RADNA SVESKA IZ HEMIJE PRIRODNIH PROIZVODA izabrane … izabrane vežbe 2017-2018 (1).pdfHEMIJA PRIRODNIH PROIZVODA – laboratorijske vežbe 0 RADNA SVESKA IZ HEMIJE PRIRODNIH PROIZVODA

HEMIJA PRIRODNIH PROIZVODA – laboratorijske vežbe

0

RADNA SVESKA IZ

HEMIJE PRIRODNIH PROIZVODA

-izabrane vežbe-

mr ph. Milica Todorovska

prof. dr Danijela Kostić

akademska 2017/2018. godina


1

I PROTEINI

1. Izolovanje kazeina iz mleka HEMIKALIJE I REAGENSI:

Rstvor hlorovodonične kiseline (0,05 mol/dm3) Rastvor hlorovodonične kiseline (1:1) Rastvor natrijum-hidroksida (0,1 mol/dm3)

PRIBOR I OPREMA:

Menzure Čaše

Levak po Bihneru Boca za filtraciju u vakuumu Filter papir Stakleni štapić

IZVOĐENJE VEŽBE:

Proceđenom mleku zapremine 100 ml doda se polako i uz mešanje desetak kapi rastvora HCl

(1:1) sve do pH 4,6 (izoelektrična tačka). Zatim se doda 100 ml vode, dobro izmeša staklenim štapićem i centrifugira 10 minuta brzinom od 2000 obrtaja/min. Talog se ispira hladnom destilovanom vodom.

Kazein, zajedno sa eventualno prisutnim Ca3(PO4)2 i mastima, prenese se u čašu i tretira sa 0,1 mol/dm3 rastvorom NaOH. Baza se dodaje veoma polako i uz mešanje do pH 6,3. Pri toj pH vrednosti rastvara se Na-kazeinat, ali ne i Ca-kazeinat, kalcijum-fosfat i masti. Ne treba dodati više baze nego što je potrebno da se dostigne ta pH vrednost.

Dobiveni rastvor filtrira se i filtriranje ponavlja sve do postizanja veoma slabe opalescencije. Zatim se filtratu dodaje rastvor 0,05 mol/dm3 HCl sve do pH 4,6. Dodavanje kiseline vrši se uz jako

mehaničko mešanje. Posle toga se rastvoru doda 100 ml hladne destilovane vode i ostavi da se talog slegne u frižideru. Talog se odvoji ceđenjem na Bihnerovom levku i ispira hladnom destilovanom vodom do negativne reakcije na hloride. Nakon odvajanja rastvora talog se suši iznad kalcijum-hlorida u eksikatoru. Kazein se u toku rada ne sme ostati izložen vazduhu, jer potamni, očvrsne i raspada se.

2. Izolovanje glutena iz pšeničnog brašna

HEMIKALIJE I REAGENSI:

Etanol 70% Rastvor natrijum-hidroksida (0,05 mol/dm3) Rastvor hlorovodonične kiseline (0,1 mol/dm3)

PRIBOR I OPREMA:

Čaše Menzure

Balon sa okruglim dnom Uspravni kondenzator Vodeno kupatilo Rotacioni vakuum uparivač Avan Levak za toplo ceđenje Levak po Bihneru


2

Boca za filtraciju u vakuumu Stakleni levak Stativ sa klemama Filter papir

Stakleni štapić Gaza IZVOĐENJE VEŽBE:

Dva sloja gaze polože se na dno čaše i na njih stavi 50 g pšeničnog brašna i malo vode. Staklenim štapićem se meša sve dok se ne formira masa slična gustom testu. Zatim se krajevi gaze skupe i talog gnječi u toploj tekućoj vodi kako bi se odstranio skrob. Ispiranje se vrši sve dok je voda od ispiranja mlečne boje i opalescira. Pri kraju ispiranja vodu treba ispitati na reakciju sa jodom (Lugolov rastvor) da

bi se utvrdilo da li je skrob još prisutan. U proseku je potrebno 45 minuta da bi se materijal oslobodio skroba. Posle ispiranja talog postaje lepljiv i treba sve vreme da ostane vlažan.

Pripremi se dovoljna količina toplog 70% etanola, talog iseče na male komade i suspenduje u vrućem alkoholu u balonu sa okruglim dnom (ne sme se raditi u blizini plamenika!). Na balon se postavi uspravni kondenzator i smeša se zagreva 15 minuta preko ključalog vodenog kupatila. Dekantovanjem se odvoji alkoholni rastvor, pa se sačuva i čvrsti ostatak i rastvor. Alkoholni ekstrakt filtriraja se na Bihnerovom levku i uparava na rotacionom vakuum uparivaču skoro do suva. U alkoholu su rastvorni

glijadini. Na kraju eksperimenta vrši se ispitivanje dobivenog materijala pomoću dokaznih reakcija za proteine (Biuretska proba).

Ostatak je sirovi gluten, nerastvoran u etanolu, čija reakcija na proteine takođe ispituje.

3. Biuretska proba na peptidnu vezu

Biuretska proba koristi se za dokazivanje proteina i peptida, a zasniva se na reakciji alkalnog

rastvora bakar-sulfata sa jedinjenjima koja sadrže dve ili više peptidnih veza. Pri tome nastaje ljubičasto obojeni kompleks (slika 1). Naziv ovog testa je u vezi sa jedinjenjem „biure“ koje se stvara zagrevanjem uree i daje tipičnu pozitivu reakciju sa alkalnim rastvorom bakar-sulfata.

Reakcija nije sasvim specifična za peptidne veze pošto se pozitivan rezultat dobija i sa jedinjenjima koja sadrže dve karbonilne grupe vezane preko azotovog ili ugljenikovog atoma. Intenzitet dobijene boje ukazuje na broj peptidnih veza prisutnih u ispitivanom jedinjenju.

Slika 1. Biuretska proba na peptidnu vezu


Rastvor bakar-sulfata (CuSO4) (1%) Rastvor natrijum-hidroksida (40%) Rastvor proteina (0,5%) (kazein se rastvara u razblaženom rastvoru natrijum-hidroksida)

PRIBOR I OPREMA:

Epruvete


3

Kapalice Pipete IZVOĐENJE VEŽBE:

1. U prvu epruvetu staviti 2 ml ispitivanog rastvora, dodati 5 kapi rastvora CuSO4. Nakon toga dodati 2 ml rastvora NaOH, dobro promešati i zabeležiti kakva se boja stvara.

2. U drugu epruvetu staviti 2 ml destilovane vode, dodati 5 kapi rastvora CuSO4 i nakon toga 2 ml rastvora NaOH. Dobro promešati i zabeležiti kakva se boja stvara.

Ukoliko se u ispitivanom rastvoru nalazi malo proteina, višak Cu2+ jona može da se taloži u

obliku Cu(OH)2, što ima za posledicu maskiranje karakteristične boje. Zato je potrebno sačekati da se Cu(OH)2 staloži. Mnoga organska jedinjenja i amonijak pojačavaju plavu boju karakterističnu za Cu2+

jone, te je zato samo izrazito ljubičasta boja je dokaz za prisustvo peptidnih veza.


4

IZVEŠTAJ:

Ime i prezime: ____________________________________ Grupa:__________

Izračunaj prinos kazeina/glutena i napiši zapažanja prilikom izvođenja biuretske probe.


5

II Kvalitativno ispitivanje proteina i

aminokiselina

Sve reakcije za dokazivanje proteina mogu se podeliti na OBOJENE (dokazivanje peptidne

veze ili pojedinih aminokiselina) i TALOŽNE REAKCIJE (temelji se na koloidnim svojstvima

rastvora proteina). Za te reakcije najbolje je koristiti vodeni rastvor belanca. Belanac se u čaši odvoji od žumanca, pa se doda trostruka zapremina vode. Nakon mešanja

staklenim štapićem, rastvor se profiltrira preko levka sa filter papirom.

Taložne reakcije proteina

1. REVERZIBILNO TALOŽENJE

Rastvoru proteina dodati čvrsti amonijum-sulfat. Nastali talog rastvoriti dodatkom vode.

2. KOAGULACIJA PROTEINA


Belance rastvor H2SO4 rastvor HNO3 rastvor HCl rastvor deterdženta

etanol (96%) PRIBOR I OPREMA:

Stalak sa epruvetama kapaljke plamenik drvena štipaljka

IZVOĐENJE VEŽBE:

U 6 epruveta sipajte po 2 ml rastvora belanca: 1. Epruveta – kuvanjem rastvora belanca u epruveti se izdvaja beli pahuljasti talog

2. Epruveta – ako u rastvor belanca uz zid epruvete dodajemo koncentrovanu HNO3, na graničnoj

površini nastaje beložuti prsten koagulisanih proteina

3. Epruveta – talog nastaje dodatkom rastvora HCl

4. Epruveta – talog nastaje dodatkom rastvora H2SO4

5. Epruveta – do koagulacije dolazi kada se rastvora belanca doda rastvror detrdženta

6. Epruveta – ako u rastvor belanca dodamo etanol i protresemo, nastaće talog koagulisanih

belančevina


6

Bojene reakcije aminokiselina

1. Ninhidrinska reakcija

Ninhindrin reaguje sa svim α-aminokiselinama na pH 4-8 i pritom nastaje ljubičasto obojeno kompleksno jedinjenje (slika 2). Ovu reakciju daju i primarni amini i amonijak, ali se tom prilikom ne oslobađa ugljendioksid. Prolin i hidroksiprolin, zbog svoje blokirane aminogrupe, daju sa ninhindrinom žutu boju.

Reakcija je veoma osetljiva i veoma je pogodna za detektovanje aminokiselina i njihovo kvantitativno određivanje.

Slika 2. Ninhidrinska reakcija


Rastvor aminokiseline (0,1%) Sveže pripremljen rastvor ninhindrina (0,1% - 0,2%) Univerzalni lakmus papir

PRIBOR I OPREMA:

Epruvete Kapalice Butan boca Pipete

IZVOĐENJE VEŽBE:

Stavi se u epruvetu 1 ml rastvora aminokiseline i pH podesi na pribložno 7. Zatim se doda oko

pet kapi rastvora ninhindrina u acetonu i reakciona smesa zagreje do ključanja. Pojavljuje se karakteristična boja koja je nepostojana na svetlosti. U prisustvu jona bakra ili kadmijuma stvara se mnogo stabilnije helatno jedinjenje.


7

2. Millonova reakcija

Jedinjenja koja sadrže benzenov prsten sa hidroksilnom grupom reaguju sa Millonovim reagensom, pritom dajući crveno obojene komplekse. Aminokiselina tirozin (kao i njeni derivati) u svojoj strukturi sadrži hidroksibenzenov prsten, te zato samo ova aminokiselina daje pozitivnu Millonovu reakciju.


Rastvor tirozina (0,1%) Millonov ragens (15% rastvor merkuri-sulfata u 15% sumpornoj kiselini) Rastvor fenola (0,1%) Rastvor natrijum-nitrita (0,1%)

PRIBOR I OPREMA:

Epruvete Kapalice Vodeno kupatilo Termometar Pipete

IZVOĐENJE VEŽBE:

U 1ml rastvora koji se ispituje, doda se 5 kapi Millonovog reagensa i zagreva na vodenom kupatilu 10 minuta. Ohlađenom rastvoru na sobnoj temperaturi doda se 5 kapi rastvora natrijum-nitrita. Ukoliko se pojavi crvena boja cigle onda je to pozitivan rezultat.

3. Ksantoproteinska reakcija

Aromatične aminokiseline zagrevanjem sa koncentrovanom azotnom kiselinom daju nitro-derivate od kojih potiče žuto obojenje. Soli ovih derivata su narandžaste boje. HEMIKALIJE I REAGENSI:

Rastvor tirozina (0,1%) Rastvor fenola (0,1%) Koncentrovana azotna kiselina

Rastvor natrijum-hidroksida (40%) Lakmus papir PRIBOR I OPREMA:

Epruvete Kapalice Butan boca

Pipete IZVOĐENJE VEŽBE:

U 1 ml rastvora tirozina koji se nalazi u epruveti doda se i 1 ml koncentrovane azotne kiseline, rastvor zagreje, ohladi i prati promena boje. Zatim se doda dovoljno 40% rastvora NaOH tako da rastvor pokazuje alkalnu sredinu.

Pozitivan rezultat je ako se žuta boja kiselog rastvora promeni u narandžastu kada rastvor

postane bazan. Test se ponavlja rastvorom fenola.


8

4. Reakcija sa Ehrlichovim reagensom

Ehrlichov reagens reaguje sa jedinjenjnima kao što su indoli, aromatični amini i ureidi, pritom

dajući obojene komplekse. Ehrlichov reagens je 10% rastvor p-dimetilaminobenzaldehida u koncentrovanoj hlorovodoničnoj kiselini. HEMIKALIJE I REAGENSI:

Rastvor histidina (1%) Ehrlichov reagens

PRIBOR I OPREMA:

Epruvete Pipete IZVOĐENJE VEŽBE:

U 1 ml rastvora histidina doda se 2 ml Ehrlichovog reagensa i posmatra promena boje.

5. Proba sa nitroprusidom

Aminokiseline koja sadrže tiolnu grupu (cistein, metionin) reaguju sa natrijum-nitroprusidom [Na2Fe(CN)5NO] u prisustvu viška amonijaka dajući crvenu boju. HEMIKALIJE I REAGENSI:

Rastvor cisteina ili metionina (0,1%) Sveže pripremljen rastvor natrijum-nitroprusida (2%) Amonijum-hidroksid (25%) PRIBOR I OPREMA:

Epruvete Pipete

IZVOĐENJE VEŽBE:

Pomeša se 0,5 ml sveže pripremljenog rastvora natrijum-nitroprusida sa 2 ml ispitivanog rastvora i doda 0,5 ml rastvora NH4OH. Ukoliko su prisutne tiolne grupe nastaje crveno obojenje.

6. Proba sa olovosulfidom za cistein i cistin

Zagrevanjem rastvora cisteina i cistina sa jakim bazama, jedan deo sumpora se prevodi u natrijum-sulfid, koji može da se dokaže kao olovo-sulfid taloženjem pomoću rastvora natrijum-plumbata. Sumpor koji se nalazi u metioninu ne daje ovu reakciju. HEMIKALIJE I REAGENSI:

Rastvor natrijum-hidroksida (0,1 mol/dm3) Rastvor olovo-acetata (0,1 mol/dm3)

Rastvor natrijum-plumbata (priprema se neposredno pre izvođenja eksperimenta dodavanjem 5 ml 0,1 mol/dm3 NaOH u 2 ml olovoacetata i kuvanjem ove smeše dok se beli talog ne rastvori). Rastvor cisteina i cistina (0,1%) Rastvor natrijum-hidroksida (40%)


9

PRIBOR I OPREMA:

Epruvete Pipete Čaše

Plamenik sa tronošcem i azbestnom mrežicom IZVOĐENJE VEŽBE:

Ispitivani rastvor zagreje se do ključanja, pomeša sa 0,5 ml 40% rastvora NaOH i kuva 2 minuta. Ohlađenom rastvoru doda se 0,5 ml rastvora natrijum-plumbata. Nastaje talog crne boje.

7. Sakaguchi-eva proba za arginin

Od proteinskih aminokiselina jedino arginin u svom molekulu sadrži gvanidino grupu. Pomenuto jedinjenje stupa u reakciju sa α-naftolom i u prisustvu oksidacionog sredstva kao što je bromna voda daje crvenu boju. HEMIKALIJE I REAGENSI:

Rastvor arginina (0,1%) Rastvor natrijum-hidroksida (40%) Rastvor α-naftola u alkoholu (0,1%) Bromna voda (priprema se u sobi za otrove tako što se doda nekoliko kapi broma u 100 ml vode i promeša) PRIBOR I OPREMA:

Epruvete

Pipete Kapalice Čaša IZVOĐENJE VEŽBE:

Pomeša se 1 ml natrijum-hidroksida sa 3 ml rastvora arginina. Nastalom rastvoru dodaju se 2 kapi α-naftola. Smeša se zatim dobro promućka i doda 4-5 kapi bromne vode. Nastaje crveno obojenje.


10

IZVEŠTAJ:


Napisati zapažanja prilikom izvođenja bojenih i taložnih reakcija.


11

III Izolovanje trehaloze iz kvasca


Suvi pekarski kvasac Zasićeni rastvor barijim-hidroksida Etanol (95%) Aktivni ugalj Rastvor hlorovodonične kiseline (0,1 mol/dm3) Rastvor cink-sulfata (20%) Rastvor fenolftaleina (1%)

Rastvor etanola (70%)

PRIBOR I OPREMA:

Erlenmajer Menzura Boca za filtraciju u vakuumu Levak po Bihneru

Hemijska čaša Vodeno kupatilo Rotacioni vakuum uparivač Balon sa okruglim dnom Termometar Filter hartija Stakleni štapić

IZVOĐENJE VEŽBE:

U erlenmajeru pažljivo napraviti homogenu kašu od 10 g suvog pekarskog kvasca i 30 ml vode.

Tome dodati 70 ml 96% etanola, promućkati i ostaviti da stoji 30 minuta uz povremeno mućkanje.

Smesu procediti kroz Bihnerov levak, a talog isprati sa 50 ml 70% rastvora etanola.

U filtrat dodati 7 ml 20% rastvora ZnSO4 i 2-3 kapi 1% rastvora fenolftaleina.

Dodati zasićeni rastvor Ba(OH)2 do pojave ljubičaste boje fenolftaleina.

Dodati na vrh kašičice aktivnog uglja i zagrejati na vodenom kupatilu do temperature od 70 °C, pritom mešajući reakcionu smešu.

Čim se ova temperatura postigne, smesu procediti kroz Bihnerov levak (upotrebiti deblji sloj filtera ili celita, tako da ugalj ne prolazi u filtrat).

Ohlađeni rastvor podesiti na pH 7 pomoću 0,1 mol/dm3 rastvora HCl.

Koncentrovati na rotacionom vakuum uparivaču.

Ovaj sirupasti ostatak se ohladi, pa se postepeno dodaje 15 ml 95% etanola uz mešanje, i ostavi da stoji preko noći da bi trehaloza iskristalisala.

Trehaloza često kristališe brzo, ali ponekad je potrebno i nedelju dana. Ovako spora kristalizacija daje kristale duge 15 mm. Kristalizacija se može i ubrzati hlađenjem rastvora na 0 ºC ili dodavanjem viška etanola.


12

IZVEŠTAJ:


Nacrtati stukturu trehaloze i napisati zapažanja prilikom izvođenja vežbe. Opisati dobijene kristale trehaloze.


13

IV Kvalitativne reakcije ugljenih-hidrata

1. Molish-ov test

Cilj: Utvrditi prisustvo ugljenih hidrata u uzorku.

Princip

Pošto su ugljeni hidrati polihidroksilni aldehidi ili ketoni, karakteristične hemijske reakcije su one koje se odnose na prisutne funkcionalne grupe (hidroksilnu, aldehidnu i keto grupu). Ukoliko tretiramo šećere kiselinama, raskidamo glikozidne veze. Pentoze se degradiraju do furfurala kao krajnjeg proizvoda, dok se heksoze transformišu do hidroksimetilfurfurala, a daljim zagrevanjem do levulinske kiseline. Furfural i hidroksimetilfurfural reaguju sa fenolima i daju obojena jedinjenja.

U Molish-ovom testu dejstvom koncentrovane H2SO4 na molekule šećera raskidaju se glikozidne veze, a zatim se nastali monosaharidni derivati, uz dehidrataciju, transformišu do derivata furfurala, koji adicijom sa molekulima α-naftola daju crveno obojeni kondenzacioni proizvod. HEMIKALIJE I REAGENSI:

α-naftol koncentrovana H2SO4

rasvtor glukoze

PRIBOR I OPREMA: Epruveta

IZVOĐENJE VEŽBE:

Dodati dve kapi rastvora α-naftola u 2 ml rastvora šećera koji ste predhodno sipali u epruvetu. l

ml koncentrovane H2SO4 dodati pažljivo niz zidove epruvete. Ostaviti epruvetu sa strane. Sadržaj epruvete će se nakon izvesnog vremena raslojiti. Pojava purpurnog obojenja koje se javlja na kontaktnoj površini između slojeva dokaz je prisustva ugljenih hidrata u uzorku.

2. Fehling-ov test Cilj: Utvrditi da li je u uzorku prisutan redukujući ili neredukujući šećer. Princip

Za redukujuće osobine šećera odgovorne su aldehidna, odnosno keto grupa. One imaju tu osobinu

da redukuju npr. Fehling-ov reagens, a da se sami oksiduju do kiselina tokom tog procesa. Fehling-ov reagens je alkalan i sadrži Cu2+jone u obliku ditartaratnog kompleksa koji se redukuju do nerastvomog crvenosmeđeg Cu2O, oksidujući pritom aldehidnu grupu šećera. Neredukujući šećeri pri ovim uslovima daju posle zagrevanja crni talog CuO.

Fruktoza daje pozitivnu reakciju na Fehling-ov reagens, tako da proba nije specifična isključivo za aldehide. Objašnjenje leži u tome što se fruktoza pod dejstvom alkalija prevodi u glukozu i manozu (enolizuje). Ovakva konverzija naziva se keto-enolna tautomerija. Pri tom se

ispostavilo da ne dolazi samo do izomerizacije, već čak i do razgradnje ugljovodoničnog niza, tako da nastaje još proizvoda sa redukujućim svojstvima. HEMIKALIJE I REAGENSI:

Fehling I: Rastvori se 35 g CuSO4 7H2O u vodi i rastvor dopuni do 500 ml Fehling II: Rastvori se 120 g KOH i 173 g K-Na-tartarata i rastvor dopuni vodom do 500 ml


14

vodeno kupatilo 4 epruvete šećeri: glukoza, fruktoza, saharoza, laktoza

PRIBOR I OPREMA:

Epruveta IZVOĐENJE VEŽBE:

Pripremiti vodeno kupatilo (voda ključa)

Označiti seriju epruveta u kojima će se nalaziti rastvori ugljenih hidrata (glukoza, fruktoza,

saharoza, laktoza)

Dodati 2,5 ml Fehling I i direktno nakon toga 2,5 ml Fehling II u svaku od obeleženih epruveta

Dodati po 5 ml rastvora različitih ugljenih hidrata u svaku od epruveta

Uzorke zagrevati u vodenom kupatilu 10 min, a ako ne dođe do pojave taloga u toku navedenog vremena, nastaviti zagrevanje još 20 min.

3. Tollens-ova reakcija (reakcija ,,srebrnog ogledala”)

Aldehidi se mogu oksidovati blagim oksidacionim sredstvima kao što su joni metala (Ag+). Ovu

reakciju ne daju ketoni. Aldehidi redukuju amonijačni rastvor srebro-nitrata (Tolensov reagens) do elementarnog srebra karakteristične metalno-sive boje, pri čemu se sami oksiduju do odgovarajuće karboksilne kiseline:

R-CHO + 2 [Ag(NH3)2]OH → R-COONH4 + 2Ag↓ + 3NH3 + H2O

Tolensov reagens je eksplozivan ukoliko stoji duže vremena pa se priprema neposredno pred upotrebu. HEMIKALIJE I REAGENSI:

Rastvor aldehida (glukoza) rastvor AgNO3 koncentrovan NaOH 25% rastvor NH3

PRIBOR I OPREMA: Epruveta vodeno kupatilo IZVOĐENJE VEŽBE:

U epruvetu sipati 1 ml rastvora AgNO3 i ukapati 0,5 ml rastvora NaOH. Gradi se mrki talog srebro-oksida, koji se rastvara po dodatku amonijaka. Dobijeni rastvor je Tolensov reagens. U napravljeni

rastvor dodati oko 1 ml ispitivanog aldehida i epruvetu zagrejati na vodenom kupatilu sve dok se njeni zidovi ne počnu prevlačiti tankim slojem srebra (,,srebrno ogledalo”). Uprošćena jednačina oksidacije na primeru formaldehida ima sledeći oblik:

HCHO + 2Ag+ + 2OH- → HCOOH + 2Ag↓ + H2O


15

4. Benedict-ov test

Cilj: Sličan cilju Fehling-ovog testa (razlikovanje redukujućih od neredukujućih šećera), ali pod drugim uslovima. Princip

U osnovi isti kao i Fehling-ov test, ali prednost u odnosu na predhodni je u znatno manjoj

baznosti reagensa i prema tome njegovoj većoj stabilnosti. Na osetljivost testa ne utiču jedinjenja kao što je kreatinin i mokraćna kiselina, tako da se ovaj test često koristi za određivanje šećera u urinu. HEMIKALIJE I REAGENSI:

Rastvor šećera Benedict-ov reagens: Rastvori se 173 g Na-citrata i 100 g Na2CO3 u oko 800 ml tople vode. Rastvor se kroz nabrani filter ocedi u menzuru od 100 ml i razblaži na 850 ml. U međuvremenu se pripremi rastvor 173 g CuSO4 u oko 100 ml vode, pa se ovaj rastvor razblaži do 150 ml. Prvi rastvor se sipa u sud od 2 l,

pa se polako i uz mešanje njemu dodaje drugi rastvor. PRIBOR I OPREMA: Epruveta vodeno kupatilo

IZVOĐENJE VEŽBE:

Dodati približno 8 kapi rastvora šećera u 5 ml Benedict-ovog reagensa koji se nalazi u epruveti

Pripremiti vodeno kupatilo (voda ključa)

Zagrevati na ključalom vodenom kupatilu u trajanju od približno 3 min, zatim ostaviti da

se rastvor u epruveti ohladi stajanjem na sobnoj temperaturi

Ako su prisutni redukujući šećeri dolazi do građenja zelenožutog ili crvenog taloga (boja zavisi od koncentracije šećera)

5. Bial-ov test

Cilj: Utvrditi da li je u uzorku prisutna pentoza ili ne.

Princip Dehidratacijom pentoza nastaje furfural kao krajnji proizvod (videti Molish-ov test). Ovaj

proizvod reaguje sa orcinolom i nastaje kondenzacioni proizvod plave boje. Kiselom hidrolizom heksoze formira se hidroksimetilfurfural, koji sa orcinolom daje proizvod obojen žućkastobraon. HEMIKALIJE I REAGENSI:

Rastvor šećera

Bial-ov reagens: rastvoriti 1,5 g orcinola u 500 ml koncentrovane HCl i dadati 20 kapi 10% FeCl3. PRIBOR I OPREMA: Epruveta vodeno kupatilo IZVOĐENJE VEŽBE:

Dodati 2 ml rastvora šećera u 5 ml Bial-ovog reagensa koji je predhodno sipan u epruvetu. Sadržaj epruvete držati na vodenom kupatilu do ključanja.

Pojava zelene boje je dokaz daje test pozitivan.


16

6. Seliwanoff-ov test

Cilj: Okarakterisati šećer kao aldozu odnosno ketozu. Princip

Dehidratacijom heksoza sa koncentrovanim kiselinama, transformacija ketoza do hidroksimetilfurfurala se odvija mnogo brže nego kod aldoza. Sa rezorcinolom kao reagensom crveni

kondenzacioni proizvod nastaje mnogo brže sa ketozama. Brzina reakcije je jako bitna.


Rastvor šećera (glukoza i fruktoza) Seliwanoff-ov reagens: rastvoriti rezorcin u 3N HCl tako da se dobije 0,05% rastvor. PRIBOR I OPREMA: Epruveta

vodeno kupatilo IZVOĐENJE VEŽBE:

Dodati 5 kapi rastvora šećera (glukoza i fruktoza) u 5ml Seliwanoff-vog reagensa koji je predhodno sipan u epruvetu. Sadržaj epruvete držati na vodenom kupatilu do ključanja.

Ukoliko je u uzorku prisutna ketoza, pojava boje se može uočiti kroz 1 min.

7. Jodni test (Lugol-ova proba)

Cilj: Utvrditi prisustvo skroba, odnosno glikogena.

Princip Polisaharidi kao amiloza, amolopektin, glikogen i dekstrin grade karakteristične obojene

komplekse kada se tretiraju jodom. Amiloza u skrobu je odgovorna za intezivnu plavu boju koja se javlja u interakciji skroba i joda. Nerazgranati lanci glukoznih jedinica u amilozi se prostorno tako uređuju da grade heliks kod koga u jednoj zavojnici heliksa ima 6 jedinica glukoze. Unutrašnjost heliksa je takva da se u nju može smestiti molekuli joda (u obliku I3

-). Polisaharidi koji su izgrađeni od razgranatih lanaca glukoznih jedinica, kao što su amilopektin i

glikogen, ne grade takve helikse lako, što se odražava u manje intezivno obojenim kompleksima sa jodom.

Test je pozitivan ako je reakciona sredina bilo kisela bilo alkalna i ako lanci molekula koje testiramo imaju više od 18 glukozidnih jedinica. HEMIKALIJE I REAGENSI:

Vodeni rastvor skroba, saharoze i glukoze

rastvor joda (Lugol-ov rastvor) PRIBOR I OPREMA: Tri peruvete vodeno kupatilo IZVOĐENJE VEŽBE:

Dodati kap rastvora joda u svaki od rastvora šećera (skrob, saharoza, glukoza)

Ubeležiti svoja zapažanja.

Zagrejati rastvor u epruvetama na vodenom kupatilu tokom 5 min i ponovo ostaviti da se hladi.


17

8. Hidroliza polisaharida HEMIKALIJE I REAGENSI:

Vodeni rastvor skroba HCl vodeni rastvor NaOH Fehling-ov rastvor

PRIBOR I OPREMA: Epruveta vodeno kupatilo lakmus papir IZVOĐENJE VEŽBE:

U epruvetu sipati malo vodenog rastvora skroba i 2 ml rastvora HCl. Epruvetu staviti u ključalo

vodeno kupatilo i zagrevati 5-10 minuta. Ohladiti epruvetu i sačekati. Podeliti sadržaj u više delova i u jedan deo dodati vodeni rastvor NaOH da bi se kiselina neutralisala (proveriti pH). Dodati Fehling-ov rastvor i zagrevati reakcionu smešu na vodenom kupatilu do pojave taloga bakar(I)-oksida crvene boje. Ovim ogledom smo dokazali da se skrob u prisustvu rastvora HCl razgradio do redukujućeg monosaharida – glukoze.

9. Plava boca Cilj: Utvrditi prisustvo glukoze.

Princip

Metilensko-plavo se redukuje alkalnim rastvorom glukoze do svog bezbojnog oblika. Mućkanjem će kiseonik iz vazduha sadržanog u boci ponovo oksidovati metilensko-plavo i prevesti ga iz bezbojne

forme u plavu.


Čvrsti KOH destilovana voda kristalna glukoza rastvor metilensko-plavog

PRIBOR I OPREMA: Boca sa gumenim čepom menzura IZVOĐENJE VEŽBE:

Rastvoriti 2 g KOH u 60 ml vode. Kada se rastvor ohladi dodati 10 g glukoze i nekoliko kapi rastvora metilensko-plavog, tek toliko da rastvor dobije plavu boju. Ne treba stavljati previše indikatora!

Bocu zatvoriti gumenim čepom. Nakon nekoliko minuta, rastvor se obezboji. Kada se rastvor ponovo promućka, boja se vraća. Ako se rastvor ostavi, ubrzo će se on opet obezbojiti.


18

IZVEŠTAJ:


Napisati zapažanja prilikom izvođenja reakcija.


19

V Saponifikacija masti i ulja, dokazne reakcije za

lipide

1. Hidroliza jestivog ulja i dobijanje sapuna

Hidroliza triglicerida može se izvršiti kiselinama, bazama, ali se koriste i metode razlaganja pregrejanom vodenom parom i enzimske metode. Baznom hidrolizom (saponifikacijom) (slika 3.) dobijaju se soli viših masnih kiselina koje se nazivaju sapuni. Saponifikacija jestivog ulja vrši se zagrevanjem alkoholnog rastvora kalijum-hidroksida i samog ulja.

Slika 3. Bazna hidroliza (saponifikacija) jestivog ulja


Čvrst NaOH (ili KOH) etanol jestivo ulje (glicerol-trioleat) PRIBOR I OPREMA: Balon od 100 ml

kondenzator azbestna mrežica rešo menzura od 50 ml menzura od 10 ml metalni stativ sa klemom

IZVOĐENJE VEŽBE:

Sastaviti aparaturu kao na slici: u balon okruglog dna odmeri se 1,5 g KOH, 20 ml etanola i 4 ml jestivog ulja. Na balon se namontira povratni kondenzator kroz koji se pusti voda i aparatura se zagreva u toku 30 minuta preko rešoa. Nakon što se smeša ohladi, hidrolizat ulja se koristi za naredne oglede.


20

Slika 4. Aparatura za saponifikaciju ulja

2. Akroleinska reakcija

Akroleinska reakcija spada u reakcije dehidratacije alkohola i služi za dokazivanje glicerola, a indirektno i masti i ulja (koje ga sadrže). Prilikom zagrevanja glicerola sa nekim dehidratacionim

sredstvom (razblažena sumporna kiselina, kalijum-hidrogensulfat, kalcijum-hlorid i sl.), iz glicerola se izdvajaju dva molekula vode i nastaje nezasićeni aldehid – akrolein (čije je ime po IUPAC-ovoj nomenklaturi propenal). Akrolein ima oštar i neprijatan miris na zagorelu mast. On se oslobađa zagrevanjem svih ulja i masti; izrazito je otrovan, citotoksičan i kancerogen, pa je ovo razlog zbog čega jedno te isto ulje ili mast ne treba više puta koristiti za termičku pripremu hrane.


Glicerol čvrst KHSO4

PRIBOR I OPREMA: Epruveta kašičica vodeno kupatilo IZVOĐENJE VEŽBE:

U suvu epruvetu sipati oko 1 ml glicerola, dodati punu kašičicu kalijum-hidrogensulfata i zagrevati epruvetu na vodenom kupatilu sve do pojave belih para i neprijatnog mirisa akroleina. Miris

akroleina treba veoma pažljivo ispitati, vodeći računa o njegovoj toksičnosti!


21

3. Prevođenje rastvorljivih sapuna u nerastvorljive

Kalijumovi sapuni su tečni, dok su natrijumovi čvrsti. I jedni i drugi u vodi grade koloidne rastvore tj. dobrim delom se u njoj rastvaraju. Za razliku od njih, sapuni zemnoalkalnih metala su u vodi nerastvorljivi. U reakciji rastvora kalcijum-hlorida sa vodenim rastvorom sapuna gradi se talog nerastvornog kalcijumovog sapuna:

2 CH3(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOK + CaCl2 → [CH3(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COO]2Ca↓ + 2 KCl


Hidrolizat jestivog ulja destilovana voda rastvor kalcijum-hlorida

PRIBOR I OPREMA:


U epruvetu sipati 1 ml hidrolizata jestivog ulja iz prethodnog eksperimenta i dodati oko 3 ml destilovane vode. Rastvor dobro promućkati, a zatim dodati 1 ml vodenog rastvora kalcijum-hlorida. Pojavljuje se beli talog nerastvornog kalcijum-oleata.

4. Istiskivanje viših masnih kiselina iz njihovih soli

Istiskivanje viših masnih kiselina iz njihovih soli se odvija dejstvom mineralnih kiselina na

sapune. Slobodne masne kiseline se izdvajaju na površini rastvora u vidu uljastih kapi (ukoliko se radi sa hidrolizatom ulja) ili belih grumuljica (kada su u pitanju hidrolizati masti).

CH3(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOK + HCl → CH3(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH↓ + KCl


Hidrolizat jestivog ulja

destilovana voda hlorovodonična kiselina (1:1)

PRIBOR I OPREMA: Epruveta IZVOĐENJE VEŽBE:

U epruvetu sipati oko 1 ml hidrolizata jestivog ulja i dodati 3 ml destilovane vode i smešu

promućkati. Zatim u rastvor dodati oko 1 ml HCl. Iz zamućenog rastvora (emulzije) nakon par trenutaka izdvajaju se kapljice oleinske kiseline.

5. Dokazivanje holesterola Liebermann-Burchardt-ovom metodom

U prisustvu smeše sulfatne kiseline i anhidrida sirćetne kiseline (acetanhidrida), holesterol se dehidratiše i naknadno oksiduje, što se opaža kao intenzivno zeleno obojenje. Reakcija je u literaturi poznata pod nazivom Liberman-Burčartova reakcija (Liebermann-Burchardt). Precizan mehanizam ove transformacije ni do danas nije razjašnjen. Dugo vremena se ova reakcija koristila u kliničkoj praksi za


22

kolorimetrijsko određivanje koncentracije holesterola u krvi, jer je intenzitet obojenja nastalog kompleksa direktno proporcionalan koncentraciji holesterola u plazmi. HEMIKALIJE I REAGENSI:

Holesterol hloroform koncentrovana H2SO4 anhidrid sirćetne kiseline

PRIBOR I OPREMA: Epruveta

IZVOĐENJE VEŽBE:

U suvu epruvetu staviti na vrh špatule holesterol i dodati mu oko 1 ml hloroforma u cilju rastvaranja. U hloroformski rastvor holesterola dodati nekoliko kapi anhidrida sirćetne kiseline i pažljivo niz zid epruvete koncentrovanu sumpornu kiselinu. Pojavljuje se nepostojana crvenoljubičasta boja koja preko plave prelazi u stabilnu zelenu boju.

6. Dokazivanje holesterola Salkowsky-jevom metodom

Na sličnom mehanizmu prethodno opisane reakcije temelji se i metoda dokazivanja holesterola po Salkovskom (Salkowsky), koja je eksperimentalno jednostavnija.


Holesterol hloroform koncentrovana H2SO4

PRIBOR I OPREMA:


U suvu epruvetu staviti na vrh špatule holesterol i dodati mu oko 1 ml hloroforma u cilju rastvaranja. U hloroformski rastvor holesterola pažljivo niz zidove epruvete uliti koncentrovanu sulfatnu kiselinu. Na dodirnom sloju organske i kiselinske faze pojavljuje se žutocrveni prsten. Kada se sadržaj epruvete promućka, hloroformski sloj se oboji crveno, a sulfatna kiselina počne da fluorescerira zeleno (ovaj fenomen nekada zna da izostane).


23

IZVEŠTAJ:


Napisati zapažanja prilikom izvođenja reakcija.


24

VI Izolovanje holesterola iz jaja

Holesterol spada u klasu nehidrolizabilnih lipida. Po strukturi je sekundarni alkohol sa

steranskom strukturom. Polarna OH-grupa mu daje amfibilni karakter, dok kondenzovani prstenovi

obezbeđuju čvrstinu. Nalazi se u membranama svih ćelija, a u serumu (plazmi) je većim delom

esterifikovan višim masnim kiselinama. Holesterol u koži prililom sunčanja prelazi u vitamin D3 (7-

dehidroholesterol). Kako je nerastvoran u vodi (pa samim tim i u krvi), kroz krv se transportuje vezan za

proteine, pa u skladu sa tim razlikujemo dva tipa holesterola – LDL i HDL. LDL (Low Density

Lipoproteins) - lipoproteini male gustine, transportuju holesterol i triacilglicerole iz jetre u tkiva i u

kliničkom žargonu se označavaju kao ,,loš“ holesterol. HDL (High Density Lipoproteins) – lipoproteini

velike gustine transportuju holesterol iz tkiva u jetru, a obzirom da sadrže visok procenat proteina, čine

tzv. ,,dobri“ holesterol u krvi.

Veća koncentracija holesterola u krvi uzrokuje njegovo taloženje po unutrašnjim zidovima krvnih

sudova i izazivanje ozbiljnih oboljenja (ateroskleroze na primer). Holesterol se sintetiše samo u

životinjskim ćelijama, polazeći iz acetil-koenzima A. U posebnim ćelijama jetre, nadbubrežne žlezde i

jajnika, holesterol se prevodi u žučne kiseline, steroidne hormone i vitamine D grupe, što ga čini

prekursorom za sintezu ovih važnih organskih jedinjenja. Svakodnevno ljudski organizam stvara od 3 do

5 g holesterola, od čega se u jetri stvara oko 90% te količine.

Slika 5. Hemijska struktura holesterola


Kokošja jaja Aceton Petrol-etar Metanol

Etar Kalijum-hidroksid Anhidrovani kalijum-karbonat Sumporna kiselina PRIBOR I OPREMA:

Erlenmajer

Levak po Bihneru Levak za odvajanje Boca za filtraciju u vakuumu Stativ sa prstenom


25

Balon sa okruglim dnom Refluks kondenzator Čaša

IZVOĐENJE VEŽBE:

Odvojena žumanca od 5 kokošjih jaja sakupe se u erlenmajer i mućkaju se 30 minuta sa oko 75 ml acetona.

Žuto obojeni ekstrakt se odvoji dekantovanjem, a ostatak se ponovo mućka sa istom količinom

acetona.

Čvrsti deo odvoji se ceđenjem i ispira se sve dok filtrat ne bude bezbojan.

Acetonski ekstrakti se spoje, a zatim suše pomoću anhidrovanog K2CO3.

Osušeni rastvor se procedi.

Filtratu se dodaju dovoljna količina petroletra i destilovane vode.

Smesa se prenese u levak za odvajanje i vrši se ekstrakcija.

Petrol-etar se iz ekstrakta odstrani uparavanjem na rotacionom vakuum uparivaču, a ostatak

(lipidi) rastvori sa 50 ml metanola i tome se doda 1,5 g KOH i oko 5 ml vode.

Smesa se zagreva na ključalom vodenom kupatilu uz refluks kondenzaciju oko 3 sata.

Nakon izvršene saponifikacije reakciona smeša se izruči u čašu od 1 l u kojoj se nalazi 500 ml

vode pri čemu se sapuni rastvore, a holesterol disperguje.

Posle stajanja talog se slegne pa se zatim procedi na Bihnerovom levku. Iz filtrata se jednostavnim zakišeljavanjem i ceđenjem dobijaju masne kiseline.

Talog, sirovi holesterol, se rastvori u etru, etarki ekstrakt se ispere vodom i suši preko anhidrovanog kalijum-karbonata.

Kalijum-karbonat se odstrani ceđenjem, a etar destilacijom.

Ostatak posle udaljavanja etra rastvori se u malo toplog metanola i ostavi na hladnom mestu.

Holesterol kristališe u obliku bezbojnih igličastih kristala. Tačka topljenja holesterola je 145 ºC.


26

IZVEŠTAJ:


Izračunaj prinos holesterola.


27

VII Izolovanje karotenoida iz biljnog materijala

1. Izolovanje β-karotena iz šargarepe

Karotenoidi su organska jedinjenja koja se svrstavaju u terpenoide: po formuli su tetraterpenoidi, zbog obojenosti pigmenti, a po fizičkim osobinama su masne komponente. Osnovni značaj karotenoida je u tome što učestvuju uz hlorofile i fikobilinske pigmente u fotosintezi.

Centralni deo molekule sastavljen je od dugog konjugovanog niza, najčešće osam izoprenskih

jedinica, vezanih tako da dve CH3 grupe najbliže centru zauzimaju položaj 1,6, a ostale su u položaju 1,5.

Na krajevima ovog niza nalaze se bilo dva otvorena niza, bilo dva prstena ili je na jednom kraju otvoren niz, a na drugom prsten. Posledica ovakve strukture je velika reaktivnost karotenoida, podložnost autoksidaciji, intezivna boja, kao i karaktersitični apsorpcioni spektri.

Slika 6. Hemijska struktura β-karotena.

Slika 7. Hemijska struktura likopena.

Karotenoidi koji su ugljovodonici nazvani su karotenima, a oksidovani derivati karotena

ksantofilima. Svi karotenoidi su rastvorni u mastima, većina je rastvorna u organskim rastvaračima (karoteni), dok su neki rastvorni u alkoholu i alkalijama (ksantofili). Karotenoidi koji su vezani za belančevine i ugljenehidrate oblik u kojem se najčešće nalaze u prirodi- jesu jedinjenja rastvorna u vodi. Nekoliko pigmenata obično dolazi zajedno i to u malim količinama. U višim biljkama najčešće se i u

najvećim količinama nalaze β-karoten, lutein, kao i violaksantin i neoksantin, koji su najvažniji ksantofili u višim biljkama. U nekim biljkama je prisutan i α-karoten, mada u mnogo manjim količinama.

U biljkama se nalaze tri vrste karotena: α, β i γ. Najzastupljeniji je β-karoten, i to u svim zelenim biljkama. U jesen, kada dolazi do degradacije hlorofila u lišću, čija zelena boja inače prekriva žutu boju β-karotena pojavljuje se karakteristična žuta boja usled prisustva ovog pigmenta. Kod β-karotena dvostruke veze iz prstena konjugovane su sa susednim dvostrukim vezama u lancu. Ovakav konjugovani

položaj dvostrukih veza je od fiziološkog značaja, jer samo od ove β-jononske strukture može da nastane vitamin A. HEMIKALIJE I REAGENSI: Šargarepa

Petrol-etar Etanol (85%)


28

Etanol (96%) PRIBOR I OPREMA:

Balon sa okruglim dnom

Rotacioni vakuum uparivač Erlenmajer Levak za odvajanje Stativ sa prstenom Levak po Bihneru Boca za filtraciju u vakuumu Filter papir

IZVOĐENJE VEŽBE:

U erlenmajer stavi se 10 g fino nastrugane šargarepa i tome doda 100 ml vrućeg 96% etanola. Ekstrakcija se vrši u toku 30 minuta. Nakon završene ekstrakcije žuti rastvor se od čvrstog ostatka odvaja ceđenjem na Bihnerovom levku. Filtratu dodati toliko vode, da se dobije oko 85% etanolni rastvor, koji se ohladi na sobnoj temperaturi. Ova smeša prenese se u levak za odvajanje, doda 50 ml petrol-etra i dobro promućka. Ostavi se da se odvoje slojevi, u gornjem se nalaze karoteni, rastvorni u petrol-etru, a u donjem ksantofili, rastvorni u alkoholu. Najpre se ispusti donji alkoholni sloj, a zatim gornji petrol-etarski

koji se stavi sa strane. Alkoholni sloj se ponovo vrati u levak za odvajanje i u porcijama ispira sa po 2 ml petrol-etra sve dok petroletarski sloj ostane bezbojan. To pokazuje da su svi karoteni ekstrahovani. Spojeni petrol-etarski rastvori se isperu sa 85% etanolom, kako bi se uklonili eventualno prisutni ksantofili.

Petrol-etarski sloj koncentruje se na rotacionom vakuum uparivaču pri čemu temperatura vodenog kupatila ne treba da prelazi 40 ºC. Uljasti ostatak čuva se u mraku, pod vakuumom i na niskoj temperaturi. Karoteni prisutni u ovom ekstraktu odvajaju se nekom od hromatografskih metoda.

2. Izolovanje likopena iz paradajza

Likopen je polien sa 11 dvostrukih veza (C40H56, aciklički tetraterpen). Svrstava se u grupu

karotenoida i strukturni je izomer karotena, ali ne pokazuje vitaminske aktivnosti. Nalazi se u plodovima voća i povrća (jabuka, paradajz) i daje plodovima crvenu boju. Apsorpcioni maksimum je na 504 nm. Po strukturi su karoteni i likopen vrlo slični i njihovo prečišćavanje pomoću uobičajenih metoda kristalizacije je bilo vrlo teško. Nagli razvoj na području hemije karotenoida započeo je primenom hromatografske apsorpcije na aluminijum-oksidu, magnezijum-oksidu ili kalcijum-karbonatu. Upravo pri odvajanju karotenoida ova se tehnika ubrzano razvijala.

IZVOĐENJE VEŽBE:

Odvagati 20 g paradajz pirea u erlenmajer (150-200 ml) i dodati 20 ml acetona.

Smesu mešati 15-20 minuta na magetnoj mešalici i nakon toga je profiltrirati.

Filtrat odbaciti, a talog preneti u novi erlenmajer, dodati dihlormetan (25 ml) i sadržaj mešati 5

minuta. Sadržaj dekantovati preko Bihnerovog levka, ostavljajući glavninu taloga u erlenmajeru.

Ponoviti ekstrakciju sa novom količinom dihlormetana (10 ml).

Sadržaj profiltrirati u istu bocu, a potom ga osušiti sa Na2SO4 i filtrirati u čistu izvaganu posudu.

Na vodenom kupatilu otpariti višak rastvarača i izračunati prinos.

Nakon toga snimiti spektar dobijenog likopena rastvorenog dihlormetanu.


29

3. Hromatografija na tankom sloju (TLC)

TLC je jednostavna, brza i jeftina procedura koja hemičaru daje odgovor koliko se komponenti

nalazi u smeši. Ona se koristi za identifikaciju komponente upoređujući njenu Rf vrednost sa Rf vrednošću poznate komponente (obe se nalaze na istoj ploči).

Različite komponente u uzorku putuju različitim brzinama zbog razlika u rastvorljivosti u rastvaraču i razlikama u privlačnosti sa stacionarnom fazom. Rezultati zavise od upotrebljenog rastvarača.

Vizualizacija tačaka se može napraviti tako što ploču prskamo sa odgovarajućim detekcionim

reagensima. Za svaku klasu organskih spojeva postoje karakteristični detekcioni reagensi koji sa komponentema uzorka daju karakteristična obojenja ili pojavu fluorescencije.

Uzorak rastvoren u odgovarajućem rastvaraču se nanosi u vidu mrlje na jednu stranu ploče, na

udaljenosti 1 cm od ivice. Ploča se unosi u komoru na čijem dnu se nalazi rastvarač koji kapilarnim silama prolazi kroz adsorbens noseći sa sobom komponente uzorka, koje se kreću do određene udaljenosti na ploči. Zbog različitog afiniteta komponente se zaustavljaju na različitim mestima na ploči, što omogućava njihovu identifikaciju.

Za svaku komponentu karakteristična je njena Rf vrednost koja se dobije iz odnosa dužine

pređenog puta komponente i dužine pređenog puta mobilne faze.

ZADATAK VEŽBE

Izvrši separaciju komponenti ekstrahovanih karotenoida tankoslojnom hromatografijom. Rezultate analize upiši u svoj laboratorijski dnevnik.


dihlormetan PRIBOR I OPREMA:

Erlenmajer od 250 ml

staklene kapilare ploče za tankoslojnu thomatografiju kada za tankoslojnu hromatografiju prskalica za tankoslojnu hromatografiju UV-lampa IZVOĐENJE VEŽBE:

Pripremi dve hromatografske ploče. Na svaku nanesi pripremljene uzorke

Odredi startnu liniju na hromatografskoj ploči, oko 1,5-2,0 cm od ivice ploče.

Na startnu liniju nanesi uzorke karotenoida, tako da je najmanji razmak među mrljama 0,5 cm.

Kao mobilnu fazu koristiti dihlormetan.

Pažljivo prenesi hromatografske ploče u kadicu za hromatografiju u kojoj se nalazi mobilna faza.

Startna linija mrlja uzoraka mora biti iznad površine mobilne faze.

Kada mobilna faza pređe određeni put na hromatografskoj ploči, ploče pažljivo izvadi iz kade,

označi front i ostavi ploče da se osuše. DETEKCIJA POD UV LAMPOM na 254 nm

Suvu ploču staviti pod UV lampu i uočiti da li je neke od komponata moguće detektovati na ovaj način.


30

IZVEŠTAJ:


masa uzorka (biljnog materijala) ___________ masa praznog balona___________ masa balona sa likopenom _____________ masa likopena _______________ prinos _________________

Izračunaj prinos β-karotena/likopena.

TLC Mobilna faza: _____________________________________________________________ Stacionarna faza: ___________________________________________________________

Način detekcije:____________________________________________________________ Upiši Rf vrednosti i odgovarajuću boju detektovane komponente u tabelu.

Uzorak

Rf vrednost Boja


31

VIII Izolovanje alkaloida iz biljnog materijala

Alkaloidi su prirodna organska jedinjenja koji sadrže azot, a tako su nazvani zbog njihovog baznog (“alkalijama sličnog") karaktera kojem je razlog upravo azot. Danas je poznato više od 12 000

alkaloida, pa pripadaju jednoj od najbrojnijih grupa prirodnih jedinjenja. Izrazitog su, ali različitog, fiziološkog delovanja na organizam čoveka i životinja. Deluju već u

vrlo malim količinama. Neki se u malim dozama koriste kao jaki i nezamenljivi lekovi, dok su gotovo svi u većim količinama vrlo jaki otrovi. U biljkama alkaloidi se ne nalaze u slobodnom obliku, već su vezani za neke organske kiseline (na primer: oksalnu, sirćetnu, mlečnu, vinsku, limunsku i druge) ili u obliku estara, amida i glikozida. Čisti alkaloidi većinom su beli sitnokristalni praškovi ili tečnosti. Nerastvorni su u vodi, ali se rastvaraju u neorganskim kiselinama i u organskim rastvaračima. Njihove soli su čvrste, rastvorne u vodi, a nerastvorne u organskim rastvaračima.

Zbog raznolikosti i složenosti alkaloidnih struktura ne postoji sistematizovana klasifikacija ovih jedinjenja. Prema hemijskoj klasifikaciji alkaloidi se mogu podeliti u sledeće grupe:

Derivati piridina i piperidina,

Derivati tropana

Derivati hinolina

Derivati izohinolina

Derivati indola

Derivati imidazola

Derivati purina

Aciklični alkaloidi

Sterodini alkaloidi

Slika 8. Hemijska struktura kofeina, teobromina i teofilina

1. Izolovanje kofeina iz zrna kafe (Coffea arabica L.) Literaturna fizička svojstva za kofein: tt = 235-238 ºC, sublimuje pri 178 ºC

IR (KBr): v(C=O) 1700, 1660 cm-1; v(C=N) v(C=C) 1550 cm-1 Rastvorljivost: vrlo dobro rastvorljiv u hloroformu, pirimidinu i vrućoj vodi; slabo je rastvorljiv u hladnoj vodi, etanolu, acetonu, benzenu i sirćetnoj kiselini; nerastvoran je u dietiletru, ugljen-disulfidu i ugljentetrahloridu. HEMIKALIJE I REAGENSI:

Mlevena zrna kafe


32

destilovana voda rastvor olovo-acetata hloroform 5% rastvor natrijum-hidroksida

anhidrovani Na2SO4 PRIBOR I OPREMA:

Balon sa okruglim dnom refluks kondenzator Bihnerov levak i guč-boca filter-papir erlenmajer

ledeno kupatilo levak za odvajanje hemijske čaše levak za ceđenje lakmus papir IZVOĐENJE VEŽBE:

U balon sa okruglim dnom od 500 ml stavi se 20 g mlevene kafe i 75 ml vode. Smeša se refluktuje uz povratni kondenzator 20 minuta. Nakon refluktovanja vruća smeša se profiltrira pomoću Bihnerovog levka preko grubog filtar-papira. Filtrat se koristi za dalji rad, a talog se baci.

Filtrat kafe se stavi u erlenmajer i doda se 7,5 ml vodenog rastvora olovo-acetata i uz povremeno mešanje smeša se zagreva 5 minuta pri čemu se stvara talog. Vruć rastvor se profiltrira preko Bihnerovog levka na koji je stavljen filtar-papir. Talog se ispere sa 20 ml vruće vode. Filtrat se hladi na ledu. Ohlađeni filtrat se prebaci u levak za odvajanje i ekstrahuje dva puta sa po 10 ml hloroforma uz lagano mućkanje.

Ne sme se jako mućkati jer bi došlo do stvaranja emulzije. Skupljaju se donji slojevi (hloroformski ekstrakti) i izmućkaju se s 10 ml vodenog rastvora 5% natrijum-hidroksida. Nakon odvajanja slojeva, hloroformski sloj se još dodatno mućka sa 10 ml vode. Ispiranje sa NaOH služi za uklanjanje tragova preostalih kiselina (galna kiselina i hlorogenska). Lakmus papirom se proveri neutralnost rastvora. Nakon toga hloroformski sloj se suši preko bezvodnog Na2SO4. Nakon sušenja rastvor se profiltrira u balon sa okruglim dnom. Hloroform se upari na rotacionom vakuum-uparivaču ili zagrijavanjem na vodenom kupatilu (u digestoru!) pri 40-50 ºC. Kristali koji su nastali u kristali kofeina.

2. Izolovanje kofeina iz čaja (postupak A)


Crni čaj dihlormetan rastvor NaOH (c= 6 mol/dm3)

destilovana voda anhidrovani Na2SO4 PRIBOR I OPREMA:

Hemijska čaša levak za odvajanje erlenmajer

levak za ceđenje filter-papir balon sa okruglim dnom


33

IZVOĐENJE VEŽBE: U čaši se zagreje 20 ml vode i u kipuću vodu se stave tri vrećice crnog čaja (izmeriti masu!).

Nakon 1 minuta vrećice čaja se izvade iz vode i istisne se iz njih što je moguće više vode. Vrećice čaja se vrlo dobro moraju iscediti jer kofein je vrlo dobro rastvoran u vrućoj vodi i on prelazi u vodeni sloj.

Ostatak većeg dela tanina ostaje unutar vrećica. Rastvor se prenese u levak za odvajanje radi ekstrakcija kofeina. Ekstrakcija se vrši tri puta sa po

20 ml dihlormetana. Ekstrahovani kofein (oko 60 ml rastvora) se ispere dva puta sa 20 ml rastvora NaOH (c= 6 mol/dm3) i, na kraju, jednom sa 20 ml hladne destilovane vode. Sloj dihlormetana se suši preko bezvodnog Na2SO4. Rastvor se upari do suva (vodeno kupelo ili rotacioni vakuum-uparivač). Dobija se beli talog.

3. Izolacija kofeina iz čaja (postupak B)


Crni čaj Na2CO3 destilovana voda hloroform anhidrovani Na2SO4

PRIBOR I OPREMA:

Hemijska čaša sahatno slaklo rešo Bihnerov levak i guč-bova levak za odvajanje

erlenmajer levak za ceđenje filter-papir IZVOĐENJE VEŽBE:

8 g natrijum-karbonata i 100 ml vode pomeša se u čaši i zagreva dok se karbonat ne rastvori. Dodati 10 g čaja i nastaviti zagrevanje do ključanja. Tada se smanji grejanje i pusti da lagano ključa poklopljeno sahatnim staklom (još oko 20 minuta). Nakon toga se vrući rastvor profiltrira preko

Bihnerovog levka. Filtrat se u levku za odvajanje ekstrahuje dva puta sa po 20 ml hloroforma. Skuplja se donji (hloroformski) sloj u erlenmajeru, zatim suši pomoću bezvodnog Na2SO4 i konačno upari do suva (vodeno kupelo ili rotacioni vakuum-uparivač). Dobijaju se beli kristali.

4. Izolacija teobromina iz kakao praha

Teobromin je alkaloid i pripada molekulama poznatim kao metilksantini. U manjim količinama nalazi se u guarani i čaju. Koristi se kao stimulator bubrežne cirkulacije, eliminator štetnih materija putem urinarnog kanala i kao diuretik.

Literaturna fizička svojstva za teobromin: tt = 290 - 295 ºC IR (KBr): v (C=O) 1700 cm-1, v (C=N) 1550 cm-1


34


Kakao prah methanol destilovana voda

MgO rešo hloroform anhidrovani Na2SO4

dietiletar PRIBOR I OPREMA:

Hemijska čaša

stakleni štapić vodeno kupatilo balon sa okruglim dnom refluks kondenzator stativ sa klemama Bihnerov levak i guč-boca filter papir

levak za odvajanje erlenmajer levak za ceđenje IZVOĐENJE VEŽBE:

U hemijskoj čaši pripremi se smeša kakao praha (20 g) i metanola (20 ml), a zatim se doda rastvor MgO (6 g u 40 ml vode). Zagrevati na vodenom kupatilu 30-45 minuta uz mešanje, dok smeša ne

postane jednolična (do stvaranja mrvičaste polučvrste forme). Tada se smeša prebaci u balon sa okruglim dnom i doda se 150 ml hloroforma, pa se refluktuje 30 minuta. Vruća smeša se profiltrira preko Bihnerovog levka, a talog ispere sa 25 ml vrućeg hloroforma. Filtrat nakon hlađenja ekstrahovati hloroformom, osušiti sa bezvodnim Na2SO4 i potom prebaciti u balon sa okruglim dnom. Filtrat se upari do suva (vodeno kupatilo ili rotacioni vakuum-uparivač). U balon se potom doda 50 ml dietiletra. Balon se zatvori staklenim zatvaračem i ostavi da stoji 24 sata. Izračunati prinos teobromina.

5. Izolacija piperina iz zrna crnog bibera (Piper nigrum L.)

Nosioci ljutog ukusa bibera su alkaloidi koji sadrže piperidinsko jezgro. Piperin je jedan od takvih alkaloida. Glavni je sastojak crnog bibera (Piper nigrum L.) koji se ubraja u porodicu Pipereceae. Domovina bibera su Indija i Indonezija gde se koristi u tradicionalnoj medicini, kao insekticid i začin. Njegova primena uključuje stimuliranje krvotoka i ublažavanje bolova u mišićima. Alkaloid piperin

nalazi se u zrnu crnog i belog bibera i u nekim drugim srodnim biljkama. U zrnu crnog bibera ima ga 6-9%.

Slika 9. Hemijska struktura piperina

Literaturne fizičke osobine za piperin:

Bezbojni kristali tt = 130 – 132,5 ºC,


35

ρ = 1,193 g/cm3 IR (KBr): v (C=O) 1634 cm-1

Rastvorljivost: u vodi 0,004 g/100 cm3 pri 18 ºC, u etanolu 23 g/100 cm3 pri 60 ºC


Zrno crnog bibera 96% etanol destilovana voda dietiletar 10% rastvor KOH u etanolu

10% rastvorom Na2CO3

PRIBOR I OPREMA:

Balon sa okruglim dnom refluks kondenzator vodeno kupatilo Bihnerov levak i guč-boca

filter papir hemijska čaša IZVOĐENJE VEŽBE:

U balon s okruglim dnom stavi se 10 g samlevenog zrna crnog bibera. Nasuti 96% etanol u balon i zagrevati na vodenom kupatilu u refluks 3 sata. Vruća smeša se profiltrira preko Bihnerovog levka preko grubog filter papira. Filtrat se upari na rotacionom vakuum-uparivaču na temperaturi nižoj od 60 °C.

Ostatak posle koncentrovanja tretira se sa 10 ml 10% rastvora kalijim-hidroksida u etanolu. Posle 15 minuta alkoholni rastvor se filtracijom odvoji od taloga. Talog se ispira 10% rastvorom Na2CO3, a zatim vodom do neutralne reakcije i na kraju sa malo dietiletra. Piperin ostavi da iskristališe u eksikatoru.

Uraditi bojenu reakciju piperina s koncentrovanom H2SO4. Rastvoriti par kristalića izolovanog

jedinjenja u etanolu i dodati par kapi koncentrovane H2SO4. U prisustvu piperina nastaje intenzivno crveno obojenje koje nestaje pažljivim dodatkom vode. OPREZ!!!!

Uraditi bojenu reakciju piperina s koncentrovanom HNO3. Rastvoriti par kristalića izolovanog jedinjenja u etanolu i dodati nekoliko kapi HNO3. U prisustvu piperina nastaje zelenožuto obojenje koje brzo prelazi u narandžasto i na kraju u intenzivno crveno.


36

IZVEŠTAJ:


Izračunaj prinos piperina.

Izračunaj prinos dobivenog kofeina/teobromina u odnosu na početnu masu materijala!

1. Zašto je važno dobro ohladiti vodeni ekstrakt čaja pre dodatka dihlormetana za ekstrakciju? 2. Kojim metodama je moguće izvršti prečišćavanje kofeina?


37

IX Flavanoidi

Fenolna jedinjenja predstavljaju široko rasprostranjenu heterogenu grupu sekundarnih biljnih metabolita i jednu od najvažnijih klasa prirodnih antioksidanasa. To su supstance koje u strukturi imaju

jedan ili više aromatičnih prstenova sa jednom ili više hidroksilnih grupa i obično se dele na:

fenolne kiseline

flavonoide

stilbene

kumarine

tanine.

Ove supstance se mogu nadi u slobodnom obliku ili češće u obliku glikozida sa različitim šećernim ostacima ili u obliku kompleksa sa organskim kiselinama, aminima, lipidima, ugljenim hidratima i drugim polifenolnim jedinjenjima. Za biološku aktivnost je zaslužan isključivo aglikonski deo molekula. U biljnim organizmima polifenoli obavljaju niz funkcija koje imaju veliki uticaj na ekofiziologiju biljaka: deluju kao antioksidansi, antimikrobni agensi, fotoreceptori, vizuelni atraktanti nekih insekata važnih za oprašivanje cvetova, repelenti herbivora ili kao zaštita biljnih tkiva od prekomernog UV-zračenja. Smatra se da je antioksidativna aktivnost polifenolnih jedinjenja prvenstveno

rezultat njihove sposobnosti da budu donori vodonika slobodnim radikalima (npr. u reakciji oksidacije lipida) nakon čega nastaju manje reaktivni fenoksi radikali:

Ph-OH + ROO˙→ Ph-O˙ + ROOH

Relativno velika stabilnost fenoksi radikala se objašnjava delokalizacijom elektrona, uz

postojanje više rezonantnih formi (slika 10).

Slika 10. Stabilizacija fenoksi radikala rezonancijom

Flavonoidi predstavljaju najznačajniju grupu fenolnih jedinjenja. Osnovni strukturni skelet

flavonoida čine 15 atoma ugljenika u osnovnoj C6-C3-C6 strukturi, od kojih devet pripada benzopiranskom prstenu (benzenski prsten A kondenzovan sa piranskim prstenom C), a ostalih šest ugljenikovih atoma čine benzenski prsten B povezan sa benzopiranskim prstenom na poziciji C-2 (flavoni, flavonoli, flavononi, dihidroflavoni, flavani i antocijanidini), na poziciji C-3 (izoflavoni) i na poziciji C-4 (neoflavoni) (slika 11)

Slika 11. Osnovna struktura flavonoida


38

U prirodi se najčešde sreću jedinjenja sa hidroksilnim grupama u C-3’ i C-4’ položaju i nešto manje sa jednom hidroksilnom grupom u položaju C-4’. Šećerna komponenta flavonoida je najčešće vezana u položaju C-3 i ređe u položaju C-7. Kao šećerna komponenta najčešće se javlja glukoza, a ređe galaktoza, ramnoza i ksiloza. Flavonoidi su rasprostranjeni u svim zelenim biljkama, a nađeni su i u nižim

organizmima. Najrasprostranjeniji su flavonoli, koji imaju oko 200-300 poznatih aglikona, i flavoni. Kvercetin, kampferol i miricetin su najzastupljeniji flavonoli, a od flavona najpoznatiji su luteolin i apigenin.

Grupu fenolnih jedinjenja čine i antocijani i antocijanidini koji su metabolički produkti flavanona.

Antocijani su glikozidi antocijanidina, flavonoida koji su zaslužni za plavu, ljubičastu i crvenu boju voda i povrda. Osnovna struktura antocijana je 2-fenilbenzopirilijum ili flavilijum katjon.

1. Ekstrakcija flavonoida iz herbe hibiskusa (Hibiscus sp.)

Ekstrakcija fenolnih materija može se vršiti ultrazvučnom ekstrakcijom. Ova ekstrakcija

primenjuje ultrazvuk u cilju intenziviranja procesa i zove se sonifikacija. Sonifikacija predstavlja upotrebu visoko-frekfentnog ultrazvuka u operaciji ekstrakcije supstanci iz biljnog materijala. Ultrazvuk proizvodi razaranje ćelija, redukovanje veličine čestica i prolaz ultrazvučnog talasa kroz čvrst materijal, što dovodi do veće dodirne površine između čvrste i tečne faze, kao i boljeg kontakta rastvarača sa komponentama.


Biljni materijal 70% etanol

PRIBOR I OPREMA:

Erlenmajer ultrazvučna kada stativ i klema Bihnerov levak i guč-boca filter papir

balon sa okruglim dnom

IZVOĐENJE VEŽBE:

U erlenmajer nasuti 100 ml 70% etanola, 10 g biljnog materijala i klemom pričvrstiti erlenmajer u ultrazvučnoj kadi tako da cela količina biljke bude potopljena. Ostaviti 30 minuta. Nakon toga, ekstrakte profiltrirati kroz filter papir (na Bihnerovom levku) i višak rastvarača upariti pod smanjenim pritiskom pomoću rotacionog vakuum uparivača. Nakon uparavanja, na dobijenom ekstraktu odraditi ispitivanja.

2. DPPH test za određivanje antioksidativnog dejstva

Ovaj spektrofotometrijski test meri antioksidativni kapacitet biljnog ekstrakta kao „hvatača” 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) radikala. Neposredno pre eksperimenta treba pripremiti svež radni rastvor DPPH.

Suvi ekstrakt hibiskusa treba rastvoriti u 96%–om etanolu da se dobije koncentracija od 1 mg/ml

(w/v). Metanolni rastvor DPPH se koristi kao slepa proba. Askorbinska kiselina rastvorena u vodi se

uvodi kao pozitivna kontrola (referentni antioksidans).


39

3. Određivanje sadržaja ukupnih fenola

Sadržaj ukupnih fenola u suvim ekstraktima određuje se metodom po Folin-Ciocalteu. Metoda po Folin-Ciocalteu je zasnovana na merenju redukujudeg kapaciteta polifenolnih jedinjenja, čijom disocijacijom nastaje proton i fenoksidni anjon. Nastali fenoksidni anjon redukuje Folin-Ciocalteu reagens do plavo obojenog jona (Fenol-MoW12O40)

4-:

Na2WO4/Na2MoO4 + Fenol → (Fenol – MoW11O40)4–

Mo(VI) (žuto obojen) + e– → Mo(V) (plavo obojen)

U test epruvetu treba odmeriti 2 ml ekstrakta hibiskusa koncentracije 1 mg/ml, a zatim dodati 0,5

ml rastvora Folin–Ciocalteu reagensa i 2 ml 20 % vodenog rastvora Na2CO3.

Slepa proba je priprema se tako da sadrži sve komponente i destilovanu vodu umesto uzorka.

Galna kiselina rastvorena u vodi se uvodi kao pozitivna kontrola (referentni antioksidans).

Ukupan sadržaj fenola u uzorcima izražava se u ekvivalentima galne kiseline kao mg GAE/g

suvog ekstrakta.

4. Ukupni sadržaj flavonoida

Za određivanje ukupnog sadržaja flavonoida koristi se procedura po Parku. U test epruvete

odmerava se po 1 ml uzorka koncentracije 1 mg/ml, zatim dodaje 3 ml destilovane vode i 0,3 ml 5%

rastvora NaNO2. Nakon 5 minuta stajanja na sobnoj temperaturi dodaje se 3 ml 1% rastvora AlCl3, a

nakon 5 minuta još 2 ml 1 mol/dm3 rastvora NaOH i destilovana voda do 10 ml. Slepa proba sadrži sve

komponente i 1 ml 96% etanola umesto uzorka.

5. Ispitivanje prisustva antocijana (pH diferencijalna metoda)

U dve epruvete odmeri se po 1 ml uzorka koncentracije od 1 mg/ml. U prvu epruvetu se doda

3 ml rastvora kalijum-hlorida, čija je pH podešena na 1,0 pomoću HCl, a u drugu takođe 3 ml acetatnog

pufera (pH=4,5). Ukoliko su prisutni u uzorku, prirodni antocijani će u jako-kiseloj sredini biti crveno

obojeni.


40

IZVEŠTAJ:


Izmeriti masu dobijenog ekstrakta i napisati zapažanja prilikom izvođenja testova.


41

X Dokazne reakcije za odabrane klase prirodnih

jedinjenja

1. BOJENE REAKCIJE ALKALOIDA

Opšte reakcije kojima se dokazuje većina alkaloida, bez obzira na njihovu hemijsku prirodu, jesu

takozvane “opšte taložne reakcije”. Zasnovane sun a građenju teško rastvornog kompleksa sa

odgovarajućim reagensima, što se manifestuje pojavom zamućenja ili taloga. Najčešće se koriste sledeći

reagensi: Mejerov reagens (K2HgI4), Dragendorfov reagens (KBiI4), Hagerov reagens (zasićeni rastvor

pikrinske kiseline), Vagnerov reagens (KI3; I2 u KI), rastvor fosfomolibdenske kiseline.

IZVOĐENJE VEŽBE:

1. Dragendorff-ov test

U 1 ml ekstrakta droge dodati 1 ml Dragendorff-ovog reagensa. Pojava narandžastocrvenog taloga

ukazuje na prisustvo alkaloida.

2. Meyer-ov test

U 1 ml ekstrakta droge dodati 1 ml Meyer-ovog reagensa. Pojava beličastog/žućkastog taloga ukazuje na

prisustvo alkaloida.

3. Hager-ov test

U 1 ml ekstrakta droge dodati 1 ml Hager-ovog reagensa. Pojava žutog taloga ukazuje na prisustvo

alkaloida.

4. Wagner-ov test

U 1 ml ekstrakta droge dodati 1 ml Wagner-ovog reagensa. Pojava narandžastocrvenog taloga ukazuje na

prisustvo alkaloida.

2. BOJENE REAKCIJE KAROTENOIDA

IZVOĐENJE VEŽBE:

1. Winterstein-ova reakcija

Likopen rastvoren u koncentrovanoj sumpornoj kiselini daje plavozelenu boju.

2. Carr–Price reakcija

Hloroformski rastvor likopena sa antimonom(III)-hloridom daje plavu boju koja je nepostojana i brzo se

transformiše u crvenu ili ljubičastu.


42

3. BOJENE REAKCIJE FENOLA (rastvornih u vodi)

Reakcija fenolnih jedinjenja sa gvožđe(III)-hloridom

Molekul fenola je bogat elektronima (π-elektronski sistem aromatičnog prstena i dva slobodna

elektronska para na atomu kiseonika, što ga čini odličnim ligandom). Sa jonima prelaznih metala lako gradi komplekse. U reakciji vodenog rastvora fenola sa gvožđe(III)-hloridom nastaju obojena kompleksna jedinjenja. Ova reakcija služi za kvalitativno dokazivanje fenola:

6 C6H5OH + FeCl3 → [Fe(C6H5O)6]3- + 6 H+ + 3 Cl-


Vodeni rastvori fenola Vodeni rastvor gvožđe(III)-hlorida PRIBOR I OPREMA:


U epruvetu usuti 2 ml rastvora fenola i dodati par kapi vodenog rastvora FeCl3. Pojavljuje se

ljubičasta boja od nastalog kompleksa.

4. TEST NA ALKOHOLE

1. Oksidacija alkohola pomoću kalijum-dihromata (Jones-ova oksidacija)

Alkalni dihromati (Na2Cr2O7 i K2Cr2O7) su narandžasto obojene kristalne supstance, koje se odlično rastvaraju u vodi. Kada reaguju sa alkoholima u kiseloj sredini, oni boju iz narandžaste menjaju u tamno-zelenu, što je pokazatelj završene reakcije oksidacije. Na ovoj hemijskoj reakciji se zasniva princip funkcionisanja alko-testa.


Etanol rastvor K2Cr2O7 koncentrovana H2SO4 PRIBOR I OPREMA:

Epruveta vodeno kupatilo IZVOĐENJE VEŽBE:

U epruvetu sipati oko 2 ml etanola, dodati jednu kap koncentrovane sumporne kiseline i oko 2 ml vodenog rastvora kalijum-dihromata. Rastvor zagrijavati na vodenom kupatilu sve do promjene boje rastvora iz narandžaste u zelenu.


43

2. Lukasov test


1o alkohol (etanol) 2o alkohol (izopropanol ili 2-butanol)

3o alkohol (t-butanol) anhidrovani ZnCl2

koncentrovana HCl PRIBOR I OPREMA:

Epruveta

IZVOĐENJE VEŽBE:

U epruveti dodati 1 ml alkohola i 5 ml Lukasovog reagensa. Dobro promućkati sadržaj epruvete i

ostaviti je da stoji na sobnoj temperature. Zabeležiti neophodno vreme za formiranje alkil-hlorida, koji se

odvaja kao gornji sloj u epruveti (ili formira emulziju).

Očekivano vreme:

3o alkohol: trenutna ili 2-3 minuta 2o alkohol: 5 -10 minuta 1o alkohol: nema reakcije

5. BOJENE REAKCIJE SA ACETONOM

Frommer-ova reakcija

Prilikom reakcije acetona sa salicil-aldehidom u baznoj sredini dolazi do aldolne kondenzacije, koja je praćena eliminacijom četiri molekula vode i nastajanjem obojenog kondenzacionog proizvoda:

Slika 12. Frommer-ova reakcija

Dobijeni adukt (natrijum-2,2'-[3-oksapenta-1,4-dien-1,5-diil]difenolat) je intenzivno crvene boje i ova reakcija je dugo vremena korišćena za dokazivanje acetona u mokraći kod pacijenata koji su oboljeli od acetonurije i dijabetesa. Reakcija je veoma osetljiva tako da se njom mogu dokazati i tragovi acetona.


Aceton rastvor salicil-aldehida koncentrovan rastvor NaOH PRIBOR I OPREMA:

Epruveta

plamenik


44

IZVOĐENJE VEŽBE:

U epruvetu sipati 1 ml acetona, dodati mu desetak kapi rastvora salicil-aldehida i pažljivo niz zid epruvete uliti 3 ml rastvora natrijum-hidroksida. Epruvetu zagrevati pažljivo na plameniku, pri čemu se na dodirnoj površini između dva sloja obrazuje prsten crvene boje.


45

IZVEŠTAJ:


Napiši zapažanja prilikom izvođenja reakcija (dobijene boje, brzinu reakcije itd.).

Documents

RADNA SVESKA IZ HEMIJE PRIRODNIH PROIZVODA izabrane … izabrane vežbe 2017-2018 (1).pdfHEMIJA PRIRODNIH PROIZVODA – laboratorijske vežbe 0 RADNA SVESKA IZ HEMIJE PRIRODNIH PROIZVODA