal
nespecific puternic, benzi multiple.
Anti-Placenta Growth Factor (PGF) antibody ABIN343441, rabbit polyclonal
(antibodies online.com)
1:800 Anticorp cu specificitate scazuta, semnal
nespecific puternic, benzi multiple.
Anti-β-Actin A2066, rabbit polyclonal (Sigma) 1:200 Semnal bun.
Anti-β-Tubulin - sc-9104 rabbit polyclonal (Santa Cruz) 1:300
Semnal prea slab. Anticorp vechi.
Anti-β-Tubulin (SDL3D10) sc-58885 mouse monoclonal (Santa Cruz) 1:200 Benzi nespecifice destul de multe. Banda
dubla pentru Tubulina. Benzi IgG (semnal
incrucisat).
Anti-β-Tubulin RB-9249-P rabbit polyclonal (NeoMarkers) 1:200 Semnal nespecific. Anticorp prea vechi.
Anti-β-Tubulin (H-235) sc-9104 rabbit polyclonal (Santa Cruz) 1:1000 Semnal prea slab, banda dubla. Anticorp
vechi.
Anti-β-Tubulin Mo-NB100690 mouse monoclonal (Novus) 1:5000 Semnal bun. Dar apar in plus doua benzi
secundare pozitive pentru IgG de soarece,
lantul greu si lantul usor. Reactie
incrucisata a anticorpului primar de soarece
pe tesut de soarece.
Anti-β-Tubulin (TU-02) sc-8035 mouse monoclonal (Santa Cruz) 1:300 Semnal destul de bun. Dar apar in plus doua
benzi secundare pozitive pentru IgG de
soarece, lantul greu si lantul usor. Reactie
incrucisata a anticorpului primar de soarece
pe tesut de soarece.
5
Culturile de celule. Pentru obținerea de culturi de celule interstițiale din mușchiul scheletic, au fost recoltate probe de la 6 animale sanătoase,
în absența traumei și 3 loturi de animale traumatizate, probele fiind recoltate la intervalele stabilite de-a lungul procesului de regenerare.
Probele au fost recoltate steril și transportate în mediu de transport (HBSS – Sigma- suplimentat cu 10mM HEPES, 1% antibiotic, pH 7,5) în
laboratorul de culturi celulare. Țesutul a fost mărunțit și incubat, la 37°C, în 7ml soluție 300u/ml de colagenaza 1. După 30 min. activitatea
colagenazei a fost inhibată cu un volume egal de HBSS rece. După centrifugare, sedimentul conținând celule desprinse și fragmente predigerate
a fost depus în plăci de cultură sterile în mediu de cultură D-MEM/F12 suplimentat cu 10% ser fetal de vițel (SFV) și 1%
penicilină/streptomicină (Sigma). După 48h , supernatantul a fost îndepărtat, iar celulele atașate au fost propagate pe parcursul a 6 pasaje.
Pentru fenotiparea in vitro, pe culturi de celule interstițiale obtinute din mușchiul scheletic normal sau post-traumatic. În vederea fenotipării
prin imunomarcare, celulele au fost fie crescute pe lamele de sticlă și apoi supuse protocolului de imunofluorescenta in vitro, prin metoda
indirectă, utilizand anticorpi primari incluși în Tabelul 3 și anticorpi secundari corespunzători, fie fenotipate prin citometrie în flux. .
Citometria în flux. În vederea fenotipării prin citometrie în flux, celulele au fost desprinse din placa de cultură prin incubare timp de 20 min. cu
o soluție EDTA 2 mM EDTA in Ca2+/Mg2+ free (divalent cation free) PBS și apoi detașate prin pipetare. După numărare, celulele au fost
distribuite în tuburi de sticlă, la o densitate de minimum 1x105 cel/probă și spălate cu 3 ml PBS/2%SFV. Toate manevrele ulterioare au fost
efectuate la 4°C. În etapa următoare celulele au fost incubate în 100µl din anticorpul primar, la diluția corespunzătoare, la întuneric la 4°C. După
45 min. celulele au fost spălate prin centrifugare în 3 ml PBS/SFV rece și apoi incubate cu anticorpul secundar corespunzător, conjugat cu
AlexaFluor 488 sau 546. După spălare, celulele au fost fixate și analizate cu ajutorul sistemului BD FACSCalibur (Cell analyzer).
Pentru evaluarea nivelului de factori de creștere, s-a utilizat un lot de animale normale la care s-a indus trauma mecanică prin clampare, de la
care s-au obținut culturi primare din mușchiul lezat și contralateral, recoltate la intervalele stabilite de-a lungul procesului de regenerare.
După ce au ajuns la 80% confluență, culturile au fost deprivate treptat, pe parcursul a 72h de suplimentul de ser fetal. După 24h de la excluderea
completă a serului fetal, supernatantul a fost colectat și conservat la -20C, iar celulele au fost desprinse și omogenizate cu tampon MILLIPLEX
MAP Lysis suplimentat cu 2% inhibitor de protează (Sigma) în raport 1:5 (w/v). Lizatele celulare și supernatantele colectate au fost utilizate
pentru multiplexare proteică după determinarea nivelului total de proteina cu ajutorul Pierce 660 nm BCA Protein Assay (ThermoScientific) în
vederea determinării concentrației factorilor de creștere introduși în studiu.
Separarea cu bile magnetice a fost realizată la primul pasaj al cuturilor primare obținute din muschiul gastrocnemian al șoarecilor transgenici
sănătoși, netraumatizați, care exprimă proteina verde fluorescentă (GFP) în toate celulele cu excepția eritrocitelor și celulelor firelor de păr
(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J, The Jackson Laboratory, 003291) Celulele au fost desprinse cu EDTA 2mM și suspensia obținută a fost
filtrată prin sita de 40 μm (BD Labware, San Jose, CA, USA), colectate prin centrifugare la 300g și resuspendate în 100μl tampon (PBS (without
Ca2+ and Mg2+) /0.1% BSA /2 mM EDTA, pH 7.4) , pe gheață. Numărul mediu total de celule obținute după desprindere dintr-o singură probă
a fost de 3,5 x105 . Mai departe celulele au fost incubate cu 2μg/106 celule de anticorp primar anti-CD56 (AntibodiesOnline ABIN809963) sau
PDGFRβ (Abcam, ab91066), ambii onținuți la șoarece. Apoi celulele astfel marcate au fost incubate cu bilele magnetice cuplate cu anticorpi de
oaie anti-șobolan (Dynabeads Sheep anti-rat, Invitrogen, 11035) conform instrucțiunilor oferite de producător și apoi plasate în câmpul magnetic
al magnetului DynaMag-5 (Life Technologies). Supernatantul a fost colectat ca fracție negativă, iar după adăugarea a 1ml de mediu de cultură și
îndepartarea din câmpul magnetic au fost colectate celulele din fracția pozitivă .
Au fost calculate:
procentul de recuperare al populatiei tinta = 100 x nr de cel in fr poz x %cel poz in fr poz/ nr de cel in susp initiala x %de cel poz
in suspensia initiala
procent total de recuparare = 100x (nr de cel in fr poz + nr de cel in fr neg + nr de cel in sol de spalare)/ nr de cel in suspensia
originală
viabilitatea – albastru de tripan = 100xnr de cellule vii/ nr total de celule
puritatea fractiei pozitive = % cel poz in fr poz
Transplantul celular. Pentru transplant a fost optimizat protocolul de injectare direct în mușchiul traumatizat la 48h de la momentul
traumei, urmând ca evaluarea grefării să fie efectuată după 5 zile. Au fost utilizate culturi primare obținute din probe recoltate de la animale
GFP+ și celulele obținute prin separare magnetică, cultivate pentru 48h în diferite condiții de cultură, fie singure fie în co-cultură cu celulele
colectate în fracția negativă.
Pentru co-cultură celulele obținute prin separare au fost cultivate în placă cu 6 godeuri în
care au fost introduce inserturi de plastic (24mm Transwell® with 0.4µm Pore Polyester
Membrane Insert, Corning, 3450) cu pori de 0,4μm în care au fost cultivate celulele
colectate în fracția negativă.
După 48h, celulele au fost desprinse cu EDTA 2mM, spălate prin centrifugare și resuspendate la o densitate de 2x106 celule/ml. 50 μl de
suspensie au fost injectați în mușchiul gastrocnemian al șoarecilor atimici NU/J (The Jackson Laboratory, 002019), la 48h de la inducerea
traumei musculare, conform protocolului.
Caracteristici
Tipuri celulare
TELOCIT
(Jessen and Thuneberg 1991,
Huizinga and Faussone-
Pellegrini 2005, Junquera,
Martinez-Ciriano et al. 2007,
Kostin and Popescu 2009)
FIBROBLAST
(Uhal, Ramos et al. 1998,
Ryan, Taliana et al. 2003,
Goldsmith, Hoffman et al.
2004, Camelliti, Borg et al.
2005, Kisselbach, Merges et
al. 2009)
MIO-
FIBROBLAST
(Chintalgattu, Nair et al.
2003, Eyden 2008, Kim,
Romero et al. 2008,
Strakova, Livak et al. 2008)
CELULA MUSCULARĂ
NETEDĂ
(Faussone-Pellegrini,
Pantalone et al. 1990, Cheng,
Lui et al. 2001, Bolton,
Gordienko et al. 2004)
PERICIT
(Challier, Galtier et al. 1999,
Armulik, Abramsson et al.
2005, von Tell, Armulik et al.
2006, Caruso, Fedele et al.
2009)
Aspect general Celule, fusiforme, triangulare
sau stelate cu puțină
citoplasmă perinuclear
Pleiomorfism
(heterogeneitate fenotipică),
citoplasmă abundentă la
nivelul corpului celular.
Celule fusiforme/stelate. Celule fusiforme Celule fusiforme
Nucleu/cromatina Oval, în mare parte
heterocromatic
Oval,
eucromatic, 1-2 nucleoli
vizibili
Grămezi de heterocromatină
atașate de fața internă a
anvelopei nucleare.
Alungit, formă de bastonaș,
cu heterocromatina dispusă
periferic.
Cit
op
lasm
a
Org
anit
e
Mit
oco
n
dri
i
Ocupă 5% din corpul cellular
și sunt prezente în dilatațiile
prezente pe prelungirile
celulare.
Câteva (~7%) Câteva, dispersate. Localizate la polii nucleari și
se extind de–a lungul axului
central.
Co
mp
l
Go
lgi
Mic Proeminent Moderat dezvoltat, produce
granule de colagen
Mai dezvoltat la fenotipul
”sintetic”
Ret
icu
l
end
op
lasm
~ <1% din volumul cellular, fie
rugos fie neted .
RER este localizat și la nivelul
dilataților.
REN absent; RER bine
dezvoltat Smooth virtually
(8-12% din volumul celulei)
RER, proeminent Reticulul endoplasmic neted
este abundent, localizat fie
central, la polii nucleului, fie
imediat submembranar, cu o
dispoziție paralele cu aceasta.
Ele
men
te
de
cito
skel
e
t
Filamente intermediare subțiri Filamentele intermediare slab
reprezentate
Miofilamente dispuse
periferic și arii/corpi denși
Microfilamente de actină și
miozină; filamentele
intermediare sunt slab
reprezentate.
Membrane Caveolae Numeroase (~2% din volumul
celular)
Absente Rare Numeroase caveole asociate
cu REN, alternează cu ariile
dense
Corpi denși/ Arii dense Absente Absente Prezente Prezente
Lamina bazală Absentă Absentă Material extracellular Continuă Incluse in membrana bazala a
celulelor endoteliale
Contacte Joncțiuni gap cu celule
similare, celule muscular
netede
Nu stabilește contacte cu alte
fibrocite, celule muscular
netede sau fibre nervoase
Fibronexus
Gap juncțiuni
Desmozomi și joncțiuni gap
cu celulele musculare
învecinate/ICC/ICLC
Contacte focale și Peg-socket
cu celulele endoteliale
Prelungiri
celulare
Număr 2-4 ~2 ~2 ~2 ~2
Lungime Foarte lungi
(zeci/sute de µm)
Scurte (µm) Scurte (µm) Scurte
Grosime la locul de emergență Foarte subțiri (~0.4 µm), mai
ales la locul de emergență.
Calibru inegal, dilatații de-a
lungul prelungirilor.
Groase la locul de emergență
și se subțiază gradat.
Groase
Groase (5 µm)
Profil Labrintic Triunghiular ?
7
Ramificare Dicotomic Neexplorat Neexplorat Neramificate Neramificate
Distribuție
preferențială în
țesutul normal
În condiții
fizologice
Distribuție in jurul arterelor si in
perimisium
rar in jurul celulelor musculare
striate
in fusul
perimisium
- in peretele vascular - media pericapilar
Raporturi cu alte
celule
intre ele – jonctiuni de tip
adherens
-
- intre ele si cu celulele
endoteliale
pericapilar
In timpul
regenerării
musculare
Distribuție in jurul arterelor (↓nr)
dispar in in jurul celulelor
musculare striate
in jurul fibrelor lezate
in nr. ↑
in jurul fibrelor lezate
in peretele vascular - media pericapilar
hipertrofiate
↑ distanta intre pericite si
celulele endoteliale
Raporturi cu alte
celule
? - - intre ele si cu celulele
endoteliale
cu celulele endoteliale
Distribuție
preferențială în
mușchiul
distrofic
(animale Dmdmdx)
În condiții
fizologice
Distribuție in jurul arterelor si in
perimisium
perimisium
- in peretele vascular - media pericapilar
Raporturi cu alte
celule
- -
- intre ele si cu celulele
endoteliale
pericapilar
In timpul
regenerării
musculare
Distribuție in jurul arterelor
in zona de leziune
- in peretele vascular - media pericapilar
hipertrofiate
↑ distanta intre pericite si
celulele endoteliale
Raporturi cu alte
celule
? - - intre ele si cu celulele
endoteliale
-
8
Tipuri celulare
Caracteristici
MACROFAG POLIMORFO
NUCLEAR
MASTOCIT LIMFOCIT CELULE
NEDIFIRENȚIATE
MIOBLAST CELULA SCHWANN SI
ALTE CELULE
PERINEURALE
Aspect general 21 µm diametru
(macrofage alveolare la
om) [13], 20-80 µm in
alte tesuturi [12]
12-15 µm Celule rotunde,
ovalare sau alungite,
5-15 µm,
numeroase granule
citoplasmatice
heterogene [2, 4]
Dimensiuni variabile,
in functie de tip (6-30
µm)
Celule poligonale,
citoplasma relativ putina
[18]
20-80 µm, stelate
sau fusiforme
Lungime de 100-400 µm,
dispuse de-a lungul axonilor.
Forma de sul de hartie in
cazul celulelor Schwann
mielinizante. Citoplasma
distribuita inegal,
predominant perinuclear [9,
10]
Nucleu/cromatina Unul sau mai multi
nuclei veziculari, de
forma rotunda sau
ovalara, frecvent cu
nucleoli proeminenti [12,
14]
Multi-lobulat, fara
nucleoli, cromatina
distribuita periferic,
electrono-densa,
conexiunile nucleare
interlobulare vizibile in
microscopia optica
reprezinta
heterocromatina
delimitata de membrana
nucleara [12]
Rotund sau lobulat,
cu nucleoli greu
vizibili sau absenti,
putina cromatina
condensata [4]
Nucleu care contine
heterocromatina sub
forma de agregate
dispuse de-a lungul
membranei nucleare si
in general (75%) un
nucleol unic, de mici
dimensiuni [4]
Nucleu mare, cromatina
nucleara agregata de-a
lungul membranei
nucleare [17],
eucromatina ocupa restul
spatiului nuclear, 1-3
nucleoli cu forma
reticulara [18]
Nucleu central, cu
numerosi nucleoli
Nucleu de 10-20 µm
lungime [10], cu pozitie
variabila
Cit
op
lasm
a
Org
anit
e
Mit
oco
nd
rii
Numeroase, alungite sau
rotunjite [14]. Se
redistribuie in urma
activarii macrofagului
[13]
Relativ putine [12] Relativ putine [4] Prezenti [4] Prezenti, de dimensiuni
si cu localizare variabile
[17]
In forma de
baston
Prezente, localizate in zonele
de citoplasma localizate
nodal [9]
Co
mp
le
x G
olg
i Prezent [14] Slab reprezentat [12] Slab reprezentat [2,
4]
Prezent, de mici
dimensiuni [17]
Slab reprezentat sau
absent [17, 18]
Compact, localizat
polar sau
perinuclear in
functie de fenotip
Prezent, localizat perinuclear,
internodal [9]
Ret
icu
l
end
op
lasm
ic Prezent [14] Absent [12] Slab reprezentat [2,
4]
Rar [4] Slab reprezentat sau
absent [17, 18]
Cantitate mica de
RE granular
(rugos)
Prezent, localizat perinuclear,
internodal [9]
Ele
men
te
de
cito
skel
et Microfilamente,
filamente intermediare,
microtubuli [15, 16]
138 de proteine
citoskeletale, inclusiv
microfilamente,
filamente intermediare si
microtubuli [6]
Microfilamente,
filamente
intermediare,
microtubuli [2]
Microfilamente
localizate adiacent
membranei,
microtubuli [4]
Filamente intermediare,
microtubuli [18]
Microfilamente
[20], filamente
intermediare [21],
microtubuli [22]
Microfilamente, filamente
intermediare, microtubuli [7].
Expresie diferentiata de
proteine citoskeletale intre
celule mielinizante si
nemielinizante [8]
Membrana Caveolae Prezente [3] Incert [3] Prezente [3] Absente [3] Prezente [19] Prezente Prezente [11]
Lamina bazală Absenta Absenta Absenta Absenta Absenta Prezenta Prezenta, compusa din
colagen V si VI, laminina si
gicozaminoglicani [9]
9
Contacte Celule mobile Celule mobile ? Celule mobile,
contacte cu alte
limfocite si macrofage
in cultura [4]
Contacte cu celule
adiacente predominant
prin desmozomi, tight
junctions, gap [17, 18]
? Terminatii nervoase (axoni),
alte celule Schwann
Prelungiri
celulare
Număr /Lungime Numeroase pseudopode
(numarul lor creste in
cazul macrofagelor
activate) [12]
Leading edges si
pseudopode (numarul lor
creste in timpul
fagocitozei) [12]
Pseudopode
(filopode) mobile,
relativ lungi (cativa
µm) [2]
Microvili (pana la 0.8
µm), pseudopode,
uropode [4]
Microvili [18] Absente Ramificari celulare frecvente,
proiectii celulare Schwann
(pseudopod-like), spatiate
aleator, de pana la 6 µm
lungime [10]
Distribuție
preferențială în
țesutul normal
În condiții
fizologice
Distribuție - - nr. ↓ in jurul vaselor rare
perineural
sub lamina bazala a
celulelor musculare
scheletice
rar intre celulele
musculare striate
interstitial
Raporturi
cu alte
celule
- - - - contact direct cu
celulelor musculare
scheletice
- terminatiile nervoase in
relatie cu celulele musculare
scheletice (CMS) la nivelul
jonctiunii neuro-musculare
si in cadrul fusului neuro-
muscular
In timpul
regenerării
musculare
Distribuție in teritoriul lezat
nr. ↑ incepand cu 48 de
ore de la trauma
(persista pana la 14 zile)
in teritoriul lezat
nr. ↑ incepand cu 48 de
ore de la trauma
(numeroase eozinofile
persista pana la 5 zile)
nu prezinta o
variatie numerica
semnificativa
rare
incepand cu 48 de ore de
la trauma migreaza
interstitial
in teritoriul lezat
nr. ↑ incepand cu 5 zile
de la trauma
nr. ↑ incepand cu
5 zile de la trauma
-
Raporturi
cu alte
celule
Fagocitoza, raport cu
celulele satelite activate
și mioblaști
contacte cu celulele
musculare scheletice
lezate
- - in contact cu
macrofagele (!)
in contact cu
macrofagele (!)
-
Distribuție
preferențială în
mușchiul
distrofic
(animale Dmdmdx)
În condiții
fizologice
Distribuție - - nr. ↓ in jurul vaselor rare
perineural
sub lamina bazala a
celulelor musculare
scheletice
- interstitial
Raporturi
cu alte
celule
- - - - contact direct cu
celulelor musculare
scheletice
- terminatiile nervoase in
relatie cu celulele musculare
scheletice (CMS) la nivelul
jonctiunii neuro-musculare
si in cadrul fusului neuro-
muscular
In timpul
regenerării
musculare
Distribuție in teritoriul lezat
nr. ↑ incepand cu 48 de
ore de la trauma
in teritoriul lezat
nr. ↑ incepand cu 48 de
ore de la trauma
- rare
incepand cu 48 de ore de
la trauma migreaza
interstitial
in teritoriul lezat
nr. ↑ incepand cu
5 zile de la trauma
-
Tabelul 3 include caracteristicile ultrastructurale utilizate pentru identificarea principalelor tipuri celulare din interstitiul muschiului scheletic și distribuția preferențială a
acestor populații în mușchiul normal, traumatizat și distrofic
10
Cell types Positive markers Selected markers Negative markers Ref. Secreted molecules Ref.
Stem cells
Resident Satellite cells*# Pax7, Pax3, Myf5, Barx2, M-cadherin,
CD206, CCL2/CCR2, CTRs, CXCR4, c-
Met, CD34, p75NTR, Tie-2, α7-intergin,
β1-integrin, VECAM-1, syndecan-3 and
syndecan-4, NCAM/CD56, caveolin-1,
Nestin ,SM/C-2.6, PW1, HMGB1
M-cadherin , c-Met,
CD34, NCAM/CD56
CD45, Sca-1, desmin,
MyHC
[1-23]
Non-specified
location
Muscle-derived side
population cells (MSP
cells)*
Abcg2, Sca-1, CD11, Gr-1, CD5 Sca-1 c-kit, CD43, CD45,
CD34.
[24-26]
PICs# PW1, Sca-1, CD34, vimentin Sca-1, CD34 PDGFRα [26,
27]
Slow-adhering stem
cells (SASCs)*
Notch1, STAT3, Msx1, Pax3, MMP2 [28]
Sk-34 myo-endothelial
progenitors#
CD34, Sca-1, c-Met CD34, Sca-1, c-Met CD45, CD14, CD31, ,
CD49, CD144 Flk1,
MyoD, myf-5, myf-6,
myogenin, M-cadherin,
Pax-3,Pax-7.
[29]
Vessel-
associated
Mesoangioblasts
(vessel-associated
stem cells)*
E-selectin, β7, integrin, AlCAM, CD44,
cav1, FGFR1,CXCR-4, TNF-R, TNFR 1a,
IL-10R, IL-4R, RAGE, TLR4 (HMGB1
rec), CD13
CD44 CD34, CD45, CD117
CD31
[30-32] HMGB1, VEGF,
CXCL12/SDF1,
CCL2, VEGF B,
bFGF, FGF7, PDGF
AA, HDGF
[32, 33]
Myogenic endothelial
cells (MECs)#
CD56, CD34, Pax7, von Willebrand
factor, VE-cadherin/CD144, UEA-1
receptor
CD56, CD34 CD45 [34,
35]
Pericytes*# CCR2, Abcg2, Alkaline phosphatase,
αSMA, desmin, NG2, aminopeptidase
A/B, RGS5, CD146, PDGFRα and β, NG2
NG2, αSMA, CD146,
PDGFRα PDGFRβ
vWF, CD31, CD34,
CD144, CD45, CD56,
Pax7
[35-43] Ang 1 [11]
Adventitial cells
(ACs)#
CD34, Sca-1, Flk1, PDGFRβ CD34, Sca-1, PDGFRβ c-kit, CD31, CD146,
CD45
[44,
45]
11
Blood-derived AC133+ cells CD133, CD34, CD90, CD45 CD34, CD90, CD45 [46]
Bone-marrow-derived
SP cells
c-kit, CD43, CD45, Sca-1 c-kit, CD45, Sca-1 B220, Mac-1, Gr-1,
CD4, CD5, CD8, CD34
[24]
Interstitial
cells
Vascular cells Endothelial cells von Willebrand factor, CD146, CD31,
CD34, CD144, CD105, Abcg2, Tie-2
CD146, CD31, CD34,
CD105
CCR2 [35,
37, 39,
47-49]
MCP-1, TNFα, VEGF,
IGF-1, FGF-2, PDGF-
BB, HGF, IL-6, IL-8,
TNFα
[11, 15, 50-
52]
Smooth muscle cells SMA, CCR2, α-actin, caldesmon, calponin SMA [42,
53, 54]
Ang 1 [11]
Nerve cells Schwann cells NCAM/CD56, nestin
S-100, GFAP, Krox24
NCAM/CD56,
S-100
cytokeratin [55-60] CTNF, IGF-1, NGF [61]
Perineurial cells Epithelial membrane antigen (EMA)
GLUT-1, claudin-1, ZO-1, connexins,
occludin, vinculin, talin, desmin, titin,
spectrin, CD34, VE-cadherin, AQP-1,
tenascin-C
CD34, cytokeratin
S-100, CD57,
neurofilaments
[57,
62, 63]
Neurons (axon) Nf200, βIII tubulin Nf200, βIII tubulin
PDGFRα
[59] Neuregulin, Calcitonin
gene related peptide
(CGRP)
[59]
Resident Cells in Muscle
Connective tissue sheaths
Fibroblasts
CCR2,vimentin, procollagen, ET-TR,
FSP-1, SMA
procollagen, SMA [43,
64-68]
PDGF AA, MCP-1,
TNFα, Ang-1
[11, 33, 50,
52]
Tcf4+ fibroblasts# Tcf4, PDGFRα Tcf4, PDGFRα
Tcf4
Pax7, MyoD, F4/80 [69,
70]
SDF-1+ muscle-
derived fibroblasts*
SDF-1 SDF-1 [6]
MPs FAPs*# Sca-1, PDGFRα, CD34, Sca-1, PDGFRα, CD34,
CD34/Sca-1
CD45, CD31, α7
integrin,
[39,
66, 71,
72]
IL6 [66]
12
Tabelul 4 include categoriile celulare descrise pana in prezent in muschiul scheletic si setul de markeri pe baza carora acestea pot fi identificate prin metode de
imunomarcare ( *in vitro, #in situ ). Aceste date sunt extrase din literatura si fac parte din articolul de sinteză publicat in BioMed Research International ‚”Cellular players
in skeletal muscle regeneration”.
Sca-1
PDGFRα+ *# PDGFRα, vimentin PDGFRα, vimentin NG2, SMA, Pax7, M-
cadherin
[71]
Tie2+skeletog
enic
progenitors*#
Tie2, Sca-1, PDFGRα, CD29, CD34 Sca-1, PDFGRα, CD34 CD31, CD45, CD11b,
CXCR4, c-kit, NG2
[73]
Telocytes (TCs)*# c-kit, CD34, vimentin, PDGFRα/β c-kit, CD34, PDGFRα,
PDGFRβ
[74,
75]
VEGF [75]
Blood-derived connective
tissue cells
Macrophages M1 CD68, CD86, CD40 CD14, MHC I/II,
CCR2
CD68, F4/80 [32,
54]
TNFα, IL1β, TNFα,
IL-6, TNF-α, IL- 1β,
IL-12, IFN-γ, NO,
VEGF, HMGB1,
CCL2, MCP-1
[32, 50]
Macrophages M2 CD163, CD36, CD163, CD206, MHC I/II,
CD14, αV-integrin, αVβ3I, VCAM-1,
membrane-bound CX3CL1, ICAM-1
PECAM-1
CD163 [32,
76]
IGF1, IL10, MMP-9,
IL10 and Low: IL-6,
TNF-α, IL- 1β, IFN-γ
[32]
Mast cells c-kit, mast cell triptase c-kit, mast cell triptase [77,
78]
TNFα, histamine,
chymase, tryptase, IL-
1, IL-6
[50, 77, 79]
Polimorphonuclear CXCR2, CD11b, CD45 CD45 [80] MPO [81]
Myoblasts Myogenin, Pax3 (cycling myoblasts), α-
actin, myosin heavy chain, CCR1 and
CCR5, CCR2. gp130 and LIFR,
NCAM/CD56, VLA-4, CX3CR1, LFA-1
and PECAM-1, Sca-1, Tie-2, p75NTR,
desmin, Myf5, HMGB1, TLR4, nestin
NCAM/CD56, Sca-1 Pax7, CCR2 [10,
11, 16,
21, 56,
61, 72,
76, 82-
87]
TNFα, INFγ, VEGF,
Ang-1
G-CSF/G-CSFR
[88, 89]
Myocytes/ Myotubes Myogenin, MRF4, CNTFR,
NCAM/CD56, nestin, RAGE
NCAM/CD56 [16,
56, 61,
86, 87]
TNFα
[88]
Rezultate/Discutii/Concluzii
Validarea modelului de trauma mecanică la animalele normale.
La 1h (S1) muschiul are un aspect aproape normal, cu foarte mici focare inflamatorii in interstitiu, mai ales in
endomisium; foarte putine fibre musculare in necrobioza, izolate. La 24h (S2) - inflamație mai ales perimisiala, nu
foarte amplă; câteva mici focare inflamatorii endomisiale; câteva fibre musculare in necrobioza, izolate. Inflamația nu
pare mult mai accentuată față de S1. La 48h (S3) există focare inflamatorii mult mai mari, atat peri- cat si endomisial;
fb. musculare în necrobioză, dar și necrozate, atât singulare, cât și grupate. La 5 zile (S4) pe lângă focarul inflamator și
fb. musculare necrozate, apar primele semne de regenerare, cu fuziunea mioblaștilor . După 7 zile (S5) inflamația pare
mult mai redusă decât la S4. Există mici focare inflamatorii în peri- și endomisium, fără necroză, se pot însă observa
miotuburi, cu diametrul redus și siruri de nuclei centrali. La 14 zile (S6) încă mai persistă focare inflamatoriii. Alaturi
de cateva fibre necrozate, apar multe miotuburi și fibre musculare tinere, cu diametre mai mici decât cele adulte si
nuclei localizați spre centru.
Analiza secțiunilor semifine, colorate cu albastru de toluidină, a pus în evidență prezența necrozei la 24 de ore de la
traumă, cu apariția infiltratului inflamator bogat, mai ales perivascular și apariția miotuburilor chiar după 5 zile, a
căror alungire progresează în paralel cu procesul inflamator și cel de necroză.
S5 S3 S2 S4
Fig.1. Hematoxylin and eosin (H&E) staining of gastrocnemius muscle sections after acute mechanical injury at a. 1 hour post-injury; b. 24 h.; c. 48 h.; d. 5 days; e. 7 days; f. 14 days. Illustrative of three samples. Original magnification 200x
14
Validarea modelului de trauma mecanică la animalele Dmdmdx.
Țesutul recoltat de la animale netraumatizate prezintă o mare variabilitate de talie a fibrelor musculare: fibre atrofice
singulare sau in grupuri mici pana la fibre hipertrofice, adesea cu 1-3 internalizari nucleare. Se observa multe fibre
musculare centronucleare, fibre musculare cu un inceput de necrobioză cu infiltrat inflamator în jur și fibre musculare
in regenerare, cu nuclei centrali, proeminenti (miotubi).
La 48 de la trauma crește numărul fibrelor aflate in diferite stadii de necrobioza, în grupuri alaturi de miotubi.
Procesul inflamator se extinde atat perimisial, cat si endomisial. Înfiltratul inflamator se amplifică către ziua 5, cu o
reducere importanta a numarului de fibre musculare, dar și finbre musculare în regenerare, miotubi cu lanțuri de nuclei
centrali. Deși procesul inflamator se reduce, aceste aspecte persistă până la 21 de zile.
N
24h
5z
15
Imunofenotiparea in situ
Pentru evidentierea celulelor satelit, in urma determinarilor repetate, am optimizat protocolul de marcare pentru c-
Met, Pax7, CD56. c-Met, receptorul pentru HGF, a fost utilizat pentru identificarea celulelor satelit dormante și
activate (Hawke et al. 2001). În cadrul acestui studiu, expresia c-Met nu se co-localizează cu cea a Pax7, considerat a
fi un marker specific pentru celulele satelit. Expresia CD56/NCAM reproduce mult mai fidel distributia acestora in
tesutul normal, dar si in urma activarii si fuziunii mioblastilor.
În cazul animalelor cu distrofie Dmdmdx
apar focare de regenerare în țesutul normal, cu celule intens pozitive
pentru CD56, izolate, în grupuri sau deja sub formă de miotuburi si finre musculare tinere. În zonele ocupate
de fibre cu aspect normal, sunt detectate celule satelit activate (Fig. 2D)
Pe baza inventarului fenotipic al literaturii de specialitate, existența și distribuția populațiile celulare descrise în
mușchiul scheletic în cadrul studiilor anterioare au fost sumarizate în Fig. 3.
Fig. 2 Imunofluorescență pe
criosecțiuni din mușchiul
gastrocnemian de șoarece arată
expresia de CD56 (roșu) (A) in
celule satelit din muschiul
normal, laminina (verde) (B)
celule stem activate in
interstitiu si in epimisium , (1h
post-trauma) (C) in celule stem
activate din spatiul perivascular
si epimisium, precum si in
mioblasti si miotuburi, laminina
(verde) (D)celule satelit și
mioblasști/miotuburi CD56
pozitive (rosu) în mușchiul
netraumatizat provenit de la
animalele Dmdmdx
A
B
C
D
16
In urma experimentelor de imunofenotipare in situ pe probele provenite de la animale normale, în absența traumei
musculare, aceste populații celulare au fost urmărite și cartografiate. În acest scop a fost selectat setul de markeri
incluși în Tabelul 4. Rezultatele sunt prezentate sintetic în Fig. 4.
Rezultatele acestui studiu demonstrează că populațiile celulare definite până în acest moment în mușchiul scheletic se
suprapun parțial. S-a constata însă că există subpopulaţii de celule care nu se încadrează în profilul fenotipic al
niciuneia dintre cele descrise până în prezent. Acestea au fost reprezentate în mov în Fig.9, pe baza rezultatelor
obținute la imunofenotipare. În Fig.10 au fost introduse imagini reprezentative pentru fiecare dintre aceste
subpopulații, în zonele în care acestea au fost detectate preferențial.
Astfel, populația de celule Sca-1 (stem cell antigen-1) pozitive, include, pe langă PICs, Sk-34 și mesenchymal
progenitors (MPs) o subpopulație de celule cu prelungiri dispuse preferențial în jurul nervilor periferici și al vaselor de
sânge, dar și răspândite printre fibrele musculare. Se pare că celulele Sca-1 pozitive sunt implica în procesul de
fibroză, întrucât în experimentele pe șoareci knock-out procesul de regenerare este înlocuit de fibroză (Long et al.
2011).
În aceeași măsură, există și celule CD34 pozitive , altele decât cele sca-1+/PGFDRα+, dispuse cu predilecție
perivascular, după cum am identificat și celule PDGFRα pozitive care nu co-exprimă markerii populațiilor descrise în
tabelul 4 (pericite, fibroblaste Tcf4+ sau MPs)
CD44 este exprimat atât pe suprafața celulelor stem mezenchimale cât și în celulele endoteliale, pericite și chiar
fibroblaste. În mușchiul scheletic, celule CD44 pozitive au fost identificate în asociere cu capilarele sanguine,
corespunzând populației de mesoangioblași. În plus, celule CD44 pozitive au fost identificate și în jurul vaselor medii
și mari din peri- şi epimisium, dar şi la distanţă faţă de peretele vascular.
CD146 este o glicoproteină de suprafață exprimată de mai multe populaţii celulare. În afara celulelor vasculare
(endoteliale – CD31+, musculare netede sau pericite – desmină+ și SMA+) au fost identificate celule CD146 pozitive
distribuite în interstițiu, atât perivascular cât și la distanță. În aceeași măsură markerul pericitar NG2 a fost identificat
și în celule vasculare (celule musculare netede) dar și în celule distribuite perivascular, în jurul vaselor de tip arterial
sau venos localizate în perimisium și în țesutul conjunctiv al epimisiumului mușchiului normal.
O altă populație interstițială este reprezentată de celulele CD90 pozitive luată în discuție doar în cazul celulelor
AC133+, provenite din sânge. În mare parte aceste celule nu sunt însă pozitive pentru CD45 dar exprimă vimentină,
fiind probabil reprezentate de fibroblaste sau celule stem mezenchimale (CD105), însă există și celule care nu respectă
aceste criterii fenotipice, răspândite în spațiul perivascular.
Intrucat spațiul perivascular este unul dintre cele mai bogate în celule interstițiale iar angiogeneza este unul dintre
fenomenele esențiale in cadrul fenomenului de regenerare, studiul nostru s-a concentrat pe acest compartiment
conjunctiv. Rezultatele acestui studiu au fost publicate parțial in revista Journal of Cellular and Molecular Medicine.
Studiul actual a pus in evidenta prezenta altor celule, localizate in spatiul vascular, care exprima PDGFRβ, dar
corespund din punct de vedere morfologic si fenotipic telocitelor.
Intrucat pentru asigurarea stabilitatii vasculare sunt necesare semnale intercelulare am testat expresia receptorului
factorului de crestere derivat din plachete, PDGFRβ, prezent pe membrana tuturor celulelor murale vasculare, fiind
implicat in procesul de recrutare al celulelor mezenchimale in timpul procesului de angiogeneza. (Winkler, Bell et al.
, Crosby, Seifert et al. 1998). Atat pericitele cat si celulele musculare netede vasculare sunt pozitive pentru αSMA si
PDGFRβ (Zhang, Cao et al. 2009) si au contacte intime cu celulele endoteliale (Armulik, Abramsson et al. 2005, von
Tell, Armulik et al. 2006). SMC sunt aranjate stratificat, fiecare celula avand o lamina bazala proprie. Pericitele sunt
incluse in membrana bazala a endoteliului si prezinta prelungiri citoplasmatice care inconjoara tubul endotelial. Studii
anterioare (Manole, Cismasiu et al. , Popescu, Gherghiceanu et al. , Popescu, Manole et al. , Suciu, Popescu et al.) au
aratat ca telocitele exprima VEGF. Asadar, telocitele ar putea fi implicate in procesul de recrutare al celulelor murale
vasculare in cadrul procesului de angiogeneza si remodelare/regenerare tisulara. Telocitele ar putea face parte asadar
dintr-un lant fenotipic care incepe cu fibroblastul, celula care sintetizeaza elementele matricei extracelulare (Göritz C
2011) si se termina cu fenotipurile contractile asociate peretelui vascular, cum sunt pericitele si celulele musculare
netede (Hirschi, Rohovsky et al. 1998, Chambers, Leoni et al. 2003, Jain 2003, Armulik, Abramsson et al. 2005).
C
17
Aceste celule cu morfologie particulară care exprima PDGFRβ au fost identificate și în endomisium, formând rețele
discrete în jurul fibrelor musculare și stabilind raporturi cu zonele în care celulele
satelit au fost puse în evidență pe baza expresiei NCAM/CD56.
În concluzie, marile compartimente conjunctive ale muschiului striat normal – spațiul perivascular, perinerv,
perimisium, epimisium - conțin o populație heterogenă de celule interstițiale, majoritatea rezidente, în urma testării
expresiei markerilor pentru celulele provenite din sânge (CD45, CD11a, F4/80) . Aceste subpopulații se suprapun din
punct de vedere fenotipic peste populațiile descrise în literatură, însă doar parțial. Studiul de față demonstrează că
aceste subpopulații ocupă poziții bine definite, așa cum rezultă din analiza probelor recoltate de la animale diferite. În
plus, datele obținute arată că există și alte tipuri celulare care nu se încadrează exact, ci doar parțial în categoriile
enunțate.
Printre fibrele musculare, endomisiumul este format din puține elemente conjunctive, celulele fiind reprezentate de
celulele capilarelor sanguine, foarte bogate la acest nivel, celule endoteliale, pericite/mesoangioblaști, fibre nervoase și
câteva alte subpopulații de celule interstițiale cu rectivitate pentru PDGFRα/β, Tcf-4, sca-1+/- CD34, vimentină+/-
CD90 cu morfologie fibroblast-like, în speță subpopulații de fibroblaste, MPs sau chiar recent descrisele telocite.
Toate aceste date sugerează heterogeneitatea celulară a teritoriilor conjunctive din muschiul scheletic normal, în care
pupulațiile de celule interstițiale nu sunt de fapt foarte bine definite, cel mai probabil facând parte dintr-un continuum
fenotipic care permite ajustarea acestui compartiment în funcție de necesitățile de moment.
In privința elementelor celulare care populează spațiul imediat înconjurător celulelor satelit, deci nișa celulelor stelit,
rezultatele imunofenotipării demonstrează relația directă dintre acestea și fibre nervoase amielinice, capilare sanguine,
formate din celule endoteliale și pericite, precum și fibroblaste Tcf4+ și celule cu prelungiri foarte fine și foarte lungi,
cel mai probabil telocite (Fig 4, 7, 9, 10).
Evaluarea ultrastructurală a nișei celulelor satelit susține datele obținute prin imunomarcare. În jurul celulelor
satelit, aflate sub lamina bazală a fibrei musculare adulte sunt prezente
frecvent capilare, fibre nervoase mielinice, prelungiri foarte fine aparținând
cel mai probabil telocitelor
Fig.3 Expresia de PGFDRβ la animalele distrofice în absența traumei musculare. Celulele cu prelungiri fine inconjoară fiecare fibra musculară, mai ales în zonele în care sunt fibre tinere sau mioblaști
Fig.4 Evaluarea fenotipică a elementelor nișei celulelor satelit evidențiate prin expresia de CD56 sau M-cadherină.
Fig.5 Celulă satelit, înconjurată de lamina bazală a fibrei musculare în țesutul normal,netraumatizat, având în proximitate un capilar sanguine, prelungirile telocitelor și un macrofag.
18
Aceste subpopulații au fost urmărite ulterior pe parcursul procesului de regenerare, prin imunofenotiparea in situ a
probelor recoltate la intervalele prestabilite după inducerea traumei musculare prin clampare, atât la animalele normale
cât și la cele cu distrofie.
Populația reprezentată de celulele PDGFRβ pozitive evoluează sub forma a două populații distincte, unele distribuite
perivascular și printre fibrele musculare, cu morfologie sugestivă pentru telocite, fiind evidențiate și pe parcursul
procesului de regenerare în jurul grupurilor de mioblaști activați și în fuziune ( începând cu ziua 5 post-traumă),
precum și o a doua populație de celule, mari, intens pozitive, care nu exprimă markeri de celule sanguine (CD45) și
care devine foarte evidentă către sfârșitul primei săptămâni după traumă. Acestea din urmă sunt răspândite printre
fibrele musculare, mai puțin în focarul traumei și mai ales în jurul nervilor periferici, persistând chiar și după primele
2 săptămâni, însă nunărul lor începe să scadă. Această populație este prezentă chiar și în probele provenite de la
animale netraumatizate în cazul mușchiului distrofic. Cealaltă populație este mult mai evidentă și mai bine
reprezentată în focarele de necroză, în jurul fibrelor în formare și perivascular (Fig. 6).
Fig 6. PGFDRβ (verde)/ CD56 (roșu) în probele recoltate la intervale stabilite de timp pe parcursul procesului de regenerare la animale normale (A) și distrofice (B)
A
B
19
În afara celulelor PDGFRβ pozitive, pe parcursul procesului de regenerare se amplifică populațiile de celule sca-1,
CD34, CD44, PDGFRα pozitive, la început pe seama procesului inflamartor. Analiza secțiunilor seriate arată că
majoritatea celulelor de tip inflamator sunt pozitive ptr sca-1, CD34, CD44 și PDGFRα.
În privința celor distribuite perivascular, și aici există mai multe subpopulații acestea exprimă PDGFRβ, sca-1, CD34
și CD44, dar într-o mică măsură PDGFRα (Fig. 8).
Fig 8. Distribuția populațiilor de celule interstițiale urmărite pe parcursul procesului de regenerare în marile compartimente conjuntive (A) spațiul perivascular, (B) spațiul din jurul nervilor periferici și (C), focarul de leziune.
B A C
Fig7. Synoptic view on the skeletal muscle interstitial space. Different stem cell populations become activated after acute injury (green), differentiate and fuse to form myotubes with the support provided by various interstitial and blood derived cells (blue) either by physical contact or paracrine signalling. Satellite cell (SC); endothelial cell (endo); adipocyte (adip); mesenchymal progenitors (MPs) – include the PDGFRα+ progenitors, the FAPs and Tie2+ skeletogenic progenitors; PW1+/Pax7– interstitial cells (PICs); SK-34 cells (SK-34); telocytes (TCs); SDF-1 skeletal muscle-derived fibroblast (fib SDF-1); macrophages (M1/M2); neutrophils (Ne); myogenic endothelial cells (MECs); Tcf4 positive fibroblasts (Tcf4); adventitial
cells (ACs); smooth muscle cells (SMC). (BioMed Research International ‚”Cellular players in skeletal muscle regeneration”)
20
Fig9. Populații celulare identificate in situ în mușchiul gastrocnemian de șoarece, în absența distrofiei și a traumei musculare. Populații de celule stem (verde), populații de celule interstițiale descrise (albastru) și populații neclasificate (mov)
Fig10. Populațiile celulare neclasificate și distribuția acestora sunt exemplifi-cate prin imagini reprezen-tative.
21
Rezultate au fost obținute în privința procesului de apoptoză atât în mușchiul normal cât și la intervalele stabilite după
inducerea traumei musculare. Fragmentele de ADN rezultate în urma inducerii apoptozei au fost detectate prin legarea
unor nucleotide modificate la capetele OH- terminale.
Rezultatele obținute în mușchiul normal, în absența traumei musculare arată că, în condiții normale (fiziologice),
fenomenul poate fi surprins foarte rar în masa țesutului.
În cazul modelului de traumă mecanică, aceste fragmente au fost localizate fie în nuclei încă intacți, în celulele
interstițiale din endomisiu (A) sau perimisiu (B) sau chiar celule musculare (C) aflate la debutul procesului (în
primele 24 de ore de la traumă), fie în corpi apoptotici aflați în matricea extracelulară sau chiar în citoplasma
fagocitelor. Această etapă a fost cel mai bine reprezentată la 24/48 de ore de la traumă (S2/3), pe seama populației de
celule inflamatorii a căror invazie este de scurtă durată, pentru ca în timpii următori amploarea fenomenului să scadă
treptat (Grafic 1).
Estimarea cantitativă a intensității acestui fenomen a fost determinată la momentele stabilite, prin numărători dublu
orb. Au fost numărați 1000 de nuclei în 15 câmpuri microscopice, analizate cu obiectivul 20x. Numărul de celule
pozitive a fost determinat ca procent din numărul total de nuclei. S-a luat în calcul și distribuția nucleilor pozitivi,
mionuclei sau nuclei ai celulelor din interstițiu.
Evaluarea proliferării celulare în mușchiul normal și după trauma musculară s-a realizat prin sanaliza PCNA.
Analiza eșantioanelor prelevate de la șoareci sănătoși au arătat o activitate de proliferare moderată atât în interstițiu
cât și în celulele musculare. Această activitate se amplifică însă în cazul eșantioanelor prelevate
la diferite intervale din cadrul lotului de animale la care a fost indusă trauma musculară
mecanică, mai ales în interstițiu, cu un maxim la 24/48 de ore, dar proporția se mentine crescută
și în etapele ulterioare ale procesului de regenerare (Grafic 2)
A B C
N
1h 24h 48h 5z 7z 14z
Grafic .1. Evoluția procesului de apoptoză în muschiul scheletic la intervalele stabilite de-a lungul procesului de regenerare (S1-S6)
Grafic .2. Evoluția procesului de proliferare în muschiul scheletic la intervalele stabilite de-a lungul procesului de regenerare (S1-S6)
22
Investigarea contributiei paracrine a celulelor interstitiale in muschiul normal si pe parcursul regenerariii
posttraumatice
Factorii solubili de crestere si citokinele joaca un rol fundamental in controlul miogenezei atat pre- cat si post-natale.
Dupa lezare, celulele inflamatorii si in special macrofagele, intervin in reglarea procesului de regenerare musculara
prin secretia de cytokine. Studiile efectuate in domeniu au demonstrat ca celulele inflamatorii intervin in mai multe
etape, mai intai sunt eliberate cytokine pro-inflamatorii (INFγ, TNF, IL-1) apoi anti-inflamatorii (IL-4, 13, 10). Alti
factori de crestere HGF, FGF-2/6, VEGF, PDGF-AA si -BB, stromal derived factor-1 (SDF-1) si IGF-1/2 sunt de
asemenea implicati in stimularea proliferarii si diferentierii celulare posttraumatic sau actioneaza ca factori inhibitori,
cum este cazul myostatinului, transforming growth factor- α and -β1 si bone morphogenetic proteins.
In afara acestora, alte populatiii de celule interstitiale, cum sunt si celulele recent identificate – telocitele- ar putea
interveni in reglarea diferitelor procese fiziologice sau desfasurate pe parcursul procesului de regenerare. Unul dintre
acestea este procesul de angiogeneza, fenomen intens studiat in alte sisteme, dar pana in prezent nu exista multe date
despre controlul molecular al acestuia in muschiul striat, mai ales prin prisma interventiei celulelor interstitiale
Pentru determinarea nivelului factorilor de crestere/angiogenici s-a proiectat un test de screening pentru selectarea
unui set de molecule cu variație corelată cu stadiile procesului de regenerare. În acest scop a fost utilizat kit-ul
MILLIPLEX® MAP Mouse Angiogenesis / Growth Factor Magnetic Bead pe platforma Luminex 200TM. Prezenta
acestora a fost determinata atat in lizatul tisular, cat si in serul animalelor de la care acesta a fost recoltat.
Un alt set de determinari a fost efectuat pe probele biologice, lizat celular si supernatant rezultate din culturile de
celule obtinute conform protocoalelor optimizate in etapele anterioare.
Rezultatele acestui test de screening au fost mai departe investigate prin tehnici complementare de imunomarcare
pentru determinarea distributiei si identitatii celulelor implicate.
În urma acestor determinări și a analizei literaturii de specialitate au fost selectate 2 seturi mai restrânse de molecule
recunoscute a fi implicate atât în procesul re regenerare musculară cât și în cel de angiogeneză.
Primul set de 6 molecule a fost urmărită pe parcursul procesului de regenerare la cele 6 loturi incluse în studiu –
follistatin (FST), Placental Growth Factor–2 (PLGF-2) – membru al familiei VEGF, EGF, amphiregulin (AREG),
betacellulin (BTC) – membrii ai familiei EGF si endoglin. În plus, pentru probele obținute de la animale normale au
fost analizat un alt set de 6 molecule – endothelin, Hepatocyte Growth Factor (HGF), keratinocyte-derived ckemokine
(KC), angiopoietin-2 și VEGF.
Rezultatelor obținute în urma determinării nivelului de expresie al moleculelor incluse în primul set au fost trimise
spre publicare către jurnalul Cell and Tissue Research sub titlul ” Interstitial outburst of angiogenic factors during
skeletal muscle regeneration after mechanical trauma”
Nivelul tuturor acestor factorilor selectați se coreleaza cu stadiile procesului de regenerare crescand gradual si
atingand valorile maxime catre sfarsitul primei saptamani dupa inducerea traumei. Aceasta perioada corespunde
procesului inflamator. Valorile lor se mentin insa crescute si dupa aceasta perioada, sugerand existenta unei alte surse
locale, cel mai probabil reprezentata de celule interstitiale câtă vreme nivelul local din țesutul traumatizat nu se
coreleaza cu evolutia nivelulului local din țesutul contralateral corespunzător și nici cu nivelul seric (Fig. 11, 12).
Deasemenea, au fost demonstrate corelații semnificative între EGF și ceilalți 2 membrii ai acestei familii, precum și cu
FST, ceea ce sugerează fie existența unei surse comune fie o interrelație dinamică între aceste molecule
(Fig. 13). Datele obținute la imunomarcarea in situ demonstrează că, în cazul moleculelor din familia EGF, acestea
prezintă o distribuție similară, ceea ce susține ipoteza existenței unei surse comune, însă nu este si cazul FST (Fig.15).
Cel mai probabil în această situație există un fenomen de potențare, fie reciprocă fie unilaterală, fenomen care merită a
fi studiat în cadrul experimentelor viitoare.
B
23
Pentru confirmarea profilului de expresie obținut prin tehnica de multiplexare proteica, a fost optimizat protocolul de
Western Blot.
Pentru urmatoarele proteine marcajul cu anticorpii utilizati a fost specific, iar cantitatea lor in tesut a fost suficient de
mare incat sa fie bine vizibile: folistatina, EGF, endotelina, endoglina (pentru endoglina s-au facut deocamdata doar
teste fiind necesare in continuare ajustari ale concentratiei).
Pentru celelalte proteine, s-au facut diferite teste, dar fie anticorpul utilizat nu a fost suficient de specific, obtinandu-se
semnal secundar nespecific prea puternic, fie cantitatea de proteina cautata a fost extrem de mica si nu a putut fi
vizualizata prin metoda WB.
Datele obținute confirmă rezultatele experimentelor de multiplexare proteică (Fig.14), fiind însă necesare determinări
suplimentare pentru obținerea unor date cu semnificație statistică.
Fig 11 Nivelul relativ, normalizat pentru FST si
PLGF-2 in tesutul lezat, contralateral si control (a, e)
si in ser (b, f). Nivelul mediu al FST si PLGF-2
raportat la controlul normal, in tesutul lezat (c, g) si
ser (d, h).
Fig. 12 Nivelul relativ, normalizat pentru BTC, EGF si
AREG in tesutul lezat, contralateral si control (a, c,
g) si in ser (d, h). Nivelul mediu al BTC, EGF si AREG
raportat la controlul normal, in tesutul lezat (b, e, i)
si ser (f, j).
A
B
24
A
B
C
Fig. 13 Corelații între profilul de expresie al moleculelor analizate în țesutul lezat versus control (A) și ser (B) și între nivelul acestor molecule în țesutul lezat (C). Corelații semnificative p<0.05
Fig. 14 reprezentarea grafica a prezentei EGF, FST și Endothelin (in functie de prezenta Actinei, ca marker de incarcare) in tesutul muscular al sorecilor cu leziune musculara, la diferite intervale de la producerea traumei. S-a masurat densitatea optica a benzilor cu ajutorul programului Image J. (A) EGF. Se observa o histograma bimodala, cu o crestere a cantitatii proteinei dupa leziune (S1) si scaderea marcata a EGF la S 2 si S3, dupa care se inregistreaza un nou varf la S4/5. (B) FST. Se observa o crestere treptata a cantitatii proteinei, cu un varf marcat la soarecele 3, dupa care prezenta Follistatinei scade catre valoarea observata la control, dupa o histograma unimodala; (C) Endothelin. Histograma este bimodala, cu un varf la soarecii cu leziune 1 si 6 si cu o scadere reprezentativa la sorecele cu leziune 2 (Ctrl=control; L1-L7 soareci cu trauma musculara, sacrificati la diferite intervale de la producerea strivirii)
25
Analiza rezultatelor experimentelor de imunomarcare in situ pentru moleculele incluse în acest set confirma
existenta unor surse locale pentru moleculele luate in discutie. Cu exceptia EGF, slab exprimat in mioblasti,
celulele musculare adulte, precum și de către celulele musculare netede vasculare și nervi periferici, aceste
surse sunt cel mai probabil reprezentate de celule localizate in interstitiu, in afara laminei bazale a fibrelor
musculare adulte, dar in apropierea acestora. Cel mai frecvent, aceste celule interstitiale sunt distribuite in
spatiile conjunctive perivasculare, atat in focarul de leziune, in jurul vaselor de neoformatie, cat si la distanta
de acesta (Fig.15) .
Fig.15 prezintă imagini reprezentative pentru distribuția FST, PLGF-2, BTC, EGF și AREG în focarul de leziune la momentul de maximă expresie
26
Pentru determinarea identității populațiilor de celule interstițiale responsabile de sinteza și secreția acestor molecule au
fost stabilite experimente de dublă marcare in situ.
Pe baza rezultatelor obținute în faza de fenotipare a țesutului pe parcursul procesului deregenerare, au fost incluse în
studiu populațiile a căror proporție a prezentat o evoluție corelată cu cea a regenerării tisulare.
Pentru acest set de experimente am ales să analizăm probele recoltate la momentele de maximă expresie a moleculelor
luate în discuție.
Astfel, în cazul primului set de molecule angiogenice/trofice, dubla marcare cu CD45 a dovedit că există o proporție
importantă de celule migrate din sânge care sunt implicate în sinteza lor, însă există și alte celule interstițiale care
participă la obținerea nivelului determinat prin multiplexare proteică (Fig.16).
Rezultatele demonstrează că, celulele interstițiale implicate în sinteza acestor factori de creștere/angiogenici, aparțin
subpopulațiilor urmărite sca-1/ CD44/CD34/PDGFRβ pozitive, populații pe care le-am izolat in vitro prin optimizarea
protocolului de cultură și care au fost utilizate pentru evaluarea influenței celulelor interstițiale asupra potențialului de
grefare al celulelor satelit.
Expresia moleculelor incluse în acest set a fost determinată și pe loturile de animale cu distrofie, în absența traumei
musculare dar și la momentele stabilite pe parcursul procesului de regenerare. Nivelurile acestor molecule în lizatul
tisular sunt semnificativ crescute la animalele cu distrofie în comparație cu animalele normale, în absența traumei
musculare. (Fig. 17), cu excepția AREG ale cărui valori s-au situat sub limita de detecție a acestei metode și EGF.
În cazul probelor provenite de la animale distrofice traumatizate, AREG și BTC au fost sub limita de detecție a acestei
metode. În privința celorlalte molecule, cu excepția EGF, valorile acestora cresc semnificativ către sfărșitul primei
săptămâni post-traumă, urmând ca în cea de a doua săptămână să înregistreze valori mai scăzute decăt la începutul
procesului. Deasemenea, profilul de expresie al PLGF-2 este modificat față de lotul animalelor normale, înregistrând
un maxim mai târziu pe parcursul procesului de regenerare.
Fig 16 Imunofluorescență in situ. Co-expresia markerilor fenotipici și a a factorilor de creștere/cytokine .
27
Fig 17 Nivelul mediu al BTC, EGF, Endoglin, FST și PLGF-2 in tesutul lezat al animalelor normale raportat la media valorilor obținute de la animalele cu distrofie
Fig. 18 Nivelul relativ, normalizat pentru EGF, Endoglin, FST și PLGF-2 in tesutul lezat al animalelor cu distrofie în probele recoltate la intervalele stabilite de timp pe parcursul procesului de regenerare. Raportat la valorile medii obținute în lotul control, în absența traumei musculare
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Ctrl Dmd/Ctrl N
Ctrl Dmd/Ctrl N
0
2
4
6
8
10
12
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
EGF Dmd
Endoglin
Follistatin
PLGF-2
28
Aceste date au fost susținute de rezultatele obținute prin imunomarcare in situ. Astfel, AREG și BTC au fost greu
decelabile în țesut, pe cand EGF, FST, PLGF-2 și endothelin sunt mult mai bine exprimate încă din probele
netraumatizate. Pe parcursul procesului de regenerare se amplifică expresia lor atât în celule de tip inflamator,
demonstrat prin co-expresia CD45, dar și de către alte tipuri de celule interstițiale localizate mai ales perivascular. În
cazul EGF, expresia e crescută în fibrele nervoase și celulele musculare netede vasculare, iar endothelina este
exprimată și de celulele endoteliale (Fig. 19).
Acest profil de evoluție, sugerează că, spre deosebire de animalele normale, la cele cu distrofie creșterea producției de
factori de creștere și citokine se realizează în special pe seama celulelor inflamatorii, urmând a fi ulterior amplificată și
preluată de alte populații celulare localizate în interstițiu, întrucât au fost înregistrate valori semnificativ crescute și
după diminuarea fenomenului inflamator, însă nu la același nivel (Fig. 18)
Fig. 19 prezintă imagini reprezentative pentru distribuția AREG, , BTC, EGF și endothelin în marile compartimente conjunctive, la animalele netraumatizate și la momentul de maximă expresie
29
În privința celui de al doilea set de factori de crestere angiogenici, rezultatele obțínute prin multiplexare proteică (Fig.
20) demonstrează că aceștia încep să crească semnificativ mai devreme decât cei incluși în primul set, iar valorile se
mențin semnificativ crescute doar pe parcursul primei săptămâni post-traumă, suprapunându-se peste episodul
inflamator care domină prima parte a procesului de regenerare.
Fig.20 Nivelul relativ, normalizat pentru endoglin, endothelin, HGF, KC și angiopoietină-2 în probele recoltate de la animalele normale la intervalele stabilite de timp pe parcursul procesului de regenerare. in tesutul lezat , contralateral și control și în ser * p<0,05
30
Angiopoietina-2 este singura moleculă inclusă în studiu care nu a
prezentat variații semnificative pe parcursul procesului de regenerare
în cazul modelului utilizat, deși experimentele de imunomarcare in situ
demonstrează existența unei surse locale.
În privința endothelinei, pe lângă celulele endoteliale, imunomarcarea
in situ a evidențiat existența a două subpopulații, una care provine din
sânge (CD45+) și o a doua reprezentată de celule din interstițiu.
Acestea din urmă sunt mult mai intens pozitive și devin mult mai
evidente către sfârșitul perioadei incluse în studiu (Fig. 21).
În cazul ambelor seturi de molecule analizate, distribuția preferențial perivasculară, mai ales în focarul leziunii, în
jurul vaselor de neoformație, demonstrează potențialul lor angiogenic.
Aceasă parte a studiului se află încă în evaluare, datele rezultate fiind incluse în două manuscrise. Unul dintre
acestea se află în evaluare la jurnalul Cell and Tissue Research iar cel de al doilea se află încă în lucru, urmând
a fi trimis spre evaluare în cursul lunii următoare la revista BioMed Research International.
Fig.21 Imunofluorescență in situ. Distribuția celulelor care sintetizează factorii trofici/angiogenici în țesutul muscular la diferite interval de la producearea traumei
31
Populații celulare selectate in vitro din țesutul sănătos.
Imunofluorescența. Analiza imunofenotipică in vitro a arătat că metoda de cultivare utilizată selectează un amestec
constant, dar în proporții variabile, de tipuri celulare cu rată mare de proliferare, care exprimă preponderent markeri de
celule stem mezenchimale (CD44, CD105, CD90, CD146) dar și markeri caracteristici pericitelor (NG2, CD146,
SMA, PDGFRβ) sau fibroblastelor (CD90, CD34, DDr2, vimentină). Foarte bine exprimați în populație sunt și
markerii pentru celule satelite M-cadherin și CD56. Există o contaminare nesemnificativă cu celule endoteliale și
probabil precursori angajați (CD31+/CD44+) precum și cu celule musculare netede (SMM, SMA, CD146, desmină).
Dublele imunomarcări demonstrează că aceste subpopulații se suprapun parțial.
Datele obținute prin analiza fenotipică a culturilor obținute pe baza modelului de traumă mecanică demonstrează
modificarea expresiei celulare. Cele mai evidente modificări apar în cazul CD34 a cărui expresie se amplifică în
primele etape ale procesului de regenerare pentru ca mai apoi să se reducă. Și expresia markerului pericitar NG2
scade, fiind contrabalansată de expresia CD90, CD146 și M-cadherin /CD56.
Au fost analizate prin citometrie în flux culturile primare, la primul pasaj, provenite din șase probe (M1-6, mușchi
gastrocnemian) recoltate de la șoareci sănătoși.
Culturile au putut fi propagate timp de șase pasaje. Evoluția expresiei markerilor introduși în studiu a fost urmărită
până la cel de al treilea pasaj (Grafic 3)
Rezultatele obținute susțin observațiile obținute prin imunofluorescență, cultura fiind minim contaminată cu celule
endoteliale, protocolul fiind optimizat pentru îmbogățirea culturilor în celule mezenchimale caracterizate prin expresia
markerilor identificați a fi preferențial exprimați in situ. În plus, cultura conține o populație constantă de celule satelit,
caracterizate prin expresia de M-cadherină.
În loturile obținite din probele recoltate la momentele stabilite pe parcursul procesului de regenerare, numărul de
celule selectate cu protocolul de cultivare optimizat crește semnificativ fața de controlul normal (Grafic 4)
-20
0
20
40
60
80
100
120
Series1
Series2
Series3
CD44
CD34
CD44
CD10
5
CD90
CD34 CD146
Sca-1
CD10
5
Grafic .3. Evoluția expresiei markerilor selectati în culturile obținute de la animale normale, netraumatizate, pe parcursul propagării culturii. CP- cultură primară, P1 – pasaj 1, P2 – pasaj 2.
Fig.22. Culturi primare din mușchiul gastrocnemian recoltate de la animale normale în absența traumei musculareImunofuorescența
32
Evoluția populațiilor urmărite a fost în continuare monitorizată pe parcursul procesului de regenerare. Valorile medii
obținute la fiecare timp de la inducerea traumei (IISt1-6) au fost raportate la media valorilor obținute în lotul de
control obținut din probele recoltate de la animale netraumatizate (Grafic 5).
Rezultatele demonstrează că populațiile selectate se mențin relativ constante pe parcursul procesului de regenerare, cu
amplificarea populației de celule CD34 pozitive, PDGFRβ pozitive și celule satelit la 48 de ore de la traumă.
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
N S1 S2 S3 S4 S5 S6
Series1
Grafic. 4. Numărul mediu de celule obținut de la animalele normale (N) și la momentele stabilite de-a lungul procesului de regenerare (S1-S6)
Grafic. 5. Evoluția expresiei markerilor selectati în culturile obținute de la animale traumatizate, la intervalele de timp stabilite, raportate la media valorilor obținute în lotul control.
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
CD31 CD34 CD90 CD44 Sca-1 NG2 PDGFRb M-cadherin
S1L/ctrl
S2L/ctrl
S3L/ctrl
S4L/ctrl
S5L/ctrl
S6L/ctrl
33
Pentru evaluarea influenței pe care celulele interstițiale selectate in vitro ar putea-o manifesta asupra celulelor satelit
și a microclimatului local în contextul utilizării lor în experimente de transplant celular la animale la care s-a indus
trauma mecanică prin clampare, nivelul factorilor de creștere folosiți pentru experimentul de screening și apoi al celor
incluși în studiu a fost determinat în supernatantul și lizatul celular din culturile primare. Acestea au fost obținute de la
animale normale și după inducerea traumei iar analiza s-a efectuat prin multiplexare proteică conform protocolului
utilizat pentru probele de țesut și ser.
Rezultatele arată că, deși variația concentrației acestor factori trofici/angiogenici nu variază corelat cu fazele
procesului de regenerare în cea mai mare parte a cazurilor (Fig. 23, AREF, BTC, EGF) există și situații în care
asistăm la o evoluție monofazică a acestora atât în lizatul celular cât și în supernatantul de cultură corespunzător. (ex.
Fig 23. Nivelul mediu al AREG, BTC, EGF, Endoglin, FST și PLGF-2 in lizatul obținut din proba lezată (LL) raportat la mușchiul contralateral (LN) și în supernatantul rezultat din culturile obținute din țesut lezat (SL)raportat la cel rezultat din probele contralaterale (SN)
34
FST, PLGF, endoglin). Pentru stabilirea unor valori cu semnificație statistică și pentru investigarea corelatiilor cu
evoluția lor tisulară este însă necesar un set mult mai extins de experimente.
Oricum, concentrațiile acestor molecule în lizatul și supernatantul obținut din culturile din probe lezate au fost găsite
la un nivel mult mai ridicat decât în culturile provenite din mușchiul contralateral, netraumatizat.
Pe baza acestor rezultate a fost planificat și optimizat protocolul de separare al populației de celule satelit (CD56+)
din culturile primare obținute de la animalele sănătoase, netraumatizate, C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J
în vederea evaluării influenței celulelor interstițiale asupra potențialului de grefare al acestor celule în urma
transplantului celular la animale atimice NU/J la care s-a aplicat protocolul de inducere a traumei musculare prin
strivire.
Viabilitatea celulelor a fost întotdeauna mai mare de 95% , iar procentul de recuperare totală de 100% . Pentru
calcularea purității fracției pozitive și a ratei de recuperare a populației țintă, s-au preparat probe pentru analiză în
citometrie în flux. Puritatea fracției pozitive a fost în medie 96%, iar rata de recuperare a populației țintă de 65,33%.
Pe baza observațiilor anterioare în privința evoluției procesului de regenerare musculară în urma inducerii unei traume
musculare mecanice la animale sănătoase, fără distrofie musculară, am constatat că numărul și activitatea paracrină a
celulelor interstițiale încep să devină semnificativ crescute in vivo cât și in vitro după 48h de la inducerea traumei, cu
un maximum la 5 sau 7 zile de la traumă. Prin urmare, pentru protocolul de transplant celular am stabilit ca momentul
optim pentru injectarea celulelor este la 48h de la momentul traumei, urmând ca evaluarea grefării să fie efectuată
după 5 zile, momentul în care au fost detectați primii miotubi în modelul animal optimizat în cadrul acetui studiu.
Pentru a urmări influența celulelelor interstițiale asupra potențialului de grefare al celulelor satelit, transplantul celular
s-a efectuat fie doar cu celulele obținute prin separare, fie după co-cultivarea acestora cu celulele interstițiale din
fracția negativă, fără contact direct, dar cu posibilitatea transferului de factori solubili, fie cu celule obținute din
cultura primară, fără separare, unde pe lângă factorii solubili, se stabilesc si contacte fizice, directe între celulele stem
și celulele interstițiale.
Analiza secțiunilor obținute după 48h de la injectare a pus în evidență existența celulelor GFP+ în țesutul
animalului gazdă, organizate în grupuri printre fibrele musculare. După încă 48h, adică 7 zile post-traumă,
acestea se alinieaza printre fibrele musculare și au fost regasite preponderent în focarul de regenerare (Fig. 24).
A
B
Fig 24. Celule GFP+ transplantate la 48h dupa inducerea traumei au fost detectate în țesutul animalului gazdă după 48h (5 zile post-traumă) (A) și 7 zile post-traumă (B).
35
Rezultate mai bune au fost obținute la injectarea culturilor primare integral, fără separare și condiționare prin
molecule solubile, sugerând ca un factor foarte important e reprezentat si de contactele directe dintre celulele
setm și celulele interstițiale.
Acestea sunt însă date preliminare, întrucât bugetul proiectului nu a permis extinderea experimentelor pentru
obținerea unor rezultate cu semnificație statistică datorită costurilor mari de achiziție pentru animalele
transgenice GFP+, C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J și a celor atimice, receptoare.
Aceste rezultate preliminare reprezintă însă un suport pentru următoarele potențiale cereri de finanțare.
În concluzie, studiul de față reprezintă o meta-analiză a evoluției și influenței pe care celulele interstițiale o au
de-a lungul procesului de regenerare musculară.
Experimentele de imunofenotipare în situ efectuate pe țesutul normal au evidențiat existența unei populații
heterogene de celule interstițiale, ale cărei subpopulații, unele dintre ele intens discutate în literatura de
specialitate, se suprapun parțial. Pe baza markerilor exprimați predominant de aceste celule interstițiale și a
elementelor ultrastructurale caracteristice, s-a realizat o cartografiere a distribuției lor în marile
compartimente conjunctive – spațiul perivascular, perinerv, perimisiumul și epimisiumul si în raport cu
celulele satelit. În condiții normale endomisiumul este sărac în celule interstițiale cu excepția rețelei extensive
de capilare.
Una dintre subpopulațiile bine reprezentate în marile compartimente conjunctive ale mușchiului normal este
reprezentată de celulele recent descoperite și descrise în majoritatea aparatelor și sistemelor, telocitele, echipa
noastră fiind cea care le-a pus în evidență și le-a descris și în mușchiul striat. Această populație este cel mai
bine definită prin corelarea analizei ultrastructurale cu expresia fenotipică a receptorului PDGFRβ. Aceste
rezultate au fost publicate în jurnalul Journal of Cellular and Molecular Medicine.
Rezultatele acestei evaluări coroborate cu datele din literatura de specialitate sugerează versatilitatea
componentei celulare a interstițiului prin existența unui continuum fenotipic prin care acest rezervor celular
poate satisface nevoile de moment ale organului din care fac parte, aspect fundamental pentru menținerea
homeostaziei și funcției acestuia.
Prin urmare, pe baza analizei rezultatelor obținute în această etapă și a concluziilor formulate, studiul a
continuat cu urmărirea evoluției acestei populații heterogene pe parcursul procesului de regenerare atât în
cazul mușchiului normal cât și al probelor recoltate de la modele animale cu distrofie musculară.
În acest scop a fost generat și optimizat un model animal de traumă musculară mecanică care să reproducă cât
mai fidel fenomenul natural și a fost achiziționată o colonie de animale cu mutație pentru gena distrofinei,
folosite ca modele animale de distrofie musculară Duchenne.
Deasemenea, a fost selectat un set de markeri fenotipici care să reprezinte cât mai bine și să acopere
subpopulațiile celulare care se dezvoltă pe parcursul procesului de regenerare, fiind urmărite procesele de
proliferare și apoptoză în cadrul acestei populații, precum și proporția și redistribuirea acestora în marile
compartimente conjunctive și în focarul de leziune, o atenție deosebită fiind acordată spațiului perivascular.
Au fost astfel definite intervalele de timp reprezentative pentru etapele procesului de regenerare, iar analiza
fluctuației și distribuției celulelor interstițiale a fost analizată prin fenotipare in situ și analiză ultrastructurală.
Rezultatele acestei etape a studiului dovedind că unul dintre cele mai dinamice și heterogene compartimente
conjunctive este cel perivascular.
O etapă importantă și decisivă a acestui studiu a fost aceea de identificare a potențialilor factori de creștere și
citokine prin care celulele interstițiale ar putea contribui la modularea procesului de regenerare musculară.
Întrucât unul dintre procesele cheie ale regenerării în orice organ este cel de angiogeneză, pentru screeningul
factorilor solubili eliberați în timpul regenerării a fost ales un kit pentru determinarea factorilor angiogenici.
Dintre acestia au fost selectate ulterior 2 seturi de molecule care nu au fost până la ora actuală studiate în
legătură cu procesul de regenerare musculară și care au prezentat o variație sugetivă pe parcursul procesului
de regenerare. În plus, în afara rolului angiogenic, aceste molecule funcționează și ca factori trofici pentru
celulele musculare și/sau nervi periferici sau ca mediatori ai inflamației. Aceste rezultate au fost corelate cu
datele furnizate de imunomarcarea in situ pentru a pune în evidență sursa interstițială a acestora si distribuția
preferențială a celulelor implicate în producerea lor. O parte dintre aceste date a fost inclusă în manuscrisul ”
Interstitial outburst of angiogenic factors during skeletal muscle regeneration after acute mechanical trauma” trimis spre
evaluare la jurnalul Cell and Tissue Research, iar o altă parte este inclusă în manuscrisul care va fi trimis spre evaluare în
cursul lunii viitoare la revista BioMed Research International.
A fost optimizat protocolul de îmbogățiere al cuturilor celulare în elemente interstițiale, astfel încât populațiile
urmărite să fie cât mai bine reprezentate, compoziția fenotipică a acestor culturi fiind urmărită în timp și pe
36
parcursul procesului de regenerare prin citometrie de flux. Ulterior, concentrația factorilor trofici/angiogenici
incluși în studiu a fost determinată în lizatul celular și supernatantul culturilor obținute din probe recoltate la
intervalele stabilite pe parcursul procesului de regenerare. Rezultatele demonstrează că factorii urmăriți sunt
mult mai bine exprimați în culturile obținute din probele lezate.
Pe baza acestor rezultate, s-su obținut culturi celulare din probe recoltate de la animale netraumatizate
transgenice care exprimă constitutiv GFP în toate celulele, astfel încât aceste celule să poată fi urmărite după
transplantul în mușchiul traumatizat al animalelor atimice. Din aceste culturi au fost separate prin izolare cu
bile magnetice celulele satelit, acestea fiind transplantate fie împreună cu celulele interstițiale fie separat sau
după conditionarea cu factori trofici proveniți de la acestea. Rezultatele demonstrează că cea mai mare
capacitate de supraviețuire și grefare au avut-o celulele provenind din culturi mixte, ceea ce susține ipoteza că,
pe lângă factorii solubili, celulele interstițiale ajută la integrarea și dirijarea celulelor satelit în microclimatul
local prin contacte fizice.
Această parte a studiului fost propusă în proiect ca experiment pilot, iar rezultatele obținute încurajează
dezvoltarea în viitor a unui studiu complex care să furnizeze date cu semnificație statistică pentru confirmarea
acestor rezultate.
37
Referinte Tabel 3
1. Díaz-Flores, L., Gutiérrez, R., and Madrid, J. (2009) Pericytes. Morphofunction, interactions and pathology in a quiescent and activated mesenchymal cell niche. Histol.
Histopathol. 24, 909–969.
2. http://www.uni-mainz.de/FB/Medizin/Anatomie/workshop/EM/EMMastzE.html
3. Harris, J., Werling, D., Hope, J. C., Taylor, G., and Howard, C. J. (2002) Caveolae and caveolin in immune cells: distribution and functions. Trends Immunol. 23, 158–164
[online] http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1471490601021615.
4. Greer, J. P. (2009), Wintrobe’s Clinical Hematology, Lippincot Williams & Wilkins
5. Lindsberg, P. J., Strbian, D., and Karjalainen-Lindsberg, M.-L. (2010) Mast cells as early responders in the regulation of acute blood-brain barrier changes after cerebral
ischemia and hemorrhage. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, 689–702 [online]
6. Xu, P., Crawford, M., Way, M., Godovac-Zimmermann, J., Segal, A. W., and Radulovic, M. (2009) Subproteome analysis of the neutrophil cytoskeleton. Proteomics 9,
2037–49 .
7. Wang, Y., Teng, H.-L., and Huang, Z. (2012) Intrinsic migratory properties of cultured Schwann cells based on single-cell migration assay. PLoS One 7, e51824 [online]
8. Jessen, K., and Mirsky, R. (1984) Nonmyelin-forming Schwann cells coexpress surface proteins and intermediate filaments not found in myelin-forming cells: a study of
Ran-2, A5E3 antigen and glial. J. Neurocytol. 13, 923–934.
9. Orchard, G. and Nation, B. (2014) Cell Structure and Function, Oxford University Press, 2014
10. Carlsen, F., and Behse, F. (1980) Three dimensional analysis of Schwann cells associated with unmyelinated nerve fibres in human sural nerve. J. Anat. 130, 545–557.
11. Kawahara, T. (2004) Caveolae Localization and Caveolin Expressions in Schwann Cells of Mature Rat Spinal Nerves. Kurume Med. J. 51, 263–271
12. Zucker-Franklin, D., Greaves, M. F., Grossi, C. E., Marmont, A. M. (1988) Atlas of Blood Cells – Function and Pathology, Edi Ermes, Milano
13. Carvalho, T. de, and Souza, W. De (1989) Study of mitochondrial organization in living resident and activated macrophages using the laser dye rhodamine 123. J. Leukoc.
Biol. 45, 498–502.
14. Perrotta, I., Carito, V., Russo, E., Tripepi, S., Aquila, S., and Donato, G. (2011) Macrophage autophagy and oxidative stress: an ultrastructural and immunoelectron
microscopical study. Oxid. Med. Cell. Longev. 2011, 282739 [online]
15. Linder, S., and Hufner, K. (2000) Microtubule-dependent formation of podosomal adhesion structures in primary human macrophages. J. cell … 113, 4165–4176.
16. Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., and Vignjevic, D. M. (2010) Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of
invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541–56.
17. Zhang, F., and Pasumarthi, K. B. S. (2007) Ultrastructural and immunocharacterization of undifferentiated myocardial cells in the developing mouse heart. J. Cell. Mol. Med.
11, 552–60.
18. Mona Elsafadi, S. A., and Ali Alrwili, M. M. (2013) Ultrastructure of Three Mouse Embryonic Stem Cell Lines: A Comparative Study. J. Stem Cell Res. Ther. 03.
19. Baker, N., and Tuan, R. S. (2013) The less-often-traveled surface of stem cells: caveolin-1 and caveolae in stem cells, tissue repair and regeneration. Stem Cell Res. Ther. 4,
90.
20. Burattini, S., Ferri, P., Battistelli, M., Curci, R., Luchetti, F., and Falcieri, E. (2004) C2 C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional
characterization. Eur. J. Histochem., 223–233.
21. Schultheiss, T., Lin, Z., and Ishikawa, H. (1991) Desmin/vimentin intermediate filaments are dispensable for many aspects of myogenesis. J. cell … 114, 953–966.
22. Musa, H., Orton, C., Morrison, E., and Peckham, M. (2003) Microtubule assembly in cultured myoblasts and myotubes following nocodazole induced microtubule
depolymerisation. J. Muscle Res. … 24, 301–308
Referinte Tabel 4
[1]. P. Seale, L. A. Sabourin, A. Girgis-Gabardo et al., “Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells,” Cell, vol. 102, no. 6, pp. 777-786, 2000.
[2]. M. Buckingham, L. Bajard, T. Chang et al., “The formation of skeletal muscle: from somite to limb,” J Anat, vol. 202, no. 1, pp. 59-68, 2003.
[3]. D. D. Cornelison, and B. J. Wold, “Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells,” Dev Biol, vol. 191, no.
2, pp. 270-283, 1997.
[4]. R. Meech, K. N. Gonzalez, M. Barro et al., “Barx2 is expressed in satellite cells and is required for normal muscle growth and regeneration,” Stem Cells, vol. 30, no. 2, pp.
253-265, 2012.
[5] A. Irintchev, M. Zeschnigk, A. Starzinski-Powitz, and A. Wernig, “Expression pattern of M-cadherin in normal, denervated, and regenerating mouse muscles,” Dev Dyn, vol.
199, no. 4, pp. 326-337, 1994.
[6] M. Z. Ratajczak, M. Majka, M. Kucia et al., “Expression of functional CXCR4 by muscle satellite cells and secretion of SDF-1 by muscle-derived fibroblasts is associated
with the presence of both muscle progenitors in bone marrow and hematopoietic stem/progenitor cells in muscles,” Stem Cells, vol. 21, no. 3, pp. 363-371, 2003.
[7] R. E. Allen, S. M. Sheehan, R. G. Taylor, T. L. Kendall, and G. M. Rice, “Hepatocyte growth factor activates quiescent skeletal muscle satellite cells in vitro,” J Cell
Physiol, vol. 165, no. 2, pp. 307-312, 1995.
[8] J. R. Beauchamp, L. Heslop, D. S. Yu et al., “Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells,” J Cell Biol, vol. 151, no.
6, pp. 1221-1234, 2000.
[9] L. A. Alfaro, S. A. Dick, A. L. Siegel et al., “CD34 promotes satellite cell motility and entry into proliferation to facilitate efficient skeletal muscle regeneration,” Stem Cells,
vol. 29, no. 12, pp. 2030-2041, 2011.
[10] E. Colombo, S. Romaggi, E. Medico et al., “Human neurotrophin receptor p75NTR defines differentiation-oriented skeletal muscle precursor cells: implications for muscle
regeneration,” J Neuropathol Exp Neurol, vol. 70, no. 2, pp. 133-142, 2011.
[11] R. Abou-Khalil, R. Mounier, and B. Chazaud, “Regulation of myogenic stem cell behavior by vessel cells: the "menage a trois" of satellite cells, periendothelial cells and
endothelial cells,” Cell Cycle, vol. 9, no. 5, pp. 892-896, 2010.
[12] D. J. Burkin, and S. J. Kaufman, “The alpha7beta1 integrin in muscle development and disease,” Cell Tissue Res, vol. 296, no. 1, pp. 183-190, 1999.
[13] V. F. Gnocchi, R. B. White, Y. Ono, J. A. Ellis, and P. S. Zammit, “Further characterisation of the molecular signature of quiescent and activated mouse muscle satellite
cells,” PLoS One, vol. 4, no. 4, pp. e5205, 2009.
[14] D. D. Cornelison, M. S. Filla, H. M. Stanley, A. C. Rapraeger, and B. B. Olwin, “Syndecan-3 and syndecan-4 specifically mark skeletal muscle satellite cells and are
implicated in satellite cell maintenance and muscle regeneration,” Dev Biol, vol. 239, no. 1, pp. 79-94, 2001.
[15] C. Christov, F. Chretien, R. Abou-Khalil et al., “Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners,” Mol Biol Cell, vol. 18, no. 4, pp. 1397-
1409, 2007.
[16] H. Lu, D. Huang, N. Saederup et al., “Macrophages recruited via CCR2 produce insulin-like growth factor-1 to repair acute skeletal muscle injury,” FASEB J, vol. 25, no. 1,
pp. 358-369, 2011.
[17] R. W. Ten Broek, S. Grefte, and J. W. Von den Hoff, “Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration,” J Cell Physiol, vol. 224, no. 1, pp.
7-16, 2010.
[18] S. Fukada, S. Higuchi, M. Segawa et al., “Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel
monoclonal antibody,” Exp Cell Res, vol. 296, no. 2, pp. 245-255, 2004.
[19] K. J. Mitchell, A. Pannerec, B. Cadot et al., “Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development,” Nat Cell
Biol, vol. 12, no. 3, pp. 257-266, 2010.
[20] J. E. Anderson, “The satellite cell as a companion in skeletal muscle plasticity: currency, conveyance, clue, connector and colander,” J Exp Biol, vol. 209, no. Pt 12, pp.
2276-2292, 2006.
[21] I. M. Conboy, and T. A. Rando, “The regulation of Notch signaling controls satellite cell activation and cell fate determination in postnatal myogenesis,” Dev Cell, vol. 3, no.
3, pp. 397-409, 2002.
[22] M. Cerletti, S. Jurga, C. A. Witczak et al., “Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles,” Cell, vol. 134, no. 1, pp. 37-47,
2008.
[23] T. L. Jesse, R. LaChance, M. F. Iademarco, and D. C. Dean, “Interferon regulatory factor-2 is a transcriptional activator in muscle where It regulates expression of vascular
cell adhesion molecule-1,” J Cell Biol, vol. 140, no. 5, pp. 1265-1276, 1998.
[24] E. Gussoni, Y. Soneoka, C. D. Strickland et al., “Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation,” Nature, vol. 401, no. 6751, pp. 390-394,
1999.
[25] A. Asakura, P. Seale, A. Girgis-Gabardo, and M. A. Rudnicki, “Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle,” J Cell Biol, vol. 159, no. 1, pp. 123-134,
2002.
38
[26] V. Moresi, A. Pristera, B. M. Scicchitano et al., “Tumor necrosis factor-alpha inhibition of skeletal muscle regeneration is mediated by a caspase-dependent stem cell
response,” Stem Cells, vol. 26, no. 4, pp. 997-1008, 2008.
[27] A. Pannerec, L. Formicola, V. Besson, G. Marazzi, and D. A. Sassoon, “Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials,” Development, vol. 140,
no. 14, pp. 2879-2891, 2013.
[28] X. Mu, G. Xiang, C. R. Rathbone et al., “Slow-adhering stem cells derived from injured skeletal muscle have improved regenerative capacity,” Am J Pathol, vol. 179, no. 2,
pp. 931-941, 2011.
[29] T. Tamaki, A. Akatsuka, K. Ando et al., “Identification of myogenic-endothelial progenitor cells in the interstitial spaces of skeletal muscle,” J Cell Biol, vol. 157, no. 4, pp.
571-577, 2002.
[30] B. G. Galvez, M. Sampaolesi, S. Brunelli et al., “Complete repair of dystrophic skeletal muscle by mesoangioblasts with enhanced migration ability,” J Cell Biol, vol. 174,
no. 2, pp. 231-243, 2006.
[31] M. Sampaolesi, S. Blot, G. D'Antona et al., “Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs,” Nature, vol. 444, no. 7119, pp. 574-579, 2006.
[32] K. Lolmede, L. Campana, M. Vezzoli et al., “Inflammatory and alternatively activated human macrophages attract vessel-associated stem cells, relying on separate HMGB1-
and MMP-9-dependent pathways,” J Leukoc Biol, vol. 85, no. 5, pp. 779-787, 2009.
[33] D. Galli, A. Innocenzi, L. Staszewsky et al., “Mesoangioblasts, vessel-associated multipotent stem cells, repair the infarcted heart by multiple cellular mechanisms: a
comparison with bone marrow progenitors, fibroblasts, and endothelial cells,” Arterioscler Thromb Vasc Biol, vol. 25, no. 4, pp. 692-697, 2005.
[34] B. Zheng, B. Cao, M. Crisan et al., “Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle,” Nat Biotechnol, vol. 25, no. 9, pp. 1025-1034, 2007.
[35] C. W. Chen, M. Corselli, B. Peault, and J. Huard, “Human blood-vessel-derived stem cells for tissue repair and regeneration,” J Biomed Biotechnol, vol. 2012, pp. 597439,
2012.
[36] A. Armulik, A. Abramsson, and C. Betsholtz, “Endothelial/pericyte interactions,” Circ Res, vol. 97, no. 6, pp. 512-523, 2005.
[37] R. G. Bagley, W. Weber, C. Rouleau, and B. A. Teicher, “Pericytes and endothelial precursor cells: cellular interactions and contributions to malignancy,” Cancer Res, vol.
65, no. 21, pp. 9741-9750, 2005.
[38] A. Dellavalle, M. Sampaolesi, R. Tonlorenzi et al., “Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells,” Nat Cell Biol, vol. 9, no. 3, pp.
255-267, 2007.
[39] M. J. Doyle, S. Zhou, K. K. Tanaka et al., “Abcg2 labels multiple cell types in skeletal muscle and participates in muscle regeneration,” J Cell Biol, vol. 195, no. 1, pp. 147-
163, 2011.
[40] M. Crisan, S. Yap, L. Casteilla et al., “A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs,” Cell Stem Cell, vol. 3, no. 3, pp. 301-313, 2008.
[41] A. Dellavalle, G. Maroli, D. Covarello et al., “Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells,” Nat Commun, vol. 2,
pp. 499, 2011.
[42] D. O. Traktuev, S. Merfeld-Clauss, J. Li et al., “A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in
a periendothelial location, and stabilize endothelial networks,” Circ Res, vol. 102, no. 1, pp. 77-85, 2008.
[43] D. Sun, C. O. Martinez, O. Ochoa et al., “Bone marrow-derived cell regulation of skeletal muscle regeneration,” FASEB J, vol. 23, no. 2, pp. 382-395, 2009.
[44] M. Corselli, C. W. Chen, B. Sun et al., “The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells,” Stem Cells Dev, vol. 21, no. 8, pp. 1299-
1308, 2012.
[45] M. W. Majesky, X. R. Dong, V. Hoglund, G. Daum, and W. M. Mahoney, Jr., “The adventitia: a progenitor cell niche for the vessel wall,” Cells Tissues Organs, vol. 195,
no. 1-2, pp. 73-81, 2012.
[46] Y. Torrente, M. Belicchi, M. Sampaolesi et al., “Human circulating AC133(+) stem cells restore dystrophin expression and ameliorate function in dystrophic skeletal
muscle,” J Clin Invest, vol. 114, no. 2, pp. 182-195, 2004.
[47] E. Zengin, F. Chalajour, U. M. Gehling et al., “Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis,” Development, vol. 133, no. 8, pp. 1543-1551,
2006.
[48] S. E. Duff, C. Li, J. M. Garland, and S. Kumar, “CD105 is important for angiogenesis: evidence and potential applications,” FASEB J, vol. 17, no. 9, pp. 984-992, 2003.
[49] A. Schrage, C. Loddenkemper, U. Erben et al., “Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1,” Histochem
Cell Biol, vol. 129, no. 4, pp. 441-451, 2008.
[50] R. A. Collins, and M. D. Grounds, “The role of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) in skeletal muscle regeneration. Studies in TNF-alpha(-/-) and TNF-alpha(-/-)/LT-
alpha(-/-) mice,” J Histochem Cytochem, vol. 49, no. 8, pp. 989-1001, 2001.
[51] O. Ochoa, D. Sun, S. M. Reyes-Reyna et al., “Delayed angiogenesis and VEGF production in CCR2-/- mice during impaired skeletal muscle regeneration,” Am J Physiol
Regul Integr Comp Physiol, vol. 293, no. 2, pp. R651-661, 2007.
[52] S. L. Deshmane, S. Kremlev, S. Amini, and B. E. Sawaya, “Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1): an overview,” J Interferon Cytokine Res, vol. 29, no. 6, pp. 313-
326, 2009.
[53] S. S. Rensen, P. A. Doevendans, and G. J. van Eys, “Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity,” Neth Heart J, vol. 15, no. 3, pp.
100-108, 2007.
[54] C. O. Martinez, M. J. McHale, J. T. Wells et al., “Regulation of skeletal muscle regeneration by CCR2-activating chemokines is directly related to macrophage recruitment,”
Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, vol. 299, no. 3, pp. R832-842, 2010.
[55] J. K. Daniloff, G. Levi, M. Grumet, F. Rieger, and G. M. Edelman, “Altered expression of neuronal cell adhesion molecules induced by nerve injury and repair,” J Cell Biol,
vol. 103, no. 3, pp. 929-945, 1986.
[56] D. Cizkova, T. Soukup, and J. Mokry, “Nestin expression reflects formation, revascularization and reinnervation of new myofibers in regenerating rat hind limb skeletal
muscles,” Cells Tissues Organs, vol. 189, no. 5, pp. 338-347, 2009.
[57] E. Perentes, Y. Nakagawa, G. W. Ross, C. Stanton, and L. J. Rubinstein, “Expression of epithelial membrane antigen in perineurial cells and their derivatives. An
immunohistochemical study with multiple markers,” Acta Neuropathol, vol. 75, no. 2, pp. 160-165, 1987.
[58] Y. G. Chen, and T. M. Brushart, “The effect of denervated muscle and Schwann cells on axon collateral sprouting,” J Hand Surg Am, vol. 23, no. 6, pp. 1025-1033, 1998.
[59] C. Webber, and D. Zochodne, “The nerve regenerative microenvironment: early behavior and partnership of axons and Schwann cells,” Exp Neurol, vol. 223, no. 1, pp. 51-
59, 2010.
[60] J. A. Blake, and M. R. Ziman, “The characterisation of Pax3 expressant cells in adult peripheral nerve,” PLoS One, vol. 8, no. 3, pp. e59184, 2013.
[61] K. Kami, Y. Morikawa, M. Sekimoto, and E. Senba, “Gene expression of receptors for IL-6, LIF, and CNTF in regenerating skeletal muscles,” J Histochem Cytochem, vol.
48, no. 9, pp. 1203-1213, 2000.
[62] M. Yamamoto, N. Okui, M. Tatebe, T. Shinohara, and H. Hirata, “Regeneration of the perineurium after microsurgical resection examined with immunolabeling for
tenascin-C and alpha smooth muscle actin,” J Anat, vol. 218, no. 4, pp. 413-425, 2011.
[63] S. Pina-Oviedo, and C. Ortiz-Hidalgo, “The normal and neoplastic perineurium: a review,” Adv Anat Pathol, vol. 15, no. 3, pp. 147-164, 2008.
[64] T. Goodpaster, A. Legesse-Miller, M. R. Hameed et al., “An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue,” J
Histochem Cytochem, vol. 56, no. 4, pp. 347-358, 2008.
[65] E. Alt, Y. Yan, S. Gehmert et al., “Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential,” Biol Cell, vol.
103, no. 4, pp. 197-208, 2011.
[66] A. W. Joe, L. Yi, A. Natarajan et al., “Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis,” Nat Cell Biol, vol. 12, no. 2, pp. 153-163,
2010.
[67] F. Strutz, H. Okada, C. W. Lo et al., “Identification and characterization of a fibroblast marker: FSP1,” J Cell Biol, vol. 130, no. 2, pp. 393-405, 1995.
[68] A. S. Brack, M. J. Conboy, S. Roy et al., “Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis,” Science, vol. 317, no. 5839, pp. 807-810,
2007.
[69] S. J. Mathew, J. M. Hansen, A. J. Merrell et al., “Connective tissue fibroblasts and Tcf4 regulate myogenesis,” Development, vol. 138, no. 2, pp. 371-384, 2011.
[70] M. M. Murphy, J. A. Lawson, S. J. Mathew, D. A. Hutcheson, and G. Kardon, “Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle
regeneration,” Development, vol. 138, no. 17, pp. 3625-3637, 2011.
[71] A. Uezumi, S. Fukada, N. Yamamoto, S. Takeda, and K. Tsuchida, “Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal
muscle,” Nat Cell Biol, vol. 12, no. 2, pp. 143-152, 2010.
[72] K. K. Long, M. Montano, and G. K. Pavlath, “Sca-1 is negatively regulated by TGF-beta1 in myogenic cells,” FASEB J, vol. 25, no. 4, pp. 1156-1165, 2011.
[73] M. N. Wosczyna, A. A. Biswas, C. A. Cogswell, and D. J. Goldhamer, “Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent
osteogenic activity and mediate heterotopic ossification,” J Bone Miner Res, vol. 27, no. 5, pp. 1004-1017, 2012.
[74] L. M. Popescu, E. Manole, C. S. Serboiu et al., “Identification of telocytes in skeletal muscle interstitium: implication for muscle regeneration,” J Cell Mol Med, vol. 15, no.
6, pp. 1379-1392, 2011.
[75] L. C. Suciu, B. O. Popescu, S. Kostin, and L. M. Popescu, “Platelet-derived growth factor receptor-beta-positive telocytes in skeletal muscle interstitium,” J Cell Mol Med,
vol. 16, no. 4, pp. 701-707, 2012.
[76] C. Sonnet, P. Lafuste, L. Arnold et al., “Human macrophages rescue myoblasts and myotubes from apoptosis through a set of adhesion molecular systems,” J Cell Sci, vol.
119, no. Pt 12, pp. 2497-2507, 2006.
[77] E. Duchesne, M. H. Tremblay, and C. H. Cote, “Mast cell tryptase stimulates myoblast proliferation; a mechanism relying on protease-activated receptor-2 and
cyclooxygenase-2,” BMC Musculoskelet Disord, vol. 12, pp. 235, 2011.
39
[78] E. Duchesne, P. Bouchard, M. P. Roussel, and C. H. Cote, “Mast cells can regulate skeletal muscle cell proliferation by multiple mechanisms,” Muscle Nerve, vol. 48, no. 3,
pp. 403-414, 2013.
[79] Y. Kharraz, J. Guerra, C. J. Mann, A. L. Serrano, and P. Munoz-Canoves, “Macrophage plasticity and the role of inflammation in skeletal muscle repair,” Mediators
Inflamm, vol. 2013, pp. 491497, 2013.
[80] G. L. Warren, L. O'Farrell, M. Summan et al., “Role of CC chemokines in skeletal muscle functional restoration after injury,” Am J Physiol Cell Physiol, vol. 286, no. 5, pp.
C1031-1036, 2004.
[81] H. X. Nguyen, A. J. Lusis, and J. G. Tidball, “Null mutation of myeloperoxidase in mice prevents mechanical activation of neutrophil lysis of muscle cell membranes in vitro
and in vivo,” J Physiol, vol. 565, no. Pt 2, pp. 403-413, 2005.
[82] L. Yahiaoui, D. Gvozdic, G. Danialou, M. Mack, and B. J. Petrof, “CC family chemokines directly regulate myoblast responses to skeletal muscle injury,” J Physiol, vol.
586, no. 16, pp. 3991-4004, 2008.
[83] S. B. Charge, and M. A. Rudnicki, “Cellular and molecular regulation of muscle regeneration,” Physiol Rev, vol. 84, no. 1, pp. 209-238, 2004.
[84] P. S. Zammit, J. P. Golding, Y. Nagata et al., “Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal?,” J Cell Biol, vol. 166, no. 3, pp. 347-357, 2004.
[85] J. G. V. Tidball, S.A., “Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration,” Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, vol. 298, pp.
R1173-R1187, 2010.
[86] F. Le Grand, and M. A. Rudnicki, “Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis,” Curr Opin Cell Biol, vol. 19, no. 6, pp. 628-633, 2007.
[87] R. De Mori, S. Straino, A. Di Carlo et al., “Multiple effects of high mobility group box protein 1 in skeletal muscle regeneration,” Arterioscler Thromb Vasc Biol, vol. 27,
no. 11, pp. 2377-2383, 2007.
[88] Y. P. Li, “TNF-alpha is a mitogen in skeletal muscle,” Am J Physiol Cell Physiol, vol. 285, no. 2, pp. C370-376, 2003.
Bibliografie
Hoier B, Nordsborg N, Andersen S, et al. (2012) Pro- and anti-angiogenic factors in human skeletal muscle in response to acute exercise and training. J Physiol 590:595–606. doi:
10.1113/jphysiol.2011.216135
Mann CJ, Perdiguero E, Kharraz Y, et al. (2011) Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle 1:21. doi: 10.1186/2044-5040-1-21
Senger DR, Davis GE (2011) Donald R. Senger 1 and George E. Davis 2 1. 1–19.
Abou-Khalil, R., R. Mounier and B. Chazaud (2010). "Regulation of myogenic stem cell behavior by vessel cells: the "menage a trois" of satellite cells, periendothelial cells and
endothelial cells." Cell Cycle 9(5): 892-896.
Alfaro, L. A., S. A. Dick, A. L. Siegel, A. S. Anonuevo, K. M. McNagny, L. A. Megeney, D. D. Cornelison and F. M. Rossi (2011). "CD34 promotes satellite cell motility and entry into
proliferation to facilitate efficient skeletal muscle regeneration." Stem Cells 29(12): 2030-2041.
Allen, R. E., S. M. Sheehan, R. G. Taylor, T. L. Kendall and G. M. Rice (1995). "Hepatocyte growth factor activates quiescent skeletal muscle satellite cells in vitro." J Cell Physiol
165(2): 307-312.
Alt, E., Y. Yan, S. Gehmert, Y. H. Song, A. Altman, S. Gehmert, D. Vykoukal and X. Bai (2011). "Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their
differentiation and colony-forming potential." Biol Cell 103(4): 197-208.
Armulik, A., A. Abramsson and C. Betsholtz (2005). "Endothelial/pericyte interactions." Circ Res 97(6): 512-523.
Asakura, A., P. Seale, A. Girgis-Gabardo and M. A. Rudnicki (2002). "Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle." J Cell Biol 159(1): 123-134.
Bagley, R. G., W. Weber, C. Rouleau and B. A. Teicher (2005). "Pericytes and endothelial precursor cells: cellular interactions and contributions to malignancy." Cancer Res 65(21):
9741-9750.
Barth, P. J. and C. C. Westhoff (2007). "CD34+ fibrocytes: morphology, histogenesis and function." Curr Stem Cell Res Ther 2(3): 221-227.
Bolton, T. B., D. V. Gordienko, O. V. Povstyan, M. I. Harhun and V. Pucovsky (2004). "Smooth muscle cells and interstitial cells of blood vessels." Cell Calcium 35(6): 643-657.
Buckingham, M., L. Bajard, T. Chang, P. Daubas, J. Hadchouel, S. Meilhac, D. Montarras, D. Rocancourt and F. Relaix (2003). "The formation of skeletal muscle: from somite to limb."
J Anat 202(1): 59-68.
Burkin, D. J. and S. J. Kaufman (1999). "The alpha7beta1 integrin in muscle development and disease." Cell Tissue Res 296(1): 183-190.
Camelliti, P., T. K. Borg and P. Kohl (2005). "Structural and functional characterisation of cardiac fibroblasts." Cardiovasc Res 65(1): 40-51.
Caruso, R. A., F. Fedele, G. Finocchiaro, G. Pizzi, M. Nunnari, G. Gitto, V. Fabiano, A. Parisi and A. Venuti (2009). "Ultrastructural descriptions of pericyte/endothelium peg-socket
interdigitations in the microvasculature of human gastric carcinomas." Anticancer Res 29(1): 449-453.
Challier, J. C., M. Galtier, A. Kacemi and D. Guillaumin (1999). "Pericytes of term human foeto-placental microvessels: ultrastructure and visualization." Cell Mol Biol (Noisy-le-grand)
45(1): 89-100.
Chambers, R. C., P. Leoni, N. Kaminski, G. J. Laurent and R. A. Heller (2003). "Global expression profiling of fibroblast responses to transforming growth factor-beta1 reveals the
induction of inhibitor of differentiation-1 and provides evidence of smooth muscle cell phenotypic switching." Am J Pathol 162(2): 533-546.
Charge, S. B. and M. A. Rudnicki (2004). "Cellular and molecular regulation of muscle regeneration." Physiol Rev 84(1): 209-238.
Chazaud, B., C. Sonnet, P. Lafuste, G. Bassez, A. C. Rimaniol, F. Poron, F. J. Authier, P. A. Dreyfus and R. K. Gherardi (2003). "Satellite cells attract monocytes and use macrophages as
a support to escape apoptosis and enhance muscle growth." J Cell Biol 163(5): 1133-1143.
Chen, C. W., M. Corselli, B. Peault and J. Huard (2012). "Human blood-vessel-derived stem cells for tissue repair and regeneration." J Biomed Biotechnol 2012: 597439.
40
Cheng, W., V. C. Lui, Q. M. Chen and P. K. Tam (2001). "Enteric nervous system, interstitial cells of cajal, and smooth muscle vacuolization in segmental dilatation of jejunum." J
Pediatr Surg 36(6): 930-935.
Chintalgattu, V., D. M. Nair and L. C. Katwa (2003). "Cardiac myofibroblasts: a novel source of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors Flt-1 and KDR." J Mol Cell
Cardiol 35(3): 277-286.
Christov, C., F. Chretien, R. Abou-Khalil, G. Bassez, G. Vallet, F. J. Authier, Y. Bassaglia, V. Shinin, S. Tajbakhsh, B. Chazaud and R. K. Gherardi (2007). "Muscle satellite cells and
endothelial cells: close neighbors and privileged partners." Mol Biol Cell 18(4): 1397-1409.
Collins, R. A. and M. D. Grounds (2001). "The role of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) in skeletal muscle regeneration. Studies in TNF-alpha(-/-) and TNF-alpha(-/-)/LT-alpha(-
/-) mice." J Histochem Cytochem 49(8): 989-1001.
Colombo, E., S. Romaggi, E. Medico, R. Menon, M. Mora, C. Falcone, H. Lochmuller, P. Confalonieri, R. Mantegazza, L. Morandi and C. Farina (2011). "Human neurotrophin receptor
p75NTR defines differentiation-oriented skeletal muscle precursor cells: implications for muscle regeneration." J Neuropathol Exp Neurol 70(2): 133-142.
Cornelison, D. D., M. S. Filla, H. M. Stanley, A. C. Rapraeger and B. B. Olwin (2001). "Syndecan-3 and syndecan-4 specifically mark skeletal muscle satellite cells and are implicated in
satellite cell maintenance and muscle regeneration." Dev Biol 239(1): 79-94.
Cornelison, D. D. and B. J. Wold (1997). "Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells." Dev Biol 191(2): 270-283.
Corselli, M., C. W. Chen, B. Sun, S. Yap, J. P. Rubin and B. Peault (2012). "The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells." Stem Cells Dev
21(8): 1299-1308.
Crisan, M., S. Yap, L. Casteilla, C. W. Chen, M. Corselli, T. S. Park, G. Andriolo, B. Sun, B. Zheng, L. Zhang, C. Norotte, P. N. Teng, J. Traas, R. Schugar, B. M. Deasy, S. Badylak, H.
J. Buhring, J. P. Giacobino, L. Lazzari, J. Huard and B. Peault (2008). "A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs." Cell Stem Cell 3(3): 301-
313.
Crosby, J. R., R. A. Seifert, P. Soriano and D. F. Bowen-Pope (1998). "Chimaeric analysis reveals role of Pdgf receptors in all muscle lineages." Nat Genet 18(4): 385-388.
Dellavalle, A., G. Maroli, D. Covarello, E. Azzoni, A. Innocenzi, L. Perani, S. Antonini, R. Sambasivan, S. Brunelli, S. Tajbakhsh and G. Cossu (2011). "Pericytes resident in postnatal
skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells." Nat Commun 2: 499.
Dellavalle, A., M. Sampaolesi, R. Tonlorenzi, E. Tagliafico, B. Sacchetti, L. Perani, A. Innocenzi, B. G. Galvez, G. Messina, R. Morosetti, S. Li, M. Belicchi, G. Peretti, J. S.
Chamberlain, W. E. Wright, Y. Torrente, S. Ferrari, P. Bianco and G. Cossu (2007). "Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells."
Nat Cell Biol 9(3): 255-267.
Deshmane, S. L., S. Kremlev, S. Amini and B. E. Sawaya (2009). "Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1): an overview." J Interferon Cytokine Res 29(6): 313-326.
Doyle, M. J., S. Zhou, K. K. Tanaka, A. Pisconti, N. H. Farina, B. P. Sorrentino and B. B. Olwin (2011). "Abcg2 labels multiple cell types in skeletal muscle and participates in muscle
regeneration." J Cell Biol 195(1): 147-163.
Duchesne, E., P. Bouchard, M. P. Roussel and C. H. Cote (2013). "Mast cells can regulate skeletal muscle cell proliferation by multiple mechanisms." Muscle Nerve 48(3): 403-414.
Duchesne, E., M. H. Tremblay and C. H. Cote (2011). "Mast cell tryptase stimulates myoblast proliferation; a mechanism relying on protease-activated receptor-2 and cyclooxygenase-2."
BMC Musculoskelet Disord 12: 235.
Duff, S. E., C. Li, J. M. Garland and S. Kumar (2003). "CD105 is important for angiogenesis: evidence and potential applications." FASEB J 17(9): 984-992.
Eyden, B. (2008). "The myofibroblast: phenotypic characterization as a prerequisite to understanding its functions in translational medicine." J Cell Mol Med 12(1): 22-37.
Faussone-Pellegrini, M. S., D. Pantalone and C. Cortesini (1990). "Smooth muscle cells, interstitial cells of Cajal and myenteric plexus interrelationships in the human colon." Acta Anat
(Basel) 139(1): 31-44.
Fukada, S., S. Higuchi, M. Segawa, K. Koda, Y. Yamamoto, K. Tsujikawa, Y. Kohama, A. Uezumi, M. Imamura, Y. Miyagoe-Suzuki, S. Takeda and H. Yamamoto (2004). "Purification
and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody." Exp Cell Res 296(2): 245-255.
Galli, D., A. Innocenzi, L. Staszewsky, L. Zanetta, M. Sampaolesi, A. Bai, E. Martinoli, E. Carlo, G. Balconi, F. Fiordaliso, S. Chimenti, G. Cusella, E. Dejana, G. Cossu and R. Latini
(2005). "Mesoangioblasts, vessel-associated multipotent stem cells, repair the infarcted heart by multiple cellular mechanisms: a comparison with bone marrow progenitors,
fibroblasts, and endothelial cells." Arterioscler Thromb Vasc Biol 25(4): 692-697.
Galvez, B. G., M. Sampaolesi, S. Brunelli, D. Covarello, M. Gavina, B. Rossi, G. Constantin, Y. Torrente and G. Cossu (2006). "Complete repair of dystrophic skeletal muscle by
mesoangioblasts with enhanced migration ability." J Cell Biol 174(2): 231-243.
Gnocchi, V. F., R. B. White, Y. Ono, J. A. Ellis and P. S. Zammit (2009). "Further characterisation of the molecular signature of quiescent and activated mouse muscle satellite cells."
PLoS One 4(4): e5205.
Goldsmith, E. C., A. Hoffman, M. O. Morales, J. D. Potts, R. L. Price, A. McFadden, M. Rice and T. K. Borg (2004). "Organization of fibroblasts in the heart." Dev Dyn 230(4): 787-
794.
Goodpaster, T., A. Legesse-Miller, M. R. Hameed, S. C. Aisner, J. Randolph-Habecker and H. A. Coller (2008). "An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in
formalin-fixed, paraffin-embedded tissue." J Histochem Cytochem 56(4): 347-358.
Gopinath, S. D. and T. A. Rando (2008). "Stem cell review series: aging of the skeletal muscle stem cell niche." Aging Cell 7(4): 590-598.
41
Göritz C, D. D., Tomilin N, Barbacid M, Shupliakov O, Frisén J (2011). "A Pericyte Origin of Spinal Cord Scar Tissue." Science 333: 238-242.
Gussoni, E., Y. Soneoka, C. D. Strickland, E. A. Buzney, M. K. Khan, A. F. Flint, L. M. Kunkel and R. C. Mulligan (1999). "Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem
cell transplantation." Nature 401(6751): 390-394.
Hirschi, K. K., S. A. Rohovsky and P. A. D'Amore (1998). "PDGF, TGF-beta, and heterotypic cell-cell interactions mediate endothelial cell-induced recruitment of 10T1/2 cells and their
differentiation to a smooth muscle fate." J Cell Biol 141(3): 805-814.
Huizinga, J. D. and M. S. Faussone-Pellegrini (2005). "About the presence of interstitial cells of Cajal outside the musculature of the gastrointestinal tract." J Cell Mol Med 9(2): 468-473.
Irintchev, A., M. Zeschnigk, A. Starzinski-Powitz and A. Wernig (1994). "Expression pattern of M-cadherin in normal, denervated, and regenerating mouse muscles." Dev Dyn 199(4):
326-337.
Jain, R. K. (2003). "Molecular regulation of vessel maturation." Nat Med 9(6): 685-693.
Jarvinen, T. A., T. L. Jarvinen, M. Kaariainen, H. Kalimo and M. Jarvinen (2005). "Muscle injuries: biology and treatment." Am J Sports Med 33(5): 745-764.
Jessen, H. and L. Thuneberg (1991). "Interstitial cells of Cajal and Auerbach's plexus. A scanning electron microscopical study of guinea-pig small intestine." J Submicrosc Cytol Pathol
23(2): 195-212.
Junquera, C., C. Martinez-Ciriano, T. Castiella, P. Serrano, M. J. Azanza and S. R. Junquera (2007). "Immunohistochemical and ultrastructural characteristics of interstitial cells of Cajal
in the rabbit duodenum. Presence of a single cilium." J Cell Mol Med 11(4): 776-787.
Kami, K., Y. Morikawa, M. Sekimoto and E. Senba (2000). "Gene expression of receptors for IL-6, LIF, and CNTF in regenerating skeletal muscles." J Histochem Cytochem 48(9):
1203-1213.
Kharraz, Y., J. Guerra, C. J. Mann, A. L. Serrano and P. Munoz-Canoves (2013). "Macrophage plasticity and the role of inflammation in skeletal muscle repair." Mediators Inflamm
2013: 491497.
Kim, S. S., R. Romero, J. S. Kim, A. Abbas, J. Espinoza, J. P. Kusanovic, S. Hassan, B. H. Yoon and C. J. Kim (2008). "Coexpression of myofibroblast and macrophage markers: novel
evidence for an in vivo plasticity of chorioamniotic mesodermal cells of the human placenta." Lab Invest 88(4): 365-374.
Kisselbach, L., M. Merges, A. Bossie and A. Boyd (2009). "CD90 Expression on human primary cells and elimination of contaminating fibroblasts from cell cultures." Cytotechnology
59(1): 31-44.
Kostin, S. and L. M. Popescu (2009). "A distinct type of cell in myocardium: interstitial Cajal-like cells (ICLCs)." J Cell Mol Med 13(2): 295-308.
Kuang, S., M. A. Gillespie and M. A. Rudnicki (2008). "Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation." Cell Stem Cell 2(1): 22-31.
Li, Y. P. (2003). "TNF-alpha is a mitogen in skeletal muscle." Am J Physiol Cell Physiol 285(2): C370-376.
Lolmede, K., L. Campana, M. Vezzoli, L. Bosurgi, R. Tonlorenzi, E. Clementi, M. E. Bianchi, G. Cossu, A. A. Manfredi, S. Brunelli and P. Rovere-Querini (2009). "Inflammatory and
alternatively activated human macrophages attract vessel-associated stem cells, relying on separate HMGB1- and MMP-9-dependent pathways." J Leukoc Biol 85(5): 779-787.
Long, K. K., M. Montano and G. K. Pavlath (2011). "Sca-1 is negatively regulated by TGF-beta1 in myogenic cells." FASEB J 25(4): 1156-1165.
Lu, H., D. Huang, N. Saederup, I. F. Charo, R. M. Ransohoff and L. Zhou (2011). "Macrophages recruited via CCR2 produce insulin-like growth factor-1 to repair acute skeletal muscle
injury." FASEB J 25(1): 358-369.
Majesky, M. W., X. R. Dong, V. Hoglund, G. Daum and W. M. Mahoney, Jr. (2012). "The adventitia: a progenitor cell niche for the vessel wall." Cells Tissues Organs 195(1-2): 73-81.
Manole, C. G., V. Cismasiu, M. Gherghiceanu and L. M. Popescu "Experimental acute myocardial infarction: telocytes involvement in neo-angiogenesis." J Cell Mol Med.
Martinez, C. O., M. J. McHale, J. T. Wells, O. Ochoa, J. E. Michalek, L. M. McManus and P. K. Shireman (2010). "Regulation of skeletal muscle regeneration by CCR2-activating
chemokines is directly related to macrophage recruitment." Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 299(3): R832-842.
Mathew, S. J., J. M. Hansen, A. J. Merrell, M. M. Murphy, J. A. Lawson, D. A. Hutcheson, M. S. Hansen, M. Angus-Hill and G. Kardon (2011). "Connective tissue fibroblasts and Tcf4
regulate myogenesis." Development 138(2): 371-384.
Meech, R., K. N. Gonzalez, M. Barro, A. Gromova, L. Zhuang, J. A. Hulin and H. P. Makarenkova (2012). "Barx2 is expressed in satellite cells and is required for normal muscle growth
and regeneration." Stem Cells 30(2): 253-265.
Mitchell, K. J., A. Pannerec, B. Cadot, A. Parlakian, V. Besson, E. R. Gomes, G. Marazzi and D. A. Sassoon (2010). "Identification and characterization of a non-satellite cell muscle
resident progenitor during postnatal development." Nat Cell Biol 12(3): 257-266.
Moresi, V., A. Pristera, B. M. Scicchitano, M. Molinaro, L. Teodori, D. Sassoon, S. Adamo and D. Coletti (2008). "Tumor necrosis factor-alpha inhibition of skeletal muscle regeneration
is mediated by a caspase-dependent stem cell response." Stem Cells 26(4): 997-1008.
Ochoa, O., D. Sun, S. M. Reyes-Reyna, L. L. Waite, J. E. Michalek, L. M. McManus and P. K. Shireman (2007). "Delayed angiogenesis and VEGF production in CCR2-/- mice during
impaired skeletal muscle regeneration." Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 293(2): R651-661.
42
Pannerec, A., L. Formicola, V. Besson, G. Marazzi and D. A. Sassoon (2013). "Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials." Development 140(14): 2879-
2891.
Popescu, L. M., M. Gherghiceanu, L. C. Suciu, C. G. Manole and M. E. Hinescu "Telocytes and putative stem cells in the lungs: electron microscopy, electron tomography and laser
scanning microscopy." Cell Tissue Res 345(3): 391-403.
Popescu, L. M., E. Manole, C. S. Serboiu, C. G. Manole, L. C. Suciu, M. Gherghiceanu and B. O. Popescu "Identification of telocytes in skeletal muscle interstitium: implication for
muscle regeneration." J Cell Mol Med 15(6): 1379-1392.
Popescu, L. M., E. Manole, C. S. Serboiu, C. G. Manole, L. C. Suciu, M. Gherghiceanu and B. O. Popescu (2011). "Identification of telocytes in skeletal muscle interstitium: implication
for muscle regeneration." J Cell Mol Med 15(6): 1379-1392.
Ratajczak, M. Z., M. Majka, M. Kucia, J. Drukala, Z. Pietrzkowski, S. Peiper and A. Janowska-Wieczorek (2003). "Expression of functional CXCR4 by muscle satellite cells and
secretion of SDF-1 by muscle-derived fibroblasts is associated with the presence of both muscle progenitors in bone marrow and hematopoietic stem/progenitor cells in muscles."
Stem Cells 21(3): 363-371.
Rensen, S. S., P. A. Doevendans and G. J. van Eys (2007). "Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity." Neth Heart J 15(3): 100-108.
Ryan, D. G., L. Taliana, L. Sun, Z. G. Wei, S. K. Masur and R. M. Lavker (2003). "Involvement of S100A4 in stromal fibroblasts of the regenerating cornea." Invest Ophthalmol Vis Sci
44(10): 4255-4262.
Sampaolesi, M., S. Blot, G. D'Antona, N. Granger, R. Tonlorenzi, A. Innocenzi, P. Mognol, J. L. Thibaud, B. G. Galvez, I. Barthelemy, L. Perani, S. Mantero, M. Guttinger, O.
Pansarasa, C. Rinaldi, M. G. Cusella De Angelis, Y. Torrente, C. Bordignon, R. Bottinelli and G. Cossu (2006). "Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in
dystrophic dogs." Nature 444(7119): 574-579.
Schrage, A., C. Loddenkemper, U. Erben, U. Lauer, G. Hausdorf, P. R. Jungblut, J. Johnson, P. A. Knolle, M. Zeitz, A. Hamann and K. Klugewitz (2008). "Murine CD146 is widely
expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1." Histochem Cell Biol 129(4): 441-451.
Seale, P., L. A. Sabourin, A. Girgis-Gabardo, A. Mansouri, P. Gruss and M. A. Rudnicki (2000). "Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells." Cell 102(6): 777-786.
Simons, M. and J. A. Ware (2003). "Therapeutic angiogenesis in cardiovascular disease." Nat Rev Drug Discov 2(11): 863-871.
Sonnet, C., P. Lafuste, L. Arnold, M. Brigitte, F. Poron, F. J. Authier, F. Chretien, R. K. Gherardi and B. Chazaud (2006). "Human macrophages rescue myoblasts and myotubes from
apoptosis through a set of adhesion molecular systems." J Cell Sci 119(Pt 12): 2497-2507.
Strakova, Z., M. Livak, M. Krezalek and I. Ihnatovych (2008). "Multipotent properties of myofibroblast cells derived from human placenta." Cell Tissue Res 332(3): 479-488.
Suciu, L., L. M. Popescu, M. Gherghiceanu, T. Regalia, M. I. Nicolescu, M. E. Hinescu and M. S. Faussone-Pellegrini "Telocytes in human term placenta: morphology and phenotype."
Cells Tissues Organs 192(5): 325-339.
Suciu, L. C., B. O. Popescu, S. Kostin and L. M. Popescu (2012). "Platelet-derived growth factor receptor-beta-positive telocytes in skeletal muscle interstitium." J Cell Mol Med 16(4):
701-707.
Sun, D., C. O. Martinez, O. Ochoa, L. Ruiz-Willhite, J. R. Bonilla, V. E. Centonze, L. L. Waite, J. E. Michalek, L. M. McManus and P. K. Shireman (2009). "Bone marrow-derived cell
regulation of skeletal muscle regeneration." FASEB J 23(2): 382-395.
Tamaki, T., A. Akatsuka, K. Ando, Y. Nakamura, H. Matsuzawa, T. Hotta, R. R. Roy and V. R. Edgerton (2002). "Identification of myogenic-endothelial progenitor cells in the
interstitial spaces of skeletal muscle." J Cell Biol 157(4): 571-577.
Ten Broek, R. W., S. Grefte and J. W. Von den Hoff (2010). "Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration." J Cell Physiol 224(1): 7-16.
Torrente, Y., M. Belicchi, M. Sampaolesi, F. Pisati, M. Meregalli, G. D'Antona, R. Tonlorenzi, L. Porretti, M. Gavina, K. Mamchaoui, M. A. Pellegrino, D. Furling, V. Mouly, G. S.
Butler-Browne, R. Bottinelli, G. Cossu and N. Bresolin (2004). "Human circulating AC133(+) stem cells restore dystrophin expression and ameliorate function in dystrophic
skeletal muscle." J Clin Invest 114(2): 182-195.
Toyota, E., D. C. Warltier, T. Brock, E. Ritman, C. Kolz, P. O'Malley, P. Rocic, M. Focardi and W. M. Chilian (2005). "Vascular endothelial growth factor is required for coronary
collateral growth in the rat." Circulation 112(14): 2108-2113.
Traktuev, D. O., S. Merfeld-Clauss, J. Li, M. Kolonin, W. Arap, R. Pasqualini, B. H. Johnstone and K. L. March (2008). "A population of multipotent CD34-positive adipose stromal
cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks." Circ Res 102(1): 77-85.
Uezumi, A., S. Fukada, N. Yamamoto, S. Takeda and K. Tsuchida (2010). "Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal
muscle." Nat Cell Biol 12(2): 143-152.
Uhal, B. D., C. Ramos, I. Joshi, A. Bifero, A. Pardo and M. Selman (1998). "Cell size, cell cycle, and alpha-smooth muscle actin expression by primary human lung fibroblasts." Am J
Physiol 275(5 Pt 1): L998-L1005.
von Tell, D., A. Armulik and C. Betsholtz (2006). "Pericytes and vascular stability." Exp Cell Res 312(5): 623-629.
Warren, G. L., L. O'Farrell, M. Summan, T. Hulderman, D. Mishra, M. I. Luster, W. A. Kuziel and P. P. Simeonova (2004). "Role of CC chemokines in skeletal muscle functional
restoration after injury." Am J Physiol Cell Physiol 286(5): C1031-1036.
43
Winkler, E. A., R. D. Bell and B. V. Zlokovic "Pericyte-specific expression of PDGF beta receptor in mouse models with normal and deficient PDGF beta receptor signaling." Mol
Neurodegener 5: 32.
Yahiaoui, L., D. Gvozdic, G. Danialou, M. Mack and B. J. Petrof (2008). "CC family chemokines directly regulate myoblast responses to skeletal muscle injury." J Physiol 586(16):
3991-4004.
Zhang, J., R. Cao, Y. Zhang, T. Jia, Y. Cao and E. Wahlberg (2009). "Differential roles of PDGFR-alpha and PDGFR-beta in angiogenesis and vessel stability." FASEB J 23(1): 153-163.
Zheng, B., B. Cao, M. Crisan, B. Sun, G. Li, A. Logar, S. Yap, J. B. Pollett, L. Drowley, T. Cassino, B. Gharaibeh, B. M. Deasy, J. Huard and B. Peault (2007). "Prospective
identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle." Nat Biotechnol 25(9): 1025-1034.
