Embed Size (px)
1
RAPORT STIINTIFIC FINAL
POS CCE
Axa prioritară 2: Competitivitate prin Cercetare, Dezvoltare Tehnologică şi Inovare
Operaţiunea: O.2.1.2 „Proiecte CD de înalt nivel ştiinţific la care vor participa specialişti din
străinătate”
Numărul de înregistrare din SMIS - CSNR: 692-12650
Contract de finanţare nr.: 211/20.07.2010
Acronimul Proiectului: GPN2
Numele proiectului: PROFILUL GENIC AL CANCERELOR BRONHO-PULMONARE PRIMITIVE
CU CELULE NON—MICI SI INVAZIA GANGLIONILOR MEDIASTINALI
Raport final
Perioada: 20 iulie 2010 – 19 mai 2014
Numele si titlul reprezentantului stiintific al proiectului:
Profesor Doctor Jean-François REGNARD, Director de Proiect
2
RAPORT STIINTIFIC
aferent Raport Final Proiect
CUPRINS Pagina
Introducere
A1. Generarea materialului biologic preterapeutic pentru investigatia genomica si activitati specifice bancii de tesuturi si organe
A2. Definirea loturilor de prognostic
A3. Prepararea esantioanelor pentru analiza genomica
A4. Analiza genica
A5. Analiza bioinformatică
A6. Validarea rezultatelor de microarray
A7. Secventierea pentru genele candidate
A8. Validarea tehnicilor de Tissue-Array pe limfoganglion in aprecierea prognosticului. Validarea tehnicilor de Tissue-Array in comparatie cu tehnicile de micro-array
Discutii
Concluzii
Bibliografie
Anexa 1 Aprobare Comisii de Etica si Protectie a Persoanelor din Franta si Austria. Autorizatie AFSSAPS – Agentia Franceza de Securitate Sanitara a Produselor de Sanatate. Asigrari Cecetare Biomedicala.
Anexa 2 Protocoale de lucru adaptate fiecarui centru
3
21
26
28
32
44
55
58
77
82
87
89
106
3
INTRODUCERE
Chimioterapia citotoxica standard este eficienta pentru anumite tipuri de cancer, dar pentru
multe alte tipuri, tratamente disponibile oferă doar un beneficiu de supravietuire limitat.
Cancerul pulmonar este un astfel de cancer. Dezvoltarea de terapii specifice este cea mai mare
promisiune pentru tratarea cu succes a aceastei boali, dar o abordare orientată depinde de
înțelegerea genomului celulelor tumorale. Secventierea exonunului unui număr mare de probe
tumorale de cancer pulmonar a oferit o primă imagine a profilului mutațiilor somatice a acestor
tumori. Astfel de studii de secventiere au confirmat frecventa mare de mutatii TP53 și KRAS în
cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori
cunoscute si neasociate anterior cu cancerul pulmonar, și au identificat mutatii oncogene ale
EGFR pe care s-a bazat prima terapie tintita pentru adenocarcinomul pulmonar. Si alte oncogene
candidate așteaptă validarea funcționala. Este de asteptat ca secventierea viitoare a întregului
exom și a intregului genom al cancerului pulmonar sa dezvăluie un peisaj mai detaliat al
mutațiilor somatice care pot fi exploatate în scopuri terapeutice.
Cancerul pulmonar este principala cauza de deces prin cancer în lume reprezentand aproximativ
1,2 milioane de decese in fiecare an [1]. La momentul diagnosticului, 30% dintre pacienti sunt
diagnosticati intr-un stadiu local avansat, pentru care strategia de tratament este încă
controversată și depinde starea patologica a ganglionilor limfatici. Rata de supravietuire globala la
5 ani a cancerului pulmonar este de numai 16%, în mare măsură determinată de frecvența mare a
diagnosticului tardiv, cu tumori nonrezecabile [1]. Cancerul pulmonar poate fi clasificat din punct
de vedere histologic, în 4 mari categorii: adenocarcinom pulmonar, carcinom cu celule
scuamoase, si carcinom cu celule mari, care formeaza cancerul pulmonar cu celule non-mici
(CPCNM), și carcinomul pulmonar cu celule mici [2].
Rata de supravietuire foarte redusa a cancerului pulmonar reflectă insuficiența chimioterapiei
citotoxice traditionale; tratamentele specifice orientate catre anumite puncte slabe ale celulelor
tumorale sunt cea mai importanta promisiune pentru viitor. Mutațiile somatice care activează
oncogene duc frecvent la dependența celulelor tumorale de produsele oncogenice modificate
[3,4] o proprietate exploatata de terapia tintita. Prin urmare, identificarea leziunilor oncogenice
4
recurente de care depinde supravietuirea celulei tumorale ar putea duce la noi terapii ale
cancerului pulmonar.
Un experiment pe scară largă de secventiere directa a exomului tumoral, Proiectul de Secventiere
Tumorala (TSP), a fost realizat cu scopul de a determina mutațiile somatice recurente în
adenocarcinomul pulmonar. În acest experiment, toți exonii codanti a 623 de gene cu rol in
oncogeneza, au fost secventiate în 188 de perechi de ADN tumori / tesut normal, ceea ce a dus la
identificarea de 1.013 mutații somatice nonsinonime [5]. Analiza statistică a indicat 26 de gene cu
mutatii semnificative.
Aceste 26 de gene cu mutatii semnificative au inclus mai multe oncogene și genele supresoare
deja cunoscute a fi implicate in cancerul pulmonary: KRAS, TP53, STK11, EGFR, și CDKN2A. In plus
au mai fost identificate cateva gene cu mutatii semnificative, neidentificate pana atunci in
adenocarcinomul pulmonar, inclusive cateva gene supresoare cunoscute si cateva gene ale tirozin
kinazei care sunt in curs de validare functionala.
Descriem aici cunostintele actuale in legatura cu genomul cancerului pulmonar, subliniind
implicatiile terapeutice.
Cunostintele viitoare rezultate din secventierea intregului exom si a intregului genom, facilitate
de tehnologii de secventiere de ultimă generație, va revoluționa probabil inca o data intelegerea
genomului acestei boli.
MUTATII GENICE CUNOSCUTE IN CANCERUL PULMONAR
Mutatii exclusive
Modificări somatice ale 7 oncogene in cancerul pulmonar [6]: KRAS, EGFR, ALK, ERBB2, BRAF
HER2 și ROS1 se exclud reciproc. Cinci dintre aceste gene (KRAS, EGFR, ALK, ERBB2, BRAF) sunt
regasite în mai mult de 50% din adenocarcinoamele pulmonare. De fapt, pacientii cu mutatii in
aceste cinci gene pot reprezenta până la 90% dintre pacientii asiatici care nu au fumat niciodata
[7]. Prin urmare, posibilitatea de a inhiba terapeutic functiile acestor gene modificate ar
reprezenta un progres semnificativ in lupta impotriva cancerului pulmonar.
5
KRAS
La om, au fost identificate trei gene RAS diferite: KRAS (omoloagă cu oncogena virusului lui
Kirsten al sarcomului șobolanului), HRAS (omoloagă cu oncogena virusului lui Harvey al
sarcomului șobolanului) și NRAS (inițial izolată de la un neuroblastom uman). Diferitele gene RAS
sunt foarte asemanatoare structural, dar distincte funcțional. Proteine RAS sunt GTPaze mici, care
trec de la forme inactive legate de guanozin difosfat (GDP) în forme active legate de trifosfat
guanozina (GTP). Proteine RAS sunt mediatori cheie în aval de receptorii factorilor de creștere și
sunt esentiale pentru proliferarea, supraviețuirea și diferențierea celulelor. RAS are capacitatea
de a activa caile de semnalizare in aval din celulă. Aceste cai includ calea PI3K - AKT - mTOR, care
este implicată în supraviețuirea celulară, si calea RAS - RAF - MEK - ERK, care este implicată în
proliferarea celulară.
RAS a fost implicat în patogeneza mai multor tipuri de cancer. Mutațiile activatoare ale genei RAS
au ca si consecinta activarea constitutiva aRAS GTPazei, chiar și în absența semnalizării de catre
factorii de creștere. Rezultatul este un semnal continuu de proliferare celulară. Gene specifice
RAS sunt frecvent mutate in diferite forme de cancer. Mutatiile KRAS sunt deosebit de frecvente
in cancerul de colon, cancerul pulmonar, si cancer pancreatic [8].
Mutatii KRAS în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)
Aproximativ 15-25 % dintre pacientii cu adenocarcinom pulmonar au mutatii KRAS. Mutatiile
KRAS sunt rare în carcinoamele cu celule scuamoase [9]. In cele mai multe cazuri, aceste mutatii
sunt mutații non-sens rezultate prin înlocuirea unui aminoacid la poziția 12 (cel mai frecvent), 13
sau 61. Acest lucru duce la activarea constitutiva a căilor de semnalizare ale KRAS. Mutatii KRAS
sunt găsite în tumori atat la fumatori cat si la fosti fumatori si nefumatori. Ele sunt mult mai rare
la nefumatori, precum și la pacientii asiatici, comparativ cu cei nord-americani sau europeeni [7,
10, 11]. KRAS nu pare a avea o valoare prognostica in CPCNM netratat [12]. Foarte putine studii
prospective randomizate au fost efectuate folosind KRAS ca un biomarker pentru stratificarea
optiunilor terapeutice in tratamentul cancerului metastatic. Spre deosebire de cancerul de colon,
mutațiile KRAS in CPCNM nu sunt un predictor negativ al rezultatului tratamentului prin anticorpi
anti - EGFR. In schimb, mutatiile KRAS sunt un factor predictiv negativ al răspunsului radiologic la
6
inhibitori ai tirozin kinazei EGFR, gefitinib si erlotinib [10, 13]. Intr-un studiu care a inclus 17 de
pacienți cu mutații KRAS, ganetespibul, un inhibitor de HSP90, a demonstrat o activitate redusa
[14]. La om, în asociere cu docetaxel, selumetinib, un inhibitor de MEK1/MEK2, a demonstrat o
activitate la pacientii aflati in tratament de linia a doua pentru CPCNM metastatic avand un KRAS
mutant. In acest studiu randomizat, perioada fara récidiva (PFR) a fost de 5,3 luni în grupul
selumetinib / docetaxel față de 2,1 luni in grupul placebo / docetaxel (HR 0,58 p = 0,014) [15].
In prezent, nu există nici un medicament cu efect direct anti KRAS.
EGFR
Receptorul factorului de crestere epidermica (EGFR) aparține unei familii de receptori de tirozin
kinaza (RTK), care includ EGFR/ERBB1, HER2/ERBB2/NEU, HER3/ERBB3 și HER4/ERBB4. Legarea
liganzilor, cum ar fi factorul de creștere epidermal (EGF) induce o modificare conformațională
care permite homo-sau hetero-dimerizarea receptorului, iar rezultatul este începutul activității
EGFR kinazei. Astfel activat, EGFR isi fosforileaza substraturi sale, ducând la activarea mai multor
căi de semnalizare in aval, din celula: PI3K-AKT-mTOR, care este implicată în supraviețuirea
celulară, și RAS-RAF-MEK- ERK, care este implicată în proliferarea celulară.
Mutatii EGFR in cancerul pulmonar cu celule non-mici (CPCNM)
Aproximativ 10% dintre pacientii cu CPCNM în SUA și 35% în Asia de Est au mutatii EGFR in tumori
[16-18]. Aceste mutații se produc în exonii 18 și 21 ai genei EGFR, care codifică o porțiune din
domeniul kinazei a receptorului. Aproximativ 90% dintre aceste mutatii sunt deletii în exonul 19
sau mutații punctuale L858R în exonul 21 [19]. Aceste mutații determine cresterea activitatea
kinazei EGFR, care duce la hiperactivarea căilor de semnalizare in aval [20] și o sensibilitate la
tratamentul cu inhibitori ai tirozin kinazei [19]. Cu toate acestea, anumite mutații (inserții in
exonul 20, mutatia T790M) semneaza prezenta unei rezistențe initiale sau, mai frecvent,
dobandita la inhibitorii de tirozin kinaza [21).
Indiferent de apartenenta etnica, mutatiile EGFR sunt mult mai frecvent în tumorile de tip
adenocarcinom la pacientii nefumători (definiti ca mai putin de 100 de tigari in viata pacientului),
7
de sex feminin [16-18]. Cu toate acestea, mutatii EGFR pot fi de asemenea găsite si în alte
subgrupuri de CPCNM: fumatori actuali si fosti fumatori, alte tipuri histologice.
ALK
Fuziuni ale genei ALK sunt prezente la aproximativ 3-7% din tumorile pulmonare. Prezența lor a
demonstrat eficacitatea primului inhibitor de ALK, crizotinib.
ALK este un receptor de tirozin kinază, care poate fi anormal în multe tipuri de cancer. De
exemplu, mutații activatoare ale ALK sunt găsite în unele neuroblastoame [22-25]. Fuziuni ALK au
fost descrise în limfomul anaplazic cu celule mari (NPM-ALK) [26], la tumori myofibroblastice
inflamatorii (IMT) [27] și in cancerul pulmonar cu celule non-mici (CPCNM) [28-32]. Toate
fuziunile ALK conțin intregul domeni tirozin kinaza al receptorului. Până în prezent, toate fuziunile
ALK evaluate biologic au demonstrat o activitate oncogenica in vitro și in vivo [26, 28, 31, 32].
Diferitii partenerii de fuziune N-terminală favorizeaza dimerizarea și prin urmare activitatea
kinazei [33]. Semnalizare in aval a acestor fuziuni se traduce prin activarea cailor implicate în
creșterea și proliferarea celulară.
Fuziuni ALK în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)
Fuziuni ale genei ALK sunt prezente la aproximativ 3-7% din tumorile pulmonare [29, 31, 34-37].
Aceste fuziuni ALK sunt mai des intalnite in randul fumatorilor de mici cantitati (<10 PA) și / sau
ne-fumatori [29, 31, 34, 37, 38]. Fuziuni ALK sunt de asemenea mai frecvente în tumorile la tineri
[34, 37, 38] in adenocarcinoamele cu componenta acinara [37, 38], sau prezenta de celule în inel
cu pecete [34].
Terapeutic, prezența fuziuni EML4-ALK este asociata cu rezistenta la inhibitori de EGFR (EGFR TKI)
[39].
Mai multe tipuri de rearanjari de ALK au fost descrise în CPCNM. Majoritatea acestor variante de
fuziune cuprind o parte a genei EML4 asociată cu gena ALK. Au fost identificate cel puțin nouă
variante de fuziune EML4-ALK în CPCNM [28, 29, 31, 32, 36, 37, 40]. In plus, au fost identificate
variante de fuziune non-EML4, de exemplu KIF5B-ALK [32] și TFG-ALK [30]. În practică, prezenta
unei rearanjari a ALK este detectata prin fluorescenta in hibridizarea in situ (FISH). FISH nu poate
8
determina subtipul specific de fuziune ALK prezenta într-o probă de tesut. Dezvoltarea detectarii
anomaliilor ALK prin RT-PCR [41] ar trebui să permita identificarea subtipurilor de anomalii. In
plus, rezultatele RT-PCR par să fie bine corelate cu cele ale FISH. S-a dovedit ca rearanjarea ALK ar
putea fi, de asemenea, detectata pe celule tumorale circulante printr-o tehnica FISH modificata.
Această tehnică permite realizarea testului atunci cand nu este disponibil tesut tumoral și
urmărirea evoluției în timp a numărului acestor celule [42]. În fine, au început să se dezvolte
tehnici de imunohistochimie pentru a detecta anomalii ale ALK [43].
În cele mai multe cazuri, prezenta unei rearanjari ALK exclude prezenta altor mutatii oncogene în
CPCNM (mutatii EGFR, mutații KRAS, etc). [34, 35, 37, 38, 44]. Cu toate acestea, a fost descrisă
coexistența cu alte anomalii moleculare (mutatii EGFR și mai ales MET) [45].
Crizotinibul (Xalkori), un inhibitor de ALK și al receptorului c-Met, a fost recent aprobat de către
autoritățile americane și europene în tratamentul CPCNM la pacientii care prezinta o fuziune ALK
[46].
Într-un studiu de faza I care implica 149 de pacienti cu fuziune ALK, rata de raspuns radiologic a
fost de 61% la tratamentul cu crizotinib, un inhibitor (TKI) de ALK / MET [47]. Mediana de
supravietuire fara progresiune a fost de 9,7 luni, iar 75% dintre pacienti au fost in viata la un an.
Un studiu international de faza III, randomizat, in cancerul pulmonar avansat ce prezinta fuziuni
ALK, a comparat crizotinibul cu chimioterapia standard, ca tratament dupa progresia bolii dupa
tratamentul standard in prima linie. Rezultatele arata un beneficiu pentru crizotinib în termeni de
supraviețuire fără progresia bolii 7.7 luni vs 3.0 luni pentru chimioterapia standard [48]. Noi
Inhibitori de ALK sunt în dezvoltare, cum ar fi CH5424802, care a dat o rată de răspuns de 93,5%
într-un studiu de faza 2 la pacienti netratati anterior cu inhibitor de ALK [49].
Sensibilitate la pemetrexed la pacientii cu cancer pulmonar ce prezinta o rearanjare ALK a fost
obiectul unor studii rétrospective care nu au permis se se faca o concluzie. Un studiu a aratat ca
pacientii cu cancer pulmonar și o rearanjare ALK au avut o rata de raspuns si o supravietuire fara
progresie mai buna daca au fost tratati cu pemetrexed în monoterapie sau în combinație [50].
Trebuie remarcat faptul că nici unul dintre pacienți ALK inclusi în acest studiu nu au fost tratați
anterior cu crizotinib. În schimb, un alt studiu retrospectiv a aratat o supravietuire fara progresie
similara cu ceea a pacientilor fara acest tip de anomalie [51].
9
Într-un studiu ne-randomizat de fază II a IPI-504, un inhibitor de HSP-90, la pacienții cu cancer
pulmonar avansat, aflati in progresie sub tratament cu EGFR TKI, tumorile a trei dintre pacienti s-
au dovedit a avea o rearanjare ALK. Doi dintre acesti pacienti au avut un raspuns partial, iar cel
de-al treilea au avut o stabilizare prelungita a bolii (7.2 luni, scadere de 24% a dimensiunii
tumorii) [52]. Într-un studiu de fază 2 a unui alt inhibitor de HSP-90, ganetespib, 7 din 8 pacienți
cu cancer pulmonar și o rearanjare ALK, netratati cu crizotinib, au avut un beneficiu clinic sub
formă de răspuns parțial (4 pacienti) sau boala stabila (3 pacienți) [14].
Până în prezent au fost găsite mai multe mutații punctiforme în domeniul tirozin kinazei ALK la
pacienții cu rezistență dobândită la crizotinib, inhibitor TKI ALK.
Prin rezistența dobândita se intelege progresia maladiei, după un răspuns inițial obținut cu
tratamentul aplicat. In prezent nu sunt bine cunoscute mecanismele de dobândirea rezistenței la
crizotinib, inhibitorul de ALK / MET. Caeva studii pe cohorte mici de pacienti au aratat ca mutatii
in domeniul kinazei a ALK pot duce la rezistență dobândită la crizotinib. Mutațiile descrise pot
conferi diferite grade de sensibilitate sau rezistenta la ALK TKI de a doua generație.
Noi strategii terapeutice sunt in curs de evaluare la pacienții cu CPCNM ALK +, cu scopul de a trata
sau preveni rezistența asociată cu aceste mutații [53].
ERBB2
Mutații somatice ale ERBB2 au fost descrise in adenocarcinomul pulmonar pentru prima dată în
același an ca și mutatiile EGFR, deși la o frecvență mai mică, de aproximativ 2-4% [54,55]. Aceste
mutații sunt de obicei mici insertii in domeniului kinazei al exonului 20, analog mutatiilor de
rezistenta primara ale EGFR în exonul paralog 20. ERBB2 este un receptor tirozin kinaza care nu
leagă nici un ligand cunoscut, dar homodimerizeaza sau heterodimerizeaza cu EGFR și alte
membri ai familiei ERBB, ERBB3 si ERBB4, pentru a activa semnalul cailor in aval [56]. Aceste
mutatii sunt activatoare si stau la baza testelor de transformare a oncogenelor celulare și răspund
în vitro la inhibitorii ireversibili ai EGFR, care de asemenea leaga si inhiba ERBB2 [57, 58-60].
Ramane de demonstrat in ce masura acesti inhibitori sunt eficienti clinic impotriva mutatiilor in
domeniul kinazei ale ERBB2 găsite în adenocarcinomul pulmonar. Anticorpul Trastuzumab ce activ
10
in cancerul de san nedeterminat pentru ERBB2 amplificat, nu este promițător în modelele
preclinice cu ERBB2 mutant [60-62].
Mutații oncogene sensibile la medicamente ale domeniului extracelular al EGFR au fost descrise
în glioblastom [63,64] ceea ce sugereaza posibilitatea ca mutații ale domeniului extracelular al
ERBB2 sa fie găsite de asemenea, la pacienții cu cancer. De fapt, în adenocarcinomul pulmonar a
fost raportat existenta mutației S310F, mutatie codanta ERBB2. Aceasta mutatie, deși nu
frecventă în adenocarcinomul pulmonar, a fost gasita si in alte tipuri de cancer, și este oncogenica
și sensibila la inhibitori ireversibili de EGFR / ERBB2 in vitro, subliniind necesitatea de a cauta
dincolo de domeniul kinazei al ERBB2 pentru a gasi mutații somatice activatoare relevante clinic.
BRAF
BRAF este o kinază care joacă un rol cheie în calea de semnalizare a kinazelor MAP. In cancerul
pulmonar, aceste mutatii sunt rare și sunt în mare parte regăsite la adenocarcinomul fumatorilor.
BRAF aparține unei familii de serin-treonin kinaze care include ARAF, BRAF, și CRAF (RAF1).
Kinazele RAF sunt mediatori cheie in calea de semnalizare a MAP kinazei. Ele își exercită efectul in
mod principal prin fosforilarea și activarea MEK care are loc prin dimerizare (homo sau hetero-) a
moleculelor RAF. Ca parte din calea MAP kinazei, RAF joaca un rol esential in multe procese
celulare, cum ar fi proliferarea, diferențierea și reglementarea transcrierii.
Mutatii ale BRAF au fost implicate în patogenia mai multor tipuri de cancer, incluzand melanomul,
cancerul pulmonar cu celule non-mici, cancerul colorectal, cancerul papilar tiroidian, și cancerul
ovarian [65].
Mutatii BRAF în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)
Mutatiile somatice ale BRAF au fost gasite in aproximativ 3-5% din CPCNM [9, 65-68], în principal
în adenocarcinoame. Mutatiile BRAF se gasesc in principal la fumători sau foști fumători [66, 67,
69].
Spre deosebire de melanom unde majoritatea mutatiilor BRAF apar pe valina 600 (mutația V600)
în exonul 15 al domeniului kinazei, mutatiile BRAF in cancerul pulmonar apar și la alte niveluri ale
domeniului kinazei. Într-un studiu pe 739 de pacienti cu adenocarcinom pulmonar, 36 de pacienți
11
prezentau mutatii BRAF (4,9%). La acești 36 de pacienți, mutatiile BRAF identificate au fost de
tipul V600E la 57% din aceste cazuri si non V600E la 43% din cazuri [68]. Intr-o alta serie a fost
gasita o proporție de 50% V600E și 50% non V600E [70].
HER2
Mutatiile HER2 sunt rare în cancerul pulmonar. Rezultatele preliminare sugerează eficacitatea
unor terapii anti HER2.
HER2 aparține unei familii de receptori de tirozin kinaza (RTKs), care includ EGFR/ERBB1,
HER2/ERBB2/NEU, HER3/ERBB3 și HER4/ERBB4. Gena HER2 este localizată pe cromozomul 17 ;
acesta este amplificat cu mai multe copii ale genei în diferite tipuri de cancer [71].
Nu se cunosc in ziua de azi liganzi HER2. Cu toate acestea, HER2 pare a fi partenerul de dimerizare
preferat pentru toți receptorii familiei ERBB [72]. Legarea ligantilor, urmată de hetero dimerizarea
receptorului détermina activarea activității de kinază a HER2. HER2 activat iși fosforileaza
substraturile sale, ducând la activarea mai multor căi de semnalizare în aval în celulă. Aceste cai
includ PI3K - AKT - mTOR, care este implicată în supraviețuirea celulară, si calea RAS - RAF - MEK -
ERK, care este implicată în proliferarea celulara.
Mutatii HER2 în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)
Mutatiile HER2 se gasesc in aproximativ 2-4 % din CPCNM [54, 55, 73]. Cea mai frecventa mutatie
este o inserție în exonul 20 [74]. Mutatiile HER2 sunt mai frecvente la nefumatori (definit ca mai
putin de 100 de tigari fumate pe durata viații), si in adenocarcinom [54, 55, 73, 74]. Cu toate
acestea, mutațiile HER2 pot fi găsite în alte subtipuri de CPCNM, inclusiv la fumători sau foști
fumători, sau in prezenta alte tipuri histologice [54, 55, 73]. Insertiile de la nivelul exonului 20
antreneaza o hiperactivitate a HER2 kinazei, urmata de activarea caii de semnalizare în aval,
avand ca rezultat : creșterea supravietuirii celulare, invazia și dezvoltarea tumorii [60].
Amplificare HER2 nu pare legate de mutatii HER2 [55, 73]. Și spre deosebire de ceea ce se observă
în cancerul de sân, amplificarea HER2 nu este un factor de prognostic in CPCNM.
ROS1
12
Fuziunile genei ROS1 sunt prezente în aproximativ 2 % din tumorile pulmonare. Rezultate
preliminare indica eficacitatea crizotinib, un inhibitor de ALK / MET cu actiune asupra ROS1.
ROS1 este un receptor de tirozin kinază (RTK) aparținând familiei de receptori de insulină.
Rearanjamente cromozomiale care implică gena ROS1, la nivelul cromozomului 6q22, au fost
descrise inițial în glioblastoame (de exemplu, FIG - ROS1) [75-77]. Mai recent fuziuni ale ROS1 au
fost identificate ca anomalii cauzale în cancerul pulmonar cu celule non mici [30].
Fuziunile ROS1 încorporează un domeniu tirozin kinază intact. Biologic, fuziunile care au fost
studiate au activitate oncogenica [30, 77]. In aval de fuziunile ROS1, semnalizarea activeaza caile
celulare cunoscute ca fiind implicate in cresterea si proliferarea celulelor. In vitro, fuziunile ROS1
sunt asociate cu o sensibilitate la inhibitori ai tirozin kinazei activi pe ROS1 [78].
Fuziuni ROS1 în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)
S-au găsit fuziuni ROS1 în aproximativ 2 % din cazurile de cancer pulmonar [79]. La fel ca si pentru
fuziunile ALK, fuziunile ROS1 sunt mai des intalnite in randul fumatorilor mici (< 10 pachete ani) și
/ sau nefumatorilor. Fuziunile ROS1 sunt mai des asociate cu vârstele tinere și histologie de
adenocarcinom [79]. Două serii asiatice recente au raportat 31 de cazuri de fuziuni ROS1 ; toate
cazurile au fost adenocarcinom [80, 81]. La modelele preclinice, fuziunile ROS1 arată o
sensibilitate la inhibitorii de tirozin kinaza care prezintă o activitate colaterala pe ROS1, cum ar fi
crizotinibul [79]. Doi pacienti cu CPCNM metastatic și fuziune ROS1 a avut un raspuns partial la
crizotinib [79, 82].
Au fost gasite mai multe rearanjamente ROS1 în CPCNM. Acestea includ SLC34A2 - ROS1 și CD74 -
ROS1 [78]. În practică, prezența unei rearanjari ROS1 este detectata prin hibridizare in situ in
fluorescenta (FISH) folosind o sondă ROS1 "break apart". FISH nu determina subtipul specific de
fuziune ROS1 prezent in proba de tesut.
Mutatii non-exclusive
13
DDR2
DDR2 (Discoidin Death Receptor 2) este un membru al familiei de receptori de tirozin kinaza DDR
care sunt stimulate de colagen și nu de factori de creștere peptidici. Semnalizarea in aval in
celulele canceroase nu este bine cunoscuta, dar ar putea fi facuta prin caile de semnalizare SRC si
STAT. Ca și la receptorii integrină, DDR2 poate juca un rol prin modularea interacțiunilor celulare
cu matricea extracelulară.
Mutații DDR2 au fost găsite (nu foarte frecvent) in cateva tipuri de cancer, inclusiv carcinom cu
celule renale, glioblastomul multiform, cancer endometrial, cancer colorectal (Catalogue of
Somatic Mutations in Cancer - COSMIC). Cel mai frecvent se intalneste in carcinomul pulmonar cu
celule scuamoase [83].
Mutații DDR2 au fost găsite în 3,8% din carcinoamele cu celule scuamoase ale plămânului, dar la
mai puțin de 1% din tumorile cu celule non-scuamoase ale plămânului [COSMIC; 83]. Nici o locație
specifică nu a fost identificata, mutațiile fiind in domeniul kinazei si al discoidinei (acesta din urmă
fiind parte a regiunii extracelulare care se leaga de colagen; 84). Nu au fost raportate nici
supraexprimari ale DDR2 nici modificări ale numărului de copii ale locusului DDR2 (1q23).
Caracteristicile clinice ale pacientilor cu mutatii DDR2 sunt puțin cunoscute, și nici o asociere
semnificativă cu sexul, vârsta, sau fumatul nu a fost găsita.
FGFR1
Amplificările FGFR1 genei sunt frecvente, găsite în aproximativ 20% din cancerul pulmonar cu
celule scuamoase și legate de fumat. Inhibitori de FGFR sunt în curs de dezvoltare.
Gena receptorului factorului de creștere a fibroblastelor de tip 1 (FGFR1) codifică unul dintre
subtipurile familiei receptorilor FGFR ai tirozin kinazei (TK). In total sunt patru astfel de familii:
FGFR1, 2, 3, și 4. FGFR TK au un rol-cheie în dezvoltare și sunt de multe ori deregulate în cancer,
prin fenomene de amplificare, mutații punctuale, sau translocatii [85]. Fenomene de amplificare
sau de aleactivare a FGFR1 au fost descrise în numeroase tipuri de cancer, inclusiv cancer cu
celule scuamoase ale gurii [86], cancerul de sân [85], carcinom cu celule scuamoase de esofag
[87] cancerul ovarian [88], cancer de vezica urinara [89], cancerul de prostata [90], și cancer
pulmonar, in special cu celule scuamoase [91- 93].
14
Mutatii FGFR1 în CPCNM
Amplificări ale FGFR1 se găsesc în principal în pulmonar cu celule scuamoase, la pacienti fumatori
sau fosti fumatori. La pacienții asiatici, amplificarea FGFR1 este legată de importanța
tabagismului ; este de asemenea un factor independent de prognostic prost [94]. Regiunea
cromozomiala 8p12 pe care se afla locusul genei FGFR1 este amplificat în ~ 20% din tumorile
pacienților cu cancer pulmonar cu celule scuamoase. Modificări în numărul de copii ale genei au
fost identificate cu diferite tehnici, printre care hibridizare in situ in fluorescenta (FISH) [91, 93,
95]; semnificația clinică a pragurilor de pozitivitate a testelor nu este determinata pana in
prezent. La pacienții care suferă de alte tipuri histologice de cancer pulmonar cum ar fi
adenocarcinoamul, amplificarea FGFR1 este rara (mai puțin de 2%) [94]. Regiunea cromozomiala
8p12 pe care se afla locusul genei FGFR1 este amplificat în ~ 20% din tumorile pacienților cu
cancer pulmonar cu celule scuamoase. Modificări în numărul de copii ale genei au fost
identificate cu diferite tehnici, printre care hibridizare in situ in fluorescenta (FISH) [91, 93, 95].
Date preclinice sugerează că celulele canceroase care prezintă o amplificare a FGFR1 sunt
dependente de calea de semnalizare FGFR.
MET
Anomaliile MET întâlnite în cancerul pulmonar constau în principal dintr- o amplificare genica, în
special prezenta la pacienții cu mutații EGFR, și rezistenti la inhibitori de tirozin kinaza.
Gena MET (gena de transformare MNNG - HOS [96]), localizată pe cromozomul 7, codifică pentru
un receptor de tirozin kinază (RTK) aparținând familiei MET / RON. Legarea ligandului, factorul de
creștere a hepatocitelor (HGF, de asemenea, cunoscut ca scuatter factor (SF)), produce o
modificare conformațională a receptorului MET care induce fosforilarea și activarea receptorului.
MET astfel activât, iși fosforileaza substraturile sale, ducând la activarea mai multor căi de
semnalizare în aval în celulă. Aceste cai includ PI3K - AKT - mTOR, care este implicată în
supraviețuirea celulară, si calea RAS - RAF - MEK - ERK, care este implicată în proliferarea celulară.
În cancer, semnalizarea anormala la nivelul receptorului MET induce reacții ce procesul de
metastazare [97, 98].
15
S-a arătat că receptorul MET și ligantul său HGF au fost anormal activate in multe cancere la om
(vezi http://www.vai.org/met/). Mutatii germinale in domeniul tirozin kinazei a MET se găsesc în
100 % din cazurile de cancer renal papilar ereditar , și mutații somatice ale MET sunt prezente în
10-15 % din carcinoamele papilare renale sporadice [99]. Cu o frecvență mai mică, au fost gasite
mutatii ale MET in cazurile de cancer cu celule scuamoase al capului si gatului [100], în carcinomul
hepatocelular al copilului [101], în CPCNM [102, 103] și în cancerul pulmonar cu cellule mici [103].
Amplificări MET au fost descrise în cancerul gastric [104], în cancerul de esofag [105], în cancerul
colorectal [106], în glioame [107] în cancerul ovarian cu celule clare [108] si CPCNM [109-115].
MET în cancerul pulmonar cu celule mici non (CPCNM)
Au fost descrise mai multe mecanisme de activare a MET în CPCNM, inclusiv amplificarea genica
[109-115] si a mutatiilor [102, 103].
Nu este cunoscută activitatea inhibitorilor de MET în CPCNM și în cancerul pulmonar cu cellule
mici, pentru tumorile cu mutatii in afara domeniului kinazei. În schimb, au fost raportate
răspunsuri la foretanib (XL880 sau GSK136308), un inhibitor al MET și a altor tirozin kinaze,
inclusiv VEGFR2, activ pe cale orala, la pacientii cu carcinom papilar renal [116].
O supraexprimare a proteinei în țesutul tumoral comparativ cu țesutul normal adiacent, este
prezenta in 25-75 % din CPCNM și este un factor de prognostic prost [117-124]. Într-un studiu
recent de faza II, pacientii cu CPCNM au fost randomizati intre MetMAb (anticorpi anti - MET), in
asociere cu erlotinib fata de erlotinib singur. Supraexprimarea proteinei MET a fost asociata cu o
crestere a supravietuirii fara progresie a bolii si supravietuirii globale la pacientii tratati cu
MetMAb plus erlotinib [125]. În acest studiu, supraexprimarea proteinei MET a fost definit, atunci
când mai mult 50 % din tumora prezenta o expresie moderată sau înaltă a MET la
imunohistochimie, folosind un anticorp specific anti - MET (Ventana CONFIRM anti-CMET clona
SP44).
NRAS
Mutatii NRAS sunt rare în cancerul pulmonar. Inhibitori MEK ar putea avea o activitate clinica.
16
La om, au fost identificate trei gene RAS diferite: KRAS (omoloagă cu oncogena virusului
sarcomului Kirsten la șobolan), HRAS (omoloagă cu oncogena virusului sarcomului Harvey la
șobolan) și NRAS (inițial izolată intr-un neuroblastom uman). Diferitele gene RAS sunt foarte
omologe, dar distincte funcțional. Proteinele RAS sunt GTPaze mici, care trec de la forme inactive
legate de guanozin difosfat (GDB) la forme active legate de trifosfat guanozina (GTP). Proteine
RAS sunt mediatori cheie în aval de receptorii factorului de creștere și sunt critice pentru
proliferarea, supraviețuirea și diferențierea celulelor. RAS are capacitatea de a activa în celulă cai
de semnalizare in aval. Aceste cai includ PI3K-AKT-mTOR, care este implicată în supraviețuirea
celulară, si calea RAS-RAF-MEK-ERK, care este implicată în proliferarea celulară.
RAS a fost implicata în patogeneza multor tipuri de cancer. Mutații activatoare ale genei RAS au
dus la activarea constitutiva a RAS GTPazei, chiar și în absența semnalizării de catre factorii de
creștere. Rezultatul este un semnal continuu de proliferare celulară. Genele RAS specifice sunt
deseori mutate in multe forme de cancer. Mutatiile NRAS sunt deosebit de frecvente in cancerul
de colon, melanom, carcinom hepatocelular, leucemie mieloidă, și cancer tiroidian [126].
Mutatii NRAS în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)
Aproximativ 1% din pacientii cu cancer pulmonar cu celule non mici au mutatii NRAS. Mutatiile
NRAS sunt rare în carcinoame cu celule scuamoase și la nefumatori [9, 5, 127]. In cele mai multe
cazuri, aceste mutatii sunt mutații non-sens prin înlocuirea unui aminoacidul din poziția 12 și 61.
Acest lucru duce la activarea constitutiva a cailor de semnalizare NRAS.
Nu exista încă tratamente tintite anti-NRAS, dar studiile pre-clinice sugereaza ca inhibitori ai MEK
(selumetinib, trametinib) ar putea fi activi [127].
În cele mai multe cazuri, mutațiile NRAS sunt exclusive altor mutatii oncogene găsite în CPCNM
(de exemplu mutatii EGFR, rearanjare de ALK, etc).
PIK3CA
17
Mutatiile PIK3CA sunt rare ; ele par a fi mai frecvente în cazurile de cancer cu celule scuamoase.
Inhibitori ai PIK3 si ai PIK3/mTOR sunt in curs de dezvoltare clinica.
Fosfatidil 3-kinazele (PI3K) sunt o familie de kinaze lipidice implicate în numeroase procese
celulare cum ar fi creșterea, proliferarea, diferențierea, mobilitatea și supraviețuirea. PI3K este un
heterodimer compus din două subunități - o subunitate de reglare a 85 kDa (p85) și o subunitate
catalitică a 110 kDa. Gena PIK3CA codifică p110α, una dintre subunități catalitice.
PI3K convertește PI (4,5) P2 [fosfatidilinozitol 4,5-bifosfat] in PI (3, 4, 5) P3 [fosfatidilinozitol (3, 4,
5)-trifosfat] în interioarul foitei interne a membranei celulare. PI (3, 4, 5) P3 activeaza la nivelul
membranei importante proteine de semnalizare, cum ar fi AKT, ducând la creșterea activității
acestor proteine.
PIK3CA mutanta este implicată în patogeneza multor tipuri de cancer, printre care glioamele,
cancerele de colon, de stomac, de sân, de endometru, și de plămân [COSMIC; 128].
Mutatii PIK3CA în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)
Mutații somatice în PIK3CA au fost găsite în 1-3% din toate CPCNM [COSMIC; 128, 129]. Aceste
schimbari au loc, de obicei, la două puncte critice ale exonului 9 (domeniul elicoidal) și exonul 20
(domeniul kinazei). Mutatiile PIK3CA par a fi mai frecvente în carcinoame cu celule scuamoase,
comparativ cu adenocarcinomul [129, 130] si s-au găsit atât în rândul fumătorilor cat si la
nefumători. Mutatii PIK3CA pot coexista cu mutații EGFR [7, 129]. Mai mult decât atât, au fost
detectate mutații PIK3CA într-un procent mic (~ 5%) din cazurile de cancer pulmonar cu mutații
EGFR prezentand o rezistență dobândită la inhibitorii de tirozin kinaza a EGFR [131].
RET
Fuziuni RET sunt descrise în aproximativ 1 la 2% din cazurile de cancer de plămân cu celule non
mici, de obicei adenocarcinoame. Mai multe studii explorareza activitatea inhibitorilor de tirozin
kinaza a RET.
Gena RET ("rearranged during transfection") [132], este localizată pe cromozomul 10 ; acesta
codifică un receptor de tirozin kinază (RTK) aparținând familiei RET. Legarea cu liganzii săi
aparținând familiei "glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF)" induce fosforilarea și
18
activarea receptorului ; acești liganzi sunt molecule de semnalizare extracelulară [133]. Odata
activat, RET fosforilează substraturile sale, determinand activarea cailor de semnalizare in aval
[134].
Anomalii RET se găsesc mai ales în cazurile de cancer tiroidian. Mutații somatice punctuale și
germinale sunt găsite în cancerul tiroidian medular [135, 136]. Fuziuni RET sunt, de asemenea,
găsite în unele adenocarcinoame pulmonare [137].
RET in cancerul pulmonar
Aproximativ 1,3% din tumorile pulmonare prezintă modificări cromozomiale de tipul genelor de
fuziune RET [41, 138-141]. Aceste rearanjamente de gene par să existe aproape exclusiv în tumori
de tip adenocarcinom. Când s-au căutat alte anomalii, fuziuni RET apar mutatii oncogene
exclusive în CPCNM (exclud existenta mutatiilor EGFR, KRAS, ALK). Cele mai frecvente gene de
fuziune sunt CCDC6-RET și KIF5B-RET și, mai recent, NCOA4-RET [41].
Într-o serie importanta de pacienti chinezi [41], pacientii ce prezinta o fuziune RET sunt mai
degraba tineri, nefumatori și cu tumori slab diferențiate, comparativ cu pacienții fără această
anomalie.
Consecințele funcționale ale proteinelor de fuziune RET în adenocarcinomul pulmonar nu sunt pe
deplin înțelese, dar se stie ca ele sunt oncogenice in vitro și in vivo. La modelele in vitro, produsii
de fuziune RET pot fi sensibili la inhibitorii de kinazei multi-țintă precum vandetanib, sorafenib,
sunitinib și cabozantinib [139, 141, 142]. In clinica, sunt încă puține datele prospective permit sa
se faca legatura intre prezența de fuziuni RET cu răspunsul la anumite tratamente [143].
Fuziuni RET au fost inițial identificate prin RT-PCR, imunohistochimie, și secvențiere de a doua
generatie. Nu există nici un test standard pentru identificarea fuziunilor RET in probele de
tumorale, dar hibridizare in situ in fluorescenta (FISH) sau captura țintită / secventiere de a doua
generatie sunt metode utile potențial.
În ciuda progreselor semnificative in dezvoltarea de noi terapii tintite, rata ridicata a mortalitatii
in cancerul pulmonar subliniază cu fermitate necesitatea unei preventii și a unei depistari mai
19
eficiente a cancerului pulmonar, precum și o mai bună clasificare a pacientilor care vor putea
astfel beneficia de un anumit tip de terapie.
Microarrays au fost folosite pentru mai mult de două decenii în cercetare preclinice cu scopul de
a determina profilele de expresie genica associate cu diferite subgrupuri tumorale histopatologice
sau diferitele evolutii clinice, și pentru a evalua funcțiile biologice și celulare determinate de
aceste seturi de gene.
Pacientii cu cancer pulmonar cu cellule non-mici (CPCNM) in stadiul IIIA (invazia ganglionilor
mediastinali – N2+) reprezintă un grup heterogen de pacienti: Ruckdeschel [144], imparte acesti
pacienti in în trei grupe: ganglioni N2 cu invazie minimă sau microscopică, descoperiti întâmplător
în timpul sau după intervenția chirurgicală; pacienți cu N2+ diagnosticat pre-operator, imagistic
sau chirurgical; si pacientii cu N2+ masiv, din mai multe statii ganglionare. In ultimii 20 de ani, au
fost propuse mai multe strategii de tratament diferite pentru a trata pacientii cu CPCNM in stadiul
IIIA [145]. Diferitele opțiuni terapeutice includ: un tratament neoadjuvant prin chimioterapie sau
chimio-radioterapie urmat de chirurgie; chirurgie primară urmata de chimioterapie adjuvanta, cu
sau fără radioterapie secvențială; chimio-radioterapie definitiva, fara interventie chirurgicala
[146-148].
Mai multe studii clinice de faza II si III au demonstrat fezabilitatea clinica si îmbunătățirea
supravietuirii prin administrarea chimioterapiei neoadjuvante [146, 148, 149-155]. In cele mai
multe dintre aceste studii, sterilizarea ganglionilor mediastinali (downstaging) si rezectia
chirurgicala completa sunt predictori ai supravietuirii pe termen lung [149, 150].
In cazul unui cancer bronho-pulmonar cu celule non-mici cu invadarea ganglionilor mediastinali
(N2+), atitudinea terapeutica acceptata in prezent este cea a unui abord multimodal ce consta din
chimioterapie neoadjuvanta pe baza de saruri de platina, urmata de rezectie chirurgicala
completa pentru pacientii care au raspuns sau au fost stabilizati de chimioterapie. Dupa
chimioterapia neoadjuvanta, aproximativ 5% din pacienti vor avea un raspuns complet.
Majoritatea pacientilor va avea un raspuns partial (mai mult de 50% reductie tumorala), dar
numarul pacientilor care vor fi doar stabilizati sau vor avea un raspuns minor, ramane foarte
important (aproximativ 40%). Supravietuirea globala la 5 ani a pacientilor cu cancer bronho-
20
pulmonar cu celule non-mici cu invadarea ganglionilor mediastinali (N2) este de 20-25%, insa
analiza de subgrup arata ca supravietuirea la 5 ani a celor care au raspuns la chimioterapie este
de 42%, versus 10% la cei care nu au raspuns la chimioterapie (156).
Este prin urmare evident ca pentru aproximativ 40% dintre pacientii in stadiul IIIA tratamentul
prin chimioterapie neoadjuvanta nu aduce niciun beneficiu, in schimb expune pacientul riscului
efectelor adverse si al diferitelor complicatii dintre care unele majore. In plus, aceste tratamente
sunt in general foarte costisitoare.
Studiul de fata are ca obiectiv determinarea unei semnaturi genice cu valoare de prognostic, care
sa permita definirea acestui grup de pacienti inainte de orice tratament.
Astfel, am realizat experimente microarray pe esantioane de tesut tumoral provenit din ganglionii
tumorali mediastinali recoltati chirurgical inainte de tratamentul prin chimioterapie
neoadjuvanta, de la 27 de pacienti cu CPCNM in stadiul IIIA. In functie de raspunsul la
tratamentului neoadjuvant in conformitate cu criteriile OMS [157], s-au determinat doua grupuri
de pacienti: Lotul A – pacientii care au avut un raspuns partial, au fost stabilizati sau nu au
raspuns la chimioterapie; Lotul B - pacientii care au avut un raspuns major sau complet la
tratamentul de inductie. In fine, s-au realizat expresiile genice pentru cele doua grupuri de
pacienti prin analiza microarray utilizand tehnologia Agilent One-Color Microarray. Datele
microarray au fost apoi analizate şi pentru identificarea principalelor căi de semnalizare implicate
în diferentierea celor doua grupuri de pacienti.
Ulterior s-a realizat secventierea exomului (Whole Exome Sequencing) tesutului tumoral din
ganglionii tumorali mediastinali recoltati chirurgical inainte de tratamentul prin chimioterapie
neoadjuvanta si s-au comparat cele doua grupuri de pacienti. Am determinat astfel 5 gene
modificate specific fiecarui grup de pacienti, in raport cu raspunsul la chimioterapia
neoadjuvanta.
21
A1. Generarea materialului biologic preterapeutic pentru investigatia genomica si activitati
specifice bancii de tesuturi si organe
- Baza de date anonima cu materiale biologice, date clinice si patologic.
- Aprobare Comisii de Etica si Protectie a Persoanelor din Franta si Austria pentru includerea
pacientilor (Anexa 1)
- Protocoale de lucru adaptate fiecarui centru (Anexa 2)
- Materiale biologice
- Esantioane tisulare si serice de la toti pacientii care intrunesc criteriile de includere
Baza de date anonima cu materiale biologice, date clinice si patologic rezultata din includerea
pacientilor poate fi consultata la adresa: https://gpn2.icfundeni.ro,
Parola: ANCS
Password: ancsgpn2.
Toate probele de tesut și datele clinice relevante au fost obținute prospectiv de la
departamentele de chirurgie toracica de la Spitalul Hotel Dieu din Paris afiliat la Facultatea de
Medicina Paris 5 Rene Descartes si de la Spitalul Allegemeines Krakenhaus Universitatskliniken din
Viena în perioada ianuarie 2011 - decembrie 2012. Probele includ 27 de ganglioni mediastinali
tumorali recoltati de la pacienti cu CPCNM si invazia ganglionilor mediastinali (stadiul IIIA), tratati
prin chimioterapie neoadjuvanta, urmată de rezecția chirurgicală la pacientii care au raspuns sau
au fost stabilizati prin tratamentul de inductie.
Consimțământul informat a fost obținut de la toți pacienții și protocoalele pentru acest studiu au
fost aprobate de către Comitetul de Protecție al Persoanelor ile de France V si Ethik-Kommission
al Universitatii de Medicina din Viena.
22
Criteriile de includere și evaluarea preoperatorie a pacientilor
Criteriile de includere au fost pacienții cu CPCNM diagnosticat histologic, care nu au primit nici un
tratament pentru cancer pulmonar înainte de tratamentul neoadjuvant și care au fost apti pentru
tratamentul prin chimioterapie urmata de intervenție chirurgicală. Toti pacientii au fost
stadializati conform clasificării TNM a American Joint Committee on Cancer, editia a 7-a, prin
bronhoscopie, computer tomografie sau tomografie cu emisie de pozitroni (PET). Invazia
ganglionilor mediastinali a fost confirmata patologic prin biopsie chirurgicala prelevata prin
mediastinoscopie sau toracoscopie. Datele clinice inregistrate au fost: ziua de nastere, sex,
histologie a tumorii, răspunsul clinic la tratament neoadjuvant, numărul de cicluri administrate,
tipul de droguri utilizate, efectele adverse, stadializarea TNM a pieselor rezecate la pacientii
operati. Numărul de cicluri de regim de chimioterapie a fost determinat de catre clinicieni si a
variat intre 2 si 3, in functie de răspunsul clinic și radiologic. Răspunsul clinic a fost definit prin
utilizarea criteriilor OMS de evaluare a raspunsului la tratament in tumorile solide. După
chimioterapia neoadjuvanta pacientii au fost reevaluati prin computer tomografie și / sau PET, și
rezecția tumorii a fost realizata pentru cei care nu au avut nici o dovada de progresie a bolii.
Pacientii care au progresat sub chimioterapie nu au fost operati. Boala stabila (SD), nu a fost
considerat o contraindicație pentru chirurgie si, prin urmare, o restadializare patologica a
statutului ganglionilor mediastinali nu a fost considerată necesară. Pacientii care au fost operati
au beneficiat de o rezectie pulmonara anatomica și o limfadenectomie sistematică a ganglionilor
limfatici mediastinali.
Un total de 73 de pacienti diagnosticati sau suspecti de CPCNM in stadiul IIIA clinic au fost inclusi
initial in studiu. Toti pacientii au beneficiat de o procedura chirurgicala (mediastinoscopie sau
toracoscopie) pentru confirmarea histologica a invaziei ganglionilor mediastinali. Un total de 44
de pacienti au fost exclusi din studiu in urma analizei histologice a tesuturilor ganglionare
mediastinale prelevate. Cauzele de excludere se regasesc in Tabelul 9.
23
Cauza de excludere Numar pacienti
Lipsa tesutului tumoral in ganglionii mediastinali 28
recoltati prin biopsie chirurgicala (pN0)
Leziuni benigne in ganglionii mediastinali 1
Carcinom pulmonar cu cellule mici 6
Invazie avansata a ganglionilor mediastinali (bulky N2) 2
Limfom in ganglionii mediastinali 1
Utilizarea tesutului ganglionar tumoral congelat in scop diagnostic 1
Absenta tesutului tumoral in tesutul ganglionar congelat 2
Descoperirea fortuita a invaziei ganglionare de tip N3 3
TOTAL 44
Tabelul 9. Cauzele de excludere
Toti pacientii au fost in stadiul IIIA (invazia ganglionilor mediastinali – N2+) clinic dovedit
histopatologic. Caracteristicile de bază ale 29 de pacienți ramasi in studiu sunt detaliate în Tabelul
10. Pacientii de sex masculin au fost predominanti (n = 18; 62%), vârsta medie fiind de 61 ani.
Adenocarcinomul (n = 22; 75,8%) a fost cel mai frecvent tip histologic.
24
Caracteristici Numar (%)
Total pacienti 29
Sex
masculin 18 (62)
feminin 11 (38)
Varsta medie (ani) 61 [40-75]
Histologie
Adenocarcinom 22 (75,8)
Carcinom scuamos 3 (10)
Carcinom neuroendocrin cu cellule mari 3 (10)
Carcinom cu cellule mari 1 (3,2)
cT (stadiul clinic al tumorii)
T1a 3 (10)
T1b 8 (27,5)
T2a 10 (34,5)
T2b 2 (7)
T3 6 (20)
Tabelul 10. Caracteristicile generale ale populatiei studiate
25
Chimioterapia neoadjuvanta
Numarul mediu de cicluri de chimioterapie administrate a fost de 3 (interval 2-4): 1 (3,2%) pacient
a primit 2 cicluri, 21 (72,6%) au primit 3 cicluri și 6 (21%) au primit 4 cicluri si 1 pacient (3,2%) a
primit 5 cicluri. Toti pacienții au fost tratați cu o combinație de două medicamente primul
chimioterapic fiind invariabil Cisplatina (n=23, 79%) sau Carboplatina (n=5, 21%), combinatia de
cisplatina/pemetrexed fiind administata în majoritatea cazurilor (n = 15; 52%). Al doilea
chimioterapic a fost Etoposidul (n=7, 24%), urmată de Gemcitabina (n=3, 10%) si Vinorelbina
(n=3, 10%). Toxicitatea la chimioterapia neoadjuvanta a fost în majoritatea cazurilor ușoară sau
moderată (gradul 1-2) evenimente adverse (efectele toxice hematologice leucopenie: în 29,4%,
anemie la 25,8%, trombocitopenie la 7%, toxice non-hematologice: gastrointestinale, inclusiv în
principal greață, vărsături sau diaree în 37,6%, oboseala la 25,8%, alopecie la 14,1% și altele în
8%). Trei (10%) pacienti au avut de grad 3/4 de toxicitate, care a inclus 2 leucopenii si o tromboză
venoasă profundă complicat cu embolie pulmonara si deces dupa primul ciclu de chimioterapie.
Răspunsul clinic a fost evaluat la cei 28 pacienti care au terminat tratamentul de inductie prin
chimioterapie. Evaluarea raspunsului la tratament s-a realizat prin scanare CT și / sau PET si a
arătat 13 pacienti (46,4%) au evoluat sub chimioterapie, 7 pacienti (25%) au fost stabilizati si 8
pacienti (28,6%) au avut răspunsuri parțiale. Nici un pacient nu a avut un răspuns clinic complet.
Rata globala de raspuns clinic la chimioterapia neoadjuvanta a fost de 15 pacienti (51,7%). Acesti
pacienti au beneficiat ulterior de interventie chirurgicala.
Chirurgie
Un pacient a avut carcinoza pleurala descoperita la toracotomie si nu a beneficiat de rezectie
chirurgicala. Restul de 14 (50%) pacienti au beneficiat de rezectie chirurgicala: 11 lobectomii
(78,5%), o bilobectomie (7%) și 2 pneumonectomii (14,5%). Limfadenectomia sistematică a
ganglionilor limfatici mediastinali a fost efectuata la fiecare pacient. Toti pacienții au beneficiat de
o rezectie completa R0.
26
A2. Definirea loturilor de prognostic
- Definire componenta Lot A: al pacientilor care au avut un raspuns obiectiv la
chimioterapie neoadjuvanta
- Definire componenta Lotul B: al pacientilor care au avut raspunsuri minore sau au fost
doar stabilizati prin chimioterapie neoadjuvanta.
- Esantioane tisulare si serice de la 100 de pacienti selectati in urma acestei etape.
O rezectie a fost considerată completă (R0), atunci când nu a existat nici o tumoare reziduala
detectata la marginile de sectiune bronșica sau vasculara și nici boala reziduala in regiunea
mediastinala. Downstagingul mediastinal a fost definit ca lipsa de celule tumorale în ganglionii
mediastinali rezecati. Răspuns patologic complet a fost definit ca absența celulelor tumorale
viabile în piesa sau in ganglionii limfatici rezecati. Pacientii care progresat sub chimioterapie si
care nu au avut un downstaging pe piesa operatorie, au fost considerati ca insensibili la
tratamentul chimioterapic si inclusi in Lotul A. Pacientii care au avut un downstaging sau au un
raspuns patologic complet pe piesa operatorie, au fost considerati ca sensibili la tratamentul
chimioterapic si inclusi in lotul B.
Răspuns histopatologic
Un raspuns patologic complet a fost observat la 2 (7%) pacienți. Boala reziduala N2 a fost prezent
în 6 (21,5%) pacienți, în timp ce 7 (25%) au avut downstaging mediastinal: N1 (n = 1; 3,5%) sau N0
(n = 6; 21,5%).
În total, 7 (25%) pacienti au avut un downstaging al bolii initiale și au fost inclusi in Lotul B al
pacientilor sensibili la chimioterapie. Restul de 21 de pacienti (cei care au evoluat sub
chimioterapie – 13 pacienti, si cei care nu au avut un dowstaging prin chimioterapie – 8 pacienti)
au fost inclusi in Lotul A ai pacientilor care nu au raspuns la chimioterapie :
- Lotul A - 21 de pacienti care nu au raspuns la chimioterapie sau au avut raspunsuri minore
ori au fost doar stabilizati prin chimioterapie neoadjuvanta (criterii OMS).
27
- Lotul B – 7 pacienti care au avut un raspuns obiectiv la chimioterapie neoadjuvanta
(criterii OMS).
Stadiul patologic a fost: nici o boală reziduală în 2 cazuri, stadiul IA în 3, IIA în 3 și IIIA în 6 cazuri.
Nu s-a determinat nici o asociere semnificativa între răspunsul clinic și patologic sau downstaging
mediastinal și de sex, vârstă, histologie, numărul de cicluri tipurile de tratament chimioterapic sau
raspunsul clinic la chimioterapie.
28
A3. Prepararea esantioanelor pentru analiza genomica
- ARN total, ADN genomic si proteinele denaturate folosind protocolul Sigma TRIREAGEN pe
loturi de 25 de probe biologice, 4 loturi
- ADN complementare pe loturi de 25 de probe biologice, 4 loturi
- Aliquoturile de ARN SI ADN purificate pe loturi de 25 de probe, 4 loturi
Extractiile ARN
Esantioanele tisulare recoltate de la pacienti eligibili pentru studiu au fost prelucrate in vederea
extactiei de ARN total.
Pe scrurt, ARN-ul total a fost obtinut prin extractie in doua etape: prima etapa reprezentata de
extractia cu Trizol (Invitrogen) si cea de-a doua reprezentata de purificarea ARN (clean-up)
folosindu-se kitul Absolutely RNA Microprep (Agilent Technologies).
In prima etapa a protocolul de extractie s-a omogenizarea tesutului cu 1 ml trizol, s-a adugat
cloroform care a permis izolarea ARN in faza apoasa. Aceasta faza a fost tratata cu izopropanol,
iar peletul (ARN precipitat) a fost spalat cu etanol 75%. Ulterior ARN precipitat a fost dizolvat in
apa Rnase Dnase free.
Cea de-a doua etapa in procesul de izolare, clean-up-ul a presupus amestecarea solutiei ARN cu
tampon de liza si beta-mercaptoetanol; ulterior a fost adugat etanol 70% care a facilitat legarea
selectiva a ARN de membrana coloanelor din kit. Urmatoul pas a presupus splarare cu 1xHigh Salt
Wash Buffer si respectiv 1xLow Salt Wash Buffer urmat de eluarea ARN cu tamponul de eluare din
kit.
Pentru probele de ARN astfel obtinute au fost realizate controalele cantitative si respectiv
calitative prin citirea spectrofotometrica a concentratiilor ARN si a raportului A260/A280 si
respectiv prin electroforeza capilara in polimer de acrilamida cu ajutorul Agilent 2100 Bioanalyser
si a chipurilor din kitului RNA 6000 Nano kit (rapoarte Bioanalyser prezentate in Figura 1). Agilent
2100 Bioanalyzer cuantifica calitatea ARN prin atribuirea unui RNA Integrity Number (RIN) fiecarei
29
probe citite. Aceste RIN poate lua valori de la 1 la 10; un RIN de valoare 1 fiind atribuit unui ARN
degradat, iar un RIN de valoare 10 fiind atribuit unui esantion ARN integru.
Figura 1 : Raport ARN total Bioanlizor 2100
Extractii ADN
Protocolul de extractie ADN (conform protocolului DNA Extraction kit (Startagene) si QIAamp Dna
Mini Kit (Qiagen)), presupune urmatoarele etape (Figura 2):
1. mojararea in azot lichid a ~30 mg tesut
2. amestecarea cu tampon de liza
3. adaugare proteinaza K
4. incubare peste noapte in termobloc la temperatura de 56˚C
5. tratament cu Rnaza. Concentratia initiala a enzimei este de 10mg/ml, concentratia finala
de Rnaza este de 20 ug/ml. Amestecul de reactie se incubeaza pe termobloc timp de 10
minute la 70˚C
6. adaugare etanol 100%
30
7. incarcare amestec de reactie pe coloane
8. centrifugare la 8000 rpm timp de 1 minut la temperatura camerei
9. aruncare eluat
10. splare cu 500 ul tampone de spalare
11. eluare finala cu 50 ul apa libera de Rnase si Dnase
12. tratament cu Rnaza.
13. citire concentratie si raport 260/280 la Nanodrop 1000
14. citirea concentratiilor fluorimetric cu ajutorul echipamentului Quibit
Puritatea probelor a fost determinata prin calcularea raportului dintre absorbanta la 260 nm si
280 nm. ADNul izolat a avut un raport intre 1.7 si 2.2.
Pentru asigurarea acuratetii concentratiei, aceasta a fost estimata si cu ajutorului Qubit 2.0
Fluorometer (test: dsDNA BR).
Echipamentul utilizeaza fluorocromi de tip sonde moleculare pentru cuantificarea gDNA. Acesti
marcatori emit semnal fluorescent numai cand sunt legati de moleculele de inters, in cazul nostru
gDNA.
Figura 2: Pasii de lucru pentru estimarea concentratiei gDNA cu ajutorul Qubit
(http://www.lifetechnologies.com/ro/en/home/brands/product-brand/qubit/qubit-
fluorometer.html#how)
ADNul astfel izolat a fost stocat la -28ºC pentru utilizare in rectiile de secventiere.
31
Ulterior, in vederea testarii calitatii, probele de ADN au fost migrate si electroforetic in gel de
agaroza 1%, 1X TAE, 100V, timp de 60 minute. Imaginile au fost preluate cu ajutorul
echipamentului GelDoc, BioRad (Figura 3).
Figura 3: Migrare electroforetica in gel de agaroza 1%, Ladder 100-3000 bp
Protocolul de secvetiere de urmatoare generatie presupune initial utilizarea tehnologiei de
capturare (SureSelect Target Enrichment) Agilent. Tehnologia SureSelect Target Enrichment
permite tintirea regiunilor de interes (precum exomul). Initial va fi necesara o etapa de
fragmentare pentru obtinerea unor fragmente de dimensiuni mici pronind de la gADN urmata de
o etapa de reparare a capetelor acestor fragmente cu ajutorul enzimei Klenow, iar ulterior vor fi
adugate in reactie sonde oligonucleotidice biotinilate care tintesc zonele de interes din genom.
Probele vor fi purificate iar in final selectia regiunilor tintite de va realiza cu bile metalice cu
streptavidina. Ulterior etapele de lucru vor presupune generarea clusterelor, secventierea,
alinierea citirilor si determinarea variatiilor.
32
A4. Analiza genica
- Expresie genica pentru fiecare proba pentru perechile de ganglion mediastinali tumorali si
normali, 100 expresii genice
- Studiu de expresie genica comparativa prin tehnica One-Color Microarray-Based Gene
Expression Analysis – AGILENT inainte si dupa chimioterapia neoadjuvanta
- Expresii genice modificate in limfoganglionii mediastinali
- Expresii genice modificate in limfoganglionii mediastinali de catre chimioterapia
neoadjuvanta, in cancerul bronho-pulmonar cu cellule non-mici si invazia ganglionilor
mediastinali si in functie de tipul histopatologic
- Consideratii privind importanta fenomenelor de epigenetica prin compararea expresiilor
genice dintre limfoganglionii mediastinali tumorali si tumora primitive dupa chimioterapie
Experimentele microarray
Pentru analiza microarray s-a utilizat tehnologia Agilent One-Color Microarray- Based Gene
Expression Analysis, versiunea 5.5 / februarie 2007. Au fost folosite lamele microarray slides
Whole Human Genome Oligo Microarray with SurePrint Technology 4 x 44 K.
33
In Figura 4 este schematizat Planul de realizare al experimentelor microarray a fost urmatoarul:
MI
Figura 4 : Planul de realizare al experimentului microarray
Tesut
normal
Tesut
tumoral
Extractii ARN total/
Purificare ARN
ARN total + spike-in
Sinteza cDNA
Sinteza ARN si amplificare
Purificare cARN
Prgatirea probelor si hibridizare
Hibridizare 17h/ 65˚C
Feature extraction/ Gene Spring
Determinare concentratie/
Verificarea calitatii
O
N
E
-
C
O
L
O
R
M
I
C
R
O
A
R
R
A
RECOLTARE TESUTURI
E
X
T
R
A
C
T
I
I
Extractii ADN
Spalare/ Scanare
34
Pornind de la 100 ng in 1.5µl, s-au realizat urmatoarele etape:
1. Reactia de marcare, folosind kitul Low Imput Quick Amp Labeling, one-color, marcajul
realizandu-se cu Cy 3. Din ARN total s-a obtinut cDNA printr-o reactie de revers
transcriere, urmata de sinteza cARN cu nucleotide marcate cu Cy3.
2. Reactia de purificare a cARN pe coloane conform protocolului Absolutely RNA Microprep
kit
3. Cuantificare cARN, prin determinarea concentratiei/ stocului (μg) si a activitatii specifice in
pmol Cy3/ μg cARN. Activitatea specifica trebuie sa fie mai mare de 8 pmol Cy3/ μg cARN
pentru continuarea experimentului.
4. Hibridizarea. Se realizeaza pornind de la 1.65 μg cARN marcat si cuantificat anterior,
folosindu-se kitul Gene Expression Hybridisation, varianta 4 x 44 k . Amestecul de reactie
este incorporat in sandwichul format de gasket slide si slidul oligo microarray, plasat in
camera de hibridizare SureHyb. Pe un gasket slide vor fi pipetate 4 probe. Camera de
hibridizare a fost incubata in cuptorul de hibridizare pentru 17 ore la 65 °C, 10 rpm.
5. Spalarea. Lamele au fost trecute prin bai succesive folosindu-se Gene Expression Wash
Buffer 1 si Gene Expression Wash Buffer 2.
6. Plasarea lamelor in slide holder. Lamele oligo microarray au fost asezate in cate un slide
holder versiunea B astfel incat codul numeric sa fie vizibil odata pus in carousel, ceea ce
permite citirea prin sticla.
7. Scanarea lamelor. Pentru scanarea lamelor a fost folosit programul Scan Control versiunea
7, compatibil cu softul de extractie a datelor Feature Extraction 9.1. Pentru lamele Agilent
4 x 44K (61 x 21.6 mm) este necesara scanarea cu o rezolutie de 5 μm. Lamele au fost
scanate folosindu-se urmatorii parametrii: RPMT 10%, GPMT 100% si XDR 0.10%. Fisierul
.tiff creat a avut o rezolutie de 16 bit (Figura 5)
35
Figura 5: Semnalele inregistrate pentru un array dupa extractia datelor din fisirele .tif cu
Feature Extraction
36
In Figura 6 este redat un rapport de calitate al unui experiment microarray.
QC Report - Agilent Technologies : 1 Color Gene Expression
Date Thursday, October 18, 2012 - 10:30 Grid 026652_D_F_20110325
Image US45102959_252665216355_S01_H
[1_2] BG Method No Background
Protocol GE1-v5_91_0806 (Read Only) Background Detrend On(FeatNCRange, LoPass)
User Name Administrator Multiplicative Detrend True
FE Version 9.1.3.1 Additive Error 4(Green)
Saturation Value 630001 (g)
Spot Finding of the Four Corners of the Array
Net Signal Statistics
Agilent SpikeIns:
Green
# Saturated Features 0
37
Grid Normal
Feature Local Background
Green Green
Non Uniform 13 103
Population 64 523
Spatial Distribution of All Outliers on the Array
532 rows x 85 columns
99% of Sig. Distrib. 294433
50% of Sig. Distrib. 683
1% of Sig. Distrib. 28
Non-Control probes:
Green
# Saturated Features 0
99% of Sig. Distrib. 35665
50% of Sig. Distrib. 144
1% of Sig. Distrib. 26
Histogram of Signals Plot
38
# FeatureNonUnif (Green) = 13(0.03%)
# GeneNonUnif (Green) = 10 (0.028 %)
# Features (NonCtrl) with BGSubSignal < 0: 3937 (Green)
Spatial Distribution of Median Signals for each Row
39
• BG NonUniform • BG Population
• Green FeaturePopulation • Green Feature NonUniform
Negative Control Stats
Green
Average Net Signals 28.31
StdDev Net Signals 2.92
Average BG Sub Signal -4.38
StdDev BG Sub Signal 2.60
Local Bkg (inliers)
Green
Spatial Distribution of Median Signals for each Column
40
Number 43887
Avg 41.04
SD 2.32
Foreground Surface Fit
Green
RMS_Fit 1.44
RMS_Resid 3.71
Avg_Fit 57.25
Multiplicative Surface Fit
Green
RMS_Fit 0.12
Agilent SpikeIns: Log(Signal) vs. Log(Relative concentration) Plot
41
Reproducibility: %CV for Replicated Probes
Median %CV Signal (inliers)
Non-Control
probes Agilent SpikeIns
Green Green
BGSubSignal 14.53 12.71
ProcessedSignal 4.47 3.80
Agilent SpikeIns Signal Statistics
Probe Name Log(Relative
Conc.)
Median(Log
Proc. Sig.) % CV StdDev
(+)E1A_r60_3 0.30 0.62 231.72 0.28
(+)E1A_r60_a104 1.30 0.60 63.77 0.17
Agilent Spike-In Concentration-Response Statistics
Linear Range Statistics:
Low Signal 0.70
High Signal 5.67
42
(+)E1A_r60_a107 2.30 1.38 24.76 0.09
(+)E1A_r60_a135 3.30 2.35 5.09 0.02
(+)E1A_r60_a20 3.83 2.73 3.69 0.02
(+)E1A_r60_a22 4.30 3.23 3.01 0.01
(+)E1A_r60_a97 4.82 3.86 3.60 0.02
(+)E1A_r60_n11 5.30 4.52 3.95 0.02
(+)E1A_r60_n9 5.82 4.85 3.80 0.02
(+)E1A_r60_1 6.30 5.44 5.91 0.03
Agilent SpikeIns: %CV of Avg. Processed Signal Plot
Low Relative
Concentration 1.72
High Relative
Concentration 6.57
Slope 1.03
R^2 Value 1.00
Signal Detection Limit Statistics
Saturation Point 5.80
Low Threshold 0.41
Low Threshold Error 0.35
Spike-In Detection Limit 1.36
43
Median %CV:3.80
Figura 6: Raportul de calitate al experimetului microarray (este prezentat raportul pentru un array (o proba))
44
A5. Analiza bioinformatică
- Gene şi căi de semnalizare cheie implicate în cancerul bronho-pulmonar cu cellule non-mici
si invazia ganglionilor mediastinali
- Analiza bioinformatica a rezultatelor globale in urma determinarilor de genom si selectarea
genelor candidat pentru validare
Datele sunt compuse din două grupuri de pacienti: cei care nu au raspuns la tratamentul prin
chimioterapie neoadjuvanta (non-responders) si cei care au raspuns la tratamentul prin
chimioterapie neoadjuvanta (responders). De notat ca printre responders există doar o singură
femeie (nepereche). Unele esantioane sunt imperecheate la esantioane de ganglioni non-tumorali
de la acelasi pacient, altele nu. Acest tip de date este menționat în literatura de specialitate ca
"Parțial imperecheat", și pot fi abordate prin modele liniare cu efecte mixte [158, 159]. Pentru
simplificare, am luat în considerare mai intai datele care sunt imperecheate, si apoi am considerat
datele ca un întreg, indepedent de împerechere.
Tesut ganglionar normal versus tumoral: În urma experimentului microarray realizat s-au putut
identifica un număr de 1127 gene cu expresie modificată în ţesutul tumoral comparativ cu ţesutul
normal cu p-value ≤ 0.05 şi 44 de gene cu p-value ≤ 0.01.
Dintre genele identificate cele cu cele mai mari diferenţe de expresie genică identificată între
ţesutul tumoral faţă de cel normal sunt COL1A1, INHBA sau TXNIP.
Tesut ganglionar tumoral responders versus non-responders: Seturile de gene au fost pregătite
pentru analiza GO (ontologia genelor) îmbogățita (bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt) [160, 161] cu
ajutorul combinațiilor de gene de varianță mare sau mica la responders si la non-responders. A fost
definit un total de 12 grupuri diferite și 50 de gene mai reprezentative (cea mai mare sau cea mai
mica varianță) au fost selectate ca in-put pentru fiecare grup. Tabelele 12 și 13 arata termenii GO
care au fost semnificativi pentru responders si non-responders, respectiv, folosind genele cu
varianță mare.
45
De notat că pentru seturile de gene cu varianță mica au existat doar rezultate de Proces Molecular,
și ca în toate cazurile, "activitatea receptorului de semnalizare transmembranara", și grupurile
asociate (de exemplu " receptorul de activitate "), au fost semnificative.
Multe categorii GO au fost semnificative pentru unele dintre grupuri, si prin urmare am filtrat
pentru a da rezumatele prezentate în Tabelele 12 și 13. Am păstrat termenii GO cu valori p <0,01,
cel puțin 5 gene in termen de Proces Biologic, cel puțin 4 gene în termen de Funcții Moleculare, și
cel puțin 3 gene în termen de Componente Celulare. A fost selectat un numărul diferit de gene
minime pentru fiecare categorie, deoarece a existat o preponderență a rezultatelor in termen de
Proces Biologic, fata de Funcțiile Moleculare and Componentele Celulare, respectiv. Din motive de
redundanta, în care există mai multe rezultate similare este redata doar o singura categorie. De
exemplu, doar termenul de"regiune extracelulară" (Componenta Celulara) in loc de "spațiul
extracelular", "o parte a regiunii extracelulare", și "regiune extracelulară".
Analiza GO îmbogățita a aratat ca genele de semnalizare transmembranara nu variază de la un
pacient la altul, independent de răspunsul la chimioterapia neoadjuvanta.
Genele cu mare variabilitate ale pacientilor care au raspuns la chimioterapia neoadjuvanta implica
keratina și cornificarea. Invelisul cornificat al celulelor epidermice ale pielii este format din keratina,
și este înconjurat de lipide. Acesta este asociat cu disfuncții de barieră și are ca rezultat un semnal
de apoptoză [162].
Genele cu mare variabilitate ale pacientilor care au nu raspuns la chimioterapia neoadjuvanta
implica activitatea enzimatică și sensibilitatea hormonala.
46
Procese Biologice - Diferentierea keratocitelor
- Dezvoltarea epiteliala
- Diferentierea celulelor epidermice
- Raspunsul la lipide
Functii Moleculare Constituenti structurali ai citoscheletului
Componente
Celulare
- invelisul keratinizat
- matricea proteica extracelulara
- regiunea extracelulara
Tabelul 12: termeni GO semnificativi pentru seturile de gene de varianță mare la responders.
Procese Biologice - Raspuns la stimulul hormonal
- Reglarea negativa a activitatii hidrolazei
- Reglarea negativa a activitatii endopeptidazei
- Raspunsul la lipide
Functii Moleculare Inhibitor al activitatii endopeptidazei
Componente
Celulare
Regiunea extracelulara
Tabelul 13: termeni GO semnificative pentru seturi de gene de varianță mare la non-responders.
Analiza Cailor de semnalizare
Am inclus ganglioni limfatici tumorali și non-tumorali și am încercat determinarea unor căi
moleculare care sa defineasca diferența răspunsului la chimioterapie. Dacă există un semnal genetic
pentru răspunsul la chimioterapie, aceasta este probabil o caracteristică a pacientului, și este
prezent în atât ganglionii tumorali cat și non-tumorali.
47
Datele au fost împărțite în subgrupuri (Tabelul 14). Rezultatele, sugerează faptul că numai
eșantioanele de dimensiuni mai mari permit obtinerea unor rezultate semnificative. In Tabelul 14
sunt prezentate căile semnificative doar pentru grupurile cu cel puțin 10 esantioane pe categorie. S-
au determinat 7 cai moleculare care au fost semnificative (FDR <0,05) în cel puțin unul din
subgrupuri. Toate aceste căi sunt in raport cu sistemul imunitar, una este o cale de semnalizare, iar
restul sunt legate de răspunsul imun sau autoimun la tesut strain. Calea de semnalizare a citokinelor
este de asemenea legata de bolile autoimune [163]; citokinele sunt implicate în procesul de
recrutare al limfocitelor.
Nu este clar dacă semnalul de raspuns la chimioterapie este prezent atat în ganglionii limfatici
invadati cat și cei neinvadati. Cu toate acestea, luând în considerare coloanele D și E, vedem că
valorile p sunt bine corelate între ele, cu excepția căii de semnalizare a citokinelor, care este mai
implicata în ganglionii limfatici invadati.
A B C D E
Caile KEGG MF M MF M M
Toti toti tumorali tumorali non-
tumorali
24/11 9/10 18/7 7/6 2/4
Boala grefon-versus-receptor
Poliartrita reumatoida
Rejetul alogrefelor
Tiroidita autoimuna
Lupus eritematos systemic
Diabet de tip I
Calea de semnalizare a citokinelor
0.04 0.08 0.07 0.09 0.06
0.04 0.05 0.07 0.07 0.06
0.04 0.07 0.07 0.09 0.09
0.04 0.05 0.07 0.09 0.06
0.04 0.26 0.13 0.32 0.24
0.05 0.08 0.07 0.10 0.06
0.97 0.05 0.93 0.24 0.96
48
Tabelul 14: Valoarea p pentru caile KEGG care sunt semnificative cu un p <0.05, pentru cel puțin unul din cele 5 seturi de date de in-put, definite de la A la E. Valorile aflate sub cutoff sunt subliniate. Prima linie a antetului arata sexul pacientilor (M=masculin, F=feminin) din subgrup. A doua linie arata tipul ganglionilor limfatici. Ultima linie a antetului arata numărul de non-responders si de responders (non-responders/responders) luati in calcul. De notat că există doar o singura femeie in grupul de responders, si prin urmare nu a fost luat în considerare un subgrup numai de femei.
Căile din Tabelul 14 amintesc de ceea ce s-ar putea aștepta de la compararea transcriptomului unei
persoane de sex masculin cu transcriptomul unei persoane de sex feminin, deoarece diferența
majoră dintre transcriptomele legate de sexe sunt procesele sistemului imunitar [164, 165]. Cu
toate acestea, semnificația căilor grupului pacientilor numai de sex masculine ai subgrupului B
(ganglioni limfatici invadati si neinvadati) sugerează, de asemenea, o functie imunitara similara cu
comportamentul autoimun.
Ca si control negativ, Ghidul Pathway a fost utilizat în compararea femeilor cu bărbații. Căile
semnificative specifice sexului sunt prezentate în Tabelul 15. Multe dintre acestea sunt căi pentru
bolile autoimune, care sunt cunoscute a fi mai frecvente la femei decât bărbați [164].
Ran
g
Nume pPERTFdr
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Receptor de interactiune citochina-citochina
*Lupus eritematos systemic
*Diabet de tip I
**Poliartrita reumatoida
*Reactie grefon-versus-receptor
Calea de semnalizare MAPK
Calea de semnalizare NF-kappa B
Interactiunea neuroactiva ligant-receptor
** Tiroidita autoimuna
Procesarea si prezentarea antigenelor
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.027
49
11
12
13
14
15
16
17
18
19
*Rejetul alogrefelor
** Calea de semnalizare a citokinelor
Cai in cancer
Calea de semnalizare a receptorului Toll-like
Proteoglicanii in cancer
Cancerul pulmonary cu cellule mici
Miocardita virala
Aderarea punctiforma
Hepatita B
0.027
0.031
0.034
0.037
0.039
0.043
0.043
0.047
0.047
(*) cai care sunt de asemenea semnificative si la responders/non-responders (Tabelul 5). (**) cai care sunt de asemenea semnificative si numai la barbatii responders/non-responders. Tabelul 15: Cele 19 cai semnificative, bazate pe diferențele de sex.
Tabelul 15 arată că există 19 cai semnificative atribuite diferențelor de sex. Șapte dintre acestea
sunt, de asemenea, semnificative atunci când se compară pacientii care au raspuns la chimioterapia
neoadjuvanta cu cei care nu au raspuns. deși unele sunt, probabil, semnificative doar pentru ca in
categoria pacientilor care au raspuns la chimioterapia neoadjuvanta exista doar o singura persoana
de sex feminin. Cu toate acestea, luând în considerare numai pacientii de sex masculin, există trei
căi importante pentru răspunsul la chimioterapie, și acestea sunt, de asemenea, printre cele mai
importante cai atribuite diferențelor de sex: poliartrita reumatoida, boli tiroidiene autoimune, și
semnalizarea citokinelor. Este interesant de a vizualiza aceste 3 cai, comparând rezultatul feminin /
masculin cu rezultatele responder / non-responder.
Pathway Guide permite vizualizarea modificarilor, perturbarea totala [166], și totalul perturbarilor
acumulate [167] in caile KEGG. În cazurile care au răspuns la chimioterapie, nu au existat gene
exprimate diferențiat. De aceea vom analiza doar rezultatele cu privire la acumularea de
perturbare. Totalul perturbarilor acumulate rezumă efectul genelor din amonte, asupra fiecarei
gene, și deduce modificarile acesteia, în timp ce perturbare totală analizeaza schimbarea fiecărei
gene.
50
In Figura 11 este prezentata acumularea totala de perturbare in calea poliartritei reumatoide pentru
pacientii de sex masculin responders / non-responders (partea de sus) și femei / bărbați (partea de
jos). Efectul asupra caii este aceeași pentru ambele categorii. Non-responders si sexul feminin are
un efect de down-regulare a semnalului pentru celulele T (CTLA4 și CD28), și up-reguleaza
angiogeneza (FLT1), in comparatie cu responders si sexul masculin, respectiv. CD28 este improtant
pentru producerea de citokine, precum și activarea și supraviețuirea celulelor T. CTLA4 are un rol în
multe boli autoimune; transmite semnale de in-hibare pentru celulele T. FLT1 este implicat in
angiogeneza și funcția macrofagelor.
51
Figura 11: Acumularea totala de perturbare in calea poliartritei reumatoide la pacientii de sex masculin non-responders/responders (A) și femei/bărbați (B). În albastru sunt CTLA4 și CD28. În portocaliu este FLT1. Aceasta cale poate fi analizata interactiv și mai în detaliu la www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa05323 .
In Figura 12 este prezentata acumularea totala de perturbare in calea tiroiditei autoimune pentru
pacientii de sex masculin non-responders/responders (partea de sus) și femei / bărbați (partea de
jos). Efectul asupra caii are unele asemănări dar și deosebiri. Ca si pentru calea poliartritei
reumatoide, non-responders și sexul feminin down-reguleaza de semnalizare CD28 catre celulele T.
Cu toate acestea, semnalizarea receptorilor celulelor B, fiind mediata de CD40, este down-regulata
la non-responders în comparație cu responders, dar up-regulata la femei față de bărbați. CD40 joacă
un rol în răspunsurile imune și inflamatorii. Activitatea receptorului de suprafață FAS a morții
celulare este down-regulata la non-responders fata de responders, dar up-regulata la femei
comparativ cu bărbații. Această observație este în concordanță cu faptul că la non-responders nu se
produce suficienta de apoptoza, dar femeile (care au cele mai multe boli autoimune) produc in mod
manifest prea multă apoptoza in tesuturile tinta.
52
Figura 12: Acumularea totala de perturbare în calea tiroiditei autoimune la pacientii de sex masculin non-responders/responders (A) și femei/bărbați (B). În albastru este CD28. CD40 și FAS sunt activate la femei comparativ cu bărbații (portocaliu), dar down-regulate (albastru) la non-responders fata de responders. Aceasta cale poate fi analizata interactiv și mai în detaliu la www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa05320 .
In Figura 13 este prezentata acumularea totala de perturbare in calea de semnalizare a Citokinelor
pentru bărbați non-responders / responders (partea de sus) și femei / bărbați (partea de jos). Marea
majoritate a efectelor asupra acestei căi sunt opuse. In comparatie cu responders, non-responderi
53
au o represiune generală a întregii cai, iar femeile au o stimulare generală a întregii cai, comparativ
cu bărbații. Unele citokine inflamatorii initiaza raspunsul imun. Represiunea semnalizarii citokinelor
la non-responders si de activarea ei la femei, confirmă, de asemenea, ipoteza că la non-responders
nu se produce suficient raspuns imunitar, în timp ce femelele produc prea mult.
Figura 13: Acumularea totala de perturbare în calea de semnalizare a citokinelor pentru pacientii de sex masculin non-responders/responders (A) și femei/bărbați (B). Cascadele coerente de perturbare
54
sunt trasate prin linii de culoare roșie. Marea majoritate a efectelor asupra acestei căi sunt opuse. Față de responders, non-responders au o down-regulare generală a întregii cai iar pacientii de sex feminin au o activare generală a întregii cai comparativ cu bărbații. Aceasta cale poate fi analizata interactiv și mai în detaliu la www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa04062.
A6. Validarea rezultatelor de microarray
- Validarea functionala in vitro a genelor candidat
- Validarea expresiei diferentiale observate in analiza genica
Profilele genice au fost identificate prin compararea nivelului de expresie in tesutul tumoral cu
tesutul normal. Graficul de tip heat map al expresiilor genice sunt prezentate in Figura 7.
Figura 7: Graficul de tip heat map al expresiilor genice pentru primele 100 cele mai variabile gene
55
Analiza expresiei genice ale datelor de tip one-color microarray au condus la identificarea unei liste
de 1127 gene cu expresie modificata in tesutul tumoral comparativ cu cel normal, cu o valoare p p ≤
0.05 si a unei liste de 44 gene cu un p ≤ 0.01.
Controlul calitatii a fost realizat utilizand pachetul Agi4x4Preprocess R.
In Tabelul 11 sunt prezentate cele 44 de gene cu p ≤ 0.01. Aceste gene au avut un fold change (in
valoare logaritmica) care a variat de la -1,7 la 4,23.
entrezgene logFC AveExpr t P.Value adj.P.Val
22821 -1,173258731 11,13694967 -12,98345105 3.49343401072318e-07 0,005546005
27286 2,545876689 8,890347552 11,34529854 1.11807759868413e-06 0,005546005
26508 1,876663537 9,192918963 11,12359435 1.3236134164741e-06 0,005546005
2191 4,022255682 9,437812624 10,9762565 1.48312639869672e-06 0,005546005
1277 4,231281424 12,9965347 10,91369957 1.55716660199109e-06 0,005546005
7434 -0,941052066 6,72058215 -10,11983818 2.95368413038161e-06 0,007499442
55379 1,004302185 10,25022671 10,11029066 2.97728365006124e-06 0,007499442
7076 2,87756409 12,53348489 9,925538564 3.47738114167333e-06 0,007499442
1741 1,123055978 8,596499646 9,824297712 3.79014937023107e-06 0,007499442
284217 1,367868135 6,674277885 9,687002883 4.26484889326777e-06 0,007567146
6659 1,667996873 8,069546502 9,496667902 5.03462255723364e-06 0,007567146
54972 2,665611377 9,862355762 9,469463092 5.15662314647218e-06 0,007567146
11215 -0,814402188 9,105882189 -9,343864536 5.76365018459461e-06 0,007567146
7083 2,676443411 12,22765411 9,308393659 5.94901376789674e-06 0,007567146
204 0,679810381 9,795624417 9,100511695 7.17620021096144e-06 0,007913304
10848 1,8321068 9,130893651 9,088531883 7.25495658932353e-06 0,007913304
1278 2,798927601 13,01906921 9,030717462 7.64862884342508e-06 0,007913304
4192 2,398358908 11,75701295 8,960337335 8.15986496238367e-06 0,007913304
57406 -1,265393014 8,965186115 -8,918510887 8.48140297045091e-06 0,007913304
101060503 -1,705156498 14,16353261 -8,815791117 9.33172609749257e-06 0,007913304
10628 -1,705156498 14,16353261 -8,815791117 9.33172609749257e-06 0,007913304
56
10631 3,540699178 10,40582188 8,731025388 1.01041507170582e-05 0,008178851
113452 2,418904943 10,67408826 8,63173113 1.10994924125068e-05 0,008337932
376267 1,829969417 10,11817436 8,591294234 1.15352807335472e-05 0,008337932
55055 0,905758763 7,666081227 8,553643689 1.19579734350864e-05 0,008337932
56262 0,912017157 11,54976301 8,535001776 1.21735309054371e-05 0,008337932
157 -1,611194101 10,07410734 -8,449010001 1.32246275601811e-05 0,008722377
2050 1,14890615 8,334851704 8,365496263 1.43414725365402e-05 0,00877029
5295 -1,339082297 9,270794271 -8,365315465 1.43439999060357e-05 0,00877029
5754 1,038829341 6,997112489 8,311579568 1.51172866405036e-05 0,00877029
541471 1,185444982 10,38471918 8,284766599 1.55201491136218e-05 0,00877029
51203 1,898659759 8,262710933 8,247583966 1.60984336317396e-05 0,00877029
51330 2,401023087 10,33485488 8,237941996 1.62522215575208e-05 0,00877029
79682 1,540038351 8,384637854 8,173828757 1.73167264134797e-05 0,00906989
22861 -0,9628272 7,900876874 -8,078060453 1.90519599582042e-05 0,009419884
80325 -0,984246414 10,58843737 -8,054256347 1.95122724610364e-05 0,009419884
332 2,601838185 9,936349792 8,051219934 1.95718606648487e-05 0,009419884
6790 1,721496802 8,056554846 8,017040016 2.02565631882032e-05 0,009492865
3624 3,429633239 9,585551188 7,952341954 2.16256362755282e-05 0,009696314
128408 -1,443797363 11,4465483 -7,945344621 2.17796802694478e-05 0,009696314
57648 2,382017595 9,588140988 7,861805962 2.37146276552714e-05 0,009727647
2150 1,812910141 7,515960736 7,86150297 2.37219796738778e-05 0,009727647
84627 1,575775347 9,129878734 7,854522972 2.38920405755272e-05 0,009727647
79686 -1,409964199 10,19374091 -7,848694623 2.40350661087991e-05 0,009727647
Tabel 11. Lista celor 44 de gene cu un p ≤ 0.01
57
A7. Secventierea pentru genele candidate
- Secventierea genelor candidate - Studii secundare pentru gasirea unor biomarkeri plasmatici echivalenti - Studiu comparativ privind piata serviciilor de analiza genomica pt dezvoltarea de noi
biomarkeri - Contract de consultanta in scopul valorificarii rezultatelor cercetarii
Secveţierea de tip whole exome sequencing
Pentru secvenţiere s-a utilizat platforma HiSeq2000 Illumina, cu la 50X coverage mediu pentru
zonele de interes.
Tehnologia Illumina de secventiere paralel in masa se bazează pe secventierea prin sinteza [158].
După preparare tesuturilor, secvențierea începe cu adăugarea ADN-polimerazei si a unui amestec
de patru nucleotide, fiecare etichetata cu un terminator reversibil și o eticheta fluorescenta
specifica bazelor. Fragmentele sunt alungite treptat cu cate o nucleotida, și după încorporarea
nucleotidelor, activarea prin laser și achiziția de imagini permite identificarea nucleotidelor recent
încorporate. Eticheta fluorescenta și terminatorul sunt apoi eliminate, si incepe următorul ciclu de
secventiere [159]. Experimentul de secvenţiere a permis identificarea genelor responsabile pentru
răspunsul la tratament prin determinarea unei semnaturi genetice a pacientilor cu CPCNM.
Intr-o prima etapa secventele adaptor din datele brute precum si datele de calitate inferioara (cu
multe N) sunt indepartate. Acest pas a permis dobandirea datelor nealterate/ curate. Apoi este
realizata alinierea BWA (Burrow-Wheeler Aligner). Acest tip de aliniere genereaza date in fisiere cu
format .bam. Aceste fiesiere sunt necesare pentru procesari, precum stabilirea informatiei pereche
a alinierii, adaugarea informatiei despre grupul de citire, realizarea citirilor duplicat cauzate de PCR.
Dupa aceste procesari, fisierele BAM au fost utilizate pentru citirea variantelor. SNP (Single
Nucleotide Polymorphism) sunt determinate cu SOAPsnp, insertiile/deletiile (InDels) mici sunt
determinate cu Samtools/GATK, SNVs (Single Nucleotid Variants) sunt detectate cu Varscan.
Insertiile/deletiile (In/Del) somatice sunt detectate cu GATK, CNVs (Copy Number Variation) sunt
58
detectate cu Exome CNV/Varscan. Procedura experimentala include si estimarea puritatii. Ulterior o
serie de filtre au fost aplicate pentru obtinerea unor rezultate mult mai sigure. Apoi s-a utilizat
ANNOVAR pentru adnotarea variantelor rezultate. Variantele finale pot fi utilizate in procedura
avansata ulterioara, in aval.
Procedura experimentala standard este prezentata in figura de mai jos (Figura 8):
Figura 8 : Rezultatele analizei bioinformatice: Procedura experimentala standard de whole exome
sequencing
59
Controlul calitatii datelor de secventiere
Definim citirile brute ca citiri care contin secventa adaptorului, un continut mare de baze
necunoscute si citiri de calitate inferioara. Acestea trebuie sa fie inalturate inaintea analizei de date.
Pasii de filtrare sunt urmatorii:
1. Eliminarea citirilor adaptorului: Citirile adaptorului sunt definite ca o citiri care include bazele
adaptorului; aceste cititi ale adaptorului vor fi eliminate din datele brute ale FASTQ;
2. Eliminarea citirilor de calitate inferioara: daca mai mult de jumatate din bazele dintr-o citire
sunt baze de calitate inferioara care a fost definite ca si calitate a bazelor mai mica sau egala
cu 5, consideram citirea ca fiind inferioara calitativ si aceasta va fi eliminate din datele brute
ale FASTQ;
3. Eliminarea citirilor in care bazele necunoscute au un procent mai mare de 10%
Dupa filtrare, citirile ramase sunt denumite “citiri curate” sunt utilizate pentru analiza
bioinformatica ulterioara. In final s-a realizat o statistica pentru a avea productia de date pentru
datele brute FASTQ si datele curate. In acelasi timp, calitatea datelor curate poate fi prezentata
intr-o imagine.
Controlul de calitate al alinierii
Citirile secventierii au fost aliniate cu secventa genomului de referinta folosind BWA. Pentru
cartografiere s-a folosit genomul uman ca genom de referinta. BWA a fost selectat dupa evaluarea
performantei sale. BWA este un program eficient, care analizeaza secventele de nucleotide relativ
scurte in vederea producerii unor rezultate precise si rapide , cu rate de eroare scazute. BWA
furnizeaza schema flexibila a parametrilor si productia alinierii este prezentata in format SAM
(Sequence Alignment/Map).
S-a folosit picard pentru a marca citirile in duplicat (informatii in exces produse prin PCR). Dupa care
s-au combinat rezultatele de aliniere la un format de fisier BAM care este forma compresata a
fisierelor SAM.
60
S-a considerat genomul uman build 37 (hg19) ca genom de referinta pentru acest proiect.
Dimensiunea intregului genom hg19 este de 3,137,161,264, in timp ce dimensiunea efectiva este de
2,861,327,131 (excluzand bazele N, regiunile randomice, regiunile hap, cromosomul Un,
cromosomul M in referinta).
Analiza SNP
Am utilizat SOAPsnp pentru detectia SNPs. Genotipul cu cea mai mare probabilitate la un locus dat
este identificat pentru fiecare proba secventiata a unui individ si secventa consens a probei este
asambalata si salvata in format CNS. Utilizand secventa consens, locusul polimorfic intre genotipul
identificat si cel de referinta poate fi filtrat si evidentiat; acesta va constitui setul de date SNP cel
mai sigur. Setul de date este salvat intr-o fila separate in format text.
Analiza In/Del si Distrbutia lungimilor
Am utilizat citirea capetelor imperecheate pentru alinierea decalajelor pentru a detecta InDel-urile
(small Insertion/Deletion) utilizand programul mpileup in SAMtools.
Distrbutia lungimilor InDelurilor in intreaga regiune tinta si regiunea CDS au fost de asemenea
reprezentate. Distributia lungimii InDel-urilor in regiunea CDS arata faptul ca peak-urile sunt
prezente in lungimile 3,6,9. InDel-urile cu aceasta periodicitate nu sunt InDel-uri de tip frameshift,
ele afecteaza relativ putin genomul in comparative cu InDel-urile de tip frameshift.
Analiza In-Dels
Parametru Java-jar GenomeAnalysisTK.jar – T UnifiedGenotyper – stand_call_conf50
stand_emit_conf10.0 – A DepthOfCoverage – A RMSMappingQuality-baq
CALCULATE_AS_NECESSARY –glm INDEL
Analiza statistică
În analiza statistica, variabile dihotomice au fost exprimate ca numere absolute și procente și
variabilele cantitative au fost rezumate ca valori medii cu primul și al treilea cuartil.
61
Asocierea dintre variabilele calitative a fost verificată prin intermediul testului χ2 sau testul Fisher.
Semnificația statistică a diferenței dintre valorile medii a fost testată prin Mann-Whitney U-test
pentru probele nepereche.
Analiza statistica si a distributiei rezultatelor secventierii
In Tabelul 1 este redat un exemplu de rezultate statistice calculate in urma secventietii unui
esantion tisular.
Tabel 1: Statistica datelor pentru o proba
Nota:
1. Regiunea din vecinatatea tintei se refera la regiunile adiacente nu mai departe de 200 pb
fata de regiunea tinta.
2. Citirile efective inseamna cartarea citirilor dupa procesul de indepartare al duplicatilor.
Bazele efective inseamna bazele din citirile efective.
3. Regiunile tinta utilizate aici se refera la regiuni genomice pe care array-ul exomomic de fapt
l-a acoperit.
62
4. Citirile cartate unic : citirile alinierii a calitatii cartografierii >= 1.
Distributia profunzimii secventierii per baza si distributia cumulativa a profunzimii in regiunile tinta
au fost de asemenea reprezentate grafic mai jos (Tabelul 2 si Figura 13).
63
Tabel 2 si Figura 13: Statistica de distributie pentru o proba
Distributia profunzimii secventierii per baza a urmat aproximativ o distributie Poisson, care arata ca
regiunea tinta de capturare a exomului a fost uniform esantionata. Axa x indica profunzimea
secventierii, in timp ce axa y indica procentul regiunii tinta totala sub o anumita profunzime a
secventieri.
Intre timp in graficul distributiei cumulative a profunzimii din regiunile tinta, axa x indica adancimea
secventierii si axa y indica fractia de baze care atinge sau depaseste o anumita profunzime a
secventierii.
Statistica SNPs
Dupa ce SNPs sunt identificate, s-a utilizat ANNOVAR pentru a face adnotarile si clasificarea (Tabelul
3).
Nota: Valoarea din prima coloana se ghideaza dupa urmatoarele prioritati:
exonic=splicing>ncRNA>>UTR5/UTR3>intron>upstream/downstream>intergenic.
1. Hom-homozigot; Het-heterozigot;
64
2. Exonic se refera numai la portiunea codanta, dar nu si la portiunea UTR, dupa cum exista 2
cuvinte UTR5 si UTR3 care sunt special rezervate pentru adnotarile UTR.
3. Stopgain inseamna ca un SNV nonsinonim care a condus la imediata creare a codonului stop
la situsul variant, iar stoploss inseamna ca a condus la o eliminare imediata a codonului stop
la situsul variant.
4. Splicing-ul in ANNOVAR este definit ca varianta care este la 2 bp departare de o limita
exon/intron
5. Daca o varianta este localizata atat in regiunea exonic cat si la joctiunea de splicing, atunci
au fost calculate atat exonii cat si splicingul (“exonic and splicing”).
6. Termenii upstream si downstream sunt definiti ca fiind la 1kb departare de situsul de start al
transcrierii sau situsul de terminare a acesteia.
7. SIFT (Sortarea tolerantului de intolerant) prezice daca o substitutie a unui aminoacid
afecteaza functia proteica.
8. Ti se refera la tranzitie, TV se refera la transversie.
Tabel 3: Statistica SNP-urilor pentru o proba
65
Statistica in Analiza In/Del
Dupa ce InDel-urile sunt identificate utilizam ANNOVAR pentru a face adnotarile si clasificarea
(Tabelul 4 si Figura 14).
Nota: Valoarea din prima coloana se ghideaza dupa urmatoarele prioritati:
exonic=splicing>ncRNA>>UTR5/UTR3>intron>upstream/downstream>intergenic.
1. Mutatiile de tip frameshift inseamna o insertie sau o deletie a uneia sau a mai multor
nucleotide care cauzeaza schimbari de tip frameshift in secventa proteica codanta.
2. Mutatiile de tip nonframeshift inseamna o insertie sau o deletie a 3 sau multiplu de 3
nucleotide care nu cauzeaza schimbari de tip frameshift in secventa proteica codanta.
3. Substitutia in bloc de tip frameshift sau nonframeshift inseamna ca o susbtitutie in bloc a
uneia sau a mai multor nucleotide care (nu) cauzeaza schimbari de tip frameshift in secventa
proteica codanta.
4. Exonic se refera doar la portiunea exonica codanta, dar nu si la portiunea UTR, dupa cum
exista 2 cuvinte UTR5 si UTR3 care sunt special rezervate pentru adnotarile UTR.
5. Stopgain se refera la o insertie sau o deletie de tip frameshift, o insertie sau o deletie de tip
nonframeshift sau o substitutie in bloc care conduce la o creare imediata de codon stop la
situsul variant. Pentru mutatii de tip frameshift, crearea unui codon stop downstream de
variant nu va fi considerat ca “stopgain”. In timp ce stoploss se refera la faptul ca se produce
o eliminare imediata a codonului stop la situsul variant.
6. Splicing-ul in ANNOVAR este definit ca varianta si care este la 2 bp departare de o legatura
exon/intron
7. Daca o varianta este localizata atat in regiunea exonic cat si la joctiunea de splicing atunci va
fi calculate atat ca exon cat si ca splicing (“exonic and splicing”).
8. Termenii upstream si downstream sunt definiti ca fiind la 1kb departare de situsul de start al
transcrierii sau situsul de terminare a acesteia.
66
Tabel 8 si Figura 10: Statistica InDel pentru o proba
Secventierea exomului (Whole exome sequencing)
Dupa analiza calitativa a esantioanelor recoltate, doar 15 pacienti au indeplinit aceste criterii.
Pacientii ai caror ganglioni mediastinali tumorali pre-chimioterapie sunt analizabili se impart in:
- Lotul A - 9 pacienti care nu au raspuns la chemioterapie, au avut raspunsuri minore sau au
fost doar stabilizati prin chimioterapie neoadjuvanta.
- Lotul B – 6 pacienti care au avut un raspuns obiectiv la chimioterapie neoadjuvanta.
Mediile numarului de secventieri a tintei per fiecare proba analizata, exprimate procentual, sunt
prezentate in tabelul de mai jos (Tabelul 16):
67
Proba Procent (%)
LOT A_11B00790 50.72
LOT A_11B02611 65.75
LOT A_11B02967 57.72
LOT A_11B04855 57.23
LOT A_11B04906 61.05
LOT A_12B05696 58.44
LOT A_LUN85_1 66.85
LOT A_LYN77_1 60.65
LOT A_LYN84 65.56
LOT B_11B01622 65.85
LOT B_12B03834 65.8
LOT B_LUN49_1 65.96
LOT B_LYN 101_1 65.66
LOT B_LYN43_1 63.28
LOT B_LYN48_1 58.82
Tabel 16 : Mediile numarului de secventieri a tintei per proba
In Tabelul 17 sunt prezentate numarul total de SNP obtinute prin secventiere in fiecare proba
analizata:
Proba Numar total SNP
LOT A_11B00790 79698
LOT A_11B02611 88013
LOT A_11B02967 78338
LOT A_11B04855 87236
68
LOT A_11B04906 84855
LOT A_12B05696 80321
LOT A_LUN85_1 82614
LOT A_LYN77_1 81344
LOT A_LYN84 84592
LOT B_11B01622 78490
LOT B_12B03834 84547
LOT B_LUN49_1 85919
LOT B_LYN 101_1 86017
LOT B_LYN43_1 76863
LOT B_LYN48_1 81829
Tabel 17 : Numarul total de SNP per proba
In tabelul de mai jos (Tabelul 18) sunt prezentate numarul total de In/Del obtinute prin secventiere
in fiecare proba analizata:
Proba Numar total In/Del
LOT A_11B00790 8557
LOT A_11B02611 10285
LOT A_11B02967 8804
LOT A_11B04855 9983
LOT A_11B04906 9826
LOT A_12B05696 9046
LOT A_LUN85_1 9672
LOT A_LYN77_1 9707
69
LOT A_LYN84 10254
LOT B_11B01622 9050
LOT B_12B03834 9547
LOT B_LUN49_1 9911
LOT B_LYN 101_1 10050
LOT B_LYN43_1 8898
LOT B_LYN48_1 9000
Tabel 18 : Numarul total de In/Del per proba
S-a identificat un numar de 216 gene cu mutaţii cu un p-value ≤ 0.05 care sunt associate cu
fenotipul cancerului bronho-pulmonar cu cellule non-mici (Figura 14).
Figura 14: Genele identificate, cu p value semnificativ statistic, prin whole genome sequencing
intre loturile de pacienti analizati
TOTAL = 216 gene
P-value< 0.05 – 211 gene
P-value<0.01 – 5 gene
70
Selecţia genelor cu p-value ≤ 0.01 (Tabel 19), a condus la identificarea SNP-urilor pentru genele
SENP5 (rs63736860 si rs1602), RGP1 (rs1570248), NCBP2 (rs553783), SLFN12L (rs2304968 si
rs9905892) si GBA2 (rs3833700) care permit identificarea pacienţilor cu raspuns la tratament
chimioterapeutic neoadjuvant versus pacienţii cu răspuns minor la tratament chimioterapeutic
neoadjuvant (Tabel 20).
Mutaţiile SENP5 (rs63736860 si rs1602) si NCBP2 (rs553783) sunt identificare cu o frecvenţă mult
mai crescută la pacienţii cu raspuns minor la tratament, în timp de mutaţiile RGP1 (rs1570248),
SLFN12L (rs2304968 si rs9905892) şi GBA2 (rs3833700) sunt identificate cu o frecvenţă mult mai
mare la pacienţii cu răspuns obiectiv la tratamentul de inductie.
Astfel prezenţa SNP-urilor menţionate pentru genele SENP5 şi NCBP2 pot indica un non-raspuns la
tratament, în timp ce prezenţa SNP-urilor meţionate pentru genelor RGP1, SLFN12L si GBA2 pot
indica un răspuns pozitiv la tratamentul chimioterapeutic neoadjuvant.
Numarul cromozomului
ID REF ALT LOTA* (Alt_freq)
LOTB** (Alt_freq)
Valoare P***
Simbolul genei
Numele complet al genei
chr3
rs63736860 CT C 1 0.5 0.0015 SENP5 SUMO1/sentrin specific peptidase 5
chr3
rs1602 G A 0,95 0,5 0.008 SENP5
chr9
rs1570248 C T 0,5 1 0.0040 RGP1 Retrograde Golgi Transport Homolog (S. Cerevisiae)
chr3
rs553783 A G 0,95 0.5 0.0057 NCBP2 Nuclear Cap Binding Protein Subunit 2
71
chr17
rs2304968 T C 0,54 1 0.0058 SLFN12L Schlafen Family Member 12-Like chr17
rs9905892 T A 0,54 1 0.0058 SLFN12L
chr9 rs3833700 G GC 0,55 1 0.009 GBA2 Glucosidase, Beta (Bile Acid) 2
*LOT A- include pacientii cu raspuns minor la tratament **LOT B- include pacientii cu raspuns la tratament ***Valoarea P a fost calculatea conform testului Fischer
Tabelul 19. Gene cu mutaţii cu un p-value ≤ 0.01
ID dbSNP
rs63736860 GTGCCACTGAAGTGTTTCTGGGACC[-/T]TTTTTTTTGCAGTACTGCAAGTGCC
rs1602 ATAACCTCCAGTGAGACATGGATGA[C/T]ACCCACACTTCACTCTTGATCCCTG
rs1570248 AAACCCTAACCTCTACTCTCATCTC[C/T]GTTCCCTCTCAGCATTACCTCTCCA
rs553783 GGGTAGAGCTGAGAGTGGTAGCTCA[C/T]AAGCGTCCCTGCACTCGTCCCTACG
rs2304968 ACATCATCACCTGTCTCCCAGAGTT[A/G]TCCTCTTCGTGAATATATTAACTTC
rs9905892 GAGCCGTTAGAATAGGAGTTAAGCC[A/T]GAGAGACAGCAAATTCTGCATTATG
rs3833700 CTGAGAGTGGCCAGAGCTGGGGGAG[-/C]AGACACAGAAGGGAGGCAGGGAATG
Tabel 20. Secventa SNPs (Single Nucleotid Polymorphism)
72
Mutatiile SENP5 (rs63736860 si rs1602) si NCBP2 (rs553783) sunt identificare cu o frecventa mult
mai crescuta la pacientii fara raspuns la tratament, in timp de mutatiile RGP1 (rs1570248), SLFN12L
(rs2304968 si rs9905892) si GBA2 (rs3833700) sunt identificate cu o frecventa mult mai mare la
pacientii cu raspuns la tratament.
Astfel prezenta SNP-urilor mai sus mentionate pentru genele SENP5 si NCBP2 pot indica un non-
raspuns la tratament, iar prezenta SNP-urilor mai sus mentionate a genelor SLFN12L si GBA2 pot
indica un raspuns pozitiv la tratamentul chimioterapeutic neoadjuvant.
Mutatii la nivelul acestor gene nu au fost depistate pana in present in asociatie cu cancerul
pulmonar cu cellule non-mici.
SENP5 (Sentrin-specific protease 5), EC=3.4.22.68 (Figura 15), face parte din familia de protease cu
SUMO-specificitate (SENP). SENP participa in reglarea SUMOilarii prin generarea unor small
ubiquitin-related modifiers (SUMO) pentru conjugarea proteinelor (clivareaa endopeptidazelor) si
deconjugarea tintelor (clivarea izopeptidazelor). Boli asociate modificarilor la nivelul SENP5 sunt
carcinomul oral cu celule squamoase si carcinomul cu celule squamoase.
Figura 15. Reteaua generata de programul String 9.05 pentru SENP5
73
NCBP2 (Nuclear Cap Binding Protein Subunit 2), component a complexului de legare a proteinei cap,
care se leaga la capatul 5`al pre-miRNA si este implicate in procese variate precum splicingul pre-
miRNA, reglarea translatiei, degradarea mARN, silentiere geneica mediata de microARN si exportul
mARN (Figura 16).
Figura 16. Reteaua generata de programul String 9.05 pentru NCBP2
RGP1 (RGP1 retrograde golgi transport homolog), poate fi necesar pentru fuziunea eficenta a
veziculelor derivate din endozomilor cu aparatul Golgi (Figura 17).
Boli associate cu modificari la nivelul RGP1 include boala periodontala si periodontita.
74
Figura 17. Reteaua generata de programul String 9.05 pentru RGP1
GBA2 (Beta Glucosidase) se gaseste in reticulul endoplasmatic si membrane aparatului Glogi fiinf
implicate in metabolismul sfingolipidelor (Figura 18). Mutatii la nivelul acestei gene sunt ascociate
cu boala Gaucher.
Functia enzimei GBA2 este de a hidroliza, la nivelul ficatului, acid 3-O-glucozidaza din bila, ca si
compus endogen, dar si de a hidroliza glucozilceramidele.
De exemplu, soarecii deficienti GBA2 prezinta acumularea de GlnCer in diferite tesuturi.
Figura 18. Reteaua generata de programul String 9.05 pentru GBA2
75
SLFN12L (schlafen family member 12-like) este implicate in legarea dependent de ATP si
preferential exprimata in tesuturile limfoide (Figura 19).
Modificari la nivelul SLFN12L sunt associate cu diabetul de tip 1.
Figura 19. Reteaua generata de programul String 9.05 pentru SLFN12L
76
A8. Validarea tehnicilor de Tissue-Array pe limfoganglion in aprecierea
prognosticului
- Validarea tehnicilor de Tissue-Array in comparatie cu tehnicile de micro-array
Experimentele de tissuearray
Tehnica Tissue Array (Figura 9) folosita in cadrul proiectului de cercetare a permis analiza pe aceeasi
lama histologica a unor probe tisulare apartinand unor pacienti diferiti.
Prin aceasta tehnica s-a urmarit identificarea nivelului de expresie a celor cinci proteine cofidicate
de genele la nivelul carora s-au identificat mutatii in experimentul de secventiere intre cele doua
loturi de paciente analizati.
Avantajele tehnicii Tissue Array.
1. Se pot preleva 80 de esantioane pe o lama histologica uzuala. In acelasi timp, se pastreza
dimensiunea de baza de la 1,5 mm in diametru pentru a ca tesutul prelevat pentru tehnica tissue-
array sa fie reprezentativ.
2. O lama de tissue-array poate conţine 200 de probe, reprezentând 200 de cazuri cu diametru de
1,0 mm.
3. Economisirea markerilor imunohistochimici.
4. Folosirea „bancilor de blocuri de parafina” in departamentele de patologie pentru o evalare
retrospectiva a noilor markeri tumorali pentru fiecare pacient . Detaliind, cu cat noile metode vor fi
aplicate mai repede in practica zilnica cu atat factorii de prognostic si tatament vor fi mai relevanti.
5. Majoritatea ramurilor de cercetare in cancer sunt focalizate pe tehnicile de Tissue Array.
Raspandirea folosirii Tissue Array va deveni o parte integranta in practica zilnica a cercetarii si in o
practica de rutina in laboratoarele clinice. Pe fundalul cazurilor de tumori arhivate, anatomo-
patologii vor putea folosi potentialul tehnologic al tissue array pentru a putea prezenta atat cazurile
arhivate cat si recente, comunitatii stiintifice.
77
6. Reducerea numarului de lame examinate
7.
Analiza probelor poate fi automatizata
8. Uniformitate experimentala
Materiale si metoda.
Din partea spitalului Hotel Dieu, Paris, Franta au fost aduse in Institutul Clinic Fundeni Bucuresti,
Romania 6 blocuri de parafina, respectiv lamele histologice corespunzatoare apartinand unui lot de
6 pacienti cu neoplazii maligne pulmonare.
Compararea rezultatelor I. Initial au fost analizate lamele histologice in vederea selectarii campului cel mai bine reprezentat
din punct de vedere tumoral. Ulterior s-au comparat blocurile de parafina cu lamele histologice
corespunzatoare in vederea corelarii imaginii microscopice cu cea macroscopica; acest pas a fost
extrem de important deoarece o buna orientare a materialului tisular conduce la o corecta recoltare
si deci la rezultate corecte.
II. In urmatoarea etapa s-a realizat un proiect pentru tissue array care sa cuprinda cele 6 blocuri
donoare de parafina si 2 blocuri receptor (cele 2 blocuri receptor formate sunt blocuri de parafina
identice). In total s-au realizat 16 punctii in blocurile de parafina, din care 4 au fost folosite pentru
orientare si cate 6 pentru fiecare bloc receptor.
78
Figura 9 : Aspecte preluate din software-ul echipamentului Tissue array
III. Ulterior s-a programat locul din blocul receptor in care ulterior au fost pozitionate fragmenele
recoltate din blocurile donor (Figura 10). Pentru orientare, s-a stabilit ca primele 2 pozitii din blocul
receptor sunt pozitii de control. In etapa actuala, s-au stabilit distantele fata de marginile blocurilor
de parafina la care s-au preformta locusurile in care s-au depuns automatizat, fragmentele de tesut
tumoral prelevat din blocurile de parafina donoare.
79
Figura 10 : Aspecte preluate din software-ul echipamentului Tissue array
IV. In aceasta etapa de lucru s-au pozitionat cele 6 blocuri de parafina donor, si cele 2 blocuri
receptor in caruselul MiniCore in locurile prestabilite (Figura 11). In pozitiile 1-6 ale caruselului s-au
fixat blocurile donor, iar in pozitiile 7-8 s-au fixat blocurile receptor (blocurile donor sunt marcate cu
albastru in programul informatic, iar cele receptor cu rosu).
Figura 11 : Aspecte preluate din software-ul echipamentului Tissue array
80
V. Este etapa efectiva in care dintr-o arie tumorala prestabilita s-au recoltat tesut tumoral conform
proiectului de Tissue microarray anteprezentat. Imaginile urmatoare prezinta in detaliu aria din care
s-a facut recoltarea (Figura 12).
Figura 12 : Blocul receptor realizat si aspecte microscopice (coloratie hematoxilina-eozina) ale
probelor analizate
81
DISCUTII
Cancerul pulmonar reprezinta una din principalele cauze de deces la nivel mondial de cancer [170],
de multe ori pentru că doar un număr redus de pacienți au la diagnosticul initial o tumoare în stadiu
incipient, care poate beneficia de rezectie chirurgicala. Aproximativ 30% din cazuri sunt intr-un
stadiu local avansat (stadiul III) la diagnosticul initial. Tratamentul optim pentru acești pacienți nu a
fost încă bine definit și depinde de mai multi factori [171]. Prognosticul pacientilor cu NSCLC in
Stadiul III tratati printr-o singur optiune terapeutica, cum ar fi chimioterapie, radioterapie sau
chirurgie, este în general prost. Rata de supravietuire la 5 ani pentru pacientii cu N2 clinic sau
dovedit histologic care au fost tratati numai prin rezectie chirurgicala este redusa, variind de 9-16%,
iar cei mai multi pacienti decedeaza prin recidive locale și sistemice după rezecția primară [172,
173]. Din aceste motive, tratamentul pacientilor cu N2 pozitiv ramane controversat; deși cei mai
multe chirurgi cred că există un rol important pentru chirurgie în tratamentul acestei boli, există o
lipsă de consens în ceea ce privește extinderea rezecției, rolul downstagingului și regimurile optime
de chimioterapie si / sau iradiere care trebuie asociate.
Istorie și rolul terapiei de inductie
Primele utilizări ale chimioterapiei neoadjuvante dateaza de la sfârșitul anilor 1980, când a fost
limitată la cazuri de CPCNM local avansat (stadiul IIIA-N2-III B) și introduse in scopul de a imbunatati
rata de supravietuire redusa vazut observata în acest grup. O serie de studii prospectiv randomizate
și evaluări retrospective au arătat rate de supravietuire mai bune pentru pacientii care au primit
chimioterapie neoadjuvanta comparativ cu interventii chirurgicale ca monoterapie [147, 146-155].
Pe baza acestor date, în septembrie 2001, Societatea Europeana de Oncologie Medicala (ESMO) a
stabilit liniile directoare de tratament recunoscand chimioterapia neoadjuvanta ca tratament
standard pentru stadiul III rezecabil in CPCNM [174]. O meta-analiza recenta a 13 studii
randomizate controlate, incluzand 3224 pacienti, a confirmat oportunitatea acestor linii directoare,
demonstrand un beneficiu de supravietuire cu un HR de 0,84 (95% CI 0.77 - 0.92, p <0,0001) la
pacienții tratați cu chimioterapie neoadjuvanta comparativ cu interventia chirurgicale ca
monoterapie [175].
82
După diagnosticarea cancerului pulmonar, parametrii clinicopatologici cum sunt profilul histologic al
tumorii, stadializarea si localizarea metastazelor determina prognosticul bolii și alegerea
tratamentului [176,177]. Ghidurile de practică clinică actuale diferențiaza cancerul pulmonar cu
celule mici (CPCM) și cancerul pulmonar cu celule non-mici (CPCNM), precum și cele mai importante
subtipuri de CPCNM: carcinom cu celule scuamoase și non-scuamoase, rezultate din analizele de
histopatologie standard.
Analiza microarray a materialului tumoral rezecat permite realizarea unui profil molecular. Astfel,
bazat pe profilele de transcriptie, adenocarcinoamele (AC) pulmonare au putut fi stratificate în
subgrupuri moleculare care propun diverse caracteristici celulare si de prognostic [178-183]. In
raport cu unele similitudini de transcriptie ale unor carcinoame definite histologic (carcinom
bronchioalveolar, carcinom cu celule scuamoase, si carcinom cu celule mari), diferite paternuri de
expresia genica au fost asociate cu diferite subtipuri de adenocarcinom (respectiv bronchioid,
squamoid, magnoid) [181]. Recent, o clasificare arhitecturala a adenocarcinoamelor pulmonare
invazive a descris cinci modele predominante ce au fost dovedite ca fiind prognostice pentru
supraviețuire independent de stadiu [184,185]. Prezenta de mai multe patenuri histologice diferite
intr-o singura tumora împiedică evaluarea arhitecturii predominante. Mai mult, diferitele patenuri
histopatologice ale adenocarcinomului nu corespund neaparat cu un subtip molecular.
Analizele de subtip similare au fost efectuate pentru carcinoamele pulmonare cu celule scuamoase
(CCS) pentru estimarea prognosticului [186-188]. Clasificarea CCS in patru subtipuri de expresie
genica diferite (primitiv, clasic, secretoriu și bazal) generate de analizele microarray au fost
reproductibile prin analize microarray independente și prin secvențierea de ARN a aproximativ 600
de CCS [188,189]. Subtipul primitiv a fost asociat cu prognosticul cel mai prost. Mai mult decât atât,
diferitele paternuri de expresie genica ale diferitelor subtipuri moleculare au fost correlate cu
starea de activare a proceselor biologice și celulare, și căile oncogene.
Mai multe studii pe baza de qPCR-și de microarray au identificat paternuri de miRNA specifice
subtipurilor de cancer pulmonar. De exemplu, clasificarea histologica a AC și CCS a fost realizata cu
un panel 34-miRNA pe blocuri de parafina la 205 fumatori de sex masculin [190].
In studiul de fata a fost investigata expresia genica si caile de semnalizare a pacientilor cu cancer
pulmonar cu cellule non-mici si invazia ganglionilor mesiastinali (stadiul IIIA, N2) in functie de
raspunsul histologic la tratamentul prin chimioterapie neoadjuvanta.
83
Nu s-au determinat gene corelate statistic semnificativ cu răspunsul la tratament. Nu s-a putut
determina un semnal de raspuns la chimioterapie nici prin clusterizarea, nici prin analiza
componentelor principale sau a expresiei genice.
In schimb, s-au determinat multe gene corelate cu statusul histologic al ganglionilor limfatici
mediastinali precum si in raport cu sexul pacientilor. Genele cele mai variabile ale pacientilor
responders sunt in legatura cu keratinizarea, iar cele ale pacientilor non-responders, in legatura cu
stimularea hormonala si activitatea peptidazei. Patenul de expresie genica a pacientilor de sex
masculin se confundă cu răspunsul la chimioterapie în acest studiu.
Analiza cailor moleculare folosind analiza de impact și studiind modificări ale tuturor genelor a dus
la unele rezultate convingătoare in legatura cu mecanismele de răspuns la chimioterapie.
Această analiză sugerează că diferența dintre responders si non-responders se gaseste în reglarea
mecanismelor imunitare. Toate caile care au fost semnificative pentru răspunsul la chimioterapie s-
au suprapus peste cele care sunt, de asemenea, semnificative pentru diferenta între bărbați și
femei. Pe de alta parte, luând în considerare numai pacientii de sex masculin, au rămas
semnificative trei cai de reglare a mecanismelor imunitare: poliartrita reumatoida, tiroidita
autoimuna, și calea de semnalizare a Citokinelor.
Acumularea totala de perturbare in calea poliartritei reumatoide a fost, în esență, aceeași pentru
responders si non-responders, si pentru pacientii de sex feminin comparativ cu cei de sex masculin.
Acumularea totală perturbare in calea tiroiditei autoimune a fost similară în ceea ce privește
activitatea celulelor T, dar diferita intre responders si non-responders în ceea ce privește răspunsul
imun și inflamator, și apoptoza. Acumularea totala de perturbare pe calea de semnalizare a
Citokinelor a fost inhibata în întregime la non-responders fata de responders, dar a fost în întregime
activata la femei comparativ cu bărbații.
Observațiile rezultate din analiză cailor moleculare sugereaza ca hormonii sexuali si raspunsul la
chimioterapie ar putea fi interconectate. Semnificativitatea termenilor GO a stimulusului hormonal
printre genele cu varianta mare la non-responders susține această ipoteză. Având în vedere că
acumularea totală de perturbare in poliartrita reumatoida este similară cu cea a răspunsului la
chimioterapie, este interesant de observat că estrogenul și citokina CCL13 sunt implicate in
severitatea poliartritei rheumatiode datorata deregularii apoptozei [191]. Nilsson [192] arata
importanța estrogenilor (atât ERα și ERβ) în controlul evoluției inflamației, în special prin
84
modificarea comportamentului leucocitelor, și prin down-regularea citokinelor și a adeziunii
moleculare. Hohla si colab. [33] a constatat că sexul feminin este asociat cu un răspuns favorabil la
chimioterapie in cancerul pancreatic. Rodriguez-Lara și colab. [194] a aratat că adenocarcinoamele
pulmonare exprima in exces ERβ, precum și citokinele CXCL12 și CXCL4 față de tesutul pulmonar
normal, și că aceasta supra-expresie este mai pronunțata la femeile aflate in premenopauza, care
au un risc crescut, decât la femeile în postmenopauză sau la bărbați. Cercetarile lui Szymanowska-
Narloch si colab. [195] arata utilitatea potențială a terapiei hormonale in CPCNM la pacienti
selectati.
Factori de prognostic
Mai multi factori au dovedit imbunatatirea supravietuirii fara boala si supravietuirii globala la
pacientii tratati cu chimioterapie neoadjuvanta, cum sunt: răspunsul clinic și histologic la
chimioterapie, rezecția completa a tumorii și downstagingul mediastinal [173-175,196]. Ca urmare,
în anii ‘90 au fost efectuate studii de faza II incluzand pacienti cu CPCNM in stadiul IIIA-N2/IIIB
utilizand diferite regimuri de radiochimioterapie, cu scopul de a creste rata de downstaging
mediastinal și astfel, creșterea procentului de rezectie chirurgicala completa [149, 151, 152]. În
ciuda unui procent mai mare de downstaging obținut în aceste studii, cu o rată de rezectie
chirurgicala completa ce se apropie de 93%, si o rata de raspuns complet la chimioterapie între 15 și
24%, a existat o ușoară creștere în morbiditatea și / sau mortalității perioperatorie, fără nici o
creștere semnificativă a ratei de supravietuire, comparativ cu studiile anterioare. Într-un studiu de
faza III al Intergrupului 0139, 396 de pacienti cu CPCNM in stadiul IIIA-N2 au fost randomizati, fie
pentru tratament prin radiochimioterapie neoadjuvanta urmata de rezectie chirurgicala si
chimioterapie adjuvanta de consolidare, fie pentru a radiochimioterapie concomitenta definitiva.
Rata mediana de supravietuire globala in grupul neoadjuvant versus grupul radiochimioterapie
singura nu diferă semnificativ (supravietuire la 5 ani de 27 vs 20%, risc relativ 0,63; 95% CI 0.36-
1.10). Cu toate acestea, o analiză de subgrup a relevat un avantaj statistic semnificativ al ratei de
supravietuire la 5 ani pentru pacientii care au fost tratati prin radiochimioterapie neoadjuvanta si
lobectomie, comparativ cu cei care au fost tratati doar prin radiochimioterapie (36 și 18%, respectiv,
p = 0,002), si a determinat un rol prognostic negativ in caz de pneumectomie [146]. Astfel, o re-
85
evaluare corecta a pacienților după terapie neoadjuvanta, in mod special a statutului ganglionilor
mediastinali, este de o importanță capitală. În experiența noastră, toți pacienții au avut o
confirmare histologica a statusului ganglionilor limfatici înainte de începerea tratamentului de
inducție, prin abordare chirurgicala (mediastinoscopie sau toracoscopie) și, prin urmare,
reevaluarea nu a fost chirurgicala, ci prin examene radiologice (scanare CT toracic și / sau PET-CT).
Îmbunătățirea metodelor bronhoscopice neinvazive pentru examinarea ganglionilor limfatici ar
putea ajuta în viitor, pentru o mai bună evaluare a răspunsului patologic după tratamentul
neoadjuvant, prin combinarea tehnicilor neinvazive înainte de tratament și biopsii chirurgicale
invazive dupa tratament, evitându-se astfel re-mediastinoscopia . Spre deosebire de Liao și colab.
[197], in studiul nostru am găsit nici o diferență intre raspunsul la chimioterapia de inductie la
pacientii cu carcinom de celule scuamoase fata de pacienți cu adenocarcinom.
Screeningul si validarea biomarkerilor moleculari capabili de a prezice raspunsul la diferiti agenti-
chimioterapeutici constituie un pas important spre un tratament personalizat pentru bolnavii de
cancer. În domeniul de biomarkerilor de prognostic, progresele in tehnicile de secventiere și analiza
microarray a genomului tumoral au permis identificarea de semnaturi moleculare si genice care pot
determina o clasificare mai precisă și pronosticare a cancerului pulmonar [198-200]. A fost
raportata o semnătură de cinci gene strâns asociata cu perioada libera de recidiva și cu
supraviețuirea globala la pacientii cu CPCNM, precum si o semnătura de 54 de gene ce ar putea
prezice riscul de recidiva in CPCNM [199]. Cu toate acestea, până în prezent, în domeniul de
biomarkerilor de predictie a chemosensibilitatii, nu există încă nici o semnatura genica c ear putea fi
utilizata pentru personalizarea chimioterapiei in cancerul pulmonar.
În studiul de față, am realizat prin secventierea intregului exom tumoral al pacientilor cu CPCNM in
stadiul IIIA, si am izolat un grup de cinci gene asociate semnificativ pacientilor care au un răspuns
pozitiv la tratamentul chimioterapeutic neoadjuvant (RGP1, SLFN12L si GBA2) si pacientilor care nu
au răspuns la tratamentul chimioterapeutic neoadjuvant (SENP5 şi NCBP2).
86
Directii de viitor
Progrese continue în tehnologii experimentale și bioinformatica sunt în dezvoltare pentru
explorarea genomului. Platformele de astăzi, care sunt, în esență, limitate la replicarea de secvențe
de nucleotide ADN-ului, ar putea fi înlocuite cu sisteme capabile să capteze ADN-ul cu modificari
epigenetice [201]. Sunt necesare instrumente analitice mai bune pentru a facilita detectarea
sensibilă a mutațiilor cheie și a realiza cataloage complete de date de genom, ceea ce va putea
facilita diseminarea acestor cunoștințe către comunitățile științifice si medicale [202]. Alte progrese
tehnologice, cum ar fi secventierea unei singure celule, sunt susceptibile de a ne ajuta sa intelegem
complexitatea și heterogenitatea genomului tumoral [203].
Mai mult decât atât, o deplina înțelegere a relațiilor complexe dintre caile intracelulare de activare
și mutațiile existente, împreună cu procesele de mutageneză care stau la baza, va putea ghida
dezvoltarea de terapii cu tintita moleculara. Pe masura ce secventierea genomului devine
disponibila pe scară largă și interpretabila cu mare precizie, la un cost redus, aceste informații vor fi
din ce în ce util pentru clinicieni, și mai important, pentru pacientii lor.
CONCLUZII
În concluzie, analiza cailor moleculare sugerează că diferența dintre responders si non-responders se
gaseste în reglarea mecanismelor imunitare. Trei cai de reglare a mecanismelor imunitare au reiesit
semnificative: poliartrita reumatoida, tiroidita autoimuna, și calea de semnalizare a Citokinelor.
Căile de semnalizare identificate cu FDR (false discovery rate) < 0.005 includ: căile de semnalizare a
citokinelor, adeziune focală sau interacţia ECM-receptor.
Pe de alta parte, observațiile rezultate din analiză cailor moleculare sugereaza ca hormonii sexuali si
raspunsul la chimioterapie ar putea fi deasemeni interconectati.
O mai bună înțelegere a relației dintre diversitatea histopatologică a tumorilor pulmonare,
caracteristicile moleculare si evolutia bolii, va contribui la dezvoltarea patologiei moleculara si a
biomarkerilor.
87
Cercetarile pentru determinarea unor semnături specifice de expresie a genelor, mutații genice și
alte modificări genomice, sunt promitatoare si vor permite identificarea de biomarkeri și de tinte
terapeutice adresate diferitelor tipuri de arhitecturi tumorale.
Mutaţiile RGP1 (rs1570248), SLFN12L (rs2304968 si rs9905892) şi GBA2 (rs3833700) sunt
identificate cu o frecvenţă mult mai mare la pacienţii cu răspuns obiectiv la tratamentul de inductie.
Instituirea acestei semnatura genice compuse din trei gene ca un nou model de estimarea a
sensibilitatii la tratamentul prin chimioterapie neoadjuvanta, asociata semnificativ pacientilor care
au un răspuns pozitiv la tratamentul chimioterapeutic neoadjuvant pe baza de saruri de platina,
constituie un nou pas către realizarea unui tratament individualizat la pacientii cu CPCNM.
Rezultatele noastre sugereaza ca un pacient cu CPCNM stadiu IIIA, care are un nivel ridicat al
indicelui de semnatura a celor trei gene, ar fi un candidat ideal pentru a primi un tratament de
inductie prin chimioterapie dubla, asociind cel putin o sare de platina. Aceste constatări sunt pre-
liminare și doar sugestive în acest moment, și această aceasta semnătură de trei gene trebuie să fie
validate înainte de a fi utilizate în practica clinică de rutina. Este necesara realizarea unui studiu
clinic în scopul de a valida rolul unui tratament personalizat pe baza acestei semnături de trei gene.
Secventierea exonului cancerului pulmonar a permis intelegerea multor mecanisme ale
oncogenezei.
Mai multi factori influenteaza aceste experimente, inclusiv pierderea de putere in a detecta
mutațiile somatice specific tumorale în prezența contaminarii stromale și o capacitate limitata de a
detecta mutații la un subset de secvențe de codificare. Scaderea costul legate de secventiere a
permis lansarea recenta a proiectelor de secventiere a întregului exome și a întregului genom al
cancerului pulomnar, care permite o analiză a mutatiilor intr-o maniera complet imparțiala. Mai
mult decât atât, colectarea datelor rezultate prin metodele de secventiere next-generation, este
"digitala", realizata pentru fiecare molecula, astfel încât capacitatea de a detecta alelele de slaba
abundenta, fie din cauza contaminarii stromale sau datorita heterogenitatii tumorii, depinde doar
de capacitatea de acoperire. Generarea datelor de secventiere a întregului exome și a întregului
genom de la un număr tot mai mare de probe, se va putea realiza o imagine mai globală a mutațiilor
somatice in cancerul pulmonar, oferind o imagine de ansamblu a genomului cancerului pulmonar și
o orientare adecvata a obiectivelor terapeutice.
88
BIBLIOGRAFIE 1. Jemal A, Siegel R, Xu J, Ward E. Cancer statis- tics, 2010. CA Cancer J Clin. 2010;60:277-300.
2. Travis WD, Travis LB, Devesa SS. Lung cancer. Cancer. 1995;75:191-202. A multicenter phase II study of ganetespib monotherapy in patients with genotypically defined advanced non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2013 Jun 1;19(11):3068-77.
3. Sharma SV, Settleman J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and “oncogenic shock.” Biochem Pharmacol. 2010;80:666-73.
4. Weinstein IB. Cancer. Addiction to onco-genes: the Achilles heal of cancer. Science. 2002;297:63-4. 5. Ding L, Getz G, Wheeler DA, et al. Somatic mutations affect key pathways in lung adeno- carcinoma. Nature. 2008; 455:1069-75. 6. Gandhi J, Zhang J, Xie Y, et al. Alterations in genes of the EGFR signaling pathway and their relationship to EGFR tyrosine kinase inhibitor sensitivity in lung cancer cell lines. PLoS ONE. 2009;4:e4576. 7. Sun Y, Ren Y, Fang Z, et al. Lung adenocarci- noma from East Asian never-smokers is a disease largely defined by targetable oncogenic mutant kinases. J Clin Oncol. 2010;28:4616-20. 8. Schubbert S, Shannon K, Bollag G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nat Rev Cancer. 2007 Apr;7(4):295-308. Review. Erratum in: Nat Rev Cancer. 2007 Jul;7(7):563. 9. Brose MS, Volpe P, Feldman M, et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer Res. 2002 Dec 1;62(23):6997-7000. 10. Riely GJ, Kris MG, Rosenbaum D, et al. Frequency and distinctive spectrum of KRAS mutations in never smokers with lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res. 2008 Sep 15;14(18):5731-4. 11. Dogan S, Shen R, Ang DC, et al. Molecular epidemiology of EGFR and KRAS mutations in 3,026 lung adenocarcinomas: higher susceptibility of women to smoking-related KRAS-mutant cancers. Clin Cancer Res. 2012 Nov 15;18(22):6169-77. 12. Shepherd FA, Domerg C, Hainaut P, et al. Pooled analysis of the prognostic and predictive effects of KRAS mutation status and KRAS mutation subtype in early-stage resected non-small-cell lung cancer in four trials of adjuvant chemotherapy. J Clin Oncol. 2013 Jun 10;31(17):2173-81. 13. Riely GJ, Marks J, Pao W. KRAS mutations in non-small cell lung cancer. Proc Am Thorac Soc. 2009 Apr 15;6(2):201-5. 14. Socinski MA, Goldman J, El-Hariry I, et al. A multicenter phase II study of ganetespib monotherapy in patients with genotypically defined advanced non-small cell lung cancer. Clin
89
Cancer Res. 2013 Jun 1;19(11):3068-77. 15. Jänne PA, Shaw AT, Pereira JR, et al. Selumetinib plus docetaxel for KRAS-mutant advanced non-small-cell lung cancer: a randomised, multicentre, placebo-controlled, phase 2 study. Lancet Oncol. 2013 Jan; 14(1):38-47. 16. Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 2004 May 20;350(21):2129-39. Epub 2004 Apr 29. 17. Paez JG, Jänne PA, Lee JC, et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 2004 Jun 4;304(5676):1497-500. Epub 2004 Apr 29. 18. Pao W, Miller V, Zakowski M, et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Sep 7;101(36):13306-11. Epub 2004 Aug 25. 19. Ladanyi M, Pao W. Lung adenocarcinoma: guiding EGFR-targeted therapy and beyond. Mod Pathol. 2008 May;21 Suppl 2:S16-22. 20. Sordella R, Bell DW, Haber DA, Settleman J. Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways. Science. 2004 Aug 20;305(5687):1163-7. Epub 2004 Jul 29. 21. Cadranel J, Ruppert AM, Beau-Faller M, Wislez M. Therapeutic strategy for advanced EGFR mutant non-small-cell lung carcinoma. Crit Rev Oncol Hematol. 2013 Dec;88(3):477-93. 22. Chen Y, Takita J, Choi YL, et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 2008 Oct 16;455(7215):971-4. 23. George RE, Sanda T, Hanna M, et al. Look AT Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 2008 Oct 16; 455(7215):975-8.. 24. Janoueix-Lerosey I, Lequin D, Brugières L, et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 2008 Oct 16; 455(7215):967-70. 25. Mossé YP, Laudenslager M, Longo L, et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 2008 Oct 16;455(7215):930-5. 26. Morris SW, Kirstein MN, Valentine MB, et al. Fusion of a kinase gene, ALK, to a nucleolar protein gene, NPM, in non-Hodgkin's lymphoma. Science. 1994 Mar 4;263(5151):1281-4. 27. Lawrence B, Perez-Atayde A, Hibbard MK, et al. TPM3-ALK and TPM4-ALK oncogenes in inflammatory myofibroblastic tumors. Am J Pathol. 2000 Aug;157(2):377-84.
90
28. Choi YL, Takeuchi K, Soda M, et al. Identification of novel isoforms of the EML4-ALK transforming gene in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2008 Jul 1;68(13):4971-6. 29. Koivunen JP, Mermel C, Zejnullahu K, et al. EML4-ALK fusion gene and efficacy of an ALK kinase inhibitor in lung cancer. Clin Cancer Res. 2008 Jul 1; 14(13): 4275-83. 30. Rikova K, Guo A, Zeng Q, et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 2007 Dec 14;131(6):1190-203. 31. Soda M, Choi YL, Enomoto M, et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature. 2007 Aug 2;448(7153):561-6. 32. Takeuchi K, Choi YL, Togashi Y, et al. KIF5B-ALK, a novel fusion oncokinase identified by an immunohistochemistry-based diagnostic system for ALK-positive lung cancer. Clin Cancer Res. 2009 May 1;15(9):3143-9. 33. Mossé YP, Wood A, Maris JM. Inhibition of ALK signaling for cancer therapy. Clin Cancer Res. 2009 Sep 15;15(18):5609-14. 34. Kwak EL, Bang YJ, Camidge DR, et al. Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 2010 Oct 28; 363(18):1693-703. 35. Shinmura K, Kageyama S, Tao H, et al. EML4-ALK fusion transcripts, but no NPM-, TPM3-, CLTC-, ATIC-, or TFG-ALK fusion transcripts, in non-small cell lung carcinomas. Lung Cancer. 2008 Aug;61(2):163-9. 36. Takeuchi K, Choi YL, Soda M, et al. Multiplex reverse transcription-PCR screening for EML4-ALK fusion transcripts. Clin Cancer Res. 2008 Oct 15;14(20):6618-24.. 37. Wong DW, Leung EL, So KK, et al. University of Hong Kong Lung Cancer Study Group. The EML4-ALK fusion gene is involved in various histologic types of lung cancers from nonsmokers with wild-type EGFR and KRAS. Cancer.2009 Apr 15;115(8):1723-33. 38. Inamura K, Takeuchi K, Togashi Y, et al. EML4-ALK lung cancers are characterized by rare other mutations, a TTF-1 cell lineage, an acinar histology, and young onset. Mod Pathol. 2009 Apr;22(4):508-15. 39. Shaw AT, Yeap BY, Mino-Kenudson M, et al. Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer who harbor EML4-ALK. J Clin Oncol. 2009 Sep 10;27(26):4247-53. 40. Horn L, Pao W. EML4-ALK: honing in on a new target in non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2009 Sep 10; 27(26): 4232-5. 41. Wang R, Pan Y, Li C, et al. The use of quantitative real-time reverse transcriptase PCR for 5' and
91
3' portions of ALK transcripts to detect ALK rearrangements in lung cancers. Clin Cancer Res. 2012 Sep 1;18(17):4725-32. 42. Pailler E, Adam J, Barthélémy A, et al. Detection of circulating tumor cells harboring a unique ALK rearrangement in ALK-positive non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2013 Jun 20;31(18):2273-81. 43. To KF, Tong JH, Yeung KS, et al. Detection of ALK rearrangement by immunohistochemistry in lung adenocarcinoma and the identification of a novel EML4-ALK variant. J Thorac Oncol. 2013 Jul;8(7):883-91. 44. Gainor JF, Varghese AM, Ou SH, et al. ALK rearrangements are mutually exclusive with mutations in EGFR or KRAS: an analysis of 1,683 patients with non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2013 Aug 1;19(15):4273-81. 45. Boland JM, Jang JS, Li J, et al. MET and EGFR mutations identified in ALK-rearranged pulmonary adenocarcinoma: molecular analysis of 25 ALK-positive cases. J Thorac Oncol. 2013 May;8(5):574-81. 46. Bang YJ. Treatment of ALK-positive non-small cell lung cancer. Arch Pathol Lab Med. 2012 Oct;136(10):1201-4. 47. Camidge DR, Bang YJ, Kwak EL, et al. Activity and safety of crizotinib in patients with ALK-positive non-small-cell lung cancer: updated results from a phase 1 study. Lancet Oncol. 2012 Oct;13(10):1011-9. 48. Shaw AT, Dong-Wan Kim, M.D., Ph.D., et al. Crizotinib versus Chemotherapy in Advanced ALK-Positive Lung Cancer. N Engl J Med 2013; 368:2385-2394June 20, 2013. 49. Seto T, Kiura K, Nishio M, et al. CH5424802 (RO5424802) for patients with ALK-rearranged advanced non-small-cell lung cancer (AF-001JP study): a single-arm, open-label, phase 1-2 study. Lancet Oncol. 2013 Jun;14(7):590-8. 50. Camidge DR, Kono SA, Lu X, et al. Anaplastic lymphoma kinase gene rearrangements in non-small cell lung cancer are associated with prolonged progression-free survival on pemetrexed. J Thorac Oncol. 2011 Apr;6(4):774-80. 51. Shaw AT, Varghese AM, Solomon BJ, et al. Pemetrexed-based chemotherapy in patients with advanced, ALK-positive non-small cell lung cancer. Ann Oncol. 2013 Jan;24(1):59-66. 52. Sequist LV, Gettinger S, Senzer NN, et al. Activity of IPI-504, a novel heat-shock protein 90 inhibitor, in patients with molecularly defined non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2010 Nov 20;28(33):4953-60. 53. Solomon B, Wilner KD, Shaw AT. Current status of targeted therapy for anaplastic lymphoma
92
kinase-rearranged non-small cell lung cancer. Clin Pharmacol Ther. 2014 Jan;95(1):15-23. 54. Shigematsu H, Takahashi T, Nomura M, et al. Somatic mutations of the HER2 kinase domain in lung adenocarcinomas. Cancer Res. 2005 Mar 1;65(5):1642-6. 55. Stephens P, Hunter C, Bignell G, et al. Lung cancer: intragenic ERBB2 kinase mutations in tumours. Nature. 2004 Sep 30;431(7008):525-6. 56. Hynes NE, Lane HA. ERBB receptors and cancer: the complexity of targeted inhibitors. Nat Rev Cancer. 2005;5:341-54. 57. Li D, Ambrogio L, Shimamura T, et al. BIBW2992, an irreversible EGFR/HER2 inhib- itor highly effective in preclinical lung cancer models. Oncogene. 2008;27:4702-11. 58. Minami Y, Shimamura T, Shah K, et al. The major lung cancer-derived mutants of ERBB2 are oncogenic and are associated with sensitiv- ity to the irreversible EGFR/ERBB2 inhibitor HKI-272. Oncogene. 2007;26:5023-7. 59. Shimamura T, Ji H, Minami Y, et al. Non-small- cell lung cancer and Ba/F3 transformed cells harboring the ERBB2 G776insV_G/C muta- tion are sensitive to the dual-specific epidermal growth factor receptor and ERBB2 inhibitor HKI-272. Cancer Res. 2006;66:6487-91. 60. Wang SE, Narasanna A, Perez-Torres M, et al. HER2 kinase domain mutation results in consti- tutive phosphorylation and activation of HER2 and EGFR and resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Cell. 2006;10:25-38. 61. Baselga J, Swain SM. Novel anticancer targets: revisiting ERBB2 and discovering ERBB3. Nat Rev Cancer. 2009;9:463-75. 62. Perera SA, Li D, Shimamura T, et al. HER2YVMA drives rapid development of adenosquamous lung tumors in mice that are sensitive to BIBW2992 and rapamycin combination therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:474-9. 63. Lee JC, Vivanco I, Beroukhim R, et al. Epidermal growth factor receptor activation in glioblastoma through novel missense mutations in the extracellular domain. PLoS Med. 2006;3:e485. 64. Network CGAR. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 2008;455:1061-8. 65. Davies H, Bignell GR, Cox C, et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 2002 Jun 27;417(6892):949-54. 66. Pratilas CA, Hanrahan AJ, Halilovic E, et al. Genetic predictors of MEK dependence in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2008 Nov 15;68(22):9375-83.
93
67. Paik PK, Arcila ME, Fara M, et al. Clinical characteristics of patients with lung adenocarcinomas harboring BRAF mutations. J Clin Oncol. 2011 May 20;29(15):2046-51. 68. Marchetti A, Felicioni L, Malatesta S, et al. Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer harboring BRAF mutations. J Clin Oncol. 2011 Sep 10;29(26):3574-9. 69. Sasaki H, Shitara M, Yokota K, et al. BRAF and ERBB2 mutations correlate with smoking status in lung cancer patients. Exp Ther Med. 2012 May;3(5):771-775. Epub 2012 Mar 1. 70. Cardarella S, Ogino A, Nishino M, et al. Clinical, pathologic, and biologic features associated with BRAF mutations in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2013 Aug 15;19(16):4532-40. 71. Jørgensen JT. Targeted HER2 treatment in advanced gastric cancer. Oncology. 2010; 78(1): 26-33. 72. Graus-Porta D, Beerli RR, Daly JM, Hynes NE. ERBB-2, the preferred heterodimerization partner of all ERBB receptors is a mediator of lateral signaling. EMBO J. 1997 Apr 1; 16(7): 1647-55. 73. Buttitta F, Barassi F, Fresu G, et al. Mutational analysis of the HER2 gene in lung tumors from Caucasian patients: mutations are mainly present in adenocarcinomas with bronchioloalveolar features. Int J Cancer. 2006 Dec 1;119(11):2586-91. 74. Arcila ME, Chaft JE, Nafa K, et al. Prevalence, clinicopathologic associations, and molecular spectrum of ERBB2 (HER2) tyrosine kinase mutations in lung adenocarcinomas. Clin Cancer Res. 2012 Sep 15;18(18):4910-8. 75. Birchmeier C, Sharma S, Wigler M. Expression and rearrangement of the ROS1 gene in human glioblastoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Dec;84(24):9270-4. 76. Birchmeier C, O'Neill K, Riggs M, Wigler M. Characterization of ROS1 cDNA from a human glioblastoma cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Jun;87(12):4799-803. 77. Charest A, Lane K, McMahon K, et al. Fusion of FIG to the receptor tyrosine kinase ROS in a glioblastoma with an interstitial del (6)(q21q21). Genes Chromosomes Cancer. 2003 May;37(1):58-71. 78. McDermott U, Iafrate AJ, Gray NS, et al. Genomic alterations of anaplastic lymphoma kinase may sensitize tumors to anaplastic lymphoma kinase inhibitors. Cancer Res. 2008 May 1;68(9):3389-95. 79. Bergethon K, Shaw AT, Ou SH, et al. ROS1 rearrangements define a unique molecular class of lung cancers. J Clin Oncol. 2012 Mar 10;30(8):863-70.
94
80. Yoshida A, Kohno T, Tsuta K, et al. ROS1-rearranged lung cancer: a clinicopathologic and molecular study of 15 surgical cases. Am J Surg Pathol. 2013 Apr;37(4):554-62. 81. Go H, Kim DW, Kim D, et al. Clinicopathologic analysis of ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer and proposal of a diagnostic algorithm. J Thorac Oncol. 2013 Nov;8(11): 1445-50. 82. Davies KD, Le AT, Theodoro MF, et al. Identifying and targeting ROS1 gene fusions in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2012 Sep 1;18(17):4570-9. 83. Hammerman PS, Sos ML, Ramos AH, et al. Mutations in the DDR2 Kinase Gene Identify a Novel Therapeutic Target in Squamous Cell. Lung Cancer Cancer Discovery June 2011 1; 78 84. Ichikawa O, Osawa M, Nishida N, et al. I Structural basis of the collagen-binding mode of discoidin domain receptor 2. EMBO J. 2007 Sep 19; 26(18): 4168-76. Epub 2007 Aug 16. 85. Turner N, Grose R. Fibroblast growth factor signalling: from development to cancer. Nat Rev Cancer. 2010 Feb;10(2):116-29. 86. Freier K, Schwaenen C, Sticht C, et al. Recurrent FGFR1 amplification and high FGFR1 protein expression in oral squamous cell carcinoma (OSCC). Oral Oncol. 2007 Jan;43(1):60-6. Epub 2006 Jun 27. 87. Ishizuka T, Tanabe C, Sakamoto H, et al. Gene amplification profiling of esophageal squamous cell carcinomas by DNA array CGH. Biochem Biophys Res Commun. 2002 Aug 9; 296(1):152-5. 88. Gorringe KL, Jacobs S, Thompson ER, et al. High-resolution single nucleotide polymorphism array analysis of epithelial ovarian cancer reveals numerous microdeletions and amplifications. Clin Cancer Res. 2007 Aug 15; 13(16):4731-9. 89. Simon R, Richter J, Wagner U, et al. High-throughput tissue microarray analysis of 3p25 (RAF1) and 8p12 (FGFR1) copy number alterations in urinary bladder cancer. Cancer Res. 2001 Jun 1;61(11):4514-9. 90. Edwards J, Krishna NS, Witton CJ, Bartlett JM. Gene amplifications associated with the development of hormone-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 2003 Nov 1;9(14):5271-81. 91. Dutt A, Ramos AH, Hammerman PS, et al. Inhibitor-sensitive FGFR1 amplification in human non-small cell lung cancer. PLoS One. 2011;6(6):e20351. 92. Weir BA, Woo MS, Getz G, et al. Characterizing the cancer genome in lung adenocarcinoma. Nature. 2007 Dec 6;450(7171):893-8. Epub 2007 Nov 4. 93. Weiss J, Sos ML, Seidel D, et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Sci Transl Med. 2010 Dec
95
15;2(62):62ra93. 94. Kim HR, Kim DJ, Kang DR, et al. Fibroblast growth factor receptor 1 gene amplification is associated with poor survival and cigarette smoking dosage in patients with resected squamous cell lung cancer. J Clin Oncol. 2013 Feb 20; 31(6):731-7. 95. Turner NC, Seckl MJ. A therapeutic target for smoking-associated lung cancer. Sci Transl Med. 2010 Dec 15;2(62):62ps56. 96. Cooper CS, Park M, Blair DG, et al. Molecular cloning of a new transforming gene from a chemically transformed human cell line. Nature. 1984 Sep 6-11;311(5981):29-33. 97. Birchmeier C, Birchmeier W, Gherardi E, Vande Woude GF. Met, metastasis, motility and more. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003 Dec;4(12):915-25. 98. Peruzzi B, Bottaro DP. Targeting the c-Met signaling pathway in cancer. Clin Cancer Res. 2006 Jun 15;12(12):3657-60. 99. Schmidt L, Duh FM, Chen F, et al. Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Nat Genet. 1997 May;16(1):68-73. 100. Di Renzo MF, Olivero M, Martone T, et al. Somatic mutations of the MET oncogene are selected during metastatic spread of human HNSC carcinomas. Oncogene. 2000 Mar 16;19(12):1547-55. 101. Park WS, Dong SM, Kim SY, et al. Somatic mutations in the kinase domain of the Met/hepatocyte growth factor receptor gene in childhood hepatocellular carcinomas. Cancer Res. 1999 Jan 15;59(2):307-10. 102. Kong-Beltran M, Seshagiri S, Zha J, Zhu W, Bhawe K, Mendoza N, Holcomb T, Pujara K, Stinson J, Fu L, Severin C, Rangell L, Schwall R, Amler L, Wickramasinghe D, Yauch R. Somatic mutations lead to an oncogenic deletion of met in lung cancer. Cancer Res. 2006 Jan 1; 66(1):283-9. 103. Ma PC, Kijima T, Maulik G, et al. c-MET mutational analysis in small cell lung cancer: novel juxtamembrane domain mutations regulating cytoskeletal functions. Cancer Res. 2003 Oct 1;63(19):6272-81. 104. Nakajima M, Sawada H, Yamada Y, et al. The prognostic significance of amplification and overexpression of c-met and c-erb B-2 in human gastric carcinomas. Cancer. 1999 May 1;85(9):1894-902. 105. Miller CT, Lin L, Casper AM, et al. Genomic amplification of MET with boundaries within fragile site FRA7G and upregulation of MET pathways in esophageal adenocarcinoma. Oncogene. 2006 Jan 19;25(3):409-18.
96
106. Umeki K, Shiota G, Kawasaki H. Clinical significance of c-met oncogene alterations in human colorectal cancer. Oncology. 1999;56(4):314-21. 107. Beroukhim R, Getz G, Nghiemphu L, et al. Assessing the significance of chromosomal aberrations in cancer: methodology and application to glioma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Dec 11;104(50):20007-12. Epub 2007 Dec 6. 108. Yamamoto S, Tsuda H, Miyai K, et al. Gene amplification and protein overexpression of MET are common events in ovarian clear-cell adenocarcinoma: their roles in tumor progression and prognostication of the patient. Mod Pathol. 2011 Aug;24(8):1146-55. 109. Bean J, Brennan C, Shih JY, et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Dec 26;104(52):20932-7. Epub 2007 Dec 18. 110. Cappuzzo F, Jänne PA, Skokan M, et al. MET increased gene copy number and primary resistance to gefitinib therapy in non-small-cell lung cancer patients. Ann Oncol. 2009 Feb;20(2):298-304. 111. Onozato R, Kosaka T, Kuwano H, et al. Activation of MET by gene amplification or by splice mutations deleting the juxtamembrane domain in primary resected lung cancers. J Thorac Oncol. 2009 Jan;4(1):5-11. 112. Engelman JA, Zejnullahu K, Mitsudomi T, et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 2007 May 18;316(5827):1039-43. Epub 2007 Apr 26. 113. Kubo T, Yamamoto H, Lockwood WW, et al. MET gene amplification or EGFR mutation activate MET in lung cancers untreated with EGFR tyrosine kinase inhibitors. Int J Cancer. 2009 Apr 15;124(8):1778-84. 114. Okuda K, Sasaki H, Yukiue H, et al. Met gene copy number predicts the prognosis for completely resected non-small cell lung cancer. Cancer Sci. 2008 Nov;99(11):2280-5. 115. Onozato R, Kosaka T, Kuwano H, et al. Activation of MET by gene amplification or by splice mutations deleting the juxtamembrane domain in primary resected lung cancers. J Thorac Oncol. 2009 Jan;4(1):5-11. 116. Eder JP, Shapiro GI, Appleman LJ, et al. A phase I study of foretinib, a multi-targeted inhibitor of c-Met and vascular endothelial growth factor receptor 2. Clin Cancer Res. 2010 Jul 1;16(13):3507-16. 117. Benedettini E, Sholl LM, Peyton M, et al. Met activation in non-small cell lung cancer is associated with de novo resistance to EGFR inhibitors and the development of brain metastasis. Am
97
J Pathol. 2010 Jul;177(1):415-23. 118. Ichimura E, Maeshima A, Nakajima T, Nakamura T. Expression of c-met/HGF receptor in human non-small cell lung carcinomas in vitro and in vivo and its prognostic significance. Jpn J Cancer Res. 1996 Oct;87(10):1063-9. 119. Liu C, Tsao MS. In vitro and in vivo expressions of transforming growth factor-alpha and tyrosine kinase receptors in human non-small-cell lung carcinomas. Am J Pathol. 1993 Apr;142(4):1155-62. 120. Ma PC, Jagadeeswaran R, Jagadeesh S, et al. Functional expression and mutations of c-Met and its therapeutic inhibition with SU11274 and small interfering RNA in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2005 Feb 15;65(4):1479-88. 121. Nakamura Y, Niki T, Goto A, et al. c-Met activation in lung adenocarcinoma tissues: an immunohistochemical analysis. Cancer Sci. 2007 Jul;98(7):1006-13. Epub 2007 Apr 24. 122. Olivero M, Rizzo M, Madeddu R, et al. Overexpression and activation of hepatocyte growth factor/scatter factor in human non-small-cell lung carcinomas. Br J Cancer. 1996 Dec;74(12):1862-8. 123. Siegfried JM, Weissfeld LA, Luketich JD, et al. The clinical significance of hepatocyte growth factor for non-small cell lung cancer. Ann Thorac Surg. 1998 Dec;66(6):1915-8. 124. Xu L, Nilsson MB, Saintigny P, et al. Epidermal growth factor receptor regulates MET levels and invasiveness through hypoxia-inducible factor-1alpha in non-small cell lung cancer cells. Oncogene. 2010 May 6;29(18):2616-27. 125. Spigel DR, Burris HA 3rd, Greco FA, et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled, phase II trial of sorafenib and erlotinib or erlotinib alone in previously treated advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2011 Jun 20;29(18):2582-9. 126. Schubbert S, Shannon K, Bollag G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nat Rev Cancer. 2007 Apr;7(4):295-308. 127. Ohashi K, Sequist LV, Arcila ME, et al. Characteristics of lung cancers harboring NRAS mutations. Clin Cancer Res. 2013 May 1;19(9):2584-91. 128. Samuels Y, Wang Z, Bardelli A, et al. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science. 2004 Apr 23;304(5670):554. Epub 2004 Mar 11. 129. Kawano O1, Sasaki H, Endo K, Suzuki E, Haneda H, Yukiue H, Kobayashi Y, Yano M, Fujii Y. PIK3CA mutation status in Japanese lung cancer patients. Lung Cancer. 2006 Nov;54(2):209-15. Epub 2006 Aug 22.
98
130. Spoerke JM, O'Brien C, Huw L, et al. Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) pathway alterations are associated with histologic subtypes and are predictive of sensitivity to PI3K inhibitors in lung cancer preclinical models. Clin Cancer Res. 2012 Dec 15;18(24):6771-83. 131. Sequist LV, Waltman BA, Dias-Santagata D, et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 2011 Mar 23;3(75):75ra26. 132. Takahashi M, Ritz J, Cooper GM. Activation of a novel human transforming gene, ret, by DNA rearrangement. Cell. 1985 Sep;42(2):581-8. 133. Airaksinen MS, Titievsky A, Saarma M. GDNF family neurotrophic factor signaling: four masters, one servant? Mol Cell Neurosci. 1999 May;13(5):313-25. 134. Phay JE, Shah MH. Targeting RET receptor tyrosine kinase activation in cancer. Clin Cancer Res. 2010 Dec 15;16(24):5936-41. 135. Ciampi R, Nikiforov YE. RET/PTC rearrangements and BRAF mutations in thyroid tumorigenesis. Endocrinology. 2007 Mar;148(3):936-41. Epub 2006 Aug 31. 136. Salvatore D, Barone MV, Salvatore G, et al. Tyrosines 1015 and 1062 are in vivo autophosphorylation sites in ret and ret-derived oncoproteins. J Clin Endocrinol Metab. 2000 Oct;85(10):3898-907. 137. Pao W, Hutchinson KE.Chipping away at the lung cancer genome. Nat Med. 2012 Mar 6;18(3):349-51. 138. Ju YS, Lee WC, Shin JY, et al. A transforming KIF5B and RET gene fusion in lung adenocarcinoma revealed from whole-genome and transcriptome sequencing. Genome Res. 2012 Mar;22(3):436-45. 139. Kohno T, Ichikawa H, Totoki Y, et al. KIF5B-RET fusions in lung adenocarcinoma. Nat Med. 2012 Feb 12;18(3):375-7. 140. Takeuchi K, Soda M, Togashi Y, et al. RET, ROS1 and ALK fusions in lung cancer. Nat Med. 2012 Feb 12;18(3):378-81. 141. Lipson D, Capelletti M, Yelensky R, et al. Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies. Nat Med. 2012 Feb 12;18(3):382-4. 142. Verbeek HH, Alves MM, de Groot JW, et al. The effects of four different tyrosine kinase inhibitors on medullary and papillary thyroid cancer cells. J Clin Endocrinol Metab. 2011 Jun;96(6):E991-5. 143. Drilon A, Wang L, Hasanovic A, et al. Response to Cabozantinib in patients with RET fusion-positive lung adenocarcinomas. Cancer Discov. 2013 Jun;3(6):630-5.
99
144. Ruckdeschel JC. Combined modality therapy of non-small cell lung cancer. Semin Oncol
1997;24:429–39.
145. Stinchcombe TE, Fried D, Morris DE, Socinski MA. Combined modality therapy for stage III non-
small cell lung cancer. Oncologist 2006;11:809–23.
146. Albain KS, Swann RS, Rusch VW, Turrisi AT III, Shepherd FA, Smith C et al. Radiotherapy plus
chemotherapy with or without surgical resection for stage III non-small-cell lung cancer: a phase III
randomised controlled trial. Lancet 2009;374:379–86.
147. Sause W, Kolesar P, Taylor S IV, Johnson D, Livingston R, Komaki R et al. Final results of phase III
trial in regionally advanced unresectable non- small cell lung cancer: Radiation Therapy Oncology
Group, Eastern Cooperative Oncology Group, and Southwest Oncology Group. Chest 2000;117:358–
64.
148. RothJA,FossellaF,KomakiR,RyanMB,PutnamJBJr,LeeJSetal.Arando- mized trial comparing
perioperative chemotherapy and surgery with surgery alone in resectable stage IIIA non-small-cell
lung cancer. J Natl Cancer Inst 1994;86:673–80.
149. Albain KS, Rusch VW, Crowley JJ, Rice TW, Turrisi AT III, Weick JK et al. Concurrent
cisplatin/etoposide plus chest radiotherapy followed by surgery for stages IIIA (N2) and IIIB non
small cell lung cancer: mature results of Southwest Oncology Group Phase II Study 8805. J Clin
Oncol 1995;13:1880–92.
150. Rosell R, Gómez-Codina J, Camps C, Maestre J, Padille J, Cantó A et al. A randomized trial
comparing preoperative chemotherapy plus surgery versus surgery alone in patients with non-
small-cell lung cancer. N Engl J Med 1994;330:153–8.
151. StraussGM,LangerMP,EliasAD,SkarinAT,SugarbakerDJ.Multimodality treatment of stage IIIA
non-small-cell lung carcinoma: a critical review of the literature and strategies for future research. J
Clin Oncol 1992;10: 829–38.
152. Albain KS. Induction chemotherapy with/without radiation followed by surgery in stage III non-
100
small-cell lung cancer. Oncology 1997;11:51–7.
153. Rosell R, Gómez-Codina J, Camps C, Javier Sánchez J, Maestre J, Padilla J et al. Preresectional
chemotherapy in stage IIIA non-small-cell lung cancer: a 7-year assessment of a randomized
controlled trial. Lung Cancer 1999;26:7–14.
154. Martini N, Kris MG, Flehinger BJ, Gralla RJ, Bains MS, Burt ME et al. Preoperative
chemotherapy for stage IIIa (N2) lung cancer: the Sloan-Kettering experience with 136 patients. Ann
Thorac Surg 1993;55: 1365–73.
155. Goldberg M, Burkes RL. Induction chemotherapy for stage IIIA unresect- able non-small cell
lung cancer: the Toronto experience and an overview. Semin Surg Oncol 1993;9:108–13.
156. Stefani A, Alifano M, Bobbio A, Grigoroiu M, Jouni R, Magdeleinat P, Regnard JF. Which
patients should be operated on after induction chemotherapy for N2 non-small cell lung cancer?
Analysis of a 7-year experience in 175 patients. J Thorac Cardiovasc Surg. 2010 Aug;140(2):356-63.
157. Miller AB, Hoogstraten B, Staquet M, Winkler A. Reporting results of cancer treatment. Cancer
1981; 47: 207–14.
158. Johan L, Jayoun K, Sangcheol K, Donghyeon Y, Kyunga K, Byung Soo K. Detection of
differentially expressed gene sets in a partially paired microarray data set. Statistical Applications in
Genetics and Molecular Biology, 11(3), 2012.
159. Yi S, Park T. Integrated analysis of the heterogeneous microarray data. BMC bioinformatics,
12(Suppl 5):S3, 2011.
160. Jing W, Dexter D, Zhiao S, Bing Z. Web-based gene set analysis toolkit (webgestalt): update
2013. Nucleic acids research, 41(W1):W77–W83, 2013.
161. Zhang B, Kirov S, Snoddy J. Webgestalt: an integrated system for exploring gene sets in various
biological contexts. Nucleic acids research, 33(suppl 2):W741–W748, 2005.
162. Candi E, Schmidt R, Melino G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature
reviews Molecular cell biology, 6(4):328–340, 2005.
163. Godessart N, Kunkel SL. Chemokines in autoimmune disease. Current opinion in im- munology,
13(6):670–675, 2001.
101
164. Oertelt-Prigione S. The influence of sex and gender on the immune response. Autoimmunity
reviews, 11(6):A479–A485, 2012.
165. Jansen R, Batista S, Brooks AI, si colab. Sex differences in the human peripheral blood
transcriptome. BMC genomics, 15(1):33, 2014.
166. Draghici S, Khatri P, Tarca AL, si colab. A systems biology approach for pathway level analysis.
Genome Research, 17(10):1537–1545, 2007.
167. Tarca AL, Draghici S, Khatri P, si colab. A novel signaling pathway impact analysis.
Bioinformatics, 25(1):75–82, 2009.
168. Systems/Genome Analyzer IIx/Specifications: Illumina Inc.; 2013 Available online:
http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer_iix/performance_specifications.ilmn
169. Sequencing Video: The Genome Analyzer: Illumina, 2009.
170. Ginsberg RJ, Vokes EE, Raben A. Non-small cell lung cancer. In: De Vita VT Jr, Hellman S,
Rosemberg SA (eds). Cancer: Principles and Practice. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven 1997, 858–
911.
171. West H, Albain KS. Current standards and ongoing controversies in the management of locally
advanced non-small cell lung cancer. Semin Oncol 2005;32:284–92.
172. Feld R, Rubinstein LV, Weisenberger TH. Sites of recurrence in resected stage I non-small-cell
lung cancer: a guide for future studies. J Clin Oncol 1984;2:1352–8.
173. Immerman SC, Vanecko RM, Fry WA, Head LR, Shields TW. Site of recur- rence in patients with
stages I and II carcinoma of the lung resected for cure. Ann Thorac Surg 1981;32:23–7.
174. Felip E, Pavlidis N, Stahel RA. ESMO Guidelines Task Force. ESMO Minimum Clinical
Recommendations for diagnosis, treatment and follow- up of non-small cell lung cancer (NSCLC).
Ann Oncol 2005;16:28–31.
175. Song WA, Zhou NK, Wang W, Chu XY, Liang CY, Tian XD et al. Survival benefit of neoadjuvant
chemotherapy in non-small cell lung cancer: an updated meta-analysis of 13 randomized control
trials. J Thorac Oncol 2010;5:510–6.
102
176. Ettinger DS, Akerley W, Borghaei H, si colab. Non-small cell lung cancer. J. Natl. Compr. Cancer
Netw. 2012, 10, 1236-1271.
177. Kalemkerian GP, Akerley W, Bogner P, si colab. Small cell lung cancer. J. Natl. Compr. Cancer
Netw. 2013, 11, 78-98.
178. Bhattacharjee A, Richards WG, Staunton J, si colab. Classification of human lung carcinomas
by mRNA expression profiling reveals distinct adenocarcinoma subclasses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
2001, 98, 13790-13795.
179. Beer DG, Kardia SL, Huang CC, si colab. Gene-expression profiles predict survival of patients
with lung adenocarcinoma. Nat. Med. 2002, 8, 816-824.
180. Garber ME, Troyanskaya OG, Schluens K, si colab. Diversity of gene expression in
adenocarcinoma of the lung. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 13784-13789.
181. Hayes DN, Monti S, Parmigiani G, si colab. Gene expression profiling reveals reproducible
human lung adenocarcinoma subtypes in multiple independent patient cohorts. J. Clin. Oncol. 2006,
24, 5079-5090.
182. Park YY, Park ES, Kim SB, si colab. Development and validation of a prognostic gene-expression
signature for lung adenocarcinoma. PLoS One 2012, 7,
183. Takeuchi T, Tomida S, Yatabe Y, si colab. Expression profile-defined classification of lung
adenocarcinoma shows close relationship with underlying major genetic changes and
clinicopathologic behaviors. J. Clin. Oncol. 2006, 24, 1679-1688.
184. Warth A, Muley T, Meister M, si colab. The novel histologic International Association for the
Study of Lung Cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society classification system
of lung adenocarcinoma is a stage-independent predictor of survival. J. Clin. Oncol. 2012, 30, 1438-
1446.
185 Travis WD, Brambilla E, Riely GJ. New pathologic classification of lung cancer: Relevance for
clinical practice and clinical trials. J. Clin. Oncol. 2013, 31, 992-1001.
186. Inamura K, Fujiwara T, Hoshida Y, si colab. Two subclasses of lung squamous cell carcinoma
with different gene expression profiles and prognosis identified by hierarchical clustering and non-
negative matrix factorization. Oncogene 2005, 24, 7105-7113.
187. Raponi M, Zhang Y, Yu J, si colab. Gene expression signatures for predicting prognosis of
squamous cell and adenocarcinomas of the lung. Cancer Res. 2006, 66, 7466-7472.
103
188. Wilkerson MD, Yin X, Hoadley KA, si colab. Lung squamous cell carcinoma mRNA expression
subtypes are reproducible, clinically important, and correspond to normal cell types. Clin. Cancer
Res. 2010, 16, 4864-4875.
189. The Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of
squamous cell lung cancers. Nature 2012, 489, 519-525.
190. Landi MT, Zhao Y, Rotunno M, si colab. MicroRNA expression differentiates histology and
predicts survival of lung cancer. Clin. Cancer Res. 2010, 16, 430-441.
191. Yamaguchi A, Nozawa K, Fujishiro M, si colab. Estrogen inhibits apoptosis and promotes cc
motif chemokine ligand 13 expression on synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis.
Immunopharmacology and immunotoxicology, 34(5):852–857, 2012.
192. Nilsson BO. Modulation of the inflammatory response by estrogens with focus on the
endothelium and its interactions with leukocytes. Inflammation Research, 56(7):269–273, 2007.
193. Hohla F, Hopfinger G, Romeder F, si colab. Female gender may predict response to folfirinox in
patients with unresectable pancreatic cancer: A single institution retrospective review. International
journal of oncology, 44(1):319–326, 2014.
194. Rodriguez-Lara V, Pe a-Mirabal E, Baez-Saldana R, si colab. Estrogen receptor beta and
cxcr4/cxcl12 expression: Differences by sex and hormonal status in lung adenocarci- noma. Archives
of Medical Research, 2014.
195. Szymanowska-Narloch A, Jassem E, Skrzypski M, si colab. Molecular profiles of non-small cell lung cancers in cigarette smoking and never-smoking patients. Advances in medical sciences, pages 1–11, 2014.
196. Betticher DC, Hsu Schmitz SF, Tötsch M, Hansen E, Joss C, von Briel C et al. Prognostic factors affecting long term outcomes in patients with resected stage IIIA pN2 non-small-cell lung cancer: 5-year follow-up of a phase II study. Br J Cancer 2006;94:1099–106.
197. Liao WY, Chen JH, Wu M, Shih JY, Chen KY, Ho CC et al. Neoadjuvant chemotherapy with docetaxel-cisplatin in patients with stage III N2 non-small-cell lung cancer. Clin Lung Cancer 2013;14:418–24.
198. Chen HY, Yu SL, Chen CH, Chang GC, Chen CY, Yuan A, Cheng CL, Wang CH, Terng HJ, Kao SF, et al: A five-gene signature and clinical outcome in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 2007, 356:11–20.
199. Larsen JE, Pavey SJ, Passmore LH, Bowman RV, Hayward NK, Fong KM: Gene expression signature predicts recurrence in lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res 2007, 13:2946–2954.
200. Dowsett M, Cuzick J, Wale C, Forbes J, Mallon EA, Salter J, Quinn E, Dunbier A, Baum M, Buzdar A, et al: Prediction of risk of distant recurrence using the 21-gene recurrence score in node-
104
negative and node-positive postmenopausal patients with breast cancer treated with anastrozole or tamoxifen: a TransATAC study. J Clin Oncol 2010, 28:1829–1834.
201. Marx V. Next-generation sequencing: The genome jigsaw. Nature 2013;501:263-8.
202. Green ED, Guyer MS, National Human Genome Research Institute. Charting a course for genomic medicine from base pairs to bedside. Nature 2011;470:204-13.
203. Leary RJ, Sausen M, Diaz LA Jr, et al. Cancer detection using whole- genome sequencing of cell free DNA. Oncotarget 2013;4:1119-20.
Director de proiect,
Prof. Dr. Jean-François REGNARD
Data: 29.06.2014
