718
Radmila Maksimović OSNOVI MEDICINSKE BIOHEMIJE

Radmila Maksimović.doc

Embed Size (px)

DESCRIPTION

biohemija

Citation preview

Radmila Maksimović

OSNOVIMEDICINSKEBIOHEMIJE

Banja Luka, 2010

OSNOVI MEDICINSKE BIOHEMIJE

Autor:dr sci. fharm. Radmila Maksimović

Recezenti:Prof. dr Rade Biočanin, expertProf. dr sci. Jovica Jovanović

Lektor:GORDANA Jovanović (Bilanović)

Izdavač:Panevropski univerzitet "APEIRON"

Banja Luka1. izdanje, godina 2010.

Odgovorno lice izdavača, DARKO Uremović

Glavni i odgovorni urednik:Mr ALEKSANDRA Vidović

Prelom teksta i crtežiJELENA Maksimović

Dizajn korica:TIJANA Maksimović

Štampa:"ART-PRINT", Banja Luka,

d.o.o., grafika - dizajn - marketingBanja Luka

Odgovorno lice štamparije: VLADIMIRA Stijak- Ilisić

Tiraž 200 primjeraka

EDICIJA:Medicinske bazične nauke – Libra Medica Basis knj. 15

ISBN 978-99955-49-37-4

Predgovor:

Poštovane kolege,

U ovom udžbeniku su izloženi gradivo i problemi medicinske biohemije. To je složeno gradivo u koje su uključena saznanja mnogih nauka, kao što su hemija, biologija i medicina. Zato su u udžbeniku pomenuti mnogi za studente novi pojmovi. Nije neophodno da studenti odmah prihvate svo gradivo iz udžbenika, ali se nadam da će ih radoznalost da saznaju kakvi se to procesi svakodnevno odvijaju u našem organizmu, i kad smo zdravi i kad smo bolesni, nagnati da se ozbiljnije zainteresuju za biohemiju.

Nadam se da će studenti učeći iz ove knjige,  shvatiti da je ljudski organizam jedan od najsloženijih, ali ujedno i jedan od najlepših funkcionalnih mehanizama. Verujem da će shvatiti da svaka živa ćelija, kao osnovna funkcionalna jedinica tela, u svom jezgru sadrži sve genske informacije potrebne za nastanak celog ljudskog bića, te da, istovremeno, geni čine zapravo mnoštvo kontrolnih sistema koji regulišu, podešavaju i diriguju doslovno hiljadu hemijskih reakcija unutar svake ćelije. Svesna sam da sam neka poglavlja obradila detaljnije dok su druga prikazana kraće. To je, između ostalog, tako, jer sam se trudila da udžbenik ne bude obiman, a da ipak student dobije osnovna znanja iz medicinske biohemije. Ako sam u tom vaganju prilikom odabira šta reći, a šta izostaviti, našla pravu meru,  ovaj se udžbenik može smatrati delom vrednim truda.

Ugodna mi je dužnost da se na ovom mestu zahvalim recenzentima prof. dr. Radetu Biočaninu i prof. dr. Jovici Jovanoviću koji su mi dali korisne primedbe i savete. Posebnu zahvalnost dugujem Nikoli i Jeleni Maksimović koji su mi pružili svekoliku pomoć tokom pisanja knjige.   

U Banja Luci 16. 04. 2010.                           dr sci. Radmila Maksimović,

specijalista medicinske biohemije

RECENZIJA

Čovečanstvo se danas nalazi pred sudbonosnim pitanjima svoje dalje egzistencije i ušao je u treći milenijum sa velikim globalnim, ekološkim, zdravstvenim i drugim problemima. Međunarodna javnost, naučnici i aktivisti mnogobrojnih visokoškolskih, naučnoistraživačkih, zdravstvenih i ekoloških udruženja-organizacija širom sveta sve brojnije i ozbiljno upozoravaju na uzroke i sve teže posledice, koji prouzrokuju morbiditet, kao posledicu devastacije radne i životne sredine i mentalnog zagađenja stanovništva planete Zemlje.

Dosadašnji razvoj industrijskih društava, naglašen ekonomiskim faktorima i zasnovan na neodgovornom i neracionalnom korišćenju prirodnih bogatstava narušava prirodnu ravnotežu i iscrpljuje ograničene prirodne resurse. Takav razvoj je neodrživ, jer prouzrokuje sve veće zagađivanje zemljišta, voda i vazduha, uništavanjem ekosistema i potrošnjom velikih količina prirodnih resursa.

Otuda, doc. dr Radmila Maksimović, autor udžbenika pod nazivom “OSNOVI MEDICINSKE BIOHEMIJE" za studente Fakulteta zdravstvenih nauka u sedištu svih zbivanja stavlja čoveka, u jednom biocenoznom okruženju, ali sa razmatranjem vitalnih elemenata organizma i svih uticajnih faktora. Ovu, sve aktuelniju naučnu oblast biohemijskih i medicinskih nauka autor obrazlaže kroz sledeću strukturu: uvod, 11 celina i 73 podceline, zaključak, literatura, uz odgovarajuće priloge, šeme i fotografije, saglasno sadržaju i cilju predmeta, koji se realizuje na Panevropskom univerzitetu “APEIRON” u Banja Luci.

Obzirom na specifičnost buduće profesije studenata, slušalaca i nastavnika ove visokoškolske i naučne ustanove, autor je nastojao da nađe sredinu tretirane problematike, sa prikazom specifičnosti i potreba ove renomirane nastavno-naučne ustanove i u tome je u potpunosti uspeo.

Ovaj udžbenik je jedno, za savremene uslove života, narušavnja zdravlja, zagađenja i degradacije životne sredine u miru, u vanrednim situacijama i ratnim uslovima, dosta značajno, aktuelno, složeno i kompleksno područje obrazovanja i vaspitanja studenata, slušalaca, nastavnika i ostalih pripadnika u sistemu školstva, u oblasti zdravstvenih nauka, eko-bezbednosti, kvaliteta života i bezbednosti i zdravlja na radu, gde nema granice posmatranja i istraživanja.

Poseban kvalitet materijala koji je pripremljen za štampu, jeste da je napisan na savremen način, prilagođen budućim zdravstvenim, inženjerima sanitarnog i biohemijskog inženjeringa, nastavnicima, vaspitačima, referentima, načelnicima i ostalim korisnicima na zadacima zaštite i unapređenja zdravlja, zaštite radne i životne sredine.

Naravno, neophodna je lektorska recenzija i ponovni detaljan pregled sadržaja knjige od strane autora, urednika i saradnika redakcije, vodeći računa da se ne ponovi negde isti pasus ili fotografija, što je meni

kao recenzentu bilo teško da ovde primetim i iznesem tu primedbu. Naučno-stručne literature nema dovoljno, a ona je neophodna u sve većem obimu, savremenog dizajna i sa novim podacima. Sve se to mora imati u vidu, kada se pokušava lapidarno ocenjivati autorov rad, visoke pažnje vredan, napor i višegodišnji uloženi trud i prikupljanje domaće i strane bio-hemijske i medicinske građe, radi sveukupnog sagledavanja i prezentovanja studentima i ostalim korisnicina ove izuzetno značajne i nedovoljno istražene problematike.

Ova knjiga je od izuzetne koristi svim onima, koji se bave zdravstvenom negom, pre svega, ali i zaštitom radne i životne sredine u školstvu, preduzećima, zdravstvenim ustanovama, civilnoj zaštiti, institutima, referentima bezbednosti i zdravlja na radu na nivou preduzeća, zavoda, instituta, lokalnih samouprava i svim ostalim, koji žele i kojima je neophodno poznavanje ove, sve aktuelnije problematike.

Sve u svemu, ovim izuzetnim naučno-stručnim delom, započet je ili se nastavlja jedan veliki poduhvat u edukciji studenata, čije ćemo konačne rezultate sagledavati, stalno ocenjivati i osavremenjavati kroz nastavnu praksu. Svakako, ova knjiga je „živa“ materija, koja je podložna promenama i stalnom unapređenju, s hodno vremenu življenja u posmodernom ambijentu.

22. 04. 2010. godineBanja Luka

RECENZENTprof. dr Rade Biočanin

Viši naučni saradnik

SADRŽAJ

UVOD 1

1. BIOHEMIJA ĆELIJE .................................................................................................. 1-1

1.1 UVOD ................................................................................................................... 1-2 1.2 ĆELIJA KAO OSNOVNA ŽIVA JEDINICA TELA ......................................................... 1-2 1.3 VANĆELIJSKA TEČNOST – UNUTRAŠNJA OKOLINA ............................................... 1-2 1.4 BIOELEMENTI I BIOMOLEKULI ............................................................................. 1-3 1.5 ĆELIJA I NJENA FUNKCIJA ..................................................................................... 1-4 1.6 FUNKCIONALNI SISTEM ĆELIJE ............................................................................. 1-9 1.7 ENERGETSKI CIKLUS U ĆELIJAMA ....................................................................... 1-12

2. VODA ELEKTROLITI I ACIDO-BAZNA RAVNOTEŽA .................................................... 2-1

2.1 UVOD ................................................................................................................... 2-2 2.2 FIZIOLOŠKI MEHANIZMI I REGULACIJA VODE ...................................................... 2-2 2.3 ACIDO-BAZNA RAVNOTEŽA ................................................................................. 2-4 2.4 POREMEĆAJ PROMETA VODE .............................................................................. 2-7

3. ENZIMI .................................................................................................................. 3-1

3.1 UVOD ................................................................................................................... 3-2 3.2 HEMIJSKA PRIRODA ENZIMA ............................................................................... 3-2 3.3 KOENZIMI I PROSTETIČNE GRUPE ........................................................................ 3-5

3.3.1 NIKOTINAMID-ADENIN-DINUKLEOTID (NAD)-SPECIFIČNE DEHIDROGENAZE 3-8 3.3.2 FLAVINADENIN-NUKLEOTID SPECIFIČNE OKSIDO-REDUKTAZE ........................ 3-9 3.3.3 OKSIDO-REDUKTAZE SA METALOM KAO KOFAKTOROM ............................... 3-10

3.4 KARAKTERISTLČNE OSOBINE BIOLOŠKE KATALIZE ............................................. 3-10 3.5 KATALIZA REVERZIBILNIH PROCESA ................................................................... 3-11 3.6 KATALITIČKO DEJSTVO ....................................................................................... 3-15 3.7 KINETIKA ENZIMSKIH REAKCIJA ......................................................................... 3-18 3.8 MICHAELIS — MENTENOVA TEORIJA ................................................................ 3-18 3.9 UTICAJ PH I TEMPERATURE NA AKTIVNOST ENZIMA ......................................... 3-22 3.10 INHIBITORI ......................................................................................................... 3-23 3.11 ODREĐIVANJE ENZIMSKE AKTIVNOSTI .............................................................. 3-24 3.12 MULTIENZIMSKI SISTEMI ................................................................................... 3-25 3.13 REGULATORNI ILI ALOSTERNI ENZIMI ................................................................ 3-27 3.14 IZOENZIMI ......................................................................................................... 3-29 3.15 FIZIOLOŠKO AKTIVIRANJE ENZIMA .................................................................... 3-30 3.16 NOMENKLATURA I KLASIFKACIJA ENZIMA ......................................................... 3-30

3.16.1 OKSIDOREDUKTAZE ......................................................................................... 3-32 3.16.2 TRANSFERAZE .................................................................................................. 3-34 3.16.3 HIDROLAZE ...................................................................................................... 3-35 3.16.4 LIAZE ............................................................................................................. 3-36

3.16.5 IZOMERAZE ................................................................................................... 3-37 3.16.6 LIGAZE ........................................................................................................... 3-37

4. UGLJENI HIDRATI I NJIHOV METABOLIZAM ............................................................ 4-1

4.1 UGLJENI HIDRATI ................................................................................................. 4-2 4.1.1 MONOSAHARIDI .................................................................................................. 4-4 4.1.2 AMINOŠEĆERI .................................................................................................... 4-13 4.1.3 ASKORBINSKA KISELINA ..................................................................................... 4-13 4.1.4 INOZITOLI .......................................................................................................... 4-14 4.1.5 GLIKOZIDI .......................................................................................................... 4-15 4.1.6 OLIGOSAHARIDI ................................................................................................. 4-16 4.1.7 POLISAHARIDI ILI GLIKANI ................................................................................. 4-20 4.1.8 BILJNI POLISAHARIDI (FITOPOLISAHARIDI) ........................................................ 4-21 4.1.9 POLISAHARIDI ANIMALNOG POREKLA (ZOOPOLISAHARIDI) .............................. 4-25 4.1.10 HOMOZOOPOLISAHARIDI (HOMOGLIKANI) ..................................................... 4-26 4.1.11 HETEROGLIKANI .............................................................................................. 4-27

4.2 METABOLIZAM UGLJENIH HIDRATA .................................................................. 4-28 4.2.1 VARENJE UGLJENIH HIDRATA ............................................................................ 4-29 4.2.2 OSOBINE I FUNKCIJE GLIKOGENA ...................................................................... 4-30 4.2.3 RAZLAGANJE GLIKOGENA (FOSFOROLIZA) ......................................................... 4-31 4.2.4 SINTEZA GLIKOGENA OD GLUKOZE (GLIKOGENOGENEZA) ................................ 4-34 4.2.5 KONTROLA SINTEZE GLIKOGENA U ŽIVOTINJA .................................................. 4-35 4.2.6 GLIKOLIZA .......................................................................................................... 4-36 4.2.7 ALKOHOLNO VRENJE ......................................................................................... 4-42 4.2.8 ENERGETSKI BILANS GLIKOLIZE ......................................................................... 4-43 4.2.9 GLUKONEOGENEZA I GLIKONEOGENEZA ........................................................... 4-43 4.2.10 METABOLIZAM FRUKTOZE I GALAKTOZE ......................................................... 4-46 4.2.11 METABOLIZAM GLICEROLA ............................................................................. 4-47 4.2.12 AEROBNI METABOLIZAM PIRUVATA: CIKLUS TRIKARBONSKIH KISELINA ......... 4-47 4.2.13 OKSIDACIJA PIRUVATA U ACETIL-KoA .............................................................. 4-50 4.2.14 POJEDINE REAKCIJE CIKLUSA TRIKARBONSKIH KISELINA ................................. 4-52 4.2.15 ENERGETSKI DOBITAK AEROBNE RAZGRADNJE GLUKOZE ............................... 4-55 4.2.16 ULOGA CLK U BIOSINTEZI I METABOLIZMU PROIZVODA NASTALIH RAZLAGANJEM MASTI I PROTEINA ............................................................................. 4-55 4.2.17 PENTOZO-FOSFATNI PUT OKSIDACIJE GLUKOZE .............................................. 4-57

5. MASTI ILI LIPIDI ...................................................................................................... 5-1

5.1 MASTI .................................................................................................................. 5-2 5.1.1 KLASIFIKACIJA MASTI ........................................................................................... 5-2 5.1.2 FOSFATIDI .......................................................................................................... 5-12 5.1.3 SFINGOLIPIDI ..................................................................................................... 5-17 5.1.4 CEREBROZIDI ..................................................................................................... 5-18 5.1.5 MICELE, MONO - I BIMOLEKULSKI SLOJEVI POLARNIH LIPIDA ........................... 5-20 5.1.6 STEROIDI I KAROTINOIDI ................................................................................... 5-22 5.1.7 KAROTINOIDI ..................................................................................................... 5-38

5.2 METABOLIZAM LIPIDA ....................................................................................... 5-45 5.2.1 VARENJE I APSORPCIJA DIJETALNIH MASTI ....................................................... 5-45

5.2.2 INTRACELURANA HIDROLIZA LIPIDA .................................................................. 5-47 5.2.3 β-OKSIDACIJA MASNIH KISELINA ....................................................................... 5-47 5.2.4 ENERGETSKI BILANS OKSIDACIJE PALMITINSKE KISELINE (CH3(CH2)14COOH) ........ 5- 515.2.5 METABOLIZAM KETONSKIH TELA ...................................................................... 5-52 5.2.6 BIOSINTEZA ZASIĆENIH MASNIH KISELINA ........................................................ 5-53 5.2.7 SINTEZA NEZASIĆENIH MASNIH KISELINA .......................................................... 5-58 5.2.8 BIOSINTEZA TRIGLICERIDA, GLICEROFOSFATIDA I SFINGOLIPIDA ...................... 5-59 5.2.9 BIOSINTEZA HOLESTEROLA ................................................................................ 5-62

6. AMINOKISELINE PROTEINI I METABOLIZAM AZOTA ................................................ 6-1

6.1 AMINOKISELINE .......................................................................................................... 6-2 6.1.1 UVOD .................................................................................................................. 6-2 6.1.2 OPTlČKA AKTIVNOST AMINOKISELINA ................................................................. 6-3 6.1.3 PODELA AMINOKISELINA ..................................................................................... 6-4 6.1.4 KISELINSKO — BAZNE OSOBINE AMINOKISELINA ................................................ 6-5 6.1.5 NEPOLARNE AMINOKISELINE ............................................................................ 6-13 6.1.6 POLARNE AMINOKISELINE ................................................................................. 6-18 6.1.7 KISELE AMINOKISELINE ...................................................................................... 6-22 6.1.8 BAZNE AMINOKISELINE ..................................................................................... 6-24 6.1.9 BIOSINTEZA AMINOKISELINA ............................................................................. 6-27 6.1.10 HEMIJSKE REAKCIJE AMINOKISELINA .............................................................. 6-29

6.2 PEPTIDI .............................................................................................................. 6-34 6.2.1 PEPTEDNA VEZA ................................................................................................ 6-34 6.2.2 NOMENKLATURA PEPTIDA ................................................................................ 6-36 6.2.3 ODREĐIVANJE SEKVENCE AMINOKISELINA U PEPTIDIMA ................................. 6-37 6.2.4 PRIRODNI PEPTIDI ............................................................................................. 6-38 6.2.5 PEPTIDNI HORMONI .......................................................................................... 6-39

6.3 PROTEINI ILI BELANČEVINE .............................................................................. 6-40 6.3.1 UVOD ................................................................................................................ 6-40 6.3.2 OSOBINE PROTEINA ........................................................................................... 6-43 6.3.3 ELEMENTARNI SASTAV PROTEINA ..................................................................... 6-45 6.3.4 STRUKTURA PROTEINA ...................................................................................... 6-46 6.3.5 PRIMARNA STRUKTURA PROTEINA ................................................................... 6-48 6.3.6 VARIJACIJE U PRIMARNOJ STRUKTURI HOMOLOGIH PROTEINA, IMUNOGLOBULINA I PATOLOŠKI NASLEDNIH PROTEINA ........................................... 6-52 6.3.7 SEKUNDARNA STRUKTURA PROTEINA ............................................................... 6-55 6.3.8 STRUKTURA α―HELIKSA ................................................................................... 6-57 6.3.9 STRUKTURA PRESAVIJENIH POVRŠINA .............................................................. 6-59 6.3.10 STRUKTURA KOLAGENA .................................................................................. 6-60 6.3.11 TERCIJERNA STRUKTURA GLOBULARNIH PROTEINA ........................................ 6-61 6.3.12 KVATERNERNA STRUKTURA PROTEINA ........................................................... 6-65 6.3.13 DENATURACIJA PROTEINA ............................................................................... 6-66 6.3.15 PROTEINI KAO ELEKTROLITI ............................................................................. 6-69 6.3.16 ELEKTROFOREZA .............................................................................................. 6-72 6.3.17 TALOŽENJE PROTEINA ..................................................................................... 6-73 6.3.18 PLAZMA―PROTEINI ........................................................................................ 6-74

6.3.19 KLASIFIKACIJA PROTEINA ................................................................................. 6-76 6.3.20 PROSTI PROTEINI ............................................................................................. 6-77 6.3.21 SLOŽENI PROTEINI ........................................................................................... 6-78

6.4 HROMOPROTEINI .............................................................................................. 6-80 6.4.1 UVOD ................................................................................................................ 6-80 6.4.2 PORFIRINI I SRODNA JEDINJENJA ...................................................................... 6-82 6.4.3 OSOBINE PORFIRINA ......................................................................................... 6-83 6.4.4 HEMOGLOBIN .................................................................................................... 6-85 6.4.5 ŽUČNE BOJE ....................................................................................................... 6-89 6.4.6 CITOHROMI ....................................................................................................... 6-90 6.4.7 HLOROFIL .......................................................................................................... 6-93 6.4.8 FLAVOPROTEINI ................................................................................................. 6-94

6.5 METABOLIZAM AZOTA ...................................................................................... 6-96 6.5.1 VARENJE PROTEINA ........................................................................................... 6-96 6.5.2 RESORPCIJA (APSORPCIJA) ................................................................................. 6-99 6.5.3 METABOLIČKI FOND ILI »POOL« AMINOKISELINA ........................................... 6-100 6.5.4 METABOLIZAM AMINOKISELINA ..................................................................... 6-101 6.5.5 PRETVARANJE AMINOKISELINA U KETOKISELlNE ............................................. 6-103 6.5.6 SUDBINA AMONIJAKA ..................................................................................... 6-107 6.5.7 DEKARBOKSILACIJA AMINOKISELINA ............................................................... 6-111 6.5.8 METABOLIZAM NEKIH SPECIFIČNIH AMINOKISELINA ...................................... 6-112 6.5.9 POREKLO KREATININA U MOKRAĆI ................................................................. 6-119

7. NUKLEINSKE KISELINE ............................................................................................ 7-1

7.1 UVOD ................................................................................................................... 7-2 7.2 HEMIJSKI SASTAV NUKLEOTIDA ........................................................................... 7-2 7.3 NUKLEOZID 5'-DIFOSFATI (NDP) I 5'-TRIFOSFATI (NTP) ..................................... 7-10 7.4 BIOLOŠKA SINTEZA NUKLEOTIDA ...................................................................... 7-11 7.5 STRUKTURA DEZOKSIRIBONUKLEINSKIH KISELINA ............................................ 7-13 7.6 RIBONUKLEINSKE KISELINE I SINTEZA PROTEINA ............................................... 7-17

8. KOENZIMI I VITAMINI ............................................................................................ 8-1

8.1 UVOD ................................................................................................................... 8-2 8.3 VITAMINI B–GRUPE ............................................................................................. 8-3 8.4 NIACIN, LAKTOFLAVIN I LIFONSKA KISELINA ........................................................ 8-3 8.5 TIAMIN ................................................................................................................ 8-6 8.6 PANTOTENSKA KISELINA ...................................................................................... 8-8 8.7 PIRIDOKSIN (VITAMIN B6) .................................................................................... 8-9 8.8 BIOTIN ............................................................................................................... 8-11 8.9 FOLNA KISELINA ................................................................................................. 8-12 8.10 VITAMIN B12 ....................................................................................................... 8-13

9. HORMONI .............................................................................................................. 9-1

9.1 UVOD ................................................................................................................... 9-2 9.2 PRINCIPI HORMONALNE REGULACIJE .................................................................. 9-2 9.3 DELOVANJE HORMONA ....................................................................................... 9-5

9.3.1 AKTIVACIJA SISTEMA ADENILAT-CIKLAZE ........................................................ 9-5

9.3.2 KONTROLA GENSKE AKTIVNOSTI ..................................................................... 9-5 9.4 PODELA HORMONA ............................................................................................. 9-7 9.5 POREMEĆAJI HORMONSKE SEKRECIJE I PRINCIPI LABORATORIJSKE DUAGNOSTIKE ................................................................................................................ 9-10 9.6. STEROIDNI HORMONI ........................................................................................ 9-11

9.6.1 BIOSINTEZA STEROIDNIH HORMONA ............................................................ 9-16 9.6.2 HORMONI KORE NADBUBREŽNE ŽLEZDE ...................................................... 9-17

9.7 MUŠKI POLNI HORMONI — ANDROGENI .......................................................... 9-27 9.8 ŽENSKI POLNI HORMONI - ESTROGENI .............................................................. 9-34 9.9 PROGESTERON .................................................................................................. 9-39 9.10 PROTEINSKI HORMONI ...................................................................................... 9-43

10. BIOLOŠKE OKSIDACIJE .......................................................................................... 10-1

10.1 MITOHONDRIJE ................................................................................................. 10-2 10.2 ORGANIZACIJA RESPIRATORNOG LANCA ........................................................... 10-5 10.3 BIOLOŠKE OKSIDO-REDUKCIJE ........................................................................... 10-7 10.4 REDOKS-POTENCIJALI ........................................................................................ 10-9 10.5 KONZERVISANJE ENERGIJE U RESPIRATORNOM LANCU .................................. 10-13 10.6 MEHANIZAM OKSIDATIVNE FOSFORILACIJE .................................................... 10-16 10.7 TRANSPORT METABOLITA KROZ MEMBRANU MITOHONDRIJA ...................... 10-19 10.8 ZAOBILAZNI SISTEMI (SHUTTLE) KOJI POVEZUJU MATRIKS SA CITOPLAZMOM 10-22

11. BIOHEMIJSKE FUNKCIJE TELESNIH TEČNOSTI I ORGANA ....................................... 11-1

11.1 BIOHEMIJA KRVI ................................................................................................ 11-2 11.2 BIOHEMIJA BUBREGA ........................................................................................ 11-4

11.2.1 FUNKCIJA BUBREGA ...................................................................................... 11-6 11.2.2 FUNKCIJA GLOMERULA ................................................................................. 11-7 11.2.3 FUNKCIJA TUBULA ......................................................................................... 11-8

11.3 BIOHEMIJA JETRE ............................................................................................ 11-14 11.3.1 METODE ISPITIVANJA INTEGRITETA I FUNKCIJE HEPATOBILIJARNOG TRAKTA 11-16 11.3.2 PROMENE AKTIVNOSTI ENZIMA U BOLESTIMA HEPATOBILIJARNOG TRAKTA 11-17 11.3.3 ŽUTICA (ICTERUS) ........................................................................................ 11-25 11.3.4 ULOGA JETRE U METABOLIZMU PROTEINA ................................................. 11-31 11.3.5 NEPROTEINSKA JEDINJENJA ........................................................................ 11-34 11.3.6 ULOGA JETRE U METABOLIZMU UGLJENIHHIDRATA ................................... 11-36 11.3.7 ULOGA JETRE U METABOLIZMU LIPIDA ....................................................... 11-36 11.3.8 ŽUČNE KISELINE ........................................................................................... 11-38

12. LITERATURA: ........................................................................................................ 12-1

UVOD

Živa bića se sastoje iz raznovrsnih organa i tkiva, u čijoj građi i funkciji učestvuju mnogobrojna i raznovrsna hemijska jedinjenja. Dugo se već traži odgovor na pitanje na koji način hemijska jedinjenja u živoj materiji međusobno reaguju i po kojim zakonima čine, održavaju i produžavaju život?

Jedan od prvih zadataka biohemije, nauke koja tumači molekulsku osnovu života, zbog toga je, određivanje hemijskog sastava i građe živih bića i utvrđivanje uloge pojedinih sastojaka u složenim procesima koji se odigravaju u živom svetu. STALNE PROMENE SASTOJAKA KOJE SE ODVIJAJU U ŽIVIM BIĆIMA ČINE NJEGOV METABOLIZAM. Sastojci se razgrađuju procesima koji se nazvaju KATABOLIZAM, ili sintetizuju u drugim, koji čine ANABOLIZAM.

Živa bića jedina imaju sposobnost da akumuliraju energiju iz okoline. Sa posebnim interesovanjem biohemija proučava način na koji se to čini i kako se ta energija koristi za izgradnju, obnavljanje i održavanje struktura, kao i za rad i reprodukciju.

Ponekad se dogodi da se neke hemijske reakcije odigravaju na nešto izmenjen način i nagrade se jedinjenja promenjenog hemijskog sastava. Ovakve promene mogu dovesti do stvaranja uslova za nastanak bolesti. Kako su u osnovi svake bolesti poremećeni biohemijski procesi, uloga ove nauke je nezamenljiva u iznalaženju uzroka nastanka bolesti, kao i mogućnosti u sprečavanju i lečenju iste.

Biohemija je, stoga, fundamentalna biološka i medicinska nauka, jer omogućava razumevanje biologije ćelije, mikrobiologije, fiziologije, farmakologije i ishrane na njihovom molekulskom nivou.

Kompleksnost živih sistema može da zastraši i zbuni, a tome još više doprinosi veliki broj komponenata koje ulaze u sastav živih organizama. Međutim, svi oblici života su sastavljeni od oko 50 osnovnih gradivnih blokova i poznavanje ovih komponenata u velikoj meri pojednostavljujeproučavanja kojima se bavi biohemija.

BIOHEMIJA ĆELIJE

1.1 UVOD

Biohemijske reakcije koje se odigravaju u ćelijama, prenos nervnih impulsa s jednog dela tela u drugi, mišićne kontrakcije, razmnožavanje, pretvaranje svetlosne energije u hemijsku što nadražuje oči i omogućava nam da vidimo svet oko nas, sve nam to omogućava da opstanemo u uslovima koji su vrlo promenljivi. Ljudsko je biće u stvari, automat. To što smo u životu gotovo da je izvan naše kontrole, jer nas glad tera da tražimo hranu, a strah da tražimo sklonište, osećaj za hladnoću tera nas da se grejemo itd., itd...

1.2 ĆELIJA KAO OSNOVNA ŽIVA JEDINICA TELA

Osnovna živa jedinica tela je ćelija. Svaki organ je zapravo skup mnoštva različitih ćelija koje su povezane zajedno međućelijskim potpornim strukturama. Svaka vrsta ćelije posebno je prilagođena za obavljanje određene funkcije. Na primer, eritrociti kojih ima ukupno 25 biliona prenose kiseonik iz pluća u tkivo. Mada su oni najrasprostranjenije ćelije, u telu postoji još i drugih 50 biliona ćelija.

Iako se ćelije u telu međusobno znatno razlikuju, sve one imaju neka zajednička svojstva. Tako svaka ćelija ima potrebu za hranom kako bi se održavala u životu, a sve ćelije iskorišćavaju na gotovo jednak način iste vrste hranljivih sastojaka. Kao jedan od glavnih sastojaka za dobijanje energije, sve ćelije koriste kiseonik. Kiseonik se spaja sa ugljenim hidratima, mastima i belančevinama pri čemu se oslobađa energija potrebna za ćelijske funkcije. Opšti mehanizmi pretvaranja hemijskih sastojaka u energiju u osnovi su jednaki u svim ćelijama, a sve ćelije predaju konačne produkte hemijskih reakcija u okolnu tečnost. Gotovo sve ćelije imaju sposobnost razmnožavanja i kad iz bilo kog razloga ćelije određene vrste budu uništene, preostale se ćelije te vrste obično neprekidno dele, sve dok se njihov broj primereno ne popuni.

1.3 VANĆELIJSKA TEČNOST – UNUTRAŠNJA OKOLINA

Približno 56% tela odraslog čoveka čini tečnost. Deo te tečnosti nalazi se u ćelijama i naziva se ćelijska ili intracelularna tečnost. Tečnost u prostorima izvan ćelije naziva se vanćelijska ili ekstracelularna tečnost. Među sastojcima rastvorenim u vanćelijskoj tečnosti nalaze se hranljivi sastojci i joni preko potrebni ćeliji za održavanje života. Vanćelijska tečnost se stalno kreće po celom telu. Ćelije mogu živeti, rasti i obnavljati svoje funkcije tako dugo dok u vanćelijskoj tečnosti postoji odgovarajuća koncentracija kiseonika, glukoze, različitih jona, amino kiselina i masti.

Prenos vanćelijske tečnosti u sve delove tela odvija se u dva različita stadijuma. Prvi obuhvata kretanje krvi kroz cirkulacijski sistem, a drugi

kretanje tečnosti između kapilara i ćelije. U protoku krvi kroz organizam, srce zapravo ima ulogu dve odvojene pumpe, od kojih jedna tera krv kroz pluća, a druga kroz sistemsku cirkulaciju. Kad čovek miruje, sva krv u cirkulaciji prođe celim cirkulacijskim krugom prosečno jednom u minutu, a za vreme intenzivne mišićne aktivnosti čak i do šest puta u minutu.

Dok krv prolazi kroz kapilare, odigrava se neprekidna izmena između krvne plazme i međućelijske tečnosti u prostorima koji okružuju kapilare. Kapilari su porozni pa velike količine tečnosti difunduju tamo – amo između krvi i tkivnih prostora. Ovaj proces difuzije uzrokovan je kretanjem molekula u svim pravcima u plazmi i vanćelijskoj tečnosti.

1.4 BIOELEMENTI I BIOMOLEKULI

Živi svet se sastoji iz veliko broja različitih hemijskih jedinjenja, a svakodnevno se izoluju i otkrivaju nova. Međutim, iako brojna, sva hemijska jedinjenja koja izgrađuju živu materiju sastavljena su iz relativno malog broja hemijskih elemenata. Od svih hemijskih elemenata koji se nalaze u prirodi samo 27 ulaze u sastav hemijskih jedinjenja koja čine živi svet. Ovi se elementi nazivaju bioelementi.

Najzastupljeniji bioelementi u građi većine organskih molekula su ugljenik, vodonik, kiseonik, azot, fosfor i sumpor. To su elementi malog atomskog prečnika i imaju osobinu da grade jake kovalentne veze. Pored toga, ugljenikov atom ima značajnu i neobičnu osobinu da gradi stabilne kovalentne veze sa drugim ugljenikovim atomima. Ovakvim vezama stvaraju se raznovrsne strukture organskih jedinjenja – pravolinijske, razgranate ili prstenaste, na čije se osnovne skelete vezuju drugi bioelementi, takođe stabilnim kovalentnim vezama.

Jednu drugu grupu elemenata, koja ulazi u sastav živih bića, čine kalcijum, magnezijum, natrijum, kalijum i hlor. Oni se nalaze u obliku jona i nazivaju se elektrolitima, a učestvuju u svim metaboličkim procesima.

U živim bićima se pored njih, nalaze još 16 raznorodnih elemenata u minimalnim količinama, pa otuda i njihov naziv elementi u tragovima ili mikroelementi. To su- gvožđe, bakar, cink, mangan, kobalt, hrom, selen, molibden, jod, fluor, bor, arsen, nikal, kalaj, vanadijum i silicijum. Iako prisutni u neznatnim količinama, ovi elementi nisu ništa manje značajni. Zato se ovi za život značajni sastojci nazivaju esencijalnim.

Pored esencijalnih elemenata živa bića sadrže često i elemente bez značaja za život, kao i štetne, toksične elemente, čije je prisustvo posledica življenja u zagađenoj životnoj sredini.

U živom svetu bioelementi se retko nalaze slobodni, u elementarnom stanju (kao, na primer kiseonik ili azot), već su najčešće u obliku brojnih i raznovrsnih neorganskih i organskih jedinjenja, koje nazivamo

biomolekuli. Biomolekuli su veoma različiti, od onih veoma proste građe, kakva je voda do jedinjenja krajnje složene strukture.

Neorganske sastojke živih bića čine razne soli, najčešće alkalnih i zemnoalkalnih metala, dok se neki elementi nalaze vezani za organske biomolekule. Za životne procese veoma su važna organska jedinjenja koja se unose hranom ili se sintetizuju u organizmu. Živi organizam se sastoji iz relativno malog broja (oko 30) organskih biomolekula. Međutim, iz ovog malog broja nastaju značajni i brojni, veliki biomakromolekuli, raznovrsne građe i specifičnih uloga. Najvažniji biomakromolekuli živih bića su proteini, lipidi, nukleinske kiseline i polisaharidi. Samo 20 aminokiselina izgrađuje izuzetno velik broj raznovrsnih proteina, a samo pet aromatičnih baza gradi nukleotide, monomerne jedinice nukleinskih kiselina. Samo jedan monosaharid, glukoza, gradi veoma velike molekule polisaharida, a palmitinska kiselina, glicerol i holin ulaze u sastav veoma raznovrsne grupe biomolekula, lipida.

Biomakromolekuli se međusobno vezuju i grade složene komplekse, a u njihovom vezivanju učestvuju i slabije, nekovalentne veze. U biološkim sistemima značajne su četri vrste nekovalentnih veza. U živom svetu se često sreću ovakvi makromolekulski kompleksi, kao što su, na primer, lipoproteini: Ili delovi ćelija, ćelijske organele.

Biomakromolekuli i biomolekulski kompleksi složeni su u veoma organizovanu, strukturnu i funkcionalnu jedinicu, ćeliju. Ova je u stanju da obavlja sve procese od značaja za održavanje života.

1.5 ĆELIJA I NJENA FUNKCIJA

Slika 1.1 - Ćelija

Svaka od 75 biliona ćelija u ljudskom organizmu živa je struktura koja može trajno preživeti, a u većini slučajeva može se čak i razmnožavati, pod uslovom da tečnost kojom je okružena sadrži potrebnu hranu. Da bismo razumeli funkciju organa i drugih struktura u telu, moramo pre svega shvatiti osnovnu organizaciju ćelije i funkcije njenih sastavnih delova.

Dva glavna sastojka ćelije su jezgro i citoplazma. Jezgro je od citoplazme odvojeno jezgrovom membranom, a cotiplazmu od okolne tečnosti odvaja ćelijska membrana.

Različite supstance od kojih je ćelija sastavljena nazivamo zajedničkim imenom protoplazma. Protoplazma je uglavnom sastavljena od: vode, elektrolita, proteina, lipida i ugljenih hidrata.

Ćelija nije samo džak u kojem se nalazi tečnost, enzimi i hemijske supstance. Ona sadrži i visoko organizovane fizičke strukture, koje se nazivaju organele. Organele su za funkciju ćelije jednako tako važne kao i hemijski sastojci ćelije. Gotovo sve fizičke strukture ćelije omeđene su membranom, sastavljenom uglavnom od lipida i proteina. Među različite mebrane ubrajamo: ćelijsku membranu, membranu jezgra, membranu endoplazmatičnog retikuluma, te membrane mitohondrija, lizozoma, Golžijevog kompleksa itd. Ćelijska membrana je tanka i elastična. Građena je gotovo isključivo od proteina i lipida. Centralno mesto u strukturi zauzima sloj lipida, prekriven s obe strane slojevima proteina. Proteini su, isto tako, raspršeni po lipidima. Prisustvo proteina i tankog sloja mukopolisaharida na površinama čine membranu hidrofilnom, što znači da voda lako prianja uz membrane. Zbog lipida u njenom središtu, membrana je uglavnom nepropustljiva za lipofobne supstance. Male okruglaste strukture koje leže na bazi proteinskog molekula jesu molekuli fosfolipida: masni deo molekula fosfolipida priljubljen je za unutrašnju lipidnu fazu ćelijske membrane, a polarni deo molekula strči prema površinama membrane i elektrohemijski je vezan s proteinima u spoljnom i unutrašnjem sloju. Tanki sloj mukopolisaharida na spoljnoj površini ćelijske membrane doprinosi tome da se spoljna površina razlikuje od unutrašnje. Na taj način membrana je polarizovana pa se hemijska reaktivnost unutrašnje površine ćelije razlikuje od one na spoljnoj površini. Veruje se da membrana poseduje mnogo sitnih pora kroz koje prolaze molekuli različitih veličina koje se razmenjuju između vanćelijke i ćelijske tečnosti. Pore u ćelijskoj membrani nastaju zbog velikih molekula proteina koje prekidaju lipidnu strukturu membrane i protežu se od jedne strane membrane do druge. Tako je omogućen direktan prolaz vode u međuprostorima proteinskih molekula.

Membrana jezgra je sastavljena od dve membranske jedinice. Jedna od njih okružuje drugu, a između njih je širok prostor. Svaka od tih jedinica gotovo je jednaka ćelijskoj membrani, ali nema sloja mukopolisaharida. Membrana jezgra sadrži velike rupe pa se gotovo sve rastvorene

supstance s lakoćom kreću između tečnosti u jezgru i tečnosti u citoplazmi.

Endoplazmatični retikulum (EPR) po građi izgleda kao mreža membrana cevastih i mehurastih struktura u citoplazmi. Prostor unutar cevčica i mehurića ispunjen je endoplazmatičnim matriksom, tečnošću koja se razlikuje od one izvan endoplazmatičnog retikuluma. Prostor unutar endoplazmatičnog retikuluma povezan je s prostorom unutar dvostruke membrane jezgra. Taj prostor nadovezuje se na prostor unutar Golžijevog kompleksa. Ponekad je endoplazmatični retikulum preko malih otvora direktno povezani s okolinom ćelije.

Na spoljnoj površini mnogih delova endoplazmatičnog retikuluma nalaze se brojne male zrnaste tvorevine koje zovemo ribozomi. Retikulum na čijoj se površini nalaze ribozomi često zovemo zrnasti endoplazmatični retikulum. Ribozomi se najvećim delom sastoje od ribonukleinske kiseline koja ima važnu ulogu u sintezi proteina. Deo endoplazmatičnog retikuluma koji ne poseduje ribozome zovemo glatki endoplazmatični retikulum. On sudeluje u sintezi lipida i verovatno igra važnu ulogu u resorpciji glikogena.

Golžijev kompleks ( koga neki autori zovu Golžijev aparat ili Golžijevo telašce) je poseban deo endoplazmatičnog retikuluma. Obično je sastavljen od četiri ili više slojeva tankih mehurića, a membrane su mu slične membanama glatog endoplazmatičnog retikuluma. Golžijev kompleks je jako razvijem u sekretornim ćelijama, u kojima je smeštem na onoj strani na kojoj se supstance izlučuju. Funkcija Golžijevog kompleksa sastoji se u privremenom pohranjivanju i kondenzaciji sastojaka koje se secerniraju, te u njihovoj konačnoj pripremi za sekreciju. U njemu se osim toga sintetišu ugljeni hidrati te se vežu s proteinima u mehurićima kompleksa. Na taj način nastaju glikoproteini koji su važni sekretorni sastojci mnogih ćelija. Među glikoproteinima se naročito ističu mukopolisaharidi koji su glavni sastojci: 1) sluzi, 2) osnovni sastojci u intersticijskim prostorima i 3) osnovne sastojci hrskavice i kostiju.

Konačno, Golžijev kompleks sudeluje u stvaranju lizozoma, citoplazmatičnih organela koje igraju važnu ulogu u varenju različitih sastojaka u ćeliji.

Citoplazma je ispunjena sitnim, ali i većim dispergovanim česticama i organelama. Bistri tekući deo citoplazme u kojem su čestice raspršene naziva se hijaloplazma. Ona uglavnom sadrži rastvorene proteine, elektrolite, glukozu i malu količinu fosfolipida, holesterola, te esterifikovanih masnih kiselina. Deo citoplazme neposredno uz ćelijsku membranu često se nalazi u stanju polučvrstog gela a naziva se korteks ili endoplazma. Među velikim česticama raspršenim u plazmi, nalaze se kapljice neutralnih masti, zrnca glikogena, ribozomi, sekretorna zrnca i dve važne organele, mitohondrije i lizozomi.

U mitohondrijama se oslobađa energija iz hranljivih supstanci i kiseonika te se tako dobija najveći deo energije potreban ćeliji za obavljanje njenih funkcija. Mitohondrije su prisutne u citoplazmi svih ćelija, a njihov broj se kreće od nekoliko stotina do mnogo hiljada, što zavisi od količine energije koja je potrebna ćeliji. I veličina i oblik mitohondrija su takođe veoma promenljivi.

Mitohondrije se uglavnom sastoje od dve membranske jedinice: spoljne membrane i unutrašnje membrane. Brojni nabori unutrašnje membrane čine pregrade na kojima se nalaze oksidativni enzimi ćelije. Osim toga unutrašnjost mitohondrija ispunjena je matriksom koji je u stanju gela, a sadrži velike količine rastvorenih enzima preko potrebnih za dobijanje energije iz hranljivih supstanci. Ovi enzimi deluju zajedno sa oksidativnim enzimima na pregradama i uzrokuju oksidaciju hranljivih supstanci, pri čemu nastaje ugljen dioksid i voda. Oslobođena energija služi za sintezu adenozin-trifosfata (ATP), supstance bogate energijom. ATP zatim odlazi iz mitohondrija i difundira svuda po ćeliji te otpušta energiju kad je potrebna ćeliji za obavljanje njenih funkcija.

Mitohondrije se verovatno mogu same razmnožavati i to se dešava uvek kad u ćeliji postoji potreba za povećanim količinama ATP.

Lizozomi predstavljaju intracelularni probavni sitem koji omogućuje ćeliji da ukloni nepoželjne supstance i strukture, naročito oštećene ili strane strukture, kao što su na primer bakterije. Lizozom je okružen jednom membranskom jedinicom. Ispunjen je velikim brojem sitnih zrnaca. To su proteinski skupovi hidrolitičkih enzima. Hidrolitički enzimi cepaju organska jedinjenja na dva ili više delova, tako da se vodonik iz molekula vode spoji sa jednim delom tog molekula, a hidroksilna grupa s drugim delom. Tako se, na primer, protein hidrolizuje u aminokiseline. U lizozomu se nalazi više od desetak različitih kiselih hidrolaza, a glavni sastojci koje oni razgrađuju su proteini, nukleinske kiseline, mukopolisaharidi i glikogen.

Membrana koja okružuje lizozom redovno sprečava da hidrolitički enzimi u lizozomu dođu u dodir sa ostalim supstancama u ćeliji. Različite okolnosti u ćeliji mogu, međutim, dovesti do kidanja lizosomske membrane, pri čemu dolazi do oslobađanja enzima. Ti enzimi tada razgrađuju organske supstance s kojima dođu u dodir.

Jezgro je kontrolni centar ćelije. On kontroliše sve hemijske reakcije u ćeliji, kao i razmnožavanje ćelije. Ukratko, jezgro sadrži dezoksiribonukleinske kiseline, što već mnogo godina nazivamo genima. Geni određuju svojstva proteinskih enzima citoplazme i tako kontrolišu citoplazmatske aktivnosti. Da bi kontrolisali razmnožavanje geni se najpre sami udvoje, a nakon toga ćelija se podeli posebnim procesom koji zovemo mitoza. Tako nastaju dve ćelije kćeri, od kojih svaka dobija jedan od dva kompleta gena. Jezgra mnogih ćelija sadrže jednu ili više

svetlije obojenih struktura koje zovemo nukleotidi. Nukleotid, za razliku od ostalih organela, nema graničnu membranu. To je, jednostavno, proteinska struktura koja sadrži i određenu količinu ribonukleinske kiseline kakva se nalazi u ribozomima. Nukleotid se izrazito poveća kad ćelija aktivno sintetizuje proteine. Geni jednog od hromosoma sintetizuju ribonukleinsku kiselinu koja se zatim pohranjuje u nukleotidu. U početku je to fibrinalna RNA koja se kasnije kondenzuje stvarajući zrnaste ribozome. Ribozomi prelaze u citoplazmu, gde se najvećim delom vežu na endoplazmatični retikulum.

1.6 FUNKCIONALNI SISTEM ĆELIJE

Dve najvažnije funkcije ćelije su:

a) prenos supstanci kroz ćelijske membrane i

b) kontrola sinteze proteina i drugih ćelijskih funkcija.

Mnoge ćelije , naročito ćelije različitih žlezda u telu, stvaraju posebne proteine koji se luče u okolinu ćelije. U mehanizam lučenja uključeni su EPR i Golžijev kompleks. Ribozomi na površini EPR sintetišu protein koji će se izlučiti. Sintetizovani protein odmah ulazi u cevčice EPR gde stvara mala proteinska zrnca. Ta se zrnca zatim polako kreću kroz cevčice prema Golžijevom kompleksu. U njemu se proteini mogu konjugovati s ugljenim hidratima stvarajući glikoproteine, koji su čest sekretorni produkt. Zrnca se osim toga nakupljaju i stvaraju združena zrnca koja se zatim kroz membranu Golžijevog kompleksa izlučuju u citoplazmu, a iz citoplazme se kreću prema površini ćelije i izbacuju napolje. Gotovo jednak mehanizam postoji i u lučenju lipida, s tim što se oni sintetizuju u glatkom delu EPR. U EPR dolazii do polimerizacje glukoze, kao i do procesa glikogenolize.

Da bi ćelija mogla živeti i rasti, ona iz okolne tečnosti mora primati hranljive i druge supstance. Kroz ćelijsku membranu supstance mogu proći na tri različita načina: 1) difuzijom, kroz pore u membrane ili kroz sam membranski matriks, 2) aktivnim prenosom kroz membranu, mehanizmom u kojem enzimski sistem i posebne prenosne supstance “nose” supstancu kroz membranu i 3) pinocitozom, mehanizmom kojim ćelija “proguta” deo vanćelijske tečnosti i njen sadržaj. Pinocitoza se zbiva, stvaranjem pinocitoznog mehurića, koji nastaje kao reakcija na dodir ćelijske membrane i samo nekih supstanci od kojih su dve najvažnije – protein i koncentrisani rastvori elektrolita. Jako je značajno što protein uzrokuju pinocitozu, jer je pinocitoza jedini način na koji proteini mogu proći kroz ćelijsku membranu.

Velike čestice poput bakterija ulaze u ćeliju fagocitozom. Mehanizam fagocitoze istovetan je mehanizmu pinocitoze. Površina čestice koja će biti fagocitovana mora biti takva da se može apsorbovati na ćelijsku membranu. Ćelijska membrana jednostavno okruži bakteriju i uvrne je. Tako nastaje fagocitozni mehurić, sličan pinocitoznom mehuriću. Gotovo odmah po pojavi ovih mehurića u ćeliji jedan ili više lizozoma prione uz njega i isprazne u njega svoje hidrolaze. Tako nastaje probavni mehurić, iz kojeg se produkti delovanja hidrolaza mogu kroz membranu mehurića difundovati u citoplazmu. Ono što ostane od mehurića, takozvano ostatno telo izluči se ili se rastvori u citoplazmi. Zbog toga lizozome možemo nazvati probavnim organima ćelije.

Za sve ćelijske funkcije neophodna je energija. Ona se dobija u procesima razlaganja i oksidacije organskih jedinjenja, u kojima se pored krajnjih proizvoda, ugljen dioksida i vode oslobađa energija:

(CH₂O)n + O₂ =CO₂ + H₂O + E

Mnogobrojne su reakcije oksidacije organskih jedinjenja, a za njihovo odvijanje neophodni su specifični enzimi. Za delovanje ovih enzima neophodno je prisustvo drugih jedinjenja, koja takođe učestvuju u ovim reakcijama. To su najčešće nikotinamidi I flavinski nukleotidi. U reakcijama oksidacije organskih molekula oslobođena energija može biti konzervirana u hemijskim vezama nekih funkcionalnih grupa, a takve se veze nazivaju visoko energetskim. Obično su to fosfatne veze nekih hemijskih jedinjenja, a najvažnije od svih je adenozin trifosfat ili ATP. Hidrolizom ATP-a mogu se izdvojiti jedna ili dve fosfatne grupe, pa nastaju adenozin difosfat, ADP i adenozin monofosfat, AMP, uz izdvajanje znatne količine energije:

ATP + H₂O = ADP + P + E

ADP + H₂O = AMP + P +E

Energija koja se oslobađa iz ATP-a koristi se za sintezu raznovrsnih jedinjenja ćelijskih sastojaka, kao i za vršenje bilo koje vrste rada. U organizmu se odvija veoma velik broj hemijskih reakcija, koje su međusobno povezane, dobro usklađene i tačno kontrolisane. Hiljade ovih reakcija, koje se stalno dešavaju u živim bićima čine njegov metabolizam.

Metabolizam se obično deli na katabolizam i anabolizam.

Pod katabolizmom se podrazumeva enzimska razgradnja, uglavnom oksidativna, hranljivih sastojaka relativno velike molekulske težine: na primer, ugljenih hidrata, lipida i proteina u niskomolekulska jedinjenja: mlečnu i sirćetnu kiselinu, ugljendioksid, amonijak i ureju. Kataboličke reakcije su praćene oslobađanjem energije koja se „hvata“ i „ugrađuje”u energetski bogatu vezu adenozintrifosfata.

Anabolizam obuhvata enzimske sinteze mnogobrojnih ćelijskih komponenata: polisaharida, nukleinskih kiselina, proteina i lipida. Sinteze teku uz potrošnju energije koju dobijaju od ATP-a ili NADPH.

U kataboličkim i anaboličkim procesima ne učestvuju isti enzimi i oni se dešavaju u odvojenim delovima ćelije. Na primer, sinteza masnih kiselina se dešava u citoplazmi, a njihova oksidativna razgradnja u mitohondrijama.Razgradnja ugljenih hidrata, masti i proteina teče preko niza povezanih reakcija, koje se odigravaju u tri stepena: (slika 1.2)

Slika 1.2 – tri stepena katabolitičke(-) i anaboličke (….) razgradnje hranljivih sastojaka

U prvom stepenu hranljivi sastojci se cepaju na prostije, osnovne molekule. Tako polisaharidi daju heksoze ili pentoze, lipidi masne kiseline, glicerol i druge komponente, a proteini dvadesetak amino kiselina. U drugom stepenu nastali produkti razgrađuju se dalje na manji broj još prostijih jedinjenja. Tako heksoze, pentoze i glicerol prelaze u šećer sa tri C- atoma (glicerinaldehid 3-fosfat), koji se dalje cepa u acetil-koenzim A, koji ima samo dva C atoma. Dvadesetak aminokiselina se razgrađuje, takođe, na manji broj prostijih jedinjenja, a to su: acetil-koenzim A, α-ketoglutarat, fumarat i oksalacetat. Ova jednostavna jedinjenja ulaze u treći stepen katabolizma, koji je zajednički za sve i u kome dolazi do njihove potpune oksidacije u CO₂ i četri para vodonikovih atoma. Četri para vodonikovih atoma ulaze u lanac disanja, da bi se preko citohroma i drugih prenosilaca sjedinili sa kiseonikom u vodu.

Anabolizam se, takođe, odigrava u tri stepena. On polazi od prostih osnovnih jedinjenja, koja nastaju u trećem kataboličkom stepenu. Tako

npr. proteinske aminokiseline nastaju transaminacijom α-ketokiselina. U zadnjem stepenu anabolizma aminokiseline se ugrađuju u protein. Kao što se vidi katabolizam i anabolizam imaju zajednički drugi stepen, koji se zove amfibolički put. On omogućava potpunu oksidaciju razgrađenih produkata hrane, a isto tako obezbeđuje osnovne sastojke potrebne za sintezu makromolekula.

Skoro sve metaboličke reakcije su međusobno povezane. Produkt jedne je supstrat druge i tako redom. Ovakvi nizovi reakcija omogućavaju nastajanje novih jedinjenja prenosom određenih grupa: metil, acetil, fosforil, vodonikovih atoma, pa i celih molekula. Razgradnja supstrata do slobodnih atoma od kojih je izgrađen, a radi sinteze nekog komplikovanijeg jedinjenja, bilo bi u energetskom pogledu vrlo neekonomično i izvan granica mogućnosti žive ćelije.

1.7 ENERGETSKI CIKLUS U ĆELIJAMA

Organska jedinjenja koja se nalaze u hrani, bogata su vodonikom i zato sadrže veliku količinu hemijske enrgije. Najvažnija osobina živih bića je što mogu da koriste energiju hranljivih sastojaka sagorevajući ih do ugljendioksida i vode, na konstantnoj temperaturi i pritisku. Korišćenje energije pod ovakvim uslovima moguće je zato što se enzimsko razlaganje hrane odigrava u više stepeni, preko zajedničkih intermedijera. Energija se dobija na nekoliko mesta u nizu reakcija u jednom od intermedijera. Na primer, u procesu glikolize to su 1,3-difosfoglicerat i fosfoenolpiruvat.

Jedinjenja od fundamentalne važnosti u prenosu energije su organski estri i anhidridi fosforne kiseline.

Poznate su četiri vrste energetski bogatih jedinjenja:

1) Fosfatni estri (glukozo-6-fosfat, α-glicerolfosfat i dr.) i enolni estri (fosfoenolpiruvat)

2) Anhidridi kiselina (ATP, acetilfosfat i dr.)

1) Derivati fosfaminske kiseline (kreatinfosfat)

3) Estri tioalkohola, koji ne sadrže fosfornu kiselinu (acetil-koenzim A).

Hidrolizom ovih energetski bogatih jedinjenja oslobađa se znatna količina energije. Ova jedinjenja se dele prema promeni slobodne energije tokom njihove hidrolize na nisko i visoko energetska. U prvu grupu spadaju α-glicerolfosfat i glukozo – 6 – fosfat, a u visoko energetska, fosfoenolpiruvat i kreatinfosfat. Najvažnije energetski bogato jedinjenje je ATP koji sadrži dve anhidridne veze. Jedan od glavnih razloga što ADP-ATP sistem zauzima centralno mesto u prenosu energije je to što ima manje energije od visokoenergetskih jedinjenja.

Slika 1.3 - Strukturne formule energetski bogatih jedinjenja

Prvi zakon termodinamike kaže da energija ne može ni da se stvori ni da se uništi, samo može da se prevede iz jednog oblika u drugi. Živi organizmi energiju uzetu iz okoline iskorišćavaju pod određenim uslovima pritiska i temperature i vraćaju je u okolinu u obliku koji im je manje koristan. Koristan oblik energije koji ćelije uzimaju naziva se slobodna energija, a ona prosto može da se definiše kao oblik energije koji može da vrši rad na određenoj temperaturi i pritisku. Manje koristan vid energije koji ćelija vraća u spoljašnu sredinu sastoji se od toplote i drugih oblika koji se rasturaju po okolini povećavajući njenu neuređenost ili entropiju. Na osnovu ovog može da se izvede izuzetno važan aksiom u

molekulskoj logici živog stanja: živi organizmi stvaraju i održavaju svoju esencijalnu uređenost na račun svoje okoline, čime čine da ona postane više neuređena i slučajna.

Spoljašna okolina je apsolutno esencijalna za žive organizme, ne samo zato što iz nje uzimaju slobodnu energiju nego i zato što iz nje uzimaju i druge materije. Jezikom termodinamike rečeno, živi organizmi su „ otvoreni“ sistemi zato što sa spoljašnom okolinom izmenjuju energiju i materiju i u tom procesu ih transformišu. Karakteristika otvorenih sistema je da oni nisu u ravnoteži sa svojom okolinom, zato što nema vidljive promene u jednom periodu vremena, oni su ustvari u stanju koje se naziva stanje stabilne ravnoteže (steady state). Ovo stanje se karakteriše time da je brzina transfera materije i energije iz okoline u sistem u potpunoj ravnoteži sa brzinom transfera materije i energije iz sistema u okolinu. Dakle, deo molekulske logike živog stanja je da je ćelija neuravnoteženi otvoreni sistem, koji se ponaša kao mašina koja uzima energiju iz svoje okoline težeći da poveća njenu entropiju. Osim toga, žive ćelije su visoko efikasne u prometu energije i materije, posebno u pretvaranju energije u rad, u čemu prevazilaze većinu mašina koje je stvorio čovek.

Mehanizam žive ćelije koji omogućava transformisanje energije zasnovan je na relativno nestabilnim i razgradljivim organskim molekulima koji ne mogu da izdrže visoke temperature, jake električne napone, ili izuzetno kiselo bazne uslove. Žive ćelije su esencijalno izotermne. Osim toga, nemaju značajne razlike u pritiscima između pojedinih delova ćelije. Zbog toga ćelije nisu u stanju da koriste toplotu kao izvor energije, već bi se pre moglo reći da su one izotermalni hemijski motori.

Ćelije apsorbuju energiju iz svoje okoline i pretvaraju je u hemijsku energiju, koja se tada transformiše u:

a) hemijski rad uključen u biosintezu ćelijskih komponenata,

b) osmotski rad koji je potreban za transport materija u ćeliju i

c) mehanički rad potreban za kontrakcije i kretanje.

Ćelija može da funkcioniše kao hemijska mašina zato što ima enzime koji znatno povećavaju brzinu hemijskih reakcija. Zato su hemijske reakcije koje se odvijaju u živoj ćeliji 100% efikasne. Mnoštvo enzimski katalizovanih reakcija u ćeliji ne postoje same za sebe već su sekvence konsekutivnih reakcija. To znači da proizvod prve predstavlja supstrat za sledeću itd. Posledica toga je da je obezbeđeno kanalisanje hemijskih reakcija po specifičnim putanjama. Veoma je značajno i to što su zbog toga te reakcije povezane zajedničkim intermedijerima.

U povezivanju enzimski katalizovanih reakcija u konsekutivne sekvence nalazimo još jedan aksiom u molekulskoj logici živih organizama: brzina specifičnih reakcija u jednom delu kompleksne mreže enzimskih reakcija u ćeliji može biti kontrolisana ili modulirana brzinom reakcije u drugom delu mreže. U najprostijem slučaju to znači da akumuliranje intermedijera ili metabolita iznad kritične koncentracije deluje kao signal da se smanji brzina reakcije u kojoj su oni nastali, ovaj vid kontrole nazivamo mehanizam povratne sprege. Žive ćelije imaju sposobnost da regulišu sintezu sopstvenih katalizatora. Ova sposobnost samo regulacije reakcija je fundamentalna u održavanju stanja stabilne ravnoteže uslova žive ćelije i esencijalna je za efikasno transformisanje energije.

Reakcije koje se odigravaju u ćelijama imaju sledeće karakteristike:

1.1. Iako je broj reakcija vrlo velik, broj reakcionih tipova je relativno mali

1.2. Mehanizmi koji su zastupljeni u biohemijskim reakcijama su relativno jednostavni

1.3. Relativno je mali broj reakcija koje imaju centralnu važnost, a to su reakcije u kojima se stvara energija i reakcije sinteze i degradacije glavnih ćelijskih komponenata.

UKRATKO:

2.1. Ćelija je osnovna živa jedinica tela;

2.2. Živi svet sastoji se od velikog broja različitih hemijskih jedinjenja. Ta jedinjenja izgrađuje samo 27 elemenata. Ovi elementi nazivaju se bioelementi.

2.3. Najzastupljeniji bioelementi u organskim jedinjenjima su: ugljenik, vodonik, kiseonik, azot, fosfor i sumpor.

2.4. Pored njih za život je značajno još 16 elemenata koji se u organizmu nalaze u minimalnim količinama, te se zato zovu elementi u tragovima ili mikroelementi. To su: gvožđe, bakar, cink, mangan, kobalt, hrom, selen, molibden, jod, fluor, bor, arsen, nikal, kalaj, vanadijum i silicijum. Ovi elementi su retko slobodni, uglavnom su vezani u obliku raznih jedinjenja koje zovemo biomolekuli.

2.5. Od biomolekula nastaju veliki biomakromolekuli. Najvažniji su: proteini, lipidi, polisaharidi i nukleinske kiseline.

2.6. Biomakromolekulski i biomolekulski kompleksi složeni su u veoma organizovanu, strkturnu i funkcionalnu jedinicu, ćeliju.

2.7. Ćelija se sastoji od visoko organizovanih fizičkih struktura koje se nazivaju organele. Njima je ispunjena citoplazma. U citoplazmi su rastvorene i sve ostale supstance koje ulaze u sastav ćelije. Organele su gotovo sve omeđene membranama, a i cela ćelija omeđena je sopstvenom, ćelijskom mebranom.

2.8. Jezgro je kontrolni centar ćelije.

2.9. Lizozomi predstavljaju intracelularni probavni sistem.

2.10. Mitohondrije sadrže velike količine rastvorenih enzima preko potrebnih za dobijanje energije.

2.11. Endoplazmatični retikulum (ERP) ima važnu ulogu u sintezi protein (zrnasti) i sintezi lipida (glatki).

2.12. Golžijev kompleks ima važnu ulogu u sintezi ugljenih hidrata i sekreciji.

2.13. Dve najvažnije funkcije ćelije su: a) prenos supstanci kroz ćelijsku membranu i b) kontrola sinteze proteina i drugih ćelijskih funkcija.

2.14. Kroz ćelijsku membranu supstance mogu proći na tri načina:

a) difuzijom, b) aktivnim prenosom i c) pinocitozom

( i u nekim slučajevima - d) fagocitozom).

2.15. Za sve ćelijske funkcije neophodna je energija. Ona se dobija u procesima razlaganja i oksidacije organskih jedinjenja, u kojima se pored krajnjih proizvoda, vode i ugljen dioksida oslobađa energija.

2.16. Oslobođena energija može biti konzervirana u hemijskim vezama nekih funkcionalnih grupa, a takve se veze nazivaju visoko energetskim. Obično su to fosfatne veze nekih jedinjenja, a najvažnije od svih je, adenozin trifosfat (ATP).

2.17. Jedinjenja od fundamentalne važnosti u prenosu energije su organski estri i anhidridi fosforne kiseline, kao i estri tioalkohola koji ne sadrže fosfornu kiselinu (acetil-koenzim A).

2.18. Reakcije koje se odigravaju u ćeliji imaju sledeće karakteristike: a) iako je broj reakcija velik, broj reakcionih tipova je relativno mali; b) mehanizmi koji su zastupljeni u biohemijskim reakcijama su relativno jednostavni; c) Relativno je mali broj reakcija koje imaju centralnu važnost, a to su reakcije u kojima se stvara energija i reakcije sinteze i degradacije glavnih ćelijskih komponenata.

VODA ELEKTROLITI I ACIDO-BAZNA RAVNOTEŽA

2.1 UVOD

Voda je najrasprostranjenije i za život neophodno hemijsko jedinjenje. Živa bića se sastoje pretežno iz vode. U njima je voda obavezan sastojak ćelija i tkiva, a u znatnom delu i raznih telesnih tečnosti, kao što su krv, limfa i druge. 60% telesne težine muškarca i 55% žena čini voda.

Značaj vode za žive organizme je veliki. Ona je jedinstven rastvarač, u kojemu se najbolje rastvaraju polarna jedinjenja. Međutim, voda rastvara i nepolarna jedinjenja koja mogu graditi vodoničnu vezu. Supstance koje se lako rastvaraju u vodi su hidrofilne, na primer, amino kiseline. Nepolarne supstance koje nisu u stanju da grade vodoničnu vezu nerastvorne su u vodi. One su hidrofobne, kao što su, na primer, lipidi.

Rastvaranjem sastojaka hrane, voda učestvuje u apsorpciji i transportu mnogih jedinjenja ili izlučivanju ekskreta. Biohemijske reakcije telesnih sastojaka odvijaju se u vodenim rastvorima, a u nekim voda i aktivno učestvuje. Osobine većine biomolekula zavise od vode. Sve mnogobrojne uloge vode u živim sistemima omogućene su posebnim osobinama vode, čiji je molekul dipolaran i ima osobinu da gradi vodoničnu vezu.

U čovekovom organizmu nalaze se mnoga organska i neorganska jedinjenja, pa i neki biomolekuli u obliku vodenih rastvora. Približno polovina ovih vodenih rastvora nalazi se u ćelijama, kao unutarćelijska tečnost . Unutarćelijska tečnost je relativno stalnog sastava, dok je sastav tkivne tečnosti i krvne plazme često podložan promenama. Za dobro funkcionisanje organizma neophodno je održavanje stalnog sastava i stalne, optimalne zapremine telesnih tečnosti, kako celokupne zapremine, tako i njene optimalne raspodele unutar ćelija ili van njih.

2.2 FIZIOLOŠKI MEHANIZMI I REGULACIJA VODE

Čovekov organizam sadrži malu zalihu vode, a dnevno gubi izlučivanjem 1,5 do 2 litra tečnosti, najviše u obliku mokraće. Ovaj se gubitak nadoknađuje unošenjem vode hranom i pićem, kao i stvaranjem vode, oksidacijom organskih molekula. Posebni fiziološki mehanizmi regulišu koliko će se vode u organizmu zadržati ili iz njega izlučiti i kako će se i koliko vode raspodeliti unutar i van ćelija. Svaka promena zapremine telesnih tečnosti i/ili promena koncentracije elektrolita u njima podstiču ove regulacione mehanizme u osnovi kojih leže osmotske zakonitosti. Ako se dva vodena rastvora različitih koncentracija neke supstance nalaze međusobno odvojeni samo polupropustljivom membranom, postoji težnja da se koncentracije oba rastvora izjednače. Zato nastaje difuzija vode kroz membranu. Kroz polupropustljive membrane mogu difundovati samo molekuli vode, a ne i molekuli rastvorene supstance.

Voda će difundovati iz razblaženijeg ili hipotoničnog u koncentrovaniji ili hipertonični rastvor. Što je veća razlika u koncentracijama dva rastvora, veća će biti i difuzija vode kroz membrane. Kada se između ova dva rastvora na ovaj način uspostavi dinamička ravnoteža, kada postanu izotonični ili izoosmotski, difuzija prestaje. Kako su telesne tečnosti unutar ćelija i izvan njih vodeni rastvori mnogobrojnih sastojaka, zavisno od koncentracije tih rastvorenih sastojaka u telesnim tečnostima, one mogu imati različite osmotske pritiske. Razlika u osmotskim pritiscima dovodi do izmene tečnosti između ćelija i vanćelijskog prostora sa jedne i plazme sa druge strane.

Osmotski pritisak unutarćelijskih rastvora zavisi od koncentracije najobilnijih sastojaka rastvora, kalijuma, kalcijuma, magnezijuma, fosfata i proteina. Veličina osmotskog pritiska vanćelijskih tečnosti, plazme ili tkivne tečnosti, zavisiće od najobilnijih jona u ovim rastvorima, uglavnom natrijuma i hlora. Unutarćelijski i vanćelijski rastvori odvojeni membranama pri normalnim uslovima nalaze se u osmotskoj ravnoteži. Ovu ravnotežu narušava promena koncentracije rastvorenih sastojaka. Promene u sastavu telesnih tečnosti znatno su češće u vanćelijskim tečnostima. Takav je slučaj, na primer, kod razblaživanja vanćelijskih tečnosti. One postaju hipotonične u odnosu na ćelijske rastvore, pa ova promena izaziva difuziju vode iz vanćelijskog prostora u ćelijski. Ovakva difuzija dovodi do hidratacije ćelija. Ako je hidratacija jako izražena ćelije bubre, a kad ćelijska membrana popusti, one se raspadaju. To je slučaj kod hemolize eritrocita. Obrnuto, u slučajevima kada vanćelijska tečnost postane koncentrovanija, hipertonična, nastaje difuzija vode iz ćelija i dolazi do ćelijske dehidratacije. Celokupna zapremina tečnosti u organizmu zavisi od unosa i izlučivanja, kao i od drugih faktora. Za živa bića veoma je značajno održavanje optimalne količine tečnosti. U ovom održavanju učestvuje više mehanizama, a osnovu čine osmotske zakonitosti. Glavno mesto gde se vrši regulacija balansa tečnosti su bubrezi. Ako kontrolni mehanizmi otkažu, u organizmu može doći do opšteg nakupljanja tečnosti, hidratacije, ili do smanjenja zapremine tečnosti, odnosno do dehidratacije.

Sve telesne tečnosti i tkiva živih bića sadrže vodonične jone. Hrana koju konzumiramo sadrži pretežno neutralne ili slabo kisele sastojke. Međutim, varenjem hrane i metaboličkim promenama svarenih sastojaka nastaju razne kiseline. U organizmu se neprekidno stvaraju kiseli proizvodi oksidacijom organskih jedinjenja ili ćelijskim disanjem. Glavni proizvod ćelijskog disanja je ugljena kiselina. Ova se kiselina lako razlaže na vodu i ugljen-dioksid, koji se može izbaciti izdisajem. Na taj način stvaranje ugljene kiseline neće znatno uticati na promene koncentracije H-jona telesnih tečnosti. Značajne promene pH vrednosti telesnih tečnosti mogu nastati stvaranjem većih količina sumporne ili fosforne kiseline. Različite tečnosti sadrže i različite i karakteristične koncentracije

H-jona. Želudačni sok je kisele reakcije, pankreasni sok i sadržaj tankog creva su alkalni, mokraća slabo kisela, a krv je neutralne reakcije. U nekim telesnim tečnostima koncentracije H-jona su promenljive, kao što je to slučaj, na primer, kod mokraće. U drugim tečnostima pH vrednosti se održavaju u određenim, tačno kontrolisanim vrednostima, kao što je pH krvi. pH krvi se kreće u uskom intervalu od 7,35 do 7,45, što je od posebnog značaja za održanje života. Donja granica pH vrednosti u krvi pri kojoj čovek ne može živeti duže od nekoliko minuta je 7,0, a gornja 7,8.

Optimalne koncentracije H-jona potrebne su za održavanje strukture i funkcije brojnih proteina, kao i za pravilno odvijanje biohemijskih reakcija, posebno onih koje katalizuju enzimi. Osim toga, neke hemijske reakcije u živim bićima katalizovane su H-jonima, a za funkcionisanje mnogih ćelijskih struktura potrebne su, takođe, optimalne koncentracije H-jona.

2.3 ACIDO-BAZNA RAVNOTEŽA

Čovekov organizam pruža otpor promeni koncentracije H-jona, odnosno promeni pH vrednosti, da bi održao acido-baznu ravnotežu. Ako se dogodi povećanje koncentracije H-jona ono se odmah neutrališe, puferuje. Tako se kod zdravih osoba, i pored svakodnevnog stvaranja velikih količina ugljene i neisparljivih kiselina, koncentracija H-jona u krvnoj plazmi održava se u granicama normalnih vrednosti. Održavanje acido-bazne ravnoteže postiže se na više načina uz učestvovanje više telesnih puferskih sistema i uz značajnu ulogu fizioloških procesa koji se odigravaju u nekim organima, pre svega, u plućima i bubrezima.

Slika 2.1 - Održavanje acido-bazne ravnoteže

U čovekovom organizmu postoje mnoge slabe kiseline i baze koje bi mogle činiti puferske sisteme. Međutim, za održavanje acido-bazne ravnoteže značajne su samo tri vrste pufera. Za održavanje acido-bazne ravnoteže u krvi najvažniji je bikarbonatni puferski sistem. Ovo ne samo zbog svoje puferske uloge već i zato što se puferski kapacitet tj. količine sastojaka koje ga čine regulišu sa dva telesna sistema, plućima i bubrezima. Pored bikarbonatnog, značajni su i proteinski puferi od kojih je najvažniji hemoglobin u eritrocitima, kao i još jedan neorganski, fosfatni puferski sistem.

Bikarbonatni pufer čine ugljena kiselina, davaoc protona i bikarbonatni joni, primaoci. Ugljena kiselina, iako slaba, disosuje stvarajući HCO- jon,

koji se kao nepostojano jedinjenje razlaže na vodu i ugljen-dioksid. Ovaj reversibilan proces u živim bićima katalizovan je jednim značajnim enzimom, karboanhidrazom. Ako se u telesnim tečnostima poveća koncentracija kiseline ili H-jona, ove se neutrališu sa HCO₃⁻ jonom bikarbonatnog pufera. Pri tome nastaje ugljena kiselina koja se kao nestabilna razlaže oslobađajući gasoviti ugljen dioksid:

H++ HCO3- ↔ H2CO3 ↔ H2O + CO2

U zatvorenom sistemu ne postoji mogućnost za izdvajanje gasovitog ugljen-dioksida, pa bi se pH vrednosti zbog nakupljanja ugljene kiseline postepeno smanjivale. Kako se, međutim, ugljen-dioksid plućima izdiše ovo se nakupljanje otklanja. Male promene u parcijalnom pritisku ugljen-dioksida ili koncentraciji H-jona, utiču na respiratorni centar, koji kontroliše ventilaciju. Takve se promene u koncentraciji ugljen-dioksida brzo koriguju izdisanjem i efikasno se održava acido-bazna ravnoteža u krvi. Ukoliko u organizmu dođe do nagomilavanja hidroksilnih jona, baza, ovi reaguju sa ugljenom kiselinom pri čemu nastaju bikarbonati:

OH‾+ H2CO3 → H2O + HCO3-

Ovako nastao višak bikarbonata neutrališe se drugim telesnim sistemom, bubrezima.

Bubrezi filtriraju krvnu plazmu i nastaje mokraća. Razlika u kiselosti između krvi i mokraće posledica su različitog hemijskog sastava ove dve telesne tečnosti. Prema potrebi bubrezi su u stanju da luče više ili manje kiselu mokraću, doprinoseći, značajno, regulaciji acido-bazne ravnoteže.

Bikarbonatni puferski sistem je veoma pogodan za održavanje acido-bazne ravnoteže. To je pufer znatnog kapaciteta pošto plazma sadrži dovoljne količine bikarbonata. Pored toga, ovaj pufer je jedinstven po svojoj povezanosti sa dva fiziološka mehanizma, koji su takođe uključeni u održavanje acido-bazne ravnoteže, tj. plućnom i bubrežnom regulacijom.

Jedan drugi neorganski puferski sistem je fosfatni pufer. Ovaj pufer je značajan za održavanje acido-bazne ravnoteže u unutarćelijskim tečnostima i bubrezima. Fosfatni pufer čine neorganski fosfati plazme i eritrocita. Ulogu davaoca protona ima H₂PO- jon, a primaoca HPO₄² - jon:

HPO₄² - + H+ ↔ H₂PO-

Međutim, kako je koncentracija fosfata niska, relativno je malog puferskog kapaciteta.

Proteini sadrže veliki broj amino- i karboksilnih grupa, koje mogu jonizovati pod određenim uslovima:

-COOH ↔ H-+ COO- , -NH₂ + H+ ↔ NH₃+

I delovati kao proteinski puferi. Najvažniji proteinski pufer je hemoglobin, koji je naročito značajan za održavanje optimalnih vrednosti pH krvi.

Puferi telesnih tečnosti najbrže reaguju na promene pH vrednosti. Oni to čine u toku 2-3 sekunde, dok su fiziološki mehanizmi, plućna i bubrežna regulacija, nešto sporiji. Tako se korekcija koncentracije ugljen-dioksida u plućima odvija u toku 2-3 minuta, a korekcija koncentracije bikarbonata u bubrezima u toku 2-3 sata, a može trajati i danima. U ćelijama se stalno stvaraju kisela i bazna jedinjenja koja se neutrališu puferima, disanjem i ekskrecijom preko bubrega. Ako se naruše kontrolni mehanizmi, dolazi do poremećaja koji mogu imati za posledicu povećanje ili smanjenje koncentracije H-jona u telesnim tečnostima, te nastaju acidoza ili alkaloza. Acidoza nastaje kod povećane koncentracije H-jona u krvnoj plazmi. Ona može biti posledica povećanog unosa ili proizvodnje kiselina ili njihovog smanjenog izlučivanja. Acidoza se može javiti i kao posledica većeg gubitka baza. Isto tako poremećaji u acido-baznoj ravnoteži mogu biti posledica promena u funkciji organa, pluća ili bubrega. Ako je acidoza posledica promena u plućnoj ventilaciji, onda se ona naziva respiratorna acidoza. Ako je plućna ventilacija dobra, postoje i drugi brojni metabolički poremećaji koji mogu dovesti do acidoze. Ovakva acidoza je metabolička.

Usled većeg gubitka kiselina ili većeg unosa baza mogu nastati povećanja vrednosti pH krvi i pojava alkaloze. Iz istih razloga kao kod acidoze i alkaloza može biti respiratorna ili metabolička.

2.4 POREMEĆAJ PROMETA VODE

Promet vode prati promet natrijuma pa se najčešće i razmatraju zajedno.

Dehidratacionih sindroma ima više, a iz shematskih razloga se dele na ekstracelularne, celularne i globalne. Potrebno ih je razlikovati budući da je i mehanizam različit, a pri lečenju treba voditi računa o patološkoj podlozi stanja.

Ekstracelularna dehidratacija nastaje kao posledica nedostatka tečnosti i soli u ekstracelularnom prostoru u izotoničnoj srazmeri. To ima za posledicu smanjenje volumena krvi, volumena međućelijskog prostora i kako nema osmotske razlike između ECP i ICP, ne dolazi do suštinske izmene u ICP.

Celularna (hipertonična) dehidratacija nastaje zbog nedostatka tečnosti u organizmu koja je posledica slabog unosa vode.

Hipotonična dehidratacija je posledica deficita natrijuma. Ovde se zato nadoknada tečnosti samo dodatkom vode smatra kontraproduktivnom. Nužno je pacijentu tečnost nadoknaditi hipertoničnim NaCl.

Hiperhidrataciona stanja nastaju zbog zadržavanja vode i karakterišu ga tri osnovna mehanizma. U jednom slučaju je prekomerno zadržavanje vode izotoničnog tipa, podjednaka je retencija vode i Na, u drugom slučaju je zadržavanje vode hipotoničnog tipa, hiperhidratacija izaziva višak vode, intoksikaciju vodom. Treći tip hiperhidratacije nastaje zbog viška natrijuma. Retencija vode je u ovom poslednjem slučaju sekundarna, ona je posledica zadržavanja u organizmu prekomernih količina natrijuma.

UKRATKO:

4.1 Voda čini oko 60% telesne mase čovekovog tela. Celokupna voda u telu raspodeljena je u:

1. ćelijsku ili intracelularnu tečnost koja čini 50% telesne mase i

2. vanćelijsku ili ekstracelularnu tečnost koja čini oko 20% telesne mase.

4.2 Vanćelijska tečnost nalazi se u međućelijskim prostorima, limfi i unutar krvnih sudova pa je delimo na:

1. međućelijsku ili intersticijsku i

2. krvnu ili vaskularnu tečnost

4.3 Sve su ćelije okružene vanćelijskom tečnošću, koja uglavnom ima isti kvalitativni sastav ali postoje kvantitativne razlike. Dominantni elektroliti u vanćelijskoj tečnosti su: Na⁺, Cl⁻ i HCO₃⁻.

4.4 Nasuprot kvalitativno jednakom hemijskom sastavu ekstracelularne tečnosti, razlike u strukturi i funkciji ćelija raznih tkiva odražavaju se i na hemijski sastav intracelularne tečnosti u pojedinim ćelijama. Eritrociti sadrže npr. specifičan protein hemoglobin, a mišićne ćelije mioglobin. Glavni katjon u intracelularnoj tečnosti je K⁺, a od anjona ima najviše fosfata.

4.5 Promena zapremine eksrtacelularne tečnosti ispoljava se u pojavi edema ili dehidrataciji. Edemi se javljaju kod srčanih mana, tromboflebitisa, kompresija vena, proteinurije, stvaranja ascitične tečnosti, gladovanja, nedovoljne apsorpcije proteina zbog npr. proliva, nedovoljne sinteze proteina zbog infekcija, anemija, insuficijencije jetre itd. Dehidratacija nastaje kao posledica gubitka tečnosti iz raznih razloga, npr. povraćanje, prolivi itd. Deficit aldosterona takođe ima za posledicu dehidrataciju.

4.6 Sva telesna tečnost, intracelularna i ekstracelularna ima određen osmotski pritisak. On zavisi od koncentracije rastvorenih supstanci i stepena njihove disocijacije. Osmotski pritisak, jednak je u ćelijskoj i vanćelijskoj tečnosti, jer ćelijske membrane propuštaju vodu i ona difunduje iz tečnosti manje osmolalne koncentracije u tečnost veće osmolalne koncentracije izjednačavajući ih.

4.7 Balans vode, tj. količina i raspodela tečnosti u telu, stoji u tesnoj vezi sa sastavom elektolita u toj tečnosti, a od toga zavisi osmotski pritisak i acidobazna ravnoteža, što je temelj normalnog odvijanja metaboličkih procesa i fizioloških funkcija u čovekovom telu. Glavni katjoni u organizmu su: Na⁺, K⁺, Ca²⁺ i Mg²⁺, a od anjona Cl⁻, HCO₃⁻, HPO₄²⁻ i SO₄²⁻.

4.8 Elektroliti imaju važni funkciju u:

a) održavanju ravnoteže i raspodele vode,

b) održavanju normalnog osmotskog pritiska,

c) održavanju acidobazne ravnoteže i

d) održavanju neuromuskulaturne nadražljivosti

ENZIMI

3.1 UVOD

Enzimi su najveća i specijalna klasa proteina. Oni su onaj biološki mehanizam koji omogućava živim organizmima da koriste energiju svoje okoline. Najvažnija osobina enzima je njihovo katalitičko dejstvo, zbog kojeg ih nazivamo »Biološki katalizatori«. Oni u deliću sekunde pokreću hiljade komplikovanih hemijskih reakcija, koje bi inače bez njih tekle vrlo sporo, danima i mesecima, pod uslovima koji se nalaze u ćeliji, odnosno na 37°C i u neutralnoj sredini. Iz iskustva znamo npr. da glukoza ostaje godinama nepromenjena na običnoj temperaturi. Tek kada povisimo temperaturu na 300°C ona će sagoreti u CO₂ i H2O. Ako tu istu glukozu damo životinji, ona će je sagoreti bez plamena vrlo brzo na konstantnoj temperaturi od 37°C i pritisku ili kako se to kaže izotermno, u CO2 i H2O. Pored toga, životinja će i energiju dobijenu sagorevanjem glukoze da iskoristi za svoje potrebe (transport kroz membranu, sinteze, mehanički rad itd.).

Supstanca čiju promenu enzim katalizuje naziva se supstrat:

Supstrat produkt reakcije

Ime enzim znači na grčkom »u kvascu« i kao i ime ferment potiče iz vremena, kada su prva saznanja o njima dobijena ispitivanjem fermentacije kvasca. Danas je ime enzim prihvaćeno za sve biološke katalizatore, bez obzira na njihovo poreklo.

Sve biološke promene i fiziološke funkcije živih bića (disanje, kontrakcija mišića prenošenje nervnih impulsa, rad bubrega itd.) dešavaju se pod katalitičkim dejstvom enzima. Zbog toga ćemo se upoznati sa najosnovnijim osobinama enzima i biološke katalize.

3.2 HEMIJSKA PRIRODA ENZIMA

Hemijska priroda enzima nije bila poznata sve dok Sumner (1926. g.) nije uspeo da izoluje i dobije u kristalnom stanju enzim-ureazu. Pokazalo se da je ureaza protein. Posle toga je sve do danas identifikovano preko 1 000 različitih enzima, a postoje genetske osnove da još mnoge treba otkriti. Svi do danas poznati enzimi su prosti ili složeni proteini, a mnogi su oligomerne strukture.

Preko 200 enzima je dobijeno u kristalnom stanju. Molekulska težina enzima kreće ss u vrlo širokim granicama. Tako npr. molekulska težina ribonukleaze iznosi 12 000, a L-glutamat dehidrogenaze oko 1 000 000. Napredak proteinske hemije omogućio je da se upozna primarna, sekundama i tercijarna struktura enzima. Jedan od enzima kome je određena struktura je himotripsin (slika 3.1). On se sastoji od

tri peptidna Ianca, koja su međusobno vezana preko dve —S—S— veze. Najveći deo peptidnih lanaca ima β- presavijenu strukturu.

Slika 3.1 - Trodimenzionalni model α-himotripsina određen merenjem difrakcije X-zrakova. Aktivni centar obrazuju ostaci histidina na polužaju 57 i serina na položaju 195; i asparaginska kiseiina 102 verovatno je uključena u katalitički

proces. Na slici su označeni N- i C- završetci tri peptidna lanca: A, B i C.

Redosled aminokiselina u enzimima je kao i u svim proteinima genetski dirigovan. To objašnjava činjenicu da se kompleksne reakcije životnih procesa prenose iz generacije u generaciju. Da je to tačno potvrđuje i otkrivanie naslednih oboljenja (galaktozemija i neke anemije), koja su posledica nedostatka odgovarajućih enzima.

Poznavanje hemijske strukture enzima omogućilo je da se objasne njihove karakteristične osobine katalizatora. Prva takva osobina je da enzimski katalizovane reakcije teku bez nastajanja sporednih produkata, odnosno sa 100% prinosom. Druga osobina je specifičnost enzimske katalize koja se sastoji u tome da ubrzavaju samo jedan od mogućih puteva razlaganja ili sinteze određenog jedinjenja. Zbog ovih osobina enzima mogu u ćeliji da teku istovremeno najrazličitije hemijske reakcije a da ih ne uspore i ne zakoče sporedni produkti. Ove osobine enzima počivaju na strukturnoj komplementarnosti proteinskog molekula enzima sa njegovim supstratom. Mnogobrojna ispitivanja su pokazala da u enzimskom molekulu postoji jedno mesto, koje vezuje samo onaj supstrat, koji mu odgovara kao ključ u bravi. Posle

vezivanja supstrata to mesto, koje se zove »aktivni centar« enzima, aktivno učestvuje u katalizovanoj reakciji. Pošto su enzimi proteinskog karaktera, aktivni centar je sastavljen od izvesnog broja blisko grupisanih funkcionalnih grupa, koje učestvuju u vezivanju supstrata i nastajanju enzim-supstrat kompleksa. Ove grupe su bočni lanci amino-kiselina (npr. serina, histidina, cisteina i dr.) ili metalni joni metalo-enzima. Vrlo često grupe pripadaju ostacima aminokiselina s udaljenih delova peptidnog lanca, ali koje su približene jedna drugoj zbog presavijanja lanaca usled specifične konformacije enzima. Tako se npr. aktivni centar α-himotripsina sastoji od ostatka histidina na položaju 57 i serina na položaju 195 (slika 3.1). Ovo objašnjava veliku osetljivost enzima na promenu njihove tercijerne strukture odnosno na denaturaciju.

Dokazano je da najmanje dve strukturne osobine supstrata i enzima određuju specifičnost reakcije. Prvo supstrat mora da ima određenu hemijsku vezu, koju može da napadne enzim i drugo, mora da ima neku drugu funkcionalnu grupu pomoću koje se vezuje za enzim. Uzmimo kao primer reakciju acetilholin-esteraze, koja teče na sledeći način:

Veza koju napada enzim je estarska veza između holina i sirćetne kiseline. Pozitivno naelektrisana kvaternerna amonijum-grupa acetilholina je ona kojom se vezuje supstrat za enzim. Veza se ostvaruje za negativni anjonski položaj na enzimu tako da se ostatak acetilholina tačno upravi na katalitičko mesto enzima. To katalitičko mesto, koje se naziva estarski položaj, ima ostatak serina. Slobodni elektronski par na -OH grupi serina aktivno učestvuje u reakciji. Na slici 3.2. predstavljen je aktivni centar acetilholin-esteraze.

Slika 3.2 Aktivni centar acetilholin-esteraze

Iz ovog primera vidimo da aktivni centar omogućava da se supstrat veže za enzim slabom nekovalentnom vezom (u našem primeru jonskom). Na taj način je omogućen kontakt supstrata sa katalitičkim

centrom, a posle završetka reakcije nastali produkt se oslobađa. Detaljni mehanizmi enzimski katalizovanih reakcija opisani su u udžbenicima enzimolcgije.

Enzimi su amfoliti, kao i svi proteini. Spadaju u globularne proteine i na površini svoga molekula sadrže pozitivne i negativne naboje. Najlakše se talože kod izoelektrične tačke, kod koje je broj pozitivnih i negativnih naboja jednak. Katalitička aktivnost enzima zavisi od pH sredine i svaki enzim pokazuje optimalnu aktivnost kod određenog pH. Izuzimajući enzime, koji su vezani za strukturne elemente ćelije, oni se uglavnom rastvaraju u vodi i razblaženim rastvorima soli. Zbog velike molekulske težine mogu dijalizom da se odvoje od soli i jedinjenja manje molekulske težine.

3.3 KOENZIMI I PROSTETIČNE GRUPE

Neki enzimi su prosti proteini, koji se sastoje samo od polipeptidnog lanca. U ovu grupu spadaju hidrolitički enzimi: pepsin, tripsin, lizozim i ribonukleaza. Mnogi enzimi su, međutim složeni (konjugovani) proteini, koji se sastoje od proteinske komponente i neproteinske - kofaktora. Kofaktor može da bude metalni jon ili kompleksni organski molekul, koji se naziva koenzim ili prostetična grupa. Kofaktori su obično stabilni pri zagrevanju, dok je većina proteina labilna. Enzim vezuje svoj faktor različitom jačinom afiniteta. Ako se kofaktor teško odvaja od enzima i u toku izolovanja ostaje vezan za enzim, tada se naziva prostetična grupa i smatra se da je integralni deo enzima. U slučaju kada se kofaktor vezuje za enzim slabim nekovalentnim vezama i lako se i reverzibilno odvaja od enzima, naziva se koenzim Proteinski deo se zove apoenzim.

Koenzim + apoenzim → holoenzim

Tabela 3.1 Enzimi sa metalom kao kofaktorom U tabeli 3.1 navedeni su enzimi, koji imaju

metal kao kofaktor. U takvim enzimima metalni jon može

da ima jednu od dve moguće uloge. Može da služi kao most za vezivanje supstrata i enzima stvarajući koordinacioni kompleks ili može da ima ulogu katalitičke grupe. Tako su npr. atomi gvožđa u katalazi, koja ubrzava razgradnju H2O₂, sastavni deo njenog katalitičkog centra.

Koenzimi i prostetične grupe su pored metala i metalo-porfirina, najčešće nukleotidnog karaktera. Takvi kofaktori se kao i svi nukleotidi sastoje od : baze + riboze + fosforne kiseline. Vrlo često su i di-nukleotidnog karaktera, od kojih jedan nukleotid sa-drži kao bazu neki vitamin B-grupe, a drugi je adenilna kiselina. U tabeli 3.1 dat je pregled koenzima i prostetičnih grupa metaloporfirinskog i nukleotidnog karaktera.

Koenzimi i prostetične grupe omogućavaju da enzimske reakcije teku stehiometrijski, jer reaguju sa supstratom mol pro mol. Oni obično tokom reakcije oduzimaju ili predaju supstratu neke atome (npr. H2) ili različite funkcionalne grupe (amino, metil, formil i dr.), pa i čitave molekule (monosaharid, uronsku kiselinu i sl.). Znači da se tokom enzimske reakcije ne menja samo supstrat, već i koenzim, koji se zbog toga često naziva kosupstrat. Koenzimi ne odgovaraju strogoj definiciji katalizatora, jer se vraćaju u prvobitno stanje tek pošto reaguju sa drugim supstratom, čiju promenu katalizuje odgovarajući enzim, koji koristi isti koenzim.

Postoji principijelna razlika u metaboličkoj ulozi između koenzima i prostetične grupe. Koenzim može da učestvuje u reakcijama svih enzima određenog ćelijskog prostora, koji su na njega specifični; u kojoj će meri pojedini koenzim učestvovati u reakciji, zavisiće od njegove stacionarne koncentracije i standardnog redukcionog potencijala reakcije E'o. Prostetična grupa međutim, sudeluje isključivo samo u jednoj reakciji specifičnoj za taj enzim, pa bila ona i dvostepena (slika 3.4). Na osnovu gornjeg možemo da kažemo da različiti enzimi mogu da imaju iste koenzime ili prostetične grupe. Iako imaju iste kofaktore, takvi enzimi katalizuju različite reakcije, jer specifičnost enzima zavisi samo od proteinske komponente.

Uzmimo nekoliko primera enzima koji imaju isti koenzim, kao i primer enzima koji sadrži prostetičnu grupu i kofaktor metal.

Tabela 3.2 - Koenzimi i prostetične grupe

Ime i skraćenicaGrupa koju prenosi i tip reakcije

Sadrži vitamin

Nikotinamid-adenin dinukleotid (NAD+)

vodonik Niacinamid

Nikotinamid-adenin dinukleotid fosfat (NADP)+

vodonik Niacinamid

Flavin nukleotidi (FMN i FAD)

vodonik Riboflavin

Gvožđe-protoporfirinielektrone; aktivne grupe katalaze, peroksidaza i citohroma

Ne

Adenozin trifosfat (ATP)ostatak H3PO4 sa energijom

Ne

Uridin difosfat (UDP) šećer, uronske kiseline Ne

Citidin dfosfat (CDP)fosforil-holin i slične grupe

Ne

Fosfo-adeniI-suIfat ostatak H2SO4 Ne

Adenozil-metionin metil-grupu (metionin)

Tiamin pirofosfat (TPP)C2-aldehidnu grupu; oksidativne dekarboksilacije

Tiamin

Piridoksal fosfatamino grupu; dekarboksilacije amino kiselina i racemaze

Piridoksin

Koenzim A (Ko-A)acetil i druge kiselinske ostatke; sinteza i oksidacija masnih kis.

Pantotenska kiselina

6.8-ditio-n-oktanonska (liponska) kiselina

akceptor vcdonika i acil grupa; oksidativna dekarboksilacija

Liponska kiselina

Tetrahidrofolna kiselina (KoF)

formil grupu Folna kis.

Biotin CO2 Biotin

Kobamidpomera karboksilnu grupu unutar molekula

Kobalamin

3.3.1 NIKOTINAMID-ADENIN-DINUKLEOTID (NAD)-SPECIFIČNE DEHIDROGENAZE

Veliki broj enzima koji katalizuju oksidaciju različitih supstrata (oksido-reduktaze) imaju isti koenzim nikotinamid-adenin-dinukleotid NAD, koji reverzibilno prima i otpušta dva atoma vodonika. Struktura NAD data je na slici 3.3, iz koje se vidi da se primanje i otpuštanje vodonika odnosno oksido-redukcija, dešava na delu nikotinamida.

Slika 3.3 - Struktura oksidovanog NAD (a) i mesto oksido-redukcije (b)

Enzimska reakcija supstrata (X) se obično piše:

XH2 + NAD+ ↔ X + NADH + H+

U toku reakcije NAD se redukovao u NADH i oslobođen je jedan ekvivalent kiseline odnosno H+.

Neka nam kao primer dva enzima sa istim koenzimom posluže: fosfotriozo-dehidrogenaza (enzim I) i dehidrogenaza mlečne kiseline (enzim II). Prvi enzim katalizuje oksidaciju glicerinaldehid-3-fosfata, a drugi redukciju pirogrožđane kiseline. U prvoj reakciji koenzim NAD+

prima vodonik od glicerinaldehida i redukuje se u NADH, a u drugoj reakciji se oksiduje predajući vodonik pirogrožđanoj kiselini (slika 3.4).

Značaj koenzima u metabolizmu je baš u tome što posreduju između različitih enzima i na taj način povezuju čitav niz metaboličnih promena. U velikom broju slučajeva, kada je koenzim adenozin-

trifosfat (ATP), on i energetski obogaćuje supstrat i na taj način omogućava endergonske procese.

Slika 3.4 - Učestvovanje istog koenzima (NAD+) u dve oksidoredukcione reakcije

3.3.2 FLAVINADENIN-NUKLEOTID SPECIFIČNE OKSIDO-REDUKTAZE

Veliki broj oksidoreduktaza ima za prostetičnu grupu flavinadenin-dinukleotid (FAD) ili mononukleotid (FMN). Reakcija oksidacije supstrata teče tako da prostetična grupa prima vodonik i redukuje se:

XH2 + FDA ↔ X + FDAH2

Pošto je prostetična grupa čvrsto vezana za supstrat, on se vraća u oksidovani oblik tako što predaje vodonik drugom supstratu. Na primeru oksidativne desaminacije D-aminokiseline pod dejstvom oksidaze, prostetična grupa prvo prima dva atoma vodonika od aminokiseline, a ponovo se vraća u oksidovano stanje (FAD) predajući vodonikove atome drugom supstratu u ovom slučaju kiseoniku. U toj reakciji, aminokiselina se oksiduje u ketokiselinu preko iminokiseline (slika 3.5).

Slika 3.5 - Reakcija oksidativne desaminacije D-aminokiselina (Učestvovanje istog enzima u dve reakcije)

Iz strukture FAD i FMN se vidi da se oksido-redukcija odigrava na izoaloksazinskom prstenu.

U poglavlju biosinteze masnih kiselina dat je još jedan primer reagovanja prostetične grupe (biotina) sa dva supstrata u reakciji koju katalizuje acetil-koenzim A- karboksilaza.

3.3.3 OKSIDO-REDUKTAZE SA METALOM KAO KOFAKTOROM

Reakcija aerobne oksidacije askorbinske kiseline (vitamin C), koju katalizuje specifična oksidaza teče na sledeći način: askorbinska kis. + 1/2 O₂→ redukovana askorbinska kis. + H2O. Čisti enzim je plavo obojeni protein, koji sadrži 8 atoma bakra čvrsto vezanih za proteinsku komponentu. U toku oksidacije bakar prelazi iz dvovalentnog u jednovalentno stanje primanjem jednog elektrona:

Cu2+ Cu+

U ovakvom slučaju prostetična grupa metala služi kao prenosilac elektrona.

3.4 KARAKTERISTlČNE OSOBINE BIOLOŠKE KATALIZE

Enzimi su katalizatori žive materije, koja ih sama i stvara. Kataliza je, međutim, poznata pojava u hemiji.

Pod katalizatorom se podrazumeva supstanca koja ubrzava jednu hemijsku reakciju, a ne pojavljuje se kao krajnji proizvod reakcije. Na primer:

2H2 + O2 2H2O

Na osnovu ove definicije ne sme se zaključiti da katalizatori ne učestvuju u reakciji. Naprotiv, da bi izvršili svoju funkciju, oni moraju na neki način da reaguju sa supstratom.

Vrlo upadljiva osobina enzima kao i svih katalizatora je da su efikasni u malim količinama. Tako vrlo mala količina platine katalizuje sjedinjavanje skoro neograničene količine vodonika i kiseonika u vodu. Naravno, pod uslovom, da se ne dešava ništa što bi dovelo do promene katalitičkih osobina platine. Efikasnost katalizatora se izražava u broju molova substrata koji se menja u jedinici vremena. Katalitička efikasnost enzima je vrlo velika, jer 1 mol enzima katalizuje promenu 10 000 do 1 000 000 mola substrata u jedinici vremena.

Prema Ostwald-ovoj definiciji količina i hemijski sastav katalizatora se ne menja posle hemijske reakcije, koju je katalizovao. Međutim, kod velikog broja katalizatora se opazilo, da vremenom toliko promene svoje fizičke osobine, da izgube katalitičko dejstvo. Pored toga aktivnost bioloških katalizatora opada tokom reakcije, jer nastali proizvodi koče (inhibiraju) njegovo dejstvo.

Jedna od najvažnijih osobina enzima je njihova specifičnost, koja počiva na strukturnoj komplementarnosti enzima i supstrata. Neorganski katalizator npr. platina može da katalizuje redukciju s molekulskim vodonikom desetine i hiljade jedinjenja različite strukture. Enzimi, međutim, katalizuju samo jednu vrstu promene i to često samo jednog supstrata. Prema rečima Dixon-a. i Webb-a: »Specifičnost enzima je najvažniji biološki fenomen bez koga normalni metabolizam žive materije ne bi mogao da postoji, a i sam život bi bio nemoguć«.

Nisko specifični su oni enzimi koji deluju samo na određenu hemijsku vezu: hidrolizuju estarsku, peptidnu ili glikozidnu vezu različitih estara, peptida odnosno glikozida. Naprotiv, apsolutno specifični su oni koji katalizuju samo jednu reakciju određenog suptrata. Npr. aspartaza katalizuje reverzibilnu adiciju NH3 na dvogubu vezu fumarata pri čemu nastaje L-aspartat. Ona ne katalizuje adiciju na slična jedinjenja: estar ili amid fumarne kiseline. Ovaj enzim pokazuje i stereospecifičnost.

(Slika 3.6). Produkt reakcije je L-aspartat pri čemu se ostvaruje asimetrična sinteza, iako postoji teorijska mogućnost da nastane D-aspartat, jer je fumarna kiselina optički inaktivna.

Slika 3.6 - Reakcija aspartaze

3.5 KATALIZA REVERZIBILNIH PROCESA

Sve hemijske i biohemijske reakcije su teorijski reverzibilne i teže ka jednom ravnotežnom stanju. Kod takvih reakcija uspostavljanje ravnotežnog stanja moguće je u oba pravca:

Katalizator ubrzava uspostavljanje ravnoteže reverzibilnih reakcija, ali ne utiče na njen položaj. On teorijski može da ubrza reakciju oba pravca. Međutim, u kom će pravcu katalizator da ubrzava uspostavljanje ravnoteže zavisi od promene slobodne energije.

Za vreme svake hemijske reakcije dolazi do promene slobodne energije. Pod slobodnom energijom podrazumeva se ona količina energije koja na konstantnoj temperaturi i pritisku (izotermno) može da pređe u maksimalni rad: mehanički, osmotski, električni i hemijski. Slobodna energija se obeležava sa ΔG. Hemijske reakcije tokom kojih dolazi do oslobađanja energije, nazivaju se egzergonske reakcije, a promena slobodne energije ima negativni znak (-ΔG). Obrnuto, reakcije kojima treba dodati energiju nazivaju se endergonske, a dodata energija ima pozitivni znak (+ΔG).

Egzergonske reakcije su spontane, to znači — kad počnu da teku, one teku same od sebe. Katalizator može da ubrza samo spontane reakcije da teku brže. Polazne supstance spontanih reakcija sadrže više energije od krajnjih proizvoda i baš zbog toga takve reakcije teku u pravcu smanjenja slobodne energije, koja se oslobađa. Razlog je isti, kao i kod kotrljanja kamena niz strmu ravan ili prelaženja vodene pare na hladnije mesto. U svim slučajevima dolazi do smanjenja slobodne energije, jer kamen pada na niži nivo potencijalne energije, a hemijska reakcija spontano teče u pravcu nastajanja jedinjenja sa manjim sadržajem slobodne energije.

Ravnotežno stanje reverzibilne reakcije okarakterisano je konstantom ravnoteže. Ona pokazuje kakav je odnos molarnih koncentracija krajnjih i početnih supstanci u momentu ravnoteže. U ravnotežnom stanju je taj odnos molarnih koncentracija svih članova reverzibilne reakcije konstantan i ne zavisi od početnih koncentracija. To je konstanta ravnoteže i prema definiciji je za gornju reakciju data odnosom:

K =

Vrednosti u srednjim zagradama označavaju molarne koncentracije. Uobičajeno je da se krajnji proizvodi reakcije pišu u brojitelju, a polazne supstance u imenitelju.

Ako je konstanta ravnoteže K= 1, ravnoteža ss nalazi na sredini, ako je K> 1, ravnoteža je pomerena u desno, a ako je K< 1, onda je pomerena na levu stranu.

Iz konstante ravnoteža reverzibilne reakcije može da se izračuna promena slobodne energije, jer između njih postoji sledeća povezanost:

U jednačini R je gasna konstanta, T apsolutna temperatura, a izraz

je odnos molarnih koncentracija na početku reakcije. U

slučaju kada međusobno reaguju jedinice aktivnosti svih komponenata (=1 M), tada je gornji izraz jednak jedinici:

Pošto je logaritam od 1 jednak nuli, to ceo drugi sabirak u jednačini otpada. Vrednost slobodne energije, koja se dobija pod takvim uslovima naziva se »standardna promena slobodne energije« i obeležava se sa ΔG°

ΔG°= -RT ln K

U dekadnom sistemu je

ΔG°= -4,575 T log K

Iz iste jednačine se vidi da promena slobodne energije zavisi od konstante ravnoteže i odnosa koncentracija na početku reakcije. Ukoliko je konstanta ravnoteže veća, a odnos molarnih koncentracija manji, utoliko dolazi do većeg oslobađanja energije kada reakcija teče s leva na desno i obrnuto.

Kada odnos molarnih koncentracija tokom reakcije postane jednak konstanti ravnoteže date reverzibilne reakcije:

tada je promena slobodne energije jednaka nuli, jer je

ΔG=-RT ln K+ RT ln K=0

Znači da hemijski sistem u ravnotežnom stanju ne može da daje energiju. Katalizator ne može da pomeri krajnje ravnotežno stanje. Svaka enzimski katalizovana reakcija teče dok se ne uspostavi ravnoteža, koja je mogućna i bez katalizatora. Primenimo gornje izlaganje na reakciju koju katalizuje fumaraza:

HOOC-CH = CH-COOH + H2O ↔ HOOC-CH2-CH(OH)-COOHfumarna kiselina jabučna kiselina

ΔG° = - 3,62 kJ. Konstanta ravnoteže =4, a to znači bilo da započne reakcija sa fumaratom, bilo sa jabučnom kiselinom, u momentu ravnoteže njihov odnos će biti 1 :4. Eksperimentalno se može da dokaže da je reakcija reverzibilna. Međutim, sledeća reakcija:

fosofo-enolpiruvat +H2O ↔ piruvat + fosfat

čija je vrednost ΔG°-62,0kJ, a konstanta ravnoteže 2,9 x 10 pomerena je toliko na desnu stranu u momentu ravnoteže, da se praktično može smatrati ireverzibilnom.

Jedina mogućnost pomeranja ravnoteže neke reakcije postoji ako se spregnu dve enzimski katalizovane reakcije na taj način, da se u jednoj reakciji neprekidno troši proizvod druge reakcije. Obično se tada kaže da se uklanjanjem jednog proizvoda reakcije, ravnoteža pomera. Bolje je, međutim reći, da se ravnoteža nikada ne postiže, pošto proizvod dalje reaguje i druga ga reakcija mora stalno da nadoknađuje.

Stotine enzimskih reakcija u ćeliji ne teku nezavisno jedna od druge. One su povezane u nizove (od 2—20), koje imaju zajedničke intermedijere tako da je proizvod jedne reakcije supstrat druge. Takvi nizovi kao npr. glikolitički, ciklus limunske kiseline, lanac disanja, su međusobno povezani i grade mrežu konvergentnih ili divergentnih puteva. Na ovaj način mogućno je kanalisanje i regulisanje enzimskih reakcija.

Jedan od najvažnijih osobina živih bića je da mogu da koriste energiju svoje okoline pod izotermnim uslovima. Životinje i čovek koriste energiju, koja je hemijski vezana u sastojcima hrane. Životinje su jedna vrsta izotermne hemijske mašine. Izotermno korišćenje hemijske energije je mogućno jedino povezivanjem enzimskih rekacija. Ako dve rekacije teku

A→B

C→D

nezavisno jedna od druge, svaka od njih je praćena sebi svojstvenom promenom slobodne energije, čija veličina ne zavisi od prisustva druge.

Ako su, međutim, reakcije povezane zajedničkim intermedijerom koji sadrži određenu količinu energije, onda se ona preko njega prenosi na drugu reakciju: A→B→C→D. Uzmimo kao primer dve reakcije glikolitičkog niza:

1. fosfoenol-piruvat + ADP piruvat + ATP. . .

ΔG° = - 31,45 kJ

2. ATP+α-D-glukoza ADP+α-D-glukozo-6-fosfat

ΔG°= -16,7kJ

Velika vrednost promene standardne slobodne energije pokazuje da su reakcije pomerene na desnu stranu i da nisu reverzibilne pod intracelularnim uslovima. Produkt prve reakcije ATP u kome je konzervirana njena slobodna energija je supstrat druge reakcije, koji je na taj način snabdeva energijom i čini spontanom.

Zbog povezivanja enzimski katalizovanih reakcija u živoj materiji nikada ne dolazi do hemijske ravnoteže, već se naprotiv ravnoteža stalno pomera, tako da se energija maksimalno koristi. U ćeliji vlada »stacionarna« ravnoteža između energije koju prima (u vidu hrane) i energije koju troši za najrazličitije životne potrebe.

3.6 KATALITIČKO DEJSTVO

Iz običnog života nam je poznato da mnoge zapaljive i reaktivne supstance, kao što je benzin ili praskavi gas, mogu da stoje vrlo dugo da se ne zapale i da ne nastupi reakcija. Međutim, kada unesemo varnicu ili katalizator, benzin će se zapaliti, a praskavi gas će uz burnu eksploziju preći u vodu. Slično će i vodonik-peroksid početi da se raspada na vodu i kiseonik, ako povisimo temperaturu ili ako dodamo neki katalizator (platinu ili enzim katalazu)

2 H2O2 2 H2O + O2

Znači da za odigravanje jedne energetski mogućne hemijske reakcije nije dovoljno da molekuli dođu samo u kontakt, nego im treba dodati izvesnu početnu energiju, koja će ih aktivisati toliko, da pri njihovom sudaru dođe do hemijske promene.

Kinetička energija molekula u jednom sistemu nije ravnomerno raspoređena (slika 3.7). Neki

imaju manju, neki veću količinu energije. Do hemijske reakcije dolazi samo kada se sudare »aktivni« molekuli tj. takvi koji sadrže znatniju količinu kinetičke energije. To mogu da budu i »nadraženi« molekuli, čiji se pojedini elektroni nalaze na većem energetskom nivou ili takvi, čija se unutrašnja struktura razlikuje od najpostojanije. Početna energija, koju je potrebno dodati za aktivisanje molekula naziva se energija aktivacije. Ukoliko je za neku reakciju potrebna veća energija

Slika 3.7 - Raspodela energije na molekule raznog energetskog stanja na temperaturi T1° i višoj T2°.

aktivacije, utoliko je ta reakcija tromija. Za vrlo reaktivne supstance energija aktivacije je mala (tabela 3.3)

Potrebu da se doda izvesna količina energije aktivacije za pokretanje hemijskih reakcija objašnjava teorija prelaznog stanja. Prema ovoj teoriji da bi jedna reakcija krenula između X i Y, treba prvo da se stvori aktivni kompleks (X—Y), koji može da nastane sjedinjavanjem aktivisanih molekula. Njihov broj je mali (šrafirani deo na slici 3.7). Aktivni kompleks sadrži veću količinu slobodne energije i sposoban je da savlada energetsku barijeru za pokretanje reakcije (slika 3.8).

Slika 3.8 - Energetska barijera između polaznih supstanci (X+Y) i krajnjeg produkta Z

Rekli smo da raspadanje H2O2 može da se ubrza ne povisujući temperaturu, ako se doda katalizator (Pt ili enzim katalaza). Dodatak katalizatora, formalno gledano, je analogan povišenju temperature, jer i u jednom i u drugom slučaju dolazi do ubrzanja reakcije. U suštini, međutim, postoje duboke principijelne razlike između ubrzanja reakcije izazvane povišenjem temperature i dodatkom katalizatora. U prvom slučaju se energija dodaje spolja do one vrednosti koliko iznosi energija aktivacije za datu reakciju. Osim toga pri povišenju temperature dolazi kod povratnih reakcija i do pomeranja ravnoteže.

Ubrzanje reakcije dodatkom katalizatora posledica je baš snižavanja energije aktivacije.

Tabela 3.3 - Zavisnost poluvremena trajanja monomolekulske reakcije od potrebne energije aktivacije

Iz tabele 3.3 se vidi da sniženje aktivacije za samo 20 kJ (od 120 na 100 kJ) skraćuje njeno trajanje od jedne godine na 3 časa. Energija aktivacije enzima kreće se od 25 do 5,5 kJ (katalaza), to znači da se one odigravaju u milionitom delu sekunde.

Munjevito dejstvo enzima ostvaruje se nastajanjem serije aktivnih intermedijera (slika 3.9; Tako je npr. dokazano da postoje četiri prelazna aktivna kompleksa kod enzima peroksidaze. Objašnjenje tačnog mehanizma akcije pojedinih enzima zahteva poznavanje njegovog aktivnog centra. U svakom slučaju ubrzanje se postiže vezivanjem supstrata i njegovom pogodnom orijentacijom u aktivnom centru.

Slika 3.9 - Smanjenje energije aktivacije enzimskih reakcija

3.7 KINETIKA ENZIMSKIH REAKCIJA

Sve što je u vezi sa brzinom hemijskih reakcija, njihovim tokom i mehanizmom obrađuje hemijska kinetika.

Enzimi su okarakterisani hemijskom reakcijom koju katalizuju. Svaka promena enzimskog molekula odražava se na brzinu katalizovane reakcije. Zbog toga je merenje brzine enzimskih reakcija od izuzetne vrednosti posebno za kliničku dijagnostiku, jer omogućava praćenje normalnog metabolizma i otkrivanje metaboličnih poremećaja.

Brzina se u fizici definiše kao promena puta u jedinici vremena, a u hemiji kao promena koncentracije u jedinici vremena: Za reakciju : A → P, ona može da se izrazi smanjenjem koncentracije polazne supstance ili povećanjem koncentracije produkta (P):

ili

Brzina hemijske reakcije zavisi od: prirode reagujućih supstanci, njihove koncentracije, temperature, pritiska, prisustva katalizatora. U ćeliji se

reakcije odigravaju na konstantnoj temperaturi i pritisku (izotermno). Pod tim uslovima brzina reakcije je upravo proporcionalna njenoj konstanti i koncentraciji reagujućih supstanci:

A predstavlja molarnu koncentraciju. Kada je A = 1 M, v = k. Prema tome konstanta brzine (k) odgovara onoj brzini date reakcije kada reaguju jedinice koncentracije (=1M).

Ako je brzina reakcije proporcionalna koncentraciji jednog reaktanta, kažemo da je to reakcija prvog reda. Ako zavisi od koncentracije dvaju reaktanata, onda je to reakcija drugog reda itd. Kada brzina reakcije ne zavisi od koncentracije reaktanata, to je reakcija nultog reda. Za reakcije prvog reda poluvreme reakcije, odnosno momenat kada početna koncentracija padne na polovinu, ne zavisi od početne koncentracije, već samo od konstante brzine

3.8 MICHAELIS — MENTENOVA TEORIJA

Brzina enzimski katalizovanih reakcija, na konstantnoj temperaturi i pH, zavisi i od koncentracije supstrata (S) i enzima (E). Kod konstantne koncentracije enzima, brzina katalizovane reakcije ne raste

linearno sa povećanjem koncentracije supstrata, kao što je to slučaj kod ne-enzimskih reakcija. Na slici 3.10 prikazan je uticaj povećane koncentracije supstrata na brzinu enzimske reakcije pri E = konst. Iz slike se vidi da brzina enzimske reakcije raste sa povećanjem koncentracije supstrata po hiperboli, a ne linearno. Kod jedne određene koncentracije supstrata postiže se zasićenje i maksimalna brzina (Vmax).

Na osnovu gornjih zapažanja Michaelis i Menten-ova izneli su svoju teoriju o međusobnom delovanju enzima i supstrata i enzimskoj kinetici. Njihova teorija predstavlja osnovu kvantitativne analize enzimske kinetike i inhibicije. Prema toj teoriji tok enzimske reakcije teče na sledeći način: Enzim prvo reaguje sa supstratom i gradi enzim-supstrat kompleks:

k₁ je konstanta brzine nastajanja kompleksa (ES) i zavisi od osobine enzima i supstrata, a k2 je konstanta brzine razlaganja kompleksa (obmuta reakcija) i zavisi od osobine ES. U drugom stupnju, enzim-supstrat kompleks se razlaže na produkt P, a enzim se oslobađa:

I ovaj proces zavisi od konstante brzine razlaganja kompleksa (k₃) i konstante brzine obrnute reakcije k4. Smatra se da su obe reakcije reverzibilne.

Slika 3.10 - Uticaj koncentracije supstrata na brzinu enzimske reakcije

Michaelis i Menten-ova. su zapazili da je postizanje maksimalne brzine, odnosno moment zasićenja enzima sa supstratom, karakterističan parametar za svaki enzim i njegov supstrat. Ova

… 1

… 2

… 3

vrednost nije ništa drugo nego odnos konstanti brzina reakcije razlaganja enzim-supstrata kompleksa i njegovog nastajanja:

Ukoliko su brzine razlaganja kompleksa veće (jednačine 1 i 2) utoliko je afinitet enzima prema supstratu manji, a vrednost Km je veća. Pošto nastajanje enzim-supstrat kompleksa od slobodnog enzima i produkta reakcije, eksperimentalno ne može da se registruje, smatra se da je vrednost konstante brzine te reakcije k4 tako mala da može u jednačini 3. da se izostavi pa dobijamo izraz odnosa konstanti, koji se naziva Michaelis-ova konstanta. Njena jedinica je Mol/1 pošto i konstante brzine imaju jedinicu Mol/litra:

Michaelis-ova. konstanta se za različite enzime kreće u granicama od 10-2 do 10-5 mola na litar (10 do 0,01 mM).

Vrednost Km može eksperimentalno da se odredi merenjem brzine reakcije y i iznalaženjem maksimalne brzine Vmax kod poznatih koncentracija supstrata. Ako detaljno posmatramo jednačine 1 i 2, onda će brzina nastajanja kompleksa [ES] da bude proporcionalna koncentraciji slobodnog enzima [E—ES] i koncentraciji supstrata:

Pošto se razlaganje supstrata dešava i u reakciji 1 i 2, to će brzina iznositi:

Znak (—) je stavljen jer se smanjuje koncentracija [ES] U momentu ravnoteže dolazi do izjednačavanja brzina razlaganja i nastajanja [ES], pa ćemo izjednačiti jednačine 5 i 6:

ako u ovoj jednačini prenesemo konstante na desnu stranu dobićemo:

… 5

… 6

… 7

… 4

Na osnovu jednačine 7. koncentracija enzim-supstrat kompleksa iznosi:

Brzina koju mi eksperimentalno merimo je brzina nastajanja produkta (jednačina 2), a ona je proporcionalna koncentraciji [ES]:

Ako u jednačinu 9. uvedemo vednost za [ES] (jednačina 8) dobićemo da je:

Pošto je maksimalna brzina proporcionalna prisutnoj koncentraciji enzima:

Zamenom ove vrednosti u jednačinu 10, dobijamo Michaelis-Mentenovu jednačinu, koja nam omogućava da odredimo Km merenjem brzine reakcije:

Ako se na slici grafički iznađe ona koncentracija supstrata, kod koje je postignuta polovina maksimalne brzine:

skraćivanjem Vmax, jer se nalazi i s leve i desne strane dobijamo:

odnosno

…11

…12

… 8

…9

…10

Tabela 3.4 - Vrednosti Km nekih enzima

Michaelisova konstanta Km odgovara, dakle, onoj konccntraciji sapstrata sa kojom se postiže polovina rnaksimalne brzine. Njena vrednost ne zavisi od koncentracije enzima. U tabeli 3.4 date su vrednosti Km za razne enzime. Njena vrednost zavisi od strukture supstrata, pH i temperature. Michaelis-Mentenova jednačina može da se transformiše u druge oblike. Najpoznatiji je oblik Lineweaver—Burk, pomoću koje može tačnije da se odredi Vmax. Detalji se mogu

naći u udžbenicima i praktikumima enzimologije.

3.9 UTICAJ pH i TEMPERATURE NA AKTIVNOST ENZIMA

Aktivnost enzima zavisi od jonskog sastava sredine, a naročito od koncentracije vodonikovih jona. Svaki enzim pokazuje maksimalnu aktivnost kod jedne određene koncentracije vodonikovih jona, koja se zove optimalni pH. Iznad i ispod ove vrednosti, aktivnost se smanjuje. Najveći broj enzima ima optimalni pH u blizini neutralne tačke, ali ima takvih koji su aktivni u kiseloj (npr. pepsin) odnosno u alkalnoj sredini (npr. alkalna fosfataza, arginaza).

Slika 3.11 - pH-optimum pepsina, papaina i tripsina (a) holinesteraze i arginaze (b)

Enzim i (supstrat) Km (mM)

Katalaza

(H2O2) 25

Heksokinaza

(glukoza) 0,15

(fruktoza) 1,5

glutamat-dehidrogenaza

(glutamat) 0,12

(α-ketoglutarat) 2,0

(NH+4) 57

3.10 INHIBITORI

Inhibitori su supstance koje inaktivišu enzime ili smanjuju njihovu sposobnost da katalizuju specifičnu reakciju. Njihovo dejstvo može da bude reverzibilno i ireverzibilno. Reverzibilni inhibitor se obično veže za enzim nekovalentnom vezom u kompleks enzim-inhibitor (EI), koji može da disosuje u slobodni enzim i inhibitor.

Ireverzibilni inhibitor se po pravilu, kovalentno vezuje za enzim bilo na mestu aktivnog centra, ili neko drugo, koje utiče na aktivni centar enzima. Ispitivanjem inhibicije može da se odredi čitav niz osobina jednog enzima, kao što su specifičnost, priroda aktivnog centra itd. Pomoću inhibitora su objašnjeni mnogi metabolički putevi, npr. glikoliza. Štaviše, ćelija pomoću svojih celularnih inhibitora reguliše sve metabolične puteve.

Razlikujemo dve vrste reverzibilne inhibicije: kompetitivnu i nekompetitivnu.

Kompetitivna inhibicija se javlja kod enzima, koji nisu strogo specifični prema supstratu. Za njihov aktivni centar mogu da se vežu supstance koje su hemijski slične supstratu. Na taj način nastaje, pored enzim-supstrat kompleksa i enzim-inhibitor kompleks (E+I↔EI). Klasičan primer kompetitivne inhibicije je inhibicija malonske kiseline na sukcinat-dehidrogenazu. Ovaj enzim katalizuje oksidaciju sukcinata u fumarat, odstranjivanjem dva vodonikova atoma. Malonat liči na sukcinat, ima dva karboksilatna anjona, ali nema vodonikove atome na susednim C-atomima. Pošto i supstrat i inhibitor konkurišu ili kompetiraju za isto mesto na enzimu, ova pojava se zove kompetitivna inhibicija. Veličina kompetitivne inhibicije zavisi od relativnih koncentracija supstrata i inhibitora. Povećanjem koncentracije supstrata (ćilibarne kiseline) može inhibicija da se prevaziđe.

Slika 3.12 - Reakcija sukcinat-dehidrogenaze i formula inhibitora

Nekompetitivna inhibicija zavisi samo od koncentracije inhibitora i ne može da se spreči povećanjem koncentracije supstrata. Inhibitor_se,

dakle, vezuje za mesto na enzimu koje nije specifično za supstrat. Nekompetitivni inhibitori nemaju nikakve strukturne sličnosti sa supstratom. lako se ne vezuju za aktivni centar, oni smanjuju aktivnost enzima menjajući mu, verovatno, konformaciju ili neki deo koji je bitan za njegovu aktivnost. Najpoznatiji nekompetitivni inhibitori su supstance koje se reverzibilno vezuju na —SH grupu cisteina, koja je bitna za katalitičku aktivnost mnogih enzima. Joni teških metala (Cu2

+, Hg2+ i Ag+) reaguju

reverzibilno sa —SH grupom, dajući merkaptide:

Enzim – SH + Ag+ ↔ Enzim – S – Ag + H+

Enzime, koji imaju metalni jon kao kofaktor, inhibiraju reagensi koji vezuju metale. Tako cijanidi grade komplekse sa gvožđem i zbog toga inhibiraju enzime koji imaju ferohem kao prostetičnu grupu. Helirajući agensi (npr. EDTA = etilen-diamin-tetra-acetat) su nekompetitivni inhibitori.

Ireverzibilna inhibicija, kao što samo ime kaže, se javlja kao posledica trajne promene enzimskog molekula ili funkcionalnih grupa bitnih za njegovu aktivnost.

Najpoznatiji ireverzibilni inhibitori su alkilirajući agensi, kao što je jodoacetamid i toksična organofosforna jedinjenja, koja ireverzibilno reaguju, prvi sa —SH grupom, a drugi sa -OH grupom serinskog ostatka:

3.11 ODREĐIVANJE ENZIMSKE AKTIVNOSTI

Količina enzima odnosno njegova aktivnost u nekom biološkom materijalu određuje se merenjem brzine hemijske reakcije, koju dati enzim katalizuje. Merenje enzimske aktivnosti se radi na konstantnoj temperaturi (obično 30°C) i određenom pH. Obično se na vodenom kupatilu inkubira test-sistem koji sadrži:1. pufer, 2. supstrat i to se uzima koncentracija sa kojom se postiže zasićenje enzima, što znači da je potrebno znati Km enzima; 3. kofaktor ili metalne jone, u slučaju kada su potrebni. Za određivanje treba dakle, obezbediti optimalne uslove i odabrati takvu koncentraciju supstrata, da je početna reakcija proporcionalna samo koncentraciji enzima. Test počinje da se meri posle dodatka enzima, odnosno materijala u kome se on nalazi (serum, citozol, homogenat itd.). Tok reakcije se prati merenjem brzine

nastajanja produkta, a ne nestajanje supstrata, jer je to mnogo tačnije. Bolje se registruje rast koncentracije npr. od 0 do 5 mM, nego smanjenje od npr. 200 na 195 mM. Povećanje koncentracije produkta se meri specifičnim hemijskim ili spektrofotometrijskim metodama. Promena koncentracije se registruje u što je moguće kraćim vremenskim intervalima (nekoliko minuta, najduže pola sata).

Količina enzima se definiše prema katalitičkoj aktivnosti. Konvencionalan način izražavanja aktivnosti je u jedinicama (J; engl. U). Ređe se koristila tzv. internacionalna jedinica (IJ) pod kojom se podrazumevala ona količina enzima koja katalizuje promenu 1mM supstrata u minuti, pod standardnim uslovima. Prelaskom na nove jedinice uzeta je kao mera ona količina enzima koja katalizuje promenu 1 mola supstrata u sekundi pod optimalnim uslovima. Nova jedinica se zove katal. 1 katal odgovara 6 x 107 intemacionalnih jedinica.

Specifična aktivnost se definiše u jedinicama na mg proteina. Ona se povećava u toku prečišćavanja enzima. Warburg je predložio da se za jedinicu aktivnosti uzme molarno dejstvo, koje se naziva preobražajni broj. On pokazuje koliko se molova supstrata promeni dejstvom jednog molekula enzima (jednog aktivnog centra). Tako je preobražajni broj enzima karboanhidraze 36 000 000 na minut.

3.12 MULTIENZIMSKI SISTEMI

U intaktnoj ćeliji enzimi deluju zajedno u uzastopnom nizu reakcija, tako da je proizvod prve enzimske reakcije supstrat druge i tako redom. Poznate su tri vrste kompleksne molekulske organizacije multienzimskih sistema. Najjednostavniji je tip kada se individualni enzimi nalaze rastvoreni u citoplazmi u obliku nezavisnih molekulskih jedinki. Ovi enzimi nisu, verovatno, fizički asocirani ni u jednom momentu svoje akcije. U takvim sistemima mali molekuli supstrata difuzijom brzo nalaze svoj put od jednog enzima do drugog.

Slika 3.13 - Tipovi multienzimskih sistema: a) rastvoreni multienzimski sistem u kojem intermedijeri difunduju; b) multienzimski kompleks (intermedijeri se ne

odvajaju od kompleksa): c) enzimski sistem asociran sa membranom.

Drugi multienzimski sistemi su tako organizovani da su pojedini enzimi fizički povezani i zajedno funkcionišu kao enzimski kompleks. Npr. sintetaza masnih kiselina kvasca, koja katalizuje sintezu masnih kiselina iz acetil-koenzima A, sastoji se iz sedam vrsta enzima, čvrsto povezanih u obliku grozda. Ovaj kompleks ne disosuje lako u pojedinačne enzimske molekule, a u stvari odvojeni enzimi nisu ni aktivni. Svakako da povezivanje enzima u kompleks ima svoj biološki smisao, jer se time ograničava razdaljina koju supstrat treba da pređe u toku niza reakcija. U stvari u sistemu sintetaze masnih kiselina supstrati nikad ne napuštaju kompleks.

Najorganizovaniji je treći tip enzimskih sistema, koji su asocirani u velikim supramolekulskim strukturama, kao što su membrane ili ribosomi. Tako su npr. u lancu respiratornih enzima molekuli pojedinih enzima vezani za unutrašnju membranu mitohondrija i u stvari obrazuju deo njene strukture. Ukoliko je enzimski sistem kompleksniji, utoliko je verovatnije da je ugrađen u neku organelu ili drugu intracelularnu strukturu.

Ispitivanje kinetike multienzimskih sistema mnogo je složenije nego kinetike prostih enzima. Svaki član multienzimskog sistema ima karakterističan Km za svoj supstrat i kofaktor. Brzina pojedinih reakcija

određena je stacionarnom koncentracijom svakog intermedijera u nizu, kao i količinom svakog enzima u reakcionom lancu. Obično jedna reakcija u nizu određuje brzinu celokupnog kompleksa, jer je ili koncentracija tog enzima ili njegovog supstrata ona koja ograničava brzinu sistema.

3.13 REGULATORNI ILI ALOSTERNI ENZIMI

Najkarakterističnija osobina multienzimskih sistema je da sami regulišu brzinu reakcije celog niza. U mnogim takvim sistemima prvu reakciju u nizu inhibira krajnji proizvod. Ovaj prvi enzim u nizu se naziva regulatorni ili alosterni enzim, a krajnji proizvod koji utiče na enzim, efektor ili modulator.

Da bi ovaj mehanizam samoregulacije dobro objasnili, pretpostavimo da u ćeliji teče sinteza produkta P u nizu reakcija:

Svaki stepen ovog niza katalizuje cdgovarajući enzim (E1, E2 itd.) Nađeno je da su obično energetski uslovi niza reakcija takvi, da ona teče samo s leva nadesno, jer su neki stepeni ireverzibilni i zbog toga se ukupan položaj ravnoteže ne dostiže. Ako su svi potrebni kofaktori prisutni i svi enzimi niza aktivni, produkt P će se sintetizovati sve dok ima početne supstance A. Kada ćeliji nisu potrebne velike količine produkta P, da bi podesila njegovu sintezu svojim potrebama, ona koristi genijalan mehanizam povratnog sprega. On funkcioniše tako što produkt P inhibira jedan od enzima u nizu reakcija, odmah čim njegova koncentracija pređe određenu granicu. Znači da sam produkt automatski usporava sopstvenu sintezu. Inhibicija je reverzibilna, odnosno kada koncentracija produkta P padne, nastali kompleks enzim-produkt (E—P) disosuje, tako da sinteza P može ponova da počne. Produkt obično inhibira enzim na početku niza reakcija, odnosno pre nego što počnu ireverzibilni stepeni. Npr. ako je stepen B ↔ C ireverzibilan i ako bi produkt inhibirao stepen 3, tada bi došlo do nagomilavanja beskorisnog intermedijera C. Međutim, ako umesto toga produkt inhibira prvi stepen, ostajaće polazna supstanca A, koju ćelija može da koristi u druge svrhe.

Na donjoj slici je dat primer kontrole povratnog sprega na nizu reakcija, kojom teče biosinteza citidin-trifosfata (CTP) od asparaginske kiseline i karbamil-fosfata.

Slika 3.14 - Biosinteza citidin-trifosfata (CTP), koju inhibira velika koncentracija samog CTP, dejstvujući na alosterni enzim na početku sinteze

Kao što se vidi na slici krajnji produkt reakcije CTP inhibira prvi enzim (as-paratat-transkarbamilazu), koja je član multienzimskog puta i tako kontroliše svoju sopstvenu sintezu. I ne ulazeći u egzaktne formule ovog niza reakcija, odmah se uočava da nema nikakve hemijske sličnosti između CTP-a i asparaginske kiseline. Prema tome; ovde je mehanizam inhibicije drukčiji od kompetitivne inhibicije, kod koje su supstrat i inhibitor hemijski slična jedinjenja.

Do sada su poznate tri vrste regulatornih enzima. U prvu grupu spadaju takvi, koji su osetljivi na svoj supstrat.

Količina supstrata reguliše (modulira) njihovu brzinu. To su homotropni enzimi. Drugu grupu, heterotropni, reguliše specifično niskomolekulsko jedinjenje, koje nije supstrat. Treću grupu, homotropno-hetero-tropne, regulišu i supstrat i specifični modulator.

Svi do sada poznati regulatorni enzimi su oligomerni proteini, koji se sastoje od više polipeptidnih lanaca. Potvrđeno je da oni mogu da disosuju u više manjih subjedinica. Npr. transkarbamilaza disosuje u osam subjedinica dva tipa. Jedan je aktivan, ali na njega ne deluje CTP, a drugi nije aktivan, ali vezuje CTP. Zbog toga se pretpostavlja da regulatorni enzimi imaju više mesta za vezivanje supstrata, od kojih je

Slika 3.15 - Šematski prikaz dejstva modulatora B na

regulatorni enzim.

najmanje jedno katalitičko. Heterotropni enzimi imaju posebno mesto za vezivanje supstrata, a posebno za vezivanje modulatora, koja se nalaze u raznim subjednicama enzima. Efekat modulatora se pripisuje promeni konformacije enzima, zbog koje dolazi do promene njegove katalitičke aktivnosti. Pojednostavljena šema ovog kontrolnog mehanizma data je na slici 3.15.

3.14 IZOENZIMI

Neki enzimi mogu metodom elektroforeze da se odvoje u više frakcija, od kojih je svaka aktivna. Ova pojava je prvo opažena kod laktat-dehidrogenaze (1957 g) koja redukuje piruvat u laktat. Pokazano je da se svaka frakcija sastoji od četiri peptidna lanca dva tipa u raznim kombinacijama: M4, H4, M3H, M2H2, MH3. Ovakvi različiti multipli oblici jednog enzima nazivaju se izoenzimi. U različitim organima jedne vrste nalaze se različite frakcije ili samo određena frakcija izoenzima. Na slici 3.16 je dat elektroferogram izoenzima laktat-dehidrogenaze iz različitih organa belog pacova. Vidi se da se u jetri i mišićima nalazi uglavnom izoenzim M4, a u srčanom mišiću ima najviše izoenzima MH3 i H4.

Izoenzimi predstavljaju u ćeliji još jedan mehanizam regulisanja određenih procesa. Određivanjem Michaelis-ove konstante izoenzima laktat-dehidrogenaze, pokazalo je da, svaki ima svoju odgovarajuću vrednost Km. Izoenzime srčanog mišića (MH3 i H4) inhibira laktat, tako da je nastajanje laktata od piruvata vrlo malo. Na taj način se u srčanom mišiću forsira dobijanje energije od aerobne oksidacije. Obrnuto, izoenzimi skeletnih mišića, koji su energetski zavisni od glikolize, nisu osetljivi na veće koncentracije laktata, što omogućava dobijanje energije iz procesa glikolize.

Slika 3.16 - Elektroforetska slika izoenzima laktat-dehidrogenaze u raznim organima belog pacova.

Pored laktat-dehidrogenaze poznati su izoenzimi:

malatdehidrogenaze, izo-citrat-dehidrogenaze, kreatin-kinaze, glutamat oksalacetat-transaminaze itd.

3.15 FIZIOLOŠKO AKTIVIRANJE ENZIMA

Neki proteolitički enzimi se luče u neaktivnom obliku, da bi se na taj način tkivo žlezde sačuvalo od proteolize. Neaktivni oblik enzima zove se »zimogen«. a preteča enzima »proenzim«. Tako se pepsin luči u formi pepsinogena, tripsin kao tripsinogen, himotripsin kao himotripsinogen.

Utvrđeno je da su kod zimogenih oblika aktivni centri enzima zakriveni jednim oligopeptidom, koji kao maska zaklanja aktivni centar od prisustva supstrata. Hidrolitičkim dejstvom sone kiseline u stomaku ili proteolitičkim uticanjem enzima u tankom crevu (enterokinaza) odvaja se maska oligopeptida i aktiviše enzim. Ovaj tip aktivisanja zove se demaskiranje.

Kod nekih enzima postoji mogućnost i autokatalitičkog aktivisanja, čim se oslobode prve količine enzima. Takav je slučaj kod tripsina, koji razlaže, pod određenim uslovima i sopstvene molekule (autoliza).

3.16 NOMENKLATURA I KLASIFKACIJA ENZIMA

Enzimi koji su među prvima otkriveni, dobijali su trivijalna imena koja su se i danas zadržala, kao npr. emulzin, tripsin, pepsin i dr. Davanje trivijalnih imena sve većem i većem broju enzima dovelo je do

JETRAMIŠIĆIDIJAFRAGMASRCE

BUBREG

konfuzije, tako da je 1883 g. prvu sistematiku pokušao da uvede Duclaux. On je predložio da enzimi dobijaju ime prema supstratu čiju promenu katalizuju, uz dodatak nastavka -aza. Tako je amilaza enzim, koji hidrolizuje skrob (amylum), saharaza hidrolizuje saharozu itd. Posle toga su enzimi dobijali imena prema tipu reakcije, koju katalizuju. Tako su se počele da razlikuju klase enzima, npr. dekarboksilaze, koje cepaju CO2 od karbonskih kiselina, izomeraze, koje katalizuju prelaženje jednog izomera u drugi, dehidrogenaze koje katalizuju oksidaciju gubljenjem vodonika itd. Pokazalo se, međutim, da jedno jedinjenje može da podleže različitim promenama kao supstrat različitih enzima. Zbog toga, a i zbog otkrivanja sve većeg i većeg broja enzima Internacionalna Unija Biohemičara predložila je sistematsku nomenklaturu i sistematizaciju enzima. Za sistematizaciju je uzeta kao osnova krajnja hemijska promena, koju enzim katalizuje. Prema ovom sistemu svi enzimi su klasifikovani u šest glavnih rodova:

1) OKSIDOREDUKTAZE

2) TRANSFERAZE

3) HIDROLAZE

4) LIAZE

5) IZOMERAZE

6) LIGAZE

Svaki od ovih šest rodova je podeljen na klase, prema supstratu koji se menja. Klase se dalje klasifikuju na podklase, prema kofermentu ili prostetičnoj grupi, koja učestvuje u reakciji. I na kraju svaki enzim ima svoj serijski broj prema redu pronalaženja. Ovakav način klasifikacije omogućio je numeričku klasifikaciju enzima i sistematsku nomenklaturu. Prema numeričkoj klasifikaciji svaki enzim je okarakterisan sa četiri broja i ima svoje sistematsko ime. Npr. enzim glicerol-NAD-oksidoreduktaza ima broj EC 1.1.1.6. Prva jedinica znači da enzim katalizuje oksidoredukciju. druga, da se oksiduje alkoholna grupa glicerola, treća da je koenzim NAD, a šestica je serijski broj enzima ovog tipa. Detaljna klasifikacija enzima može se naći u udžbenicima enzimologije.

Pošto su sistematska imena dugačka, za poznatije enzime se još uvek koriste trivijalna imena. Npr. enzim ATP : D-glukozo-6-fosfotransferaza (EC 2.7.1.2) iz čijeg se imena vidi da se odigrava reakcija prenosa fosforil-grupe sa ATP-a na alkoholnu grupu šestog ugljenikovog atoma D-glukoze, ima trivijalno ime glukokinaza.

3.16.1 OKSIDOREDUKTAZE

Oksidoreduktaze su veliki rod enzima, koji katalizuju oksidacije različitih organskih jedinjenja. Oni igraju u metabolizmu važnu ulogu, jer iz oksidacionih procesa živa bića crpe energiju za zadovoljavanje svojih životnih potreba, odnosno samog bitisanja.

Prema vrsti jedinjenja koje se oksiduje, oksidoreduktaze se dele na one koje deluju:

a) na —CH—OH grupu (alkoholnu)

b) na — C=O grupu (karbonilnu- aldehidnu i keto)

c) na —CH = CH— grupu (desaturacija C-C veze)

d) na —CH—NH2 grupu (primarnu amino)

e) na —CH—NH— grupu (sekundarnu amino)

f) na NADH i NADPH

Svi enzimi ovog roda sadrže koenzim ili prostetičnu grupu, koja u toku oksidoredukcije prima ili daje vodonikove atome ili elektrone. Dok je broj enzima ovog roda veliki, samo nekoliko koenzima i prostetičnih grupa sudeluju u oksidativnim procesima. Znači da različiti enzimi imaju iste koenzime.

Pošto kod svake oksidoredukcije dolazi do gubljenja vodonika ili elektrona, svaka klasa oksidoreduktaza deli se prema vrsti akceptora na:

1. oksidoreduktaze kod kojih je akceptor vodonika nikotinamid-adenin dinukleotid (NAD+) i nikotinamid-adenin dinukleotid fosfat (NADP+),

2. oksidoreduktaze kod kojih su akceptori elektrona citohromi i

3. oksidoreduktaze sa molekulskim kiseonikom kao akceptorom vodonika ili elektrona.

Uzmimo kao primer oksidaciju alkohola (alkohol oksidoreduktaze) sa različitim akceptorima. Oksidacija alkohola gubljenjem vodonika, koji preuzima koenzim NAD+ i pri tome se redukuje, teče na sledeći način dejstvom alkohol-dehidro-geneze (EC 1.1.1.1):

CH3CH2OH + NAD+ = CH₃CHO + NADH + H+

Najveći broj bioloških oksidacija pod anaerobnim uslovima ima NAD+ i NADP+ kao akceptor vodonika. Ovaj rod enzima se ranije zvao dehidrogenaze. Najpoznatiji enzimi ove grupe su: laktat-dehidrogenaza, malatdehidrogenaza, NAD -specifična izocitrat-

dehidrogenaza. Prvi učestvuje u procesu glikolize, a druga dva u ciklusu limunske kiseline. Glukozo-6-fosfat dehidrogenaza ili »Zwischenferment« je enzim pentozofosfatnog puta razgradnje glukoze.

Oksidacija alkoholne grupe gubljenjem elektrona, koje preuzimaju citohromi, imamo na primeru oksidacije sekundarne alkoholne grupe mlečne kiseline:

CH3–CHOH–COO¯ + 2 fericitohrom c=CH3–CO–COO¯ + 2 ferocitohrom

Enzim koji katalizuje ovu promenu je laktat-dehidrogenaza kvasca (EC 1.1.2.3). koja se razlikuje od laktat-dehidrogenaze mišićnog tkiva (EC 1.1.1.27), jer je flavo-protein (identičan sa citohromom b₂). Sam proces se odvija u više stepena, što je karakteristično za najveći broj bioloških oksidacija. Opširnije informacije o tome se nalaze u udžbenicima enzimologije.

I na kraju, alkoholna grupa može da se oksiduje direktnom predajom vodonika odnosno elektrona molekulskom kiseoniku. Enzimi čiji je akceptor vodonika kiseonik, poznati su i pod imenom oksidaze. Npr. alkoholna grupa (β-D-glukoze oksiduje se u glukonsku kiselinu (odnosno lakton) u reakciji glukozo oksidaze (EC 1.1.3.9.).

β-D-glukoza + O₂ = glukonska kiselina + H₂O₂

I ovaj proces teče postupno. Naime, prvo prostetična grupa flavin-adenin dinukleotid (FAD) enzima, glukozo oksidaze, preuzima vodonik od glukoze, koji tada predaje kiseoniku:

β -D-glukoza + enzim-FAD=glukonska kiselina + enzim-FADH2

Enzim-FADH2 + O2=enzim-FAD + H2O2

U grupu oksidoreduktaza spadaju i katalaza (EC 1.11.1.6) i peroksidaze (EC 1.11.1.7), koje katalizuju reakcije tipa:

RH2 + H2O2 = R + 2H2O (peroksidaze)

U slučaju kada je R molekulski kiseonik (O₂), onda se odigrava proces raspadanja H2O2. Raspadanje peroksida katalizuje katalaza:

oksidovansusptrat

susptrat

Peroksidaze, dakle, katalizuju oksidacije sa vodonikperoksidom, a katalaza oslobađanje nascentnog kiseonika iz vodonikperoksida.

3.16.2 TRANSFERAZE

Transferaze katalizuju prenošenje funkcionalnih grupa ili celih molekula od supstrata na neki akceptor. Npr. alanin-aminotransferaza, čije je sistematsko ime: L-alanin: 2-ketoglutarat aminotransferaza (EC 2.6.1.2,) katalizuje prenošenje amino grupe od alanina na α-ketoglutarnu kiselinu:

Transferaze su složeni proteini, čije prostetične grupe preuzimaju radikale koji se prenose. Najveći broj prostetičnih grupa ove grupe enzima spadaju u vitamine B grupe ili u sistem adenilnih kiselina.

Prema grupi koja se prenosi, transferaze se dele na:

a. koje prenose grupu koja ima jedan C-atom

(–CH3, –CH2OH, –CHO itd.)

1.) koje prenose aldehidnu ili keto-grupu

2.) koje prenose acilnu grupu (ostatke kiselina)

3.) koje prenose glikozilnu grupu (ostatke monosoharida)

4.) koje prenose fosfatne grupe sa energijom (kinaze)

5.) koje prenose grupe koje imaju sumpora

Bez obzira na veliki značaj svih transferaza, ovde ćemo samo da naglasimo ulogu fosfotransferaza (2.7.). Koenzimi ove grupe enzima su adenilne kiseline (AMP, ADP, ATP), uridilna (UTP) i citidilna kiselina (CTP).

Fosfotransferaze prenose ostatak fosforne kiseline zajedno sa oslobođenom energijom, poznate su pod imenom kinaze. Kadgod se u nekom procesu oslobađa energija, one je prenose, gradeći energetski bogato jedinjenje adenozintrifosfat (ATP). Na taj način se oslobođena energija hvata i čuva, da bi je organizam koristio za svoje potrebe. Tako npr. enzim fosfoglicerat-kinaza (EC 2.7. 2.3) prenosi energiju,

nastalu oksidacijom glicerinaldehid-3-fosfata u 1,3-difbsfoglicerinsku kiselinu, na akceptor adenozindifosfat (ADP):

S druge strane, fosfotransferaze, omogućavaju mnogobrojne endergonske reakcije, koje ne mogu da teku bez dodatka energije. Tako npr. glukoza, kao i sva druga jedinjenja, može da uđe u metabolizam tek pošto se energetski obogati. Dejstvom enzima heksokinaze (EC 2.7. 1.1.) prenosi se energija sa adenozintrifosata (ATP) na glukozu.

3.16.3 HIDROLAZE

Hidrolaze su najbrojniji enzimi. One katalizuju hidrolitičko cepanje različitih jedinjenja. Karakteritsično je da ova grupa enzima ne sadrži koenzime ili prostetične grupe. Međutim, mnoge hidrolaze su aktivne jedino u prisustvu metalnih jona.

Prema tome koja se hemijska veza hidrolizuje, hidrolaze se dele na:

a) Hidrolaze različitih estara (karboksilne, glicerol-estre ili lipaze, tioestara, mono i di-estre fosforne kiseline itd.)

b) Hidrolaze glikozidnih veza

c) Hidrolaze etarskih veza

d) Hidrolaze peptidnih veza i

e) drugih C-N jedinjenja (npr. amida)

f) Hidrolaze anhidrida kiselina

g) Hidrolaze koje u prisustvu vode kidaju vezu između dva ugljenikovaatoma (C—C hidrolaze)

h) Hidrolaze hemijske veze ugljenika i halogena i

i)Hidrolaze hemijske veze fosfora i azota

Biološka uloga hidrolaza sastoji se u tome, što pripremaju hranu za apsorpciju u stomaku i crevima. Tako se belančevine hidrolizuju pod dejstvom proteolitičkih enzima (pepsin, tripsin, himotripsin) do aminokiselina, jer samo tako mogu da uđu u krvotok. Polisaharidi (skrob i glikogen) i oligosaharidi hidrolizuju se u toku varenja do monosaharida, da bi mogli dalje da se metabolišu u jetri i ostalom tkivu.

3.16.4 LIAZE

Liaze katalizuju cepanje različitih hemijskih veza bez prisustva vode. Na primer, pod dejstvom aldolaze cepa se veza između trećeg i četvrtog ugljenikovog atoma u fruktozo-l, 6-difosfatu i nastaju dve trioze (Lohmann-ovi estri).

Slično dejstvuju i dekarboksilaze, koje cepaju veze između dva ugljenikova atoma (C—C veze) u aldehidnim, keto aminokiselinama. Na pr. enzim kvasca, piruvat dekarboksilaza, cepa pirogrožđaru kiselinu na aldehid i CO2:

Prema vrsti hemijskih veza, čije cepanje katalizuju, liaze se dela na:

a) Ugljenik-ugljenik (—C = C—) liaze

b) Ugljenik-kiseonik (—C = O) liaze

c) Ugljenik-azot (—C=N-) liaze

d) Ugljenik-sumpor (—C=S) liaze

3.16.5 IZOMERAZE

Izomeraze su enzimi koji katalizuju prelaz jednog izomernog jedinjenja u drugo. Npr. glukozofosfat-izomeraza (EC 5.3.1.9) katalizuje prelaz glukozo-6-fosfata u fruktozo-6-fosfat u procesu glikolize:

Maleat izomeraza utiče na ravnotežu između dva cis-trans izomera:

Izmomeraze se dele na:

1) Racemaze i epimeraze

2) Cis-trans izomeraze

3) Intramolekulske oksidoreduktaze

4) Intramolekulske transferaze

5) Intramolekulske liaze

6) Druge izomeraze.

3.16.6 LIGAZE

Ligaze ili sintetaze su enzimi koji katalizuju neku sintezu. Pošto su sintetske reakcije endergonskog karaktera, ova grupa enzima deluje samo u prisustvu nekog davaoca energije, najčešće adenozin-trifosfata.

Npr. u sintezi viših masnih kiselina, koju katalizije acetil-koenzim A-karboksilaza, prvi međuproizvod malonil-koenzitn A, nastaje u prisustvu ATP-a:

Ovaj enzim ima kao prostetičnu grupu vitamin B-grupe,

Prema tome koja vrsta nove veze nastaje, ligaze se dele na:

(—C = O) ligaze

(—C = C—) ligaze

(—C=S) ligaze

(—C=N-) ligaze

UKRATKO:

1) Enzimi su biološki katalizatori, a po hemijskoj strukturi to su proteini. Kao katalizatori pospešuju hemijske reakcije, a da se pri tome sami ne troše i ne menjaju.

2) Mehanizam kojim enzim smanjuje potrebnu aktivacionu energiju Koshland hipotetički tumači time da se spajanjem enzima sa supstratom menja i supstrat i konformacija enzima. Deo enzimske proteinske molekule na koji se veže supstrat naziva se aktivni centar enzima. Vezivanjem supstrata za aktivni centar pomoću kontaktnih amino kiselina stvara se kompleks emzim-suptrat (ES) i delovanjem katalitičkih amino kiselina, kompleks enzim-produkt (EP), koji se dalje raspada na produkt (P) i enzim (E), te se tako smanjuje potrebna energija aktivacije i omogućava reakcija.

3) Prema Michaelis-Mentenovoj teoriji koja tumaču mehanizam enzimske reakcije, brzina cele enzimske reakcije zavisi od: 1) brzine stvaranja kompleksa enzim supstrat i 2) brzine stvaranja produkta uz razlaganje kompleksa ES. U matematičkoj interpretaciji enzimske reakcije koju su izveli Michaelis i Mentenova dobija se jednačina u kojoj centralno mesto ima Michaelis-ova konstanta Km. Ona je jednaka koncentraciji supstrata pri kojoj je brzina reakcije jednaka polovini maksimalne brzine. Km je karakteristična za svaki enzim i supstrat, a grafički se može odrediti prema Lineweaver-Burku.

4) Brzina enzimske reakcije zavisi od uslova pod kojima se ta reakcija odvija. Faktori koji utiču na brzinu enzimske reakcije su: pH, koncentracija i jonska snaga pufera, koncentracija supstrata, prisutnost koenzima, aktivatora i inhibitora.

5) Inhibicija enzima može biti reverzibilna i ireverzibilna. Ireverzibilnu inhibiciju ili „trovanje“ enzima izazivaju mnogi teški metali (živa, bakar i dr.), neki katjoni i anjoni (pesticidi i otrovi na bazi organofosfata i dr.). Reverzibilna inhibicija posledica je delovanja inhibitora na kinetiku reakcije između enzima i supstrata, a može biti kompetitivna, nekompetitivna i akompetitivna.

6) Enzimima je često potrebno da se aktiviraju da bi imali puno dejstvo. Najčešći aktivatori enzima su razni joni na primer: Cl¯, Co²+, Mn²+, Mg²+, Zn²+ itd.

7) Temperatura i pH enzimskih reakcija su u fiziološkim okvirima jer su enzimi proteini i denaturisali bi se i na visokim i na niskim temperaturama i pH vrednostima.

8) Nazivi enzima su nastali bez nekih pravila i obično su ih davali sami pronalazači većinom prema supstratu na koji enzim deluje uz sufiks aza (lipaza, peptidaza itd.). Drugi su enzimi imali trivijalna imena npr. tripsin. Sve je to unosilo zbrku pa je enzimska komisija IUB-a donela preporuku o nomenklaturi i klasifikaciji enzima.

9) Prema toj klasifikaciji postoji 6 rodova enzima: a) oksidoreduktaze, b) transferaze, c) hidrolaze, d) liaze, e) izomeraze i f) ligaze/sintetaze.

10) Prema rasprostranjenosti u organizmu enzimi se mogu podeliti u tri grupe:

11) Organski nespecifični enzimi. To su enzimi koji sudeluju u procesima u kojima se stvara energija. To su enzimi glikolize, oksidacije glukoze i disanja;

12) Organospecifični enzimi. To su enzimi koji se nalaze samo u određenim organima i sudeluju u metaboličkim procesima koji se odvijaju samo u određenim organima. ( amilaza, lipaza itd.);

13) Organospecifični izoenzimi. Pojedini izoenzimi nekog enzima su specifični za određene organe. Tako se nrp. LDH u miokardu nalazi u obliku LDH1 i nešto LDH2; dok je u jetri LDH5 i nešto LDH4.

14) Metode za određivanje enzima u osnovi se temelje na istom principu. Enzim deluje na svoj specifični supstrat i nakon toga se meri koncentracija nastalog proizvoda reakcije, ili smanjenje koncentracije supstrata.

15) Određivanje enzimske aktivnosti koristi se danas u dijagnostici brojnih patoloških stanja i poremećaja:

16) Bolesti koje zbog potpunog nedostatka ili deficita nekog enzima, menjaju normalni tok metaboličkih procesa. Ovu grupu bolesti nazivamo urođene greške metabolizma. To su nasledne genetski uslovljene bolesti;

17) Stečeni deficit enzima, obično zbog oštećenja funkcije organa, npr. smanjenje sinteze enzima u jetri;

18) Razna patoločka stanja u kojima dolazi do oštećenja, lezija ćelija koje sadrže enzime, pa enzimi izlaze u ekstracelularnu tečnost, što dovodi do povećane aktivnosti tih enzima.

UGLJENI HIDRATI I NJIHOV METABOLIZAM

4.1 UGLJENI HIDRATI

Ugljenihidrati su pored proteina, masti i vitamina neophodni sastojci hrane. Nalaze se u znatnim količinama u biljnom i životinjskom organizmu, gde imaju različite i karakteristične funkcije. U ugljene hidrate se ubrajaju supstance koje se po svojim fizičkim osobinama jako razlikuju. Ova jedinjenja nastaju u zelenim biljkama od ugljen dioksida i vode, biosintezom, koja direktno iskorišćava sunčevu svetlosnu energiju. Ovu biosintezu zovemo fotosinteza. Ona je od prvorazrednog značaja za održavanje života na zemlji. Fotosinteza se može predstaviti sledećom jednačinom:

6CO2+12H2O→sunčeva energija→C6H12O6+6O2+6H2O

Iz gornje jednačine se vidi:

1) Da je to jedan oksido redukcioni proces, gde je voda davalac vodonika i

2) Da je količina CO2, koju apsorbuju zelene biljke, jednaka molekulskom ekvivalentu kiseonika, koji one izdišu.

Za asimilaciju jednog mola ugljendioksida potrebno je oko 473 J. Ovu energiju apsorbuje biljka posredstvom hlorofila od sunčeve svetlosti. Svetlosna energija posle komplikovanog niza hemijskih reakcija pretvara se u hemijsku energiju, koja je potebna da iz ugljendioksida i vode nastanu ugljeni hidrati.

U životinjskom organizmu odigrava se proces obrnut fotosintezi i pri njemu se oslobađa energija dobijena od sunčeve svetlosti.

Na ovaj način stvoreni ugljeni hidrati u biljci, podloga su za izgradnju svih ostalih sastojaka a preostali, nepotrošeni deo odlaže se kao rezervna hrana. Animalni organizmi se hrane ovim biljnim rezervnim ugljenim hidratima i glavni deo svoje životne energije dobijaju metaboličkom oksidacijom ugljenih hidrata u ugljendioksid i vodu.

Životinje tako deponuju suvišne količine glukoze u jetri i mišićima u obliku glikogena, koji se uprkos svojoj velikoj molekulskoj težini lako hidrolizuje ponovo u glukozu i služi životinji kao vrlo pristupačan izvor i rezerva energije.

Ugljeni hidrati (šećeri, saharidi) su organska jedinjenja izgrađena od tri biogena elementa: ugljenika, vodonika i kiseonika. Odnos ovih elemenata je (1 : 2 : 1) tako da je opšta formula ugljenih hidrata Cn(H2O)n. Zbog toga se ranije mislilo da su ugljeni hidrati - hidrati ugljenika (otuda im i ime). Međutim njihova empirijska formula nije karakteristična samo za ovu grupu jedinjenja, već istu formula imaju i neka hemijska jedinjenja, čije hemijske osobine ne odgovaraju

osobinama ugljenih hidrata, kao što su na primer formaldehid, sirćetna kiselina i mlečna kiselina. S druge strane neka jedinjenja, koja su nesumljivi ugljeni hidrati po svom hemijskom ponašanju, ne odgovaraju gornjoj definiciji. Zbog toga je jednom definicijom teško obuhvatiti pojam ugljenih hidrata, no najbolje ih je okarakterisati kao primarne oksidacione proizvode -aldehide i ketone - polivalentnih alkohola.

Ugljene hidrate delimo na tri osnovne grupe, prema tome kako se ponašaju pri hidrolizi :

1. monosaharide,

2. oligosaharide i

3. polisaharide

Monosaharidi se hidrolizom ne cepaju u prostija analogno građena jedinjenja, koja imaju karakter ugljenih hidrata. Oligosaharidi su ugljeni hidrati koji su izgrađeni najviše od šest molekula monosaharida. Oni se hidrolizom cepaju na monosaharide iz kojih su izgrađeni. Ugljeni hidrati čiji su molekuli izgrađeni od više od šest monosaharida zovu se polisaharidi. Imena većine ugljenih hidrata imaju nastavak -oza, a koren reči ukazuje na poreklo (laktoza) ili neku drugu osobinu (levuloza, jer skreće ravan polarizovane svetlosti na levo).

Monosaharidi su najprostiji šećeri. Oni mogu u svom molekulu da imaju aldehidnu grupu, tada govorimo o aldozama ili keto grupu, tada govorimo o ketozama. Po broju kiseonikovih atoma oni se dele na: bioze, trioze, tetroze, pentoze, heksoze itd. Broj kiseonikovih atoma može, a ne mora da bude jednak broju ugljenikovih atoma. Od monosaharida, najvažnije su heksoze, a među njima naročito glukoza, kao predstavnik aldoza, i fruktoza kao predstavnik ketoza.

Monosharidi imaju dva izomerna oblika. Oni koji imaju OH-grupu do zadnjeg C-atoma (CH2OH) s desne strane označavaju se kao D-izomer, a oni kojima je ona s leve strane L-izomer. U organizmu se nalaze većinom šećeri D-reda. Dok oznake D i L označavaju konfiguraciju, optička aktivnost koju šećeri poseduju označava se sa + za desno, a sa – za levo skretanje šećera.

U alkalnoj sredini aldoze, na primer glukoza, prelaze u enolni oblik. U obliku enolnog anjona glukoza deluje kao jak reducens, i to svojstvo se koristi za dokazivanje i određivanje u laboratoriji.

Unutar šećera aldehidna i hidroksilna grupa međusobno reaguju i stvaraju poluacetate. Time se stvaraju petočlani ili šestočlani prstenovi tipa furana ili pirana. U slučaju glukoze reaguju aldehidna grupa na C-1 i hidroksilna grupa na C-5 atomu. Prema položaju OH-grupe, na C-1 atomu, ako je ova desno, nastaje α-glukoza, odnosno ako je OH-grupa levo, nastaje β- glukoza.

α i β- oblici skreću različito ravnu polarizovane svetlosti. α-D-glukoza ima specifičnu rotaciju {α}25 + 113°, a β-D-glukoza + 19,7°. Međutim, u vodenom rastvoru obe su forme u ekvilibrijumu i glukoza ima ugao skretanja polarizovanog svetla + 52,5°. To svojstvo glukoze da skreće polarizovano svetlo koristi se za polarimetrijsko određivanje koncentracije glukoze, na primer, u urinu. Glukoza je biološki najvažniji šečer i po tome što većina heksoza u toku metabolizma prelazi u glukozu.

4.1.1 MONOSAHARIDI

4.1.1.1 Hemijske osobine monosaharida

Hemijska reaktivnost monosaharida odraz je prisustva većeg broja OH grupa u njihovom molekulu. Kao polihidroksilna jedinjenja monosaharidi se rastvaraju u vodi, slatkog su ukusa, a ne rastvaraju se u organskim rastvaračima i mastima. Oni ne pokazuju sve karakteristične reakcije aldehida i ketona, jer u rastvoru praktično nema aldehidnog oblika šećera, već samo poluacetalnog (α i β).

Estri monosaharida: Karakteristična osobina alkoholne grupe da sa kiselinama daje estre javlja se i kod hidroksilnih grupa šećera. U metabolizmu monosaharida najvažniju ulogu igraju estri sa fosfornom kiselinom. Estri monosaharida sa sirćetnom ili benzoevom kiselinom koriste se u organskoj hemiji kao polazne supstance za sintezu različitih monosaharida.

Vezivanjem za trobaznu fosfornu kiselinu šećeri postaju elektroliti (kiseline) i time iz osnova menjaju svoje fizičko-hemijske osobine u pogledu pokretljivosti u električnom polju, permeabilnosti i reaktivnosti. Fosforni estri šećera su otkriveni u kvascu i mišiću kao polazni međuproizvodi prometa šećera.

Monosaharidi ulaze u anaerobnu metaboličnu razgradnju, tek kada se dejstvom odgovarajućeg enzima (heksokinaze) glukoza fosforiliše u glukozo-6-fosfat.

Imena fosfornih estara šećera grade se tako što se imenu monosaharida doda broj hidroksilne grupe koja je esterifikovana i reč fosfat. Tako na primer glukozo-6-fosfat označava estar glukoze čija je hidroksilna grupa na šestom ugljenikovom atomu esterifikovana fosfornom kiselinom. Umesto fosforna kiselina nekog šećera često se kaže jednostavno fosfat, što znači fosforni estar šećera, analogno kao što amilbutirat znači da se radi o estru buterne kiseline. Prema tome, nazivi kao glukozo-1-fosforna kiselina i glukozo-1-fosfat su sinonimi. Takođe se u formulama pojednostavljuje pisanje ostataka fosforne kiseline simbolom (P).

Etri monosaharida: Hidroksilne grupe šećera daju etre sa alkoholima ili nekim drugim jedinjenjima koja imaju alkoholnu funkciju. U monosaharidu

se najlakše eterifikuje poluacetalna hidroksilna grupa, odnosno ona koja je nastala na prvom ugljenikovom atomu aldoza. Etri poluacetalne grupe monosaharida zovu se glikozidi. O glikozidima će kasnije biti opširnije govora, pošto je nastajanje glikozidne veze od prvenstvene važnosti u hemiji oligo i polisaharida.

Derivati karbonilne grupe šećera: Mnoge reakcije koje su karakteristične za aldehide i ketone ne daju monosaharidi, jer u njihovom rastvoru ima malo aldehidnog oblika (0,01%). Obrazovanjem oksima ili osazona monosaharida može se aldehidni oblik izdvojiti.

Oksimi monosaharida: Šećeri kao aldehidi i ketoni višehidroksilnih alkohola daju s hidroksilaminom jedinjenja, koja se zovu oksimi. Oksimi šećera su značajniji po tome što se preko njih izvodi skraćivanje lanca ugljenikovih atoma i na taj način dobijaju šećeri s manjim brojem ugljenikovih atoma. Dejstvom hidroksilamina na aldoze nastaju aldoksimi.

Fenilhidrazoni i osazoni monosaharida:Šećeri teško kristališu, naročito kada nisu čisti, i izdvajaju se u obliku sirupa. Osim toga većina šećera se raspada već ispod tačke topljenja. Zato je za identifikaciju i izolovanje šećera od naročite važnosti dobijanje fenilhidrazona i osazona, koji dobro kristališu. Naročito osazoni pojedinih šećera imaju oštru tačku topljenja i karakterističan oblik kristala, na osnovu kojih mogu lako da se razlikuju pojedini šećeri. Ovaj reagens je u hemiju šećera uveo Emil Fischer 1884 godine.

Fenilhidrazoni i osazoni nastaju dejstvom fenilhidrazina na šećere. Fenilhidrazin je poznati reagens za karbonilnu grupu. Reakcija fenilhidrazina sa šećerima vršila se na neočekivani način, jer su osazoni sadržavali dva ostatka fenilhidrazina, a u reakciji je potrošeno tri mola fenilhidrazina na jedan mol heksoze. Reakcija teče već na sobnoj temperaturi:

Stvaranjem osazona nestaju prostorne razlike na prvom i drugom ugljenikovom atomu, zbog čega epimerni šećeri daju identične osazone kao npr. glukoza, manoza i fruktoza. Primarni proizvod s fenilhidrazinom (hidrazon) kod gornja tri šećera je različit.

Dejstvo kiselina na monosaharide: Zagrevanjem rastvora pentoza i heksoza s jakim kiselinama (npr. HCl) odvajaju se tri mola vode. Od pentoza tako nastaje furfural, a od heksoza oksimetilfurfural. Ovaj poslednji prima vodu i raspada se na levulinsku i mravlju kiselinu. Furfural i oksimetilfurfural (OMF), koji nastaju dejstvom jakih kiselina na šećere, mogu lako da se kondenzuju s različitim fenolima u boje. Reakcija služi za dokazivanje pentoza (Tollens-ove reakcije s floroglucinolom i orcinolom). Za dokazivanje fruktoze poznata je reakcija po Seliwanqff-us rezorcinolom, a za dokazivanje glukoze Molisch-eva sa α-naftolom.

Dejstvo baza na monosaharide: Slabe alkalije izazivaju sasvim drugačije promene kod šećera, nego što smo ih dosad upoznali. Kod aldoza i ketoza dolazi do intramolekularnog premeštanja H i OH grupe i karbonilne na prvom i drugom ugljenikovom atomu. Premeštanje ide preko jednog međuproizvoda, koji do danas nije mogao da se izoluje, a posle uspostavljanja ravnoteže, nalaze se u rastvoru stereoizomeri i odgovarajuća ketoza. Ovakva promena na prva dva ugljenikova atoma zove se epimerizacija, a šećeri koji se konfigurativno razlikuju samo na drugom ugljenikovom atomu. zovu se epimerni šećeri.

Ostavimo li u alkalnom rastvoru bilo koji od tri moguća epimerna šećera, pojaviće se posle izvesnog vremena i ostali epimeri. Reakcija ne teče brzo, pa je potrebno povisiti temperaturu.

Dejstvom jakih alkalija šećeri se raspadaju i među proizvodima raspadanja pojavljuje se mlečna kiselina.

Oksidacija monosaharida: Blagim oksidacionim sredstvima prvo aldehidna grupa prelazi u karboksilnu, a poluacetalni oblik gubi dva vodonikova atoma dajući lakton odgovarajuće kiseline, a u alkalnoj sredini so te kiseline. Pod biološkim uslovima može da se sačuva aldehidna grupa, a krajnja alkoholna grupa da se oksidiše u karboksilnu. U oba slučaja dobijamo monokarbonske kiseline: prve su onske, a druge uronske. Pri oksidaciji i aldehidne i poslednje alkoholne grupe dobijaju se dvobazne dikarbonske ili šećerne kiseline. Na primer:

Ostale važnije heksoze daju sledeće dikarbonske kiseline: galaktoza — sluznu, manoza — manošećernu kiselinu.

Dejstvom jakih oksidacionih sredstava na aldoze cepa se lanac ugljenikovih atoma, a kod ketoza je to slučaj pri svakoj oksidaciji.

U gore navedenim oksidacionim reakcijama šećera dolaze do izraza jake redukcione osobine aldehidne, keto i alkoholnih grupa. Čitava analitika šećera zasniva se na ovim reakcijama. Treba da se naglasi da kod svih oksido-redukcionih reakcija šećera sudeluju osim karbonilne i druge redukcione grupe. Iz tog razloga sve ovakve metode za kvantitativno određivanje šećera su empirijske i ne mogu se prikazati hemijskim jednačinama. Kao oksidaciona sredstva služe alkalni rastvori metalnih jona (Cu, Bi), a pozitivna reakcija se pri dokazivanju vidi po promeni boje. Najpoznatije su sledeće reakcije: Fehling-ov, kod koje se dejstvom šećera vrši redukcija kupri-kalijum-natrijum-tartarata s izlučivanjem kupro-hidroksida, koji spontano prelazi u crveni kupro-oksid. Pri oksidaciji glukoze Fehling-ovim rastvorom oksidacija se vrši duž niza (počev od aldehidne grupe), postupnim aktiviranjem položaja, zbog čega se troši više ekvivalenata reagensa. Zato se u praksi koriste empirijske tabele za kvantitativno određivanje šećera. Za dokazivanje šećera u mokraći koristi se Benedict-ov reagens, jer ne oksiduje urate i kreatinin, zatim Borfoed-ov, kojim se može dokazati 0,5 mg glukoze u prisustvu četrdeset puta veće količine laktoze ili maltoze i šesdeset puta veće koncentracije saharoze.

Redukcija monosaharida: KarboniIna grupa aldoza i ketoza može da se redukuje u alkoholnu, pri čemu nastaju polialkoholi.

Glukoza daje redukcijom sorbitol, manoza manitol, a sve ketoze ekvimolekularne smese steoizomernih polialkohola.

Cijanhidrinska sinteza: Poznata reakcija dobijanja oksikiselina od velike je važnosti za hemiju šećera, jer se na taj način mogu od šećera s manjim brojem ugljenikovih atoma da dobiju šećeri sa većim brojem ugljenikovih atoma.

Aldoze dejstvom HCN prelaze u cijanhidrine, koji imaju jedan ugljenikov atom više u molekulu. Tako aldopentoza (arabinoza) u reakciji sa HCN daje smesu od dva cijanhidrina, jer se nastajanjem sekundarne alkoholne grupe na drugom ugljenikovom atomu formira novi centar asimetrije. Nastaju dva prostorna izomera: glukonitril i manonitril. Ova dva nitrila saponifikacijom daju smesu glukonske i manonske kiseline i konačno redukcijom svojih laktona ekvimolarnu smesu glukoze i manoze.

Po sličnoj reakcionoj šemi može se od heksoze dobiti heptoza, od heptoze oktoza, itd.

4.1.1.2 Podela monosaharida prema broju ugljenikovih atoma

Bioze. - Šećer sa dva ugljenikova atoma nije nađen u prirodi. Glikoaldehid, ili glikoloza (CHO-CH2OH) je laboratorijski proizvod. Sigurno je, međutim, da jedinke s dva ugljenikova atoma postoje kao važni međuproizvodi metabolizma u oksidacionom razlaganju glukoze i fotosintezi.

Trioze. - Glicerinaldehid i dioksiaceton, takođe, nisu dosad nađeni kao slobodni sastojci biološkog materijala. Fosforni estri trioza, glicerinaldehid-fosfat i dioksiaceton-fosfat, poznati su pod imenom Lohmann-ovi estri. Nastaju tokom anaerobnog razlaganja glukoze.

Tetroze. - Sve četiri moguće aldotetroze nisu biološki važne. To su dva para enantiomera L- i D-treoza i L- i D-eritroza. Dobijene su samo sintetičkim putem.

Biološki najvažnija tetroza je D(—)-dezoksiriboza ili 2-ribodesoza, koja je prvi put nađena u timonukleinskoj kiselini, izolovanoj iz grudne žljezde. Ona je derivat riboze.

Pentoze. - Slobodne pentoze nalazimo jedino povremeno u mokraći. Vezanih ima u biljnom materijalu u većim količinama u obliku polisaharida - pentozana. Pentozani prate celulozu kao sastavni deo

biljnog skeleta. Nalaze se i u gumoznim smolama (trešnja, arapska guma) i pektinima.

D-(—)-riboza, odnosno njen fosfatni estar, je nezamenljiva pentoza u čitavom nizu nukleotida (adenilnoj, gvanilnoj, inozinskoj kiselini), kao i u odgovarajućim nukleozidima, koji nastaju od nukleotida odvajanjem fosfata.

Jedan tip nukleinskih kiselina je karakterističan po svom sadržaju riboze, pa su po tome i dobile ime — ribonukleinske kiseline (RNA), po nekima i PNA, jer je riboza jedina pentoza u takvom sastavu. U drugom tipu nukleinskih kiselina nalazi se tetroza 2-dezoksiriboza, pa se po njoj zovu dezoksiribonukleinske kiseline (DNA).

Slobodna riboza se nalazi u piranoznom obliku.

D- i L-arabinoza je šećer koji može služiti kao primer da u prirodi nalazimo levi i desni oblik istog šećera. Nalazi se u većim količinama u polisaharidima, arabanima (arapska guma), sluzima i pektinima. Arabinoza se deset puta teže resorbuje od glukoze. Sisari je ne mogu fosforilisati i zato ne ulaze u njihov metabolizam.

D-ksiloza je pentoza, koja je prilično rasprostranjena u bilju u obliku polimera ksilana.

U pentoze ubrajamo i metilpentoze, koje imaju šest ugljenikovih atoma. To su L-ramnoza, koja ima konfiguraciju L-manoze; digitaloza, šećer iz digitalis glikozida sa strukturom D-fukoze i kinovoza, izolovana iz kininove kore.

Metilpentoze ulaze u metabolizam samo nekih bakterija, npr. paratifusa.

Ribuloza je ketopentoza, čiji su fosfatni estri nađeni kao međuproizvodi fotosinteze i u biološkim prelazima šećera jednih u druge, u tzv. »pentozo-fosfatnom ciklusu«.

Heksoze. - Ovoj grupi pripadaju najvažniji i najpoznatiji prosti šećeri — monosaharidi. Većina polisaharida u biljkama i životinjama daje hidrolizom samo heksoze; tako skrob, glikogen i celuloza daju samo glukozu; inulin — fruktozu; manani i galaktani — manozu i galaktozu. U manjim količinama nalaze se slobodne heksoze: glukoza i fruktoza. Biološki je važna i ketoza L-sorboza, koju sintetišu izvesne bakterije.

D (+ ) Glukoza zove se i grožđani šećer (saccharum uvae), jer se nalazi u grožđu, i dekstroza, jer je desnogira. Poznata je i pod imenom krvni šećer, jer se nalazi u krvi u maloj, ali konstantnoj koncentraciji. U prirodi se nalazi zajedno s fruktozom u medu, slatkom voću, ćelijskom soku, semenkama i korenju.

D-glukoza kristališe s jednim molom vode (monohidrat) ili bez nje (glucosum anhydricum). Topi se na 81°C. Vodeni rastvor glukoze pokazuje mutarotaciju, a posle uspostavljanja ravnoteže specifični ugao

skretanja polarizovane ravni iznosi = +25.7°. Glukoza se u vodi

rastvara vrlo lako, slabije u metanolu i piridinu, a vrlo malo u etanolu.

Glukoza koja nastaje u toku varenja enzimskim cepanjem skroba, prelazi iz tankog creva u krv i deponuje se u jetri i mišićima u obliku polisaharida glikogena. I mikroorganizmi deponuju glukozu u obliku glikogena (npr. kvasac).

Glukoza je biološki najvažniji šećer i po tome što većina heksoza u toku metabolizma prelazi u glukozu. Anaerobno razlaganje glukoze, fermentacija ili glikoliza, u ljudskom i životinjskom organizmu identična je s alkoholnim vrenjem kvasca (Saharomiceta), samo se razlikuje po krajnjem proizvodu.

U mišiću nastaje L-mlečna kiselina, a različiti sojevi daju razne konačne proizvode: alkohol, sirćetnu kiselinu, buternu kiselinu; pri mlečno-kiselom vrenju (Bacillus acidi lactici) nastaje D-mlečna kiselina.

Od fosfornih estara glukoze najvažniji su glukozo-1-fosfat (Corijev estar) i

glukozo-6-fosfat (Robison-ov estar).

α- D- GLUKOZA α- D- GLUKOZO -1-FOSFAT GLUKOZO-6-FOSFAT

Glukozo-1-fosfat (G-l-P) nastaje fosforolitičkim razlaganjem skroba i pri razlaganju glikogena u jetri i mišiću (glikogenoliza).

Glukozo-6-fosfat nastaje iz glukoze i adenozintrifosfata (ATP) uz katalitičko dejstvo enzima heksokinaze. Može da nastane i iz glukozo-1-fosfata preko međuprodukta glukozo-l,6-difosfata.

Oksidacijom aldehidne grupe nastaje iz glukoze glukonska kiselina iz koje se dekarboksilacijom i oksidacijom dobija arabinoza. Oksidacijom primarne alkoholne grupe na šestom ugljenikovom atomu dobija se glukuronska kiselina, a totalnom oksidacijom obeju krajnjih grupa u molekulu glukoze nastaje dvobazna šećerna kiselina. Redukcijom prelazi glukoza u šestovalentni alkohol D-sorbitol.

Glukuronska kiselina nastaje u organizmu enzimskom oksidacijom glukoze. Poluacetalni hidroksil u glukuronskoj kiselini može da se veže s nekim alkoholom ili kiselinom; prema tome razlikujemo glikozidne (etarske) i estarske glukuronide. Prirodni glukuronidi su β-oblika. U obliku glukuronida izlučuju se iz organizma štetne supstance, koje nastaju od hrane tokom varenja, degradirani hormoni, lekovi i otrovi (npr. morfin). Ova pojava zove se detoksikacija ili zaštitna sinteza. Vezivanje na glukuronsku kiselinu je samo jedan tip detoksikacije.

D (+) Manoza je epimerna s glukozom tj. razlikuje se samo po položaju -OH grupe na drugom ugljenikovom atomu.

Manoza se ne nalazi slobodna u prirodi, već samo u polisaharidima (manan) i u nekim glikoproteinima (ovomukoid). Manoza se topi na

133°C, a specifični ugao skretanja ima = +14.5°

Kao epimer glukoze i fruktoze daje isti osazon, ali se može razlikovati po fenil-hidrazonu i hromatografski.

D (+) Galaktoza zajedno s glukozom gradi disaharid laktozu ili mlečni šećer; čitav niz cerebrozida i galaktolipida ima galaktozu glikozidno vezanu za jedan aminoalkohol (sfingol). U biljkama se nalazi u obliku polisaharida galaktana. Agar-agar, koji od galaktoze.

Galaktoza lako kristališe iz vodenog rastvora; tačka topljenja bezvodne

galaktoze je 171°C, a specifični ugao skretanja =+80°. Galaktoza

daje oksidacijom sluznu kiselinu (dikarbonska kiselina) koja je optički

inaktivna (unutrašnja kompenzacija) i teško se rastvara u vodi, što se koristi za identifikaciju galaktoze.

D (—) Fruktoza (levuloza ili voćni šećer) nalazi se u raznom voću, po čemu je i dobila ime. U voću se pored fruktoze nalazi vrlo često i glukoza, a i drugi šećeri. Fruktoza je najslađi šećer, zato je med tako sladak. U medu se nalazi ekvimolekulska smeša fruktoze i glukoze. Polisaharid inulin je polimer fruktoze (fruktozan).

Po svojoj građi prirodna fruktoza je desne konfiguracije (D), zato pišemo u njenoj formuli -OH grupu na petom ugljenikovom atomu na desnoj

strani. No ona skreće ravan polarizovane svetlosti nalevo = - 93°,

po čemu je i dobila ime levuloza. Topi se na 103°C. Fruktoza redukuje isto kao i glukoza. Kvasac lako previre fruktozu.

U disaharidima fruktoza je obično u furanoznom obliku. Fruktoza sa glukozom izgrađuje disaharid saharozu, koja se nalazi gotovo u svim biljkama u manjoj količini, a u kultivisanim biljkama šećernoj repi i šećernoj trsci — i to do 10%. U nekim organima životinjskog organizma (mozak, testis) ima slobodne fruktoze. U semenskoj tečnosti (ejakulatu) fruktoza služi spermatozoidima kao izvor energije za održavanje njihove pokretljivosti. Dijabetičari podnose bolje fruktozu od glukoze.

Dva fosforna estra fruktoze: fruktozo-6-fosfat (Neuberg-ov estar) i fruktozo-1,6-difosfat (Harden-Young-ov estar) su biohemijski najvažniji međuproizvodi anaerobnog razlaganja glukoze.

Heptoze. — Od monosaharida sa sedam ugljenikovih atoma treba spomenuti ketozu sedoheptulozu, čiji fosfatni estar nastaje iz ribozo-5-fosfata i aktivnog glikolaldehida.

4.1.2 AMINOŠEĆERI

Na aminošećere prvi put se naišlo ispitujući hitin, skeletnu supstancu koja se nalazi u oklopu rakova i drugih beskičmenjaka. Kiselom hidrolizom hitina dobija se glukozamin, jedinjenje kod kojeg je -OH grupa glukoze na drugom ugljenikovom atomu zamenjena aminogrupom.

D-Glukozamin zove se po svom poreklu i hitozamin. Nalazi se u životinjskoj sluzi (pljuvački, želudačnom soku, žuči, crevnoj sluzokoži) zajedno s glukuronskom kiselinom, kao sastavni deo glikoproteina, zatim u glikolipidima, u supstancama krvnih grupa i drugim komplikovano građenim polisaharidima. Amino-grupa glukozamina je obično acetilirana.

Glukozamin redukuje Fehling-ov reagens kao i glukoza i daje isti osazon; kvasac ne previre glukozamin.

N-metil derivat L-glukozamina nalazi se u streptomicinu.

D-Galaktozamin je strukturno sličan galaktozi, jedino se na drugom ugljenikovom atomu nalazi amino-grupa mesto -OH grupe. I amino-grupa galaktozamina je acetilovana (acetil—galaktozamin).

D-galaktozamin se dobija hidrolizom polisaharida hondroitinsumporne kiseline; po tome se i zove hondrozamin.

Neuraminska kiselina je aminošećer, nešto komplikovanije strukture, koji je nađen kao sastavni deo glikolipida ćelijskih membrana (gangliozida) i oligosaharida mleka (»Bifundus faktoren«). Ona je derivat manozamina iz koga se dobija aldolnom kondenzacijom s pirogrožđanom kiselinom.

4.1.3 ASKORBINSKA KISELINA

L (+) askorbinska kiselina ili vitamin C, je po svojoj hemijskoj konstituciji

najbliža šećerima.

Odavno je bilo poznato da su ljudi, koji su se hranili duže vremena konzervisanom hranom bez svežeg voća i povrća (mornari i zatvorenici) oboljevali od skorbuta. Ova bolest se prvo manifestuje krvavljenjem desni (gingiva). Szent Gyorgyi (1927 g.) je izolovao iz nadbubrežne žlezde čistu,

kristalnu supstancu, koja je jako redukovala. Tek četiri godine posle izolovanja i mnogih eksperimenata, isti autor je konstatovao da ima u rukama dugo traženi vitamin C. Posle toga je vitamin C izolovan iz limuna i drugih agruma, šipka (Rosa canina) i paprike (Capsicum vulgare). Prvi je Reichstein uspeo da sintetiše askorbinsku kiselinu (1934 g.).

Askorbinska kiselina je lakton 2-keto-L-gulonske kiseline. Kiseli karakter vitamina C dolazi isključivo od enolnih grupa (dve hidroksilne grupe na -C=C-), koje su i nosioci reduktivnih osobina. Blagom oksidacijom askorbinska kiselina gubi dva vodonika i prelazi u dehidroaskorbinsku kiselinu.

Dejstvom raznih oksidoredukcionih enzima u tkivu prelaz askorbat–dehidroaskorbat je potpuno reverzibilan i važan je prirodni redoks-sistem određenog oksidacionog potencijala (Eo = + 0.390 V).

Nedostatak askorbinske kiseline dovodi u organizmu do teških smetnji, ali ni do danas nije poznata uloga i mesto delovanja vitamina C.

Danas se askorbinska kiselina dobija naveliko sintezom, a kao polazni materijal služi sorbitol.

4.1.4 INOZITOLI

Inozitoli su biološki vrlo bliski šećerima. Po svojoj hemijskoj građi inozitoli su izociklična jedinjenja, heksaoksi-derivati cikloheksana.

Heksaoksi-derivati cikloheksana grade niz stereoizomera, od kojih je mezoinozitol ili izoinozitol najrasprostranjeniji oblik.

Mezoinozitol je optički neaktivan oblik inozitola i nalazi se u mišićima i unutrašnjim organima, jetri, slezini, bubregu, plućima i mozgu. Ima ga u leukocitima. Mezoinozitola ima i u biljkama, i to fosforilisanog. Kalijumova ili magnezijumova so heksafosfornog derivata mezoinozitola zove se fitin (phvtic acid). Sa žitaricama dolazi u hleb, gde se 75 do 85% fosfora nalazi vezano u fitinu. Fitin otežava resorpciju kalcijuma, jer stvara teško rastvorni kalcijumfosfat. Ako je takav hleb glavni izvor ishrane, tada organizam nema dovoljno kalcijuma.

Inozitola ima u kvascu i drugim mikroorganizmima, zove se bios ili fitohormon rastenja kvasca.

Kod raznih životinja dokazana je metabolična veza inozitola s ugljenim hidratima. U jaje ubrizgan šećer prelazi u inozitol.

Inozitol je sastavni deo lipozitola, fosfatida, kojih ima u mozgu i u nekim semenkama(soja).

4.1.5 GLIKOZIDI

Poluacetalna grupa monosaharida je vrlo aktivna i stupa u reakciju s različitim alkoholima, fenolima, karbonskim kiselinama, dajući jedinjenja poznata pod imenom glikozidi.

Glikozidi su vrlo rasprostranjeni u biljnom svetu, a poznati su i animalni glikozidi. Tu pre svega spadaju za ishranu ljudi i životinja važni oligo i polisaharidi zatim farmakološki aktivni glikozidi, koji stimulišu rad srca, pigmenti cveća, prirodne boje (indigo), a od životinjskih poznati su cerebrozidi.

Prirodu glikozidne veze objasnićemo na jednostavnom primeru. Kada se glukoza zagreva sa metanolom i HCl dobijaju se dva glikozida: α i β-metilglukozid, od kojih prvi nastaje od α-D-glukoze, a drugi od β-D-glukoze.

Glikozidi su jedinjenja tipa acetala. U njima je vodonik poluacetalne grupe zamenjen alkilnim ostatkom. Jedinjenje koje stupa u reakciju sa šećerom zove se aglikon, a nastala veza naziva se glikozidnom vezom. Glikozidna veza može da nastane i između dva molekula monosaharida, kada poluacetalna grupa jednog šećera reaguje sa hidroksilnom grupom drugog. U ovakvom slučaju je i aglikon šećer i takvi glikozidi se zovu holozidi, a za razliku od heterozida kod njih aglikon nije šećer.

U starijoj literaturi ova jedinjenja nazivana su glukozidi, a danas se zovu opštim imenom glikozidi, a glukozidi su glikozidi glukoze, manozidi — manoze, fruktozidi — fruktoze, itd. Imena glikozida grade se tako što se prvo stavi ime aglikona, zatim se sa α— ili β — označi konfiguracija poluacetalnog hidroksila i na kraju stavi ime šećeta s nastavkom»ozid«. Tako se, na primer, glikozid koji je nastao od metilalkohola i α-glukopiranoze zove: metil-α-glukopiranozid, a sa β-glukopiranozom: metil-β-glukopiranozid. Ova dva jedinjenja su najprostiji predstavnici glikozida i ne nalaze se u prirodi. Kada se reduktivna poluacetalna grupa veže na ovaj način u glikozid, ona više ne redukuje Fehling-ov rastvor, ne daje osazone, a konfiguracija prstena u molekulu šećera je stabilizovana u α ili β-obliku.

Kao i svi acetali, i glikozidi se lako hidrolizuju dejstvom kiselina ili enzima, koji se zovu glikozidaze. Prema tome, ako enzim hidrolizuje α-glikozid, zove se α-glikozidaza, a β-glikozid β-glikozidaza. Ovi enzimi mogu da posluže za dokazivanje konfiguracije glikozidne veze. Tako, na primer β-glikozidaza iz gorkih badema, poznata pod imenom emulzin, dokazuje prisustvo β-glikozida.

Pored takozvanih O-glikozida, nastalih reakcijom šećera sa hidroksilnom grupom alkohola, fenola, karboksilne grupe neke kiseline, poznati su i N-glikozidi. Oni nastaju kada poluacetalna grupa monosaharida reaguje sa amino grupom nekog jedinjenja. Izdvajanjem jednog molekula ovde

nastaje N-glikozidna veza. U ovu grupu jedinjenja spadaju cerebrozidi, nukleozidi i polinukleotidi o kojima će kasnije biti govora.

4.1.6 OLIGOSAHARIDI

Oligosaharidi su glikozidi, koji nastaju spajanjem n (dva, tri do šest) molekula monosaharida uz odvajanje (n-1) molekula vode:

C6H12O6 + C6H12O6-H2O = C12H22O11 (disaharidi)

3 C6H12O6 –2 H2O = C18H32O16 (trisaharidi)

Principijelno pri sjedinjavanju monosaharida u oligosaharid u reakciju stupa poluacetalna grupa jednog šećera s alkoholnom grupom drugog, gradeći glikozidne veze.

Prema broju monosaharida, oligosaharide delimo na disaharide, trisaharide, tetrasaharide, itd.

Dosad je tačno ispitan samo mali broj disaharida, nekoliko trisaharida i tetra-saharida. Neki oligosaharidi poznati su već odavno, pa ih često označavamo narodnim trivijalnim imenima, koja često ukazuju na poreklo: sladni šećer - maltoza, mlečni šećer - laktoza, trščani šećer - saharoza.

Disaharidi. — Najvažniji disaharidi sastoje se od dve heksoze. Takvim disa-haridima zajednička je bruto formula C12H22O11, molekulska težina 342,2 i pro-centni sastav C-42,08%, H - 6,48%, O - 51,44%.

Razlikujemo dva tipa saharida:

a) Tip maltoze, kod kojih je poluacetalni -OH jednog šećera reagovao s bilo kojom alkoholnom grupom drugog šećera. U takvim je disaharidima poluacetalni - OH drugog šećera ostao slobodan. Zbog toga disaharidi tipa maltoze redukuju Fehling-ov rastvor, pri rastvaranju mutarotiraju i grade osazone.

b) Tip trehaloze, koji nastaje sjedinjavanjem isključivo poluacetalnih hidroksila oba šećera. Ovakvi disaharidi nemaju slobodne poluacetalne grupe, ne redukuju Fehling-ov rastvor, ne pokazuju mutarotaciju i ne grade osazone.

Imena disaharida grade se tako da ime monosaharida, čiji poluacetalni hidroksil ulazi u jedinjenje, dobija nastavak »id«, a monosaharid koji se vezao za alkoholni hidroksil ostaje s nepromenjenim imenom, na primer,

maltoza je glukozido-glukoza, a laktoza galaktozido-glukoza:

Pošto u momentu nastajanja disaharida poluacetalni hidroksil ima određenu prostornu konfiguraciju, to disaharidna veza prvog tipa može biti α ili β glikozidna, na primer kod maltoze odnosno celobioze. Tip veze α ili β stavlja se ispred imena disaharida. Kod disaharida drugog tipa mora se uzeti u obzir orijentacija i jednog i drugog poluacetalnog - OH, pa imamo tri mogućnosti: α-α, β-β i α-β. Poslednji slučaj imamo kod običnog šećera saharoze, koji nam služi za hranu.

I raspon kiseonikovog mosta u svakom pojedinom šećeru oligosaharida igra ulogu u nastajanju izomernih oblika. Zato se hemijskom nomenklaturom označava i raspon kiseonikovog mosta, tako da se u zagradu stave brojevi ugljenikovih atoma, između kojih postoji kiseonična veza: na primer: (1,5) za piranoze, a (1,4) za furanoze.

Neki disaharidi se nalaze slobodni u prirodi (saharoza, laktoza, trehaloza), a drugi izgrađuju polisaharide (skrob, celulozu) ili su sastavni deo nekog glikozida.

Maltoza ili sladni šećer, dobio je ime po sladu, proizvodu industrije vrenja.

Maltoza nastaje i razgradnjom skroba i glikogena u digestivnom traktu. Maltoza se dejstvom enzima maltaza razlaže na dve glukoze. Maltaze mogu biti vrlo specifične (slad) ili manje specifične (crevni sok). Maltaza iz creva razlaže ne samo maltozu nego celu grupu α-glukozida, pa je za nju ispravniji naziv α-glukozidaza.

Hemijsko ime maltoze je α-D-glukozido —(l,5)-4-D-glukoza-(1,5). Broj 4 znači da se poluacetalni hidroksil jednog šećera vezao na alkoholnu grupu na 4-ugljenikovom atomu drugog šećera. Umesto brojeva u zagradi, koji označavaju raspon kiseonikovog mosta, možemo staviti piranozido ili furanozido; maltoza bi se tada zvala α-D-glukopiranozido-4-D-glukopiranoza.

Maltoza kristališe kao monohidrat, lako se rastvara u vodi i alkoholu. Pokazuje mutarotaciju, a specifični ugao skretanja polarizovane ravni

posle uspostavljanja ravnoteže je = 138,8°. Maltoza redukuje

Fehling-ov rastvor, stvara osazon i podržava vrenje kvaščevih gljivica.

Celobioza je β-D-glukozido —(1,5) 4-D-glukoza-(l,5), a razlikuje se od maltoze samo po β-glukozidnoj vezi. Kvasac ne previre celobiozu, nju razlažu β-gluko-zidaze, na primer emulzin iz gorkih badema.

Celobioza se ne nalazi slobodna u prirodi. Njena teorijska važnost je velika jer izgrađuje polisaharid celulozu, iz koje se može dobiti pod povoljnim uslovima hidrolize.

Saharoza, šećer iz repe, trščani šećer, je disaharid koji se sastoji od glukoze i fruktoze. Hemijsko ime saharoze je α-D-glukozido (1,5)—β-D-fruktozid (2,5).

Saharoza je vrlo rasprostranjena u biljnom svetu, a najviše je ima u šećernoj trsci i šećernoj repi. Proizvodi se ekstrakcijom i kristalizacijom iz ovih biljaka, koje se u tu svrhu kultivišu. U svetu se proizvodi oko 30 miliona tona saharoze.

Saharoza se topi na 184°, raspada se iznad tačke topljenja, potamni i daje karamel. Lako se rastvara u vodi. Ne redukuje Fehling-ov reagens; kvasac previre saharozu. Dejstvom enzima invertaze saharoza se cepa na glukozu i fruktozu. Dobijena masa se zove invertni šećer, a sam proces inverzija. Ime dolazi zbog toga što se optičko skretanje saharoze ( + 66,5) posle hidrolize menja, preobraća »invertira«, jer smesa glukoze (52,7°) i fruktoze (—93°) skreće ravan polarizovane svetlosti nalevo. Pčelinji med je prirodni invertni šećer.

Za vreme varenja saharoza se cepa u tankom crevu.

Laktoza ili mlečni šećer je β-D-galaktozido-(l,5)-4-D-glukoza (1,5). Nas-taje u mlečnoj žlezdi sisara, a pri sirenju ostaje u surutki. Laktoza se posle partusa nalazi u urinu porodilja.

Mlečni šećer se rastvara u šest delova hladne vode, a ne rastvara se u etru i hladnom alkoholu. Daje obične redukcione probe na šećere. Topi se na 202°C.

Čisti sojevi kvasca ne previru laktozu, a kiseline je razlažu na glukozu i galaktozu. U tankom crevu postoji enzim laktaza (β-galaktozidaza), koji hidrolizuje mlečni šećer na sastavne monosaharide, koji se onda lako resorbuju.

Od ostalih disaharida spomenućemo neke samo po imenu: Genciobioza, sastavni deo glikozida amigdalina iz gorkih badema (β-glukozido-6-glukoza); meli bioza se nalazi u biljnim eksudatima i sastavni je deo trisaharida rafinoze (α-gala-tozido-6-glukoza); furanoza, sastavni deo trisaharida melecitoze (α-glukozido-3-fruktoza).

4.1.7 POLISAHARIDI ILI GLIKANI

Polisaharidi nastaju kad se stotine i hiljade molekula monosaharida vežu međusobno glikozidnom vezom. Nagomilavanjem tako velikog broja molekula u jednu veliku česticu menjaju se osnovne osobine šećera: polisaharidi nisu slatkog ukusa, ne rastvaraju se u vodi, nego samo bubre i imaju sve osobine koloidnih velikih »molekula«. Ovde su stavljeni znakovi navoda, jer se kod polisaharida ne radi u koloidnim rastvorima o česticama iste veličine, izgrađenih od istog broja atoma, već o česticama istog načina unutrašnje građe, čija se veličina gomila (kumulira) više ili manje oko iste vrednosti.

Prirodni polisaharidi se dele na »skeletne« ili »strukturne«, koji služe biljci ili životinji kao potporno tkivo za održavanje čvrste mehaničke strukture, i na »hranljive« koji su rezervna hrana. Ima čitav niz polisaharida koji se ne mogu uvrstiti u ovu klasifikaciju.

Struktura polisaharida. — Prirodni polisaharidi nastaju dejstvom specifičnih enzimskih organizacija. Od njih zavisi koji se šećer kondenzuje i na koji način. Iz tih razloga je struktura pojedinih polisaharida strogo određena.

Od velikog broja stereoizomernih monosaharida samo mali broj ulazi u sastav prirodnih polisaharida. Vrlo često se polisaharidi sastoje samo od jedne vrste monosaharida. Tako se celuloza sastoji samo od jedinica D-glukoze, koje su povezane β-glikozidno. Poznati su zatim, polisaharidi koji se sastoje od D-manoze, D-fruktoze, D-galaktoze. Od pentoza grade polisaharide D-ksiloza, L i D-arabinoza. Neki se polisaharidi sastoje od derivata šećera kao što su: D-glukozamin, D-galaktozamin ili uronske kiseline (D-glukuronska, D-galakturonska). Svi monosaharidi su u pojedinim polimerima raspoređeni po jednom određenom planu.

Pri kondenzaciji monosaharida poluacetalni hidroksil uvek učestvuje, i to može da se vezuje bilo za alkoholne grupe drugog šećera bilo za njegov poluacetalni hidroksil. Način vezivanja je vrlo određen za svaki pojedini polisaharid. Tako se kod amiloze molekuli D-glukopiranoze vezuju međusobno α-glukozidno-1,4, kao kod maltoze.

Kod celuloze se molekuli D-glukopiranoze vezuju međusobno (β-glukozidno 1,4, kao kod celobioze. Fizičke osobine amiloze i celuloze, kao i njihova biohemijska funkcija u biljci vrlo su različite, i to pre svega zbog različitog načina međusobnog vezivanja jedinica D-glukopiranoze.

U slučaju kada se molekuli monosaharida međusobno vezuju samo na jedan način, onda grade jednolične lance, kao što je to slučaj kod celuloze. Međutim, kada postoje dva ili tri načina međusobnog vezivanja monosaharida, takvi polisaharidi imaju razgranat lanac i globularnu strukturu, kao na primer skrob. Kod takvih polisaharida se hidroksilna grupa jednog šećera u glavnom lancu vezuje s poluacetalnim grupama šećera u bočnom lancu. Na slici br. 4.1 prikazani su načini međusobnog vezivanja molekula šećera predstavljenih u obliku kružića. Mogućne su razne kombinacije, ali su one u raznim polisaharidima, kao što smo već naglasili, strogo određene.

Slika 4.1 - Načini međusobnog vezivanja jedinica monosaharida u polisaharidima:

A — lančasta struktura: S—jedno grananje: C—sa više tačaka grananja i D—višestruko grananje

4.1.8 BILJNI POLISAHARIDI (FITOPOLISAHARIDI)

Celuloza je najvažniji predstavnik strukturnih polisaharida u biljkama. Količina celuloze u nekim mikroorganizmima, algama i lišajevima je beznačajna, a životinje uopšte nemaju celuloze.

Od celuloze se sastoji oko polovina materijala, koji izgrađuje ćelijske zidove kod drveta i drugih biljnih proizvoda. Pamuk (medicinska vata, Gossypium depuratum) je skoro 100% celuloza vlakana pamučne semenke. Upotrebljava se u medicini, jer može da upije velike količine tečnosti. Filter hartija je jako prečišćena celuloza. Celuloza je građena isključivo od celobioze, koja je β-1,4 glukozidnim vezama spojena u dugačke lance. U celuloznom vlaknu može lanac jednog »molekula« da sadrži i do 3.200 ostataka glukoze. Potpunom hidrolizom celuloze mineralnim kiselinama dobija se D-glukoza, a delimičnom hidrolizom celobioza.

Životinje ne mogu da vare celulozu. Biljojedima, kojima celuloza služi kao hrana, pomažu mikroorganizmi. Životinja im pruža u svom debelom crevu, a preživari u predželucima, životni prostor, a ona koristi njihovu sposobnost da razlažu celulozu. Produkti mikrobiološke razgradnje jesu niže masne kiseline. Činjenica da u ljudskoj hrani ima dosta celuloze (spanać, kelj, kupus, sočiva) ne znači da čovek može da vari celulozu. Celuloza »puni« hranu, pojačava peristaltiku creva i daje volumen fekalijama.

U biljkama se pored celuloze nalaze i drugi polisaharidi, poznati pod imenom hemiceluloze. Tu spadaju ksilani koji se sastoje od jedinica D-ksiloze, i njih ima najviše; zatim kisele hemiceluloze, koje se sastoje od uronskih kiselina, i manani, polimeri D-manoze. Kod procesa prelaza zelene biljke u drvo, u celuloznu strukturu se inkrustira lignin, koji nastaje oksidativnom polimerizacijom supstance slične koniferilnom alkoholu. Pri dobijanju celuloze drvo se prvo kuva kiselinama ili alkalijama, jer se u njima ne rastvara celuloza.

Pektini takođe izgrađuju ćelijske membrane biljaka, naročito ih ima mnogo u nekom voću kao dunji, limunu, jabuci i dr. Odatle se i dobijaju. Nalaze se uvek u embrionalnom tkivu višeg bilja. Pektini zrelog voća rastvaraju se u vodi, a u prisustvu šećera daju čvrsti gel (želirano voće). Zbog te svoje osobine pektini se upotrebljavaju u prehrambenoj industriji.

Po svojoj hemijskoj građi pektini su kalcijumove i magnezijumove soli α-1,4--poligalakturonske kiseline. Pektin stalno prate arabani i galaktani, polimeri D-arabinoze odnosno D-galaktoze.

Skrob se nalazi u obliku sitnih zrnaca u različitim delovima biljke, a naročito u embrionalnom tkivu (krtola krompira, semenke žitarica: pšenice, raži, pirinča, ječma, kukuruza). Skrob je glavna rezervna hrana biljnog organizma. Ima jedinstevenu osobinu da se nalazi u obliku zrna razne veličine i oblika, koji su karakteristični za svaku biljku. Zrna su slične hemijske građe: spoljni deo (omotač) sastoji se od polisaharida amilopektina, a srž od amiloze. Amiloza

daje plavu boju s jodom, amilopektin ljubičastu. Oba polisaharida daju potpunom hidrolizom D-glukozu.

Amiloza je jednostavnije građena od amilopektina, zato ćemo prvo o njoj govoriti. Nalazi se u skrobnom zrncu obavijena amilopektinom i za svaku biljku je karakterističan odnos amiloze i amilopektina. Tako u krompirovom skrobu ima 20% amiloze, a u nekim specijalnim vrstama graška i 75%.

Čestice krompirove amiloze imaju molekulsku težinu od 4.000 do 150.000, a molekulska težina nekih amiloza iz semenja je 400 000. Iako je po veličini čestica, amiloza nehomogena, sve su one jednake unutrašnje građe. Enzimskim razlaganjem amiloze dobija se maltoza. Pošto maltoza ima α-1,4 glukozidnu vezu to se smatra da je amiloza isključivo lančasto građena, iako je taj lanac uvijen u obliku spirale sa po šest ostataka glukoze u jednom zavoju. Misli se zato da enzim α-amilaza odjednom otcepljuje jedinke od šest ostataka glukoze, jer svojim aktivnim grupama obuhvata celi jedan zavoj u spirali. I pojava tamno plave boje koju amiloza daje s jodom, objašnjava se adsorpcijom atoma joda unutar spirale amiloze.

Amilopektin je polisaharid, koji je mnogo komplikovanije građen od amiloze. U skrobnom zrncu ima ga oko tri puta više od amiloze, a ima i takvih vrsta kukuruza i pirinča gde je skrobno zrno isključivo građeno od amilopektina. Amilopektin jako bubri i lepljiv je. Prema predlogu našeg naučnika Samec-a. za amilopektin je prihvaćen naziv izo-amiloza.

Slika 4.2. - Spirale amiloze

Amilopektin ima račvastu i razgranatu strukturu: na glavne lance α-1,4-glikozidno povezanih jedinica glukoze nadovezuju se bočni lanci vezani α-1,6-glikozidno (mesto račvanja), tako da amilopektin ima trodimenzionalnu, globularnu građu. I glikogen, rezervni polisaharid životinja, je slične razgranate strukture kao i amilopektin. Razlika između amilopektina i glikogena postoji očigledno u broju molekula glukoze u običnim lancima i mestima grananja u glavnom lancu.

Amilopektin daje s jodom ljubičastu ili mrku boju, koja nije tako intenzivna kao plava boja, koju daje amiloza s jodom i koja pokriva sve druge nijanse.

Slika 4.3 - Amilopektin (deo molekula)

Zrnca skroba imaju uvek male količine stranih tela: masne kiseline, fosforne kiseline i katjone: kalcijum, magnezijum, kalijum i natrijum. Samo je fosoforna kiselina hemijski vezana sa skrobom (na 6-C atomu jedinica glukoze), i to uglavnom kod skroba podzemnih delova biljaka (npr. krompir).

Kiselom hidrolizom ili zajedničkim dejstvom nekoliko enzima kao α-amilaze (iz ječmenog slada), β-amilaze i maltaze, skrob se kvantitativno razlaže do glukoze. Pojedinačno, gore navedeni enzimi ne hidrolizuju skrob potpuno, već daju jedinjenja niže molekulske težine, koja se nazivaju dekstrinima. To su jedinjenja različite molekuske težine i prema tome kako se boje s jodom, delimo ih na: amilodekstrine, koji daju plavu boju s jodom i najveće su molekulske težine. Daljom razgradnjom nastaju eritrodekstrini, koji daju crvenu do mrku boju s jodom. Niskomolekularni ahrodekstrini ne boje se s jodom.

Skrob → amilodekstrini → eritrodekstrini → ahrodekstrini → maltoza → glukoza

Shema postepenog razlaganja skroba

Dekstrini nastaju i dejstvom kiselina na skrob, a i suvim zagrevanjem (kora hleba). Dekstrini imaju raznu tehničku primenu, pa i kao lepak.

Inulin spada u grupu rezervnih polisaharida i sastoji se od jedinica D-fruktofuranoze (fruktan), koje su međusobno vezane β-2,1-fruktozidno. Inulin je ciklične građe i ima trideset ostataka fruktoze u molekulu. Najviše ga ima u korenima glavočika (Compositae).

Ostali polisaharidi. — Postoji čitav niz fruktana, koji su dobili ime po biljkama u kojima su nađeni: asparagozin, sinistrin, graminin; zatim bakterijelni levani i sekalin iz roščića raži (Secale cornutum) zaražene gljivicom (Claviceps purpurea).

Treba spomenuti polisaharid, koji se dobija iz crvenih algi (Rhodophvceae), poznat pod imenom agaragar. Već 2% rastvor agara

lako želatinizuje i upotrebljava se za čvrste podloge u mikrobiologiji. Agar je galaktozan u kome su jedinice galaktoze povezane 1,3 i 1,4-glikozidno. Potpuna struktura mu još nije poznata. Primarna alkoholna grupa na 6-C atomu galaktoze je esterifikovana sumpornom kiselinom. Ostaci sumporne kiseline neutralisani su kalcijumom i magnezijumom. Po svom sastavu agar spada u grupu mineralnih estara-polisaharida.

Od bakterijskih polisaharida važni su serološki specifični polisaharidi, koje je izolovao Heidelberger iz filtrata nekih bakterija. Ovi polisaharidi su hapteni, koji specifično reaguju s antitelom, ali sami ne mogu izazivati organizam da stvara antitela. Bakterijski polisaharidi su različitog sastava, tako se specifični polisaharidi pneumokoka sastoje od glukoze i glukuronske kiseline; B. dysenteriae i B. antracis imaju aminošećere kao jedinice, a neki pentoze, kao V. Cholerae.

4.1.9 POLISAHARIDI ANIMALNOG POREKLA (ZOOPOLISAHARIDI)

Poznat je veliki broj zoopolisaharida različitog hemijskog sastava i fiziološke uloge. Najduže je poznat i odavno ispitan glikogen ili — kako ga često zovu — životinjski skrob. On je metabolična i energetska rezerva skoro svih ćelija, a naročito ćelija jetre i mišića. U životinjskom organizmu vrlo su rasprostranjeni polisaharidi viskoznih sekreta »sluzi«. Oni pokrivaju i štite respiratorni i digestivni trakt, reproduktivne organe, a naročito ih mnogo ima u embrionalnom tkivu. Vezivno i rskavičavo tkivo sastoji se od znatnih količina kiselih polisaharida. Kod mnogih nižih životinja, kao što su insekti i ljuskari, glavna strukturna i zaštitna supstanca je polisaharid hitin. Osim toga, neki hormoni i enzimi sastoje se delimično od ugljenih hidrata. Tako hormon prednjeg režnja hipofize, koji stimuliše rad folikula (FSH), ima heksozamina, gonadotropin urina trudnih žena (HCG) i gonadotropin krvnog seruma kobila (PMSG) imaju galaktozu i heksozamin. I tireoglobulin ima u svom molekulu glukozamina, galaktoze i manoze. Jaki antikoagulans heparin je polisaharid. Iz ovih nekoliko primera vidi se od kolike su važnosti animalni polisaharidi.

Danas još nema jedne opšte prihvaćene klasifikacije ove velike grupe ugljenih hidrata. Pošto se neki od njih nalaze slobodni, a drugi vezani u obliku nestabilnih kompleksa tipa soli ili hemijski vezani za proteine ili lipide, podelićemo ih u dve velike grupe:

I. Zoopolisaharide

a. Homozoopolisaharide ili homoglikane (glikogen i hitin), koji se sastoje samo od jednog tipa monosaharida.

b. Heterozoopolisaharide ili heteroglikane (hialuronska kiselina, hondroitin-sulfat, heparin, polisaharidi krvnih grupa), u čijem su molekulu polimerizovana dva ili više monosaharida.

II. Komplekse zoopolisaharida

a. Komplekse s proteinima (mukoproteine i glikoproteine).

b. Zooglikolipoproteine.

c. Zooglikolipide

O kompleksnim zoopolisaharidima biće govora u poglavlju o Složenim belančevinama.

4.1.10 HOMOZOOPOLISAHARIDI (HOMOGLIKANI)

Glikogen je glavni rezervni polisaharid životinja. Po svojoj funkciji i strukturi vrlo je sličan skrobu. Glikogena ima u nekim gljivama, kvascima i bakterijama.

Životinjski organizam nagomilava rezerve glikogena u jetri i mišiću. U tkivu koje je bogato glikogenom, ne mogu se videti mikroskopom zrnca glikogena, jer je on rastvoren u protoplazmi. Tek delovanjem alkohola glikogen se taloži, pa ga je tako i otkrio Claude Bernard. Za izolovanje glikogena tkivo se prvo razara toplim alkalijama, jer one ne utiču na njega.

Glikogen je polisaharid račvasto-globularne strukture. Molekul mu se sastoji od lanaca jedinica glukoze, vezanih α-l,4-glukozidno sa grananjima α-l,6-glukozidno, slično kao i kod amilopektina. Glavni lanac se sastoji od 12 do 18 jedinica glukoze (u zavisnosti od porekla glikogena), a u bočnim lancima ima 25 do 27 jedinica. Molekulska težina glikogena kreće se od jednog do nekoliko miliona.

Enzimsko razlaganje glikogena analogno je kao i kod skroba. Tako nastaje Corijev estar, glukozo-1-fosfat (G-l-P). Proces se zove glikogenoliza. Kao rezerva glukoze, glikogen se nalazi tokom metabolizma u ravnoteži s drugim komponentama životinjskog organizma.

Hitin je strukturna supstanca nižih životinja i insekata. Od njega se sastoji oklop rakova, a nalazi se i u ćelijama nekih gljiva.

Molekuli hitina su vlaknaste strukture i po tome liči na celulozu. Potpunom hidrolizom hitina dobijaju se skoro teorijske vrednosti D-glukozamina i sirćetne kiseline. Hitin je polimer N-acetil-D-glukozamina. Molekule N-acetil-D-glukozamina povezane su u hitinu—1,4—glikozidno.

Slika 4.4 - Šematski izgled molekula glikogena

4.1.11 HETEROGLIKANI

U životinjskom organizmu vrlo su rasprostranjeni polisaharidi, koji se sastoje od amino šećera (D-glukozamina ili D-galaktozamina) i uronskih kiselina. Pošto su to vrlo viskozne i sluzave supstance dato im je ime mukopolisaharidi. Najpoznatiji polisaharidi ove grupe su: Hialuronska kiselina, hondroitin-sumporna kiselina i heparin.

Mukopolisaharidi imaju istu osnovnu hemijsku strukturu. Osnovne jedinice ove grupe polisaharida su disaharidi, koji se sastoje od jedne uronske kiseline vezane β-glikozidno za treći ugljenikov atom aminošećera (l→3). Amino-grupa amino-šećera je uvek acetilovana ili sulfatirana. Ovakve osnovne disaharidne jedinice vezuju se međusobno β-1,4-glikozidno, gradeći dugačke lančaste molekule.

Hialuronska kiselina sastoji se od disaharidnih jedinica D-glukuronske kiseline i N-acetil-D-glukozamina.

Hialuronska kiselina je prvo izolovana iz staklastog tela oka, a docnije iz pupčane vrpce, vezivnog kožnog tkiva, sinovijalne tečnosti, pevčeve kreste i drugog materijala. U neutralnim rastvorima je vrlo viskozna, a viskozitet joj je proporcionalan sa stepenom polimerizacije. Hialuronska kiselina je u životinjskom organizmu cementna supstanca subkutanog i drugog tkiva. Druga važna funkcija hialuronske kiseline je da u sinovijalnoj tečnosti služi kao neka vrsta podmazivača u zglobovima. Nalazi se i slobodna, ali je vrlo često vezana za proteine. Molekulska težina hialuronske kiseline iz pupčane vrpce iznosi 4 do 8 miliona.

Pod dejstvom hidrolitičkih enzima, hialuronidaza, dolazi do razlaganja hialuronske kiseline. Ovi enzimi su vrlo rasprostranjeni i od velike biološke važnosti. Ima ih u patogenim organizmima i u otrovima zmija i insekata. Hialuronidaze ima i u životinjskom organizmu npr. u testisima.

Pri prodiranju patogenih organizama u životinjsko telo (infekciji) hialuronidaza im olakšava ulaz, jer cepajući hialuronsku kiselinu

smanjuje viskozitet tkiva. Na sličan način hialuronidaza testisa olakšava spermijama ulaz u neoplođeno jaje.

Hondroitin-sumpoma kiselina ili hondroitin-sulfat izgrađuje osnovnu supstancu životinjskog vezivnog tkiva i rskavica. Vrlo lako može da se preparira iz nosne rskavice. Do danas su izolovani A, B i C hondroitin-sulfat. Disaharidna jedinica hondroitin sulfata C sastoji se od glukuronske kiseline i N-acetil-D-galaktozamin-6-sulfata (β-l→3, β-l→4). Hialuronidaza testisa hidrolizuje i hondroitin-sulfat.

Heparin (α-heparin), krvni antikoagulans, nađen je u jetri, plućima, timusu, slezini i krvi. Sastoji se od disaharidnih jedinica D-glukuronske kiseline i D-glukozamin-N-sumporne kiseline. Pored toga su i alkoholne grupe amino šećera esterifikovane sumpornom kiselinom. Vezivanje u disaharidu je l→3, a disaharidnih jedinica I→4. Molekulska težina heparina kreće se između 17 000 do 20 000.

Polisaharidi krvnih grupa nađeni su u eritrocitima, mucinu želudca, pljuvački, tečnostima ovarijalnih cista i drugim sekretima. Krvne grupe A, B, O (H), Rh-faktor sastoje od polisaharida vezanih za proteine. Polisaharidi raznih krvnih grupa mogu da se sastoje od istih osnovnih monosaharida. Tako je dokazana D-galaktoza, N-acetilgalaktozamin i L-fukoza u specifičnim supstancma izolovanim iz mucina želudca. Interesantno je da sve ove supstance gube svoje specifično dejstvo otcepljenjem acetilnih grupa.

4.2 METABOLIZAM UGLJENIH HIDRATA

Metabolizam ugljenih hidrata, kao i metabolizam masti i proteina, predstavlja zajedničku i povezanu aktivnost mnogobrojnih multienzimskih organizacija koje učestvuju u razmeni materije i energije između ćelije i njene okoline. Metabolizam obuhvata stotine enzimskih reakcija koje se obično prikazuju nepreglednim shemama i daju utisak beznadežne složenosti. Međutim, centarlni metabolički putevi su jednostavni i slični za sve oblike života.

Pod intermedijernim metabolizmom se podrazumeva celokupni splet metaboličkih procesa. Njegova funkcija se sastoji:

2) Da preuzima hemijsku energiju okoline, bilo u obliku hrane bilo u obliku sunčeve energije,

3) Da od uzete hrane sintetiše sastavne opeke ćelije i da ih ugradi u proteine, nukleinske kiseline, lipide i druge karakteristične ćelijske komponente i

4) Da formira i razgrađuje one biomolekule koji imaju specijalne funkcije, na primer hormone.

Razgradnja ugljenih hidrata teče preko niza povezanih reakcija koje se odigravaju u tri stepena. U prvom hranljivi se sastojci cepaju na prostije, osnovne molekule. Polisaharidi na haksoze ili pentoze. U drugom stepenu nastali produkt razgrađuje se do još prostijih jedinjenja. Tako heksoze, pentoze i glicerol prelaze u šećer sa tri C- atoma (glicerinaldehid 3-fosfat), koji se dalje cepa u acetil -koenzim A, koji ima samo dva C atoma. U trećem stepenu katabolizma, dolazi do potpune oksidacije u ugljendioksid i četiri atoma vodonika. Četiri para vodonikovih atoma ulaze u lanac disanja, da bi se preko citohroma i drugih prenosilaca sjedinili sa kiseonikom u vodu.

Anabolizam se, takođe, odigrava u tri stepena. On polazi od prostih osnovnih jedinjenja, koja nastaju u trećem kataboličkom stepenu.

4.2.1 VARENJE UGLJENIH HIDRATA

Pod normalnim uslovima, čovek i sisari se većinom hrane ugljenim hidratima, koji se nalaze u najpristupačnijim biljnim proizvodima (žitaricama i krompiru). Sa ugljenim hidratima se pokrivaju najosnovnije energetske potrebe za održavanje i reprodukciju organizma.

Prosečna kalorična vrednosti ugljenih hidrata iznosi 17 kJ po gramu. Pored skroba i šećera u hrani se nalaze i drugi ugljeni hidrati: celuloza, glikogen, gliko-proteini, a za novorođenče je najvažnija laktoza. Čovek ne vari celulozu, jer njegov digestivni trakt ne luči nikakav enzim, koji bi bio sposoban da je hidrolizuje. Preživari i životinje sa dobro razvijenim slepim crevom (caecum) mogu da koriste i celulozu, jer njihovi simbiotični mikroorganizmi započinju njeno razlaganje.

U hrani se nalaze pored spomenutih polisaharida i prosti šećeri, heksoze (glukoza, fruktoza) u manjim količinama; sem toga ima i pentoza, naročito posle varenja nukleinskih kiselina i voćnih pentozana.

Za održavanja života i normalnog metabolizma jedino je potrebna glukoza ili bilo koji njen svarljivi polimer. Sve heksoze u organizmu lako prelaze u glukozu. Prema tome, nema nikakve dijetalne potrebe za nekim specifičnim, bitnim ugljenim hidratom, jer se svi oblici potrebni organizmu sintetišu od glukoze. Sama glukoza može da se sintetiše od

drugih organskih jedinjenja npr. piruvata ili aminokiselina — ovaj proces se zove glukoneogeneza.

Za razliku od varenja proteina i lipida, probava ugljenih hidrata nije komplikovan proces. To je odraz relativne jednostavnosti njihove hemijske strukture. Homoglikani, kao što je skrob, sastavljeni su samo od jedinica D-glukoze, koje su povezane α-1,4 i α-1,6-glukozidnom vezom.

U probavnom traktu se skrob i glikogen razlažu dejstvom enzima α-amilaze (1,4-α-D-glukan 4-glukanohidrolaza 3.2.1.1). α-Amilaza se nalazi i u pljuvački i u pankreasnom soku, naziva se endo-amilaza, jer hidrolizuje veze unutar lanca. Za njenu punu aktivnost su potrebni Cl¯ i Ca2+joni. Konformacija aktivnog centra α-amilaze je takva da može da se cepa svaka druga veza, pa se kao krajnji proizvod javlja najvećim delom samo maltoza. Ona ne hidrolizuje α-1,6-glukozidne veze, tako da posle hidrolize amilopektina ostaju niži oligosaharidi, u kojima su ove veze netaknute (dekstrini). Zato se ona zove i dekstrinogena amilaza.

Udeo pljuvačne amilaze u varenju ugljenih hidrata je nesiguran, jer se hrana zadržava u ustima vrlo kratko. Pošto je pH optimum amilaze u području pH=7,1, dejstvo enzima prestaje čim hrana dođe u kontakt sa kiselim sadržajem stomaka, gde se manja količina hidrolizuje pod dejstvom stomačne HCl. Najveći deo razgradnje ugljenih hidrata se dešava u tankom crevu dejstvom pankreasne amilaze.

α-l,6-glukozidne veze na mestima grananja u amilopektinu i dekstrinima, koji ostaju posle dejstva α-amilaze, cepa enzim izomaltaza ili oligo-l,6-glukozidaza (3.2.1.10).

Ona se nalazi u tankom crevu i hidrolizuje i neke disaharide. Hidroliza maltoze, laktoze i saharoze odigrava se, takođe, u tankom crevu dejstvom niskospecifičnih enzima: α-glukozidaze, β-galaktozidaze i β-fruktozidaze.

Ugljeni hidrati se dakle, u digestivnom traktu hidrolizuju do monosaharida, pre nego što se apsorbuju. Apsorpcija se dešava, uglavnom, u srednjem delu tankog creva. Od monosaharida najlakše se apsorbuje galaktoza, zatim redom glukoza i fruktoza, koja ulazi verovatno, prostom difuzijom. Apsorbovani šećeri ulaze u portalnu cirkulaciju i prenose se u jetru.

4.2.2 OSOBINE I FUNKCIJE GLIKOGENA

Ugljeni hidrati se odlažu u organizmu u obliku glikogena, čija je struktura fiziološki vrlo povoljna. Molekulska težina glikogena varira od 0,5—5 x 106 , odn. može da se sastoji od 3 000 do 30 000 jedinica glukoze, koje su međusobno povezane α-1,4 i α-l,6-glikozidnim vezama. Odnos α-1,4 veza prema α-1,6 je takav da se nizovi glukoze račvaju posle svakih 10 do 12 jedinica. Zbog grananja, molekul glikogenaje loptastog izgleda, kompaktan i zauzima malo prostora. Iz istog razloga, broj jedinica

glukoze (5—10%) se nalazi spolja na krajevima, sa slobodnom —OH grupom na četvrtom C-atomu. To su aktivna mesta u molekulu glikogena na kojima počinje njegovo razlaganje (fosforobza) a isto tako i vezivanje daljnih molekula glukoze kada teče obrnuti proces, glikogeneza.U glikogenu postoji samo jedna slobodna »reducirajuća« poluacetalna glupa (C—1).

Glikogen se nalazi gotovo u svim tkivima. Međutim, postoje dva odvojena mesta, jedno u jetri, a drugo u prugastim mišićima koja se razlikuju po ulozi i korišćenju. Glikogen, deponovan u jetri održava koncentraciju glukoze u krvi na konstantnom nivou između obroka. Mišićni glikogen ne prelazi u krvnu glukozu. On obezbeđuje energiju za mišiće, kad god njihovo snabdevanje glukozom iz krvi nije dovoljno. Koncentracija glikogena se smanjuje u toku napornog rada, a povećava za vreme mirovanja.

Putevi razgradnje i sinteze su isti i za jetreni i za mišićni glikogen. Usled velike dimenzije čestica, glikogen ne može da se transportuje sa jednog mesta na drugo, pa se razlaže u ćeliji gde je uskladišten.

Mobilni oblik ugljenih hidrata u krvi je glukoza. Potpuna razgradnja glikogena do glukoze odvija se u tri stepena, od kojih je fosforoliza najbolje proučena.

Slika 4.5 - Položaj glikogena jetre i mišića u metabolizmu ugljenih hidrata

4.2.3 RAZLAGANJE GLIKOGENA (FOSFOROLIZA)

Razlaganje glikogena, glikogenoliza, odvija se uzastopnim dejstvom dva enzima: glikogene (ili skrobne) fosforilaze i fosfoglukomutaze. Fosforilaze su vrlo rasprostranjeni enzimi, koji se nalaze u biljkama, životinjama i mikroorganizmima. Dejstvo fosforilaze se sastoji u tome da otkida ostatke glukoze sa nereducirajućeg kraja glikogena, cepa α-1,4 glukozidnu vezu i prenosi ostatak glukoze na fosfornu kiselinu. Fosforilaze su, dakle, transferni enzimi (glukozil-transferaze 2.4.1.1). Kao što se na slici 4.6 vidi proizvod reakcije je D-glukozo-1-fosfat.

Fosforilaza ne može da cepa α-l,6-glukozidne veze, pa njeno dejstvo prestaje kada se približi mestu račvanja. Da bi se razlaganje glikogena nastavilo, stupaju u akciju još dva enzima. Prvi, jedna oligotransferaza, prenosi tri (ili dva) ostatka glukoze sa prikraćenog spoljnog lanca na drugi lanac amiloznog tipa (α-1,4). Posle njenog dejstva ostaje samo jedna glukoza vezana α-l,6-glikozidno (slika 4.7), koju hidrolitički cepa drugi enzim, α-1,6 glukozidaza (3.2.1.33). Na taj način, fosforilaza može opet da dejstvuje na novi lanac, koji se pojavio na površini.

Slika 4.6 - Fosforolitično cepanje ostataka glukoze sa neredukujućeg kraja glikogena dejstvom fosforilaze

Slika 4.7 - Intramolekulski prenos triostatka glukoze i produžavanje amiloznog α-1.4. glukanskog lanca

Potrošnja energije deponovane u obliku glikogena i održavanje koncentracije glukoze u krvi na normalnom nivou i pod uslovima gladovanja, održava se pomoću homeostatskog procesa, koji sprečava rasipanje rezervi i gubitak energije. U ovom kontrolnom mehanizmu, koji reaguje prilikom iznenadnih potreba povećanog mišićnog rada i omogućava regulaciju potrošnje glikogena, bitnu ulogu igra oligomerna struktura enzima fosforilaze. Zbog takve strukture mišićna fosforilaza je regulatorni enzim, koji se javlja u dva oblika: aktivni (fosforilaza a) i neaktivni (fosforilaza b). Aktivna fosforilaza a je kristalizovana. Njena molekulska težina iznosi 380 000, a sastoji se od četiri identične jedinice. Svaka jedinica sadrži ostatak fosfoserina, koji je bitan za katalitičku aktivnost i jedan koenzim piridoksal-fosfat, koji je kovalentno vezan za ostatak lizina. Aktivni oblik (fosforilaza a) prelazi u neaktivni dejstvom enzima fosforilaza-fosfataza. Ona otkida orto-fosfatne ostatke od serinskih ostataka, zbog čega aktivni tetramer enzima prelazi u dva

dimera, koji predstavljaju neaktivni enzim, fosforilazu b. Fosforilaza b može da pređe u aktivnu fosforilazu dejstvom pozitivnog modulatora, u ovom slučaju c-AMP-a. Aktivaciju katalizuje poseban enzim, fosforilaza-kinaza, koja analogno svim kinazama zahteva prisustvo Mg2+ jona. Na ovaj način, pomeranjem odnosa aktivne i neaktivne fosforilaze, reguliše se potrošnja glikogena. Modulator ove regulacije je sistem ATP—ADP. Regulacija aktivnosti fosforilaze je samo jedan stepen kontrolnog mehanizma razgradnje glikogena, koji počinje preko adrenergičnih vlakana.

U jetri se, takođe, fosforilaza javlja u aktivnom i neaktivnom obliku, čiji je odnos kontrolisan. Međutim, jetrena fosforilaza se strukturno razlikuje od mišićne. Isto tako kontrolni mehanizam je podešen sa funkcijom jetrenog glikogena, da održava nivo glukoze u krvi. U vezi s tim u regulaciji učestvuje hormon glukagon, koga luči pankreas kada se koncentracija glukoze u krvi smanji.

Kao što smo videli krajnji produkt fos-forolitičkog razlaganja glikogena i skroba u ćeliji je glukozo-1-fosfat (slika 4.8) Dejstvom fosfoglukomutaze dolazi do premeštanja orto-fosfatnog ostatka sa položaja 1-glukoze na položaj 6, tako da nastaje glukozo-6-fosfat. Za aktivnost enzima je potrebno prisustvo Mg-+ jona i kofaktora glukozo-1,6-di fosfata, koji aktivno učestvuje u reakciji prenošenja orto-fosfata sa enzimskog molekula; fosfoglukomutaza sadrži, naime, ostatke fosfoserina, koji su bitni za enzimsku aktivnost. Reakcija se odvija u dva stepena:

Slika 4.8 - Reverzibilno prelaženje aktivne fosforilaze a u neaktivnu

fosforilazu b

1. Enzim–O–P+glukozo-1-fosfat→Enzim–OH+glukozo-1,6-difosfat

2. Enzim–OH+glukozo-1,6-difosfat→Enzim–O–P+glukozo-1-fosfat

U obliku G–6–P ulaze jedinice glukoze (glikozilni ostaci) iz glikogena u metabolički proces anaerobne razgradnje.

U jetri je prelaz glukozo-1-fosfata u glukozo-6-fosfat reakcija koja joj omogućava da održava koncentraciju glukoze u krvi na normalnom nivou. U jetri se nalazi enzim glukozo-6-fosfataza (a nema ga u mišićima) koja hidrolitički cepa ostatak fosforne kiseline iz G-6-fosfata:

D-glukozo-6-fosfat+H2O→D-glukoza + Pi

4.2.4 SINTEZA GLIKOGENA OD GLUKOZE (GLIKOGENOGENEZA)

Sinteza glikogena od glukoze odigrava se u jetri i mišićima na isti način.

Glukoza ulazi i u katabolične (glikoliza) i u anabolične procese (sinteza glikogena) u obliku svog fosfatnog estra glukozo-6-fosfata (G-6-P). Fosforilaciju glukoze u prisustvu ATP-a i Mg2+ jona katalizuju dva enzima; kod normalne koncentracije glukoze u krvi reakciju katalizuje

heksokinaza, a kod povećane (npr. u šećernoj bolesti) glukokinaza:

Heksokinaza i glukokinaza su transferni enzimi, koji prenose energiju sa ATP-a zajedno sa fosforil-ostatkom kao i sve kinaze. Njihov kosupstrat je MgATP2-. U mišićima se nalazi samo heksokinaza.

Sledeći korak u sintezi glikogena je prevođenje glukozo-6-fosfata u glukozo-1-fosfat. Reakciju katalizuje fosfoglukomutaza, o kojoj je već bilo govora.

Sinteza glikogena od glukozo-1-fosfata (G—I —P) ne ide na isti način kao njegova razgradnja: Ona se odvija u tri stepena. Za formiranje svake glukozidne veze potrebna je energija, koju u ovom slučaju neposredno daje uridin-trifosfat (UTP). Sam UTP nastaje prenošenjem energije sa ATP-a na uridin-difosfat (UDP) dejstvom nukleozid-difosfokinaze:

ATP + UDP ↔ ADP+UTP

Sinteza glikogena, a i ostalih disaharida i oligosaharida, odigrava se prenošenjem celih molekula glukoze (tačnije glukozila), koji se prvo energetski obogaćuju primanjem energije od UTP-a:

G – 1 – P + UTP → uridin-difosfat-glukoza+ PPi

U reakciji, koju katalizuje pirofosforilaza, nastaje uridin-difosfat glukoza (UDPG) i pirofosfat. Pirofosfat se vrlo brzo hidrolizuje u dva molekula fosfata, izlazi iz reakcije i ravnoteža se pomera na desnu stranu.

U drugom stepenu sinteze nastaje pravolinijski α-1.4 amilozni deo glikogena. Povezivanje jedinica glukoze α-1,4 vezom katalizuje enzim glikogen-sintetaza. To je transferaza, koja prenosi glukozilne ostatke od UDP-glukoze na 4 OH-grupu glukoze u postojećem amiloznom lancu (primer):

UDP-glukoza+(glukoza)n→UDP+(glukoza)n+1

Kada se na ovaj način izgradi lanac od 10-12 molekula glukoze, počinje proces grananja. Ovaj treći stepen sinteze glikogena katalizuje enzim »račvanja« (ili grananja), amilo-l,4-l,6-transglikozilaza. On skida završne glikozilne ostatke sa amiloznog dela (oko 6 ostataka) i prenosi ih na šestu OH-grupu glukoze u istom lancu ili na neki drugi pored njega (slika 4.9). Produživanje ovog novog lanca ide opet dejstvom glikogen-sintetaza.

Slika 4.9 - Grananje glikogena

4.2.5 KONTROLA SINTEZE GLIKOGENA U ŽIVOTINJA

Faktori koji kontrolišu sintezu i fosforolizu glikogena su detaljno ispitivani, jer je vrlo dugo poznato da su pod endokrinom kontrolom insulina, glukagona, steroidnih hormona, epinefrina i hormona rasta. Oni dejstvuju na različitim mestima u meta-bolizmu glukoze. Na slici 4.10 su dati najvažniji faktori, koji regulišu aktivnost glikogen sintetaze i fosforilaze u jetri.

Glikogen-sintetaza kao i fosforilaza postoji u dva oblika: »aktivni« I- (inde-pendent=nezavisna) i »neaktivni« D-oblik (dependent=zavisna). Nazivi »nezavis-na« i »zavisna« odnose se na to da li je aktivna ili nije u prisustvu alosternog akti-vatora glukozo-6-fosfata, jer je glikogen sintetaza I alosterni enzim. Obrnuto, nego što je slučaj kod fosforilaze, sintetaza je aktivna u defosforilisanom obliku. Ona se aktiviše dejstvom fosfataze, a inaktiviše kada se fosforilira dejstvom kinaze. Ki-naza, koju opet aktivira ciklični 3,5-adenozin monofosfat, verovatno je ista protein-kinaza, koja katalizuje aktivaciju fosforilaze b kinaze. I ovde postoji ste-penasti

regulacioni mehanizam, kojemu je početni signal hormonalna aktivacija adenil-ciklaze. Ovaj enzim je lociran u ćelijskoj membrani. Na ovaj način, adrenalin u mišićima i glukagon i adrenalin u jetri smanjuju brzinu sinteze glikogena istovre-meno kad pojačavaju njegovu razgradnju.

Slika 4.10 - Najvažniji faktori regulacije aktivnosti glikogen sintetaze i fosforilaze

u jetri

4.2.6 GLIKOLIZA

Razlaganje skroba i glikogena je samo priprema rezervnih ugljenih hidrata da uđu u metabolični proces u kome se iz glukoze dobija energija u obliku adenozin-trifosfata (ATP). Razgradnja glukoze može da se odvija anaerobno i aerobno.

Anaerobna razgradnja glukoze ili fermentacija je najprimitivniji proces, koji se zadržao po filogenetskom nasleđu i u visoko diferenciranim organizmima. Naime život je na zemlji nastao kada u atmosferi nije bilo kiseonika, nego azota, amoni-jaka i CO2, pa su se živa bića morala da prilagode anaerobnim uslovima. Zbog toga je anaerobna razgradnja glukoze, koja se naziva i glikoliza, najprostiji biološki proces i jedini koji u anaerobnim organizmima dobija energiju iz glukoze. Viši organizmi su zadržali glikolitički put, kao početak aerobnog cepanja glukoze. Glikoliza je u njih, pored toga, i rezervni, uvek prisutan proces, da u nedostatku kise-onika ili krajnjem naporu mišići mogu da se snabde energijom:

Anaerobni uslovi:

glukoza fermentacioni produkti

Aerobni uslovi:

glukoza fermentacioni produkti CO2+H2O

Fermentacija je kao i respiracija oksido-redukcioni proces u kome dolazi do prenosa elektrona. Oni se razlikuju po krajnjem primaocu elektrona: u fermentaciji je to neko organsko jedinjenje, koje nastaje u toku samo fermentacije (npr. pirogrožđana kiselina), a u respiraciji je krajnji primalac elektrona kiseonik. Zbog toga što se dešava anaerobno, u fermentaciji dolazi samo do intramolekulske oksido-redukcije, a krajnji proizvod se nalazi na istom oksido-redukcionom stepenu kao i početni supstrat — glukoza. To jasno proizlazi iz sadržaja vodonika u molekulu: glukoza sadrži dva vodonika na atom ugljenika (C6H12O6), kao i krajnji proizvod mlečno-kiselinskog vrenja, mlečna kiselina (C3H6O3).

Najčešća dva tipa fermentacije glukoze su: mlečno-kiselinsko i alkoholno vrenje. Putevi razgradnje glukoze su identični u oba, razlika postoji samo u krajnjem proizvodu. U mlečno-kiselinskom vrenju krajnji proizvod je mlečna kiselina:

C6H12O5 → 2 CH3CHOHCOOH

a u alkoholnom, etanol i CO2:

C6H12O6 → 2CH3CH2OH + 2CO2

I u jednom i drugom oslobađa se dovoljno energije, tako da nastaju dva mola ade-nozin-trifosfata pro mol glukoze. Na osnovu toga, reakcije glikolize su pomerene u pravcu nastajanja laktata. Videćemo, međutim, kasnije da mnoge reakcije glikolize prati mala promena slobodne energije i da mogu da teku reverzibilno u pravcu bio-sinteze glukoze od laktata.

Glikoliza se odvija u 11 uzastopnih reakcija, od kojih su samo tri ireverzibilne. Enzimi glikolize su rastvoreni u citoplazmi i ona teče u citoplazmi. U toku glikolitičnog razlaganja glukoze izdvajaju se dva stepena. U prvom se unosi energija u obliku dva mola ATP-a, a u drugom dolazi do oslobađanja 4 mola ATP-a.

I stepen glikolize (početne reakcije)

U početnom stepenu glikolize pripremaju se glukoza i drugi monosaharidi (manoza, galaktoza, pentoze) za ulazak u razgradnju, koji se sastoji u tome da se neutralni molekul monosaharida prevede u energetski bogatije jedinjenje. Ćelija uvek radi ekonomično, pa tako i ovde sve monosaharide prevodi u jedno zajedničko jedinjenje glukozo-6-fosfat (G-

6-P). Kao što je već ranije rečeno ovu reakciju katalizuje heksokinaza pod normalnim uslovima:

ATP + α-D-glukoza → ADP+G-6-P ΔG°' = -16,7 kJ

heksokinaza je nisko specifičan enzim, tako da može da fosforiliše i manozu i fruktozu na položaju šest. Reakcija heksokinaze je ireverzibilna, jer je egzergonska i teče uz potrošnju ATP-a.

Glukozo-1-fosfat, koji nastaje razgradnjom glikogena, nalazi se na istom ener-getskom nivou kao i glukozo 6-fosfat. G-l-P prelazi u G-6-P dejstvom fosfogluko-mutaze, o kojoj je bilo govora kod razgradnje glikogena.

Slika 4.11 - Prvi stepen glikolitičke razgradnje monosaharida

U drugoj reakciji glikolize, glukozo-6-fosfat (G-6-P) prelazi u izomerni fruktozo-6-fosfat (F-6-P). Reakciju katalizuje jedna izomeraza, glukozofosfat-izomeraza (5.3.1.9):

α-D-glukozo-6-fosfat ↔ α-D-fruktozo-6-fosfat

Fruktozo-6-fosfat ima kao derivat fruktoze petočlani prsten, pa je reaktivniji od glukozo-6-fosfata. Reakcija je reverzibilna.

Treća reakcija glikolize je slična prvoj, po tome što je to još jedno mesto aktivacije uz potrošnju drugog mola ATP-a. Energija se prenosi dejstvom fosfofruktokinaze (2.7.1.11) koja kao i sve kinaze, radi u prisustvu Mg2+jona. Fruktozo-6-fosfat prelazi u energetski bogatije jedinjenje fruktozo-l,6-difosfat:

ATP+D-fruktozo-6-fosfat ↔ ADP+D-fruktozo-l,6-difosfat ΔG° = -14,2 kJ

Reakcija je iz energetskih razloga ireverzibilna. Jedan drugi enzim (fruktozo-1,6-fosfataza) prevodi fruktozo-l,6-difosfat u fruktozo-6-fosfat.

Fosfofruktokinaza je regulatorni enzim, koji ima bitnu ulogu u regulaciji glikolize. Njegovi pozitivni modulatori su ADP i AMP.

Energijom bogati fruktozo-l,6-difosfat, u sledećoj reakciji glikolize, razlaže se u dva šećera sa tri C-atoma

D-fruktozo-l,6-difosfat ↔ dihidroksiaceton fosfat+D-glicerinaldehid-3-fosfatΔG°' = + 30kJ

Reakciju katalizuje jedna liaza, aldolaza (4.1.2.13). To je vrlo rasprostranjeni enzim, za čiju su katalitičku aktivnost bitne slobodne— SH grupe.

Prema promeni slobodne energije, ravnoteža reakcije aldolaze bi trebala da bude na strani fruktozo-l,6-difosfata. Međutim, ravnoteža je na strani trioza, jer je jedna od njih, glicerinaldehid-3-fosfat, supstrat sledeće reakcije. Kao takav, on stalno izlazi iz reakcije, usled čega se ravnoteža stalno pomera na desnu stranu. Iz istog razloga, odnosno da bi se obezbedile dovoljne količine glicerinaldehid-3-fosfata za daljnu razgradnju, i dihidroksiaceton-fosfat reverzibilno prelazi u glicerin-aldehid-3-fosfat

dihidroksiaceton-fosfat ↔D-glicerinaldehid-3-fosfat

Ovu reverzibilnu izomerizaciju katalizuje triozofosfat-izomeraza (5.3.1.1).

Cepanjem fruktozo-l,6-difosfata u dve trioze završava se prvi stepen glikolize. U njemu se sve heksoze prevode u zajednički produkt D-glicerinaldehid-3-fosfat, što znači da su od jedinjenja sa 6 C-atoma (heksoza) nastala dva sa po 3 C-atoma (trioze). Za ovu razgradnju utrošena su dva mola adenozin-trifosfata.

II stepen glikolize

U drugom delu glikolize dolazi do oslobađanja energije u obliku 4 mola ATP-a (od svake jedinice sa 3 C-atoma po dva ATP-a).

Prva reakcija počinje oksidacijom D-glicerinaldehid-3-fosfata u 1,3-difosfo-glicerinsku kiselinu:

D-glicerinaldehid-3-fosfat + NAD+Pi → 1,3-difosfoglicerat + NADH + H+

ΔG°' = + 6,3kJ

Reakciju katalizuje NAD specifična glicerinaldehid-3-fosfat dehidrogenaza. Oksidaciono sredstvo ove reakcije je koenzim NAD, koji se redukuje u NADH preuzimanjem vodonika. Ova reakcija je već prodiskutovana u poglavlju o enzimima.

U gornjoj reakciji proizvod oksidacije D-glicerinaldehid-3-fosfata, nije slobona kiselina, već njen anhidrid sa fosfornom kiselinom, 1,3-difosfoglicerat. Znači da se istovremeno sa oksidacijom odigravao i proces fosforilacije produkta. Ovako spregnuti procesi, se nazivaju oksidativna fosforilacija na nivou supstrata. Pomoću njih ćelija ne dozvoljava da se energija oksidacija gubi u vidu toplote, već ih hvata (konzerviše) u vidu energetski bogatih jedinjenja, kao što je u našem primeru 1,3-difosfoglicerat. Pokušaćemo da objasnimo ovaj proces, uzimajući da se odigravaju dve reakcije povezane preko zajedničkog intermedijera:

1. oksidacija aldehida u kiselinu

R–CHO+H2O+NAD+→COO-+NADH+2H+

Reakcija je egzergonska, oslobađa se energija ΔG°' = – 43 kJ

2. fosforilacija nastale kiseline u produkt u koji je ugrađena energija oksidacije:

Reakcija je endergonska i teče samo spregnuta sa reakcijom oksidacije.

Zbirna promena energije iznosi:

ΔG0l = -43 + 49,4 = 6,3kJ

Mehanizam ove reakcije je detaljno studiran i može se naći u udžbenicima enzimologije.

Energija može u ćeliji da se prenosi sa kataboličnih na anabolične procese jedino pomoću sistema ATP-ADP. Zato se i u procesu glikolize energija sadržana u 1,3-difosfogliceratu prenosi na ADP:

1,3-difosfoglicerat+ADP → 3-fosfoglicerat+ATP DG°'=–18,8 kJ

Prenošenje energije katalizuje jedna kinaza, fosfoglicerat-kinaza (2.7.2.3). Ovom reakcijom je završen proces oksidacije glicerinaldehid-3-fosfata i dobijen prvi mol ATP-a, odnosno od svake trioze po jedan.

Sledeća reakcija je u stvari priprema 3-fosfoglicerata za drugu, intramolekulsku oksidaciju, premeštanjem ostatka fosforne kiseline sa položaja 3 na položaj 2:

Ovu reverzibilnu reakciju katalizuje jedna izomeraza, fosfogliceromutaza (5.4.2.1).

Druga reakcija glikolize u kojoj se dobija energija, je odvajanje molekula vode iz 2-fosfoglicerata. Produkt reakcije je energetski bogato jedinjenje, fosfoenolpiruvat, koje hidrolizom oslobađa —62 kJ:

Reakciju katalizuje enolaza (4.2.1.11), koja pripada rodu liaza. Ako pogledamo formulu fosfoenolpiruvata vidimo da je gubitkom vode došlo do intramolekulske oksidacije na drugom C-atomu i to na račun redukcije prvog C-atoma. Karboksilna grupa je najviši oksidacioni stepen ugljenika i ona se u toj reakciji nije promenila (treći C-atom).,

Energija se sa fosfoenolpiruvata prenosi, dejstvom piruvat kinaze (2.7.1.40), na ADP, tako da se u ovoj reakciji dobija drugi mol ATP-a od jedne trioze:

fosfoenolpiruvat+ADP → piruvat+ATP ΔG°' = - 31,4 kJ

Reakcija je egzergonska i ireverzibilna pod intracelularnim uslovima. To znači da sintezu fosfoenolpiruvata od piruvata katalizuju drugi enzimi. Piruvat kinazu inhibišu NADH, citrat i ATP. Ireverzibilne reakcije glikolize su, dakle, reakcija: heksokinaze, fosfofrukto kinaze i piruvat kinaze. Prve dve troše po jedan ATP, a u trećoj se dobija.

U poslednjoj reakciji glikolize piruvat se redukuje u laktat, dejstvom NAD specifične laktat-dehidrogenaze:

Redukciono sredstvo u gornjoj reakciji je NADH, koji je nastao prilikom oksidacije glicerinaldehid 3-fosfata (prva reakcija II stepena). Na osnovu promene slobodne energije, vidi se da je ravnoteža pomerena na strani laktata.

Poslednja reakcija glikolize, nastajanje laktata od piruvata, odigrava se samo pod anaerobnim uslovima, odnosno kada je ćeliji potrebno više energije, nego što može da dobije aerobnom oksidacijom piruvata u mitohondrijama. Dobar primer nastajanja takve situacije je kod napornog fizičkog rada, kada su se rezerve glikogena razgradile do piruvata, a nastali NADH ne može, zbog nedostatka kiseonika da se reoksidiše u

NAD. Da bi se omogućilo da glikoliza teče, NADH se reoksidiše u reakciji laktat-dehidrogenaze.

Koncentracija laktata u krvi čoveka, u stanju mirovanja, iznosi 0,5-1,5 mmol/1 Za vreme fizičkog rada, ona može da poraste i do 20 mmol/1. Od nagomilanog laktata nastaje u jetri glukoza (glukoneogeneza). Na taj način se nadoknađuju zalihe glikogena u mišićima, kad kontrakcija prestane.

Kao što je ranije rečeno identifikovano je pet izoenzima laktat-dehidrogenaze. Njihove relativne koncentracije variraju u zavisnosti od funkcije tkiva ili organa.

4.2.7 ALKOHOLNO VRENJE

Alkoholno vrenje se razlikuje od glikolize (mlečno-kiselinskog vrenja) po krajnjem produktu. U prvom je krajnji produkt alkohol, a u drugom mlečna kiselina:

Kao što se vidi iz toka reakcija, u alkoholnoj fermentaciji sudeluju još dva enzima.-piruvat-dekarboksilaza (4.1.1.1) i alkohol-dehidrogenaza (1.1.1.1). Dejstvom prvog enzima, koji ima za prostetičnu grupu tiamin pirofosfat (TPP piruvat se dekar-boksilira, gubi CO2, i prelazi u acetaldehid. U drugoj reakciji acetaldehid se redukuje u etanol, a redukciono sredstvo je NADH.

Kao što se vidi u alkoholnoj fermentaciji je nastajanje etanola direktno analogno nastajanju laktata, jer i u jednoj i drugoj reakciji dolazi do reoksidacije NAD. Ovim reakcijama se obnavlja NAD+ za reakciju oksidacije glicerinaldehid 3-fosfata, a time ponovni tok glikolize.

4.2.8 ENERGETSKI BILANS GLIKOLIZE

U toku anaerobne glikolize, kada je laktat krajnji proizvod, dobijaju se dva mola ATP-a na svaki mol razgrađene glukoze.

Pod aerobnim uslovima, kada piruvat u obliku acetil-koenzima-A ulazi u ciklus limunske kiseline, nastaju pored dva mola ATP-a i dva mola redukovanog nikotinamid dinukleotida (NADH). Ta dva mola NADH su

energetski ekvivalentna sa šest mola ATP-a, kada se oksiduju u lancu disanja. Zbog toga je celokupni dobitak ATP- pod aerobnim uslovima 8 mola ATP-a na svaki mol glukoze.

U slučaju kada je glikogen supstrat glikolize, pa se glukozo-6-fosfat stvara bez utroška jednog ATP-a, onda je dobitak energije veći za jedan mol ATP-a. On tada iznosi za anaerobne uslove tri mola, a za aerobne devet mola ATP-a po metabolizovanom glukozilnom ostatku.

4.2.9 GLUKONEOGENEZA I GLIKONEOGENEZA

Pod glukoneogenezom se podrazumeva sinteza glukoze od neugljenohidratnih jedinjenja, kao što su laktat, piruvat i proizvodi nastali dezaminacijom aminokiselina. Glikoneogeneza ili tačnije glikogenogeneza, je sinteza glikogena iz tih istih jedinjenja.

Glikoneogeneza je u suštini obratni proces od glikolize i mnogi intermedijeri i enzimi su zajednički u oba puta. Glukoneogeneza se odvija u jetri, mada i neki drugi organi, a naročito bubreg, mogu da sintetišu glukozu na taj način. U skeletnim mišićima praktično nema enzima specifičnih za glukoneogenezu, pa zato laktat, koji nastaje za vreme kontrakcije, mora krvotokom da dospe u jetru da bi poslužio kao supstrat za sintezu glukoze.

Videli smo da su u toku anaerobne razgradnje glukoze tri reakcije (zbog velike promene slobodne energije), ireverzibilne: 1.) prelaženje glukoze u glukozo-6-fosfat, 2.) nastajanje fruktoze-l,6-difosfata od fruktozo-6-fosfata i 3.) fosfoenolpiruvata od piruvata. Zbog toga u sintezi postoje posebni enzimi, koji zaobilaze gornje ireverzibilne reakcije.

Nastajanje fosfoenolpiruvata od piruvata. - Fosforilacija piruvata u fosfoenol-piruvat odigrava se u nizu reakcija, dejstvom enzima koji se nalaze i u mitohondrijama i u citoplazmi. Prvo dolazi do karboksilacije piruvata (vezivanja CO2) pri čemu nastaje oksalacetat:

Ovu reakciju katalizuje mitohondrijalni enzim, piruvat karboksilaza, čija je prostetična grupa biotin. Enzim je aktivan samo u prisustvu acetil-KoA. Energiju za karboksilaciju piruvata daje ATP. Nastali oksalacetat, konačno reaguje sa GTP-om prelazeći u fosfoenolpiruvat:

Enzim koji katalizuje ovu reakciju, fosfoenolkarboksikinaza, nalazi se u citoplazmi, a oksalacetat nastaje u mitohondrijama. Pošto je mitohondrijalna membrana nepermeabilna za oksalacetat, postoji zaobilazni mehanizam, koji omogućava njegov izlaz u citoplazmu. U ovom prenosu učestvuju dva razna enzima, koja katalizuju istu reakciju i koja su smeštena s obe strane membrane, a to su mitohondrijalna i citoplazmatska malat-dehidrogenaza. U mitohondrijama se nastali oksalacetat prvo redukuje u prisustvu mitohondrijalnog NADH u malat:

Malat difunduje iz mitohondrija u citoplazmu, gde se ponova oksiduje u oksalacet dejstvom citoplazmatskog enzima.

Slika 4.12 - Nastajanje fosofoenolpiruvata iz piruvata, zaobilaznim prenosom oksalacetata kroz mitohondrijalnu membranu

Ukupna promena nastajanja fosfoenolpiruvata može se izraziti sledećom reakcijom: piruvat + ATP + GTP→fosfoenolpiruvat + ADP + GDP + Pi

Promena slobodne energije ove reakcije je mala (ΔG°' = + 0,8 kJ) i ona je reverzibilna. Znači da će se fosfoenolpiruvat stvarati kada god ima dovoljno piruvata i kada je odnos ATP/ADP veliki.

Ne treba da se zaboravi da je u toku reakcije došlo i do prenosa dva vodonikova atoma od mitohondrijalnog NADH (vezanih za malat) na citoplazmatski NAD+.

U mitohondrijama ima više redukovanog NADH, a u citozolu oksidovanog oblika NAD+. Zbog toga su u mitohodrijama pogodni uslovi za redukciju oksalacetata u malat, a u citozolu za oksidaciju malata u oksalacetat.

Drugo mesto glukoneogeneze koje treba da se zaobiđe je da od fruktoze-1,6-difosfata nastane fruktozo-6-fosfat. Ovaj prelaz se ostvaruje dejstvom hidrolitičnog enzima fruktozo-6-fosfataze:

fruktozo-l,6-difosfat+H2O → fruktozo-6-fosfat + Pi

Ne sličan način se i treće mesto glukoneogeneze zaobilazi, dejstvom glukozo-6-fosfataze, koja oslobađa glukozu iz njenog estra, glukozo-6-fosfata:

fruktozo-l,6-difosfat+H2O → glukoza+Pi

Ovaj enzim se nalazi samo u jetri. O njegovoj ulozi u snabdevanju krvi glukozom bilo je već ranije opisano. On svoju funkciju obavlja bez obzira da li je glukozo-6-fosfat intermedijer u razgradnji glikogena ili je nastao u procesu glukoneogeneze.

4.2.10 METABOLIZAM FRUKTOZE I GALAKTOZE

Pored glukoze u hrani se nalaze još dve veoma važne heksoze, fruktoza i galaktoza. Prva potiče uglavnom od saharoze, a druga od mlečne laktoze, pa je njen metabolizam važan u prvoj godini života.

Fruktoza može dejstvom heksokinaze da se fosforiliše u fruktozo-6-fosfat i tako uđe u proces glikolize. Međutim, najveći deo fruktoze ulazi drugim putem u glikolizu. Dejstvom specifične fruktokinaze uz utrošak jednog ATP-a nastaje fruktozo-1-fosfat:

D-fruktoza + ATP→D-fruktozo-1-fosfat+ADP

Tako nastali fruktozo-1-fosfat se cepa u D-gliceraldehid i dihidroksiaceton-fosfat dejstvom enzima, koji se nalazi samo u jetri (fruktozo-1-fosfat aldolaza):

fruktozo-1-fosfat → D-gliceraldehid + dihidroksiaceton-fosfat

D-Gliceraldehid ulazi, posle fosforilacije u 3-fosfogliceraldehid, u proces glikolize: D-gliceraldehid + ATP → 3-fosfoglicerladehid + ADP

Galaktoza posle niza promena u kojima sudeluju tri enzima, ulazi u metabolizam u obliku glukoze-1-fosfat (slika 4.13). Kao što se na slici vidi prvo dolazi do fosforilacije u galaktozo-1-fosfat, dejstvom specifične galaktokinaze i utrošak jednog ATP-a. Zatim, se dejstvom jedne transferaze (fosfogalaktozo-uridiltransferaza) prenosi galaktoza na uridin-difosfat (UDP). U toj reakciji nastaje UDP-galaktoza i glukozo-1-fosfat. Dejstvom jedne epimeraze dolazi do promene položaja OH-grupa na 4 C-atomu galaktoze i UDP-galaktoza se epimerizuje u UDP-glukozu.

Slika 4.13 - Nastajanje glukozo-1-fosfata od galaktoze-1-fosfata

Kod male dece koja nemaju uridil-transferazu dolazi do nagomilavanja galaktoze i galaktozo-1-fosfata u krvi (galaktozemija).

4.2.11 METABOLIZAM GLICEROLA

O metabolizmu glicerola govorićemo na ovom mestu, jer je povezan sa reakcijama glikolize i glukoneogeneze.

Glicerol je sastavni deo mnogih lipida i kao sastojak neutralnih masti unosi se s hranom u većim količinama. Dejstvom dva enzima, glicerokinaze i α-glicerofosfat-dehidrogenaze prelazi glicerol u dihidroksiacetonfosfat:

Glicerol može da se sintetiše obratnim smerom gornjih reakcija, izuzev što se fosforna grupa α-glicerofosfata hidrolitički odvaja dejstvom α-glicerofosfataze.

4.2.12 AEROBNI METABOLIZAM PIRUVATA: CIKLUS TRIKARBONSKIH KISELINA

Videli smo da se u toku anaerobne glikolize, glukoza (ili glikogen) razgrađuje u laktat. Za vreme te razgradnje oslobađa se samo mali deo energije koju sadrži glukoza (2 ATP-a), a najveći deo ostaje vezan u laktatu:

Glukoza → 2 laktata ΔG°'=-196,7 kJ

Slobodna energija, koju sadrži glukoza, oslobađa se njenom potpunom oksidacijom u prisustvu kiseonika, a to se dešava kada ćelija diše:

glukoza+6 O2→6CO2 + 6H2O ΔG°'=-2 871 kJ

Prema tome, ćelija pod anaerobnim uslovima mora da potroši daleko veće količine glukoze, da bi dobila potrebnu energiju, nego pod aerobnim. Glikoliza teče, dakle, vrlo brzo u odsustvu kiseonika. Uvođenjem kiseonika, ona se usporava i prestaje nagomilavanje laktata. Pojavu inhibicije glikolize (ili potrošnje glukoze) posle uvođenja kiseonika, prvi je zapazio Pasteur i ona se po njemu zove Pasteur-ov efekt.

Organizacija aerobnog metabolizma prikazana je na slici 4.13. Ona se odvija u tri stepena:

1) nastajanje acetil-KoA iz piruvata, masnih i aminokiselina,

2) oksidacija acetil-ostatka (2 C-atoma) u CO2 i H-atoma u ciklusu trikarbonskih kiselina i

3) transport elektronskih ekvivalenata (4x2 H) do molekulskog kiseonika. Ovaj poslednji stepen je praćen dobijanjem energije u obliku ATP-a i zove se oksidativna fosforilacija.

Kao što se na slici 4.14 vidi, svi hranljivi sastojci oksidativnom razgradnjom prelaze u jedan krajnji proizvod, koji ima dva C-atoma: aktivnu sirćetnu kiselinu ili acetil-KoA. On se oksiduje u CO2 i H-atome, u kružnom procesu, koji se zove ciklus trikarbonskih kiselina ili ciklus limunske kiseline (CLK). CLK je centralno mesto u kome se oksiduju krajnji proizvodi svih kataboličnih puteva: piruvat dobijen iz ugijenih hidrata, acetil-KoA iz masti, α-ketoglutarat, fumarat i oksalacetat iz amino-kiselina. Ovaj centralni proces objasnio je Krebs (1937 g.) i po njemu se zove i Krebs-ov ciklus.

Ukupna promena, koja se odigrava u Krebs-ovom ciklusu je:

CH3COOH + 2H2O→2CO2 + 8H

Kao što se vidi iz jednačine u CLK ne sudeluje molekulski kiseonik, ni neorganski fosfat, a ni ATP. Njegova prvenstvena uloga sastoji se u tome da dehidrogenira (oduzme vodonikove atome) sirćetnu kiselinu do CO2 i 8 H. Za razliku od glikolize, Krebs-ov ciklus je kružni proces u koji ulaze ostaci od 2 C-atoma kondenzacijom sa jedinjenjem od 4 C-atoma (oksalsirćetnom kiselinom) u jedinjenje od 6 C-atoma, limunsku kiselinu. Ona se u ciklusu razgrađuje u dva molekula CO, i jedinjenje sa 4 C-atoma, ćilibarnu kiselinu. Oksidacijom ćilibarne kiseline u oksalsirćetnu, krug se završava i može ponova da uđe novi ostatak od 2 C-atoma. Pošto je proces kružni, to male količine oksalsirćetne kiseline mogu da posluže za razgradnju neograničene količine ostataka sirćetne kiseline.

8 H-atoma, koji nastaju u CLK razgradnjom jednog ostatka sirćetne kiseline oksiduju se dalje u lancu disanja spajanjem s molekulskim kiseonikom u H2O i kod toga se dobija velika količina energije (11 ATP-a = 341 kJ / za 2 C-ostatka).

Slika 4.14 - Organizacija aerobnog metabolizma. Krajnji proizvod svakog stepena je zaokružen

Za razliku od glikolize, koja se odigrava u citozolu ili »rastvorljivoj« frakciji ćelije, oksidativni metabolizam se odigrava u mitohondrijama. Enzimi koji

katalizuju respiraciju nalaze se, dakle, u mitohondrijama i to neki u matriksu, a neki čvrsto vezani za unutrašnju membranu . Pojedine reakcije CLK mogu da se odigraju i van mitohondrija, naravno uz katalitičko dejstvo drugih enzima. Ovakvo enzimsko dupliranje se javlja zbog nepermeabilnosti unutrašnje membrane mitohondrija za neke metabolite.

4.2.13 OKSIDACIJA PIRUVATA U ACETIL-KoA

Oksidacija piruvata u acetil-KoA je jedini put uključivanja ugljenih hidrata u aerobni metabolizam, odnosno CLK. Oksidaciju katalizuje multienzimski kompleks piruvat-dehidrogenaze, koji se sastoji od tri enzima: piruvat-dekarboksilaze (E1–4.1.1.1), liponil-reduktaza-transacetilaze (E2–2.3.1.12) i flavoenzim dihidroliponil-dehidrogenaze (E3- 1.6.4.3). U reakcijama učestvuju pet koenzima: tiamin-pirofosfat (TPP), vezan kao E1-TPP, liponska kiselina vezana za E2, koenzim A, flavinadenin-dinukleotid (E3-FAD) i nikotinamid adenin-dinukleotid (NAD+). Reakcija oksidacije počinje dekarboksilacijom piruvata, a njegov ostatak se vezuje za TPP u obliku hidroksietil derivata:

1) E1-TPP+CH3COCOOH→E1-TPP-CHOH-CO3+CO2

Dejstvom drugog enzima hidroksietil-ostatak se prenosi na liponsku kiselinu, koja ga istovremeno oksiduje u acetil-ostatak:

U ovoj oksidacionoj reakciji liponska kiselina se redukovala. Nastala acetilna grupa za E2 prenosi se na tiolnu grupu koenzima A, koji prelazi u acetil-KoA:

Acetil-KoA otkida se s enzimskog kompleksa i ulazi u CLK. Redukovanu liponsku kiselinu reoksiduje treći flavoenzim, sastavni deo kompleksa:

Prostetičnu grupu flavoenzima reoksiduje NAD+, koji se redukuje u NADH.a njegovom oksidacijom u respiratornom lancu dobijaju se 3 ATP-a.

Odigravanje ovog niza reakcija predstavljeno je na slici 4.15 iz koje se vidi da liponska kiselina vezana za peptidni lanac enzima (E2), prenosi kao neka poluga ostatak piruvata sa piruvat dekarboksilaze (E1) na koenzim A, a vodonikove atome na E3 flavoenzim (E3-FAD).

Slika 4.15 - Liponska kiselina vezana za peptidni lanac liponilreduktaze-transacetilaze (E2) prenosi acetilni ostatak na HS-KoA, a elektrone (H) na

flavoenzim(E3-FAB)

Zbirna reakcija oksidativne dekarboksilacije piruvata je

CH3COCOOH+NAD++HS-KOA→CH3CO-S- KOA+NADH+H+ CO2

Oksidativna dekarboksilacija je praćena velikom promenom slobodne energije (ΔG°'= 33,5 kJ), pa je prema tome ireverzibilna. Iz toga proizlazi da acetil-KoA ne može da pređe u piruvat karboksilacijom i da tako posluži kao supstrat za glukoneogenezu. Zato se ugljeni hidrati ne mogu da sintetišu od acetil-KoA ili od masnih kiselina, čija razgradnja ide preko acetil-KoA.

Oksidacija piruvata je potpuno analogna oksidaciji α-ketoglutarne kiseline u: sukcinil-KoA. U oba slučaja dolazi do dekarboksilacije jedne keto-kiseline i nastajanja derivata koenzima A.

4.2.14 POJEDINE REAKCIJE CIKLUSA TRIKARBONSKIH KISELINA

Stvaranja citrata. - Inicijalna reakcija ciklusa trikarbonskih kiselina koja daje početnu energiju, je aldolna kondenzacija acetil-KoA i oksalacetata (OA) u limunsku kiselinu:

Reakcija je egzergonska (DG°'=–32,2 kJ), jer se dešava hidroliza tioestarske veze acetil-KoA a pomerena je na stranu citrata. Reakciju katalizuje regulatorni enzim citrat-sintaza. Jaki inhibitor ove reakcije u većini organizma je ATP, a u E.Coli i NADH.

Ravnoteža akonitaze. - Enzim akonitaza katalizuje reverzibilno prelaženje citrata u L-izocitrat, preko nezasićene cis-akonitne kiseline. U reakciji dolazi do intramolekulskog premeštanja molekula vode tako, da od simetričnog molekula citrata nastaje asimetrični L-izocitrat. Fe2+joni aktivišu akonitazu.

Slika 4.16 - Ravnoteža akonitoze Zvezdicama su obeleženi C-atomi, koji potiču od acetil-KoA

Pretpostavlja se da u toku reakcije, Fe2+ koje ima šest koordinativnih veza gradi kompleks i sa enzimom i citratom i učestvuje u prenošenju H-atoma i OH- grupe vode sa trećeg C-atoma citrata na drugi.

U Krebs-ovom ciklusu se simetrični molekul citrata ponaša kao asimetričan, jer mu krajnje (—CH2—COOH) grupe nisu ekvivalentne. O ovome će biti kasnije govora.

Reakcija NAD specifične izocitrat-dehidrogenaze

Oksidaciju L-izocitrata u α-ketoglutarat katalizuju dva enzima: NAD i NADP specifične izocitrat-dehidrogenaze:

Izocitrat + NAD+(NADP+) → α-ketoglutarat+NADH(NADPH) + CO2 + H+

NAD specifičan enzim se nalazi samo u mitohondrijama i on katalizuje oksidaciju izocitrata u Krebs-ovom ciklusu. To je regulatorni enzim, za čiju je punu aktivnost potrebno prisustvo Mg2+ ili Mn2+ jona. Pozitivni modulator NAD-specifične izocitrat-dehidrogenaze je ADP, pa prema tome i brzina rada ciklusa zavisi od odnosa koncentracija ATP : ADP i NADH : NAD+.

NADP-specifična izocitrat-dehidrogenaza nije alosterni enzim, a nalazi se i u citozolu. Ona igra ulogu u biosintetskim reakcijama za koje obezbeđuje dovoljne količine redukovanog NADH, kao i α-ketoglutarat za procese transaminacije.

Oksidacija α-ketoglutarata u sukcinat

Oksidacija α-ketoglutarata u sukcinat odigrava se u dva stepena: prvo se α-ketoglutarat oksidativno dekarboksilira u sukcinil-KoA:

α-ketoglutarat + NAD+ + HS - KoA→sukcinil-KoA + CO2 + NADH + H+

Reakcija je egzergonska (ΔG°' = -33,5 kJ) i ireverzibilna. Mehanizam reakcije je analogan oksidativnoj dekarboksilaciji piruvata. U reakciji učestvuju isti koenzimi: TPP, liponska kiselina, HS—KoA, FAD i NAD+. Kranji produkt gornje reakcije sukcinil-KoA sadrži energetski bogatu tioestarsku vezu kao i acetil-KoA. Razlika između ova dva derivata koenzima A je u tome što acetil-KoA obezbeđuje energiju za inicijalnu reakciju Krebs-ovog ciklusa (reakciju citrat-sintaze), a drugi predaje energiju, koja se na kraju odlaže u obliku ATP-a. Drugi stepen oksidacije α-keto-glutarata je prenos energije na gvanidin-difosfat u prisustvu neorganskog fosfata (Pi):

sukcinil-KoA+Pi + GDP → sukcinat +GTP + HS – KoA

Reakciju katalizuje sukcinil-tiokinaza. Ovo je primer fosforilacije na nivou supstrata u CLK. Sličan primer smo imali kod glikolize u reakciji piruvat-kinaze.

U gornjoj reakciji nastali GTP lako predaje energiju krajnjeg fosforil-ostatka adenozin-difosfatu dejstvom nukleozid-difosfat-kinaze :

GTP + ADP → GDP + ATP

Sukcinil-KoA sudeluje takođe i u reakcijama prenosa koenzima A na druge karbonske kiseline. Tako je npr. sledeća reakcija prenosa na acetoacetat bitna u metabolizmu ketonskih tela.

Reakcija sukcinat-dehidrogenaze. - Dejstvom flavoenzima sukcinat-dehidro-genaze, sukcinat se oksiduje u fumarat, a koenzim FAD se redukuje u FADH2:

Oksidacija sukcinata razlikuje se od ostalih oksidacija u CLK, što u njoj učestvuje FAD, a ne NAD. Prenosom vodonika u lancu disanja od FAD dobijaju se samo dva mola ATP-a. Sukcinat-dehidrogenaza ima neke osobine alosternih enzima. Aktivišu je fosfati, sukcinat i malat, a dikarbonske kiseline (malonska i oksal-sirćetna) je kompetitivno inhibiraju. Nagomilavanje oksalsirćetne kiseline, koja. nastaje u zadnjoj reakciji ciklusa trikarbonskih kiselina, reguliše kao kompetitivni inhibitor svoju sopstvenu sintezu.

Fumaraza katalizije reverzibilnu hidrataciju fumarata u L- malat:

Fumaraza deluje stereospecifično, jer se stvara (a i dehidrira) samo L-stereoizomer malata.

Oksidacija malata u oksalacetat. - U zadnjoj reakciji ciklusa NAD-specifična malat - dehidrogenaza katalizuje oksidaciju L-malata u oksalacetat:

Iako je reakcija endergonska, ona teče u pravcu nastajanja oksalacetata, jer on odmah reaguje s acetil-KoA i reakcija se pomera na desnu stranu.

Kružni proces oksidacije acetil-KoA završava se, dakle, ponovnim nastajanjem oksalacetata. Zbog toga male količine ove kiseline omogućuju oksidaciju veoma velikih količina piruvata, ili tačnije acetil-KoA.

4.2.15 ENERGETSKI DOBITAK AEROBNE RAZGRADNJE GLUKOZE

Videli smo da se piruvat oksiduje u CLK do C02, u pet oksidacionih reakcija. U svakom oksidacionom stepenu izgubi po jedan par vodonikovih atoma, ukupno 5x2H. Ovi vodonikovi atomi se u lancu disanja prenose do kiseonika i oksiduju u vodu. Četiri para vodonika ulaze vezani za NADH, a jedan za FADH2 sukcinat-dehidrogenaze. U prvom prenosu nastaju oksidativnom fosforilacijom 3 ATP-a na svaki par vodonika, a u drugom 2 ATP-a, ukupno 12 ATP-a. Ako ovome dodamo i onaj ATP-koji se dobija prilikom oksidativne dekarboksilacije α-ketoglutarne kiseline, prenosom energije sa sukcinil-KoA na GDP, onda je ukupan dobitak energije15 mola ATP-a pro mol piruvata.

Ako se setimo da smo ranije izračunali, da se u toku glikolize do piruvata dobija 8 mola ATP-a pro mol glukoze i ako ovo dodamo broju mola ATP-a oslobođenih u toku oksidacije dva mola piruvata, onda to iznosi 38 mola ATP-a pro mol glukoze.

Ako uporedimo energiju koju sadrže 38 mola ATP-a sa energijom 2 ATP-a, koja nastaju anaerobnom razgradnjom glukoze, očito je da se aerobnom razgradnjom dobija daleko više energije.

4.2.16 ULOGA CLK U BIOSINTEZI I METABOLIZMU PROIZVODA NASTALIH RAZLAGANJEM MASTI I PROTEINA

Videli smo da ciklus trikarbonskih kiselina omogućuje dobijanje velike količine energije u obliku ATP-a. Pored toga CLK ima važnu ulogu u biosintezi.jer su mnogi intermedijeri ciklusa polazni materijal za nastajanje velikog broja metabolita potrebnih za biosintezu makromolekula. Da spomenemo samo nekoliko primera, a važnije ćemo kasnije opisati. Tako glutaminska i asparaginska kiselina nastaju transaminacijom α-ketoglutarata, odnosno oksalacetata. Ove aminokiseline, pored toga što se ugrađuju u proteine, učestvuju u biosintezi prolina i pirimidinskih baza. Slično tome sukcinil-KoA je polazna supstancija za sintezu porfirina, koji izgrađuju hemoglobin i citohrome.

Jedno od najvažnijih jedinjenja CLK je oksalacetat, koji je ključni intermedijer za sintezu glukoze (glukoneogeneza). On je prema tome glukogena supstanca, kako se nazivaju jedinjenja iz kojih može da nastane glukoza (ili glikogen). Preko oksalacetata su i svi ostali intermedijeri ciklusa glukogeni. Reakcija koja povezuje ciklus trikarbonskih kiselina sa biosintezom glukoze je reakcija piruvat-karboksilaze, o kojoj je u poglavlju o glukoneogenezi bilo govora. U slučaju kada u ciklusu nedostaje oksalacetat, piruvat se karboksilira u oksalacetat. Obrnuto kada nastaju veće količine oksalacetata, on se

dekarboksilira u piruvat. Pošto je acetil-KoA alosterni aktivator piruvat-karboksilaze, to je ujedno mehanizam kojim se stimuliše sinteza oksalacetata, neophodnog za funkcionisanja CLK.

Na prvi pogled dve uloge CLK, obezbeđivanje energije oksidacijom acetil-KoA i davanje materijala za biosinteze odlaženjem intermedijera iz ciklusa, izgledaju nespojive. Uklanjanje oksalacetata bi značilo prestanak rada ciklusa. Ova prividna protivrečnost se rešava tako što i druga jedinjenja, sem acetil-KoA ulaze u ciklus i kompenzuju manjak intermedijera. Tako mnoge aminokiseline (aspartat, glutamat, histidin) mogu direktno da daju intermedijere. To su glukogene aminokiseline. Alanin i serin ulaze preko piruvata u CLK.

Pod izvesnim uslovima može da nastane u jetri toliko acetil-KoA, da prevaziđe kapacitet CLK da sav oksiduje. U tim slučajevima se javlja višak ketonskih tela. Zbog toga se acetil-KoA i jedinjenja iz kojih on nastaje nazivaju ketogena. Tako su masti ketogene, jer se pretežno razgrađuju u acetil-KoA. Leucin je, takođe, ketogeno jedinjenje, dok su brojne druge aminokiseline delom ketogene, a delom glukogene.

Odnos trikarbonskih kiselina prema glikolizi, glukoneogenezi kao i metabolizmu krajnjih proizvoda proteina i masti dat je na slikama 4.12. i 4.13. Na njima se uočava važnost ciklusa u metabolizmu velikog broja jedinjenja, pored njegove uloge u oksidaciji acetil-KoA.

U CLK oksiduje se još jedan derivat koenzima A: propionil-KoA. On nastaje u toku razgradnje aminokiselina metionina i izoleucina, a i kao završni metabolit oksidacije masnih kiselina sa neparnim brojem C-atoma. Propionil-KoA ulazi u CLK preko sukcinil-KoA; na taj način što se prvo karboksilira u metilraalonil KoA:

Reakciju katalizuje propionil-KoA karboksilaza i troši se jedan ATP. Nastali metilmalonil-KoA ima jedan C-atom više, intramolekulskim premeštanjem prelazi u sukcinil-KoA.

U ovoj reakciji učestvuje kao kofaktor vitamin B12. Smetnja u apsorpciji ovog vitamina u crevima, koja se javlja usled nedostatka »unutrašnjeg faktora« (koji se normalno luči u stomaku) dovodi do pojave perniciozne anemije. Iako se nedostatak enzima, koji katalizuje gornju reakciju (metilmalonil-mutaza) klinički ne manifestuje, svejedno pacijenti koji pate od perniciozne anemije izlučuju u mokraći velike količine propionske i metilmaionske kiseline.

4.2.17 PENTOZO-FOSFATNI PUT OKSIDACIJE GLUKOZE

Mnoge ćelije mogu da oksiduju glukozu do C02 ne samo u CLK, već i na drugi način. Alternativni put razgradnje glukoze naziva se po početnoj reakciji fosfoglukonatni put ili pentozo-fosfatni odvojak. U većini tkiva glikoliza i pentozni odvojak funkcionišu jedan pored drugog.

Karakteristične osobine pentozo-fosfatnog odvojka su: prvo da se svi enzimi odvojka nalaze u rastvornom delu ćelije, citozolu, i drugo da je njegov zadatak da obezbedi ekstramitohondrijalne redukcione ekvivalente u obliku nikotinamid-adenin--dinukleotidfosfata NADPH. Ova njegova funkcija je naročito važna za tkiva u kojima se odigrava reduktivna sinteza masnih kiseiina i steroida, kao što su: jetra, mlečna žlezda, adipozno i!i masno tkivo i kora nadbubrežne žlezde. U ovim tkivima glikoliza i pentozo-fosfatni put postoje jedan pored drugog. U skeletnim mišićima se glukoza ne razlaže na ovaj način, jer se u njima ne odigrava sinteza masnih kiselina.

Pored NADPH, fosfoglukonatni put stvara i pentoze, naročito D-ribozu, koja je potrebna za sinteze nukleinskih kiselina.

Nastajanje glukoze fotosintezom odigrava se fiksiranjem CO2, koje se odigrava fosfoglukonatnim putem.

Radi lakšeg razumevanja oksidacije glukoze u pentozo-fosfatnom putu, pratićemo sudbinu šest molekula glukoze, a ne jednog.

Reakcije odvojka se mogu podeliti u dva stepena: prvi u kojima dolazi do oksidacije glukoze do pentoze, i drugi u kome se dešava »pregrupisavanje« šest molekula pentoze u pet molekula heksoze.

1) 6 heksoza + 6 H2O → 6 pentoza + 6 CO2 + 24 H

2) 6 pentoza → 5 heksoza

Ukupna promena: heksoza +6H2O→6CO2 + 24H

Zbog jednostavnosti i kratkoće pisali smo ovde i govorili o heksozama i pentozama, mada i ovde kao i u glikolizi učestvuju fosfatni estri šećera.

Pentozni odvojak je prikazan na slici 4.17 u vrlo pojednostavljenom obliku. Pošto se enzimi glikolize i pentoznog odvojka nalaze zajedno u

mnogim tkivima, moguće je da se 3-fosfogliceraldehid oksiduje u piruvat. Ovaj metabolit nastaje u znatnim količinama u odvojku.

Slika 4.17 Reakcije pentozo fosfatnog puta.

Sleđećim brojevima su obeleženi enzimi odvojka: b. glukozo—6—fosfat-dehidrogenaza (DH), c. glukonolaktonaza, d. 6-fosfog!ukonat-DH, e. fos-fopentozo-epimeraza, f.fosfopentozo-izomeraza, g. transketolaza i h. transaldolaza. Enzimi glikolize i glukoneogeneze obeleženi su sa: a. heksokinaza, i. triozo-fosfat-izomeraza, j. aldolaza, k. frukto-zo-6-fosfataza i 1. fosfoglukoizomeraza. Arapski brojevi u zagradama pokazuju koliko molekula ulazi u reakciju.

Pentozo-fosfatni put počinje oksidacijom glukoze u 6-fosfoglukonsku kiselinu, koja se javlja u obliku laktona (6-fosfoglukonolakton). Ovu reakciju katalizuje NADP-specifična glukozo-6-fosfat dehidrogenaza (b.), ranije poznata kao »Zwischenferment«. Oksidaciono sredstvo je NADP, koji se redukuje u NADPH.

Glukozo-6-fosfat + NADP+ ↔ 6-fosfoglukonolakton + NAD PH + H+

Nastali 6-fosfoglukonolakton je vrlo nestabilan i hidrolizuje se dejstvom specifične laktonaze u slobodnu kiselinu, 6-fosfoglukonat (c).

NADP-specifična 6-fosfoglukonat-dehidrogenaza (d) katalizuje oksidaciju 6-fosfoglukonata, koji se istovremeno i dekarboksilira. Proizvod reakcije je šećer sa 5 C-atoma, ribulozo-5-fosfat. U toku ove oksidacije nastaje drugi mol NADPH:

6-fosfoglukonat + NADP+ → ribulozo-5-fosfat + CO2 + NAD FH + H+

U reakcijama drugog stepena pentozo-fosfatnog odvojka dolazi do resinteze glukozo-6-fosfata (5 molekula) iz ribulozo-5-fosfata (6 molekula). Reakcije počinju dejstvom fosfopentoze-epimeraze (e), koja

katalizuje reverzibilno prelaženje ribulozo-5-fosfata i njen epimer ksilulozo-5-fosfat. Ova keto-pentoza može da pređe i u drugi izomer u aldo-pentozu, D-ribozo-5-fosfat, dejstvom fosfopentoze-izomeraze (f.). Pod izvesnim okolnostima fosfoglukonatni put se završava na ovom mestu, tako da nastali D-ribozo-5-fosfat odlazi za sintezu RNK.

U prisustvu dva enzima, transketolaze (g) i transaldolaze (b) fosfoglukonatni put se nastavlja. Transketolaza, koja ima tiamin-pirofosfat (TPP) za prostetičnu grupu, prenosi krajnja dva C-atoma sa jedne pentoze (ksilulozo-5-fosfata) na drugu. Oni se prenose u obliku glikolaldehida vezani za prostetičnu grupu E-TPP. Proizvod reakcije je šećer sa 7 C-atoma, sedoheptulozo-7-fosfat i 3-fosfogliceraldehid:

Gliceraldehid-3-fosfat je mesto sa kojim je povezan pentozo-fosfatni put sa glikolizom.

Dejstvom transaldolaze prenose se prva 3 C-atoma (dihidroacetonska grupa) sa sedoheptulozo-7-fosfata na gliceraldehid 3-fosfat. Proizvod reakcije je fruktozo-6-fosfat (jedna heksoza) i šećer sa 4 C-atoma, D-eritozo-4-fosfat. Fruktozo-6-fosfat je drugo mesto vezivanja pentozo-fosfatnog puta sa glikolizom. Uopšte je karakteristično za pentozo-fosfatni put da omogućava, zajedno s enzimima glikolize, reverzibilno prelaženje šećera sa 3, 4, 5, 6 i 7 C-atoma, bilo prenošenjem ostatka od 2 ili C-atoma. Tako na kraju transketolaza katalizuje prenos 2 C-atoma sa D-ksilulozo-5-fosfata na eritrozo-4-fosfat. I u ovoj reakciji nastaje fruktozo-6-fosfat, koji dejstvom fosfoglukomutaze prelazi u glukozo-6-fosfat (1.).

Ukupna promena u fosfoglukonatnom putu je sledeća:

6 glukozo-6-fosfat+7 H2O + 12 NADP+ → 5 glukozo-6-fosfat +12 NADPH +

+12 H+ + 6 CO2 + Pi

Ako skratimo s desne i leve strane, dobijamo, da se jedan mol glukozo-6-fosfata oksidovao i da je dobijeno 12 NADPH:

glukozo-6-fosfat+7 H2O+12 NADP+ → 6 CO2+12 NADPH + H2 + Pi

Na kraju da zaključimo da pentozo fosfatni put omogućava sintezu i razgradnju ostalih šećera sem heksoza, posebno pentoza, a najvažnija mu je funkcija da obezbedi redukcione ekvivalente NADPH za biosintezu masnih kiselina, holesterola i drugih jedinjenja.

UKRATKO:

PENTOZO-FOSFATNI PUT OKSIDACIJE GLUKOZE, JE ALTERNATIVNI PUT RAZGRADNJE GLUKOZE, KARAKTERISTIKE OVOG PUTA SU: A) DA SE SVI ENZIMI TOG PROCESA NALAZE U CITOSOLU I B) DA JE NJEGOV ZADATAK DA OBEZBEDI EKSTRAMITOHONDRIJALNE REDUKCIONE EKVIVALENTE U OBLIKU NADPH. UKUPNA PROMENA U FOSFOGLUKONATNOM PUTU JE SLEDEĆA:

G-6-P +7H2O + 12 NADP → 12 NADPH + H2 + 6CO2 + Pi

Vidi se da se jedan mol G-6-P oksidovao i da je dobijeno 12 NADPH. Ovim se obezbeđuje NADPH koji je neophodan za biosintezu masnih kiselina, holesterola i drugih jedinjenja.

REGULACIJA ŠEĆERA U KRVI JE SLOŽEN PROCES U KOME SUDELUJE VIŠE FAKTORA. POD NORMALNIM USLOVIMA KONCENTRACIJA GLUKOZE U KRVI REZULTAT JE DELOVANJA INSULINA, GLUKAGONA I HORMONA RASTA I NJIHOVIH MEĐUSOBNIH ODNOSA. NA KONCENTRACIJU GLUKOZE UTIČU I ADRENALIN, ACTH, GLUKOKORTIKOIDI I TIROKSIN, NAROČITO U STRESU. INSULIN JEDINI SNIŽAVA NIVO GLUKOZE, DOK SVI OSTALI POVISUJU KRVNI ŠEĆER.

Najveći uzrok hiperglikemije je šećerna bolest ili dijabetes melitus. Uzrok te bolesti je manjak insulina. Hipoglikemija se pojavljuje zbog raznih uzroka, iako je ređa od hiperglikemije.

Ugljeni hidrati (šećeri, saharidi) su organska jedinjenja izgrađena od tri biogena elementa: ugljenika, vodonika i kiseonika. Odnos ovih elemenata je 1: 2 : 1, a opšta formula im je Cn(H2O)n. Dele se na aldoze i ketoze, zavisno od toga da li su nastali blagom oksidacijom primarne ili sekundarne alkoholne grupe polihidroksilnih alkohola.

Prema tome kako se ponašaju pri hidrolizi ugljeni hidrati se dele na:

Monosaharide,Oligosaharide iPolisaharide

MONOSAHARIDI SU NAJPROSTIJI ŠEĆERI KOJI SE DALJE NE MOGU CEPATI, A DA PRI TOME NE IZGUBE KARAKTERISTIČNE OSOBINE

ŠEĆERA. PO BROJU KISEONIKOVIH ATOMA MONOSAHARIDI SE DELE NA: BIOZE, TRIOZE, TETROZE, PENTOZE, HEKSOZE ITD.

U slobodnom stanju monosaharidi se nalaze u piranoznom obliku, a furanozni oblik šećera sreće se kod oligo i polisaharida.

Na predlog Haworth-a ciklični oblici šećera predstavljaju se perspektivnim formulama iz kojih se jasno vidi njihova peto ili šestočlana građa. Pri pisanju ovih formula treba imati na umu: a) kada kiseonik leži na ravni hartije, a prvi ugljenik desno, tada kod svih desnih šećera -CH₂OH grupa leži gore i b) kod β-D-glukoze sve –OH grupe imaju trans položaj.

U vodenim rastvorima najvažniji monosaharid D-glukoza ima α i β oblik, koji se nalaze u ravnotežnom položaju i prelaze jedan u drugi.

Šećeri imaju u svom molekulu asimetrične ugljenikove atome, te zbog toga skreću ravan polarizovane svetlosti. Ova osobina se koristi za polarimetrijsko određivanje šećera. (npr. glukoza u urinu).

Monosaharidi su veoma reaktivna jedinjenja. Grade: a) estre; b) etre; c) oksime; d) fenilhidrazone i osazone; e) furfural i oksimetilfurfural; f) epimerne šećere; h) šećerne ili dikarbonske kiseline; g) polialkohole; i) šećere sa većim brojem ugljenikovih atoma.

Glukoza je biološki najvažniji šećer i po tome što većina heksoza u toku metabolizma prelazi u glukozu. Anaerobnim razlaganjem glukoze (glikoliza) u mišićima nastaje L-mlečna kiselina.

Od fosfornih estara glukoze najvažniji su glukozo-1-fosfat (Corijev estar) i glukozo-6-fosfat (Robisonov estar).

Enzimskom oksidacijom glukoze nastaje glukuronska kiselina. U obliku glukuronida izlučuju se iz organizma štetne supstance.

Od aminošećera najznačajniji su: D-glukozamin, D-galaktozamin i neuraminsku kiselinu.

Jedinjenja vrlo bliska šećerima su: askorbinska kiselina (vitamin C) i inozitoli.

Glikozidi nastaju kad poluacetalna grupa monosaharida stupi u reakciju s različitim alkoholima, fenolima ili karboksilnim kiselinama. To su jedinjenja tipa acetala u kojima je vodonik poluacetalne grupe zamenjen alkilnim ostatkom. Jedinjenje koje stupa u reakciju sa šećerom zove se aglikon, a nastala veza glikozidnom vezom. Ova veza može nastati i između dva šećera.

Oligosaharidi su glikozidi, koji nastaju spajanjem n (dva ili više, do šest) molekula monosaharida uz odvajanje (n-1) molekula vode.

Od oligosaharida treba izdvojiti maltozu, celobiozu, saharozu, laktozu i druge.

Polisaharidi ili glikani nastaju kad se stotine i hiljade molekula monosaharida vežu međusobno glikozidnom vezom. Prirodni polisaharidi nastaju dejstvom specifičnih enzimskih organizacija. Od velikog broja stereoizomernih monosaharida samo mali broj ulazi u sastav prirodnih polisaharida. Tako se celuloza sastoji samo od jedinica glukoze, koje su povezane β-glikozidno.

U biljkama se pored celuloze nalaze i drugi polisaharidi. Tu spadaju: pektini, inulin, agar-agar, skrob (koji se sastoji od amilopektina i amiloza) i drugi.

Polisaharidi animalnog porekla (zoopolisaharidi) su veoma brojni, različitog su hemijskog sastava i fiziološke uloge. Najduže je poznat i odavno je ispitan glikogen (životinjski skrob). On je metabolička i energetska rezerva skoro svih ćelija. Osim njega mnogi hormoni i enzimi sastoje se delimično od ugljenih hidrata. Npr. FSH, HCG.

Zoopolisaharidi se dele na homoglikane (glikogen, hitin) i heteroglikane ili mukopolisaharide (hialuronska kiselina, hondroitin-sumporna kiselina, heparin, polisaharidi krvnih grupa itd.).

Pod normalnim uslovima čovek i sisari se većinom hrane ugljenim hidratima, i na taj način pokrivaju najosnovnije energetske potrebe za održavanje i reprodukciju organizma.

Ugljeni hidrati se odlažu u organizmu u obliku glikogena. On je loptastog izgleda, kompaktan i zauzima malo prostora. Glikogen se nalazi gotovo u svim tkivima, a najviše u jetri i mišićima. Glikogen iz jetre održava koncentraciju glukoze u krvi na konstantnom nivou. Mišićni glikogen obezbeđuje energiju za mišiće.

Razlaganje glikogena (fosforoliza) ili glikogenoliza odvija se uzastopnim dejstvom dva enzima: glikogene(ili skrobne) fosforilaze i fosfoglukomutaze. Krajnji proizvod fosfolitičkog razlaganja glikogena u ćeliji je glukozo-1-fosfat (G-1-P). Dejstvom fosfoglukomutaze, ovaj prelazi u glukozo-6-fosfat (G-6-P). U jerti enzim glukozo-6-fosfataza cepa G-6-P na ostatak fosforne kiseline i vodu.

Glikogenogeneza je proces sinteze glikogena od glukoze i odvija se u jetri i mišićima. Sinteza se odvija prenošenjem celih molekula glukoze koja se prvo energetski obogaćuje sa UTP (uridiltrifosfat), te se na ovaj način izgradi lanac od 10 do 12 molekula glukoze, pa potom počinje granjanje.

Sinteza i fosforoliza glikogena su pod endokrinom kontrolom insulina, glukagona, steroidnih hormona, epinefrina i hormona rasta.

Glikoliza je metabolički proces u kome se iz glukoze dobija energija u obliku adenozin-trifosfata (ATP). Razgradnja glukoze može da se odvija anaerobno i aerobno. U anaerobnim uslovima procesom fermentacije nastaju fermentacioni proizvodi, a u aerobnim uslovima, pored fermentacije imamo i respiraciju, tj. oksido-redukcioni proces. Najčešća dva tipa fermentacije glukoze su: mlečno-kiselinsko i alkoholno vrenje. U prvom je krajnji proizvod mlečna kiselina, a u drugom etanol i CO₂. U oba se oslobađa dovoljno energije, tako da nastaju dva molekula ATP-a pro mol glukoze.

Glikoliza se odvija u 11 uzastopnih reakcija, od kojih su samo tri ireverzibilne. Enzimi glikolize su rastvoreni u citoplazmi i ona teče u citoplazmi.

U toku anaerobne glikolize kad je laktat krajnji proizvod, dobijaju se dva mola ATP-a na svaki mol razgrađene glukoze.

Pod aerobnim uslovima, kada piruvat u obliku acetil-koenzima-A ulazi u ciklus limunske kiseline, nastaju pored dva mola ATP-a i dva mola redukovanog NADH. Ta dva mola NADH ekvivalentna su sa šest mola ATP-a, kada se oksiduju u lancu disanja. Zato je celokupni dobitak 8 mola ATP na svaki mol glukoze.

Glukoneogeneza je proces sinteze glukoze od neugljenohidratnih jedinjenja, kao što su laktat, piruvat i proizvodi dezaminacije aminokiselina.

Glikoneogeneza je obrnut proces od glikolize.

Ciklus trikarbonskih kiselina (CTK) je centralno mesto u kome se oksiduju krajnji proizvodi svih kataboličkih puteva: piruvat dobijen iz ugljenih hidrata, acetil-koenzim-A iz masti, α-ketoglutarat, fumarat i oksalacetat iz aminokiselina. Ovaj centralni proces objasnio je Krebs i po njemu se zove Krebsov ciklus. Ukupna promena koja se odigrava u Krebsovom ciklusu je :

CH₃COOH + 2H₂O → 2CO₂ + 8H.

KAO ŠTO SE VIDI U CTK NE SUDELUJU MOLEKULI KISEONIKA, NI NEORGANSKI FOSFOR, NI ATP. NJEGOVA PRVENSTVENA ULOGA JE DA IZVRŠI DEHIDROGENIZACIJU SIRĆETNU KISELINU DO CO₂ I H. 8 H-ATOMA, KOJI NASTAJU U CLK OKSIDUJU SE DALJE U LANCU DISANJA SPAJANJEM SA MOLEKULSKIM KISEONIKOM U VODU I PRI TOM SE DOBIJA VELIKA KOLIČINA ENERGIJE.

MASTI ILI LIPIDI

5.1 MASTI

5.1.1 KLASIFIKACIJA MASTI

Masti ili lipidi su velika grupa prirodnih jedinjenja, koja se nalaze u biljkama, životinjama i mikroorganizmima. U lipide spadaju rezervne masti životinjskog i biljnog porekla i strukturne masti, koje su bitni sastojci protoplazme i ćelijske membrene. Francuzi nazivaju rezervne ili deponovane masti »element variable«, jer kvalitativno i kvantitativno variraju s promenom ishrane, a strukturne masti »element constant«, jer je njihov sadržaj u tkivu prilično konstantan i pri promeni ishrane, pa i gladovanju.

Po svom hemijskom sastavu masti su vrlo heterogena jedinjenja, a ujedinjuje ih samo njihova fizička osobina da se ne rastvaraju u vodi. Zbog toga je teško definisati šta su to lipidi. Danas se prema Bloor-u ubrajaju u lipide sva ona jedinjenja, koja imaju sledeće osobine

ne rastvaraju se u vodi, a rastvaraju se u jednom ili više organskih rastvarača kao što su: etar, hloroform, aceton, benzol i drugi rastvarači za masti (Fett- loesungsmittel, fat solvents).

da su estri viših masnih kiselina bilo stvarni bilo potencijalni,

da mogu da ih upotrebljavaju živi organizmi.

Osim toga u ovom poglavlju biće govora o čitavom nizu jedinjenja, koja su strukturno hemijski vezana za neke lipide, iako imaju sasvim druge osobine. To je s biohemijskog gledišta opravdano, jer između njih postoji povezanost u metabolizmu.

Masti ili lipide delimo na:

1. Prave masti

2. Voskove

3. Fosfatide

4. Saharolipide (glikolipide)

5. Steroide i njihove derivate

6. Karotinoide i njima srodna jedinjenja

5.1.1.2 PRAVE MASTI

Prave masti su estri trovalentnog alkohola glicerola s višim masnim kiselinama. Glicerol može da se jedini s jednom, dve ili tri masne kiseline i da gradi mono-, di- i trigliceride:

Prirodne masti su smeše triglicerida u kojima su hidroksilne grupe glicerola esterifikovane raznim masnim kiselinama. Homogeno građeni trigliceridi - tri-palmitin, tristearin i triolein - sačinjavaju samo mali deo prirodne smeše glicerida, tj. rezervnih ili deponovanih masti.

Trigliceridi koji u α, α', β položaju imaju ostatke različitih masnih kiselina trebalo bi da budu optički aktivni, jer im je srednji ugljenikov atom asimetričan.

Rezervne masti biljnog i životinjskog porekla su smeša triglicerida. Priroda rezervne masti zavisi od životinjske vrste i od hrane. Svaka životinja deponuje mast karakterističnih osobina, mirisa i sastava. Sigurno da to zavisi i od specifičnog metabolizma, vrste i načina života. Pošto pojedine životinje biraju određenu hranu, onda i način ishrane mora biti značajan faktor u formiranju specifične masti jedne vrste. Eksperimentalno je dokazano da sastav deponovane masti jako varira promenom hrane. Veliki broj masnih kiselina, koje mogu da uđu u sastav pravih masti, kao i mogućnost nastajanja različitih triglicerida, objašnjava činjenicu da je broj kombinacija u mastima različitog porekla vrlo veliki. Kao primer dajemo sadržaj masnih kiselina u deponovanoj goveđoj masti:

Palmitinske kiseline 33%

Stearinske kiseline 21%

Oleinske kiseline 35%

Miristinske kiseline 2.4%

Arahinske kiseline 1.3%

Drugih nezasićenih kiselina 3.6%

Iz ovih podataka se vidi da palmitinska, stearinska i oleinska kiselina zauzimaju 90% raspoloživih mesta na hidroksilima glicerola.

U ishrani ljudi i mnogih životinja masti imaju značajnu ulogu. One su važan izvor energije; 1 g masti oslobađa oko 38,9 kJ (ugljeni hidrati i proteini imaju 17,2 kJ/g) Prekomerno unete hranljive materije, organizam pretvara u masti i deponuje u pojedinim tkivima. Stvarni biološki značaj masti sastoji se u tome što su one rezervna hrana koju organizam životinja deponuje i koristi kada mu je potrebno. Najlakše i najbrže se koristi mast deponovana u jetri. Tako se masnoće jetre menjaju svakih 1-2 dana kod pacova, a potkožne 15-20 dana.

Masti su osim toga, mada u malim količinama, pored fosfatida, sterola i dr. sastavni delovi membranske strukture ćelija.

5.1.1.3 FIZIČKE OSOBINE PRAVIH MASTI

Specifična težina svih masti je manja od 1,0. Masti se ne rastvaraju u vodi, ali se mogu dobiti stabilne emulzije dodatkom supstanci, koje smanjuju površinski napon, kao na primer, sapuni, proteini, žučne kiseline, deterdženti i dr. U tankom crevu žučne kiseline emulguju masti i na taj način omogućavaju njihovo varenje i apsorpciju. Mleko je primer emulzije masti stabilizovane proteinom. Svaka kapljica masti okružena je slojem proteina u koji je ugrađen sloj lecitinskih kapljica (haptogena membrana). Mehaničkim razbijanjem membrane oslobađa se mast mleka i dobija buter.

Tačka topljenja prirodnih masti nije oštra, pošto su one smeša raznih triglicerida. Gliceridi masnih kiselina s većim brojem ugljenikovih atoma tope se na višoj temperaturi od glicerida masnih kiselina, koje imaju manji broj ugljenikovih atoma. Najnižu tačku topljenja imaju gliceridi nezasićenih masnih kiselina. Mnogi od njih su, kao na primer triolein, tečni na sobnoj temperaturi. Tečne masti se zovu ulja.

Masti hladnokrvnih životinja i bilja su tečne na sobnoj temperaturi, a masti toplokrvnih životinja su čvrste. Postoji razlika u tački topljenja masti i u istom organizmu. Potkožna mast ima nižu tačku topljenja od rezervne masti u abdominalnoj šupljini. Priroda na taj način osigurava istu konzistenciju i viskozitet masti u unutrašnjim delovima tela, gde je temperatura viša i u potkožnom tkivu, gde su masti izložene spoljnom hlađenju. To se postiže selektivnim ugrađivanjem nezasićenih masnih kiselina. Usled toga se povećanje tačke topljenja kreće paralelno sa smanjenjem jodnog broja.

5.1.1.4 HIDROLIZA MASTI

Dejstvom pregrejane vodene pare, alkalija ili specifičnih enzima (lipaza) masti se hidrolizuju. Hidroliza masti s koncentrovanim

alkalijama ili alkalnim karbonatima, poznata pod imenom saponifikacija, odavno se primenjuje za dobijanje sapuna koji su alkalne soli viših masnih kiselina. Saponifikacija je najduže poznati proces hidrolize masti od čega i dolazi opšti termin saponifikacija, ne samo za alkalnu hidrolizu masti nego i za hidrolitičko cepanje bilo kog estra.

Saponifikacija (- hidroliza) masti pod dejstvom alkalija

Lipidi koji se mogu hidrolizovati nazivaju se osapunjivim lipidima. Saponifikacijom se menja rastvorljivost, jer se pri podesnom razblaženju dobijeni proizvodi rastvaraju u vodi. Hidrolizom pravih masti dobijaju se, dakle, slobodne masne kiseline ili sapuni (ako je hidroliza izvršena alkalijama) i glicerol.

Hidroliza masti u probavnom traktu vrši se pod katalitičkim dejstvom enzima, koji se nazivaju lipaze. Ovi enzimi cepaju estarske veze postepeno, tako da prvo nastaju digliceridi, a posle dužeg dejstva oslobađa se i drugi i treći molekul masne kiseline.

Hidroliza masti dejstvom lipaza iz pankreasa i creva

Lipaza ima u visokoj koncentraciji u pankreasu, crevnom zidu i u jetri. Lipaze pankreasa otcepljuju masne kiseline, koje se nalaze u položaju α i α', a lipaze crevnih zidova cepaju β-gliceride. Lipaze deluju na emulgirane masti.

Glicerol, poznat i pod imenom glicerin, nije samo stalni sastojak masti (tri-glicerida) nego i lecitina i kefalina. Po svom hemijskom sastavu glicerol je pro-pantriol-1, 2, 3. To je bezbojna, gusta (d = l,26), vrlo viskozna tečnost slatkog ukusa. Meša se s vodom u svakom odnosu, a isto tako i sa etanolom i acetonom. Kao i od drugih polivalentnih alkohola i od glicerola

nastaju šećeri (trioze) biološkom oksidacijom. Sam glicerol je sporedni proizvod alkoholnog vrenja.

Slobodni i esterifikovani ghcerol daje akroleinsku reakciju zagrevanjem s kiselim kalijum sulfatom (KHSO4) ili bezvodnim CaCl2.

5.1.1.5 MASNE KISELINE PRIRODNIH GLICERIDA

Sve masne kiseline koje se nalaze u prirodnim mastima imaju po pravilu prav lanac i paran broj ugljenikovih atoma. Ovo je potpuno razumljivo, pošto se danas zna da masne kiseline nastaju biološkom kondenzacijom dva po dva ugljenikova atoma tzv. C2 jedinica, koje se nazivaju aktivni ostaci sirćetne kiseline. U mastima su najviše zastupljene masne kiseline sa šesnaest i osamnaest ugljenikovih atoma: palmitinska (C16H32O2) i stearinska kiselina (C18H36O2). U rezervnim mastima nalaze se pored zasićenih masnih kiselina i takve sa nezasićenim ugljovodonikovim lancem, i to često u većoj količini.

Zasićenim masnim kiselinama odgovara bruto formula CnH2nO2, a nezasićenim s jednom dvogubom vezom CnH2n — 2O2 sa dve dvogube veze CnH2n—4O2, sa tri CnH2n—6O2. Ima masnih kiselina i sa trogubom vezom. U niže navedenoj tabeli date su najvažnije prirodne zasićene masne kiseline. Većina od njih se nalazi u kravljem buteru.

Zasićene masne kiseline

Palmatinska kiselina C16H32O2 skraćena formula

Palmatinska kiselina C18H32O2 skraćena formula

Od nezasićenih masnih kiselina najrasprostranjenija je oleinska kiselina, koja ima jednu dvogubu vezu i 18 ugljenikovih atoma. Dvoguba veza se nalazi na sredini lanca između 9 i 10 ugljenikovog atoma (9):

Oksidacijom oleinske kiseline dobija se pelargonska kiselina CH 3—(CH2)7COOH i azelainska kiselina HOOC—(CH2)7COOH, što

potvrđuje da se dvoguba veza nalazi na sredini lanca. Oleinska kiselina je cis-oblik; dejstvom azotaste kiseline, azotne kiseline ili zagrevanjem sa NaHSO3 ona prelazi u trans-oblik elaidinsku kiselinu, koja je čvrsta na sobnoj temperaturi i lako kristališe. Adiranjem dva vodonikova atoma (hidrogeniranjem) oleinska kiselina prelazi u stearinsku kiselinu.

Pored oleinske, postoji i palmitoleinska kiselina C15H29COOH (9), koja hidrogenizacijom daje palmitinsku kiselinu. Jednu dvogubu vezu ima i ricinolna kiselina. U ricinusovom ulju ona iznosi 80% ukupnih masnih kiselina. Docnije ćemo se susresti sa nervonskom kiselinom, koja ima 24 ugljenikova atoma i dvogubu vezu na 15.

Dve dvogube veze ima linolna kiselina (9,12):

a tri nezasićene veze ima linolenska kiselina (9, 12, 15).

Gliceridi ovih nezasićenih masnih kiselina nalaze se u lanenom ulju (Oleum lini) i drugim sušivim uljima (semenki hmelja, suncokreta,

tikve, kokosa, aloje). Ova ulja se na vazduhu oksidišu i daju smolu, koja više nije masna i ne rastvara se u acetonu. Ova njihova osobina je od bitne važnosti za bojenje i lakiranje.

Od masnih kiselina koje imaju četiri dvogube veze ( 5, 8, 11, 14) spomenućemo arahidonsku kiselinu sa 20 ugljenikovih atoma:

Na svakoj dvoguboj vezi u molekulu nezasićenih masnih kiselina postoji mogućnost izomerije. Slučaj oleinske kiseline i elaidinske kiseline već smo spomenuli. Od linolne kiseline koja ima dve dvogube veze postoje četiri izomera: cis-cis, trans-trans, 9 cis-12 trans, 9 trans-12 cis. Prirodna linolna kiselina je smeša od najmanje dva izomera.

U mnogim uljima nalaze se mnogostruko nezasićene masne kiseline, među njima i sa trogubom acetilenskom vezom kao, na primer, taricinska kiselina koja ima 18 ugljenikovih atoma i trogubu vezu između 9 i 10 ugljenikovog atoma.

Pored toga što su masti za živi organizam vrlo bogat izvor energije, pokazalo se da su izvesne masne kiseline, i to nezasićene, od naročite važnosti za ishranu. Nedostatak nekih masnih kiselina u hrani, kao što su linolna, linolenska, arhidonska i druge, dovodi do oboljenja životinja (na primer: pojava lezija na koži kod pacova). Ovakve masne kiseline, koje organizam ne može sam da sintetiše, već mora da ih dobija s hranom, zovu se esencijalne ili bitne masne kiseline.

5.1.1.6 KVARENJE MASTI

Izolovane iz svoje prirodne sredine, masti se kvare pod uticajem atmosferilija i mikroorganizama. One promene boju, požute ili posmeđe, neprijatnog su mirisa i ukusa. U narodu se kaže mast se pokvarila, upalila, užegla. Tokom kvarenja masti, dolazi do slabe hidrolize, pri čemu se oslobađaju isparljive masne kiseline neprijatnog mirisa. Istovremeno se dešava oksidacija nezasićenih masnih kiselina na dvoguboj vezi. Pri tome se preko peroksidnih derivata stvaraju aldehidi, ketoni i masne kiseline s manjim brojem ugljenikovih atoma.

Lakše se kvare masti, koje sadrže više nezasićenih masnih kiselina.

Kvarenje masti može da se spreči i dodavanjem različitih antioksidansa, Kao npr.: vitamina E, vitamina C, glutationa i sl.

Hidrogenizacija masti. - Moderna tehnologija prehrambene industrije daje na tržište hidrogenizovane masti. Masti i ulja se hidrogenizuju u prisustvu katalizatora (Ni). Nezasićene masne kiseline u tom procesu adiraju vodonik na mestima gde se nalaze dvogube veze i tada nastaju od ulja čvrste masti. Zbog toga se ovaj postupak zove proces očvršćavanja.

5.1.1.7 ISPITIVANJE MASTI I ULJA

Vrlo često je potrebno da se zna iz kojih su triglicerida sastavljene prirodne masti i ulja, koliko imaju zasićenih, a koliko nezasićenih masnih kiselina i da li imaju slobodnih masnih kiselina. U tu svrhu se mast analizira.

Za ispitivanje masti i ulja postoje fizičke i hemijske metode. Fizičkim metodama se određuje tačka topljenja, tačka očvršćavanja, specifična težina, indeks prelamanja. Od hemijskih metoda najvažnije su: određivanje kiselinskog broja, saponifikacionog broja, jodnog broja, Reichert-Meissl-ovog broja i acetilnog broja.

Kiselinski broj. - Prirodne masti, a naročito ulja, sadrže i slobodne masne kiseline. Kad se ulja rafinišu za jelo, moraju da se oslobode slobodnih masnih kiselina. Kiselost masti može se povećati i stajanjem ili kvarenjem masti.

Količina slobodnih masnih kiselina u mastima i uljima određuje se titiranjem sa KOH. Broj potrošenih mg KOH za neutralisanje 1 g masti je »kiselinski broj« ispitivane masti.

Saponifikacioni broj. - Zagrevanjem masti sa standardnim alkoholnim rastvorom KOH na vodenom kupatilu određuje se saponifikacioni broj. Definiše se kao broj mg KOH, potrebnih da se saponifikuje 1 g masti ili ulja.

Tokom zagrevanja saponifikuju se i slobodne i vezane masne kiseline. Pošto pri saponifikaciji svaka karboksilna grupa masne kiseline reaguje s jednim molekulom KOH ili NaOH, jasno je da nam količina potrošenog KOH daje podatak o broju karboksilnih grupa. Masti koje imaju masne kiseline s manjim brojem ugljenikovih atoma imaće više karboksilnih grupa u 1 g masti, nego one koje su

sastavljene od masnih kiselina s većim brojem ugljenikovih atoma. Veliki saponifikacioni broj ukazuje da je mast sastavljena od masnih kiselina s kraćim lancem, a mali saponifikacioni broj da je mast sastavljena od masnih kiselina s dužim lancem. Šta više, pošto ekvivalenat triglicerida troši tri ekvivalenata KOH (M.T. = 56), možemo iz saponifikacionog broja da izračunamo i prosečnu molekulsku težinu smeše triglicerida iz sledeće formule:

Tako, na primer buter, koji sadrži više masnih kiselina s kraćim lancem ima saponifikacioni broj 220-230, a margarin koji ima više masnih kiselina s dužim lancem oko 195.

Jodni broj. Stepen nezasićenosti masti i ulja je najvažniji faktor od koga zavise i fizičke i hemijske osobine masti. Nezasićene masne kiseline lako podležu oksidaciji na mestu dvogube veze i zbog toga dolazi do kvarenja masti.

Količina nezasićenih masnih kiselina u ispitivanoj masti određuje se merenjem količine joda koju mast može da veže. Jod se pri tome adira na dvogubim vezama nezasićenih masnih kiselina, koje prelaze u zasićene halogenske derivate:

Jodni broj se definiše kao broj grama J2 koje vezuje 100 g masti.

Reichert-Meissl-ov broj nam daje podatak o količini isparljivih masnih kiselina (sa manje od dvanaest ugljenikovih atoma) u ispitivanoj masti. Određuje se na taj način što se mast prvo saponifikuje, iz dobijenih sapuna se oslobode masne kiseline dodavanjem neke anorganske kiseline, a zatim se predestiluju vodenom parom isparljive masne kiseline. Broj mililitara 0,1 N KOH, potrebnih za neutralisanje isparljivih masnih kiselina u destilatu dobijenom od 5 g masti, jeste Reichert-Meissl-ov broj

Acetilni broj određuje količinu slobodnih hidroksilnih grupa u ulju ili masti.

5.1.1.8 VOSKOVI

Voskovi su slični pravim mastima po svom estarskom karakteru, ali zbog toga što nemaju glicerola, nego su monoestri masnih kiselina

pravog lanca s isto takvim jednovalentnim alkoholima, oni su po svojim fizičkim i hemijskim osobinama sasvim odvojena grupa jedinjenja. Prave masti služe kao rezervna hrana i izvor energije u ćelijama, a voskovi se redovno nalaze na epidermi, koja ih luči da bi sprečila prolaz vlage. Na taj način se biljke čuvaju od gubitka vode i od prodiranja plesni-parazita. Kod životinja je uloga voskova epitela funkcionalno ista. Tako ptice plivačice maste perje voskom (stearinolni oleat) iz specijalne žlezde.

Pčelinji vosak. Ima mnogo vrsta pčela (naša domaća vrsta je Apis mellifica), no vosak im se malo razlikuje po fizičkim i hemijskim karakteristikama: kiselinski broj 17,0; jodni broj 5,8; saponifikacioni broj 84,4; t.t. 64°. Vosak se lako rastvara u etru, hloroformu i ugljentetrahloridu. Treba imati na umu da je vosak prirodni proizvod i da nije homogeno građen. On je uglavnom estar miricilalkohola C30H61OH. Miricilalkohol je vezan za palmitinsku, palmitooleinsku, hidroksipalmitinsku ili cerotinsku kiselinu. U pčelinjem vosku ima do 12% ugljovodonika (C19H38, C31H62).

Cetaceum ili spermacet je sastavni deo ulja, koje se nalazi u »anthrum cranii« nekih vrsta kitova. Sastoji se od palmitinskog estra cetilnog alkohola CH3(CH2)14CO · OCH2(CH2)14CH3. Spermacet se upotrebljava u medicini i kozmetici za pripremu masnih podloga i kremova. Danas se skoro isključivo dobija sintetički.

Voskovima slične materije nalaze se u lanolinu, masti ovčije vune. To je smesa holesterol-palmitata, stearata i oleata. I on se obilno koristi u medicini i kozmetici, jer može da veže dvostruko veću količinu vode od svoje težine.

5.1.2 FOSFATIDI

Fosfatidi, poznati i pod imenom fosfolipidi su komplikovanije građeni od neutralnih masti, a po svojoj biološkoj funkciji spadaju u »konstantni element« životinjskog tkiva. Nezamenjiva je njihova uloga u izgradnji ćelijske membrane i unutrašnje strukture ćelija. Fosfatida ima u svim organima, a naročito je bogato nervno tkivo i žumance jajeta. U mišićima je sadržaj fosfatida proporcionalan s važnošću njihove funkcije: najviše ih ima u srčanom mišiću.

Fosfatidi su po svojoj hemijskoj strukturi diestri fosforne kiseline. Alkoholna komponenta jedne estarske veze je glicerol ili sfingol, a druge amino alkoholi - holin i holamin, aminokiselina - serin i inozitol. Najbolje ih je podeliti prema glavnoj alkoholnoj komponenti na: glicero-fosfatide i sfingolipide.

5.1.2.1 GLICERO FOSFATIDI

Fosfatidne kiseline su najprostiji fosfatidi. One su derivati glicerinfosforne kiseline, čije su alkoholne grupe glicerola esterifikovane višim masnim kiselinama. Prema položaju fosfome kiseline, razlikujemo α i β derivate glicerinfosforne kiseline:

Mnogi fosfatidi imaju u svom molekulu glicerinfosfornu kiselinu. Dokazano je (Baer) da svi prirodni fosfatidi, pa i prirodne fosfatidne kiseline imaju L-α-konfiguraciju:

R1 i R2 su ostaci viših masnih kiselina.

Fosfatidnih kiselina ima u maloj količini u mnogim biljnim i životinjskim organima. U krvi su nađene u obliku kalcijumove soli. Smatra se da su one prethodnici drugih krvnih fosfatida i da iz njih nastaju drugi fosfatidi.

Pangborn je 1941. godine izolovao iz goveđeg srca jednu fosfatidnu kiselinu, kojoj je dao ime kardiolipin. To je jedna polifosfatidna kiselina; nalazi se u lipidnoj frakciji za koju se smatra da daje pozitivnu reakciju kod Wassermann-ove probe na sifilis.

Lecitini imaju u svom molekulu amino-alkohol holin, koji je estarski vezan za fosfornu kiselinu. Pored toga su alkoholne grupe glicerola esterifikovane višim masnim kiselinama.

Amino-alkohol holin spada u kvarternerne amonijumne baze. Hemijsko ime mu je: etanol-trimetil-amonijum-hidroksid i kao sve baze toga tipa ima pozitivno naelektrisanje na azotovom atomu.

Lecitini se hidrolizuju dejstvom baza, kiselina i hidrolitičkih enzima, jer su masne kiseline i fosforna kiselina estarski vezane sa glicerolom. Baza je u glicerin-fosfatidima vezana na ostatak fosforne kiseline. I kod ovih jedinjenja fosforna kiselina može da se veže na α ili β ugljenikov atom glicerola i prema njenom položaju razlikujemo α i β-lecitine. Dokazano je da su prirodni glicerofosfatidi optički aktivni L-α-lecitini i L-α-kefalini.

Lecitini iz pojedinih životinjskih organa imaju različite zasićene i nezasićene masne kiseline. Tako lecitini iz jetre raznih životinja imaju vrlo specifično raspoređene masne kiseline: nezasićene masne kiseline se obično nalaze na β-ugljenikovom atomu glicerola, a zasićene na α.

Lecitini se rastvaraju u etru, hloroformu i toplom alkoholu, a ne rastvaraju se u acetonu. Na taj način mogu da se izoluju lecitini od ostalih masti taloženjem acetonom. Izolovanje lecitina je vrlo teško, jer se zbog prisustva nezasićenih masnih kiselina lako oksidišu na vazduhu.

Biološka važnost lecitina je mnogostruka. Oni su bitni sastojci ćelija, igraju važnu ulogu u procesu zgrušavanja krvi.

Otrovi egzotičnih zmija, kao i naših otrovnica, imaju enzime (lecitinaze), koji specifično hidrolizuju samo estarsku vezu sa nezasićenim masnim kiselinama u lecitinima. Preostali deo lecitinskog molekula, koji se zove lizolecitin, je jako hemolitičko sredstvo. Ujed zmija otrovnica izaziva, prema tome, jaku hemolizu.

Kefalini se uvek nalaze zajedno s lecitinima u životinjskim organima. Slabo se rastvaraju u alkoholu i na taj način se mogu odvojiti od lecitina. Oni su posle lecitina najrasprostranjeniji

glicerofosfatidi. Po svojoj hemijskoj strukturi su vrlo slični lecitinima, izuzev što imaju drugu bazu.

Poznate su dve vrste kefalina: holamin-kefalin i serin-kefalin. Prvi sadrže azotnu bazu holamin (HO—CH2—CH2NH2 = etanolamin), a drugi aminokiselinu serin.

Aminokiselina serin je biološki prethodnik holamina. Biološkom metilacijom vodonikovih atoma u amino-grupi holamina sa aktivnim metioninom prelaze holamin-kefalini u lecitine. Prirodni kefalini imaju levu konfinguraciju (L-α-kefalini).

Holamin-kefalini mogu da se odvoje od serin-kefalina na osnovu njihove različite rastvorljivosti u organskim rastvaračima (hloroformu i etanolu). Kao i lecitini vrlo su osetljivi na svetlost i oksidaciju, jer sadrže nezasićene masne kiseline. Odnos nezasićenih masnih kiselina prema zasićenim masnim kiselinama u holamin-kefalinima izolovanim iz raznih organa je različit. Tako je Debuch našao da holamin-kefalini moždanog tkiva imaju 48,8% zasićenih i 51,2% nezasićenih masnih kiselina.

Holamin-kefalini kao i lecitini igraju važnu ulogu u procesu zgrušavanja krvi, transportu, resorpciji i metabolizmu masnih kiselina.

Serin-kefalini se nalaze uvek u obliku soli Na, K, Ca i Mg, a sadrže uglavnom stearinsku i oleinsku kiselinu. Dokazano je da su oni neophodni za metabolizam katjona u eritrocitima.

Plazmalogeni su vrlo rasprostranjeni glicerofosfatidi. Otkrio ih je Feulgen 1924. godine. Dejstvom sublimata ili sumporne kiseline oslobađaju se iz plazmalogena aldehidne grupe, koje se boje crveno sa fuksin-sumporastom kiselinom (plazmal-reakcija). Na osnovu ovakvog ponašanja smatralo se da plazmalogeni nemaju u svom molekulu više masne kiseline, nego jedan viši masni aldehid. Tako je Rapoport sa saradnicima 1957. godine dokazao da se plazmalogeni

sastoje iz jednog mola aldehida, koji je vezan samo za α-položaj glicerola enoletarskom vezora. Na -položaju se nalazi ostatak nezasićene masne kiseline, a u α-položaju ostatak fosforne kiseline sa azotnom bazom, koja može biti etanolamin ili holin.

Plazmalogen

Plazmalogena ima u srčanom i skeletnim mišićima, mozgu, jetri i jajima.

Inozitolfosfatidi sadrže umesto aminoalkohola, ciklični šestovalentni alkohol mezo-inozitol. Izolovao ih je Anderson 1930. godine iz bacila tuberkuloze, a posle toga su nađeni i u drugom životinjskom i biljnom materijalu.

Inozitolfosfatidi spadaju takođe u glicerofosfatide, jer sadrže glicerol, dva mola masnih kiselina, inozitola i jedan ili više mola fosforne kiseline.

Izolovani su, osim toga, inozitolfosfatidi velike molekulske težine koji sadrže holamin, galaktozu i vinsku kiselinu.

Inozitolfosfatidi su kiselog karaktera i u prirodi se nalaze u obliku mineralnih soli (X = Na, Mg, K, Ca). Ima ih u srčanom mišiću (5-10% od ukupnih fosfolipida), u jetri pacova, goveda, svinje, u kvascu i soji.

Prema podacima Claude-a. četvrti deo lipida mikrozoma sastoji se od inozitolfosfatida. Inozitolfosfatidi, koji sadrže dva mola fosforne kiseline (difosfoi-nozitidi) nađeni su u moždanom tkivu.

5.1.3 SFINGOLIPIDI

Glavna alkoholna komponenta sfingolipida je nezasićeni amino-alkohol sfingol. Sfingol ima 18 ugljenikovih atoma, dvostruka veza se nalazi između 4 i 5 ugljenikovog atoma, amino-grupa na drugom, a alkoholne grupe na prvom i trećem ugljenikovom atomu. Hemijsko ime sfingola je: l,3-dihidroksi-2-amino-oktadecen-4.

Sfingolfosfatidi se nalaze u mielinskoj ovojnici nervnog tkiva i po tome se nazivaju sfingomielini. Izolovao ih je Thudichum još 1884. godine iz mozga. U starijoj literaturi poznati su pod imenom diamino-fosfatidi, jer sadrže dva amino-alkohola: sfingol i holin.

Hidrolizom sfingolfosfatida dobija se pored sfingola, jedan mol masne kiseline i fosforil-holin. Masna kiselina je vezana amidno za amino-grupu sfingola, a ostatak fosforilholina estarski sa primarnom alkoholnom grupom sfingola.

U sfingomielinima iz moždanog tkiva nalazi se stearinska, lignocerinska ili nervonska kiselina, a sfingomielini iz pluća i jetre imaju palmitinsku i lignocerinsku kiselinu. Sfingomielini su mnogo stabilniji od drugih fosfatida. Ne rastvaraju se u etru i hladnom alkoholu, a rastvaraju se u hloroformu, benzolu i toplom alkoholu.

Kod urođene smetnje u metabolizmu lipida, dolazi do nagomilavanja sfingomielina u jetri, slezini i mozgu (Niemann- Pieck-ova. bolest).

5.1.4 CEREBROZIDI

Cerebrozidi su prvo izolovani iz mozga (Thudichum 1874. godine) i po latinskom nazivu cerebrum dobili su ime. Mozak je najpogodniji materijal za izolovanje cerebrozida, mada se nalaze i u drugim tkivima: jetri, slezini, bubregu, nadbubrežnoj žlezdi, plućima, timusu, žumancetu jajeta i ribljoj spermi.

Cerebrozidi spadaju u sfingolipide, ali ne sadrže fosfornu kiselinu i holin. Od sfingomielina se razlikuju po tome što umesto fosforilholina imaju jedan mol šećera, obično galaktoze. Zbog toga što sadrže šećer nazivaju se i saharolipidi, odnosno galaktolipidi, ako sadrže galaktozu. Molekul šećera je glikozidno vezan za primarnu alkoholnu grupu sfingola.

Masna kiselina je u cerebrozidima vezana za amino-grupu sfingola na drugom ugljenikovom atomu. Poznate su četiri masne kiseline, koje daju poseban karakter cerebrozidima. Sve one sadrže 24 ugljenikova atoma.

a. Kerazin sadrži zasićenu lignocerinsku kiselinu:CH3(CH2)22COOH

b. Cerebron sadrži cerebfonsku kiselinu:CH3(CH2)21 CHOH . COOH

c. Nervon sadrži nezasićenu (15) nervonsku kiselinuCH3(CH2)7-CH = CH-(CH2)13-COOH

d. Oksinervon sadrži oksinervonsku kiselinu.

Sulfatidi. - Blix je 1933 godine izolovao iz goveđeg srca cerebrozide, koji su sadržavali ostatke sumporne kiseline. Sumporna kiselina je u sulfatidima estarski vezana za treći ugljenikov atom galaktoze. Zbog toga su ovi lipidi kiselog karaktera i nalaze se obično u obliku kalijumove soli. Sadrže uglavnom cerebronsku kiselinu.

Gangliozidi. - U ganglijama su nađeni sfingolipidi, čija se šećerna komponenta sastoji od polisaharida. Pojedini gangliozidi se razlikuju po šećernoj komponenti, koja sadrži pored heksoza, amino-šećere i neuraminsku kiselinu. Na donjoj slici je data formula najrasprostranjenijeg gangliozida G IV.

Formula gangliozida

Prostaglandini. - Prostaglandini su nedavno otkriveni u prostati ovnova i drugih sisara. Pokazalo se, medutim, da se nalaze i u drugim organima i tkivima u vrlo malim količinama. Oni su modulatori aktivnosti hormona. Različiti članovi ove grupe lipida stimulišu kontrakciju glatkih mišića i snižavaju krvni pritisak .

Slika 5.1 - Nastajanje prostaglandina iz poli-nezasićene masne kiseline:8, 11, 14-eikozatrienska kiselina

Prostaglandini nastaju iz poli-nezasićenih masnih kiselina, oksidativnim zatvaranjem ciklopentanskog ili ciklopentenskog prstena na sredini ugljovodoničnog lanca kiseline (slika 5.1).

5.1.5 MICELE, MONO - I BIMOLEKULSKI SLOJEVI POLARNIH LIPIDA

Polarni lipidi se rastvaraju u organskim rastvaračima, a u vodi obrazuju micele. Ovo je karakteristično za sva jedinjenja, koja imaju u svom molekulu i nepolarne (hidrofobne) i polarne (hidrofilne) grupe. Takva jedinjenja se nazivaju amfipatična.

Najprostija amfipatična jedinjenja su sapuni, koji su soli viših masnih kiselina. Oni sadrže nepolarni ugljovodonični niz od 10 i više C-atoma, a na vrhu polarni, negativno naelektrisan anjon (slika 5.2). Ovakva jedinjenja voda disperguje u micele, jer se njihovi nepolarni delovi odbijaju od vode, čiji se molekuli čvrsto drže međusobno povezani vodoničnim vezama. Zbog toga se molekuli sapuna grupišu u micele, upravljajući svoj polami deo prema vodi (odnosno površini micele), a u unutrašnjem delu se zbijaju nepolarni lanci ugljovodnika, privlačeći se van der Waals-ovim silama. Treba da se naglasi, da nema pravih stehiometrijskih veza između ugljovodoničnih lanaca u miceli i zbog toga je pravilnije reći hidrofobne međureakcije. Mnoge ćelijske komponente su amfipatičnog karaktera i grade čestice u kojima je nepolarni deo sakriven od vode (npr. čestice globularnih proteina).

Slika 5.2 Micele, mono- i bimolekulski slojevi lipida u vodi

Fosfogliceridi spadaju u najpolarnije lipide. Njihovi ostaci fosforne kiseline su negativno naelektrisani kod pH=7, a ostatak amino-alkohola (holina, etanolamina) i amino-grupa serina, pozitivno. Pojedini fosfogliceridi se razlikuju u veličini i broju naelektrisanja, što znatno utiče na strukturu micela, kao i mono-i bimolekulskih slojeva lipida koji čine membranu ćelije. Polarni lipidi mogu da se rasprše po vodenoj površini gradeći monomolekulski sloj. U sloju su alifatični lanci upravljeni prema vazdušnoj, gasnoj fazi koja je relativno hidrofobna, a polarni deo lipida se nalazi prema vodenoj površini.

Bimolekulski slojevi lipida lako nastaju, ako se stave u pukotinu između dva vodena prostora. U takvim dvoslojima, alifatični lanac se proteže unutar dvosloja, a polarni delovi štrče prema vodenoj fazi. Ovakav tip fosfolipidnih slojeva ima osobine, vrlo slične ćelijskim membranama. Oni slobodno propuštaju molekule vode, a nepermeabilni su za proste katjone (Na+ i K+) i anjone (Clˉ). Pored toga imaju veliki električni kapacitet i rezistentnost, jer je alifatični lanac izuzetno slab provodnik. Pošto fosfolipidi spontano grade dvosloje, pretpostavlja se da ćelijske membrane imaju lipidno dvoslojno jezgro. U vezi s tim ne treba da se zaboravi, da ćelijska membrana sadrži 40% i više polarnih lipida. Jedino plazma-membrane viših životinja sadrže dosta i holesterola (slika 5.3).

Slika 5.3 - Lipidni sastav membrane eritrocita različitih životinja: H-holesterol, PE-fosfatidiletanolamin, PC-fosfatidilholin i SP-sfingomielin

5.1.6 STEROIDI I KAROTINOIDI

5.1.6.1 UVOD

Steroidi i karotinoidi su derivati nezasićenog ugljovodonika - izoprena. Jedinjenja izoprenske strukture vrlo su rasprostranjena u biljnom i životinjskom svetu. Najvažniji predstavnici ove grupe jedinjenja su, pored steroida i karotinoida, terpeni i kamfori.

Ružička je još 1922. godine pretpostavio da biološka sinteza svih ovih jedinjenja ide preko jednog zajedničkog prethodnika. Ružičkinu »izoprensku hipotezu« su pre tridesetak godina dokazali Lynen, Bloch, Popjak i Folkers. Ustanovljeno je da biološka sinteza steroida i karotinoida ide preko »aktivnog izoprena«, koji nastaje od aktivne sirćetne kiseline odnosno koenzima

O

//

A (CH3 - C ~ S – CoA)

5.1.6.2 PODELA STEROIDA

Steroidi su velika grupa prirodnih jedinjenja s vrlo šarolikim fiziološkim dejstvom. Svi imaju istu osnovnu hemijsku strukturu. Spadaju u lipide koji ne mogu da se saponifikuju tj. posle dejstva alkalija zadržavaju lipoidni karakter.

Steroidi se dele na:

Sterole

1) Zoosterole, životinjskog porekla

2) Fitosterole, biljnog porekla i

3) Mikosterole iz gljivica

Vitamine D grupe

Žučne kiseline

Saponine

Kardiaka biljnog porekla

Seksualne hormone: estrogene, gestagene ili progestacione i androgene

Kortikosteroide - hormone kore nadbubrežne žljezde. U sledećoj tabeli dat je pregled najvažnijih steroida.

5.1.6.3 STEROLI

Osnovni ugljovodonik iz koga se izvode steroli, žučne kiseline, seksualni hormoni i hormoni kore nadbubrežne žljezde jeste ciklopentano-perhidrofenantren, koji se zove steran. Steran je zasićeni alicikličan ugljovodonik.

Steroidi i njihova biološka funkcija

Grupa Predstavnik Mesto nalaženja i funkcija

1. Steroli Holesterol nalazi se u svim životinjskim ćelijama i plazmi; izgraduje ćelijsku membranu i polazni je materijal za sintezu mnogih steroida

  7-dehidro-holesterol

nalazi se u koži; provitamin D

  Ergosterol nalazi se u kvascu; provitamin D

2. Žučne kiseline

Holna kiselina nalazi se u žuči i crevima; olakšava resorpciju masti

Hormoni sa 21 C-atoma

Progesteron hormon Corpus luteuma

sa 19 C-atoma sa 18 C-atoma

  Kortekson Kortizol

hormoni kore nadbubrežne žlezde

sa 19 C-atoma

Testosteron hormon testisa

sa 18 C-atoma

Estradiol hormon folikula

Radi lakše klasifikacije i nomenklature mnogobrojnih derivata sterana, ugljenikovi atomi u prstenu su numerisani, a pojedini prstenovi obeleženi velikim slovima na sledeći način:

Steroli su alkoholni derivati sterana, koji na 17 ugljenikovom atomu imaju bočni lanac, a na 10 i 13 ugljenikovom atomu metil-grupu (—CH3). Pojedini steroli se međusobno razlikuju po dužini i srtukturi bočnog lanca na 17 C-atomu i stepenu zasićenja steranovih prstenova. Alkoholna grupa se u sterolima često nalazi na trećem ugljenikovom atomu.

Steroli su čvrste kristalne supstance, koje se nalaze u neosapunjivoj frakciji biljnih i životinjskih masti. Prema mestu nalaženja mogu se podeliti na:

1) Zoosterole — životinjskog porekla

2) Fitosterole — biljnog porekla

3) Mikosterole — iz gljivica

Holesterol (C27H46O) ili holesterin je najvažniji sterol životinjskog porekla. To je i prvi steroid koji je pronađen i izolovan iz žučnih kamenaca krajem 18. veka. Ime mu je dao Chevreuil, a znači mast iz žuči (Cholestearin).

Holesterol je čvrsta kristalna supstanca, rastvara se u organskim rastvaračima i optički je aktivan. Zajedno sa fosfatidima izgrađuje ćelijske membrane. Ima ga u svim životinjskim organima, a najviše u mozgu (do 10%). Kada se mozak razriba sa peskom i ekstrahuje toplim alkoholom, dobijaju se posle hlađenja relativno čisti kristali holesterola. U krvi ima oko 200 mg% holesterola, od čega je oko 35% esterifikovano masnim kiselinama (estri holesterola). U serumu je odnos obratan.

Kod čitavog niza oboljenja (masna degeneracija jetre, tumori, atheroskleroza) dolazi do nagomilavanja holesterol-estara.

Iz formule holesterola se vidi da bočni niz ima osam ugljenikovih atoma i da se u prstenu B nalazi dvoguba veza između 5 i 6 ugljenikovog atoma. Katalitičkom hidrogenizacijom dvogube veze u prstenu B holesterola dobijaju se dva izomerna sterola: holestanol i koprostanol.

Holestanol i koprostanol su cis: trans-izomeri. Ovde se susrećemo sa geometrijskom izomerijom, koja nastaje zbog toga što su zajednički ugljenikovi atomi kondenzovanih prstenova fiksirani i supstituenti na njihovim valencama ne rotiraju slobodno u prostoru. Tako su u steranovom prstenu fiksirani 5 i 10, 8 i 9 i 13 i 14 ugljenikov atom. Kada se na ovakvim ugljenikovim atomima nalaze dva različita supstituenta, oni mogu da leže iznad ili ispod ravni prstena. U slučaju kada se oba supstituenta nalaze na istoj strani ravni (iznad ili ispod) radi se o cis, a ako se nalaze jedan ispod a drugi iznad ravni prstena, onda se radi o trans-izomeru. Cis-izomer se obeležava sa β, a trans sa α. Trans položaj se u formulama obeležava isprekidanom linijom, a cis punom.

U prirodnim steroidima su prstenovi B, C i D uvek u trans-položaju, a samo prstenovi A i B mogu da zauzimaju cis i trans-položaj. Iz tog razloga je kod steroida dogovorno uzeto da kao fiksna tačka za obeležavanje izomera bude metil-grupa (CH3) na 10 ugljenikovom atomu, koja se uvek piše iznad prstena (cis).

Treći ugljenikov atom sterola na kome se nalazi hidroksilna grupa je asimetričan, a —OH grupa je u položaju cis (β) kod svih prirodnih sterola.

Pošto steroidi izgrađuju ćelijske membrane od bitne je važnosti da molekuli steroida priležu uz membranu. Zbog toga su samo oni steroidi sastavni delovi membrana čiji molekuli imaju određeni izgled u prostoru. Molekuli

steroida se sastoje od cikloheksanskih prstenova, koji ne leže u jednoj ravni, već mogu da imaju izgled stolice ili korita.

Iako u prirodnim sterolima svi prstenovi imaju izgled stolice, drugi oblik imaju molekuli čiji prstenovi (A i B) zauzimaju trans-položaj, od onih kod kojih su ovi prstenovi u cis-položaju.

Na donjoj slici se jasno vidi da samo molekul holestanola može da prileže uz membranu, dok molekuli koprostanola ne mogu. Kod njih se prstenovi A i B nalaze u cis-položaju i zbog toga prsten A štrči

Slika 5.4 - Prostorni izgled molekula sterola sa različitim položajem prstenova A : B

Holesterol daje čitav niz bojenih reakcija, koje se upotrebljavaju za njegovo određivanje. Tako se hloroformski rastvor holesterola oboji postepeno ljubičasto dodatkom koncentrovane sumporne kiseline. To je reakcija po Salkowskom. Za kvantitativno određivanje holesterola upotrebljava se Libermann-Burchard-ova reakcija. Po ovim metodama određuje se ukupna količina holesterola (slobodnog i esterifikovanog). Odvajanje slobodnog od esterifikovanog postiže se taloženjem sa digitoninom. Digitonin taloži specifično samo -sterole. Esterifikovani holesterol se ne taloži, jer je hidroksilna grupa na trećem ugljenikovom atomu esterifikovana masnom kiselinom.

Holesterola ima u velikoj količini u kožnoj masti. Ta mast se industrijski dobija iz ovčije vune. Prečišćena se upotrebljava u medicini i kozmetici pod imenom lanolin (Adeps lanae).

Životinjski organizam sintetiše holesterol. Kokoška sintetiše celokupni holesterol koga snese u jajima. In vitro je dokazano da se sinteza holesterola dešava u jetri, a verovatno i u drugim organima. Na eksperimentalnim životinjama takođe je dokazano da iz holesterola

nastaju žučne kiseline i čitav niz hormona ciklo-pentano-perhidro-fenantrenske strukture.

Holestanol i koprostanol. — Koprostanol nastaje iz holesterola u crevima dejstvom bakterija (bakterijska redukcija) i zbog toga se nalazi redovno u fekalijama (kopros — izmet).

Holestanol se nalazi stalno pored holesterola u životinjskom organizmu. Verovatno nastaje enzimskom hidrogenizacijom holesterola u tkivu. Holestanol se teško apsorbuje, stoga ga ima u izmetu daleko više od holesterola.

7-Dehidro-holesterol nalazi se kod čoveka isključivo u koži a sadrži u prstenu B dve konjugovane dvogube veze. On je provitamin vitamina D3.

7-DEHIDROHOLESTEROL VITAMIN D3 (HOLE)- KALCIFEROL

Slika 5.5 - Nastajanje vitamina D3 iz provitamina dejstvom ultravioletne svetlosti

Stigmasterol (biljni sterol) ima istu konfiguraciju kao i holesterol, a u osnovi i istu strukturu; razlikuje se samo po etilnoj grupi, koja se nalazi na 24 ugljenikovom atomu u bočnom lancu i jednoj dvoguboj vezi na 22 ugljenikovom atomu (22).

STIGMASTEROL C29H48O

Stigmasterol je dobio ime po Stigmata Maydis (dugački vratovi tučkova kukuruznog cveta), odakle je prvi put izolovan. Najviše ga ima u soji — do 25% ukupnih sterola. Stigmasterol je postao od industrijskog i medicinskog značaja od kako se uzima kao polazni materijal za sintezu progesterona i dezoksikortikosterona.

Većina fitosterola ima 29 ugljenikovih atoma i dve nezasićene veze. To su spinasterol iz spanaća, brasikasterol iz slačice, fukosterol iz smeđih algi, sinhol iz kininove kore i sitosteroli iz raznih biljaka.

Ergosterol je jedini steroid mikroorganizma, čija je struktura poznata. Nalazi se u kvascu odakle se tehnički i dobija. Prvo je dobijen iz glavnice raži (francuski ergot = Secale cornutum), koja nastaje kad se neoplođeni cvet raži zarazi gljivicom Claviceps

purpurea. Ergosterola ima i u plesni Aspergillus, Neurospora i u lišajevima.

Taloži se digitoninom (3— β-ol) i ima tri nezasićene veze. Konjugovane dvogube veze u prstenu B (—5,7) karakteristične su za provitamine D grupe.

U glavnici postoji još jedan steroid — fungisterol, a u kvascu — zimosterol.

5.1.6.4 VITAMINI D GRUPE

Rahitis ili engleska bolest je pojava usporene kalcifikacije kostiju kod dece i kod mladunaca domaćih sisara i pilića. Kod dece koja su prohodala savijaju se duge kosti nogu i dobijaju O oblik, a kod manje dece rahitis se lako opaža po zakasnelom zarašćivanju fontanele i ispupčenom čelu. Rendgenski se vidi rskavičast karakter kostiju u blizini zglobova, što služi kao biološki test na eksperimentalnim životinjama. Kod rahitičnih životinja (svinja) pojavljuju se rahitične kvržice na rebrima.

Hopkins je već 1906 godine pretpostavio da je ova patološka pojava u vezi s nedostatkom »akcesornih« sastojaka hrane. Razinsky je smatrao da rahitis nastaje usled nedostatka sunčeve svetlosti. Docnije je Windaus-ove škola utvrdila da zračenje životnih namirnica može da zameni sunčanje pacijenata, a dejstvom ultravioletne svetlosti na ergosterol dobijen je antirahitični princip i nazvan vitamin. D.

Kalciferol. — Dejstvom fotona ultravioletne svetlosti određene frekvencije na ergosterol nastaju u njegovom molekulu strukturne promene. Preduslov za te promene je postojanje konjugovane dvogube veze u prstenu B (provitamini D grupe) koju svetlosna energija otvara između 9 i 10 ugljenikovog atoma. Jedinjenja iz kojih mogu da nastanu vitamini zovu se provitamini.

Slika 5.6 — Nastajanje vitamina D2 iz ergosterola dejstvom ultravioletne svetlosti

Proces unutrašnjih strukturnih promena u molekulu provitamina nije tako jednostavan, tako da pored kalciferola nastaju i sporedni proizvodi kao: lumisterol, tahisterol i dr.

Englezi su prvi napravili čist preparat vitamina D2, kome su dali ime kalciferol, jer pomaže mineralizaciju kostiju.

Iako vitatnin D2 ima potpuno antirahitično dejstvo, vertebrati imaju jedan drugi vitamin. Taj vitamin, nazvan D3, prvo je izolovao Brockmann hromatografijom u koloni iz ribljeg ulja, a Windaus je sintezom dobio njegov provitamin iz holesterola → 7-dehidroholestrol.

7-dehidroholesterol nalazi se kod čoveka isključivo u koži, gde se leti dejstvom sunčeve svetlosti akumuliraju rezerve potrebne za zimu. Nižim životinjama je kalciferol verovatno prirodni D vitamin. Poznat je i vitamin D4 i D5.

Vitamini D grupe rastvaraju se isključivo u mastima. Nalaze se u uljima jetre (Oleum jecoris) riba (bakalara, tune, halibut) u velikim količinama (0,2 mg%). Za čovekovu ishranu i profilaksu zanimljiv je sadržaj provitamina D3 (7-dehidro-holesterola) u svinjskim kožicama.

Vitamin D određuje se biološkim i hemijskim metodama. Najpoznatija hemijska metoda je po Carr-Price-u sa SbCl3. Kao standard služi 0,1% rastvor kristalnog, zračenog ergosterola u maslinovom ulju; 1 mg ovog rastvora ima jednu I. J. (internacionalnu jedinicu), a to je identično sa 0,025 g vitamina D2 ili 0,1 g zračenog ergosterola.

5.1.6.5 ŽUČNE KISELINE

Žuč koju izlučuje jetra izliva se u duodenum zajedno sa sokom pankreasa. Ona sadrži pored boja, holesterola, mucina i žučne kiseline. Žučne kiseline su oksidacioni produkti steroida. One su kod sisara konjugovane sa glicinom ili taurinom.

H 2N-CH 2-COOH H2N-CH2-CH2—SO2OH

glicin taurin

Sve žučne kiseline smatramo teorijski derivatima holanske kiseline C23H39COOH, koje nema u žuči:

U holanskoj kiselini vodonik na 5 ugljenikovom atomu nalazi se u cis-položaju i prema tome žučne kiseline imaju koprostansku strukturu. Bočni lanac na 17 ugljenikovom atomu je valerijanska kiselina.

Holna kiselina je 3, 7, 12α trioksiholanska kiselina. Ima je u čovečijoj i goveđoj žuči, a i kod drugih vertebrata. Hidroksilna grupa na trećem ugljenikovom atomu je u položaju trans (α) kod svih žučnih kiselina, tako da nijedna ne reaguje sa digitoninom. Holne kiseline ima u žuči u daleko većoj koncentraciji od ostalih žučnih kiselina. Konjugovana sa glicinom zove se glikoholna, a sa taurinom tauroholna kiselina:

gliko - holna kiselina tauro - holna kiselina

Dezoksiholna kiselina je dioksiholanska kiselina (3α, 12α). Prati holnu kiselinu kod svih spomenutih životinjskih vrsta. Isto se tako nalazi u žuči konjugovana sa taurinom odnosno glicinom (dezoksiholna i glikodezoksiholna kiselina). Holna i dezoksiholna kiselina razlikuju se po rastvorljivosti njihovih barijumovih soli u alkoholu. One se mogu odvojiti i hromatografski.

dezoksi - holna kiselina litoholna kiselina

Hiodezoksiholna kiselina (3α, 6α-dioksiholanska kiselina) nađena je prvi put u svinjskoj žuči (hys = svinja) vezana za glicin.

Henodezoksiholna kiselina je izolovana prvo iz kokošije i guščije žuči. Izgleda da je to žučna kiselina zajednička gmizavcima i pticama. U neznatnoj količini ima je i u ljudskoj žuči. Ona je 3α 7α-dioksiholanska kiselina.

Litoholna kiselina je dobila ime po tome što se nalazi u žučnim konkrementima (lithos = kamen). U žuči je ima malo 0,01—0,02%. Može lako da se izoluje, jer se njena barijumova so teško rastvara. Litoholna kiselina je 3α-holanska kiselina.

Žučne kiseline nastaju u jetri iz holesterola, što je dokazano sa izotopno obeleženim jedinjenjima. Vezivanje sa glicinom i taurinom dešava se »in situ«.

Žučne kiseline i njihove soli smanjuju površinski napon, deluju kao emulgatori, stabilizuju emulzije lipida i na taj način direktno i indirektno aktiviraju delovanje lipaza i apsorpciju masnih kiselina u crevima.

5.1.6.6 SAPONINI

Saponini su glikozidi, koji smanjuju površinski napon vode. Mućkanjem njihovih rastvora dobija se intenzivna i trajna pena kao kod sapuna.

Rastvori saponina dejstvuju hemolitički. Kvalitet saponina različitog porekla određuje se po jačini hemolize eritrocita u fiziološkom rastvoru. Najinteresantniji saponin je digitonin iz lišća digitalis vrsta, koji specifično taloži steroide s 3 β-hidroksilom (trans).

Saponini imaju do 5 molekula glikozidno vezanih monosaharida. Posle otcepljenja šećera ostaju genini (aglikoni) sa 27 ugljenikovih atoma.

5.1.6.7 KARDIACI BILJNOG POREKLA

U biljkama se pored saponina nalaze često i steroidni glikozidi, koji na specifičan način stimulišu rad srca. U većim dozama prekidaju rad srca u sistoli. Primitivni narodi stavljaju ekstrakte takvih biljaka na vrhove strela radi otrovnog delovanja.

Glikozidi domaće biljke Digitalis purpurea i Digitalis lanata, purpurea glikozidi, digilanid, gitoksin i digitoksin izolovani su u kristalnom stanju i upotrebljavaju se u medicini. Njihovi genini su gitoksigenin i digitoksigenin, a šećeri digitoksoza i glukoza.

DIGITOKSIGENIN

Drugi važni glikozidi koji deluju na rad srca su strofantidin i konvalatoksin u listovima đurđevka (Convallaria maialis).

Svi srčani glikozidi daju Legal-ovu reakciju na aceton, zbog toga što sadrže keto-grupu u bočnom lancu i dvogube veze između 20. i 21. ovo ugljenikovog atoma.

5.1.6.8 STEROIDNI HORMONI

Žlezde s unutrašnjom sekrecijom izlučuju supstance, koje u vrlo malim količinama imaju specifično fiziološko dejstvo. Ovakve aktivne supstance zovu se hormoni. U nadbubrežnoj žlezdi, ovariju, corpus luteumu, testisima, nastaju od holesterola steroidni hormoni.

Najbolje je ispitano nastajanje steroidnih hormona u nadbubrežnoj žlezdi, gde je ono i najraznovrsnije.

Radi boljeg razumevanja stmkture steroidnih hormona i njihove biološke sinteze, treba da ih podelimo prema broju ugljenikovih atoma na:

1) Hormone sa 21 ugljenikovim atomom. U ovu grupu spada hormon corpusluteuma — progesteron i hormoni kore nadbubrežue žlezde: kortekson, kortikosteron, kortizol, aldosteron i dr.

2) Hormone sa 19 ugljenikovih atoma. Najvažniji hormon ove grupe je hormon testisa — testosteron.

3) Hormone sa 18 ugljenikovih atoma. U ovu grupu spadaju ženski seksualnihonnoni poznati pod imenom estrogeni. Predstavnik ove

grupe je estradiol.

C21 — Steroidni hormoni. — U ovu grupu spada progesteron i hormoni kore nadbubrežne žlezde, poznati pod imenom kortikosteroni. Progesteron je hormon corpus luteuma, koji priprema mukozu uterasa da se oplođeno jaje smesti.

Do danas je otkriveno oko tridesetak kortikosterona od kojih su najvažniji: aldosteron, kortekson, kortikosteron, kortizol i kortizon. Njihova fiziološka uloga je vrlo raznovrsna: regulišu metabolizam elektrolita, ravnotežu vode, metabolizam ugljenih hidrata, masti i proteina.

PREGNAN

Progesteron i hormoni kore nadbubrežne žlezde su po svojoj hemijskoj strukturi derivati zasićenog alicikličnog ugljovodonika — pregnana.

Biosinteza C21 steroidnih hormona polazi od holesterola, skraćivanjem njegovog bočnog lanca na 17-tom ugljenikovom atomu. Prvi međuproizvod je pregnenolon, koji još uvek ima —OH grupu na trećem ugljenikovom atomu, a na 20. keto-grupu. Hemijsko ime pregnenolona je: pregnen-3-ol-20-on. Dehidrogenizacijom pregnenolona nastaje najvažnije jedinjenje ove sinteze progesteron.

Slika 5.7 — Nastajanje progesterona iz holesterola

Hormoni kore nadbubrežne žlezde nastaju iz progesterona uvođenjem jedne ili više —OH grupa u njegov molekul. Hidroksilacija progesterona odnosno uvođenje —OH na 21, 17 i 11. ugljenikov atom, odigrava se na principu oksigeniranja sa O2 uz NADP i katalitičkim dejstvom enzima steroid-oksigenaza. Poznata je 17-oksigenaza, 21. -oksigenaza i 11-oksigenaza, koje katalizuju uvođenje —OH grupa na 17., 21. i 11. ugljenikov atom u molekulu progesterona. Dejstvom oksigenaza jedne za drugom

nastaje kortizol, preko hidroksi-progesterona. Intetesantno je napomenuti da 17-oksigenaza ne dejstvuje na 21-hidroksi jedinjenje progesterona. Ona ne dejstvuje, dakle posle 21-oksigenaze nego samo pre nje. Ako se na 21. ugljenikovom atomu nalazi — OH grupa, tada ne može više da se dobije steroid sa —OH grupom na 17. ugljenikovom atomu. Od progesterona nastaje u tom slučaju kortikosteron (levi deo sheme).

Slika 5.8. – Biosinteza hormona kore nadbubrežne žlezde

Steroidi, koji na 11. ugljenikovom atomu imaju hidroksilnu grupu reverzibilno prelaze u 11-ketosteroid. Tako kortizol reverabilno prelazi u kortizon.

Aldosteron, jedan od vrlo aktivnih kortikosterona, sadrži na 18. ugljenikovom atomu aldehidnu grupu. Ona nastaje verovatno oksidacijom —CH3 grupe na 18. ugljenikovom atomu. Aldehidna grupa u aldosteronu nije slobodna, već gradi poluacetalni prsten sa —OH grupom na 11. C-atomu.

17-Ketosteroidi su proizvodi raspadanja steroidnih hormona. Sastavni i neophodni stepen u procesu hormonalne regulacije je stalno inaktiviranje i izlučivanje hormona mokraćom. Prilikom inaktiviranja hormona dolazi do promena u njihovoj hemijskoj strukturi. Ovi procesi se dešavaju u jetri, gde se inaktivirani hormoni i detoksiciraju vezivanjem za glukuronsku kiselinu. Oni se u obliku glukuronida izlučuju u mokraći.

Inaktivisanjem steroidnih hormona nastaju jedinjenja poznata pod imenom 17-ketosteroidi, što označava da ona na 17. C-atomu steranovog prstena imaju keto grupu.

Određivanje i praćenje koncentracije 17-ketosteroida u mokraći je za dijagnostiku u humanoj medicini od velikog značaja. Normalni čovek izlučuje dnevno 10—20 mg 17-ketosteroida.

C19-Steroidni hormoni. — Najvažniji steroidni hormon sa 19 ugljenikovih atoma je testosteron. Nalazi se u testisima, gde se i odvija njegova sinteza.

Testosteron i njegov derivat androsteron dejstvuju na muški genitalni trakt i direktno utiču na pojavu sekundaraih muških karakteristika: porast brade, rast petlove kreste, rogova kod ovna i bika, itd.

Testosteron nastaje od progesterona preko međuproizvoda 17α-hidroksi-progesterona i androstendiona. Pri tome dolazi do skraćivanja bočnog lanca na 17. ugljenikovom atomu za dva ugljenikova atoma.

Slika 5.9. - Biosinteza testosterona i androsterona

Androsteron je prvi put izolovan iz mokraće u kojoj ga normalno ima 1—2 mg u litri. Androsteron je 17- ketosteroid i može da nastane razlaganjem kortikosterona.

Steroidni hormoni sa 18 ugljenikovih atoma . U ovu grupu spadaju ženski seksualni hormoni — estrogeni. Zovu se i folikularni hormoni, jer nastaju u folikulama ovarija za vreme menstrualnog ciklusa. Estrogeni izazivaju estrus kod nezrelih ženki pacova tj. naglo sazrevanje i seksualni nagon.

Svi estrogeni su derivati ugljovodonika sterana, samo je prsten A aromatičnog karaktera (benzenov). Zbog toga —OH grupa na trećem ugljenikovom atomu ima osobine fenola. Osim toga, zbog dvogube veze između 5 i 10 ugljenikovog atoma u prstenu A, estrogeni nemaju —CH3 grupu na 10 ugljenikovom atomu. Najvažniji estrogeni hormoni su: estron, estradiol i estriol.

Estradiol je najaktivniji i reverzibilno prelazi u estron pod dejstvom enzima estradiol-NAD-17-β-oksidoreduktaze.

Estron prelazi u estriol ireverzibilno. Estriol se izlučuje u mokraći kao glukuronid.

Estrogeni su nađeni u folikulima ovarija, ali se nalaze i u mokraći trudnica, placenti, nadbubrežnoj žlezdi. Interesantno je da estrona ima i u biljnom materijalu (jezgra kokosovih oraha).

U mokraći kobila (equus — lat. konj) otkrivena su još dva estrogena hormona: ekvilin i ekvilenin.

Pošto se nalaze samo u moraći, pretpostavlja se da su ekvilin i ekvilenin nastali metaboličnom desaturacijom estrona.

Supstance sa estrogenim dejstvom nemaju specifičnu konstituciju ili bar hemijsku grupaciju (funkciju) odgovornu za hormonalnu

aktivnost. To se vidi ne samo iz strukture estrogenih hormona, nego naročito iz činjenice da su u raznom biološkom materijalu nađene supstance estrogenog dejstva: biljnim klicama, cvetovima, plodovima, tresetu, mrkom i kamenom uglju, nafti. Nije se moglo dokazati da su te supstance identične sa estronom i estriolom, kao što je bio slučaj kod izolovanja iz palmine masti.

Postoje i sintetički preparati estrogenog dejstva kojima se sličnost s prirodnim hormonima jedva naslućuje. Jedan od njih je stilbestrol (bis-p-oksifenil-dietileten).

5.1.7 KAROTINOIDI

Karotinoidi ili lipohromi su obojene supstance masnog karaktera, koje se uglavnom nalaze u biljnim uljima. Od njih potiče crvena boja paradajza (likopin), narandžasta boja šargarepe (α i β-karotin), žuta boja kukuruza (zeaksantin) i dr. Ime su dobili po tome što su prvi put izolovani iz šargarepe (Daucus carota). Postoje, takođe i životinjski karotinoidi, od kojih je najpoznatiji skvalen.

Biljni karotinoidi igraju važnu ulogu u selektivnoj apsorpciji svetlosti kod fotosinteze. Uneseni u životinjski organizam doprinose pigmentaciji kože, corpus luteuma i krvnog seruma.

Primenjujući hromatografiju na koloni po Cvet-u, koja se sastoji u tome što se kroz stub napunjen nekim adsorbensom (CaCO3, Al2O3 i dr.) propušta petrol-etarski ekstrakt različitog biljnog materijala, izolovano je do danas preko 60 karotinoida.

Karotinoidi se mogu podeliti na:

a) Ugljovodonike — karotine

b) Hidroksilne derivate ugljovodonika — ksantofile i

c) Karotinoidne kiseline

Po svom hemijskom karakteru karotinoidi su derivati izoprena. Molekuli karotinoida sadrže veliki broj konjugovanih dvogubih veza, imaju 40 ugljenikovih atoma tj. osam ostataka izoprena, pa se ubrajaju u tetraterpene. Zbog velikog broja dvogubih veza u molekulima karotinoida postoji mogućnost cis-trans izomerije na svakoj dvoguboj vezi. Dokazano je da većina prirodnih karotinoida ima trans-konfiguraciju.

Biološka sinteza karotinoida polazi od jedinica sa dva ugljenikova atoma (acetil-koenzima A), preko mevalonske kiseline, katalizom specifičnih biljnih enzima. Pošto su karotinoidi simetrično građeni, pretpostavlja se da u toku biosinteze dolazi do kondenzacije dva ugljovodonika od 20 ugljenikovih atoma (geranil-geranil-pirofosfat) u C40 ugljovodonik.

Likopin je nezasićeni, lančasti ugljovodonik, koji plodovima paradajza daje lepu crvenu boju (Solanum lycopersicum). Molekul mu je simetričan, ima 13 nezasićenih veza, od kojih su 11 konjugovane. U formuli je tačkastim linijama podeljen molekul likopina na ostatke izoprena.

Karotini su strukturno izomerni s likopinom. Od njega se razlikuju po tome što im se lanci završavaju šestočlanim prstenom, koji se u likopinu samo nazire. Prsteni karotina strukturno odgovaraju terpenima, α i β jononu.

Poznata su tri izomerna karotina: α, β i γ-karotin, α-karotin je nađen u šargarepi, kokosovim orasima, pitomom kestenu. β-karotin se nalazi prvenstveno u šargarepi, paprici, zelenom lišću (industrijski se ekstrahuje iz trave). γ-karotina ima u kajsijama.

Kod β-karotina su dvogube veze u prstenu konjugovane sa dvogubom vezom, koja se nalazi u lancu. Ovakav položaj dvogubih veza je od fiziološkog značaja, jer samo od β-jononske strukture može da nastane vitamin A.

α-karotin ima s jedne strane molekula β-jononski prsten, a lanac se završava sa α-jononskim prstenom. β-karotin ima na oba kraja lanca β-jononski prsten. γ-karotin ima pored jednog β-jononskog prstena otvoreni završetak lanca kao likopin.

Karotini su važni zbog toga što su prirodni izvori provitamina grupe A vitamina.

Ksanotofili. — Veliki broj karotinoida ima hidroksilnu grupu u jononskom prstenu i to u para-položaju prema ugljovodoničnom lancu. Poznat je veliki broj oksi-derivata β-karotina među žutim i crvenim pigmentima: zeaksantin (kukuruz) violaksantin (cvet dan i noć), astacin (crveni pigment rakova) rubiksantin (crvena boja šipka).

Na ovom mestu treba da spomenemo skoro potpuno zasićeni alkohol fitol, koji se dobija razlaganjem hlorofila. Fitol je primarni alkohol sa 20 ugljenikovih atoma i dvogubom vezom u položaju 2. Sastoji se od četiri ostataka izoprena. Ostatak fitola je sastavni deo molekula hlorofila i vitamina E i K grupe.

5.1.7.1 VITAMINI A GRUPE

Vitamin A1 (Axerophtol) je primarni alkohol, koji ima β-jononski prsten, pet dvogubih veza od kojih su dve konjugovane. Izolovao ga je Karrer 1931. godine. Vitamin A1 nastaje iz β-karotina oksidacionim cepanjem centralne etilenske veze i primanjem dva molekula vode. Prvi proizvod cepanja karotina je aldehid vitamina A1—trans-retinin1. Redukcijom aldehida retinina nastaje vitamin A1. Pošto je molekul β-korotina simetričan, od njega se dobijaju dva molekula vitamina A 1. Ostali provitamini (α i γ-karotin i kriptoksantin) daju jedan molekul vitamina, jer samo na jednom kraju lanca sadrže β-jononski prsten.

Slatkovodne ribe sadrže vitamin A2, koji nije važan u ishrani sisara. On sadrži u β-jonskom prstenu konjugovane dvogube veze.

Vitamini A spadaju u grupu vitamina koji se rastvaraju u mastima i organskim rastvaračima. Osetljivi su prema kiseoniku i ultraljubičastoj svetlosti. U odsustvu vazduha dosta su otporni pri zagrevanju.

Vitamini A grupe imaju karakterističan apsorpcioni spektar (max. 325—328 nm) i potpuno različit od karotina. Sa SbCl 3 daju lepu plavu boju, što se koristi za kvantitativno određivanje A vitamina (Carr — Price-ova. reakcija).

Nalaze se samo u hrani životinjskog porekla. Vrlo bogat izvor A 1

vitamina su jetrena ulja morskih riba.

Rezerve vitamina A esterifikovanog sa višim masnim kiselinama, nalaze se u jetri. Jetra održava konstantnu koncentraciju vitamina A u krvnoj plazmi; ako u hrani nema vitamina A, njegova koncentracija se u krvi ne menja znatno i po nekoliko meseci.

Vitamini A su zaštitni vitamini epitela, antikseroftalmični i antiinfektivni vitamini. Danas je poznata samo njihova uloga u fiziologiji vida.

Boll je 1877. godine, izolovao iz oka žabe vidni purpur ili rodopsin. Ovo jedinjenje je osetljivo na svetlost. Sastoji se iz dve komponente: belančevine opsina i prostetične grupe, koja je aldehidni derivat vitamina A1 (11-cis-retinin ili neoretinin b).

5.1.7.2 VITAMINI E GRUPE

Vitamini E grupe spadaju u grupu vitamina koji se rastvaraju u mastima i organskim rastvaračima. Poznati su pod imenom tokoferoli, koje dolazi od grčkih reči tokos — porođaj i fero — nosim.

Vitamini E nalaze se rastvoreni u biljnim uljima, naročito onima koja se dobijaju iz pšeničnih klica. E vitamini su uljaste tečnosti, postojane pri zagrevanju u odsustvu vazduha do 200° i otporne prema kiselinama i alkalijama. Oksidaciona sredstva ih razaraju.

Poznata su četiri tokoferola: α, β-, γ- i -tokoferol. Biološki je najaktivniji α-tokoferol.

Tokoferoli se sastoje iz dve komponente: aromatičnog jezgra (metilovani hidrohinon) i karotinoidnog alkohola — fitola. Fitol se vezuje preko jedne fenolne grupe, a druga ostaje slobodna. Pri ovom vezivanju nastaje hromanski prsten, a ostatak alkohola fitola nalazi se u bočnom lancu:

Vitamini E su antioksidansi, koji štite mnoge supstance od ireverzibilne oksidacije. Tako na primer, sprečavaju stvaranje peroksidnih derivata nezasićenih masnih kiselina, koji dejstvuju razorno na celularne enzime.

Vitamini E su poznati i pod imenom antisterilitetni vitamini, jer su bitni za normalnu sposobnost reprodukcije. Njihov nedostatak manifestuje se na različit način kao: resorpcijom fetusa, sterilitetom i akutnom muskularnom distrofijom.

5.1.7.3 FILOHINON I UBIHINON

Filohinon ili vitamini K1 nađen je u zelenom bilju (filos — list). Derivat je naftohinona, koji na položaju 3 ima ostatak alkohola fitola. Pored vitamina K1 nađena su još dva vitamina ove grupe, koja se razlikuju po bočnom lancu. Tako vitamin K2 ima umesto ostatka fitola difarnezilni ostatak. Svi vitamini K grupe imaju isti aromatični deo — 1,4-naftohinonski prsten. Dokazano je da i sam menadion (2-metil-l,4-naftohinon) pokazuje biološku aktivnost kao i vitamini ove grupe.

Vitamini K grupe sprečavaju da dođe do krvavljenja, što je povezano s njihovom ulogom u sintezi protrombina (antihemoragični vitamini).

Vitamin K2 sintetišu bakterije crevne flore. Nedostatak K vitamina javlja se kad se bakterije crevne flore unište antibioticima ili kod novorođenčađi, kojima mikroorganizmi u crevima još nisu stvorili potrebne rezerve K vitamina.

Ubihinon, kao što mu samo ime kaže, vrlo je rasprostranjen i to kako u životinjskom tako i u biljnom svetu. U relativno velikoj koncentraciji ga ima u mitohondrijama. Poznat je i pod imenom koenzim Q.

Po svojoj hemijskoj strukturi je sličan filohinonu i tokoferolima. Naime, sastoji se iz aromatičnog odnosno hinonskog prstena, za koji je vezan bočni izoprenski lanac.

Bočni lanac nastaje u organizmu od mevalonske kiseline. Za ubihinon nije dokazano vitaminsko dejstvo. Međutim postoje indicije da učestvuje u respiratomom lancu kao prenosilac vodonika.

Ubihinoni različitog porekla razlikuju se po broju izoprenskih ostataka u bočnom lancu.

5.2 METABOLIZAM LIPIDA

Posle ugljenih hidrata, neutralne masti su po količini glavna hrana za većinu životinja i vrlo važan izvor energije. Više životinje i biljke mogu da odlažu velike količine neutralnih masti, da bi im služile kao energetska rezerva. Neutralne masti imaju veću kaloričnu vrednost (oko 37 kJ/g) od glikogena i skroba, jer ne sadrže vode. Utvrđeno je da kičmenjaci dobijaju polovinu svoje energije oksidacijom masnih kiselina u jetri, bubrezima, srcu i skeletnim mišićima u stanju mirovanja. Masti su jedini izvor energije u gladovanju, zimskom snu prezimara i godišnjoj seobi ptica.

Jedino se u moždanom tkivu ne vrši oksidacija masnih kiselina, jer je njegov jedini izvor energije glukoza.

5.2.1 VARENJE I APSORPCIJA DIJETALNIH MASTI

Lipaze pankreasnog soka i creva hidrolizuju emulgovane masti. Stabilne emulzije triglicerida, čije čestice imaju 500—1000 nm u prečniku, nastaju u prisustvu žučnih soli i fosfolipida duodenuma. Emulgovanjem se jako povećava površina masnih čestica i olakšava (ubrzava) dejstvo lipaza. Glavni produkti hidrolize masti su slobodne masne kiseline i β-monogliceridi. Oni, raspršeni u micele prečnika 3—8 nm, zajedno sa žučnim solima i žučnim fosfolipidima ulaze u ćelije intestinalne mukoze. Unutar ćelija, većina slobodnih masnih kiselina iz micela ponova se pretvara u trigliceride.

Biosinteza triglicerida u intestinalnim ćelijama ide tako da kao supstrat služe bilo monogliceridi bilo -glicerofosfat (slika 5.10). U svakom slučaju slobodne masne kiseline se energetski obogaćuju prelazeći u derivat acil-KoA:

α-Glicerofosfat može da nastane bilo od glicerola bilo od glukoze:

glicerol kinaza

a)

b)

Resintetizovani trigliceridi se oblikuju u kapi prečnika 100—500 nm koje se nazivaju hilomikroni. Oni sadrže oko 2% proteina i 7% fosfolipida, i u stvari su kompleks lipida s proteinom. Hilomikroni prolaze kroz

bazu mukoznih ćelija u ekstracelularnu tečnost i odatle u limfni sistem. Nalaze se u krvnoj plazmi zdravih životinja samo za vreme apsorptivnog stanja.

Slika 5.10 - Biosinteza Triglicerida u intestinalnim ćelijama

Veći deo viših masnih kiselina se apsorbuje u limfu kao hilomikroni, ali se manji deo ne esterifikuje ponova u mukozi i ulazi u portalni krvotok gde se veže na albumin.

Vitamini rastvorljivi u mastima A, D, E i K i u ograničenoj količini i holesterol, verovatno ulaze u intestinalne ćelije sa fosfolipidima u obliku micela različitog tipa od micela masnih kiselina. Fina disperzija u micele u tankom crevu izgleda da je preduslov za apsorpciju, koja se jako smanjuje ako se sprečava stvaranje micela. Tako opstruktivnu žuticu, kod koje se koncentracija žučnih soli u lumenu creva smanjuje, često prati i nedostatak vitamina A, D i naročito K. Nešto se triglicerida apsorbuje i u odsustvu žuči, ali je apsorpcija vitamina prosto zanemarljiva.

5.2.2 INTRACELURANA HIDROLIZA LIPIDA

Masne kiseline koje treba da se oksiduju u tkivima viših životinja dolaze ili iz ekstracelularne tečnosti ili iz endogenih intracelularnih lipida. U krvi kičmenjaka nalaze se znatne količine triglicerida i fosfoglicerida, a vrlo malo slobodnih masnih kiselina. One su nekovalentno vezane za serum-albumin, i direktno se oksiduju u srcu i mišićima. Rezervne masti su glavni endogeni izvor masnih kiselina. One se nalaze u obliku masnih kapljica u citoplazmi i sastoje se uglavnom od triglicerida. Pošto se jedino slobodne masne kiseline mogu da oksiduju, trigliceridi se prvo hidrolizuju dejstvom intracelularnih lipaza.

Drugi izvor masnih kiselina su one koje se nalaze vezane u fosfogliceridima ćelijskih membrana. Iako su oni relativno konstantnog sastava, nalaze se u stalnom metaboličnom prometu u ćelijama viših životinja. Dejstvom fosfolipaza oslobađaju se masne kiseline fosfoglicerida.

Relativno malo je poznato o detaljima i redosledu intracelularne hidrolize lipida. Međutim, pod normalnim uslovima ne dolazi do nagomilavanja slobodnih masnih kiselina ili drugih hidrolitičkih produkata, kao što su lizofosfatidi, koji razaraju strukturu membrana i vrlo su toksični. Utvrđeno je da je brzina hidrolize intracelularnih lipida podešena prema brzini potrošnje masnih kiselina.

5.2.3 β-OKSIDACIJA MASNIH KISELINA

Poznato nam je da sve prirodne masne kiseline imaju paran broj ugljenikovih atoma. Zbog toga se dugo naslućivalo da sinteza i razgradnja masnih kiselina ide dodavanjem odnosno oduzimanjem dva ugljenikova atoma. Činjenica da u krvi i urinu životinja koje gladuju dolazi do nagomilavanja kiselina sa 4—C atoma, koje su na β-položaju oksidovane (acetsirćetna=CH3COCH2COOH i β-hidroksibuterna = CH3CHOHCH2COOH), doprinosila je gornjem mišljenju. Pokazalo se tačnim da razgradnja masnih kiselina ide postepenim odvajanjem dva ugljenikova atoma, jer se oksidacija odigrava na β-položaju. Zbog toga se razgradnja masnih kiselina i naziva β-oksidacija.

Masne kiseline se oksiduju u matriksu mitohondrija dejstvom čitavog niza enzima u prisustvu koenzima A, adenozin-trifosfata, NAD+ i Mg2+ jona.

a) Aktivacija i ulazak masnih kiselina u mitohondrije

Pošto su masne kiseline hemijski inertna jedinjenja, da bi mogle metabolički da se upotrebe, one se prvo energetski obogaćuju prelazeći u »aktivne« masne kiseline. Esterifikacijom sa

ekstramitohondrijalnim koenzimom A, masne kiseline daju tiolski estar, energetski bogato jedinjenje.

Reakcija se odigrava u citoplazmi u prisustvu ATP-a, uz katalitičko dejstvo tiokinaze masne kiseline. Do sada je izolovano najmanje tri tiokinaza, koje su specifične na dužinu C-lanca masne kiseline. Najvažnija je tiokinaza dugolančanih masnih kiselina, koja aktiviše kiseline sa C12—C22 atoma.

U toku reakcije aktivacije ATP se cepa u pirofosfat (PPi), koji se odmah hidrolizuje, dejstvom pirofosfataze, u neorganski fosfat:

PPi + H2O —> 2P i

Ova reakcija osigurava da aktivacija masnih kiselina teče samo u pravcu nastajanja „aktivne" masne kiseline, odnosno acil-KoA.

U mitohondrijama se nalazi drugi tip tiokinaze, koji aktiviše masne kiseline u prisustvu mitohondrijalnog GTP-a. On nastaje u mitohondrijama oksidacijom α-ketoglutarata.

Masne kiseline vezane u obliku acil-KoA vrlo teško mogu da prođu kroz unutrašnju membranu mitohondrija. Zbog toga se ostatak masne kiseline prenosi na specifični prenosilac karnitin (-trimetilamino β-hidroksibuterna kiselina):

Karnitin Acil-KoA Acil karnitin

Reakciju katalizuje jedna transferaza. U mitohondrijama se ostatak masne kiseline ponova prenosi sa karnitina na mitohondrijalni koenzim A:

acil-karnitin + HS—KoA → acil—KoA + karnitin

Masne kiseline ulaze u ciklus β-oksidacije u obliku acil-KoA. β-oksidacija masnih kiselina odigrava se u ciklusu od četiri reakcije.

Slika 5.11. β-oksidacija masnih kiselina po Lynen-u

1) Prva dehidrogenacija acil-KoA odigrava se na položaju dejstvom FAD-specifične acil-KoA dehidrogenaze (1.14.99.5)

Gubitkom dva vodonikova atoma, koje preuzima FADH2, nastaje α, β-trans nezasićena masna kiselina ili tačnije α, β-enoil-KoA. FADH2 predaje vodonikove atome drugom flavoenzimu, koji prenosi elektrone (ETF) citohromu c.

2) U drugoj reakciji ciklusa, na α, β-nezasićenu vezu adira se molekul vode, tako da nastaje L-β-hidroksiacil-KoA:

Ovu asimetričnu sintezu L-izomera katalizuje enoil-hidrataza (=β-hidroksiacil-KoA hidroliaza (4.2.1.17).

3) Enzimi, koji katalizuju drugu dehidrogenaciju, apsolutno su specifični na L-stereoizomer (1.1.1.35).

Oduzimanjem drugog para vodonikovih atoma, koje preuzima NAD, nastaje β-ketoacil-KoA. NADH predaje vodonikove atome NADH-dehidrogenazi respiratornog lanca.

4) β-ketomasna kiselina-KoA je vrlo reaktivno i nepostojano jedinjenje, jer se u neposrednoj blizini nalaze —C=O i tioestarska veza. Zbog toga se molekul cepa na β-položaju, dejstvom tiolaze (= β-ketotiolaza 2.3.1.16), na masnu kiselinu sa dva C-atoma manje. Dva C-atoma preuzima slobodni koenzim A, i oni se odvajaju u obliku acetil-KoA (CH3C-S-KoA):

Ova reakcija je egzergonska, što znači da je ravnoteža pomerena u pravcu tioklastičnog cepanja. Za dva C-atoma kraći ostatak masne kiseline ulazi u novi ciklus, u obliku estra sa koenzimom A.

Za svaki ciklus β-oksidacije potreban je po jedan molekul koenzima A. Pošto je njegova koncentracija u mitohondrijama mala, acetil-KoA mora brzo da se oksiduje u ciklusu trikarbonskih kiselina, da bi se oslobodio koenzim A.

U slučaju da masna kiselina sadrži neparan broj C-atoma, krajnji produkt β-oksidacije je ostatak od tri C-atoma, propionil-KoA (CH3CH2CO—KoA).

Oksidacija nezasićenih viših masnih kiselina, kao što je oleinska, odigrava se na isti način kao i zasićenih masnih kiselina, sve dok se u

toku odcepljivanja po dva C-atoma razgradnja ne približi dvoguboj vezi. Kod oleinske kiseline posle odvajanja tri acetil-KoA:

ostaje kiselina, koja na β-položaju ima cis-dvogubu vezu:

CH 3 (CH 2 ) 7 -CH=CH-CH 2CO-SKoA

3 : 4—cis—dodecenoil—KoA

Pošto enoilhidrataza katalizuje adiciju vode samo na trans-dvoguboj vezi, oksidacija gornje nezasićene kiseline će se nastaviti kada ona pređe u izomernu trans-nezasićenu kiselinu. Izomerizaciju katalizuje trans: enoil-izomeraza.

Slično, oksidacija višestruko nezasićenih masnih kiselina (npr. linolenske) zahteva da sve dvogube veze iz cis-oblika pređu u trans.

5.2.4 ENERGETSKI BILANS OKSIDACIJE PALMITINSKE KISELINE (CH3(CH2)14COOH)

U toku jednog ciklusa β-oksidacije dobija se jedan molekul acetil-KoA (CH3CO—KoA) i dva para vodonikovih atoma (=4H). Za kompletnu oksidaciju palmitinske kiseline potrebno je da ona prođe kroz sedam takvih ciklusa. Njenom oksidacijom će se dobiti 8 molekula acetil-KoA i 14 pari vodonikovih atoma.Palmitoil-KoA + 7Ko-A + 7FAD + 7NAD+ + 7H2O → 8 acetil-KoA + 7FADH2 +7NADH + 7H+

Sedam pari vodonikovih atoma ulazi u respiratorni lanac u obliku FADH2, a sedam u obliku NADH + H+. Prenos elektrona do kiseonika od FADH2 daje dva molekula ATP-a, a od NADH tri. Svaki ciklus odvajanja dva C-atoma, daje 5 ATP-a. Na osnovu toga može da se napiše jednačina, koja uključuje i fosforilaciju:Palmitoil-KoA + 7Ko-A+7O2 + 35Pi + 35ADP → 8 acetil-KoA + 5ATP+42H2O

Oksidacijom jednog molekula acetil-KoA u ciklusu trikarbonskih kiselina (CLK) dobijaju se 12 molekula ATP-a, fosforilacijom na nivou supstrata i oksidativnom fosforilacijom. Prema tome, kompletnom oksidacijom palmitinske kiseline do CO2 i H2O dobijaju se: 35 + 8x12=131 molekul ATP-a.

Pošto se na početku za aktivaciju masne kiseline utroši samo jedan ATP, to se oksidacijom palmitinske kiseline dobija 130 molekula ATP-a, a to iznosi 130x x30,7kJ = 3991 kJ. Imajući u vidu da je promena standardne slobodne energije u toku kompletne oksidacije palmitinske kiseline 9 830 kJ, izlazi da se 40% ove energije prevodi u energetski bogate pokretne molekule ATP-a.

5.2.5 METABOLIZAM KETONSKIH TELA

Acetosirćetna kiselina, β-hidroksibuterna kiselina i aceton se tradicionalno i netačno nazivaju ketonska tela. Ona nastaju u neznatnim količinama u jetri, a krvotokom dospevaju u periferna tkiva koje ih oksiduje u CLK.

Osnovno jedinjenje ove grupe acetsirćetna kiselina, odnosno acetoacetil-KoA, nastaje kondenzacijom dva acetil -KoA:

2CH3CO-SKoA → CH3COCH2CO-SKoA + KoA-SH acetoacetil—KoA

Reakciju katalizuje β-ketotiolaza. Oslobađanje acetsirćetne kiseline iz njenog estra sa koenzimom A ide preko β-hidroksi-β-metil-glutaril-KoA (HMG—KoA):

Intermedijerno jedinjenje koje nastaje u gornjem procesu HMG-KoA, je polazni supstrat za sintezu holesterola i steroida uopšte.

Acetsirćetna kiselina prelazi pod fiziološkim uslovima spontano u aceton, a dejstvom NAD-specifične β-hidroksibutirat dehidrogenaze u D-β-hidroksibuternu kiselinu (CH3CHOHCH2COOH). Jetra je glavno mesto u kojem nastaju ketonska tela, ali ona za razliku od drugih organa i tkiva ne može da ih koristi. Ketonska tela difunduju iz ćelija jetre u krv koja ih odnosi u periferna tkiva. Periferno tkivo i srčani mišić pretvaraju acetosirćetnu kiselinu u estar sa koenzimom A na dva načina. Jedan katalizuje tiokinaza i odigrava se utroškom jednog ATP-a:

Nastali acetoacetil-KoA se tiolitički cepa na dva acetil-KoA, koji ulazi u ciklus trikarbonskih kiselina gde se oksiduje.

Kod gladovanja i nekontrolisanog »diabetes mellitus-a« povećava se koncentracija ketonskih tela u krvi. U tim slučajevima je brzina njihovog nastajanja u jetri veća, nego što periferno tkivo može da ih oksiduje. Kada koncentracija ketonskih tela u krvi pređe normalnu granicu, nastupa ketonemija. Ako ona dostigne bubrežni prag, znatne količine se pojavljuju u mokraći (ketonurija). Klinička slika ove pojave zove se ketoza.

5.2.6 BIOSINTEZA ZASIĆENIH MASNIH KISELINA

Biljke, plesni, kvasci i bakterije sintetišu i gliceride i njihove sastavne masne kiseline; životinje sintetišu mnoge, ali ne sve, potrebne gliceride i masne kiseline. One, takođe, modifikuju biljne gliceride, koje unose hranom.

Dugo je poznato da mnogi organizmi glukozu mogu da pretvore u mast. Pošto je kapacitet životinja u odlaganju rezervnog ugljenog hidrata, glikogena, ograničen, sav višak ugljenih hidrata koji ne može da se odloži, odmah se pretvara u masne kiseline. One se odlažu u velikim količinama kao trigliceridi u adipoznom tkivu.

Posle otkrića da se oksidacija masnih kiselina odigrava u mitohondrijama i objašnjenja uloge koenzima A, mnogi su mislili da se i biosinteza masnih kiselina odigrava u mitohondrijama, obrnutim smerom istih enzimskih procesa. Međutim, eksperimentalno je dokazano:

1) sinteza masnih kiselina odigrava se u citoplazmi, a ne u mitohondrijama,

2) citrat maksimalno ubrzava sintezu masnih kiselina, a sam se ne ugrađuje u masne kiseline niti služi kao redukciono sredstvo.

3) CO2 i bikarbonati su bitni u sintezi masnih kiselina, a izotopno obeleženi CO2 se ne ugrađuje u masne kiseline.

Ovu neočekivanu i neobičnu ulogu CO2 objasnio je Wakil sa sar. Oni su dokazali da neposredni prethodnik dva C-atoma, koji ulazi u masnu kiselinu

nije acetil-KoA, nego derivat sa tri C-atoma, malonil KoA: HOOC—CH2

—CO—S—KoA. CO2 je bitan jer se ugrađuje u malonil-KoA, bez koga sinteza ne može da počne.

Danas je objašnjena kompletna ,,de novo" sinteza viših masnih kiselina, koja se odigrava u rastvornom delu citoplazme. Sintezu katalizuje kompleks od sedam enzima, koji se zove kompleks sintetaze masnih kiselina. U mitohondrijama i endoplazmatskom retikulumu, može samo da se produži lanac neke masne kiseline (C12 do C16), a ne može da se odigra njena kompletna sinteza.

Sinteza palmitinske kiseline

Sintetaza masne kiseline katalizuje celokupnu sintezu palmitinske kiseline, koja nastaje od jednog molekula acetil-KoA i sedam molekula malonil-KoA. Vodonikove atome daje redukciono sredstvo NADPH. Zbirna reakcija sinteze je:acetil-KoA+7 malonil-KoA+14NADPH+14H+→

CH3(CH2)14COOH+7 CO2 + 8 KoA-SH+14 NADP++6 H2O

Jedini molekul acetil-KoA potreban za početak sinteze služi kao primer ili starter (=seme), i njegova dva C-atoma se nalaze na početku lanca masne kiseline. Njen lanac počinje da raste od karbonilne grupe acetil-KoA sukcesivnom adicijom acetil-ostataka.

Intermedijerni ostaci (acil) masnih kiselina različite dužine C-lanaca (C4, C6 sve do C16) koji nastaju u toku sinteze nisu vezani tioestarski za koenzim A, kao što je to bio slučaj kod β-oksidacije, nego su vezani tioestarski za SH grupu jednog proteina male molekulske težine. On se naziva acil-prenosni protein (ACP) otporan je pri zagrevanju, izolovan je i određena mu je primarna struktura. —SH grupa AC Proteina je vezana za 4'-pantetein kao i u koenzimu A. ACP je ugrađen u kompleks sintetaze masnih kiselina tako da njegova —SH grupa 4'-fosfopantetina štrči van, tako da može da obavlja funkciju prenosioca acil-ostataka. Njegova funkcija je analogna funkciji koenzima A u β-oksidaciji. Oni vezuju ostatke, koji nastaju u toku sinteze, za svoju-SH grupu gradeći tioestarsku vezu.

Slika 5.12 - Enzimski kompleks sintetaze masnih kiselina

Svi ugljenikovi atomi masnih kiselina potiču od citoplazmatskog acetil-KoA, koji dolazi iz mitohondrija indirektnim putem. Ranije je konstatovano da acetil-KoA nastaje u mitohondrijama oksidativnom dekarboksilacijom piruvata, a videli smo da nastaje i β-oksidacijom masnih kiselina. Pošto acetil-KoA ne može da prođe kroz mitohondrijalnu membranu, on se aldolnom kondenzacijom s oksalacetatom pretvara u citrat, koji je permeabilan i ulazi u citoplazmu (slika 5.12). Citrat u citoplazmi reaguje sa koenzimom A dajući ponovo acetil-KoA i oksalacetat:

citrat+KoA—SH + ATP → CH3CO—S—KoA+ADP+Pi + oksalacetat

Citrat je prema tome prenosilac acetil-grupa iz mitohondrija u citoplazmu. Acetil grupe mogu da se prenose i vezivanjem za karnitin, ali to nije glavni put.

Malonil-KoA, za koga smo rekli da je polazno jedinjenje u sintezi masnih kiselina, nastaje ugrađivanjem CO2 u acetil-KoA. Reakciju

katalizuje acetil-KoA karboksilaza, biotin-enzim. Biotin je intermedijerni prenosilac CO2 u sledećoj dvostepenoj reakciji:

Nastajanje malonil-KoA je reakcija koja određuje celokupnu brzinu sinteze masnih kiselina, pa je prema tome acetil-KoA karboksilaza regulatorni enzim. Pozitivni modulatori ovog enzima su citrat i izocitrat, i to objašnjava njihovu ranije zapaženu ulogu u sintezi masnih kiselina.

U sintezi palmitinske kiseline učestvuje 7 molekula malonil-KoA. Prva dva C-atoma masne kiseline nastaju, kao što smo već rekli, od starter (primer) molekula acetil-KoA, čiji se acetilni ostatak prenosi na ACP, dejstvom acetil-transacilaze:

acetil-S-KoA + ACP-SH → acet i l -S-ACP+KoASH

Sledeći parovi C-atoma potiču od drugog i trećeg C atoma malonil-KoA, koji se takođe vezuje na ACP, dejstvom malonil-transacelaze:

malonil-KoA + ACP—SH → malonil—S—ACP+KoA—SH

Acetil—S—ACP i malonil—S—ACP reaguju na taj način da se drugi i treći C-atom malonil-ostatka adira na karbonilnu (CO) grupu acetil koenzima A, koji istovremeno istiskuje karboksilnu grupu u obliku CO2

Oslobođeni molekul CO2 je onaj isti koji se, dejstvom acetil-KoA karboksilaze, ugradio u malonil-KoA u toku njegove sinteze. Uloga CO 2

u sintezi masnih kiselina je sada jasna, on je potreban samo za sintezu malonil-KoA.

U sledećoj reakciji sinteze acetoacetil-ostatak se redukuje sa NADPH u -hidroksibutiril—S—ACP. Redukciju katalizuje β-ketoacil-ACP-reduktaza:

CH3COCH2CO-S-ACP +NADPH + H+→ CH3CHOHCH2CO-S-ACP+NADP+

D-β-hidroksibutiril—S—ACP, u sledećoj reakciji gubi molekul H2O, prelazeći u ostatak α, β-nezasićene krotonske kiseline (trans):

CH3CHOHCH2CO-S-ACP→ CH3CH = CHCO-S-ACP + H2Okrotonil - SACP

Nastali krotonil ostatak se na kraju ciklusa redukuje, dejstvom NADP-specifične krotonil-reduktaze u ostatak buterne kiseline (C4):CH3CH=CHCO-S-ACP + NADPH + H+→ CH3CH2CH2CO-S -ACP + NADP+

butiril-S-ACP

Ovom reakcijom se završava prvi od sedam ciklusa sinteze palmitinske kiseline. Drugi ciklus počinje slično, reakcijom drugog molekula malonil-KoA sa sada nastalim butiril—S—ACP uz izlaženje CO2. Posle niza reakcija dobija se ostatak masne kiseline sa 2 C-atoma više, odnosno kapronil—S—ACP (C6). Kada se lanac produži do 16 C-atoma, slobodna palmitinska kiselina se odcepi od ACProteina

Za sintezu palmitinske kiseline potrebno je 14 molekula redukovanog NADPH koji se dobija uglavnom oksidacijom glukozo-6-fosfata u citoplazmi,dejstvom NADP-specifičnih enzima pentozo-fosfatnog puta. Sedam molekula glukozo-6-fosfata moraju se oksidovati u ribulozo-5-fosfat i CO2, da bi se dobilo dovoljno NADPH za sintezu jednog molekula palmitinske kiseline. Zbog toga je pentozo-fosfatni put vrlo aktivan u svim onim tkivima, kao što su jetra i adipozno tkivo, gde je brzina sinteze masnih kiselina velika.

Drugi izvor NADPH za sintezu masnih kiselina u jetri je od oksidacije malata u piruvat i CO2 dejstvom »jabučnog« (»malic«) enzima.

Brzina biosinteze masnih kiselina je prilagođena brzini sinteze triglicerida i fosfoglicerida, jer normalno u ćelijama ima vrlo malo slobodnih masnih kiselina.

Palmitinska kiselina je normalni krajnji produkat sinteze masnih kiselina, koja se odigrava u citoplazmi. Njen lanac može i još da se produži. Ovaj proces se odigrava u mitohondrijama i endoplazmatskom retikulumu dejstvom odgovarajućih enzima. Produžavanje C-lanca masnih kiselina, koje sadrže 12—16 ugljenikovih atoma, ide sukcesivnim ugrađivanjem acetil-KoA. Ostaci masnih kiselina, čiji se lanac produžuje, nalaze se u obliku estra s

koenzimom A (acil-KoA). Produžavanje lanca u mitohondrijama je direktno obrnuti proces -oksidacije masnih kiselina. Jedina je razlika što redukciju α, β-dvogube veze katalizuje NADP-specifična reduktaza, a ne flavoenzim.

5.2.7 SINTEZA NEZASIĆENIH MASNIH KISELINA

U organizmu sisara se nalaze četiri tipa nezasićenih masnih kiselina:

1) grupa tipa palmitoleinske kiseline sadrži ostatak:CH3(CH2)5—CH = CH— kao i sama palmitolenska kiselina

2) grupa tipa oleinske kiseline sadrži ostatak:CH3(CH2)7—CH=CH—, kao i oleinska kiselina.

3) grupa tipa linolna kiseline sadrži ostatak:CH3(CH2)4-CH=CH- kao i linolna kiselina

4) grupa tipa linolenske kiseline s ostatkom:CH3CH2—CH = CH— kao i linolenska kiselina.

Oleinska i palmitoleinska kiselina su najrasprostranjenije masne kiseline. One imaju dvogubu vezu između 9 : 10 C-atoma ( 9,) u položaju cis. Oleinska i palmitinska kiselina nastaju u životinjskom organizmu od stearinske, odnosno palmitinske kiseline dejstvom specifičnih oksigenaza, koje su asocirane s endoplazmatskim retikulumom, naročito u ćelijama jetre i adipoznog tkiva. Dvoguba veza se obrazuje tako da molekulski kiseonik prima dva elektrona. Jedan elektron dobija od supstrata u kome nastaje dvoguba veza (acil-KoA), a drugi od NADPH:

Četiri tipa poli-nezasićenih masnih kiselina su prethodnici svih poli-nezasićenih kiselina u sisara. One nastaju ili produžavanjem C-lanca ili desaturacijom.

Linolnu i linolensku kiselinu ne mogu da sintetišu sisari i one su za njih bitne masne kiseline, koje treba uneti hranom. Od poli-nezasićenih masnih

kiselina najviše ima arahidonske, koja sadrži četiri konjugovane dvogube veze. Ona nastaje u životinjskom organizmu od linolne kiseline. Biljke sintetišu poli-nezasićene masne kiseline.

5.2.8 BIOSINTEZA TRIGLICERIDA, GLICEROFOSFATIDA I SFINGOLIPIDA

a) Biosinteza triglicerida

Trigliceridi, koji obrazuju biljne i životinjske rezervne masti, sintetišu se od L-glicerol 3-fosfata i acil-KoA. U jetri i adipoznom tkivu sinteza teče uvek preko intermedijerne fosfatidne kiseline, a jedino ćelije intestinalne mukoze mogu direktno da aciluju monoglicerid u di- i triglicerid. Fosfatidna kiselina je intermedijer i u sintezi glicerofosfatida. Ona se nalazi u ćelijama u vrlo malim količinama (tragovima).

b) Biosinteza glicerofosfatida

Najvažniji glicerofosfatidi, koji su sastavni delovi ćelijske membrane, nastaju od fosfatidne kiseline (slika 5.13). Kao i kod svih biosinteza i ovde se polazni supstrat energetski obogaćuje. Vezivanjem za citidintrifosfat fosfatidna kiselina prelazi na viši energetski nivo:

Slika 5.13 - Biosinteza najvažnijih glicerofosfatida

Biosinteza teče tako da se u CDP-gliceridu CDP zamenjuje sa jednim od sledeća tri alkohola: serinom (vezuje se na mestu CH2OH grupe), inozitolom ili glicerol-fosfatom. Vezivanjem ovih alkohola za fosfatidnu kiselinu nastaju odgovarajući glicerofosfatidi: lecitin, serin-kefalin, inozitol-fosfatid i kardiolipin.

Kao što se na slici 5.13 vidi lecitin nastaje od serin-kefalina u dvostepenoj reakciji. Prvo se ostatak serina dekarboksilira u etanolamin:

serin-kefalin → fosfatidil-etanolamin + CO2

a zatim se u molekul etanolamina transmetilacijom, uvode tri —CH3

grupe. Donor metil-grupa je »aktivni« metionin (S-

adenozilmetionin):Fosfatidil-etanolamin + 3 S-adenozilmetionin → lecitin (fosfatidil-holin) + 3 S-adenozinhomocistein

Uvođenje metil grupa u ostatak etanolamina ide postepeno, tako da prvo nastaju monometil i dimetil-derivati.

c) Biosinteza sfingolipida

Alkoholna konponenta sfingolipida je nezasićeni aminoalkohol sfingol koji ima 18 C-atoma. On nastaje od palmitinske kiseline odnosno njenog estra s koenzimom A, palmitoil-KoA. Sinteza teče tako da se prvo palmitoil-KoA redukuje u aldehid, koji kondenzacijom sa serinom daje dihidro sfingozin. Redukcijom sa flavo-enzimom ovaj zasićeni derivat prelazi u nezasićeni sfingozin ( = sfingol):

Amino grupa sfingozina je u svim sfingolipidima acilirana s višim masnim kiselinama. Aciliranjem sfingola sa acil-KoA nastaju prvo jedinjenja poznata pod imenom ceramidi. Uvođenje holina u ova jedinjenja nastaju sfingolipidi. Holin se prenosi sa aktivnog citidin difosfat holina (CDP-holin):

Cerebrozidi, derivati ceramida koji sadrže glukozu i galaktozu, sintetišu se reakcijom ceramida sa uridin difosfat glukozom (UDPG) ili UDP-galaktozom.

5.2.9 BIOSINTEZA HOLESTEROLA

Biosinteza holesterola počinje na isti način kao i sinteza ketonskih tela. Prvo se kondenzuju dva molekula acetil-KoA u acetoacetil-KoA, koji sa trećim molekulom acetil-KoA prelazi u β-hidroksi-β-metil-glutaril-KoA (HMG-KoA). To je intermedijer od koga se odvaja sinteza holesterola i steroida u organizmu sisara, a terpena i njihovih derivata u biljkama (slika 5.14).

β-hidroksi-β-metil glutaril-KoA prelazi u mevalonsku kiselinu, dejstvom jedne reduktaze, koja redukuje —CO—S—KoA grupu i odcepljenjem koenzima A. Redukcija HMG—KoA je ireverzibilna, a odvija se u najmanje dva stepena. To je i kontrolno mesto u sintezi holesterola. Fosforilacijom u tri koraka sa tri molekula ATP-a pretvara se mevalonska kiselina u »aktivni izopren« izopentenil-pirofosfat. Ovo jedinjenje prelazi u svoj izomer 3,3'-dimetil-alil-pirofosfat. U sledećem nizu reakcija, dolazi do kondenzacije ova dva izomerna izoprenil-pirofosfata i posle niza reakcionih proizvoda nastaje derivat izoprena skvalen.

Slika 5.14 - Početne reakcije biosinteze holesterola

Skvalen je simetrično građeni nezasićeni ugljovodonik, koji se sastoji od šest ostataka izoprena (C30H50). Prvo je izolovan iz jetre ajkula.

Ako se formula skvalena napiše onako kako stvarao izgleda u prostoru, vidi se da lako dolazi do ciklizacije. Zatvaranjem ugljenikovog lanca

skvalena u steranov prstenasti sistem nastaju steroidi lanosterol i holesterol. Reakcija je praćena premeštanjem dvostrukih veza i metilnih grupa u molekulu skvalena.

Slika 5.15 - Ciklizacija skvalena

Pre zatvaranja prstena jedan atom kiseonika se vezuje na dvogubu vezu skvalena u položaju 3, gde ostaje u obliku OH grupe u holesterolu i njegovim derivatima.

UKRATKO:

1) Pod nazivom lipidi podrazumeva se skup raznolikih hemijskih supstanci kojima je zajedničko svojstvo da su nerastvorljivi u vodi, a rastvorljivi u nepolarnim organskim rastvaračima, kao što su etar, hloroform i sl.

2) Ima nekoliko klasifikacija lipida. Mogu se podeliti i na sledeći način:

11 jednostavni lipidi:

a) trigliceridi ili neutralne masti

b) voskovi

12 složeni lipidi:

a) fosfolipidi

b) glikolipidi

c) neosaponifikovane supstance

3) Jednostavne masti sadrže samo masne kiseline i neki alkohol. U mastima je alkohol glicerol, a u voskovima je to neki alkohol veće molekulske mase (cetilni, miricilni).

4) U trigliceridima su hidroksilne grupe glicerola esterifikovane istom ili različitim masnim kiselinama.

5) Sve masne kiseline koje se nalaze u organizmu su nezasićene (jedno i višestruko nezasićene) i zasićene masne kiseline s parnim brojem C atoma. Masne kiseline s 4-8 C atoma su tekuće, s 8-12 C atoma imaju uljnu konzistenciju, a one s više C atoma su čvrste.

6) U čovekovom telu najviše su zastupljene palmitinska, stearinska i oleinska kiselina. Višestruko nezasićene linolna, linolenska i arahidonska kiselina za organizam su esencijalne. Te višestruko nezasićene kiseline, nazvane još i vitamin F, potrebne su za pravilan rast i prekursori su prostaglandina.

7) Fosfolipidi su sastavljeni iz glicerola (esterifikovanog s dve masne kiseline, od kojih je barem jedna nezasićena), i fosforne kiseline na koju je vezana još jedna azotna baza. Kao azotne baze u fosfolipidima su holamin i holin te aminokiselina serin.

8) Prema tome koje od navedenih azotnih jedinjenja sadrže, fosfolipidi se dele na:

a) cefaline (fosfatidil holamin),

b) lecitine (fosfatidil holin) i

c) fosfatidil-serine.

9) Fosfolipida ima u gotovo svim ćelijama, a najviše u ćelijama CNS-a. U krvi se transportuju vezani za lipoproteine, a najviše ih ima u lipoproteinima visoke gustoće (α - lipoproteini).

10) Fosfolipidi koji ne sadrže azotovu bazu su inozitolfosfatidi ili lipozitoli. Oni umesto glicerola imaju hidroaromatični alkohol inozitol esterifikovan s dve molekule fosforne kiseline, na koju su opet vezane dve masne kiseline.

11) Sfingomijelini su diaminofosfatidi koji ne sadrže glicerol, nego aminoalkohol sfingozin. U sfingomijelinima je fosforna kiselina estarski vezana na primarnu OH-grupu sfingozina, a masna kiselina je vezana amidskom vezom. Osim alkohola, fosforne i jedne masne kiseline, sadrže i azotovu bazu vezanu za fosfornu kiselinu.

12) Glikolipidi su složeni lipidi građeni od sfingozina, masne kiseline i šećera galaktoze, a ređe od glukoze. U tu grupu ubrajaju se cerebrozidi, sulfolipidi i gangliozidi. Cerebrozidi su dobili ime po tome što ih ima u mozgu, sadrže masne kiseline s 24 C atoma u lancu, koje su vezane amidskom vezom na sfingozin, te heksozu vezanu preko primarne OH-grupe sfingozina. Cerebrozida ima u malim koncentracijama u mnogim tkivima, a velike količine se akumuliraju (posebno u jetri i slezini) u Gaucher-ovoj bolesti.

13) Sulfolipidi sadrže iste sastojke kao i cerebrozidi, samo je na C6 atom galaktoze vezana još jedna sumporna kiselina.

14) Gangliozidi sadrže masnu kiselinu s 22 i 24 C atoma, zatim sfingozin, heksoze, heksozamin i neuraminsku ili sijalinsku kiselinu. U raznim gangliozidima različiti su odnosi i vrste heksoza, glukoze i galaktoze te heksozamina.

15) U neosaponifikovane supstance ubrajaju se steroli, (steroidi) - holesterol, žučne kiseline, steroidni vitamini i steroidni hormoni. Sva ta jedinjenja imaju u osnovi opštu policikličnu strukturu tzv. ciklopentano-perhidrofenantrensko jezgo. Zajedničko im je sa lipidima da se rastvaraju u organskim rastvaračima, a i metabolizam im je tesno vezan sa metabolizmom lipida. Steroidna struktura sadrži više centara aktuelne i potencijalne asimetrije. To je od velike važnosti, naročito za hormone tj. njihovo fiziološko delovanje.

16) Kao steroli označavaju se alkoholni derivati sterana koji nemaju hormonsko delovanje, a kao steroidi derivati s hormonskom aktivnošću. Razni steroli i steroidi razlikuju se po dvostrukim vezama i supstituentima (najčešće OH i CH₃ grupama) u osnovnom steranskom prstenu, kao i po alifatičnom lancu na C-17 atomu.

17) Ako se redukuje dvostruka veza na C-5 atomu holesterola, prsten A i B mogu zauzeti dve prostorne konfiguracije. U holestanonu su u ravni, a u koprostanonu je A prsten pod pravim uglom u odnosu na B prsten. Supstituenti na steranskom prstenu mogu takođe imati različitu prostornu orjentaciju, iznad ili ispod ravni prstena, što određuje njihovu hemijsku reaktivnost. Ako je supstituent iznad ravni, označava se kao β, a ako je ispod ravni kao α-izomer.

18) Pri katabolizmu lipida glicerol se veže sa fosfatom u glicerolfosfat, koji se dalje oksiduje u fosfoglicerinaldehid i ulazi u lanac glikolize, te se metabolizuje u piruvat i laktat ili se iz njega stvara glikogen.

19) Masne kiseline se, prema Knoop-u, razlažu u procesu β-oksidacije. One se razlažu oksidacijom na drugom C atomu (β-položaj) od karboksilne grupe, te se na taj način odvaja ostatak od dva C atoma u formi acetata, a lanac se skraćuje za dva C atoma, dok ponavljanjem tog procesa ne ostane acetat. Ova β-oksidacija odvija se u mitohondrijama. U β-oksidaciji učestvuju acil-koenzim A (CoA) i ATP, a krajnji proizvod acetil-koenzim A veže se delovanjem enzima sa oksalsirćetnom kiselinom nastalom metabolizmom glukoze i nastaje limunska kiselina koja ulazi u ciklus trikarbonskih kiselina.

20) Masne kiseline s neparnim brojem C atoma razgrađuju se isto uz CoA β-oksidacijom i odvajanjem acetil-CoA. Kad se lanac masne kiseline skrati na 5 C atoma iz njega pored acetil CoA nastaje i ostatak propionil-CoA, koji se u mitohondrijama jetre karboksiluje i prelazi u jantarnu kiselinu, koja onda ulazi u trikarbonski ciklus.

21) U određenim patološkim stanjima, npr. dijabetesu, gladovanju ili ishrani s mnogo masti a malo ugljenih hidrata mogu se u krvi i urinu pojaviti ketonska ili acetonska tela. Acetonska tela nastaju iz masnih kiselina zbog njihove nepotpune oksidacije. Do ketonemije i ketonurije dolazi zbog: a) nedostatka metaboličkih produkata ugljenih hidrata, piruvata odnosno oksalacetata, koji je potreban za konačnu okslidaciju acetil-CoA nastalog u toku β-oksidacije masnih kiselina ili b) nedostatka potrebne količine energije za sintezu masnih kiselina iz acetil-CoA.

22) Kad nedostaju ugljeni hidrati ne stvara se dovoljno piruvata pa se nagomilava acetil-CoA, koji se kondenzuje u β-hidroksi-β-metilglutaril-CoA koji se enzimski cepa na acetil CoA i acetsirćetnu kiselinu. Ova se može redukovati u β-hidroksibuternu kiselinu ili spontano dekarboksilovati u aceton, pa njihove koncentracije rastu u krvi. Njihovo nagomilavanje u krvi izaziva metaboličku acidozu te može dovesti do kome i smrti.

23) Sinteza masti u organizmu zavisi od više faktora: ishrane, fiziološkog stanja, fizičke aktivnosti. Masti mogu nastati i od ugljenih hidrata i ostataka amino kiselina nakon deaminacije. Glicerol nastaje od međuprodukata tokom glikolize: 3-fosfogliceraldehida koji redukcijom prelazi u glicerolfosfat, a iz ovog se odvaja fosfat i ostaje glicerol.

24) Masne kiseline sa dužim lancem sintetizuju se u jetri, i to u mitohondrijama. Sinteza započinje s acetil-CoA, a produžavanjem lanca za 2 C atoma nastaju buterna, kapronska, kaprilna i tako do palmitinske i ostalih kiselina dužeg lanca. Osim CoA u tom procesu sudeluju NADH₂, NADPH₂ i ATP, koji osigurava potrebnu energiju.

25) U citoplazmi se sintetizuju masne kiseline kratkih i srednjih lanaca. Sinteza započinje karboksilacijom acetil-CoA, za što je potrebno prisustvo biotina, i nastaje malonil-CoA koji veže dalje molekul acetil-CoA, te se preko jednog intermedijera reduktivno dekarboksiluje u butiril-CoA. Osim CO₂, biotina i CoA u tome još sudeluju ATP, NADPH₂ i Mn²+. Dalje butiril-CoA veže ponovo malonil-CoA i tako se produžava lanac masne kiseline.

26) U organizmu se masne kiseline nalaze esterifikovane u neutralnim mastima, fosfolipidima, glikolipidima i holesterol estrima, a samo u vrlo malim količinama kao slobodne masne kiseline. Vežu se sa glicerolom obično u mešane trigliceride, a retko su sve tri OH-grupe esterifikovane s istom masnom kiselinom.

27) Lipidi se unose u telo hranom. Glavni proces probave i resorpcije lipida odigrava se u tankom crevu. Delovanjem žučnih kiselina iz žuči i alkalija pankreasnog soka lipidi se u crevu prvo emulguju i na te fino emulgovane čestice s velikom površinom, deluje hidrolitički pankreasna lipaza. Glicerol, rastvorljiv u vodi, lako se resorbuje dok je resorpcija masnih kiselina složeniji proces. One se apsorbuju da se vežu sa žučnim kiselinama i holesterolom. Dospevši u eritrocite, masne kiseline se oslobađaju i vežu ponovo sa glicerolom

stvarajući trigliceride. Ovi egzogeni trigliceridi, uz nešto holesterola, fosfolipida i tragova proteina stvaraju hilomikrone, koji se limfom prenose u cirkulaciju te krvlju u jetru i masne ćelije. Tako se transportuju masne kiseline dužih lanaca, dok masne kiseline s kratkim lancem ulaze u portalni krvotok i jetru.

28) Treba razlikovati rezervnu mast, tj. trigliceride u mezenhimalnim ćelijama ili masnim ćelijama od lipida koji čine strukturni deo ćelije. Funkcija rezervnih lipida je da organizmu osigura rezervni materijal za sagorevanje, tj. energiju. Poremećaji u vezi sa lipotropnim faktorima mogu dovesti do nakupljanja lipida u jetri tzv. masne infiltracije (steatoze) jetre i do promene koncentracije lipida u krvi.

29) Lipidi krvne plazme i krvnih ćelija međusobno se razlikuju. U krvnim ćelijama lipidi su strukturalni, integralni, deo tih ćelija, dok lipidi krvne plazme ili seruma predstavljaju lipide u transportu i u tkivo i iz tkiva. Ukupni lipidi u eritrocitima nešto su niži nego u krvnoj plazmi. Sadrže manje triglicerida, minimalno esterifikovanog holesterola. Eritrociti sadrže gotovo dva puta više fosfolipida nego plazma. Leukociti su bogati lipidima, naročito fosfolipidima.

30) Na koncentraciju lipida u serumu utiču i endokrine žlezde. Tiroksin iz tiroideje utiče na koncentraciju lipida tako što su povišeni u hipofunkciji, a sniženi u hiperfunkciji tiroideje. Insulin snižava koncentraciju lipida u serumu, a nedostatak insulina uzrokuje povišenje njihove koncentracije. Estrogeni hormoni snizuju serumske lipide. Neki lekovi i hemikalije takođe utiču na koncentraciju lipida u serumu.

31) Povišena koncentracija lipida nalazi se kod hipofunkcije štitne žlezde, dijabetes melitusa, opstruktivnog ikterusa, hroničnih bolesti bubrega, nefroze, akutnih infekcija, depresivnih bolesti, poremećaja metabolizma lipida.

32) Hipolipemija se nalazi kod hiperfunkcije štitne žlezde. Holesterol i trigliceridi su naročito sniženi u degenerativnom teškom hepatitisu, cirozi jetre, anemiji, tuberkulozi hroničnim insuficijencijama i šizofreniji.

AMINOKISELINE PROTEINI I METABOLIZAM AZOTA

6.1 AMINOKISELINE

6.1.1 UVOD

Hidrolitičkim razlaganjem proteina dobijaju se jedinjenja male molekulske težine — aminokiseline. BRACONNOT (1820 god.) je prvi izvršio hidrolizu želatina i dobio kristale slatkog ukusa, koje je nazvao glikokol, što znači želatinski šećer. Pokazalo se da glikokol nije šećer, već aminokiselina, jedinjenje koje ima amino i karboksilnu funkciju. Posle njegovog otkrića hemičari su obratili pažnju na različita niskomolekularna jedinjenja, aminokiseline, koje se dobijaju hidrolizom proteina. Danas je poznato oko 25 proteinskih aminokiselina. Struktura aminokiselina dokazana je razgradnjom i sintezom u toku sto godina rada na ovom polju. Svih 25 aminokiselina ne mora da se nalaze u hidrolizatu svakog proteina, a i količina im varira od proteina do proteina.

Pored toga što su aminokiseline osnovni sastojci proteina, one takođe imaju važnu ulogu u prometu materija. Tako od njih mogu da nastanu razna druga za organizam važna jedinjenja (npr. hem).

Hidrolitičko cepanje proteina na aminokiseline izvodi se na taj način što se proteinski rastvor zagreva sa 6—12 N hlorovodoničnom ili sumpornom kiselinom 24 časa na 100°C.

Hidroliza se može raditi i sa bazama. Pri digestiji proteina u gastrointestinalnom traktu viših životinja proteini se hidrolizuju na amokiseline dejstvom proteolitičkih enzima (pepsin, tripsin i dr.) pri blagim uslovima temperature i kiselosti. Enzimska hidroliza se upotrebljava nekad i u analitičke svrhe, jer se neke aminokiseline raspadaju pri kiseloj odnosno baznoj hidrolizi.

Tok hidrolize proteina i završetak može se konstatovati reakcijom sa azotastom kiselinom, s kojom ―aminokiseline reaguju kvantitativno, kao i svi primarni amini:

Pri reakciji se oslobađa voda, odgovarajuća oksikiselina i elementarni azot, koji se hvata i meri. Pošto se iz 1 g―mola aminokiseline razvije 1 g―mol azota, može se iz zapremine izdvojenog azota da izračuna količina aminokiselina. Ovo je poznata Donald D. van Slyke―ova metoda.

U hidrolizatu proteina nalazi se mešavina različitih aminokiselina. Odvajanje pojedinih aminokiselina iz ove smese predstavljalo je ranije velike teškoće, a danas je vrlo dobro rešeno hromatografskim metodama.

Sve proteinske aminokiseline su α―amino, α―karbonske kiseline čija je opšta formula:

R u formuli označava karakteristični bočni lanac. Izuzetak su prolin i oksiprolin koji su sekundarni amini.

6.1.2 OPTlČKA AKTIVNOST AMINOKISELINA

Iz opšte formule aminokiselina se vidi da je ―ugljenikov atom asimetričan. Sve proteinske aminokiseline, sem glicina, su optički aktivna jedinjenja leve (L) prostorne konfiguracije. Pri pisanju formula L―aminokiselina, karboksilna grupa se piše gore a amino grupa levo.

Leva konfiguracija proteinskih aminokiselina dokazana je na razne načine, između ostalog sintezom i razgradnjom alanina do L(—) glicerinaldehida:

Iako su proteinske aminokiseline leve konfiguracije, neke kao alanin obrću ravan polarizovane svetlosti nadesno, a neke kao fenilalanin nalevo. Skretanje ravni polarizovane svetlosti je fizička osobina koja zavisi i od pH sredine, a prostorna konfiguracija je stalna osobina molekula.

U prirodi se nalaze i aminokiseline desne (D) prostome konfiguracije. Tako su u nekim antibioticima, kao gramicidinu (iz Bacillus brevis) i polimiksinu, nađene aminokiselme D―konfiguracije.

Optički aktivna jedinjenja su asimetrično građena odnosno njihovi molekuli nemaju ravan simetrije. Karakteristična osobina asimetričnih molekula je da mogu hemijski da reaguju samo sa odgovarajućim drugim asimetričnim jedinjenjem na principu prostorne komplementarnosti (ili »ključa i brave«). Ova osobina aminokiselina objašnjava stereospecifičnost bioloških katalizatora, koji su proteinskog karaktera i čije su osnovne jedinice aminokiseline. Ovu pojavu je prvi uočio Pasteur (1857. godine) kada je pustio da gljivice rastu u rastvoru racemske smeše vinskih kiselina. One su potrošile samo desnogiri oblik, a levi je ostao, jer nije bio odgovarajuće prostorne konfiguracije. I viši organizmi, zbog asimetrične strukture bioloških katalizatora (enzima), koriste u svojoj ishrani samo određene stereoizomerne oblike šećera, aminokiselina i drugih potrebnih sastojaka.

6.1.3 PODELA AMINOKISELINA

Iz opšte formule aminokiselina se vidi da se one razlikuju po veličini, obliku i polarnosti bočne grupe R. Funkcionalni značaj bočne grupe R je u tome što je ona slobodna u peptidnim lancima proteina. Ona određuje izgled proteina u prostoru, njegovu biološku funkciju i aktivnost, a pri sintezi proteina bočne grupe su onaj genetski »znak« raspoznavanja, koji omogućava reproducibilnost genetskih informacija. Iz tog razloga se aminokiseline klasifikuju prema kiselinsko―baznom karakteru bočne grupe —R na:

1) nepolarne ili hidrofobne aminokiseline

2) polarne, ali bez naboja u području intracelularnog pH

1) kisele aminokiseline, čija je bočna grupa negativno naelektrisana u područjupH 6―7 i

2) bazne aminokiseline, čija je bočna grupa pozitivno naelektrisana kod pH 6―7

Tabela. 6.1 - Nepolarne ili hidrofobne aminokiseline

Tabela 6.2. Polarne aminokiseline

Tabela 6.3 - Kisele aminokiseline

Tabela 6.4 - Bazne aminokiseline

Pored proteinskih aminokiselina u tkivu se nalazi još 15―tak aminokiselina, koje imaju značajnu ulogu u intermedijemom metabolizmu. To su: ornitin, citrulin, homocistein, norvalin, β―alanin i druge.

6.1.4 KISELINSKO — BAZNE OSOBINE AMINOKISELINA

Poznavanje kiselinsko―baznih osobina aminokiselina je bitno za objašnjenje strukture proteina i svih njihovih karakterističnih osobina. Osim toga svi načini odvajanja, identifikovanja i određivanja aminokiselina baziraju se na ovim osobinama.

Aminokiseline su na sobnoj temperaturi kristalne supstancije sa relativno visokom tačkom topljenja (npr. glicin 232°), dobro se rastvaraju u vodi ali se ne rastvaraju u organskim rastvaračima (izuzev prolina). Za razliku od tipičnih organskih kiselina koje sve isteruju CO2 iz karbonata jer su jače od ugljene kiseline:

aminokiseline su u neutralnoj sredini slabije od ugljene kiseline i ne oslobađaju CO2 iz njenih soli:

Aminokiseline pokazuju dakle osobine soli organskih kiselina (npr. Na―acetata) i to kako po svom fizičkom kristalnom izgledu tako i po hemijskoj reakciji sa bikarbonatom:

Na osnovu ovakvog ponašanja aminokiselina, njihove velike dielektrične konstante i drugih osobina utvrđeno je, da su one unutrašnje soli u kojima je došlo do prelaza protona sa karboksilne na amino―grupu:

Aminokiseline se u neutralnoj sredini nalaze u obliku dipolarnih jona i ne sadrže ni slobodnu karboksilnu niti slobodnu amino―grupu.

Dipolarna struktura aminokiselina objašnjava mnoge njihove osobine. Tako se dobra rastvorljivost u vodi objašnjava reakcijom dipolarnog jona aminokiseline sa dipolima vode, koji prodiru u kristalnu rešetku i razlažu je. Isto tako aminokiseline zbog svoje dipolarne strukture imaju osobine i slabih kiselina i slabih baza. One su dakle — elektroliti amfoternog karaktera.

Kiselinsko―bazne osobine aminokiselina biće nam jasnije ako pojam kiseline i baze proširimo primenjujući definiciju Bronsted―Lowry―a. koja glasi: kiseline su jedinjenja koja oslobađaju protone u rastvoru, a baze su jedinjenja koja vezuju protone. Tako npr. u reakciji između natrijum―acetata i hlorovodonične kiseline, acetatni jon se ponaša kao baza, jer vezuje protone:

U kiselinsko — baznim reakcijama uvek zajedno učestvuje konjugovani par (kiselina i njoj odgovarajuća konjugovana baza):

Iz gornjih jednačina se vidi da je konjugovana baza sirćetne kiseline acetatni jon, a da je konjugovana kiselina amonijaka―amonijum jon (NH+

4). U rastvorima slabih kiselina nalazi se i njena konjugovana baza. Njihov međusobni odnos zavisi od koncentracije H+ jona i konstante disocijacije kiseline.

Konstanta disocijacije kiseline je mera njene jačine, odnosno njenog afiniteta prema protonu. Ukoliko je afinitet prema protonu manji, utoliko je to jača kiselina i obrnuto.

Konstanta disocijacije predstavlja se odnosom molarnih koncentracija u momentu ravnoteže:

Zagrade u gornjoj jednačini označavaju molarne koncentracije. Veličina konstante disocijacije pokazuje jačinu kiseline odnosno kolika je njena tendenca da disosuje na H+ jon i konjugovanu bazu (A‾ ). Ukoliko konjugovana baza ima veći afinitet prema protonu (H+), utoliko se u rastvoru nalazi više nedisosovanih molekula kiseline (HA) i utoliko je ona slabija. Iz toga proizlazi: da ukoliko je kiselina jača utoliko je njena konjugovana baza slabija i obrnuto.

Ako jednačinu 1. logaritmujemo dobićemo :

Prebacimo log H+ na levu, a log K na desnu stranu, pa ćemo dobiti da je:

Znamo da je ―log [H+] = pH, a analogno se i negativni logaritam konstante disocijacije obeležava sa pK= —log K. Ako ove izraze zamenimo, dobićemo poznatu Henderson―Hasselbalch―ova jednačinu,

… 1

koja je od fundamentalnog značaja za kvantitativno ispitivanje kiselinsko―baznih ravnoteža u biološkim sistemima:

Pošto pH može lako da se izmeri eksperimentalno, a koncentracija konjugovane kiseline (HA) i baze (A‾) da se odredi (titracijom), gornja jednačina omogućava da se eksperimentalno nađe konstanta disocijacije, odnosno pK (slika 5.1). Prema titracionoj krivulji pK odgovara onoj koncentraciji [H+] jona, kada se u rastvoru nalaze iste količine akceptora (A‾) i davaoca protona (kiseline HA), jer je tada drugi izraz u jednačini 2 jednak 0:

Slika 6.1 -Titracione kriva sirćetne kiseline

Ta tačka se nalazi na sredini krivulje neutralizacije. Za sirćetnu kiselinu pK=4,76 (slika 6.1).

Iz slike 6.1 se vidi da se u toku neutralizacije sirćetne kiseline vrednost pH naglo menja u početku dodavanja NaOH. U sredini neutralizacije, kada se u rastvoru nalaze iste količine kiseline i njene konjugovane baze (CH3COO―), pH je konstantan. To je njeno područje puferovanja.

U tabeli 5.5 date su konstante disocijacije nekih kiselina. Prema gornjem izlaganju ne treba da nas zbuni što smo za NH+4 stavili da je kiselina, jer je to prema definiciji davalac protona. Vidi se da je daleko praktičnije izraziti konstantu disocijacije u obliku celih brojeva kao pK, nego u

… 2

obliku negativnih stepena. Iz tabele se vidi da ukoliko je pK veći utoliko je kiselina slabija, jer je vrednost K manja.Tabela 6.5 - Eksperimentalno određene konstante disocijacije nekih kiselina na 25°

Iz opšte formule aminokiselina: vidi se da one sadrže dva konjugovana kiselinsko―bazna para: prvi je:―COOH ↔ COO-, + H+, a drugi —NH+

3 ↔ NH2 + H+. Zbog toga u vodenim rastvorima aminokiselina postoje sledeći jonski oblici, koji se nalaze u ravnoteži:

Položaj ove ravnoteže zavisi od koncentracije H+ jona. U neutralnoj sredini aminokiseline su amfoliti, pokazuju osobine i slabe kiseline i slabe baze. U kiseloj sredini, one su dvobazne kiseline, a u baznoj dvokisele baze. Onaj pH kod koga se u rastvoru nalazi maksimalna koncentracija dipolarnih jona naziva se izoelektrična tačka (I.T.). Svaka aminokiselina ima svoju karakterističnu izoelektričnu tačku, koja zavisi od karaktera bočne grupe —R. U izolektričnoj tački aminokiseline ne provode električnu struju, rastvorljivost u vodi im se smanjuje, a pravac skretanja polarizovane svetlosti se pomera ulevo. Iz svega toga proizlazi da osobine aminokiselina jako zavise od pH sredine.

U neutralnoj sredini je nosilac kiselih osobina dipolarnog jona (II)—NH3+, a

baznih osobina karboksilatni anjon —COO¯. Pošto je konstanta disocijacije konjugovane kiseline — NH3

+ → H2 + H+ vrlo mala (pK=9,25), jasno je zašto su aminokiseline u neutralnoj sredini slabije od ugljene.

Na sličan način kao kod slabe sirćetne kiseline, možemo i kod aminokiselina da odredimo titracijom pK vrednosti njihovih kiselinsko―baznih parova. Ako titrujemo kiseli rastvor aminokiseline alanina, u kome se ona nalazi u protoniranom obliku (I), videćemo da će se u toku neutralizacije osloboditi dva mola protona (H+), kao i kod svake dvobazne kiseline. Dodatak prvog mola NaOH trošiće se u sledećoj reakciji:

a dodatak drugog mola u reakciji:

Iz titracione krive alanina (slika 6.2) se vidi da pH na sredini prve neutralizacije iznosi 2,34 i on odgovara konstanti disocijacije (pK1) prve kisele grupe — COOH → COO + H+; isto tako, pH na sredini druge neutralizacije alanina iznosi 9,69 i on odgovara negativnom logaritmu konstante disocijacije (pK2) grupe H3N+—, druge kisele grupe alanina. Na slici 6.2 se vidi da se u tim područjima pH slabo menja dodatkom NaOH. Kod tih pH vrednosti (2,34 i 9,69) alanin ima puferne sposobnosti. U uslovima fiziološkog pH alanin ne puferuje.

Kao što je katjonski oblik alanina (I) dvobazna kiselina, tako je njegov anjonski oblik (III) dvokisela baza, koja na dva mesta može da veže piotone: na —NH2 grupu i karboksilatni anjon —COO. Amino―grupa je jača baza od — COO.

Slika 6.2 - Titraciona kriva alanina

Titraciona krivulja aminokiselina čija bočna grupa može da jonizuje (kisele i bazne aminokiseline) ima oblik titiacione krive trobazne kiseline (slika 6.4). One sadrže tri mesta koja mogu da otpuštaju i primaju protone. U tabeli 6.6 date su pK vrednosti jonizabilnih grupa proteinskih aminokiselina.

Tabela 6.6 - pK vrednosti jonizabilnih grupa aminokiselina

Aminokiseline čije bočne grupe jonizuju nalaze se u rastvoru u četiri razna jonska oblika. Uzmimo kao primer histidin:

Slika 6.3 - Jonski oblici histidina (Shema)

Slika. 6.4 - Titraciona krivulja histidina

Iz tabele 6.6 i titracione krivulje histidina se vidi da konstanta disocijacije bočne imidazolske grupe iznosi 6,0. Iz toga proizlazi da bočna grupa histidina puferuje u neutralnom području. Ova osobina bočne grupe histidina je od izvanrednog značaja za puferni kapacitet onih proteina koji sadrže ovu aminokiselinu (npr. hemoglobin).

Izolektrična tačka baznih aminokiselina leži između pKR (bočne grupe) i pK2 (amonijum―grupe). Tako je izoelektrična tačka histidina kod pH 7,58. I.T. kiselih aminokiselina leži između pK1 (karboksilne grupe) i pKR.

Tako je za asparaginsku kiselinu:

6.1.5 NEPOLARNE AMINOKISELINE

U nepolarne aminokiseline, čija je bočna grupa —R hidrofobna spadaju: glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, triptofan i metionin. Prvih šest aminokiselina su alifatične, a bočna grupa fenilalanina i triptofana je aromatičnog karaktera. Metioninska bočna grupa se sastoji iz sumpora, koji je tioetarski vezan za metil―grupu (—S—CH3).

Sve nepolarne aminokiseline, izuzev glicina, manje se rastvaraju u vodi od ostalih grupa.

Glicin ima u bočnoj grupi vodonikov atom, koji je vrlo mali i zbog toga ne može da utiče na polarnost molekula. To je najprostija aminokiselina i jedina koja nije optički aktivna. Glicina ima u mnogim proteinima, a u velikim količinama se nalazi u bidrolizatu skeletnih proteina: kolagena (tetive, kože) i elastina (ligamenata). Želatin, koji se dobija kuvanjem kostiju, sadrži 25% glicina, a fibroin svile do 40%.

Glicin može da sintetiše većina živih organizama, zbog tog ga ubrajamo među nebitne ili neesencijalne aminokiseline. Pilići ne mogu da sintetišu glicin.

Glicin je u direktnoj vezi s nizom biološki važnih jedinjenja. Zamenom jednog vodonikovog atoma u primarnoj amino―grupi s metil―grupom nastaje sarkozin:

CH3NH—CH2—COOH. Nalazi se slobodan u krvnom serumu i mišićima, a nema ga u hidrolizatima proteina animalnog porekla. Sarkozin je nađen u biljnom proteinu iz semenki kikirikija.

Daljim metilovanjem sarkozina nastaje betain, koji se nalazi ili u obliku dipolnog jona ili kao so; ima ga u mnogim biljkama naročito u korenu repe.

Jedan od najvažnijih derivata glicina je mišićni kreatin (metilgvanidino sirćetna kiselina). Kreatina ima naročito u mišićnom i nervnom tkivu gde je vezan za fosfornu kiselinu u obliku kreatin―fosfata (fosfagen), a u testisima se nalazi slobodan. Fosfagen igra vrlo važnu ulogu u radu mišića.

Izdvajanjem jednog molekula vode (dehidiatacijom) kreatin prelazi u kreatinin, koji se redovno nalazi u mokraći. Izlučivanje kreatinina je merilo mišićne aktivnosti. Povećane količine kreatinina javljaju se u mokraći pri oboljenju mišićnog tkiva (muskularna distrofija).

Sa žučnim kiselinama glicin gradi složene kiseline: glikoholnu, glikodezoksiholnu, glikolitoholnu i dr.

U procesima detoksikacije (zaštitne sinteze) glicin služi za uklanjanje štetnih materija iz organizma, naročito aromatičnih jedinjenja. Tako se npr. benzojeva kiselina izlučuje u mokraći biljoždera kao benzoilglicin ili hipurna kiselina (hipos = konj). Fenilsirćetna kiselina izlučuje se kao fenaceturna, a nikotin kao nikotinurna kiselina:

L―Alanin. — Prirodna ―aminopropionska kiselina nalazi se u hidrolizatu većine proteina. Ima L―konfiguraciju, a obrće ravan polarizovane svetlosti nadesno (+). Samo u fibroinu svile ima alanina u većoj količini (20%), odakle ga je Weyl izolovao (1888 godine).

Pirogrožđana kiselina, koja se nalazi u najrazličitijem biološkom materijalu, transaminacijom lako prelazi u alanin (glutamat:piruvat―transaminaza). To objašnjava činjenicu da se alanin može izostaviti iz dijete svih životinja i podloga za kulturu svih mikroorganizama. Metabolična povezanost s piruvatom pokazuje da od alanina mogu da nastanu ugljeni hidrati i zbog toga, spada u takozvane glikogene amino kiseline.

U nekim mikroorganizmima (Lactobacillus casei, Straeptococcus faecalis) nalazi se alanin D―konfiguracije.

Alanin ima pored optičkog izomera i položajni izomer β―alanin: H2N—CH2— —CH2—COOH, koji se nalazi u dipeptidima karnozinu i anserinu. Pantotenska kiselina, vitamin B grupe, je pantoil―β―alanin. Ona je sastavni deo koenzima A.

L―Valin. — Valin je pronašao u ekstraktu pankreasa Gorup―Besanez 1856. godine. Posle toga je nađen u hidrolizatu albumina, a E. Fischer mu je definitivno odredio strukturu. Valin je α―amino―izovalerijanska kiselina:

Ova se aminokiselina ne nalazi ni u jednom proteinu u većoj količini. U hemijskom pogledu valin se ne razlikuje od ostalih aminokiselina sa ugljovodoničnim lancem bez drugih funkcionalnih grupa. U metabolizmu se, međutim, bitno razlikuje od glicina i alanina, jer pripada grupi bitnih ili esencijalnih aminokiselina. Eksperimentalne životinje zaostaju u rastenju ako u hrani nema valina. Uzrok te pojave je nesposobnost viših životinja da sintetišu aminokiseline s račvastim lancem tolikom brzinom, koliko je potrebna mladim životinjama, koje rastu.

L―Leucin. — Proust je izolovao leucin iz hidrolizata sira 1819. godine. Kri―stalnu aminokiselinu je dobio Braconnot iz hidrolizata mesa i vune. Leucin je ―amino―izokapronska kiselina:

Spada u esencijalne aminokiseline, jer je račvaste strukture. Nalazi se u mnogim proteinima i to u većim količinama, na primer: u tireoglobulinu, hemoglobinu, γ―globulinu, kazeinu i keratinu vune.

L―Izoleucin. — Izoleucin je α―amino―β―metilvalerijanska kiselina. F. Ehrlich je našao izoleucin u melasi šećerne repe 1904. godine. Posle toga je izolovao ovu aminokiselinu iz enzimskog hidrolizata fibrina, pšeničnog glutena, albumina kokošijeg jajeta i goveđeg mesa. Izolovana

aminokiselina je imala različitu rastvorljivost i tačku topljenja od leucina, od kojeg se nije razlikovala po hemijskom sastavu. Ove dve aminokiseline razdvajaju se teško i vrlo osetljivim fizičko―hemijskim metodama (npr. hromatografijom). Izoleucina ima po pravilu uvek manje od leucina u raznim proteinima.

Izoleucin je takođe esencijalna aminokiselina.

L―Prolin. — (pirolidin―2―karbonska kiselina). — Fischer je našao prolin u hidrolizatu kazeina (1901. god.). Prolina ima u nekim skleroproteinima, a naročito u prolaminima, koji se rastvaraju u 70% alkoholu, kao i prolin.

Prolin sadrži sekundarnu amino―grupu u pirolidinskom prstenu, primarne aminogrupe uopšte nema. Ipak se ubraja u aminokiseline, jer se nalazi u hidrolizatima proteina s ostalim α―aminokiselinama.

Derivat prolina je oksiprolin, koji je polarnog karaktera jer ima alkoholnu —OH grupu u pirolidinskom prstenu.

L―Oksiprolin je 2―karboksi―4―hidroksipirolidin―karbonska kiselina. Redukcijom alkoholne grupe prelazi u prolin. Ona se jedino u želatinu nalazi u većoj količini (cca 14%), ostali proteini je retko sadrže i to u malim količinama.

L―Fenilalanin. Najprostija aromatična aminokiselina je ―amino――fenilpropionska kiselina, ili fenilalanin. Izolovao ju je Schulre iz biljnih klica 1879 god., a docnije je izolovana iz hidrolizata belančevina. Ova aminokiselina je vrlo rasprostranjena i neophodna u hrani mladih životinja. Više životinje ne mogu da sintetišu aromatični prsten. Tirozin ne može da zameni fenilalanin.

Kod nekih poremećaja u metabolizmu fenilalanina izlučuje se u mokraći fenilpirogrožđana kiselina.

L― FENILALANIN (Phe)

Pošto ima aromatični prsten, fenilalanin se može nitrovati, a nastali dinitro―derivat daje s hidroksilaminom u amonijačnom rastvoru tamnoljubičasto obojenje. Ovo je poznata bojena reakcija na fenilalanin.

L―Triptofan. Hopkins i Cole našli su triptofan u hidrolizatu kazeina, posle enzimske hidrolize s tripsinom. Hidrolizom s kiselinama triptofan se razara. Belančevine koje sadrže triptofana daju sa mešavinom glacijalne sirćetne i sumporne kiseline ljubičasto obojenje (Adamkiewicz―eva. reakcija).

Triptofan je esencijalna aminokiselina. Bakterije dekarboksiluju triptofan u triptamin. U ekstraktu crevne sluzokože nađen je derivat triptofana — serotonin (5―hidroksitriptamin). Serotonin pojačava krvni pritisak, a nalazi se vezan i u moždanoj kori i trombocitima.

Smatra se da crevne bakterije mogu od triptofana da sintetišu amid nikotinske kiseline i osiguraju životinji potrebne količine ovog vitamina.

L―Metionin je α―amino―γ―metil―tiobuterna kiselina. Ona može potpuno da snabdeva organizam sumporom i sasvim da zameni cistein i cistin.

Ovu aminokiselinu pronašao je Muller (1922) tražeći faktor rastenja za neke mikroorganizme u hidrolizatu kazeina. Struktura metionina je docnije potvrđena sintezom.

Osborne je primetio da je sumpor u proteinima dvojakog karaktera: nestabilan prema alkalijama, kao u cisteinu i cistinu, i stabilan prema alkalijama, za koji se utvrdilo, da je vezan u metilnom tioetru metionina.

Metil―etar merkaptana ne daje samo poseban karakter vezanom sumporu, nego i metil―grupa metionina ima karakteristične osobine i funkcije. Specifični enzimi (metil―transferaze) katalizuju prenošenje metil―grupe sa metionina na čitav niz jedinjenja, koja se biološki metiluju, npr. noraderenalin u adrenalin, etanolamin u holin, histamin u N―metilhistamin i čitav niz metilovanja kod detoksikacija. Gubljenjem metil―grupe metionin prelazi u homocistein. Po tome što ima važnu funkciju davaoca metil―grupa, metionin se ne može zameniti ni cisteinom ni cistinom.

Metionin je vrlo rasprostranjen u proteinima, ali ga ima u malim količinama.

6.1.6 POLARNE AMINOKISELINE

U aminokiseline čija je bočna grupa —R polarnog karaktera spadaju: serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin i glutamin. Sve se one dobro rastvaraju u vodi, jer njihove polarne grupe grade sa vodom vodonične veze. Bočna fenolna grupa tirozina i tioalkoholna (—SH) grupa cisteina imaju najveću polarnost. Obe ove grupe u kiselom području pH gube proton i prelaze u jonsko stanje (negativno se naelektrišu). Međutim, kod neutralnog pH njihova jonizacija je vrlo mala (oko 0,01%).

L―Serin. — Serin ili α―amino―β―hidroksi propionska kiselina, može se hemijski smatrati alkoholnim derivatom alanina. Pronašao ga je Cramer (1865) u hidrolizatu sericina, proteinu želatinskog karaktera, koji zajedno s fibroinom gradi svilenu nit. Serin je dobio ime po sericinu. Kazein mleka i vitelin iz žumanceta takođe su bogati serinom. To su fosfoproteidi, složene belančevine, koje imaju ostatak fosfornu kiseline estarski vezan baš za hidroksilnu grupu serina. Serin―fosfat zove se fosfoserin.

Mnogi enzimi imaju u svom aktivnom centru aminokiselinu serin (acetil―holin esteraza, tripsin, bimotripsin i dr.). Aktivnost ovih enzima smanjuju i potpuno inhibiraju organofosforna jedinjenja, koja se zbog toga ubrajaju u jake otrove. Njihova toksičnost osniva se na tome što reaguju sa alkoholnom grupom serina, tako da nastaje estar i na taj način se blokira aktivni centar enzima.

Sika. 6.5 - Reakcija serina u aktivnom centru enzima sa organofosfatima

L―Treonin. — Treonin (α―amino―β―hidroksibutema kiselina) ima dva asimetrična ugljenikova atoma, čije su karakteristične funkcije raspoređene u prostoru isto kao i kod šećera treoze. Smatra se da je Rose odatle uzeo ime za ovu aminokiselinu.

Slično kao i serin, treonin se u nekim proteinima nalazi u obliku fosfatnog estra. Treonin je esencijalna aminokiselina, jer više životinje ne mogu da sintetišu prostornu konfiguraciju kakvu imaju dva susedna ugljenikova atoma u treoninu.

L―Cistein i L―Cistin. — Cistein i cistin opisuju se zajedno, pošto su to, dinamički gledano, samo dva oblika jedne aminokiseline.

Gornjom reakcijom cistein sudeluje u mnogim biološkim procesima održavanja određenog oksidoredukcionog potencijala.

Hemijsko ime cisteina je α―amino―β―merkapto propionska kiselina.

Bočna —SH grupa cisteina je slabo kiselog karaktera i hemijski je vrlo reaktivna. Cistein daje merkaptide sa tragovima teških metala (kao i sumporovodonična kiselina —H2S). Ova osobina —SH grupe je važna zbog toga, što se ona nalazi u aktivnim centrima biološki aktivnih proteina — enzima. Tretiranjem takvih SH―enzima sa teškim metalima, blokiraju se slobodne —SH grupe i enzim se inaktiviše:

Slobodne —SH grupe cisteina dokazuju se jednostavnom reakcijom s natrijumnitroprusidom.

Cistein biološkom oksidacijom prelazi u cisteinsku kiselinu, a ova u taurin:

Cistein učestvuje kod detoksikacije. U mokraći se nalaze merkapturne kiseline (=N―acetilcistein vezan za otrovna jedinjenja) ili prosto sulfat (nastao metabolizmom od cisteina) vezan za otrovna jedinjenja (npr. indoksilsulfat).

Cistin je izolovao Wollaston još 1810 godine iz mokraćnih kamenaca. Docnije je nađen u hidrolizatima raznih proteina. Cistin je glavni sastojak keratina (u vodi nerastvornih proteina) i vrlo lako se izoluje iz kose

(12%). Alkalnom hidrolizom potpuno se razaraju obe aminokiseline, pri čemu nastaje pirogrožđana kiselina, amonijak, vodoniksulfid i sumpor:

Prisustvo cistinskih disulfidnih veza —S—S— je bitno za strukturne proteine, jer se pomoću njih mogu da povežu dva peptidna lanca. Cistinski —S—S— most obezbeđuje čvrstinu strukturnih proteina. Međutim, ima proteina i peptida (npr. hormon insulin) za čiju je aktivnost bitan integritet —S—S mosta.

L―Tirozin. — Tirozin ili α―amino―β―hidroksifenilpropionska kiselina dobila je svoje ime po siru (grčki = tyros) iz koga je prvi put izdvojena. U većini proteina ima malo tirozina, a jedino u fibroinu svile ima ga do 10%. Neke biljne belančevine nemaju tirozina i zato su one slabe hranljive vrednosti, jer je tirozin važna aminokiselina. Nju jedino može da zameni fenilalanin.

Tirozin se kvalitativno dokazuje sa smešom merkuro― i merkurinitrata u azotnoj kiselini (Millonova reakcija). Prostija je ksantoproteinska reakcija (žuto obojenje — nitrotirozin) s koncentrovanom azotnom kiselinom. Ovu reakciju daju i suvi proteini (koža, nokti). Tirozin reaguje i s Pauly―jevim reagensom kao i histidin. Tirozin se teško rastvara u vodi (0,4 g/1).

Od tirozina nastaju u životinjskom organizmu hormoni tireoideje, srži nadbubrežne žlezde i pigmenti (melanin), a u biljkama alkaloidi:

laudanozin, papaverin, meskalin. Kod poremećaja u metabolizmu tirozina dolazi do različitih patoloških pojava (alkaptonurija i druge).

Jodgorgonska kiselina ili 3,5―dijodtirozin nađen je u koralu Gorgonia, zatim u sunđerima i konačno u tireoglobulinu štitne žlezde (tireoideje). To je samo jedan oblik vezanog joda u tom organu, jer se veći deo nalazi vezan u tiroksinu. Hormoni tiroksin i trijodtirozin nalaze se i u slobodnom stanju i vezani za tireoglobulin.

Alkalnom hidrolizom tireoidne žljezde dobija se tiroksin. Fiziološki je aktivan samo levi oblik (L―). Tiroksin se teško rastvara u vodi. On je 10.000 puta aktivniji od dijodtirozina. U novije vreme nađen je još jedan sastojak tireoglobulina — tri―joditironin, koji jače deluje od tiroksina.

Adrenalin, hormon srži nadbubrežne žlezde, nastaje biološkom oksidacijom tirozina preko intermedijernog jedinjenja 3,4―dihidroksifenilalanina (»Dopa«). Adrenalin je po svom hemijskom sastavu 3,4―dihidroksifenil―etanol―metilamin:

Slika 6.6 - Biosinteza adrenalina (shema)

U polarne amino kiseline spadaju i L―asparagin i L―glutamin. Pošto su to amidi asparaginske odnosno glutaminske kiseline, o njima će biti reči u okviru tih kiselina.

6.1.7 KISELE AMINOKISELINE

U ovu grupu spadaju L―asparaginska i L―glutaminska kiselina. Bočna grupa ovih aminokiselina je u području pH 6,0—7,0 negativno naelektrisana. Kod drugih pH vrednosti, asparaginska kiselina ima sledeće jonske oblike:

Slika 6.7 - Jonski oblici asparaginske kiseline kod različitih pH sredina

Kisele amino kiseline su monoaminodikarbonske jer imaju jednu amino, a dve karboksilne grupe.

L―Asparaginska kiselina i asparagin. — Vauguelin i Robiquet su nasli u špargli (Asparagus officinalis) supstancu, koju su po biljci nazvali asparagin. Hidrolizom je dobijena slobodna asparaginska kiselina, koja je L(+) aminoćilibarna kiselina. To je najkiselija aminokiselina s izoelektričnom tačkom kod pH 2,8. Asparaginska kiselina je posle toga nađena u proteinskom hidrolizatu. (Ritthausen, 1868).

Fumarna kiselina

Asparaginska kiselina se teško rastvara u vodi (0,424%). Rastvor je izrazito kiselog ukusa. Lakše se rastvara dodatkom hlorovodonične kiseline. Nalazi se skoro u svim proteinima. Asparaginska kiselina je neesencijalna glikogena aminokiselina. U mikroorganizmima nastaje direktno od fumarne kiseline dejstvorn enzima aspartaze:

Asparaginska kiselina igra važnu ulogu u procesima transaminacije i pri tome revizibilno prelazi u oksalsirćetnu kiselinu.

Kod fotosinteze i asimilacije azota asparaginska kiselina je jedno od prvih azotnih jedinjenja, koje nastaje biološkom sintezom.

L(—) Asparagin koji je β―amid asparaginske kiseline, može se izolovati iz nekih proteina; zbog toga i njega ubrajamo u proteinske aminokiseline. Asparagin je rezerva azota u biljnom tkivu.

L―Glutaminska kiselina i glutamin. — Neki semenski proteini, naročito prolamini, imaju u hidrolizatu do 45% glutaminske kiseline. Izolovao ju je Ritthausen (1866) iz belančevine glutena, koje ima u pšeničnom zrnu i po njoj dao ime.

Glutaminska ili α―aminoglutarna kiselina je najčešća arninokiselina i zauzima centralno mesto u metabolizmu aminokiselina. U vodenom rastvoru je mnogo manje kisela od asparaginske; odatle lako kristališe dodatkom hlorovodonične kiseline, pošto se njen hidrohlorid vrlo teško rastvara.

Glutamin je γ―amid glutaminske kiseline. Prvo je nađen u soku od repe, a docnije u hidrolizatima proteina. Slobodan glutamin se nagomilava u bilju, gde predstavlja azotnu rezervu. Ima ga i u krvi i tkivu životinja.

Glutamin se različito ponaša od asparagina pri zagrevanju njihovog vodenog rastvora. On prelazi u ciklično jedinjenje pirolidonkarbonsku kiselinu, a asparagin se ne menja:

Pirolidon―karbonska kiselina redukcijom prelazi u prolin.

6.1.8 BAZNE AMINOKISELINE

U ovu grupu spadaju lizin, arginin i histidin. Bočna grupa ovih aminokiselina je kod pH 6,0—7,0 pozitivno naelektrisana. Kod raznih vrednosti pH, lizin se nalazi u sledećim jonskim oblicima;

Slika 6.8 - Jonski oblici lizina kod različitih pH vrednosti

L―Lizin. — Drechsel je izolovao lizin iz hidrolizata kazeina (1889 god.). Lizin ili α, e―diaminokapronska kiselina je esencijalna aminokiselina. Nalazi se u manjim količinama u proteinima animalnog porekla, a većina biljnih belančevina nema lizina. To su belančevine male hranljive vrednosti (npr. zein, gliadin). Za izolovanje lizina koristi se slaba rastvorljivost njegovog pikrata.

Lizin pod uticajem mikroorganizama gubi CO2 (dekarboksilacija) i prelazi u pentametilendiamin, kadaverin:

Slika 6.9 - Deksarboksilacija lizina

L―Hidroksilizin. — α――diamino― hidroksikapronska kiselina dodana je listi proteinskih aminokiselina tek pre pedeset godina. Otkrivena je zahvaljujući osobini, koju imaju i druge oksikiseline, serin i treonin, da reaguju s perjodnom kiselinom. Ta je reakcija bila pozitivna i u materijalu gde nije bilo serina i treonina. D. van Slyke je obratio pažnju na tu frakciju i izolovao do tada nepoznatu aminokiselinu iz želatina 1938. godine. Hidroksilizin se nalazi u malom broju proteina (kolagen, želatin).

L―Arginin. — Arginin je α―amino―δ―guanidinovalerijanska kiselina. Nađena je prvo u semenkama lupina (Schulze i Steiger, 1886), a deset godina posle toga Kossel je pokazao da proteini ćelijskih jedra (protamini i histoni) daju hidrolizom velike količine ove aminokiseline (80 do 90%).

Arginin se dobro rastvara u vodi; rastvor reaguje jako alkalno. Zagrevanjem arginina s alkalijama nastaje karbamid (urea) i ornitin. Ako se uzme ekvimolekulska količina Ba(OH)2, postaje citrulin. Ornitin i citrulin nisu proteinske aminokiseline. Dejstvom α―naftola ili β―oksihinolina i natrijumhipohlorita vodeni rastvor arginina oboji se crveno. Reakciju daje guanidinska grupa. Pošto je arginin jedina aminokiselina s guanidinskom grupom, Sakaguchi je upotrebio ovu reakciju za fotometrijsko određivanje arginina.

U jetri čoveka i primata nastaje od arginina urea u poznatom Krebs―Henseleit―ovom ciklusu.

Argininfosfat učestvuje u kontrakciji mišića kod beskičmenjaka (analogno kreatinfosfatu — fosfagenu — kod vertebrata).

L―Histidin. — Histidin su našli istovremeno: Kossel u kiselom hidrolizatu sturina (protamina spermatozoa štuke) i Hedin u proteinskom hidrolizatu (1896 god.),

Histidin je α―amino―β―imidazolilpropionska kiselina. Pauly je dokazao imidazolov prsten u strukturi histidina i našao da zato daje reakciju s diazotovanom sulfanilnom kiselinom. (Pauly―jeva reakcija). Može se smatrati i derivatom alanina, koji na mesto jednog vodonika ima imidazolov prsten (imidazolil — alanin).

Većina proteina sadrži histidin, a u hemoglobinu se nalazi u relativno velikoj količini odakle se lako izoluje.

Slika 6.10 - Dekarboksilacija histidina

Gubitkom CO2 (dekarboksilacijom) histidin prelazi u histamin. Histamin je snažni vazodilatator; nalazi se u vrlo malim količinama u krvi, a vezan se nalazi u većim količinama u tkivu (pluća, mišići). Histamin se oslobađa pri alergičnim procesima u toku reakcije antigena sa antitelima vezanim za ćelije. U organizmu pasa histidin gubi amonijak i izlučuje se u mokraći kao urokaninska kiselina. U čovečjoj jetri je put razlaganja histidina isti, samo se nastavlja do glutaminske kiseline:

Lizin, arginin i histidin su poznati i pod imenom heksuronske baze (imaju 6 ugljenikovih atoma).

6.1.9 BIOSINTEZA AMINOKISELINA

Aminokiseline nastaju u organizmu kako biosintezom, tako i enzimskom hidrolizom proteina hrane. Biljke i mnogi mikrooroganizmi mogu da sintetišu sve aminokiseline, a organizam čoveka i većine životinja ne može da sintetiše sve potrebne aminokiseline. Takve aminokiseline nazivaju se bitne ili esencijalne, nasuprot neesencijalnim koje organizam sam sintetiše. Esencijalne aminokiseline za većinu životinja su: valin, leucin, izoleucin, fenilalanin, tirozin, triptofan, treonin, metionin i lizin. Histidin je bitan samo za neke vrste (npr. pacova).

U ovoj knjizi ne možemo da se upuštamo u detalje biosinteze pojedinih aminokiselina, ali ćemo dati tabelarni pregled porekla pojedinih atoma aminokiselina. Smatramo da je ovo vrlo instruktivno da student vidi da i aminokiseline nastaju od jednostavnih jedinjenja kao što su: pirogrožđana, oksalsirćetna i α―ketoglutarna kiselina.

Tabela. 6.7 - Poreklo pojedinih atoma aminokiselina

6.1.10 HEMIJSKE REAKCIJE AMINOKISELINA

Videli smo da aminokiseline imaju u svom molekulu amino― i karboksilnu grupu i zbog toga daju sve karakteristične reakcije ovih grupa.

Poznatu reakciju primarnih amina s azotastom kiselinom već smo spomenuli i kod aminokiselina, kao i njenu primenu.

Kao i sva jedinjenja sa amino― i iminogrupom, tako i aminokiseline reaguju s hloridima kiselina ili kako se kaže mogu se acilovati. Acetilhlorid reaguje u alkalnom rastvoru na sledeći način:

Acetilovanjem, aminogrupa gubi svoje bazne osobine.

Vrlo je važna reakcija aminogrupe sa CO2, pri čemu nastaju karbaminokiseline, stabilne samo u obliku svojih soli —NHCOO Na+. Kod životinja se na ovaj način prenosi CO2 iz tkiva u pluća, vezivanjem za slobodne aminogrupe proteina.

Poznata formolna titracija aminokiselina po Sorensen―u osniva se na reakciji slobodne (neprotonirane) amino―grupe sa formaldehidom. Ona se vrlo često koristi za praćenje procesa hidrolize proteina dejstvom proteolitičkih enzima. U toku reakcije višak formaldehida prouzrokuje gubitak protona (H+), koji se zatim iztitrira sa NaOH uz fenolftalein kao indikator:

Najpoznatija i najosetljivija reakcija na amino―grupu je ninhidrinska reakcija. Sve aminokiseline i peptidi, koji imaju slobodnu amino―grupu, daju sa ninhidrinom intenzivno plavo obojeni produkt. Jedino prolin i hidroksiprolin koji imaju supstituisanu amino―grupu daju pigment žute boje.

Slika 6.11 - Hemijska formula plavog pigmenta ninhidrinske reakcije

l―Fluoro―2,4―dinitrobenzen (FDNB) je reagens na slobodnu α―amino―grupu. Ovaj reagens je koristio F. Sanger za obeležavanje krajnjih α―amino―grupa u peptidima. Slobodne a―amino―grupe daju u slabo alkalnom rastvoru sa FDNB žuto obojene derivate, koji se zovu dinitrofenil―aminokiseline (DNP―aminokiseline).

Slika 6.12 - Reakcija l―fluoro―2,4― dinitrobenzena (FDNB)

Danas se za određivanje slobodnih α―amino―grupa upotrebljava fenil―izo―tiocijanat, poznat pod imenom Edman―ov reagens. Dejstvom ovog reagensa krajnja aminokiselina prelazi u feniltio―karbamilamino―derivat, koji u kiselom rastvoru ciklizira i odvaja se od ostalog peptidnog lanca. Zbog toga je ovaj reagens vrlo pogodan za određivanje redosleda aminokiselina u peptidnim lancima.

Slika 6.13 - Reakcija fenil―izo―tiocianata sa slobodnom α―amino grupom

Amino―grupa reaguje reverzibilno s aldehidom dajući vrlo labilno jedinjenje poznato pod imenom Schiff―ove baze. Ono nastaje i u toku enzimskog prenošenja amino―grupa u procesima transaminacije.

Slika 6.14 - Reakcija amino – grupe sa aldehidom

α―Karboksilna grupa aminokiselina pokazuje sve karakteristične reakcije organskih kiselina. Tako s alkoholima daje estre, s aminima amide a gubitkom vode prelazi u anhidride. Od derivata aminokiselina s biohemijskog stanovišta su najvažniji amidi aminokiselina. S amonijakom nastaju nesupstituisani amidi (I), a sa drugim aminima supstituisani amidi (II), koji se zovu peptidi.

Pored reakcija na amino― i karboksilnu grupu, aminokiseline daju i reakcije na prisutnu bočnu —R grupu: —SH grupu, fenolnu grupu (tirozin), gvanidinsku grupu (arginin) itd. Reakcije bočnih grupa opisane su kod pojedinih aminokiselina.

6.1.11 HROMATOGRAFIJA AMINOKISELINA

Hromatografija je dobila ime po tome što je poljski naučnik Cvet prvi put primenio ovu metodu za odvajanje obojenih supstanci (karotinoida ili lipohroma). Metoda se sastojala u sledećem: jedna staklena cev (kolona) napuni se aluminijum――oksidom ili nekim drugim adsorbensom i u nju se sipa petroletarski ekstrakt biljnog materijala. Naknadnim sipanjem benzola ili nekog drugog organskog rastvarača dolazi do razvijanja hromatograma tj. do rastavljanja smeše boja u pojedine komponente. Ovom metodom je Cvet uspeo da dokaže da se u biljnom materijalu nalaze različiti karotinoidi. Na slici je shematski predstavljeno odvajanje tri različite supstance u koloni tokom razvijanja hromatograma.

Slika 6.15 - Shematski predstavljeno odvajanje tri supstancije na koloni adsorbensa. Slike a, b, c i d prikazuju odvajanje tokom razvijanja hromatograma

prolaženjem organskog rastvarača kroz kolonu.

Ova metoda se naziva i adsorpciona hromatografija, jer do odvajanja komponenata iz smeše dolazi zbog različite adsorpcije supstancija na koloni od aluminijum―oksida.

Adsorpciona hromatografija se primenjuje samo za odvajanje lipofilnih jedinjenja, odnosno takvih koja se rastvaraju samo u organskim rastvaračima.

Klasičnim hemijskim metodama je bilo vrlo teško i skoro neizvodljivo da se iz smeše izdvoje slična jedinjenja, koja se rastvaraju u vodi, kao što su aminokiseline. Sve one imaju iste funkcionalne grupe, a razlikuju se samo po ostatku —R. Pored toga one se posle hidrolize proteina nalaze u hidrolizatu u vrlo malim količinama.

Tražeći pogodnu metodu za odvajanje hemijski sličnih jedinjenja, koja se rastvaraju u vodi (aminokiseline, šećeri i sl.) Martin, Gordon i Synge su 1941. god. uveli metodu podeone hromatografije. Ona se zasniva na poznatom Nernst-ovom zakonu raspodele supstanci između dva rastvarača, koji se ne mešaju. Naime, kada se vodeni rastvor polarnih organskih jedinjenja (aminokiselina, mono― i disaharida i sl.) pomeša, na primer, sa fenolom (etrom, hloroformom i sl.) stvoriće se dva sloja. Pri tome će jedan deo rastvorenih supstanci da pređe u fenolni sloj, već prema tome kolika je njihova rastvorljivost u fenolu. Odvajanjem fenola i ponovnim dodavanjem sveže količine, opet će jedan deo supstanci da pređe u fenol. Ako ovaj postupak ponovimo više puta, preći će iz vodenog rastvora u fenol prvo one komponente koje se najbolje u njemu rastvaraju, a posle mnogostrukog dodavanja i one koje se teže rastvaraju. Isti autori su 1944. godine postupak dodavanja svežeg organskog

rastvarača neobično uprostili, što su ceo postupak izvodili na koloni i na kraju su kolonu zamenili trakom filtracione hartije. Vodeni rastvor upija hartija (stacionarna faza), a sveže količine organskog rastvarača stalno ulaze (mobilna faza), noseći sa sobom prvo one aminokiseline, koje se u njemu najbolje rastvaraju, pa tako redom do onih koje se u organskom rastvaraču najmanje rastvaraju. Pošto se radi na čvrstoj podlozi (hartija), prilikom hromatografisanja igraju izvesnu ulogu i adsorpcione pojave.

Hromatografija na filtracionoj hartiji je jedna od metoda za odvajanje aminokiselina iz proteinskog hidrolizata. Ova metoda se odlikuje jednostavnošću, ne zahteva skupocenu aparaturu, a pomoću nje mogu da se dokažu vrlo male količine (10 g.).

Postupak: Pošto su aminokiseline vezane u belančevinama, prvo se izvrši hidroliza zagrevanjem u vakuumu (sa 6—10 M HCl) na 100°C. Hidrolitičkim razlaganjem belančevina dolazi do oslobađanja aminokiselina. U hidrolizatu se nalazi smeša svih aminokiselina i pre nego što se pristupi kvalitativnoj hromatografskoj analizi, višak kiseline se odstrani ponovljenim uparavanjem i dodavanjem vode.

Za hromatografiju se pripremi komora u kojoj će se raditi. To može da bude visoki stakleni cilindar ili neka druga pogodna posuda odgovarajućih dimenzija. Isto tako se priprema rastvor za razvijanje hromatograma. Obično se u levak za odvajanje sipa n―butanol (40 ml), sirćetna kiselina (10 ml) i voda (50 ml). Kada se organski rastvarač, u ovom slučaju n―butanol, zasiti vodom, odvoji se od vodenog sloja i nalije u posudicu, koja se nalazi na dnu komore. Vodeni sloj se stavi na dno komore, pored posudice sa rastvaračem da bi se cela komora zasitila vodenom parom.

Sada se uzme jedna traka specijalne filter hartije za hromatografiranje (Whatman), opere destilovanom vodom i osuši. Na 3—4 cm od kraja trake nanese se rastvor aminokiselina (oko 10 1 = 0,010 ml odnosno 30— 50 mg = 0,030 mg) pomoću fine pipete ili kapilare i osuši u struji toplog vazduha. Papir se zatim postavi u komoru za hromatografiju tako da mu jedan kraj (blizu mesta nanašanja probe) uroni u posudicu sa rastvaračem, a drugi kraj se zakači tako da slobodno visi. Rastvarač počinje da ulazi u hartiju i polako se širi. Kada dođe skoro do gornje ivice hartije (3—4 cm do kraja) traka se izvadi, osuši i poprska rastvorom ninhidrina. Posle ponovnog sušenja u sušnici pojavljuju se ljubičasto obojene mrlje pojedinih aminokiselina.

Dužina putovanja svake aminokiseline (A) podeljena sa dužinom putovanja rastvarača (B) (Rf=A/B) je konstantna vrednost za svaku aminokiseiinu u datom rastvaraču i uvek je manja od jedan.

Slika 6.16 - a ) Aparatura za uzlaznu b) Hromoatogram aminokiselina

hromatografiju posle prskanja ( detekcije)

sa ninhidrinom

Pored hromatografije na filtracionoj hartiji, danas se za kvantitativno određivanje aminokiselina, primenjuju vrlo precizne metode hromatografije na jonskim izmenjivačima.

6.2 PEPTIDI

6.2.1 PEPTEDNA VEZA

Posle saznanja da se svi proteini dejstvom razblaženih kiselina, baza ili smeše proteolitičkih enzima hidrolitički razlažu na aminokiseline, postavilo se pitanje na koji su način aminokiseline vezane u proteinima. E. Fischer i F. Hofmeister su 1912. godine pretpostavili da su aminokiseline povezane u proteinima amidnom vezom, koja nastaje reakcijom karboksilne grupe jedne aminokiseline s amino grupom druge:

glicilalaninSlika 6.17 - Nastajanje dipeptida glicil―alanin

Oni su prvi uspeli da iz dva molekula glicina uz izdvajanje molekula vode dobiju dipeptid glicil―glicin. Nazvali su ga dipeptid, jer se sastojao iz dva ostatka glicina, a nastalu amidnu vezu — peptidna veza. Dipeptid, kao i svaka aminokiselina sadrži jednu slobodnu amino― i jednu karboksilnu grupu. On može sa svojim slobodnim grupama ponova da stupi u reakciju sa nekom trećom aminokiselinom i da nagradi tripeptid. Na ovaj način povezivanjem četiri, pet i više aminokiselina nastaju tetra―, penta― i polipeptidi. Kako polipeptid još uvek ima slobodne krajnje grupe, ovaj proces može da se ponavlja stotinama puta.

Peptidi su, dakle, složena jedinjenja koja se sastoje iz više aminokiselina vezanih međusobno peptidnom vezom. Oni se dobijaju nepotpunim hidrolitičkim razlaganjem proteina. Pored toga izolovan je veliki broj prirodnih peptida specifičnog fiziološkog dejstva (peptidni hormoni, antibiotici i sl.). Karakteristična reakcija na peptidnu vezu je biuretska proba. Reakcija je nazvana po jedinjenju »biuret«, koje nastaje zagrevanjem ureje:

Biuret i sva jedinjenja, koja imaju jednu ili više peptidnih veza daju karakteterističnu ljubičastu boju sa bakar―sulfatom i natrijum―hidroksidom.

Peptidna veza je, dakle, supstituisana amidna veza. Kao i kod proste amidne veze, raspored elektrona oko atoma peptidne veze je simetričan i ona je zbog toga vrlo stabilna. Pored toga, veza između ugljenika i azota (C―N) ima 40% osobina dvogube veze, a dvoguba veza između ugljenika i kiseonika (C=0) ima 40% osobina jednogube veze. Zbog ove tzv. rezonantne stabilizacije, atomi koji ostvaruju peptidnu vezu ne mogu slobodno da rotiraju u prostoru. Ova osobina peptidne veze je od posebne važnosti s obzirom na trodimenzionalnu konformaciju peptidnog lanca.

Slika 6.18 - Raspored atoma peptidne veze u prostoru

6.2.2 NOMENKLATURA PEPTIDA

Prema broju aminokiselina koje sadrže, peptidi se dele na: oligopeptide i polipeptide. Oligopeptidi se sastoje od najviše 10 aminokiselina. Tu spadaju dipeptidi, tripeptidi, tetrapeptidi, itd. Polipeptidi sadrže cca 50 aminokiselina. Jedinjenja koja se sastoje od 100 i više ostataka aminokiselina spadaju u proteine.

Imena peptida grade se tako da se jedno za drugim navode imena ostataka aminokiselina sa nastavkom ―il, i na kraju se doda nepromenjeno ime aminokiseline sa slobodnom karboksilnom grupom, na primer:

Da bi se izbeglo pisanje dugačkih imena polipeptida, danas se prema zvaničnoj nomenklaturi IUPAC―a1[1] pišu samo prva tri slova iz imena aminokiselina. Krajnja aminokiselina sa slobodnom amino grupom piše se uvek na levoj strani niza, a ona sa slobodnom karboksilnom grupom na desnoj strani. Tako bi skraćeno ime gore napisanog peptida bilo: Ala―Gln―His―Gly.

Za potpuno poznavanje hemijskog sastava nekog peptida nije dovoljno samo da se zna iz kojih se aminokiselina sastoji, već i po kom su redu one međusobno vezane. Redosled vezivanja pojedinih aminokiselina u peptidima i proteinima naziva se sekvenca aminokiselina. Zbog različitog redosleda aminokiselina dipeptidi imaju dva izomera AB i BA, tripeptidi šest ABC, BCA, ACB, BAC, CAB i CBA, tetrapeptidi 24, itd.

Dugo vremena su hemičari pokušavali da nađu analitičke metode za određivanje redosleda aminokiselina u peptidima i proteinima. Jedino poznavanje redosleda omogućava da se i sintetiše dati peptid. Poslednjih dvadeset godina uvedeno je više analitičkih metoda za određivanje sekvence aminokiselina.

6.2.3 ODREĐIVANJE SEKVENCE AMINOKISELINA U PEPTIDIMA

Kod određivanja sekvence ili redosleda aminokiselina prvo se odrede krajnje aminokiseline peptidnog lanca. Posebne metode se koriste za određivanje krajnjih amino grupa (tzv. N―krajnje aminokiseline), a posebne za određivanje krajnjih karboksilnih grupa (C―krajnje aminokiseline). C―krajnje aminokiseline se otkidaju iz peptidnog lanca dejstvom enzima karboksilaza, odvajaju se hromatografski i identifikuju.

Za određivanje N―krajnjih aminokiselina poznati su različiti reagensi koji reaguju sa amino grupom. Mi smo spomenuli dva takva reagensa: l―fluoro―2,4―dinitrobenzen i fenil―izotiocijanat. Danas se uglavnom upotrebljava fenilizotiocijanat (Edman―ov), koji ima tu prednost što se krajnja aminokiselina posle reakcije odvaja od peptida, a da ne dolazi do cepanja drugih peptidnih veza unutar peptidnog lanca. Pomoću ovog reagensa može da se odredi na jednom uzorku peptida redosled pedesetak uzastopnih aminokiselina. Određivanje redosleda aminokiselina u peptidima pomoću Edman―ovog reagensa je danas automatizovano.Određivanje sekvence aminokiselina u polipeptidima zahteva da se polipeptidni lanac hidrolitički cepa na manje peptide dejstvom proteaza (tripsina, pepsina, himotripsina). Manji peptidi se hromatografski razdvoje i odredi im se sekvenca.

1

6.2.4 PRIRODNI PEPTIDI

Poznat je veliki broj prirodnih peptida. Jedan od najpoznatijih i najrasprostranjenijih je tripeptid — glutation. Hopkins ga je prvi izolovao iz kvasca 1921. god. Glutation je γ―L― glutamil―L―cisteinil―glicin.

Skraćeno se piše: G—SH. Dva mola glutationa gube dva vodonika i prelaze u disulfidni oblik: G—S—S—G (oksidovani glutation). Imajući u vidu da sva —SH jedinjenja imaju slabo kisele osobine, jer se izvode od sumporovodonične kiseline (H2S), možemo glutation da napišemo u jonskom obliku:

Prelaženje glutationa (G—SH — redukovani glutation) u oksidovani oblik G—S—S—G je reverzibilni oksido―redukcioni proces. Zbog toga glutation ima ulogu biološkog »redox« sistema.

U mišićima vertebrata nalaze se peptidi karnozin (β―alanil―L―histidin) i anserin (β―alanil―N―metil―L―histidin). I jedan i drugi imaju u svom sastavu neproteinsku aminokiselinu β―alanin.

Poznat je čitav niz polipeptida, koje sintetišu razni mikroorganizmi, a koji deluju antibakterijelno na druge mikroorganizme. Tu spadaju: penicilini, gramicidin, polimiksini, aktinomicin i dr. Najpoznatiji među njima su penicilini. Oni nastaju od aminokiselina valina i cisteina.

Antibiotik gramicidin je polipeptid koji sadrži D―fenilalanin.

6.2.5 PEPTIDNI HORMONI

Hormoni zadnjeg režnja hipofize oksitocin i vazopresin su ciklični peptidi, koji sadrže osam aminokiselina od kojih je jedna cistin.

Du Vigneaud je prvi uspeo da sintetiše oksitocin, a to je bila i prva sinteza jednog prirodnog peptida.

Kortikotropin (ACTH) adrenokortikotropni hormon prednjeg režnja hipofize i melanotropin, melano―stimulišući (MSH) hormon srednjeg režnja hipofize su polipeptidi lančaste strukture. Prvi sadrži 39 aminokiselina, a drugi 13—22 u zavisnosti od vrste sisara.

Insulin, hormon pankreasa, je visokomolekularni polipeptid sastavljen od 51 aminokiseline. Molekulska težina insulina iznosi 6 000, ali u prisustvu metalnih jona molekuli insulina asociraju u jedinice molekulske težine od 2 x 6 000, 3x12 000 i 4x12 000. Pošto su prvi rezultati određivanja molekulske težine insulina davali vrednost od 36 000 i 48 000, insulin se ranije ubrajao u proteine. Asocijacija proteinskih molekula u veće agregate (»molekule«) je danas opažena kod velikog broja proteina. Zbog toga i ne postoje oštre granice između polipeptida i proteina.

Hormon pankreasa glukagon je takođe polipeptid. Sadrži 29 ostataka aminokiselina, čija je sekvenca određena.

6.3 PROTEINI ILI BELANČEVINE

6.3.1 UVOD

Proteini su najbitniji sastojci žive materije. Mnogobrojnost, raznolikost i organizovanost živih bića počiva na osobinama proteina. Ime im je dao Berzelius, od grčke reči »proteinos«, što znači od prvenstvene važnosti.

U prirodi se nalazi veliki broj proteina. Mala i prosta ćelija bakterija kao npr. Escherichia coli sadrži oko 3 000 vrsta proteina, a u čoveku se računa da ima oko 5 miliona različitih proteina. Zastupljenost glavnih grupa bioloških makromolekula data je u donjoj tabeli. Ona je uglavnom ista u svim ćelijama (izuzev u kostima, kosi, masnim ćelijama). Iz tabele se vidi da 50% suve supstance otpada na proteine.

Tabela 6.8 - Molekulske komponente ćelije E. coli

Ukupna težina u % Broj svake

Procenat od ukupne grupe

težine

Voda 70

Proteini 15 oko 3 000

nukleinske kiseline

dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) 1 1

ribonukleinske kiseline 6 oko 1000

ugljenih hidrata 3 oko 50

Masti 2 oko 40

nisko molekulskih

biomolekula (osnovnih i intennedijera) 2 oko 500

neorganskih jona 1 oko 12

Za razliku od većine drugih sastojaka živog organizma, proteini su vrlo specifični. Tako nijedan protein E. coli nije identičan sa proteinima čoveka, iako mogu da vrše istu funkciju. Svaka životinjska i biljna vrsta ima svoje specifične proteine, a kod viših organizama i svaka individua ima svoje specifične proteine.

Proteini su biološki najaktivniji molekuli, jer obavljaju najrazličitije biološke funkcije. U donjoj tabeli dat je pregled i podela proteina na osnovu njihove biološke aktivnosti. U tabeli prva grupa proteina, poznata pod imenom enzimi, igra ulogu bioloških katalizatora. Oni između ostalog omogućavaju ćeliji da funkcioniše kao hemijska mašina, odnosno da može da koristi energiju okoline za svoj rast, održavanje i reprodukciju. Poznato je oko 2 000 različitih enzima koji se odlikuju po svojoj specifičnosti i efikasnosti. Svaki od njih katalizuje jedan tip ili samo jednu reakciju, i to vrlo efikasno i brzo, u milionitom delu sekunde.

Tabela 6.9 - Biološke funkcije proteina

Proteini Nalaženje i funkcija

1.

Enzimi:

Ribonukleaza

citohrom c

tripsin

hidrolizuje RNKprenosi elektrone

hidrolizuje peptidnu vezu

2.

Strukturni proteinistrukturni proteini membrane

α―keratinkolagenelastin

mukoproteini

sastavni delovi membranekoža, nokti, perje

tetive, kosti hrskavicaligamenti

sluzavi sekreti, sinovijalna tečnost

3.

Kontraktilni proteinimiozin

aktin

stacionarni filament miofibrila

pokretni filamenti miofibrila

4.

Transportni proteini

hemoglobin,mioglobin

serumski albumin

―lipoprotein, ceruloplazmin

proteini belancetaproteini mleka

proteini sa rezervama gvožđa

proteini pšenice i kukuruza

5.

Rezervni proteinialbutnin jajeta

kazeinferitin

gliadini i zeini

reguliše metabolizam glukoze reguliše sintezu kortikosteroida

stimuliše rast kostiju

6.

Hormoniinsulin

adrenokortikotropni hormon

hormon rasta

grade komplekse sa stranim proteinima

prethodnik fibrina u krvnom koagulumu

učesnik u procesu zgrušavanja

7.

Zaštitni proteini u krvi kičmenjaka

antitela

fibrinogen

trombin

izazivač bakterijalnih trovanja hranom

bakterijelni toksinenzimi koji hidrolizuju

fosfogliceride

8.

Toksinitoksin Clostridium botulinum

toksin difterije

zmijski otrov

Druga grupa obuhvata proteine koji izgrađuju strukturne elemente organizma i ona je po količini najveća. Različiti nerastvorni proteini ćelijske membrane, kompleksno vezani sa polarnim lipidima, čine srž membranske strukture. Oni igraju veliku ulogu u prenosu jona i manjih organskih molekula kroz membranu.

Glavni ekstracelularni strukturni protein vezivnog tkiva i kostiju viših životinjskih vrsta je lančasti protein kolagen. Fibrini kolagena takođe povezuju grupe ćelija u tkivo. Hrskavica se sastoji iz proteina konjugovanog sa polisaharidom — hondroitinsulfatom.

Treća grupa proteina čini bitne elemente kontraktivnih i pokretnih sistema, na primer: aktin i miozin u mišićima.

Grupa transportnih proteina može da prenosi različite molekule putem krvotoka. Tako hemoglobin prenosi kiseonik, albumin — slobodne masne kiseline, β1―lipoprotein — lipide, ceruloplazmin — bakar, itd. Neki proteini služe kao rezerva i obezbeđuju neometano razviće jedinke: na

primer albumin u jajetu, kazein mleka, gliadini i zeini u klici pšenice i kukuruza.

Pored enzima biološki je aktivna i grupa proteina koja pokazuje hormonsko dejstvo. Mnogi hormoni kao što je insulin, hormon rasta i drugi su proteinskog karaktera.

Zaštitni proteini kao što su antitela štite kičmenjake od stranih supstanci, a fibrinogen i trombin ih čuvaju da kod ranjavanja ne iskrvare.

Plazmaproteini, naročito albumin imaju odlučujuću ulogu u održavanju standardnih uslova u ćeliji i tkivima, kao što je održavanje osmotskog pritiska i pH.

Svi proteini, uključujući i one aktivne i toksične, sastavljeni su od samo dvadesetak aminokiselina, koje same po sebi nisu ni biološki aktivne niti toksične supstance. One su zajedničke za sva živa bića. Danas je objašnjeno kako povezivanje aminokiselina u proteinske čestice različitog oblika i dimenzija omogućava da proteini mogu da vrše toliko različitih i važnih funkcija.

U proteinima su aminokiseline vezane peptidno samo svojim α―amino i α―karboksilnim grupama. Druge polarne, kisele i bazne grupe različitih aminokiselina su slobodne i čine bočne grupe peptidnog lanca.

6.3.2 OSOBINE PROTEINA

Upadljiva osobina proteina je da mogu da grade kompleksna jedinjenja sa raznim supstancama i to na principu strakturne komplementarnosti. Enzimski molekuli su komplementarni sa supstratom, čiju promenu katalizuju; antitela su komplementarna sa svojim antigenom, koji je prouzrokovao njihovo nastajanje; transportni proteini su komplementarni sa supstancama koje prenose. Strukturna komplementarnost omogućava proteinima da mogu da vrše tolike raznolike funkcije.

Zajednička i karakteristična osobina proteina, po kojoj se razlikuju od drugih biohemijskih sastojaka, jeste njihova velika osetljivost prema svemu što ubija živa bića. Vrlo rano je zapaženo da se supstance kao: belance jajeta, krvni serum, ugrušano mleko, koagulišu pri zagrevanju, dejstvom kiselina i tzv. alkaloidnih reagenasa. Dobijeni kaogulum se ne rastvara, za razliku od taloga koji se dobija isoljavanjem proteina neutralnim solima i alkoholom. Zagrevanjem proteini se menjaju ili kako se to kaže »denaturišu«. Pod pojmom denaturacije podrazumeva se niz promena koje se odigravaju u komplikovanoj strukturi proteinskih

molekula. Denaturisanjem protein gubi svoje fiziološko dejstvo, a poznaje se odmah po promeni njegove rastvorljivosti.

Do denaturisanja proteina može da dođe ne samo povišenjem temperature već i dejstvom visokog pritiska mehaničkim tretiranjem, dejstvom kiselina, baza i organskih rastvarača i raznih zračenja. To je razlog da je živi svet toliko osetljiv na radioaktivnost.

Zbog velike osetljivosti proteina i opasnosti da ne dođe do denaturisanja, izolovanje nativnih proteina je vrlo težak i osetljiv posao. Pri tome se naročita pažnja obraća na temperaturu i koncentraciju vodonikovih jona. Ispitivanje proteina je koraknulo napred, tek kada su pronađene fizičke metode, koje nisu izazivale njihovu denaturaciju. Tada se pokazalo da su proteini makromolekuli. Njihova molekulska težina kreće se u širokim granicama i može da dostigne jedan milion daltona2[2] (vidi tabelu).

Tabela 6.10 - Molekulske težine nekih proteina

Proteini

Molekulska

težina

Broj aminokiselinskih

ostataka

Broj

proteina

Insulin goveđi 5 733 51 2

Ribonukleaza 12 640 124 1

Lizozim (belanceta) 13 930 129 1

Mioglobin (goveđeg srca) 16 890 153 1

Hemoglobin (ljudski) 64 500 574 4

Albumin (ljudskog seruma) 68 500 oko 550 1

Y―globulin (konjski) 149 900 Oko 1 250 4

Glikogen fosforilaza

(iz mišića kunića) 495 000 Oko 4100 4

Sintetaza masnih kiselina (iz kvasca) 2 300 000 oko 20 000 oko 21

Virus duvana 40 000 000 336 500 oko 2130

Proteini istog tipa i funkcije mogu da imaju različite molekulske težine. Neki proteini postoje u obliku oligomera tj. sastoje se iz nekoliko proteinskih molekula (protomera). Tako se hemoglobin sastoji od četiri protomera. Svi regulatorni enzimi sastoje se od više enzimskih molekula: na primer, sintetaza masnih kiselina ima sedam aktivnih enzima, a ceo kompleks se sastoji od 21 protomera. Najveći supramolekulski kompleksi su virusi, čija molekulska težina prelazi i 40 miliona. Oni se sastoje od

2

hiljadu i više proteinskih molekula, povezanih međusobno nekovalentnom vezom.

Kao i sva jedinjenja ugljenika molekuli proteina su trodimenzionalni i svaki od njih ima svoj karakterističan oblik u prostoru. Ispitivanjem zaštitnih proteina, poznatih pod imenom antitela ili imunoglobulini, koji nastaju u krvi kičmenjaka posle injekcije nekog proteina stranom tom organizmu, pokazalo se da proteini sa istom fiziološkom funkcijom (tzv. homologi proteini) nisu imunološki identični. Na primer hemoglobini različitih sisara ubrizgani eksperimentalnoj životinji izazivaju nastajanje različitih antitela. Znači da se hemoglobini različitih sisara i uopšte homologi proteini razlikuju po svojoj strukturi i obliku. Mi ćemo kasnije opširnije govoriti o strukturnim razlikama homologih proteina na primeru insulina i hemoglobina. Zasada je važno da naglasimo da veličina i oblik svake vrste zavisi od veličine i oblika proteina koji ih izgrađuje. Dakle, molekularna osnova raznolikosti živih bića počiva na raznolikosti izgleda i veličine proteina specifičnih za datu vrstu.

6.3.3 ELEMENTARNI SASTAV PROTEINA

Gerardus Johannes Mulder (1839) god. je prvi počeo sistematsko ispitivanje proteina. Primenjujući elementarnu analizu na proteine svile, krvnog fibrina, belanceta jajeta, želatina, našao je da svi imaju 12—19% azota. Prema ovom karakterističnom elementu i danas se izračunava i procenjuje proteinski sastav tkiva i hrane.

Princip određivanja azota u proteinima sastoji se u tome što se proteini sagore uz dodatak konc. H2SO4 i u prisustvu katalizatora (Cu, Hg, H2O2). Prilikom sagorevanja azot koji se nalazi u proteinima prelazi u amonijum―sulfat. Posle sagorevanja višak konc. H2SO4 se neutrališe i dodatkom jake baze NaOH oslobodi se amonijak iz nastalog amonijum―sulfata:

(NH4)2SO4 + 2NaOH=Na2SO4 + 2NH3 + 3H2O

Oslobođeni amonijak se kvantitativno hvata destilacijom u struji vodene pare u rastvor kiseline poznate koncentracije. Pri tome se neutrališe jedan deo kiseline, a titracijom se odredi koliko je amonijaka predestilovalo.

U analitičkom određivanju proteina krvne plazme dogovorno je uzeto da proteini imaju cca 16% azota i na osnovu toga se proračunava sadržaj proteina, množenjem postotka dobijenog azota s faktorom 6,25 (100/16 = 2,25). Naravno ovako dobijeni rezultati su samo približni.

Pored azota proteini sadrže 50—55% ugljenika, 6—7% vodonika, 20—23% kiseonika. Sumpora imaju 0,2—3%, a fosfora 0—6%. Neki proteini imaju u svom molekulu gvožđa (kao na primer hemoglobin), bakra, magnezijuma, cinka i drugih elemenata.

Hidrolitičkim razlaganjem proteina dobijena su jedinjenja male molekulske težine — aminokiseline. Utvrđeno je da su one osnovne strukturne jedinice iz kojih se sastoje svi proteini. U proteinima su aminokiseline vezane peptidnom vezom, gradeći peptidni lanac (ili lance). Ima proteina koji se sastoje samo od jednog peptidnog lanca (protomer), a veliki broj se sastoji od više, obično parnog broja, peptidnih lanaca. To su oligomerni proteini.

Proteini nisu slučajni polimeri različite dužine lanca. Naprotiv, svaki tip proteina okarakterisan je:

1) svojim specifičnim hemijskim sastavom,

2) molekulskom težinom i

3) redosledom (sekvencijom) aminokiselina u njegovom polipeptidnom lancu, koji je genetski dirigovan.

6.3.4 STRUKTURA PROTEINA

Svaki protein u nativnom stanju ima svoj specifičan i karakterističan trodimenzionalni oblik u prostoru, koji nazivamo KONFORMACIJA. Prema obliku i strukturi molekula proteini se dele na dve velike grupe:

A. Fibrilarne ili lančaste proteine i

B. Globularne ili sferoidne proteine.

Fibrilarni proteini imaju molekule u obliku vlakna (fibrila) dužine nekoliko stotina jedinica angstrema*3[3]. Njihovi polipeptidni lanci su paralelno smešteni duž jedne jedine osovine. Fibrilarne belančevine su osnovni strukturni elementi vezivnog tkiva viših životinja. Najpoznatiji proteini ove grupe su keratini, kolageni i elastini.

Keratini se sastoje iz dve vrste belančevina: fibrilarne komponente koja ima malu količinu sumpora i amorfnog globularnog proteina bogatog sumporom. Fibrili proteina su ugrađeni u amorfnu masu, slično čeličnim štapovima u betonski temelj. Principijelna razlika između keratina različitih životinja je u načinu pakovanja filamenata i količini i sastavu amorfnog matriksa. Kosa, koža, nokti, rogovi, perje su izgrađeni od keratina.

3

Kolageni su bitne komponente vezivnog tkiva kože, tetiva, kostiju, hrskavica i zubi. Javlja se u različitim oblicima. Elastina ima najviše u žutim elastičnim vlaknima vezivnog tkiva.

Karakteristična osobina ove grupe proteina je da su fizički i hemijski vrlo otporni, ne rastvaraju se ni u jednom neutralnom rastvaraču, niti u razblaženim kiselinama i bazama.

Globularni proteini imaju molekule manje ili više elipsoidnog oblika. Njihovi peptidni lanci su čvrsto sklupčani unutar globularne čestice. U ovu grupu spadaju biološki vrlo aktivni proteini: enzimi, hormoni, antitela, virusi i dr. Globularni proteini se nalaze u krvnoj plazmi, belancetu jajeta, mleku i svim tkivnim tečnostima. Rastvaraju se u vodi i rastvorima neutralnih soli.

Globularni proteini koji se sastoje iz više peptidnih lanaca nazivaju se oligomerni proteini. Sastavni peptidni lanci se zovu protomeri.

Slika 6.19 - Konformacija fibrilarnih (a) i globularnih (b) proteina

Ima proteina, koji se po svojoj konformaciji nalaze između fibrilarnih i globularnih. Njihovi molekuli su lančasti, slično fibrilarnim proteinima, ali se rastvaraju u vodi i rastvorima neutralnih soli. U ovu grupu spadaju miozin mišića i fibrinogen, strukturni element ugruška krvi.

Hemijske i biološke osobine proteina jedino mogu da se objasne egzaktnim opisom njihove konformacije. Prostorna organizacija peptidnih lanaca u proteinima ispituje se uglavnom merenjem difrakcije X―zrakova. Talasna dužina X―zrakova je istog reda veličine kao i razdaljina atoma u kristalima. Prema tome, kada su atomi pravilno razmešteni u jednom kristalu, oni difraktuju, ugibaju X―zrakove kao i

optička rešetka. Tako se na osnovu difrakcionih merenja može da ustanovi položaj pojedinih atoma peptidnog lanca i njihova međusobna razdaljina.

U molekulima proteina postoje četiri nivoa strukturne organizacije peptidnih lanaca: primarna, sekundarna, tercijerna i kvarterna. Primama struktura obuhvata samo kovalentnu kičmu polipeptidnog lanca i karakterističan redosled ostataka aminokiselina (sekvencu). Sekundarna struktura obuhvata način prostiranja peptidnih lanaca (izduženi ili spiralni), naročito onakav kakav se nalazi u fibrilarnim proteinima. Tercijarna struktura objašnjava način na koji se peptidni lanac presavija i uklupčava da bi se stvorila kompaktna struktura globularnih proteina. Fibrilarni proteini nemaju tercijernu strukturu. Kvaterna struktura obuhvata prostornu organizaciju više peptidnih lanaca. Ovu strukturu imaju samo oligomerni proteini.

6.3.5 PRIMARNA STRUKTURA PROTEINA

Aminokiselinski sastav proteina određuje se u hidrolizatu pomoću raznih hromatografskih metoda, koje su danas automatizovane. Dosta dobar uvid u sastav proteina daju formule, koje u principu odgovaraju opštim formulama neorganskih jedinjenja npr. Na2SO4. Sastav β―laktoglobulina bi bio: Gly8. Ala29. Val21. Leuso. Ile27. Pro15. Phe19. Arg7. His4. Asp36. Glu26. Ser20. Thr21. Cys4. Cys―Cys8. Met9. Tyr9. Try4. (NH3)32.

U ovoj formuli grupacije od tri slova označavaju pojedine aminokiseline, a indeks pored njih znači da ima toliko ostataka dotične aminokiseline u molekulu.

Određivanje sekvence aminokiselina

Kod utvrđivanja redosleda odnosno sekvence aminokiselina prvo treba da se odredi da li se protein sastoji iz jednog ili više peptidnih lanaca. Ovo može da se konstatuje određivanjem broja krajnjih aminogrupa u intaktnom proteinu pomoću reakcije sa fluorodinitrobenzenom. Daljnji korak je da se u slučaju oligomernog proteina njegovi sastavni peptidni lanci (monomeri) odvoje i izoluju u čistom stanju. Odvajanje se radi elektroforetski ili hromatografski. U slučaju kada su peptidni ianci povezani kovalentnom —S—S— vezom preko ostataka cisteina, lanci se odvajaju cepanjem ove veze oksidacijom sa perhlornom kiselinom.

Pošto se peptidni lanci u proteinima sastoje od stotine aminokiselinskih ostataka, oni se prvo cepaju na manje peptide, jer se redosled može da odredi samo na manjim peptidima. Cepanje na manje peptide može da se radi hemijskim ili enzimskim metodama. U oba slučaja treba da se zna između kojih aminokiselina je došlo do kidanja peptidne veze. Od

hemijskih reagenasa za sada se najviše upotrebljava cijanogenbromid, koji cepa na mestu metionina. Nastali manji peptid ima kao krajnju aminokiselinu homoserin (derivat metionina).

Kod enzimske hidrolize koristi se osobina enzima da hidrolizuju veze samo između određenih aminokiselina. Tako hidroliza sa tripsinom daje peptide koji imaju kao krajnju C―aminokiselinu lizin ili arginin. Himotripsin cepa na mestu aromatičnih aminokiselina, tako da nastaju peptidi čija je krajnja aminokiselina triptofan, tirozin ili fenilalanin. Pored ova dva enzima koristi se pronaza i suptilizin i papain.

Slika 6.20 - Redosled aminokiselina u goveđem insulinu položaj —S—S— veza između A i B lanca.

Podvučene su one aminokiseline, koje se nalaze u homologim insulinima.

N―I―C―D―I―S―C―D―K―F―L―N―N―I―T―N―N―I―M―C―A―K―K―I―L―D―I―K―G―I―N―O―W―L―A―H―K.

Niz aminokiselina u peptidnom lancu ―laktalbumina (velika slova označavaju ostatke aminokiseliina)

A. Cepanjem sa cijanogenbromidom na mestu gde se nalazi metionim (M) nastaje:

N―I―C―D―I―S―C―D―K―F―L―N―D―N―I―T―N―N―I―M

jedan peptid br. 1

C―A―K―K―I―L―D―I―K―G―I―N―O―W―L―A―H―K.

drugi peptid br. 2

B. Enzimskim cepanjem dobijenih peptida sa tripsinom dobija se od peptida br. 1:

N―I―C―D―I―S―C―D―K Peptid 1―1 i

F―L―N―D―N―I―T―N―N―I―M Peptid 1―2

a od peptida br. 2

C―A―K i slobodan lizin (K) Peptid 2―1

I―L―D―I―K Peptid 2―2

G―I―N―O―W―L―A―H―K Peptid 2―3Slika 6.21 - Cepanje peptidnog lanca sa cijanogenom i tripsinom; velika slova

označavaju aminokiseline, npr. M―metionin, K―Iizin.

Iz slike 6.21. se vidi da je peptid od 28 aminokiselinskih ostataka prvo hidrolizovan sa cijanogenbromidom na dva peptida: Peptid 1 i 2. Hidrolizom ovih manjih peptida sa tripsinom dobijeno pet još manjih: 1 — 1, 1— 2, 2—1, 2—2 i 2—3.

Slika 6.22 - Peptidni lanac goveđe ribonukleaze, sa položajem četiri—S—S—mosta

Do danas je relativno malom broju proteina određena sekvenca aminokiselina. Prvi protein kome je određena sekvenca je bio insulin, za njega je docnije pokazano da je peptid. Sekvencu insulina je utvrdio Sanger sa saradnicima 1953. godine, za šta je dobio Nobelovu nagradu. Iz sheme se vidi da se insulin sastoji iz dva peptidna lanca: A i B. Prvi je izgrađen iz 21 aminokiseline, a drugi od 30. Lanac A i B su povezani sa dva —S—S— mosta. Posle insulina određena je sekvenca hormona adrenokortikotropina, čija je molekulska težina 4 600, a sastoji se od 39 aminokiselina. Ribonukleaza je prvi enzim kome je određena sekvenca. Ona se sastoji od 124 aminokiselina, povezanih u jedan peptidni lanac koji na četiri mesta ima —S—S— mostove.

Određena je i sekvenca enzima tripsinogena (229 aminokiselina) himotripsinogena (245 aminokiselina) gliceraldehid―3―fosfat dehidrogenaze (333 aminokiselina).

Prvi oligomerni protein kome je određena sekvenca aminokiselina bio je normalni hemoglobin odraslog čoveka Hb A. On se sastoji od četiri peptidna lanca: dva alfa i dva beta. Alfa―lanac ima 141 ostataka aminokiselina, a beta 146. Na sledećoj shemi dat je redosled aminokiselina u alfa― i beta― lancu adultnog hemoglobina HbA. Na shemi su podvučene aminokiseline, koje se na istom mestu javljaju u oba lanca. Pojava istih aminokiselina na istim mestima u različitim peptidima naziva se homologija sekvence. Protein mioglobin, koji se nalazi u mišićima i koji kao i hemoglobin može da vezuje kiseonik, pokazuje s

alfa― i beta― lancem hemoglobina homologiju sekvence (na shemi zaokružene aminokiseline). Mioglobin se sastoji samo od jednog peptidnog lanca.

Slika 6.23 - Sekvenca aminokiselina u α i β lancu čovečijeg adultnog hemoglobina. Iste aminokiseline u oba lanca su podvučene, a zaokruže su one

koje se na istom mestu javljaju i u miglobinu.

6.3.6 VARIJACIJE U PRIMARNOJ STRUKTURI HOMOLOGIH PROTEINA, IMUNOGLOBULINA I PATOLOŠKI NASLEDNIH PROTEINA

Određivanje sekvence aminokiselina u proteinima otkrilo je mnoge značajne činjenice i proširilo naše znanje o proteinima. Konstatovano je

da u proteinima postoje sve moguće kombinacije aminokiselina. Kod globularnih proteina nema periodičnog ponavljanja redosleda aminokiselina kao ABABABABAB ili ABCDABCDABCD. Međutim, kod lančastih proteina ima periodičnog ponavljanja nekih aminokiselina. Tako se u kolagenu ostaci alanina, glicina, prolina i hidroksi―prolina periodično javljaju.

a. Homologi proteini

Proteini koji vrše istu fiziološku funkciju kod različitih životinja nazivaju se homologi proteini. Oni obično imaju istu molekulsku težinu. Ispitivanje homologih proteina pokazalo je da se oni razlikuju u sekvenci aminokiselina i da su, prema tome različiti proteini. Oni samo na pojedinim mestima u svojim polipeptidnim lancima (ili lancu) imaju iste aminokiseline (homologija sekvence). Razlika u sekveneci varira od vrste do vrste i ukoliko je veća filogenetska razlika utoliko je i veća razlika u sekvenci. Tako se citohrom c konja i kvasca razlikuje na 48 mesta u peptidnom lancu, koji se sastoji od 104 aminokiseline.

Kad su filogenetske razlike manje onda je i razlika u sekvenci pojedinih proteina manja. Tako je pokazano da insulini izolovani iz pankreasa: krave, svinje, ovce, koze i konja imaju identičan redosled aminokiselina u lancu B, a u lancu A postoje razlike samo na položajima 8, 9 i 10.

Ispitivanjem sekvence enzima tripsina i himotripsina različitih životinja, takođe je pokazalo da su to različiti proteini, koji pokazuju homologiju na pojedinim mestima u peptidnom lancu. Enzimi obično imaju isti redosled na onom delu peptidnog lanca za koji se veže supstrat.

b. Imunoglobulini

Većina antitela su proteini molekulske težine od 150 000 daltona. Svaki imunoglobulin reaguje sa svojim antigenom na specifičan način, što je prikazano na donjoj shemi.

Slika 6.24 - Specifična reakcija antigena s molekulima antitela i nastajanje nerastvornog kompleksa

Ispitivanje sekvence različitih imunoglobulina (antitela) pokazala su da se njihov molekul sastoji od dva laka i dva teška lanca. Lakši lanci imaju molekulsku težinu 20 000 daltona, a teški 50 000. Sekvenca svih 1 300 aminokiselina u jednom tipičnom imunoglobulinu je određena i upoređena sa sekvencom drugih imunoglobulina specifičnih na različite antigene. Pokazalo se da imunoglobulini imaju u pojedinim delovima molekule iste aminokiseline. Samo se oni delovi lakog i teškog peptidnog lanca, koji su blizu krajnjoj aminokiselini sa slobodnom —NH2 grupom.

Slika 6.25 - Struktura imunoglobulina (IgG): sastavljen je od dva teška lanca i dva laka lanca. Sekvenca aminokiselina na kraju lanca gde se nalazi slobodna

―NH2 grupa varira kod različitih anti―tela (šrafirani deo) dok je u ostalim delovima ista (nešrafirani deo).

(N―krajnje aminokiseline) razlikuju u sekvenci. To je zapravo onaj deo molekula koji specifično reaguje s antigenom. Verovatno je da ova razlika u sekvenci prouzrokuje i fine razlike u obliku mesta u koje treba da se

uglavi antigen. Antigen mora da bude komplementaran s antitelom, znači mora da prileže kao ključ u bravi.

c. Patološki nasledni proteini

L. Pauling i H. Itano su izolovali hemoglobin osoba obolelih od jedne nasledne anemije, poznate pod imenom »srpasta« anemija. Izolovani hemoglobin S (HbS) razlikovao se po svojim fizičko―hemijskim osobinama od normalnog hemoglobina A čoveka (HbA). On se teže rastvarao nego normalni, sporije je putovao u električnom polju, itd. Određivanje sekvence HbS pokazalo je da se njegov β―peptidni lanac razlikuje od istog lanca HbA, po tome što na položaju šest umesto glutaminske kiseline ima valin. Zbog toga HbS ima jedan negativan naboj manje kod neutralnog pH i sporije se kreće u električnom polju. Na ovaj način je dokazano da je »srpasta« anemija nasledno oboljenje, koje nastaje zbog mutacije DNK molekula, koji diriguje sintezu (β ―peptidnog lanca hemoglobina. Zbog toga što HbS ima drukčije osobine od normalnog hemoglobina on prouzrokuje promenu bikonkavnog oblika normalnih eritrocita. Kod ljudi je do danas otkriveno oko 150 patoloških hemoglobina. Oni su posledica genetskih promena, koje obično prouzrokuju zamenu samo jedne aminokiseline u alfa― ili beta― lancu hemoglobina.

Tabela 6.11 - Deo β―polipeptidnog lanca u hemoglobinima A, S i C

Ispitivanja patoloških hemoglobina ukazalo je na mogućnost postojanja i drugih patoloških proteina, čija je sekvenca aminokiselina promenjena zbog mutacije odgovarajućih gena. Do danas je otkriveno nekoliko stotina tzv. »molekulskih oboljenja«, koja nastaju zbog promene sekvence

normalnog proteina. Ova oboljenja se najlakše otkrivaju kod proteina koji su enzimski aktivni. Naime, promena u sastavu njihovog molekula reflektuje se na njihovu enzimsku aktivnost u određenom metaboličkom procesu, koja može da se izmeri ili konstatuje na odgovarajući način.

6.3.7 SEKUNDARNA STRUKTURA PROTEINA

Pod sekundarnom strukturom proteina se podrazumeva način prostiranja njegovog peptidnog lanca, odnosno međusobni položaj aminokiselina. Najbolje je ispitana sekundaraa struktura fibrilarnih proteina (α―keratina, fibroina svile i kolagena), jer imaju najprostiju strukturu.

Strukturu proteina određuje na prvom mestu prostorni raspored atoma u peptidnoj vezi, jer je osnovna struktura proteina polipeptidna. Ranije je rečeno da je raspored elektrona oko atoma peptidne veze simetričan i da zbog toga njena šest atoma Cα―CO―NH―Cα leže u jednoj ravni.

Slika 6.26 - Raspored atoma peptidne veze i mesta rotacije oko―ugljenikovih atoma (1. i 6.C)

1―C i 6―C su alfa―ugljenikovi atomi aminokiselina između kojih se nalazi peptidna veza i za koje su vezani ostaci R' i R". Jedan alfa―ugljenikov atom je vezan jednogubom vezom za ugljenik —CO grupe (2.), a drugi za azot (5.) —NH grupe. Pošto atomi povezani jednogubom vezom slobodno rotiraju, to se peptidni lanac može samo na tim mestima da savija gradeći spiralu. Nasuprot tome, veza između ugljenika CO grupe (2―C) i azota —NH (5―N) grupe, zbog gustine elektrona, ima karakter dvogube veze, koja je u prostoru nepokretna

(fiksirana). Atomi kiseonika i vodonika nalaze se u položaju trans. Vodonik je prostorno udaljen od elektronegativnog kiseonika i zbog toga ne može da daje proton.

Na osnovu prostornog položaja atoma peptidne veze kičma polipeptidnog lanca u proteinima je planarna i sastoji se od serije relativno nepokretnih površina odvojenih supstituisanim metilenskim grupama za koje su vezani ostaci aminokiselina. Iz tog razloga polipeptidni lanci imaju samo jedan prirodni oblik u prostoru, koji nazivamo sekundarna struktura. Ona je stabilnija od svih drugih koje bi lanac mogao da zauzme.

Slika 6.27 - Kičma polipeptidnog lanca: šrafirane su površine prostorno fiksirane peptidne veze, a strelicom su označena mesta na kojima lanac može da se

savije

Zbog nesavitljivosti peptidnih veza postavilo se pitanje kakav oblik imaju peptidni lanci. Pokazalo se da peptidni lanci, uglavnom, zauzimaju dva oblika ili kako kažemo sekundarne strukture:

A) oblik desne α―spirale (ili α―heliks) i

B) oblik presavijenih površina (cik―cak struktura).

6.3.8 STRUKTURA α―HELIKSA

Ispitivanja strukture ―keratina su pokazala da peptidni lanac ovog fibrilarnog proteina nije pravolinijski izdužen, nego je dužina identičnih perioda skraćena i kreće se od 5,0—5,5 angstrema. Pomoću konstruisanih modela Pauling i Corey su utvrdili da peptidni lanac α―keratina ima oblik α―heliksa. Spirala α―heliksa čini kičmu peptidnog lanca iz koje štrče prema spolja isturene bočne grupe aminokiselina (slika 7.10). U α―heliksu je svaka aminokiselina povezana vodoničnom vezom sa sledećom četvrtom aminokiselinom, tako da se zavoj sastoji od 3,6 ostataka aminokiselina. Vodonične veze se nalaze na svakoj peptidnoj vezi, koja ima s jedne strane vodonik vezan za azot (—N : H), a s druge strane elektronegativni kiseonik (—C=O). Vodonik gradi most između kiseonika jedne peptidne veze i azota četvrte i na taj način povezuje delove α―heliksa. α―Helikoidni oblik peptidnog lanca je najpovoljniji

od svih drugih mogućih obiika, jer omogućava postojanje maksimalnog broja vodoničnih veza. Električni vektori sila vodoničnih veza su tako orijentisani da osiguravaju maksimalnu jačinu α―heliksu. Iako jačina vodonične veze iznosi samo 5—10% jačine kovalentne veze, jer je za njeno kidanje dovoljno samo 5 000 cal/mol (20 920 J/mol) kada ih ima više stotina, one stabilizuju datu molekulsku strukturu. Zbog toga se i pretpostavlja da se peptidni lanac spontano spiralizuje u α―heliks, jer je to najstabilnija struktura, sa najmanjim sadržajem slobodne energije. U α―heliksu ima, dakle, onoliko vodoničnih veza, koliko i peptidnih.

Peptidni lanac može da se spiralizuje u α―heliks ako je sastavljen samo od L―ili samo od D―aminokiselina. Proteinske L―aminokiseline grade uglavnom desni α―heliks, jer je on stabilniji. Tako α―keratini kose, noktiju, perja, vune grade desne helikse, koji su međusobno upleteni u trostruke ili sedmorostruke niti.

Treba da se naglasi da ne može svaki peptidni lanac da se spiralizuje u α―heliks. Nastajanje stabilnih helikoidnih struktura zavisi od primarne strukture proteina, odnosno njegovog aminokiselinskog sastava i sekvencije. Samo određeni raspored bočnih — R grupa omogućava spiralizaciju peptidnog lanca. U tabeli 6.12 je dato koje aminokiseline pogoduju spiralizaciji α―heliksa, a koje je narušavaju. Tako npr. kada peptidni lanac sadrži mnogobojne ostatke lizina, koji su kod pH 7 pozitivno naelektrisani, zbog međusobnog odbijanja pozitivnih bočnih grupa, spirala će se odviti.

Slika 6.28 - Shema α―heliksa sa tačkasto oznsčenim vodoničnim vezama

Gubitkom pozitivnog naboja (kod pH 12) ovakav peptid će spontano da spiralizuje. Slično se ponaša peptidni lanac sa ostacima asparaginske kiseline, koji nose negativne naboje kod pH 7. Kada kisele bočne grupe izgube naboj povećaniem H+ jona (kod pH 2), peptid će da nagradi α―heliks. Jedine aminokiseline, koje ne mogu da se uklope u α―heliks su prolin i oksiprolin. One nemaju primarnu aminogrupu, već je njihov azot sastavni deo nesavitljivog pirolidinskog prstena.

Tabela 6.12 - Uticaj aminokiselina na nastajanje α―heliksa

aminokiseline koje aminokiseline koje Aminokiseline kojestabilizuju ―heliks destabilizuju ―heliks cepaju ―heliksAlanin serin ProlinLeucin izoleucin OksiprolinFenilalanin treoninTirozin glutaminska kiselinaTriptofan asparaginska kiselinaCistein lizinMetionin argininHistidin glicinasparagin i glutaminValin

6.3.9 STRUKTURA PRESAVIJENIH POVRŠINA

Astbury je našao da se fibrile α―keratina na dvostruko rastegnuti zagrevanjem u vlažnoj atmosferi. Rentgenskim ispitivanjem rastegnutih i nerastegnutih fibrila keratina, pokazalo se da je položaj atoma u njima različit. Nerastegnuti oblik ima strukturu α―heliksa, a rastegnuti, koji se obeležva sa β―oblik, je vrlo sličan fibroinu svile. On se sastoji iz serije polipeptidnih lanaca povezanih mnogobrojnim vodoničnim vezama. Zagrevanjem keratina došlo je, dakle, do promene njegove konformacije prešao je iz α―helikoidnog oblika u β―oblik koji se naziva oblik presavijenih površina ili cik―cak. Površine obrazuju mnogobrojni peptidni lanci, povezmi brojnim međulančanim vodoničnim vezama, kojih ima onoliko koliko i peptidnih veza. Bočne grupe aminokiselina štrče iznad i ispod površine.

Slika 6.29 - β―Struktura presavijenih površina sa R―grupama ispod i iznad površina. Tačkastim linijama su označene vodonične veze.

U slučaju da su R―grupe glomazne ili nose istoimene električne naboje β―struktura postaje nestabilna i prelazi spontano u α―heliks.

Peptidni lanci presavijenih. površina mogu da budu paralelni tj. da teku u istom smeru (β―keratin) ili antiparalelni (fibroin svile).

6.3.10 STRUKTURA KOLAGENA

Kolagen je pored keratina po količini najzastupljeniji telesni protein. Bitni je sastojak vezivnog tkiva. Pored kolagena intracelularni prostor sadrži mukopolisaharide, kompleksno vezane za proteine i nekolagenske proteine. Kolagen se sintetiše u ćeliji u rastvornom obliku, koji posle izlaska iz ćelije menja svoju strukturu prelazeći u nerastvorne f ibrile.

Kolagen se nalazi u više oblika. Njegova struktura liči na porozni sunđer, koji lako adsorbuje vodu i zagrevanjem se skvrči. Aminokiselinski sastav kolagena varira prema poreklu, ali je za sve kolagene karakteristično da sadrže mnogo hidroksiprolina i hidroksilizina (oko 22%) i oko 33% glicina. Pošto je svaka treća aminokiselina glicin, lanac ima sledeću sekvencu aminokiselina: H2N. . . Gly—X—Y—Gly—X—Y—Gly... COOH. Poznato je da ove aminokiseline utiču na odvijanje α―heliksa i prema tome fibrili kolagena ne mogu da budu helikoidne strukture. Ispitivanja sa X―zrakovima su pokazala da peptidni lanci kolagena grade izdužene trostruke spirale. Između lanca spirale postoje vodonične veze, što daje čvrstinu fibrilima kolagena i otpornosti na zagrevanje. Trostruka spirala kolagena naziva se tropokolagen. Ona je tako uvijena da se ostaci glicina nalaze unutar spirale, a glomazne bočne grupe prolina i

hidroksiprolina štrče iz spirale. Peptidni lanci trostruke spirale su povezani i drugim vrstama nekovalentnih veza. Sa metaboličke tačke gledišta kolagen je interesantan, jer se sintetiše samo dok životinja raste. Tako kod čoveka njegova sinteza pada na minimum posle 18―te godine, ali kod trudnica se javlja ponova u uterusu.

Slika 6.30 - Konformacija polipeptidnih lanaca tropokolagena

6.3.11 TERCIJERNA STRUKTURA GLOBULARNIH PROTEINA

Većina nativnih globularnih proteina ima čvrstu kompaktnu strukturu u obliku manje ili više izdužene loptice. Pod tercijernom strukturom se podrazumeva kako su unutar takve loptaste čestice smešteni peptidni lanci. Tercijerna struktura je kod nekih globularnih proteina poznata na osnovu podataka, koji su dobijeni merenjem difrakcije X―zrakova na njihovim kristalima.

Presudni uticaj na tercijernu strukturu globularnih. proteina imaju reakcije koje se odigravaju između bočnih R―ostataka aminokiselina njihovog peptidnog lanca ili lanaca. Zbog tih međusobnih reakcija dolazi do umotavanja peptidnog lanca na tačno određeni način i nastajanja čestice preciznih dimenzija. Pošto oblik i veličina čestice globularnog proteina zavisi od vrste i broja određenih bočnih grupa u peptidnom lancu, znači da je primarna struktura ona koja određuje tercijernu, odnosno krajnji izgled u prostoru.

Do međusobnih reakcija bočnih R―grupa dolazi, jer se one razlikuju po svojim fizičko―hemijskim osobinama. Bočne grupe mogu da budu

nepolarnog ili hidrofobnog karaktera, mogu da budu polarne ali nejonizovane, zatim kisele i bazne. Kisele bočne grupe su kod fiziološkog pH negativno naelektrisane, a bazne pozitivno. Da se podsetimo da je bočna grupa histidina kod pH = 6 jonizovana 50%, odnosno samo 10% kod pH = 7.

Prvi protein kome je ispitana tercijerna struktura je bio mioglobin i zato ćemo na njegovom primeru pokušati da objasnimo tercijernu strukturu globularnih proteina.

Mioglobin se inače sastoji samo od jednog peptidnog lanca sa 153 aminokiselinskih ostataka, ima kao prostetičnu grupu jedan hem za koji je vezan atom gvožđa. Molekulska težina mioglobina iznosi 17 500 daltona. U njegovom molekulu nema —S—S— veza. On u mišićima ima ulogu prenosioca kiseonika.

Merenjem difrakcije X―zrakova na kristalima mioglobina se pokazalo da pojedini delovi njegovog peptidnog lanca imaju oblik α―heliksa. Tačnije, samo 77% polipeptida je u obliku spirale, a 23% nije. Struktura mioglobina je prikazana na donjoj slici 6.31

Slika 6.31 - Tercijerna struktura mioglobina. Molekul je izgrađen od 8 spiralnih peptidnih lanaca (α―helikoidnih peptidnih lanaca), koji formiraju jednu vrstu

kutije za hem grupu. Na slici su pojedini Ianci obeleženi slovima: A, B, C, E, F, G i H. Kiseonik se nalazi na mestu W. Hem―grupa je levo i desno vezana za

histidin. Zidove kutije obrazuju spirale E i F, podnožje (osnovicu) B, G2 i H, a lanac C i D zatvara ugao gornjeg dela kutije. Sa COOH je označena krajnja

aminokiselina sa slobodnom karboksilnom grupom, a sa ―NH2 aminokiselina sa slobodnom amino grupom.

Atom Fe je u mioglobinu koordinativno vezan za azotove atome porfinskog prstena kao i za azot histidinskog ostatka u polipeptidnom lancu. Kiseonik asocira sa gvožđem na način koji još nije tačno određen.

Nezavisno od toga što je vezan za gvožđe i histidin, hem je sam po sebi hidrofobnog karaktera i drži se u hidrofobnom mediju nepolarnih aminokiselina.

Ispitivanje mioglobina je pokazalo da je njegova tercijerna struktura takva da je vrlo pogodna za reakciju sa kiseonikom. Istovremeno je to i model strukture, koji bi omogućavao kod enzima da reaguju sa njihovim supstratima. Opšte osobine koje proizlaze su sledeće:

1) Molekul je tako kompaktan da unutra ima mesta za mali broj molekula vode.

Skoro svi polarni ostaci aminokiselina, uključujući naelektrisane (npr. lizina, arginina, histidina i dr.) nalaze se na površini proteinskog molekula. One su, prema tome, izložene dejstvu molekula vode u rastvoru. To je razlog što jonske sile malo utiču na kompaktnost (celinu) proteinske čestice. Medutim, ovo objašnjava uticaj promene pH sredine na rastvorljivost proteina.

U unutrašnjem delu proteinske čestice smeštene su nepolarne aminokiseline (valin, leucin, izoleucin i fenilalanin). One se međusobno povezane hidrofobnim vezama, koje prouzrokuju asocijaciju i zbijanje proteinske čestice. Bočne grupe (―R) ovih aminokiselina ponašaju se kao i ugljovodonični lanci masnih kiselina. Molekul globularnog proteina liči zbog toga na kapljicu ulja sa polarnom membranom.

Slika 6.32 - Shematski prikazani različiti tipovi veza koje nastaju međureakeijama bočiih

grupa aminokiselina.

Opšti pojmovi o strukturi globularnih proteina, koji su enzimski aktivni, dobijeni su ispitivanjem enzima koji lako kristalizuju. Prvi enzim, čija je struktura ispitana bio je lizozim, a zatim ribonukleaza, karboksipeptidaza, himotripsinogen i dr.

Spomenuti enzimi su se razlikovali od mioglobina i hemoglobina po sekundarnoj strukturi. Naime, veći deo njihovog polipeptidnog lanca ima oblik β―presavijene površine, a manji deo je u obliku α―heliksa.

Slika 6.33 - Struktura lizozima iz belanceta jajeta, sa označenim položajima četiri disulfidne veze (a), i shema konformacije polipeptidnog lanca (b)

6.3.12 KVATERNERNA STRUKTURA PROTEINA

Pod kvaternernom strukturom se podrazumeva prostorna organizacija oligomernih proteina. Oni se obično sastoje od parnog broja protomera, koji su međusobno povezani silama nekovalentnog tipa.

Prvi oligomerni protein kome je određena kvaternerna struktura je hemoglobin i na njegovom primeru ćemo da objasnimo prostornu organizaciju oligomernih proteina.Hemoglobin A se sastoji od četiri peptidna lanca, dva α i dva β. Ova četiri lanca priležu medusobno tako da grade kompaktnu česticu dužine 64, širine 55 i visine od 50 Å. Helikoidni delovi peptidnih lanaca hemoglobina presavijeni su u obliku dvostruke mašne i priležu oko prostetične grupe.

Slika 6.34 - Prostorna orijentacija α― i β―peptidnog lanca hemoglobina

Protomeri oligomernih proteina vrlo se teško odvajaju i izoluju. Kod nekih mogu da se odvoje kad se protein suspenduje u rastvor koncentrovane ureje, koja kida vodonične veze. Ovo je indirektan dokaz da su u oligomernim proteinima protomeri povezani silama nekovalentnog tipa, kao što su jonske i vodonične veze. Tako je dokazano, da se četiri protomera hemoglobina drže međusobno vezama tipa soli.

Vezivanjem određenih niskomolekulskih jedinjenja (modulatora) za oligomerni protein, razdaljine između njegovih protomera se menjaju. Ova pojava je prvo zapažena kod hemoglobina. Kada se, naime za jedan α―lanac hemoglobina veže kiseonik, tada se njegova razdaljina prema drugom ―lancu smanji. Ovo pomeranje protomera olakšava vezivanje daljnja tri molekula kiseonika za hemoglobin.

Kod oligomernih enzima vezivanje modulatora, i pomeranje protomera, reflektuje se na njihovu aktivnost. Ova pojava im omogućava da mogu da regulišu brzinu niza enzimskih reakcija, odnosno metaboličkih puteva.

Neki oligomerni proteini, kao što je laktatdehidrogenaza, sastoje se iz raznih kombinacija istih protomera. Takvi oligomerni enzimi se nazivaju izoenzimi. Laktatdehidrogenaza se sastoji iz četiri lanca tipa A i B u raznim kombinacijama. U raznim tkivima čovečijeg organizma nađene su sledeće kombinacije: AAAA, BBBB, ABBB, AABB i AAAB. Sve kombinacije odnosno svi izoenzimi laktatdehidrogenaze katalizuju istu reakciju, a razlikuju se u afinitetu prema svom supstratu i imaju osobine da najbolje udovolje potrebi tkiva u kome se nalaze.

6.3.13 DENATURACIJA PROTEINA

Iz opisa različitih nivoa strukturne organizacije proteinskih molekula može se zaključiti da svaki protein ima sebi svojstvenu konformaciju tj. izgled u prostoru. Ona je posebno podešena da odgovara njegovoj biološkoj funkciji. S druge strane, bilo bi pogrešno misliti da je struktura globularnog proteina fiksirana, što bi se moglo zaključiti iz ispitivanja njihovih kristala. Međutim, protein je u rastvoru vrlo pokretan i može da menja svoju strukturu u prilično širokim granicama. On bi mogao da se uporedi sa harmonikom. Narušavanje strukture proteina preko određene granice prouzrokuje gubitak njegove biološke aktivnosti. Da ne bi došlo do toga proteini koji su izoloženi nepovoljnoj sredini imaju u svom molekulu —S—S— veze, koje pojačavaju njihovu čvrstoću. Tako npr. strukturni proteini imaju mnogo S—S — veza; One se nalaze i u proteinima životinjskih ćelija kao npr. u ribonukleazi, dok intracelularni proteini bakterija nemaju —S—S— veza (npr. E.Coli).

Pod denaturacijom proteina se podrazumeva promena konformacije proteina preko određene granice. Denaturaciju proteina prati smanjena rastvorljivost i gubitak biološke aktivnosti. Za protein se kaže da je DENATURISAN.

Neki se proteini denaturišu zagrevanjem njihovog rastvora u slabo kiseloj sredini. Zbog promene rastvorljivosti iz rastvora ispada koagulum, koji se ne rastvara niti u suvišku kiseline niti baze. Koagulacija proteina, usled denaturacije, se bitno razlikuje od taloženja proteina neutralnim solima ili alkoholom na niskoj temperaturi. Na ovaj način istaloženi protein ne gubi svoje biološke osobine i ne menja rastvorljivost.

Do denaturacije proteina može da dođe ne samo povišenjem temperature, već i dejstvom visokog pritiska, raznih zračenja, ekstremnom promenom pH, dejstvom organskih rastvarača i sl. Čak i jako potresivanje proteinskog rastvora tako da nastane pena, može da izazove denaturaciju. Zbog velike osetljivosti proteina i opasnosti da ne dođe do denaturisanja, izolovanje

proteina je komplikovano. Pri tome naročitu pažnju treba obratiti na temperaturu i koncentraciju vodonikovih jona.

Tokom denaturacije ne dolazi do cepanja peptidnih veza. Postoji više načina da se ustanovi da li je došlo do denaturacije kao npr. merenjem viskoziteta, rastvorljivosti, promene difuzionog i sedimentacionog koeficijenta itd. Kod enzima se denaturisanje najlakše ustanovljava, jer oni gube aktivnost. Tako npr. ribonukleaza gubi aktivnost ako se tretira sa koncentrovanim rastvorom ureje ili sa redukcionim sredstvima kao što je merkaptoetanol, koji njene —S—S— veze redukuje u —SH. Ureja, kao što smo ranije rekli, cepa vodonične veze i time narušava sekundarnu i tercijernu strukturu enzima, koja je bitna za njegovu aktivnost. Ako se ureja i merkaptoetanol odstrane dijalizom, mogu da se ponovo uspostave vodonične i —S—S veze i sam enzim da se reaktivira. Ova pojava se naziva reverzibilna denaturacija ili renaturacija. Ona je pokazana na više enzima, kao što su : tripsin, amilaza i lizozim.

Pojava ponovnog aktiviranja globularnih proteina odnosno renaturacija ukazuje da tokom denaturacije ne dolazi do cepanja peptidnih veza. Drugim rečima, primarna struktura proteina se ne menja tokom denaturacije. Zbog toga je i mogućno ponovono reaktiviranje, jer primarna struktura određuje sekundarnu i tercijernu strukturu proteina. Isto tako, renaturacija proteina potvrđuje mišljenje da u zavisnosti od primarne strukture, peptidni lanac zauzima termodinamički najstabilniji oblik i strukturu koja je biološki aktivna.

Daleko češće se dešava da je denaturacija ireverzibilna i da se protein nikad više ne vraća u nativno stanje. Denaturisani proteini lako ispadaju iz rastvora, koagulišu. Peptidne veze denaturisanih proteina mnogo lakše i brže cepaju hidrolitički enzimi jer su pristupačnije usled odmotavanja peptidnog lanca.

Slika 6.35 - Denaturacija i renaturacija globularnog proteina. Pošto se pesptidni lanac odvio — povišenjem temperature ili ekstremnom promenom pH, on se

ponovo formirao u nativni oblik.

6.3.14 ODREĐIVANJE MOLEKULSKE TEŽINE PROTEINA

Proteini imaju veliku molekulsku težinu, koja se kreće u granicama od 20 000— 20 000 000. Molekulska težina ne može da se odredi uobičajenim metodama (merenjem gasne gustine, određivanjem sniženja tačke mržnjenja ili povećanja tačke ključanja) nego samo specijalnim fizičkim metodama.

Slika 6.36 - Odvajanje proteina različite molekulske težine na koloni dekstrana

Švedski hemičar Svedberg je prvi konstruisao i primenio ultracentrifugu za određivanje molekulskih težina proteina. Brzine koje se postižu ultracentrifugom dostižu 60 000 obrtaja u minuti. Centrifugovanjem velikim brzinama talože se proteinske čestice iz koloidnog rastvora. Pomoću vrlo preciznih optičkih instrumenata prate se promene indeksa prelamanja proteinskog rastvora za vreme centrifugovanja. Kada indeks prelamanja pokaže nagli skok, to je znak da se stvorila oštra granica između proteinskih čestica i rastvarača. Veličina indeksa prelamanja na graničnom sloju određuje istovremeno i koncentraciju proteina.Postoji više metoda za odredivanje molekulskih težina proteina sa ultracentrifugom. Najbrža je i najčešće se radi metoda merenja brzine

sedimentacije. Ovom metodom se meri brzina kojom se proteinske čestice kreću u centrifugalnom polju takvog intenziteta, da je proces sedimentacije brži od slobodne difuzije. Sedimentacioni koeficijent je funkcija i molekulske težine proteina, ali i njegovog oblika. Vrednost od 1 x 103 s, naziva se Svedberg―eva jedinica i obeležava sa S.

Gel Fìltracija je vrlo pogodna metoda za određivanje molekulske težine proteina, koja ne zahteva skupu aparaturu. Prema ovoj metodi rastvor proteina se propušta kroz kolonu dekstrana, jedne vrste polisaharida. Dekstran je umrežen tako da obrazuju sito, čije pore imaju određene dimenzije. Prolaženjem kroz kolonu dekstrana, mali molekuli ulaze u čestice dekstrana, a veći prolaze pored njih i izlaze iz kolone.

Poređenjem sa standardima poznate molekulske težine, može se priličnom tačnošću da se odredi molekulska težina nepoznatog proteina.

6.3.15 PROTEINI KAO ELEKTROLITI

Proteini su u vodenom rastvoru dipolarni joni i zbog toga se ponašaju kao slabe kiseline ili baze, zavisno od pH sredine. Krajnja amino― i karboksilna grupa peptidnog lanca neznatno utiče na ovu njihovu osobinu. Električni naboj proteina potiče od slobodnih kiselih, baznih i polarnih bočnih grupa, koje se nalaze na površini molekula. Proteini su zbog toga polivalenti joni. Znak i veličina njihovog električnog naboja zavisi od prirode bočnih grupa i koncentracije vodoničnih jona.

U kiseloj sredini sve slobodne grupe proteina vezuju vodonične jone:a) bazna negativno naleketrisana —COO―+H+→ COOH prelazi u neutralnu karboksilnu grupu, ab) bazna amino―grupa — NH2 + H+→ ― NH3

+

prelazi u pozitivno naelektrisanu grupu. Protein je u kiseloj sredini naelektrisan pozitivno (višak —NH3

+ i ostaci histidina) i ponaša se kao višebazna kiselina. Smanjenjem koncentracije vodoničnih jona, u baznoj sredini, sve slobodne grupe oslobađaju protone:a) neutralna karboksilna grupa —COOH →H+ + —COO― prelazi u nega-tivno nalektrisanu konjugovanu bazu —COO―, ab) pozitivno naelektrisana ―NH+

3 → H―+H—NH2 prelazi u neutralnugrupu —NH2.

Protein je u baznoj sredini naelektrisan negativno (višak —COOˉ) i ponaša se kao slaba polivalentna baza.

Menjajući pH sredine od pH = l do pH=13 naići će se za svaki protein na jednu vrednost pH, kod koje on ima isti broj pozitivnih i negativnih naboja. Ova vrednost pH naziva se izoelektrična tačka proteina (I.T.).

Ona zavisi od broja baznih i kiselih grupa. U donjoj tabeli su date izoelektrične tačke nekih proteina. Ukoliko se neki protein sastoji više od kiselih aminokiselina, utoliko ima nižu izoelektričnu tačku. Obrnuto protein kao što je citohrom c ima izoelektričnu tačku kod velikog pH, jer se sastoji iz više baznih aminokiselina.

Tabela 6.13 - Izoelektrčcne tačke poznatijih proteina

Kod pH nižih od izoelektrične tačke protein je naelektrisan pozitivno, ponaša se kao slaba kiselina, a kod pH višeg od izoelektrične tačke naelektrisan je negativno i ponaša se kao slaba baza. Tako je npr. Serum- albumin, čija je izoelektrična tačka kod pH=4,7, slaba kiselina kod pH = 3,0 a slaba baza kod pH = 6.

Sl. 6.37 - Bočne grupe koje nose naboj u proteinu. Brojevi pored svake grupe označvaju pK područje u kome disosuju.

Proteini imaju puferne osobine, jer mogu da vezuju i otpuštaju protone. Kod fiziološkog pH, pufersku sposobnost pokazuju samo oni proteini koji imaju veći broj histidinskih ostataka jer se područje njegove disocijacije

(pKa) nalazi između pH = 6—7. Na donjoj slici je predstavljena promena naelektrisanja histidinskog ostatka u raznim područjima pH.

Slika 6.38 - Promena naelektrisanja histidinskog ostatka kod različitih koncentracija H jona.

Pošto proteini nose pozitivne i negativne naboje, oni mogu da vezuju jone. Vezivanje katjona Ca2+ i K+ je fiziološki značajno, jer je 30—50% neorganskog Ca2+ vezano u krvi za proteine. Isto tako je veliki deo K+ u eritrocitima vezan za hemoglobin. Neorganski katjoni se, uopšte, vezuju za karboksilatni anjon ili u slučaju fosfoproteina, za ostatke fosforne kiseline. Proteini koji imaju pozitivne naboje mogu da vezuju anjone organskih i neogranskih kiselina. Zbog toga se proteini talože sa pikrinskom, sulfosalicilnom i trihlorsirćetnom kiselinom kod pH, koji se nalazi ispod njihove izoelektrične tačke. Iz istog razloga može da veže i različite boje.

Pored prostog vezivanja anjona i katjona, proteini vrlo često grade helate sa jonima. Na ovaj način vezuju se za protein različiti metali kao sto su Cu, Co, Mg, Zn i dr. To je slučaj kod velikog broja tzv. Metalo- proteina. Na donjoj slici je data shema vezivanja cinka (Zn) u enzimu karboksipeptidazi A. Iz sheme se vidi da se cink, pošto ima koordinativni broj 4, vezuje na četiri mesta, tri za aminokiselinske ostatke peptidnog lanca, a jednom za supstrat.

Slika 6.39 - Vezivanje Zn za karboksipeptidazu A. Cink helira sa glutaminskom kiselinom na položaj 72, histidinom na položaju 69 i lizinom na položaju 196 u

peptidnom lancu

Pored jona, proteini vezuju čitav niz različitih jedinjenja kao sto su: steroidi, ugljovodonici, viši alkoholi i masne kiseline. Mnogi lekovi cirkulišu u krvi vezani za plazma proteine.

6.3.16 ELEKTROFOREZA

Kretanje naelektrisanih čestica u električnom polju prema suprotno naelektrisanoj elektrodi zove se elektroforeza. Proteinske čestice putuju u rastvoru čiji je pH manji od izoelektrične tačke (I.T.) prema katodi, a kad je pH viši od I.T. prema anodi. Tokom elektroforeze proteini ne menjaju ni svoje fizičke ni hemijske osobine, a imajući u vidu veliku osetljivost proteina, to je svakako najveće preimućstvo elektroforeze. Danas je elektroforeza jedna od najboljih metoda za ispitivanje proteina.

Pri elektroforetskim eksperimentima najvažnije je da naboj proteinskih čestica bude konstantan tokom rada. Ta konstrantnost se održava tako da se radi u puferima pogodnog pH, jonske jačine i provodljivosti.

Pokretljivost proteinskih čestica u električnom polju biće utoliko veća ukoliko imaju veći naboj, odnosno ukoliko je veća razlika između njihove izoelektrične tačke i pH sredine u kojoj čestica putuje. Pošto pojedini proteini imaju različite izoelektrične tačke, oni će kod izvesnog pH, koji se ne poklapa s njihovom izoelektričnom tačkom putovati raznim brzinama, jer će imati različite veličine naboja. Na taj način rastavlja se smeša proteina, koji imaju različite izoelektrične tačke. Ako pogledamo u tabeli izoelektrične tačke proteina plazme, videćemo: 1). da će svi u puferu pH 8—9 putovati anodno i 2). da će najbrže putovati albumin, jer je najveća razlika između njegove izoelektrične tačke (4,64) i pH radne sredine (8—9), pa zatim redom 1 i 2―globulini, ―globulini, fibrinogen, a najsporije ―globulini. Elektroforetski možemo, dakle, da rastavimo smešu proteina plazme na šest frakcija.

Slika 6.40 - Elektroferogram proteina plazme

6.3.17 TALOŽENJE PROTEINA

Rastvorljivost globularnih proteina je različita i zavisi od: pH sredine, prisustva soli (jonske jačine), dielektričnih osobina rastvarača i temperature.

Na slici 6.41 je prikazan uticaj pH na rastvorljivost β―laktoglobulina u rastvoru NaCl različite koncentracije. Iz slike se vidi da je rastvorljivost najmanja kod pH 5,2—5,3 koji odgovara izoelektričnoj tački laktoglobulina. Na obe strane kritičnog pH, rastvorljivost naglo raste i kod pH 4,9 i 5,7 dostiže maksimum. Svi globularni proteini su najmanje rastvorljivi u izoeletričnoj tački, jer kod tog pH nemaju naboja.

Slika 6.41 - Uticaj pH i koncentracije soli na rastvorljivost β―laktoglobulina na 25°C. Na svakcj krivi je naznačena koncentracija NaCl

Zbog toga između njihovih čestica nema elektrostatskog odbijanja i one ispadaju iz rastvora (preciptacija). Kod pH nižih i viših od izoelektrične tačke proteini su naelektrisani istoimenim električnim nabojem (pozitivnim ili negativnim), njihove čestice se međusobno odbijaju i ne dolazi do preciptacije. Neki proteini su odsustvu soli potpuno nerastvorni kod pH izoelektrične tačke.

Pošto proteini imaju različite izoelektrične tačke, oni mogu da se odvoje jedan od drugog primenom postupka, koji se naziva »izoelektrična precipitacija«. Kada se, naime, pH rastvora u kome se nalazi smeša proteina dotera na vrednost izoelektrične tačke jednog od njih, taj će da se

istaloži, a ostali će ostati u rastvoru. Ovakav postupak se vrlo često koristi za prečišćavanje i izolovanje proteina iz smeše.

Iz slike 6.41 se vidi da neutralne soli utiču na rastvorljivost globularnih proteina. Smanjenjem jonske jačine povećava se rastvorljivost mnogih proteina. Soli koje imaju dvovalentne jone npr. MgCl2 i MgSO4 povoljnije utiču na rastvaranje proteina nego NaCl, NH4Cl i KCl.

Kada se koncentracija soli poveća, rastvorljivost proteina se smanjuje i kod jedne određene koncentracije, karakteristične za pojedine proteine, dolazi do taloženja. Taloženje proteina neutralnim solima zove se »isoljavanje«. Fizičko―hemijska osnova isoljavanja nije još potpuno objašnjena. Pažljivim isoljavanjem protein se ne denaturiše i može ponova da se rastvori, pošto se neutralne soli odstrane dijalizom.

Od neutralnih soli se za taloženje proteina najviše upotrebljavaju natrijum―sulfat (Na2SO4), amonijum―sulfat [(NH4)2SO4, kuhinjska so (NaCl). Najpogodniji je amonijum―sulfat, jer mu je rastvorljivost u vodi velika (750 g na 1 000 ml).

Svaki protein se taloži kod određene koncentracije soli, pa se i ova činjenica koristi za odvajanje proteina iz smeše. Prva izolovanja pojedinih proteina vršena su taloženjem sa neutralnim solima. Pogodnim menjanjem koncentracije soli i pH sredine mogu se frakciono istaložiti pojedini proteini. Tako se iz krvnog seruma može da odvoji albumin od globulina. Albumin se taloži zasićenjem rastvora amonijum sulfatom, a za taloženje globulina je dovoljna upola manja koncentracija soli tj. poluzasićenje rastvora.

Proteini mogu da se istalože iz rastvora i dodatkom organskih rastvarača, koji se mešaju sa vodom kao što su alkohol i aceton. Organski rastvarači smanjuju dielektričnu konstantu sredine i time i hidrataciju jonskih grupa proteina, što dovodi do njihovog ispadanja iz rastvora. Taloženjem proteina alkoholom na niskoj temperaturi ne dolazi do njihovog denaturisanja. Pošto se svaki protein taloži sa određenom količinom alkohola, može da se postigne frakciono taloženje pojedinih proteina iz smeše. Cohn i sar. su uspeli da izoluju oko 30 proteina iz krvne plazme primenjujući frakciono taloženje alkoholom na niskoj temperaturi i kod različitog pH.

Rastvorljivost proteina raste povišenjem temperature, ali samo u granicama od 0 do 40°C. Daljnim povišenjem, dolazi do promene konformacije proteina i denaturacije.

6.3.18 PLAZMA―PROTEINI

Prvi istraživači na polju proteina delili su globularne proteine prema njihovoj rastvorljivosti na dve velike grupe : albumine i globuline. Prvi se rastvaraju u vodi i talože se potpunim zasićenjem njihovog rastvora amonijum―sulfatom. Druga grupa, globulini, ne rastvaraju se u vodi, već u rastvorima neutralnih soli. Sa današnjeg gledišta ova definicija nije egzaktna, ali se zadržala i nalazi se u mnogim udžbenicima.

Odvajanje proteina krvne plazme isoljavanjem, dobijaju se dve frakcije: albumin i globulini. Elektroforezom se globulini rastavljaju: na alfa1, alfa2, beta i gama globuline. Elektroforetska frakcija albumina je vrlo homogena, dok frakcije 1, 2 i ―globulina sadrže smešu različitih proteina. U ―globulinskoj frakciji se nalaze antitela. Zbog toga i podela plazma proteina prema brzini putovanja u električnom polju, takođe, nije više pogodna. Danas je identifikovano preko 200 proteina u krvnoj plazmi, od kojih je 70 dobijeno u čistom stanju. U najskorijoj budućnosti plazma proteini će se klasifikovati prema njihovoj funkciji.

Serum―albumin ima molekulsku težinu 69 000 i sastoji se od samo jednog peptidnog lanca, koji sadrži 575 aminokiselina. U krvnom serumu ima oko 7% belančevina, od čega preko polovine otpada na albumin (oko 4%). Izoelektrična tačka albumina se nalazi kod pH 4,8. Zbog toga on najbrže putuje, kada se elektroforeza radi kod pH = 8,6. Kod fziološkog pH, serum―albumin ima 18 negativnih naboja. Ovo objašnjava, takođe, njegovu dobru rastvorljivost u vodi (do 40%).

Čestice albumina su simetričnog, elipsoidnog oblika što je vrlo bitno, jer rastvor albumina ima zbog toga mali viskozitet, pa ne opterećuje rad srca.

Pošto u serumu ima najviše albumina, on reguliše osmotski pritisak krvi, Jedna od najvažnijih funkcija serum―albumina je njegova osobina da može da vezuje različite supstance, naročito masne kiseline i prenosi ih s jednog mesta na drugo.

Albumini, iste molekulske težine, nalaze se i u mleku i belancetu jajeta.Tabela 6.14 -Osobine plazma―proteina

Proteinska frakcija

Mol. težina Izoel. tacka Rei. % Sastav i funkcija

Albumin 69 000 4,8 52―62%Reg. osm. pritisak

prenosilac

―Globulini 130 000 5,0 3―5% Gliko i lipoproteidi

prenosioci2―Globulini 200 000 5,0 6—9%

―Giobulini 1300 000 5,12 9―14%Lipoproteidi, protrombin,

aglutinini

―Globulini 150 000 6,8― 7,3 11—17% Antitela

Globulini su vrlo nehomogena grupa u koju spadaju proteini različitih fizičkih, hemijskih i bioloških osobina. Molekulske težine globulina se kreću od 130 000 do 1 300 000. U tabeli su date najvažnije osobine serum globulina. U 1―globulinskoj frakciji se nalazi protein, koji vezuje bilirubin, kao i jedan lipoprotein. U istoj frakciji se javlja i jedan glikoprotein, čija se koncentracija povećava kod tumora.

U 2―globulinskoj frakciji nalaze se drugi glikoproteini i haptoglobini, koji vezuju hemoglobin. ―globulinska frakcija obuhvata ―lipoproteine niske specifične težine (oko 1,04), koji posle centrifugovanja seruma isplivaju na površini. ―Lipoprotein ima molekulsku težinu 1 300 000 i sadrzi 39% holesterolskih estara, 9% slobodnog holesterola, 29% fosfolipida, a samo 23% peptidnih lanca, sa ―globulinskom frakcijom putuje protein, koji prenosi gvožđe (transferin) i onaj koji prenosi bakar (ceruloplazmin). Protrombin, prethodnik trombina, takode se nalazi u ovoj frakciji.

U ―globulinskoj frakciji se nalaze antitela o čijoj je strukturi ranije bilo govora. Najviše je prisutan imunoglobulin IgG, oko tri četvrtine cirkulirajućih. On se vrlo lako vezuje na površini bakterija i neutralizuje njihove toksine, koji imaju antigena svojstva. Pored imunoglobulina IgG, najzastupljeniji su imunoglobulini IgM i IgA. Oni se nalaze u kolostrumu i salivi. Kao što je ranije rečeno, svaka klasa imunoglobulina se razlikuje u primarnoj strukturi.

Fibrinogen se nalazi samo u krvnoj plazmi, koja se izdvaja kada se u krv doda neki antikoagulans (npr. heparin). Njegov molekul je vrlo izduženog oblika. U procesu zgrušavanja krvi, u kome učestvuje veliki broj proteolitičnih enzima i faktora, fibrinogen prelazi u fibrin: trombin

fibrinogen -----------------------► fibrin + fibrinopeptidi A i B proteoliza

6.3.19 KLASIFIKACIJA PROTEINA

Do danas ne postoji jedna opšte prihvaćena klasifikacija proteina. Prema obliku molekula proteini se dele na:

A.— Lančaste ili fibrilarne čiji molekuli imaju izduženi oblik i

B.— Globularne ili steroidne čiji molekuli izgledaju kao elipsoidi.

Fibrilarne belančevine se ne rastvaraju ni u jednom neutralnom rastvaraču, niti u razblaženim kiselinama i bazama. Najpoznatiji predstavnici ove grupe belančevina su : keratini, elastini i kolageni. Keratini se nalaze u epidermi (koža, kosa, nokti, rogovi), kolageni u vezivnom tkivu, koži i kostima, a elastina ima najviše u žutim elastičnim vlaknima vezivnog tkiva.

Kod podele globularnih proteina kao osnova služi njihova različita rastvorljivost u vodi i drugim rastvaračima. Osim toga globularni proteini se dele prema predlogu američkog i engleskog Udruženja Fiziologa od 1911. g. na: Proste i složene ili konjugovane proteine.

Prosti proteini sastoje se isključivo od aminokiselina i razlikuju se po svojoj rastvorljivosti.

U ovu grupu spadaju:

Histoni i protamini, koji su baznog karaktera

Albumini, rastvorljivi u vodi

Globulini, rastvaraju se u rastvorima neutralnih soli

Biljne belančevine: glutelini, gliadini i prolamini.

Složeni proteini sadrže pored aminokiselina i druga jedinjenja ili grupe jedinjenja, koja nazivamo prostetične grupe. Prema karakteru prostetične grupe dele se na:

1. — Fosfoproteine2. — Lipoproteine3. — Glikoproteine4. — Nukleoproteine5. — Hromoproteine i6. — Metaloproteine

6.3.20 PROSTI PROTEINI

Treba naglasiti da su prosti proteini dobijeni izolovanjem. U prirodi su proteini često vezani s nekom prostetičnom grupom.

Histoni su belančevine baznog karaktera, jer sadrže velike količine baznih aminokiselina: arginina, lizina i histidina. Nalaze se uglavnom u jedrima ćelija vezani za nukleinske kiseline. I proteinska komponenta hemoglobina, globin, je jedan histon.

Protamini su takođe baznog karaktera i nalaze se vezani s nukleinskim kiselinama. Izolovani su prvo iz riblje sperme. Za razliku od histona molekulska težina protamina je mala (oko 5 000) i zbog toga ih ubrajamo u peptide.

U albumine ubrajamo sve proteine, koji se rastvaraju u vodi i koji se talože potpunim zasićenjem amonijum―sulfatom. Albumini su potpune belančevine, jer sadrže sve esencijalne aminokisjline. To su vrlo rasprostranjene belančevine, najbolje su ispitani albumini jajeta, mleka (laktalbumin) i krvnog seruma. Karakteristično je da albumini različitog porekla imaju približno istu molekulsku težinu (69 000).

U krvnom serumu, žutoj tečnosti koja se izdvaja kada se krv ugruša, ima oko 7 g% belančevina, a od toga oko 4 g% albumina. Veče količine albumina se i dobijaju iz krvnog seruma, taloženjem s amonijum―sulfatom ili alkoholom.

Globulini su, pored albumina, najrasprostranjeniji proteini. Najbolje su ispitani globulini jajeta, mleka (laktoglobulini) i krvnog seruma.

Većina globulina rastvara se samo u razblaženim rastvorima neutralnih soli, ali postoje i takvi koji se rastvaraju u vodi — pseudoglobulini I i II. Za razliku od albumina, globulini su vrlo nehomogena grupa u koju spadaju proteini različitih fizičkih, hemijskih i bioloških osobina.

6.3.21 SLOŽENI PROTEINI

Fosfoproteini su složene belančevine, koje imaju za prostetičnu grupu ortofosfornu kiselinu, koja je estarski vezana za alkoholne grupe serina.

Tipičan predstavnik fosfoproteina je kazein mleka. Elektroforetski se kazein rastavlja na tri frakcije , i ―kazein. Svi sadrže oko 0,8% fosfora. Razlikuju se po molekulskoj težini, koja se teško određuje, jer vrlo lako grade veće agregate, tako da se dobijaju vrednosti od 24 000 do 400000. Kazeini se razlikuju i po % fosfora.

Kazein je potpuna belančevina, u mleku se nalazi u obliku soli kalcijum―kazeinata. Taloži se kada se mleko zakiseli:

Ca—kazeinat + 2HC1 → kazein + CaCl2

Razni proteolitički enzimi, a naročito labferment, zgrušavaju mleko. Zgrušavanje mleka dejstvom enzima bitno se razlikuje od zgrušavanja izazvanog dodavanjem kiseline, jer dolazi do cepanja molekula kazeina. Dejstvom labfermenta u prisustvu kalcijumovih jona, taloži se kalcijum—parakazeinat:

Ca — kazeinat + labferment → Ca—parakazeinat + peptid

Pored kazeina u mleku se nalazi i laktalbumin i laktoglobulin.Fosfoproteina ima u većoj količini i u žumancetu jajeta. Najpoznatiji je vitelin, koji sadrzi 10% fosfora. U novije vreme se pokazalo da je to lipoprotein, koji se sastoji od fosfatida i proteina nazvanog fosvitin.

Neki regulatorni enzimi kao što su glikogen―fosforilaza i glikogen―sintetaza postoje u fosforilisanom i nefosforilisanom obliku.

Glikoproteini su složeni proteini, čija je prostetična grupa neki šećer. Šećerna komponenta je vezana za neku aminokiselinu peptidnog lanca (obično asparagin, serin ili treonin). Glikoproteini su vrlo viskozne i sluzave supstancije, poznate i pod imenom mukoproteini.

Glikoproteini su vrlo rasprostranjeni u životinjskom organizmu. Nalaze se u svim sekretima (pljuvački, želudačnom soku, sinovijalnoj tečnosti, crevnoj sluzokoži itd.), u hrskavici, pupčanoj vrpci, staklenom telu oka, rožnjači, serumu, eritrocitima (krvne grupe) i vezivnom tkivu.

Glikoproteini su vrlo različitog sastava i osobina. Prema karakteru polisaharida delimo ih na neutralne i kisele. Polisaharid prve grupe je neutralnog karaktera i sastoji se od više jedinica monosaharida ili aminosećera. Polisaharid kiselih glikoproteina je hialuronska kiselina, hondroitin―sumporna kìselina ili se sastoji od više jedinica heksuronskih kiselina. O ovim kiselim polisaharidima (mukopolisaharidima) bilo je govora u poglavlju o ugljenim hidratima.

Lipoproteini su kompleksi proteina s različitim lipidima: fosfolipidima, estrima holesterola, karotinoidima i dr. Lipoproteini koji se nalaze u telesnim tečnostima (serumu, likvoru) su rastvorni. Oni igraju ulogu prenosilaca lipida. Ova grupa se razlikuje prema svojoj specifičnoj težini. Tako postoji grupa ―lipoproteina i grupa ―lipoproteina. O njima je bilo govora kod plazma―proteina.

ćelijska membrana i strukturni elementi ćelije (granule, mitohondrije) izgrađeni su od nerastvornih lipoproteina . Kompleksi proteina s karotinima su obojeni. Takav lipoprotein je vidni purpur.

Nukleoproteini imaju kao prostetičnu grupu nukleinsku kiselinu. Tako je u nukleusu ćelija dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) asocirana s baznim proteinima, histonima i protaminima. Ribosomi se sastoje od ribonukleinske kiseline (RNK) i proteina. Virusi su sličnog hemijskog sastava s tim što se njihova proteinska komponenta sastoji od velikog broja peptidnih lanaca (oko 2 000), koji su kao grozd nanizani oko nukleinske kiseline.

Slika 6.42 - Čestica virusa duvana sa oko 2 200 peptidnih lanaca

Hromoproteini imaju za prostetičnu grupu neki pigment. Najrasprostranjeniji su hemoproteini i flavoproteini. Prvi imaju kao prostetičnu grupu hem, koji je kompleksno jedinjenje gvožđa sa protoporfirinom. O njima će biti opširno govora kasnije.

Flavoproteini sadrže flavin―mononukleotid (FMN) ili flavindinukleotid (FAD) kao prostetičnu grupu. U ovu grupu spada veliki broj enzima, koji katalizuje biološke oksidacije.

Metaloproteini imaju kao prostetičnu grupu neki metal. U ovu grupu spada veliki broj enzima. Tako alkohol―dehidrogenaza ima cink, fosfotransferaze magnezijum, tirozinaza bakar itd.

Rezerve gvožđa se nalaze u jetri vezane za protein »feritin«.

6.4 HROMOPROTEINI

6.4.1 UVOD

Hromoproteini su složene belančevine, čija je prostetična grupa neki pigment (hromos — boja). Najrasprostranjeniji hromoproteini imaju za prostetičnu grupu obojeno kompleksno jedinjenje gvožđa s porfirinom, koje se zove hem.

Hemproteini su fiziološki vrlo aktivni. U ovu grupu spada hemoglobin od koga potiče crvena boja eritrocita i koji prenosi kiseonik iz pluća u tkivo, zatim intracelularni pigmenti (citohromi), koji prenose elektrone tokom

bioloških oksidacija i čitav niz enzima, koji katalizuju oksido-redukcione procese.

Gvožđe u hemu može da bude dvovalentno (fenohem ili samo hem), trovalentno (ferihem ili hemin), a može i reverzibilno da prelazi iz dvovalentnog u trovalentno stanje. Prema valentnosti gvožđa razlikujemo sledeće porfirinoproteine:

A. Gvožđe u dvovalentnom stanju:

Hemoglobini — respiratorni pigmenti vertebrata

Eritrokruorini — odgovarajući respiratorni pigmenti u krvi i tkivnim tečnostima invertrebrata.

Mioglobini — respiratorni pigmenti koji se nalaze u mišićima vertebrata i invertebrata.

B. Gvožđe u prostetičnoj grupi reverzibilno prelazi iz dvovalentnog u trovalentno stanje (Fe+++ = = Fe++ + e) :

4. Citohromi — intracelularni pigmenti, koji se nalaze u ćelijama svih aerobnih organizama. Neki od njih, kao citohrom b i c, sadrže kao prostetičnu grupu hemin (Fe3

+— protoporfirin), a citohrom a (poznat i pod imenom citohrom―oksidaza ili ferment disanja) ima za prostetičnu grupu citohemin.

C. Gvožđe u trovalentnom stanju.: 5. Katalaza i peroksidaze — vrlo rasprostranjene belančevine enzimskog karaktera. Katalaza ubrzava raspadanje vodonik―superoksida na vodu i kiseonik: 2H2O2→ 2H2O + O2. Njena prostetična grupa je hemin u kome je gvožđe trovalentno.

Peroksidaze katalizuju oksidacije sa vodonik―peroksidom kao oksidacionim sredstvom. Biljna peroksidaza ima za prostetičnu grupu hemin, a životinjska zeleni hematin.

Fiziološka aktivnost navedenih hemproteina zavisi od proteinske komponente.

Navedeni hemproteini razlikuju se po specifičnoj strukturi proteinske komponente, koja određuje fiziološku aktivnost, a prostetična grupa je ista (hem ili hemin) ili slične strukture. Zato ćemo prvo da objasnimo hemijski sastav i osobine hema.

6.4.2 PORFIRINI I SRODNA JEDINJENJA

Nobelovac H. Fischer je tokom svog dugogodišnjeg rada (1920—1940) objasnio strukturu hema.

Ferohem ili samo hem je kompleksno jedinjenje gvožđa s protoporfirinom IX, jednim od mnogih derivata kondenzovanog cikličnog jezgra — porfina. Porfinsko jezgro je sastavljeno od četiri pirolova prstena vezana medusobno preko četiri metinske grupe:

Osam vodonikovih atoma, koji se nalaze na četiri pirolova prstena, obeleženi su brojevima od 1 do 8, a vodonikovi atomi metinskih grupa grčkim slovima: , , i . Zamenom vodonikovih atoma na mestima od 1 do 8 raznim organskim radikalima (—CH3, ―C2H5, ―CH = CH2, ―CH2―COOH, —CH2―CH2―COOH), nastaju derivati porfina, koji se zovu porfirini. Izomerija porfirina zavisi kako od broja grupa, koje zamenjuju vodonikove atome, tako i od njihovog položaja. Zamenom vodonikovih atoma sa dve grupe nastaju četiri izomera, sa tri razne grupe — petnaest itd.

Vodonikovi atomi u protoporfirinu IX zamenjeni su sa četiri metil―grupe —CH3 na mestima 1, 3, 5 i 8, sa dve vinilne grupe —CH = CH2, na 2 i 4 i sa dva ostatka propjonske — CH2—CH2—COOH (tačnije karboksietana) kiseline na mestima 6 i 7. Raspored ovih grupa u protoporfirinu IX odgovara jednom od 15 mogućih izomera.

Često se formule porfirina pišu skraćeno, kao na primer, za protoporfirin IX:

U gornjoj formuli Me= ―CH3, V = ―CH = CH2, Pr= ―CH2―CH2―COOH.

U životinjskom organizmu nalaze se različiti izomerni porfirini, koji nastaju ili prilikom sinteze ili razlaganja hemoglobina. Tako se u ljudskom fecesu nalaze koproporfirin I i koproporfirin III; prvi je takođe nađen i u kvascu. U perju nekih ptica (Turaco corythaix) ima uroporfirina III, koji se zajedno s izomernim uroporfirinom i izlučuje u mokraći osoba koje imaju poremećen metabolizam porfirina (porphyria).

6.4.3 OSOBINE PORFIRINA

Porfirini su crveno obojeni pigmenti s karakterističnim apsorpcionim spektrima, zbog velikog broja nezasićenih veza u porfinskom jezgru. Svi

porfirini su obojeni i imaju karakteristični apsorpcioni maksimum na 400 nm, koji se zove »Soret band«. Pored ovog maksimuma, porfirini pokazuju apsorpciju i kod drugih talasnih dužina, koje su karakteristične za svaki porfirin, sto se koristi za njihovu identifikaciju. Porfirini fluoresciraju i vrlo su osetljivi na svetlost.

Najkarakterističnija osobina porfirina je da sa mnogim metalima, kao sto je Fe, Cu, Co, Mn, Mg, daju kompleksna jedinjenja — metaloporfirine. U metalo―porfirinima metalni jon je vezan za azotne atome pirolskih prstenova i nalazi se u centru planarne strukture. Pri sjedinjavanju porfirina s metalima menjaju se njihovi apsorpcioni spektri.

Kompleksno jedinjenje dvovalentnog gvožđa s protoporfirinom IX zove se ferohem ili samo hem.

Hem je planarne strukture i u njemu su samo četiri valence gvožđa vezane za azotove atome pirolovih prstenova. Pošto je koordinativni broj gvožđa šest, to peta i šesta valenca gvožđa leže uspravno na ravan prstena. Jednom od njih se vezuje hem za proteinsku komponentu, obično preko aminokiseline histidina, a na šestoj valenci se nalazi molekul vode ili kiseonika (kod oksihemoglobina).

Slika 6.43 - Vezivanje hema za proteinsku komponentu u hemoglobinu

Oksidacijom ferogvožđa u feri, hem prelazi u ferihem ili hemin. Ferihem gradi hidroksid, koji se zove hematin.

Hem i drugi ferokompleksi porfirina reaguju s različitim azotnim bazama, kao što su: primarni amini, pirimidin, histidin, dajući hemohromogene.

6.4.4 HEMOGLOBIN

Hemoglobin je složena belančevina, koja se sastoji od proteinske komponente globina i prostetične grupe hema. Skraćeno se obeležava sa Hb. Molekulska težina hemoglobina iznosi 67 000. Proteinska komponenta je sastavljena od četiri polipeptidna lanca dva i dva . Svaki od njih sadrži po jednu prostetičnu grupu, hem, tako da u molekulu hemoglobina ima četiri hema.

GLOBIN

Slika 6.44 - Uprošćena formula hemoglobina A

Gvožđe se u hemoglobinu nalazi u obliku dvovalentnog jona Fe++. Jedna koordinativna veza gvožđa u svakom hemu vezana je za globin preko histidina. Pored toga i dve karboksilne grupe propionske kiseline hema vezane su za globin.

Hemoglobini raznih životinja imaju istu prostetičnu grupu (hem), ali je proteinska komponenta, globin, drugog sastava, specifičnog za pojedine vrste. Pored toga i iste vrste životinja sadrže različite hemoglobine. Tako se npr. u krvi odraslog čoveka nalaze dva hemoglobina: adultni hemoglobin (HbA) i hemoglobin A2 (HbA2). Oba se sastoje od četiri polipeptidna lanca i to hemoglobin A od dva i dva , a hemoglobin A2

od dva i dva . Hemoglobin čovečijeg fetusa sadrži fetalni hemoglobin HbF, koji je sastavljen od dva i dva polipeptidna lanca, lanac se sastoji od 141 aminokiseline, a , i od 146. Poslednja tri se razlikuju

što na pojedinim mestima polipeptidnog lanca imaju različite aminokiseline.

Hemoglobini i njihovi derivati imaju karakteristične apsorpcione spektre, tako da mogu lako da se identifikuju. Hemoglobini raznih životinja kristališu u raznim kristalnim oblicima i različito se rastvaraju.

U životinjskom organizmu hemoglobin ima respiratornu funkciju. Ova fiziološki najvažnija osobina hemoglobina osniva se na tome što se hemoglobin jedini s vazdušnim kiseonikom i daje labilno jedinjenje oksihemoglobin. U oksihemoglobinu je molekul kiseonika koordinativno vezan za gvožđe hema, koje ne menja svoju valentnost, već ostaje dvovalentno. Oksihemoglobin je molekulsko jedinjenje hemoglobina s kiseonikom, a ne oksidacioni proizvod hemoglobina. Taj proces se zove oksigenacija. Svaki atom gvožđa vezuje jedan molekul kiseonika, a pošto u hemoglobinu ima četiri hema, reakcija respiracije je sledeća:GLOBIN (FEROHEM)4 + 4O2→ globin (ferohem―O2)4hemoglobin (Hb)

oksihemoglobin (HbO2)

a često se piše i jednostavno, imajući u vidu 1 /4 molekula hemoglobina :

I drugi respiratomi pigmenti — eritrokruorini i mioglobini — grade molekulsko jedinjenje s kiseonikom, pod uslovom da je gvožđe hema dvovalentno.

Oksigenacija hemoglobina, mioglobina i eritrokruorina je reverzibilna reakcija koja ima svoju konstantu ravnoteže. Radi lakšeg razumevanja, uzećemo oksigenaciju mioglobina koji ima jedan atom gvožđa i vezuje jedan molekul kiseonika kada daje oksimioglobin. Reakcija mioglobina s kiseonikom je:

Mb + O2—>MbO2

Konstanta ravnoteže ove reakcije je:K= _(MbO2)_ Mb = mioglobin (Mb) x (O2) MbO2 = oksimioglobin

Koncentracija kiseonika je proporcionalna njegovom parcijalnom pritisku i zato možemo umesto (O2) da pišemo pO2.

a za hemoglobin(HbO2) =K * (pO2) n

(Hb)

Dobili smo da odnos koncentracija oksimioglobina i mioglobina zavisi od parcijalnog pritiska kiseonika. To isto važi i za hemoglobin. Povećavanjem pritiska kiseonika, povećaće se koncentracija oksihemoglobina, a smanjiti koncentracija hemoglobina i obrnuto. Ako u koordinatni sistem nanesemo na ordinatu koncentraciju oksihemoglobina, a na apscisu parcijalne pritiske kiseonika, dobićemo krivu disocijacije oksihemoglobina:

Slika 6.45 - Kriva disocijacija hemoglobina (A) i mioglobina (B)

Iz krive disocijacije vidi se da povećavanjem pritiska kiseonika, što se dešava u plućnim alveolama (pO2 oko 105 mm Hg)*4[4]), 95% hemoglobina se nalazi u obliku oksihemoglobina, a smanjenjem pritiska kiseonika u tkivu, oksihemoglobin se potpuno disosuje u hemoglobin i slobodni kiseonik.

Oksihemoglobin je slaba kiselina, koja povećavanjem koncentracije vodonikovih jona disosuje na hemoglobin i kiseonik. Povećavanje koncentracije CO2 u tkivu, koje prati i povećana koncentracija vodonikovih jona, povoljno utiče, pored smanjenog pO₂, na oslobođenje kiseonika iz oksihemoglobina.

4

Hemoglobini raznih životinja imaju različiti afinitet prema kiseoniku. Hemoglobin ljudi ima veći afinitet od psećeg i kokošijeg.

Hemoglobin, kao i sve belančevine, ima osobine pufera. Pošto u krvi ima najviše hemoglobina (10—14g%), to 60% ukupnog puferskog kapaciteta krvi dolazi na hemoglobin. U tkivu se oslobađa toliko CO2 da bi pH krvi trebalo da se smanji od 7,4 na 4,0 a to se ne dešava. Hemoglobin i oksihemoglobin imaju izoelektrične tačke kod pH 6,8 odnosno 6,65. Kod pH krvi oni se ponašaju kao slabe kiseline, koje reaguju s katjonima dajući soli: KHb i KHbO2. Kada na ove soli dejstvuje ugljena kiselina, oslobađa se hemoglobin, a ugljena kiselina prelazi u bikarbonat:

KHb+H2CO3―> HHb + KHCO3

U krvi se najveći deo CO2 nalazi u obliku bikarbonata i pH krvi ostaje konstantan.

Pored toga što hemoglobin kao pufer sprečava da ne dođe do promene koncentracije vodonikovih jona u krvi, on takođe i jedan deo CO2 vezuje hemijski na globin, dajući karbaminohemoglobin:

HbNH2 + CO2→ HbNH―COOH

Hemoglobin Karbaminohemoglobin

U plućima karbaminohemoglobin dejstvom jače kiseline, oksihemoglobina, oslobađa CO2 i prelazi u hemoglobin.

Kada na hemoglobin dejstvujemo sirćetnom kiselinom i natrijumhloridom, dobija se ferihem―hlorid ili hemin, koji se odvaja u obliku lepih kristala. Ovo je poznata Teichmann―ova. reakcija, koja je dugo vremena služila u sudskoj medicini za identifikaciju krvnih mrlja. Dejstvom KCN ili NaCN na alkalni rastvor hemoglobina dobija se cijanmethemoglobin.

Karboksihemoglobin je molekulsko jedinjenje hemoglobina i ugljenmonoksida. Zove se ugljenmonoksidhemoglobin ili karbonilhemoglobin. Afinitet hemoglobina prema ugljenmonoksidu je 210 puta jači nego prema kiseoniku. Zbog toga povećanje koncentracije ugljenmonoksida u vazduhu od 0,03% deluje smrtonosno za 15 minuta. Ugljenmonoksid je jedan od najjačih krvnih otrova. Karboksihemoglobin disosuje pod uticajem svetlosti. Kao i svi derivati hemoglobina ima karakterističan apsorpcioni spektar, po kome se lako raspoznaje (na 571 i 538 nm).

Methemogiobin je oksidacioni proizvod hemoglobina. Zove se hemiglobin (Hi) ili ferihemoglobin. Dejstvom slabih oksidacionih sredstava, kao K3Fe(CN)6,

dvovalentno gvožđe hemoglobina prelazi u trovalentno i nastaje methemoglobin. Prostetična grupa methemoglobina je feriprotoporfirin IX (ferihem ili hematin). Methemoglobin se potpuno razlikuje od oksihemoglobina, u kojem je molekulski kiseonik labilno vezan za dvovalentno gvožđe. Methemoglobin ne prenosi kiseonik a povećanje njegove koncentracije u krvi preko 2% (methemoglobinemija) je znak bolesti. Dejstvom raznih hemikalija, kao hlorata, nitrita, nitrobenzola, joda, sulfamida i dr., povećava se koncentracija methemoglobina u krvi.

6.4.5 ŽUČNE BOJE

Život eritrocita traje 120 do 130 dana. Posle toga se hemoglobin eritrocita raspada u retikuloendotelnom sistemu (uglavnom u slezini, jetri i koštanoj srži). Proizvodi raspadanja hemoglobina su žučne boje — biliverdin i bilirubin. One se sastoje iz četiri pirolova prstena povezana u lancu.

Raspadanje hemoglobina počinje oksidacijom na položaju porfirina, zbog čega se na tom mestu prsten otvara. Posle toga se odvaja globin i gvožđe i nastaje zelena žučna boja biliverdin. Enzimskom redukcijom biliverdin prelazi u crvenu žučnu boju bilirubin.

Slika 6.46 - Nastajanje žučnih boja (M―metil, V―vinil, P―karboksietil grupa)

U žuči ima najviše bilirubina i to kako slobodnog tako i vezanog za glukuronsku kiselinu. On se nalazi u malim količinama i u krvnom serumu kompleksno vezan za albumin.

Kada žuč uđe u duodenum, enzimi crevne flore redukuju bilirubin u urobilinogen i sterkobilinogen. U ovim jedinjenjima su pirolovi prstenovi povezani — CH2 grupama. Bilinogen jedinjenja su bezbojna, a na vazduhu se oksiduju u obojeni urobilin i sterkobilin, narandžasto crvene pigmente urina i fecesa.

6.4.6 CITOHROMI

Citohromi se nalaze u ćelijama svih aerobnih organizama i to vezani za mitohondrije ili slične strukturne elemente ćelije. Sastoje se iz prostetične grupe i proteinske komponente. Prostetična grupa je metaloporfirinskog karaktera (Fe―protoporofirin, citohemin i dr.). Ona omogućava prenošenje elektrona u lancu disanja pri čemu metal (obično gvožđe) reverzibilno prelazi iz višeg na niži oksidacioni stepen.

Slika 6.47 - Spektri redukovanih citohroma

Citohromi imaju karakteristične apsorpcione spektre, na osnovu kojih su i otkriveni (McMunn 1882). Tako su prva ispitivanja citohroma iz srčanog mišića (Keilin 1925) pokazala, da prema apsorpcionim spektrima, postoje najmanje tri vrste citohroma: a, b i c. Posle toga je u raznom biološkom materijalu (bakterijama, mikroorganizmima, biljkama) otkriveno preko trideset vrsti citohroma, od kojih se samo pet: a, a3, b, c1 i c nalaze u unutrašnjoj membrani mitohondrija. Spektar citohroma potiče od njihove prostetične grupe.

Citohromi a i a3 su razni oblici enzima citohrom―oksidaze (Warburg―ov ferment disanja). Teško se ekstrahuje iz tkiva, jer je čvrsto vezan za strukturne elemente ćelije. Citohrom―oksidaza je protein vrlo komplikovanog sastava. Sastoji se najmanje od 6 proteinskih jedinica. Svaka jedinica sadrži jednu prostetičnu grupu— hemina a(=citohemin) i

jedan atom bakra. Hemin a je zeleno obojeni derivat hema, koji na položaju 2 ima ostatak farnezilalkohola, a na položaju 8 formil grupu.

Citohrom―oksidaza se u lancu disanja nalazi između citohroma c i kiseonika. Od svih poznatih citohroma ona jedino može direktno da redukuje kiseonik predajući mu 4 elektrona:

Vrlo verovatno da elektroni potiču od dva atoma Fe++ i dva atoma Cu+. Citohrom―oksidaza se direktno jedini sa kiseonikom u prisustvu citohroma c. Oksidovana (feri) citohrom―oksidaza se jedini sa CN―

jonima, posle čega ne može da se redukuje i da učestvuje u prenosu elektrona. Zbog toga su CN― joni jako otrovni. Redukovana (fero) citohrom―oksidaza vezuje CO, slično kao hemoglobin.

Citohrom b je vrlo nestabilan i teško se ekstrahuje iz tkiva. Prema apsorpcionom spektru prostetična grupa citohroma b je verovatno protohemin. Autooksidabilan je, ali ne reaguje sa CO niti sa CN― jonima. Posle mnogo godina određeno mu je i mesto u respiratornom lancu.

Citohrom c je najbolje ispitan, jer je dosta stabilan i lako se ekstrahuje. Molekulska težina mu iznosi 12 000.

Dobijen je u kristalnom stanju iz različitog biološkog materijala. Citohrom c je bazni protein, koji se sastoji od jednog peptidnog lanca izgrađenog od 104 aminokiselina i jednog hema. Hem je vezan za peptidni lanac dvojako; koordinativnom vezom gvožđa za ostatak histidina i kovalentno, preko dve vinilne grupe, za ostatke cisteina u peptidnom lancu. Hem je smešten duboko unutar peptidnog lanca, koji ga

opkoljava s obe strane. Zbog toga redukovani (fero) citohrom c ne može da veže ni CO, niti direktno reaguje sa kiseonikom. Isto tako oksidovani (feri) citohrom c ne vezuje CN― jon.

Slika 6.48 - Vezivanje hema preko —SH grupa cisieina u citohromu c

6.4.7 HLOROFIL

U zelenim delovima svih autotrofnih biljaka, nalaze se hlorofilni pigmenti. Oni su neobično važni, jer omogućavaju korišćenje svetlosne energije kod fotosinteze.

Wilstatter i Stoll su 1913 g. izolovali iz lišća hlorofil a i hlorofil b. Hlorofil a je plavozelene boje, a hlorofil b žutozelene. Strukturu hlorofila je objasnio H. Fischer. Hlorofili su kao i hem metaloporfirini, samo mesto gvožđa sadrže kompleksno vezan magnezijum.

Hlorofil A

Hlorofili su materije voštane konsistencije, jer imaju u svom molekulu visokomolekularni alkohol fitol (C20H39OH)). Fitol je estarski vezan za ostatak propionske kiseline na položaju 7 porfirinskog prstena.

Hlorofil b se razlikuje od hlorofila a u tome što na položaju 3 porfirinskog prstena ima aldehidnu (―CHO) grupu namesto metil―grupe.

U hloroplastima je hlorofil vezan za protein, što znači da se u lišću hlorofil nalazi kao prostetična grupa jednog hlorofil―proteina.

6.4.8 FLAVOPROTEINI

Flavoproteini su velika grupa biolški vrlo aktivnih proteina. U ovu grupu spada veliki broj oksidoredukcionih enzima kao što je Warburgov »stari žuti ferment«, oksidaze različitih aminokiselina, čitav niz enzima koji učestvuju u respiratornom lancu, enzimi ciklusa β―oksidacije masnih kiselina i dr.

Flavoproteini su složene belančevine, koje imaju za prostetičnu grupu Flavin―mononukleotid (fmn) ili flavin―adenin―dinukleotid (fad). Neki od njih sadrže pored toga i metal (Mo, Fe ili Cu), to su tzv. metaloflavoproteini (npr. ksantin―oksidaza, dehidrogenaza ćilibarne kiseline i dr.). Poznati su hemoflavoproteini, koji pored flavin―nukleotida sadrže i hem (npr. dehidrogenaza L(+) mlečne kiseline).

Sastavni deo flavin―nukleotida je vitamin B2, nazvan laktoflavin, jer ga ima u mleku, ili riboflavin jer je žuto obojen. Laktoflavin se sastoji iz izoaloksazinskog

prstena, za koji je vezan alkohol D―ribitol. Hemijsko ime mu je 6,7―dimetil―9―N―ribitil―izoaloksazin.

Flavin―mononukleotid (FMN) sadrži ostatak fosforne kiseline, koja je estarski vezana za primarnu alkoholnu grupu ribitola. Iako ne postoji N―glikozidna veza, kao u nukleotidima, zadržao je ime nukleotid, radi sličnosti sa njima.

Većina flavoproteina ima za prostetičnu grupu flavinadenin―dinukleotid (FAD), koji se sastoji iz dva nukleotida: riboflavin―fosfata i adenozin―monofosfata. Oni su međusobno povezani preko fosforne kiseline.

Svi flavoproteini katalizuju oksidacije različitih organskih jedinjenja, oduzimajući im jedan par vodonikovih atoma. Njih preuzima prostetična grupa, koja se pri tome redukuje. Reverzibilno primanje i odpuštanje vodonika dešava se na izoaloksazinskom prstenu laktoflavina, kako je u gornjoj formuli prikazano.

Neki flavoproteini sadrže metal, obično gvožđe, koje nije vezano kao u hemu i koje se zato zove »nehemsko gvožđe«. U ovim mitohondrijalnim flavoproteinima Fe3+ služi kao akceptor elektrona i reverzibilno prelazi u Fe2 +

Flavoenzimi, koji se nalaze u mitohondrijama, ne mogu direktno da reaguju sa kiseonikom. Njihova ponovna oksidacija u respiratornom lancu ide preko ubihinona. U ovu grupu spadaju: dehidrogenaza nikotinamid―dinukleotida (NADH―DH), sukcinat―dehidrogenaza, dehidrogenaza masna kiselina―koenzim A, lipoil―dehidrogenaza i dr. Flavoproteini koji prenose elektrone (ETF) i dehidrogenaze masnih kiselina čine zajedno 80% mitohondrijalnih proteina.

Za razliku od mitohondrijalnih flavoenzima, oni, koji se nalaze u drugim delovima ćelije, mogu direktno da se oksiduju sa O2. Kod toga nastaje vodonik―peroksid. Neki od ovih flavoenzima npr. oksidaza D―aminokiselina i urat―oksidaza se nalaze u organelama, koje se zovu peroksisomi ili mikro―tela.

6.5 METABOLIZAM AZOTA

6.5.1 VARENJE PROTEINA

Najveći deo azotnih jedinjenja koja se unose hranom su u obliku proteina. Zato će biti korisno da ukratko prikažemo njihovo varenje, pre nego što pređemo na metabolizam azota.

Proteini ne mogu da se apsorbuju kroz zidove gastro―intestinalnog trakta, odraslih životinja, sem u retkim i izuzetnim slučajevima. Oni moraju, dakle, da se prvo razgrade u svoje sastavne aminokiseline ili manje peptide. U proteinima su, kao što znamo, aminokiseline povezane peptidnom vezom, čijom se hidrolizom dobija smeša slobodnih aminokiselina. Za hidrolizu peptidne veze su termodinamični uslovi povoljni, jer se slobodna energija smanjuje za oko 15 kJ po vezi. Teorijski bi samo jedan enzim specifičan za peptidnu vezu bio dovoljan za varenje proteina. Hidroliza peptidne veze je u stvarnosti komplikovanija, jer su digestivni enzimi nešto specifičniji, a i osetljivi na veličinu peptidnog lanca, kao i prirodu aminokiselina koje ostvaruju peptidnu vezu (odnosno njihove bočne grupe).

U hrani se nalazi više miliona različitih proteina, ali se mogu svariti usklađenim dejstvom malog broja proteolitičkih enzima (oko dvanaestak). Oni se mogu klasifikovati u dve grupe:

Egzo―peptidaze koje hidrolizuju krajnje peptidne veze i odvajaju jednu po jednu aminokiselinu. To su npr. karboksi―, amino―, di i tri―peptidaze.

Endo―peptidaze obično hidrolizuju peptidne veze unutar lanca, tako da posle njihovog dejstva ostaju manji polipeptidi. U ovu grupu spadaju: pepsin, tripsin, himotripsin, elastin.

U prvu grupu enzima spadaju karboksipeptidaze A i B. One se sintetišu u pankreasu, a luče se u crevo u sastavu pankreasnog soka. Svaki polipeptid ima na jednom kraju lanca (N―završetak) amino―grupu, a na drugom (C―završetak) slobodnu karboksilnu grupu. Karboksipeptidaze A i B deluju samo na C―završetak, sa koga hidrolitički otkidaju aminokiselinu sa slobodnom ―COOH grupom. Posle reakcije ostaje opet slobodna nova ―COOH grupa, pa enzim nastavlja da »gricka« peptidni lanac otkidajući jednu po jednu aminokiselinu.

Trodimenzionalna struktura karboksipeptidaze A je poznata. Njen aktivni centar ima »džep« u koji paše bočni lanac aminokiseline C―završetka. Slobodna karboksilna grupa supstrata smeštena je prema argininskom ostatku enzima tako da je poslednja peptidna veza tako orijentisana da lako podleže hidrolizi. Supstrat i enzim grade kompleks preko atoma Zn u enzimu. Karboksipeptidaza A skida aminokiseline, čiji je bočni lanac aromatičan ili rašljasti alifatičan. Karboksipeptidaza dejstvuje na peptide čije su krajnje aminokiseline lizin ili arginin. Obe karboksipeptidaze se sintetišu u zimogenom obliku, koji aktivira pepsin u crevu.

U crevnom soku, koji luče mnogobrojne žlezde sluzokože tankog creva. nalaze se aminopeptidaze. One deluju na sličan način kao i karboksipeptidaze, samo što otkidaju aminokiseline sa N―završetka peptidnog lanca. Najpoznatiji enzim ove grupe je leucin―aminopeptidaza (3.4.11.1). Kao što se iz imena naslućuje enzim najbrže hidrolizuje peptide koji imaju leucin u N―završetku. Može da hidrolizuje i N―završetke drugih aminokiselina nešto sporije. U crevnom soku se nalaze i tripeptidaze, koje odlepljuju jednu aminokiselinu sa tripeptida, tako da ostaje dipeptid. Na ovaj deluju dipeptidaze crevnog soka, koje ga hidrolitički cepaju na dve aminokiseline.

Egzo―peptidaze bi mogle hidrolitičkim cepanjem sa oba kraja da potpuno svare proteinski molekul. To bi međutim, bio vrlo spori proces. Značaj endo―peptidaze je baš u tome što one ubrzavaju hidrolizu proteina na taj način što dugačke peptidne lance cepaju u male fragmente usled čega se jako povećava broj slobodnih završetaka, koje cepaju egzo―peptidaze. Prvi proteolitički enzim koji u probavi deluje na proteine hrane je pepsin (3.4.23.1) u stomaku. Ova endo―peptidaza je vrlo široke specifičnosti, a najosetljivija na hidrolizu pepsinom je peptidna veza izmedu hidrofobnih aminokiselina, kao što su fenilalanin, tirozin i leucin. Pepsin tako načinje razgradnju proteinskih lanaca do polipeptida različite veličine, zavisno od dužine trajanja njegovog dejstva. Treba reći da pepsin spada u retke enzime, koji imaju pH optimum oko 2,0, dakle, daleko od neutralne tačke. Pošto mukoza želuca luči HC1, to je sadržaj stomaka vrlo povoljan za aktivnost pepsina.

tripsin R1=lizin, arginin

himotripsin; R1 = fenilalanin, triptofan,tirozin;

pepsin R2 = fenilalanin, triptofan, leucin,

asparaginska i glutaminska kis.

Pepsin se luči u obliku neaktivnog zimogena, pepsinogena, koji se početno aktiviše sa HC1, a onda autokatalitički prisutnim pepsinom. Mogućno je da od ovog zimogena nastaje u čoveka više srodnih pepsina i jedan pepsinu sličan enzim gastriksin, čiji je optimalni pH = 3.

Renin (labfement, himozin), enzim koji aktivno učestvuje u koagulaciji mleka, javlja se u stomačnom soku dece, ali ga nema u soku odraslog čoveka. Luči se obilno u četvrtom stomaku teladi, koji se koristi za proizvodnju sirišta. On koaguliše mleko i time usporava prolaz mlečne hrane kroz digestivni trakt. Mlečni kazein dejstvom renina prelazi u parakazein, čija je kalcijumova so nerastvorljiva i odvaja se kao ugrušak. U odsustvu Ca2+ jona ne dolazi do koagulacije.

Hormon gastrin stimuliše izlivanje stomačnog soka, koji sadrži pepsinogen, HC1 i sluz. Sam hormon se oslobađa u krvotok posle dejstva nekih sastojaka u hrani (»sekretagogum«) na mukozu stomaka. Gastrin je polipeptid koji se sastoji od 17 aminokiselinskih ostataka. Postoji u dva oblika: sulfatiranom (koji je aktivniji) i nesulfatiranom. Injicirani histamin, takođe, jako stimuliše sekreciju stomačnog soka.

Polu―varena hrana (himus), kad napusti stomak ulazi u dvanaestopalačno i tanko crevo, gde se meša sa tri sekreta: pankreasnim sokom, crevnim sokom i žuči. Njihov pH je između 7 i 8, jer su bogati bikarbonatom koji neutrališe stomačni HCl u poluvarenoj hrani i pomera joj pH bliže optimumu digestivnih enzima pankreasnog i intestinalnog soka. Ova titracija kiseline izgleda da se reguliše na sledeći način:

kiselina u himusu deluje na mukozu duodenuma i izaziva lučenje hormona sekretina u krvotok,

sekretin se prenosi krvotokom do pankreasa gde stimuliše pojačani tok alkalnog soka. Sekretin nestaje iz krvi posle kratkog vremena.

kada se kiselina neutrališe, lučenje sekretina se smanjuje, pa se time i usporava tok alkalnog soka.

Sekretin je polipeptid, koji se sastoji od 27 aminokiselinskih ostataka. Dobijen je i sintezom. Pankreasni sok koji se oslobađa posle stimulacije izazvane sekretinom, sadrži malo enzima, a mnogo bikarbonata. Stimulacijom drugim hormonom, pankreoziminom, stvara se sok u kome ima dosta enzima.

U sledeću digestiju proteina se uključuju tri važne endo―peptidaze: tripsin (3.4.21.4), himotripsin (3.4.21.1) i elastaza (3.4.21.11). Sva tri se stvaraju u pankreasu u obliku zimogena, luče se u pankreasnom soku i izlivaju u crevo, gde se odigrava njihova aktivacija. Tripsinogen se početno aktivira specifičnim enzimom, enterokinazom, koju luči intestinalna mukoza. Kad se jednom stvori slobodni tripsin, on aktivira još više tripsinogena i proces teče autokatalitički kao prelaženje pepsinogena u pepsin. U toku aktivacije tripsinogena skida se heksapeptid sa N―završetka, koji sakriva aktivni centar tripsina.

Himotripsinogen i proelastaza prelaze u aktivne enzime cepanjem nekih peptidnih veza tripsinom. Navedene tri endo―peptidaze se nadopunjuju međusobno, jer hidrolizuju peptidne veze između različitih aminokiselina. Specifičnost elastaze je veoma široka, mada brže cepa peptidne veze aminokiselina sa kratkim hidrofobnim bočnim lancima, kao što su alanin, glicin i serin. Tripsin je vrlo specifičan za veze karboksilnih grupa arginina i lizina, dok himotripsin uglavnom hidrolizuje peptidne veze karboksilnih grupa aromatičnih aminokiselina triptofana, tirozina i fenilalanina. Posle dejstva ova tri enzima ostaje smeša malih peptida i nešto slobodnih aminokiselina.

Elastaza je dobila ime po tome što razgrađuje elastin. To je protein koji se nalazi u žutom vezivnom tkivu i koji je veoma bogat glicinom i alaninom i zbog toga je dobar supstrat za elastazu. Tripsin i himotripsin uopšte ne deluju na elastin. Struktura ova tri enzima na mnogim mestima pokazuje homologiju sekvence, ima sličan položaj disulfidnih mostova i svi imaju u aktivnom centru ostatak serina. Zbog toga njih inhibira DFP i druga organofosforna jedinjenja. Misli se da su ova tri enzima nastala od nekog zajedničkog pretka― endopeptidaze.

6.5.2 RESORPCIJA (APSORPCIJA)

Proizvodi proteinskog varenja se resorbuju kroz crevni zid i ulaze u portalni krvotok, koji ih nosi u jetru da se metabolizuju. Proteinske L―aminokiseline resorbuju se daleko brže od neproteinskih D―aminokiselina. Da je njihova resorpcija prosta difuzija, one bi se resorbovale istom brzinom. Razlika u brzini resorpcije L― i D―oblika pokazuje da je u to uključen neki selektivni transportni sistem, koji pumpa L―aminokiseline kroz intestinalnu mukozu.

Svi se slažu da intaktni proteinski molekuli prolaze kroz crevni zid u krv vrlo retko i pod specijalnim okolnostima. Antitela, proteinskog porekla, kojih ima u kolostrumu izvesnih životinja, npr. konja, može novorođenče da resorbuje nepromenjena u prvim danima života. Ona mu obezbeđuju pasivni imunitet. Neke osobe su alergične na izvesne sastojke hrane, koji ulaze u krvotok.

Verovatno je da se prolaz makromolekula u cirkulaciju dešava i u respiratornom traktu, kao i u crevu. To je sigurno dokazano za izvesne viruse kao što je virus poliomielitis―a. Retki slučajevi nastajanja antitela samo od nekih od nebrojenog broja proteina je jak dokaz da se intaktni protein vrlo retko direktno resorbuje.

Nedavno je potvrđeno da se mali peptidi resorbuju brže od aminokiselina iz kojih su izgrađeni. To je dokaz da postoje aktivni transportni mehanizmi ne samo za slobodne aminokiseline, već i za manje peptide. Izgleda da se posle varenja u crevu dobijaju pored slobodnih aminokiselina i manji peptidi, koji se resorbuju. Zadnji stepen varenja, odnosno hidroliza malih peptida, odigrava se unutar epitelijalnih ćelija debelog creva. Slobodne aminokiseline napuštaju ove ćelije i ulaze u krvotok.

U vezi sa resorpcijom ostaje još mnogo nerazjašnjenih pitanja, kao što su: relativni odnos količine resorbovanih aminokiselina prema peptidima; ne zna se mesto gde se hidrolizuju manji peptidi, da li na površini ćelija ili intracelularno i kakav je mehanizam njihovog transporta.

6.5.3 METABOLIČKI FOND ILI »POOL« AMINOKISELINA

Smatra se da celokupna količina slobodnih aminokiselina u krvi i drugim telesnim tečnostima obrazuje »zalihu ili fond« (pool). U ovaj fond se aminokiseline neprestano dodaju i iz njega uzimaju, tako da je on prilično na konstantnom nivou. Srednja koncentracija slobodnih aminokiselina u krvi čoveka je oko 50 mg%, odnosno u celoj krvi oko 2,5 g. Stalnim varenjem proteina ulazi u fond oko 70 g. Veličina zalihe se menja u toku dana. Najvažniji putevi snabdevanja i potrošnje fonda aminokiselina dati su na slici 6.49

Slika 6.49 - Procesi koji učestvuju u održavanju fonda aminokiselina

Ispitivanja aminokiselina obeleženih izotopima pokazala su da se proteini neprestano razgrađuju i resintetizuju, tako da njihovi molekuli imaju ograničeno vreme trajanja. Kod toga cela količina ostaje nepromenjena. U odraslih osoba prinos fondu aminokiselina od razgradnje telesnih proteina je u ravnoteži sa potrošnjom za njihovu resintezu. Medutim, ove dve veličine nisu uravnotežene u mladunčeta, koje raste, kao ni kod gravidnih ženki ili u laktacionom periodu. Tako npr. koza proizvode do 300 g

mlečnih proteina dnevno, koje uzima iz fonda aminokiselina. U njemu nema nikad više od nekoliko grama u bilo koje doba.

Aminokiseline se vrlo često koriste za biosinteze drugih sastojaka. One obezbeđuju različite nizove ugljenikovih atoma, prstenaste sisteme i reaktivne grupe. Na slici 6.50 su dati primeri učestvovanja aminokiselina u sintezi nekih biomolekula.

Slika 6.50 - Biomolekuli koji nastaju od aminokiselina

Izlučivanjem u urinu gubi se nešto malo aminokiselina, oko 1,5 g dnevno u čoveka. To je neznatno u odnosu na dnevno unošenje hranom.

Za razliku od masti, koje se mogu odlagati u adipozno tkivo ili ugljenih hidrata koji se čuvaju u obliku glikogena, organizam ne odlaže aminokiseline, ako ih ima više nego što mu je potrebno. Svi proteini se sintetišu za specifične potrebe, a ne kao rezerva za dobijanje aminokiselina. Višak aminokiselina ulazi u energetski metabolizam. a koncentracija aminokiselina u krvi se održava na prilično konstantnom nivou.

6.5.4 METABOLIZAM AMINOKISELINA

Metabolizam aminokiselina je vrlo komplikovan, jer se one međusobno veoma razlikuju, a osim toga mnoge aminokiseline mogu da se metabolišu na više načina. Glavni metabolični put vodi do potpune razgradnje aminokiselina do CO2, vode i amonijaka. Manji deo aminokiselina se uključuje u sporedni put, koji je specijalni za svaku aminokiselinu. Iako male količine aminokiselina se metabolišu ovim sporednim putevima, i njima nastaju korisna i organizmu neophodna jedinjenja.

Prvi stepen u oksidaciji aminokiselina je odvajanje amino―grupe i njena zamena keto―grupom. Taj proces se zove desaminacija. Pošto sve

proteinske aminokiseline (izuzev prolina i oksiprolina) imaju opštu formulu R―CH(NH3+)COO-, one koriste prilično isti način za početnu (primarnu) desaminaciju. Nastale keto―kiseline su različite strukture. Mogu imati ravan niz C―atoma, rašljasti ili aromatične i heterociklične prstenove. Svaka ketokiselina se dalje zato individualno metabolizuje. Razgradnja ketokiselina je često prilično komplikovana. Npr. razgradnja triptofana do acetil―KoA odvija se u 14 reakcija. Prosta i jednostavna je razgradnja ketokiselina, koje nastaju transaminacijom glutaminske i asparaginske kiseline. To su α―ketoglutama i oksalsirćetna kiselina, koje se kao intermedijeri ciklusa trikarbonskih kiselina uključuju u oksidativni metabolizam. Zadatak svih metaboličnih puteva aminokiselina je da se one pretvore u takvo prosto jedinjenje, koje može da uđe u CLK. Razgradnja aminokiselinskih ostataka ide do piruvata, acetil―KoA ili u neki od intermedijera ciklusa (npr. oksalacetata, sukcinil―KoA).

Sudbina dvadesetak proteinskih aminokiselina može se sažeti na sledeći način:

Aspartat i glutamat desaminacijom daju oksalacetat i α―ketoglutarat, intermedijere CLK, koji se uključuju u ciklus.

Metionin, izoleucin i valin pretvaraju se u sukcinil―KoA, koji je takođe intermedijer CLK.

Asparagin prvo gubi amidnu grupu i daje aspartat, koji se, kao što je već rečeno, pretvara u oksalacetat.

Prolin, glutamin, histidin i arginin prvo prelaze u glutamat, pa zatim u α―ketoglutarnu kiselinu.

Na donjoj slici 6.51 je prikazan ulaz različitih aminokiselina u CLK.

Slika 6.51 - Putevi ulaženja aminokiselina u ciklus trikarbonskih kiselina

Na slici 6.51 se vidi da se pet aminokiselina razgrađuju do piruvata, koji posle oksidativne dekarboksilacije u obliku acetil―KoA ulazi u CLK. To su cistein, alanin, glicin, serin i treonin. Fenilalanin, tirozin, leucin, lizin i triptofan se pretvaraju u acetoacetil―KoA, koji pošto pređe u acetil―KoA, ulazi u oksidativnu razgradnju. Aminokiseline koje se pretvaraju u piruvat nazivaju se »glukogene«, a one koje daju acetoacetil―KoA su »ketogene«. Samo od glukogenih može da se sintetiše glukoza.

Na slici 6.51 se vidi da su neke aminokiseline i glukogene i ketogene. Npr. od devet C―atoma tirozina četiri daju acetoacetat, a 3 C―atoma piruvat.

6.5.5 PRETVARANJE AMINOKISELINA U KETOKISELlNE

Dva najvažnija i opšta procesa kojima se postiže pretvaranje aminokiselina u ketokiseline su: oksidativna desaminacija i transaminacija.

a) Oksidativna desaminacija

Najvažniji enzimi koji učestvuju u oksidativnoj desaminaciji su: oksidaza D―aminokiselina (1.4.3.3), oksidaza L―aminokiselina (1.4.3.2) i glutamat―dehidrogenaza (1.4.1.2).

O oksidazi D―amino kiselina je već bilo govora. To je enzim kojiima za prostetičnu grupu FAD, a katalizuje sledeću reakciju:

Prisustvo ovog enzima je prilično misteriozno, jer su njegovi supstrati neproteinske D―aminokiseline. One se vrlo retko javljaju u prirodi, tako npr. se nalaze u ćelijskom zidu nekih bakterija.

Oksidaza D―aminokiselina se nalazi u specijalnim organelama, ćelijskim mikro―telešcima (peroksizomima). Oni sadrže i katalazu, enzim koji razlaže vodonik―peroksid, koji nastaje u toku reakcije oksidaze.

Oksidaza L―aminokiselina katalizuje sličnu reakciju kao oksidaza L―aminokiselina, s tom razlikom što su njeni supstrati proteinske L―aminokiseline. Prostetična grupa ovog enzima je flavin mononukleotid (FMN), a ne FAD. Aktivnost ovog enzima je mala u ćelijama sisara i smatra se da nema značajnu ulogu u metabolizmu aminokiselina. On jedino oksidativno desaminira lizin, na koga ne deluju drugi enzimi, a koji mora prethodno da pređe u ―acetil―derivat.

Glutamat―dehidrogenaza je najvažniji enzim i to ne samo zbog njene uloge u metabolizmu glutamata, već što može da desaminira većinu

aminokiselina, kad se poveže sa procesom transaminacije. Ona katalizuje sledeću reakciju:

Reakcija glutamat―dehidrogenaze je reverzibilna i služi kako za sintezu glutamata, tako i za njegovu oksidativnu desaminaciju. Glutamat je najbolji supstrat za ovaj enzim. Slabija aktivnost može da se dokaže i za neke monokarbonske aminokiseline, kao što je alanin. Enzim ima molekulsku težinu oko 312 000, oligomerne je strukture. I njegove protomerne jedinice se sastoje od šest peptidnih lanaca (M.T. = 52 000). Aktivan je samo oligomerni oblik, koga ADP i izvesne aminokiseline štite da ne pređe u sastavne protomere. Različita jedinjenja kao gvanozin―trifosfat (GTP), NADH i neki steroidni hormoni izazivaju desagregaciju oligomera, što izaziva smanjenje aktivnosti glutamat―dehidrogenaze. Protomeri za razliku od oligomera pokazuju aktivnost alanin―dehidrogenaze. Ove promene u specifičnosti ukazuju da enzim može da postoji u raznim oblicima u zavisnosti od prisustva izvesnih manjih molekula. Glutamat―dehidrogenaza zbog alosterne strukture je regulatorni enzim metabolizma aminokiselina.

b) Transaminacija

U reakcijama transaminacije prenosi se amino―grupa aminokiselina na jednu od sledeće tri ―ketokiseline: piruvat, α―ketoglutarat i oksalacetat. Najmanje 11 proteinskih aminokiselina može da se transaminira: alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, izoelucin, lizin, fenilalanin, triptofan, tirozin i valin.

Transaminacija se može predstaviti sledećom shemom:

Najvažnije transaminaze su alanin―transaminaza (2.6.1.2)—GPT:α―aminokiselina + pirogrožđana ↔ ―ketokiselina+alanin i glutamat―trans―aminaza (2.6.1.1)— GOT:

U reakcijama transaminacije ne dolazi do prave »transaminacije«, jer se ne oslobađa amonijak. Zadatak transaminaza je da sakupe amino―grupe različitih aminokiselina u obliku jedne aminokiseline, obično glutaminske, ređe je to asparaginska i alanin. Alanin―transaminaza (GPT) je specifična za par: piruvat―alanin, aglutamat dehidrogenaza za par glutamat―α―ketoglutarat. U organizmima gde dominira GPT u sakupljanju amino―grupa, ona mora da se prenese na α ―ketoglutarat dejstvom GOT:

Krajnji primalac amino―grupa od većine aminokiselina je ―ketoglutarat.

Povezivanjem transaminacije sa oksidativnom desaminacijom, koju katalizuje glutamat―dehidrogenaza, dolazi do oslobađanja NH4

+.

Transaminaze se nalaze i u citoplazmi i u mitohondrijama. Transaminacije, koje se odigravaju u i citoplazmi povezane su s onima u mitohondrijama. Dokazano je da se amino―grupe sakupljaju u citoplazmi u obliku glutamata. On ulazi u mitohondrije posredstvom specifičnih prenosilaca. U matriksu mitohondrija se nalazi

aspartat―glutamat―transaminaza. Transaminaze imaju analognu ulogu u metabolizmu amino―grupa, kao kinaze u energetskom metabolizmu.

Sve transaminaze izgleda da imaju isti koenzim, piridoksal―fosfat. On igra ključnu ulogu u prenošenju amino―grupa. Kondenzacijom s aminokiselinom koenzim prelazi u Schiff―ovu bazu u kojoj dolazi do premeštanja i posle hidrolize, dejstvom molekula H2O, nastaje ketokiselina (A) i oslobađa se koenzim (slika 6.52).

Slika 6.52 - Uloga pirodoksal―fosfata u transaminaciji. Na slici je označena samo aldehidna grupa koenzima H—C=O

c) Neoksidativna desaminacija

Aminokiseline mogu da izgube amino―grupu ne samo dejstvom transaminaza i dehidrogenaza, već i dejstvom specifičnijih dehidrataza i desulfhidraza. To su enzimi koji otkidaju molekul vode od supstrata, odnosno H2S. Najpoznatiji enzimi ove grupe su: serin i treonin―dehidrataza i cistein―desulfhidraza. Oni katalizuju sledeće reakcije:

Sva tri enzima imaju piridoksal―fosfat kao koenzim. Treonin―dehidrataza je naročito interesantna, jer se njena sinteza može da indukuje i kod viših životinja, npr. kazeinom. Glukoza reprimira sintezu ovog enzima.

6.5.6 SUDBINA AMONIJAKA

Desaminacijom aminokiselina u jetri i drugim organima, a naročito u bubrezima stvaraju se znatne količine amonijaka, u obliku NH4

+ jona. Amonijak je vrlo toksičan i njegova koncentracija u krvi mora da se održava na vrlo niskom nivou (u tragovima). U čoveka iznosi 0,1 do 0,2 mg/100ml. Životinje moraju, dakle, da otklanjaju amonijak istom brzinom, kojom ga i proizvode. Neke ribe izlučuju slobodan amonijak, ali njima stoje na raspolaganju neograničene količine vode u kojoj žive. Kopnene životinje detoksiciraju amonijak na taj način što ga pretvaraju u neko neškodljivo jedinjenje, koje se lako izlučuje. Kod sisara je to ureja (ureotelne), čije izlučivanje zahteva veliku količinu vode. Životinje kao što su ptice, reptili i neke muve koje moraju da čuvaju vodu, izlučuju amonijak u obliku nerastvorne mokraćne kiseline (to su urikotelni organizmi).

Kao što smo već rekli, amonijak nastaje u većini tkiva, a njegova detoksikacija, prelaženje u ureju se odigrava u jetri, u koju dospeva krvotokom. Da ne bi došlo do povećanja koncentracije amonijaka u krvi, on se u tkivu, dejstvom glutamin―sintetaze, prevodi u glutamin:

Glutamin, pored toga, što služi za transport amonijaka, predstavlja i jedinu rezervu azota u organizmu. Od svih aminokiselina u krvi ima najviše slobodnog glutamina (oko četvrtine slobodnog amino―azota u krvi).

U bubregu se neutrališu kiseline urina (sumporna i fosforna iz proteinske hrane), NH4

+ jonima, koji se dobijaju hidrolizom glutamina. Reakciju katalizuje glutaminaza:

glutamin + H2O → glutamat + NH3

Na ovaj način organizam čuva Na+ jone plazme, koji bi se inače potrošili za neutralizaciju kiselina.

Sintezu ureje u jetri su objasnili Krebs i Henseleit 1931 g. Ona se odigrava u ciklusu povezanih reakcija i zato se naziva ciklus ureje. U ciklus ulaze dve amino―grupe, nastale desaminacijom aminokiselina. One zajedno sa molekulom CO2 prevode aminokiselinu ornitin u arginin. Ovaj deo ciklusa odigrava se kod svih životinja koje mogu da sintetišu arginin, ali samo ureotelne životinja sadrže enzim arginazu. Ona katalizuje ireverzibilno hidrolizu arginina u ureju, kod toga se ornitin regeneriše. Male količine ornitina učestvuju u »urea«―ciklusu (1 ornitin: 20 ureje). Danas se smatra da prva amino―grupa koja ulazi u ciklus nastaje oksidativnom desaminacijom glutamata u mitohondrijama:

Nastali slobodni amonijak zajedno sa CO2 prelazi dejstvom karbamil―fosfat sintetaze u karbamil―fosfat:

Enzim sadrži biotin kao prostetičnu grupu, za koju se vezuje CO2 (aktivni CO2,) i tek onda reaguje s amonijakom. Dva molekula ATP―a su potreba za nastajanje jednog molekula karbamil―fosfata. Reakcija je ireverzibilna, a karbamil―fosfat je visokoenergetsko jedinjenje. On prenosi karbamil―grupu na ornitin, dajući citrulin.

Druga amino―grupa ulazi u ciklus u obliku aspartata. On nastaje od glutamata dejstvom aspartat―glutamat―transaminaze:

Amino―grupa apsartata se vezuje na karbonilni C―atom citrulina dajući arginino―sukcinat. Reakciju u prisustvu ATP―a katalizuje argininosukcinat―sintetaza:

Argininosukcinat se reverzibilno razlaže, dejstvom argininosukcinaze, na slobodni arginin i fumarat. Nastali fumarat ulazi u CLK kao intermedijer.

Ovaj niz reakcija koriste ćelije za sintezu arginina. Urotelne životinje imaju arginazu, koja otkida ureju od arginina, dajući ornitin:

Arginin + H2O → ureja + ornitin

Posle ove reakcije počinje ponova sinteza arginina. Ukupna promena u ciklusu ureje je sledeća:

2NH3 + CO2 + 3 ATP + 2H2O → urea +2ADP+2Pi + AMP+PPi G°' = oko ―40kJ

Pošto se nastali pirofosfat hidrolizuje u fosfat, to su za nastajanje jednog mola ureje u stvari potrebne četiri visoko energetske fosfatne veze.

Mnogi enzimi koji snabdevaju ciklus amino―grupama, kao što su glutamat―transaminaza, glutamat―aspartat transaminaza, karbamilfosfat sintetaza, kao i enzimi četiri glavnih reakcija ciklusa, nalaze se u mitohondrijama jetre. Nedavna ispitivanja su pokazala da su enzimi ciklusa prostorno odvojeni, da bi se sprečilo nagomilavanje amonijaka u krvi, koji je vrlo jak otrov, posebno centralnog nervnog sistema.

6.5.7 DEKARBOKSILACIJA AMINOKISELINA

U mnogim tkivima se nalaze enzimi, koji katalizuju dekarboksilacije aminokiselina:

Produkti dekarboksilacije su primarni amini, koji često imaju snažno fiziološko dejstvo. Tako se npr. histidin dekarboksilira u histamin, koji jako stimuliše glatku muskulaturu, širi kapilare, pojačava sekreciju stomačnog soka itd. Drugi primeri su: CO2

glutaminska kiselina-------→ γ―aminobutirat (aktivan u CNS) CO2

5―hidroksi―triptofan --------→ serotonin (vazokonstriktor i sinaptički transmiter)3 :4―dihidroksi―fenilalanin → dopamin (preteča adrenalina)

—CO2

Tirozin ---------→ tiramin (sužava krvne sudove i dovodi do povišenja krvnog pritiska)

Sve ove supstance se posle izvršene akcije, moraju da detoksiciraju. Za njihovu detoksikaciju postoje enzimi, mono― i diamin―oksidaze, koje ih oksiduju u aldehide, npr.

6.5.8 METABOLIZAM NEKIH SPECIFIČNIH AMINOKISELINA

Da bi mogli da objasnimo poreklo nekih azotnih jedinjenja u urinu, potrebno je da detaljno prodiskutujemo metabolizam glicina i serina, cisteina i metionina, fenilalanina i tirozina, a i triptofana.

a) Glicin i serin

Glicin je jedina proteinska aminokiselina koja nema asimetričan C―atom i nije supstrat za oksidaze ni D― niti L― aminokiselina. Za oksidaciju glicina postoji specifična glicin―oksidaza (flavoenzim), koja katalizuje reakciju:

Glioksalat može takođe da nastane i transaminacijom glicina. On se vrlo brzo oksiduje u jetri u formijat i CO2. Formijat se koristi kao izvor C―l čestica (aktivni formijat), za biointezu npr. purinskih i pirimidinskih baza. C—1 ostaci se aktivišu vezivanjem za tetrahidrofolne kiseline (THFA), kojih ima u nekoliko međupromenljivih oblika, odnosno na raznim

oksidacionim nivoima. Svaki oksidacioni oblik prenosi određeni C—1 ostatak: formil —CHO, oksimetil —CH2OH i metil ―CH3.

Dokazano je da glicin i serin prelaze jedan u drugi. Dva C― atoma serina ( i ) vode poreklo od ―C―atoma glicina:

Donor C—1 ostataka odnosno —CH2OH grupe je N5, N10 ―metilen THFA.

Pošto serin ne―oksidativnom desaminacijom , gubi vodu i prelazi u piruvat, to su obe aminokiselina glukogene. One se preko piruvata uključuju u metabolizam ugljenih hidrata.

Pretpostavlja se da biosinteza glicina i serina u jetri ide na sledeći način:

Od serina može da nastane dekarboksilacijom etanolamin, koji metilacijom daje holin. Poznato nam je da su ova dva amina, komponente fosfoglicerida, a acetilholin igra ključnu ulogu u prenosu nervnih impulsa.

Molekul glicina ima dakle mnogostranu ulogu u biosintezi ćelijskih sastojaka i biološki aktivnih jedinjenja. Ranije je, takođe bilo govora da glicin učestvuje u detoksikaciji aromatičnih jedinjenja, npr. benzojeve i nikotinske kiseline.

Od glicina i sukcinata nastaje prostetična grupa hem. Osam C―atoma i četiri N―atoma porfirinskog prstena (debelo ucrtani) potiču od osam molekula glicina.

Životinski organizam može da sintetiše purinske baze, koristeći ugljenikove i azotove atome glicina. C―atomi purinskog prstena na položaju 4 i 5, kao i N―atom na položaju 7 potiču od glicina. Biosinteza ovih jedinjenja je do detalja objašnjena.

Slika 6.53 - Skelet porfirinskog prstena hema

(C― i N―atomi, koji potiču od glicina zadebljani su).

b) Aminokiseline sa sumporom (cistein i metionin)

Cistein je analog serina u kojem je kiseonikov atom alkoholne grupe zamenjen sumporom. Tiolska ―SH (ili sulfhidrilna) grupa je vrlo reaktivna. Dve ―SH grupe se oksiduju u disulfidnu —S—S— grupu; O važnosti —SH grupe za aktivnost mnogih enzima bilo je ranije govora.

Glavni put metabolizma viška cisteina vodi do piruvata i neorganskog sulfata

Slika 6.54 - Oksidacija cisteina

Oksidacioni proizvod cisteina, taurin, nastaje kao sporedni proizvod. On je sastavni deo žučnih kiselina i doprinosi polarnosti ove grupe lipida svojom —SO3H grupom.

Metionin je aminokiselina koja sadrži metil―grupu, koja se koristi za biosintezu mnogih sastojaka. U biološkim metilacijama metil―grupa se prvo energetski obogaćuje sa ATP―om. Aktivni davalac ―CH3 grupa je »aktivni metionin« koji se zove S - adenozilmetionin

Metilna grupa se prenosi (reakcije transmetilacije) na razne akceptore kao što su: gvanidino―sirćetna kiselina, katehol, histamin, fosfatitil―etanolamin itd. Tako trans―metilacijom nastaje od gvanidino―sirćetne kiseline kreatin:

Na sličan način nastaju metilovane purinske baze, N1―metil―nikotinamid, adrenalin.

Metionin može potpuno da snabdeva organizam sumporom. Od njegovog demetilovanog derivata, homocisteina, sintetiše se u organizmu cistein. Homocistein ima jednu —CH2 grupu više nego cistein. Ona ne može direktno da se odstrani da bi nastao cistein. Sinteza cisteina ide tako da se koristi samo atom sumpora homocisteina, koji se prenosi na serin.

Ostatak homocisteina se transaminacijom pretvara u α―ketobuternu kiselinu, koja se kompletno metabolizira. Homocistein služi, takođe, i za regeneraciju metionina. Njegova metilacija ide sa derivatima tetrahidro―folne kiseline.

c) Fenilalanin i tirozin

Fenilalanin je esencijelna aminokiselina, jer životinjski organizam nije u stanju da sintetiše benzolov prsten. Tirozin nastaje iz fenilalanina hidroksilacijom (uvođenjem hidroksilne grupe). On zbog toga nije esencijelna aminokiselina, kada u hrani ima dosta fenilalanina. Tirozin ne može da pređe u fenilalanin, jer je hidroksilacija ireverzibilan proces.

Razgradnja aromatičnog prstena je medicinski vrlo interesantna, jer su u čoveka već odavno poznata nasledna oboljenja, koja nastaju kada je ova razgradnja poremećena. Ona se poznaju po nagomilavanju intermedijera. Zbog genetskog defekta u sintezi enzima dolazi na mestima njihovog dejstva do prekida razgradnje i nagomilavanja intermedijera. Na slici 6.55 je data shema razgradnje aromatičnog prstena, na kojoj su sa A, B, C i D označena mesta, koja mogu da budu genetski defektna.

U nedostatku enzima A dolazi do blokade glavnog puta razgradnje, tako da ona skreće u pravcu nastajanja fenilpiruvata, koji se nagomilava. Ova metabolična greška, poznata kao fenilketonurija, prouzrokuje mentalno zaostajanje bolesnika.

Tirozinoza je vrlo redak genetski defekt, kada se mokraćom izlučuje tirozin i p―hidroksifenil―pirogrožđana kiselina.

Izlučivanje homogentizinske kiseline u mokraći, koja zbog toga stajanjem pocrni, naziva se alkaptonurija. Ona se javlja u nedostatku enzima koji razgrađuju homogentizinsku kiselinu.

Albino životinje ne mogu da sintetišu pigmente melanine, zbog nedostatka enzima na mestu D. Različite oksidaze u prisustvu kiseonika pretvaraju tirozin u reaktivni hinon. On sadrži indolov prsten, koji polimerizuje u pigmente melanine. Pigmenti se sastoje od dugačkog C―lanca, sa velikim brojem konjugovanih dvogubih veza, koje apsorbuju u vidljivom delu spektra i zbog toga su vrlo tamno obojeni

.Slika 6.55 - Šema razgradnje fenilalanina i tirozina sa označenim genetski

:defektnim mestima

d) Triptofan

Triptofan je esencijelna aminokiselina, iz koje bakterije crevne flore sintetišu amid nikotinske kiseline.

6.5.9 POREKLO KREATININA U MOKRAĆI

U mokraći životinja pored veće količine ureje, izlučuje se i dosta kreatinina (u čoveka 1—3 g dnevno). Mokraćni kreatinin je endogenog porekla, odnosno ne potiče iz hrane. Celokupna količina kreatina plus kreatin―fosfata jedne individue održava se na prilično konstantnom nivou, koji je proporcionalan njenoj mišićnoj razvijenosti. Jedan deo ovog kreatina i kreatin―fosfata (oko 20%) se svakog dana pretvara u kreatinin, tako da je njegovo izlučivanje takođe konstantno. Dnevni gubitak kreatina se nadoknađuje sintezom u kojoj učestvuju tri aminokiseline: arginin,

glicin i metionin u obliku S―adenozilmetionina:Slika 6.56 - Biosinteza kreatin―fosfata i nastajanje kreatinina

Ukratko:

Aminokiseline su osnovna strukturna jedinica protina i čine više od 20% suve mase organskih molekula koji se nalaze u ćelijama, tkivima i organima. Enormna strukturna i funkcionalna složenost proteina proizilazi iz različitih kombinacija 20 proteinogenih aminokiselina koje se vezuju u polimere.

Aminokiseline sadrže karboksilnu (COOH) grupu i amino grupu (-NH₂). U organizmu čoveka nalaze se α-aminokiseline, tj. samo one koje imaju –NH₂ grupu vezanu na C atomu uz karboksilnu grupu. Osim glicina, ostale amino kiseline mogu biti u dva izomerna oblika. One aminokiseline čija se amino grupa nalazi levo od α-C atoma, označavaju se kao L-aminokiseline, a one s NH₂ grupom desno kao D-aminokiseline.

Zbog karboksilne i aminogrupe što ih sadrže, aminokiseline su amfoterna jedinjenja, tj. mogu se ponašati i kao kiseline i kao baze.

Prema hemijskoj strukturi aminokiseline se dele na neutralne, kisele i bazne. Neutralne aminokiseline imaju jednu COOH i jednu NH₂ grupu, a ostatak R može biti nepolaran (glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin i fenilalanin) ili polaran (triptofan, tirozin, serin, treonin, cistin, cistein, metionin). Kisele aminokiseline imaju dve COOH grupe. To su asparaginska i glutaminska kiselina. Bazne aminokiseline imaju, osim α-NH₂ grupe, još jednu baznu grupu. Tu spadaju lizin, arginin i histidin.

Prema osobinama bočnih nizova mogu se razlikovati više grupa aminokiselina, koje imaju alifatične, aromatične ili heterociklične bočne nizove, koje sadrže još i SH- i OH-, kao i dodatne NH₂ i COOH grupe. Aminokiseline sa alifatičnim bočnim nizovima su nepolarne ili hidrofobne, a takve su i neke aminokiseline sa aromatičnim R-ostacima. Aminokiseline koje sadrže SH- i OH- grupe su hidrofilne i polarne ali nisu jonizovane. Na kraju postoje i jonizovane, pozitivno i negativno naelektrisane aminokiseline.

Konformaciono važne aminokiseline su glicin i prolin. Glicin nema bočni lanac i može da se prilagođava konformacijama koje su sterno nedostupne za druge aminokiseline. Tako se glicin obično nalazi u regionima uvrtanja lanca gde polipeptidna kičma pravi oštre zaokrete.

Aminokiseline pokazuju sve hemijske reakcije karakteristične za obe funkcionalne grupe, karboksilnu i amino-grupu. Kako aminokiseline sadrže najmanje dve funkcionalne grupe koje mogu da se jonizuju, u neutralnim rastvorima većina aminokiselina se nalazi u obliku dipolarnog ili cviter (zwitter) jona.

Pored -NH₂ i COOH-grupa u sastav nekih aminokiselina ulaze i druge funkcionalne grupe (imidazolova, OH- ili SH-). U ovakvim slučajevima dipolarni joni nastaju ne u neutralnim, već u kiselim ili baznim sredinama. Zato za svaku aminokiselinu postoji određena pH-vrednost na kojoj se ova nalazi u rastvoru u obliku dipolarnog jona. Ova pH-vrednost se naziva izoelektrična tačka (pI).

Najvažnije hemijske osobine aminokiselina su: a) esterifikacija, b) acilovanje, c) dekarboksilacija, d) oksidativna dezaminacija, e) transaminacija, f) stvaranje soli, g) stvaranje peptidne veze.

Neke aminokiseline čovek može sam sintetizovati, a neke mora unositi hranom (esencijalne), a takve su leucin, izoleucin, valin, metionin, treonin, triptofan i fenilalanin, a delimično i arginin, histidin i lizin.

Ključnu ulogu u metabolizmu aminokiselina imaju procesi transaminacije. Delovanjem enzima aminotransferaza (transaminaza) prenosi se aminogrupa na ketokiselinu i pri tome aminokiselina, donor -NH₂ grupe, prelazi u odgovarajuću ketokiselinu, a iz ketokiseline koja je primila -NH₂ nastaje aminokiselina. Kao akceptor aminogrupe obično služi 2-oksoglutarna kiselina. Transaminacija je reverzibilni proces i predstavlja vezu između metabolizma proteina, odnosno metabolizma aminokiselina i metabolizma ugljenih hidrata i lipida.

Dekarboksilacijom koju katalizuju dekarboksilaze s piridoksal-fosfatom kao koenzimom, iz aminokiselina nastaju odgovarajući amini, od kojih su neki (biogeni amini) vrlo važni za organizam.

Oksidativnom deaminacijom nastaju takođe iz aminokiselina ketokiseline, uz oslobađanje amonijaka. Od oslobođenog amonijaka nastaje ureja koja se urinom izlučuje iz organizma. Tokovi metabolizma aminokiselina omogućavaju da one nakon deaminacije mogu: a) oksidacijom preći konačno u CO₂ i H₂O i poslužiti kao izvor energije, b) poslužiti kao izvorni materijal za stvaranje acetsirćetne kiseline, c) poslužiti kao izvorni materijal za stvaranje glukoze, a time i glikogena ili masti, d) preći u druge aminokiseline.

Najvažnija osobina aminokiselina je stvaranje peptidne veze, tj. međusobnog vezivanja aminokiselina tzv. peptidnom vezom između karboksline grupe jedne aminokiseline i aminogrupe druge aminokiseline. Na taj način nastaju peptidi. Ako se peptid sastoji od dve aminokiseline zove se dipetid, od tri tripeptid itd. Peptidi s više od 6 i manje od 50 aminokiselina nazivaju se polipeptidi.

Proteini su osnovni i najvažniji sastojci ćelije. U živim bićima proteini su najbrojnija jedinjenja, najraznovrsnijih struktura i brojnih, najrazličitijih, veoma važnih uloga. Prema sastavu proteine delimo na jednostavne i složene proteine. Jednostavni su izgrađeni samo od aminokiselina, dok složeni, osim svoje proteinske strukture, sadrže i tzv. neproteinsku ili prostetičnu grupu.

Prema prostetičnoj grupi imaju proteidi i svoje nazive, npr. lipoproteini, koji sadrže lipide, glukoproteini koji sadrže ugljene hidrate, hemoproteini koji sadrže hem kao prostetičnu grupu.

Proteini su sastavljeni od aminokiselinskog niza karakterističnog za svaki protein, tj. svaki protein ima određeni redosled ili sekvencu aminokiselina. Prostorni raspored lanca aminokiselina naziva se lančana konformacija. Ranije se govorilo o primarnoj, sekundarnoj i tercijalnoj strukturi. Primarna struktura označavala je sekvencu aminokiselina, sekundarna je označavala raspored lanaca, uvojnica, a tercijalna izgradnju globularnih proteina. Kvatenarnom strukturom označava se agregacija više polipeptidnih lanaca u molekulu proteina.

Proteinski lanci su nabrani i međusobno uvijeni (α-uvojnica, α-heliks), a heliksi su međusobno vezani prvenstveno vodonikovim, ali takođe i kovalentnim vezama, među kojima prevladavaju jonske, elektrostatičke veze između slobodnih grupa (R), te disulfidne veze.

Nabiranjem ili uvijanjem lanaca nastaju razni oblici proteina koji mogu da se podele u: a) fibrilne (ili nitaste) i b) globularne. Fibrilarnu strukturu u kojoj su α-heliksi međusobno isprepleteni poput konopca poseduju nerastvorljivi skleroproteini ( to su keratin iz kose i noktiju, kolagen vezivnog tkiva, elastin iz tetiva, miozin iz mišića i fibrinogen iz krvi). U globularnim proteinima proteinski lanac je prvenstveno vezan disulfidnim vezama i na određeni način zavrnut. Takvi su npr. hemoglobin, mioglobin i lizozom.

Struktura proteina uslovljava i njihova fizičko-hemijska svojstva. Proteini se lako denaturišu, recimo već zagrevanjem na 60 d0 70°C, jer se kidaju -S-S- veze. Raznim fizičkim i hemijskim metodama proteini

se mogu frakcionisati i to: a) frakcionisanje taloženjem sa solima ili rastvorima (temelji se na razlikama u rastvorljivosti pojedinih vrsta proteina u prisustvu jona ili dehidrirajućih rastvora kakvi su natrijum sulfat i sulfit, magnezijum i amonijum sulfat , alkohol ili etar); b) elektroforezom ( temelji se na razlikama u električnom naboju pojedinih proteinskih frakcija); c) hromatografijom ( temelji se na razlikama u veličini, obliku, naboju i rastvorljivosti); d) ultracentrifugiranjem ( temelji se na razlikama u relativnoj molekularnoj masi i obliku molekula proteina).

Proteini su osnovni sastojci živih bića i u njima igraju najraznovrsnije i značajne uloge. Tako su oni strukturne komponente ćelije. Promenu oblika ćelija nekih tkiva obezbeđuju kontraktilni proteini. Proteini na razne načine učestvuju u: a) održavanju homeostaze (od naročitog značaja su transportni proteini); b) odbrani živih sistema od raznih uticaja ( imunoglobulini i faktori koagulacije); c) regulisanju metabolizma ( regulatorni proteini - enzimi, hormoni i receptori - učestvuju u održanju i kontroli svih životnih procesa).

Proteini se unose u organizam hranom, gde ih razgrađuju nekoliko proteolitičkih enzima (proteaze). Želudac je mesto početka razgradnje proteina. Na njih tu deluje pepsin. Razgradnja se nastavlja u tankom crevu delovanjem tripsina i himotripsina, a nastali peptidi razgrađuju se dalje delovanjem karboksipeptidaza, aminopeptidaza i konačno dipeptidaza do aminokiselina. Svaki od navedenih enzima deluje samo na određene peptidne veze. Oslobođene aminokiseline resorbuju se iz intestinalnog trakta i prelaze krvotokom u jetru i ostala tkiva, gde se iz njih sintetizuju specifični peptidi i proteini pojedinih organa i tkiva.

Stvaranje određenog proteina, tj. sekvenca aminokiselina u polipeptidnom lancu određena je genima.

Razgradnja ćelijskih proteina je enzimski proces. U tkivnim ćelijama nalaze se u lizozomima proteolitički enzimi koji razgrađuju proteine do aminokiselina, koje se (zajedno sa aminokiselinama iz hrane koje nisu bile korišćene za biosintezu proteina) metaboliziraju dalje do amonijaka, odnosno ureje koja je konačni proizvod metabolizma proteina.

Regulacija metabolizma proteina je nervna i hormonska. Nadbubrežna žlezda, tiroidna žlezda i estrogeni stimulišu razgradnju mišićnih proteina, pa u jetru dolazi krvotokom više aminokiselina. Tada se u jetri stvara više proteina, čijom razgradnjom nastaje više ureje. To

se isto događa i kod malignih bolesti, kada dolazi do kaheksije. Obrnuto deluju hormon rasta, insulin i androgeni koji stimulišu sintezu proteina u mišićima.

U krvnoj plazmi proteini imaju razne funkcije: a) imaju zaštitnu ulogu od infekcija; b) utiču na koloidno-osmotski pritisak i time raspodelu vode između vaskularnog i međućelijskog prostora (pre svih albumini); c) deluju kao puferi, zbog čega su važni za održavanje acidobazne ravnoteže; d) imaju transportnu funkciju, jer se razni lekovi, neki hormoni, vitamini, oligoelementi i elektroliti u cirkulaciji vežu na pojedine proteine (albumin, transferin i dr.); e) pojedini proteini imaju specifične funkcije, npr. enzimi, hormoni, inhibitori enzima, komplement, faktori koagulacije, hemoglobin itd.

Plazma sadrži albumine, globuline i fibrinogen, dok serum ne sadrži fibrinogen. Ti se proteini sintetizuju u telu iz aminokiselina. Albumin i fibrinogen stvaraju se isključivo u jetri, gde se stvara i manji deo globulina (α- i β-globulini), dok se veći deo globulina (γ-globulini) stvara u plazma-ćelijama i ćelijama RES-a.

Promene koncentacije proteinskih frakcija u raznim bolestima treba posmatrati povezano. Koncentracija ukupnih proteina može biti i normalna, a da koncentracija pojedinih frakcija bude promenjena. Povećanje koncentracije ukupnih proteina (hiperproteinemija) javlja se prilikom dehidratacije, paraproteinemije i mijeloma, a ponekad i kod ciroze jetre, sarkoma, hroničnih upala i autoimunih bolesti (reumatoidni ili eritematozni lupus). Smanjenje koncentracije proteina (hipoproteinemija) javlja se pri prekomernoj hidrataciji, gubitku proteina iz organizma, smanjenoj sintezi proteina ili pojačanom katabolizmu proteina, npr. u hipertireozi ili dijabetesu melitusu.

Posebnu grupu proteina čine hemoproteini. Oni su složeni proteini čija je prostetična grupa porfirinski prsten s inkorporiranim gvožđem. U njih se ubrajaju hemoglobin, koji prenosi kiseonik iz pluća do tkiva, mioglobin, koji se nalazi u mišićima i može takođe vezati kiseonik i tako ga povremeno spremati u mišićima, citohromi i citohrom-oksidaza, enzimi koji kataliziraju vezivanje kiseonika sa vodonikom iz metaboličkih supstrata te enzimi katalaze i peroksidaze.

Sinteza hema započinje reakcijom između sukcinil-koenzima A i glicina. Aktivirana jantarna kiselina (sukcinil CoA) potrebna za ovu sintezu može nastati na više načina: 1) iz ciklusa trikarbonskih kiselina od α-ketoglutarata ili trasaminacijom iz glutamina, 2) iz sukcinata i koenzima A (CoA) uz guanozin-trifosfat i enzim sukcinil-CoA-

sintetazu, 3) iz acetoacetil-CoA i sukcinata delovanjem enzima sukcinil-CoA-transferaza ili 4) iz valina i izoleucina preko propionil-CoA i metil-malonil-CoA. Proteinski deo hemoglobina, globin, sintetiše se u ćelijskim ribozomima i zavisi od sekvence nukleotida hromozomske DNA. Biosinteza hemoglobina, nizom reakcija, odvija se u eritroblastima, ali se taj proces produžava sve do stadijuma retikulocita.

U kliničkim poremećajima biosinteze hema dolazi do porfirija, porfinurije i porfinemije. Porfirije su nasledne bolesti. Razlikuju se dva tipa, eritropoetske i hepatične porfirije. Laboratorijsko ispitivanje poremećaja metabolizma porfirina započinje kvalitativnim testovima na porfirine i porfobilinogen. Ako su nalazi pozitivni analiza se proširuje na kvantitativno određivanje i diferenciranje uroporfirina i koproporfirina, na određivanje porfobilinogena i d-aminolevulinske kiseline.

NUKLEINSKE KISELINE

7.1 UVOD

Nukleoproteini su složene belančevine, koje imaju za prostetičnu grupu neku nukleinsku kiselinu. Proteinska komponenta većine nukleoproteina je baznog karaktera (protamin ili histon), a vezana je za nukleinsku kiselinu vezom tipa soli.

Nukleoproteini čija je prostetična grupa dezoksiribonukleinska kiselina, nalaze se u jedrima svih ćelija životinja, bilja i mikroorganizama. Naročito ih ima mnogo u ćelijama, koje imaju veliko jedro u poređenju sa citoplazmom, na primer: ćelije sperme, timusa, pankreasa, slezine i drugih zlezda. Nukleoproteini, čija je prostetična grupa ribonukleinska kiselina, nalaze se i izvan nukleusa i to delom vezani za strukturu ribozoma, a u citoplazmi ima i slobodnih ribonukleinskih kiselina.

Dejstvom razblaženih kiselina razlažu se nukleoproteini na belančevinu (protamin ili histon) i nukleinsku kiselinu.

Hidrolizom nukleinskih kiselina, bilo dejstvom enzima (polinukleotidaza) ili sa N-rastvorom NaOH, dobijaju se prostija jedinjenja nukleotidi. Slično kao što se belančevine sastoje iz velikog broja aminokiselina, nukleinske kiseline se sastoje iz velikog broja nukleotida odnosno od polinukleotida.

Nukleotidi su, dakle osnovne jedinice iz kojih su sastavljene ribonukleinske (RNK) i dezoksiribonukleinske (DNK) kiseline. Njihov redosled u DNK predstavlja molekulski mehanizam u kome se ostavlja genetska informacija, koja se prenosi i replikuje iz generacije u generaciju jedne vrste i individue. Mononukleotidi imaju i druge uloge u ćeliji (npr. kao koenzimi transferaza) naročito u njenom energetskom metabolizmu i u reakcijama prenosa grupa (koenzimi transferaza).

7.2 HEMIJSKI SASTAV NUKLEOTIDA

Nukleotidi se sastoje od po jednog molekula baze, šećera i fosforne kiseline, koji su međusobno povezani na sledeći način:

Otcepljenjem fosforne kiseline nukleotid prelazi u nukleozid.

U sastav nukleotida ulaze dve pentoze: D-RIBOZA i D-2-DEZOKSIRIBOZA. Obe se nalaze u furanoidnom obliku:

Prema vrsti šećera koji se nalazi u nukleotidima, nukleinske kiseline se dele na:

a. ribonukleinske kiseline, koje sadrže D-ribozu. One se skraćeno obeležavaju RNK,

b. dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) sadrže D-2-dezoksiribozu.

Ova hemijska podela se slaže i sa njihovom različitom biološkom funkcijom. Ribonukleinske kiseline učestvuju u sintezi proteina, a dezoksiribonukleinske kiseline su genetski materijal, bitan za prenošenje naslednih osobina.

Posle blage hidrolize, ribonukleinske kiseline se različito ponašaju od dezoksi-ribonukleinskih kiselina prema redukovanom fuksinu. Dezoksiriboza daje boju s redukovanim fuksinom, a riboza ne daje. Ovo je poznata Feulgen-ova proba na dezoksiribonukleinske kiseline.

U nukleotidima se nalaze pirimidinske i purinske baze. Pirimidinske baze su derivati pirimidina, heterocikličnog jedinjenja sa dva atoma azota u šestočlanom prstenu. Purinske baze su derivati purina, takode heterocikličnog jedinjenja, koje se sastoji od kondenzovanog

pirimidinskog i imidazolovog prstena. Radi lakše orijentacije o prirodi derivata, pojedini atomi u pirimidinskom i purinskom prstenu obeleženi su brojevima.

U nukleotidima se obično nalaze tri pirimidinske baze: uracil (2,4-dioksipiri-midin), timin (5-metiluracil ili 2,4-dioksi-5-metilpirimidin) i citozin (2-oksi-4-amino-pirimidin). One se označavaju velikim slovima: U-uracil, T-timin i C-citozin. Uracila ima uglavnom u ribonukleinskim, a timina u dezoksiribonukleinskim kiselinama.

Pored ovih baza, ređe se nalaze i : 5-metilcitozin i 5-hidroksi-metil citozin.

Najduže poznat derivati purina je mokraćna kiselina, koju je izolovao Schede .1776. god. Nalazi se u mokraći, a ima je u malim količinama i u čovečijoj krvi.

Od purinskih baza u sastav nukleinskih kiselina ulaze samo aminopurini: Adenin (6-aminopurin) i Gvanin (2-amino-6-oksipurin), koji se obeležavaju sa A •odnosno G.

Adenin je izolovao Kossel (1885. god.) iz pankreasa. Nalazi se uglavnom vezan u nukleinskim kiselinama. Slobodan adenin može se naći u nekim biljkama (čaj, šećerna repa i dr.).

Gvanin je izolovan iz »guane« (ekskremenata ptica), odakle mu dolazi i ime. I on se uglavnom nalazi vezan u nukleinskim kiselinama. Slobodan se nalazi u krljuštima riba, reptilija i amfibija, čiji sjaj potiče od kristalnog gvanina.

U nekim nukleotidima se mogu naći i 2-metiladenin i 1-metilgvanin.

Pirimidinski prsten je planarne strukture, a purinski je planaran sa malim ispupčenjima (naborima).

Purinske i pirimidinske baze imaju vrlo slične hemijske osobine. U nukleotidima su derivati pirimidina sekundarni amini, kao i purini, jer imaju na položaju 2, kiseonikov atom. Citozin, uracil i timin su, prema tome ciklični amidi nastali gubljenjem molekula vode i zatvaranjem prstena. Oni su laktamskog karaktera.

Purinske i pirimidinske baze imaju — NH—CO— grupu i reaguju u više tautomernih oblika, koji se nalaze u ravnoteži. U nukleotidima se pojavljuju samo oni tautomerni oblici koji imaju vodonik (NH) na položaju 3, pirimidinskog odnosno na polozaju 9, purinskog prstena.

Kod pH oko 7 preovlađuje uvek »laktam« oblik.

Sve purinske i pirimidinske baze nukleinskih kiselina jako absorbuju ultravioletnu svetlost u području 260—280 nm. Ova njihova osobina se koristi za dokazivanje i kvantitativnu analizu kako slobodnih baza, nukleozida i nukleotida, tako i nukleinskih kiselina.

Tokom metaboličkog razlaganja prelaze amino purini u oksipurine: Hipoksantin (6-oksipurin), ksantin (2,6-dioksipurin) i mokraćnu kiselinu (2,6,8-trioksi-purin).

Kod čoveka i antropoidnih majmuna mokraćna kiselina je krajnji proizvod metabolizma purinskih baza. Kod ostalih sisara razlaganje ide dalje dejstvom enzima urikaze do alantoina.

U kafi, čaju, kakau nalaze se metilovani derivati purina: Kofein (1,3,7-tri metilksantin), Teobromin (3,7-dimetilksantin) i Teofilin (1,3-dimetilksantin).

Nukleozidi. — Pod imenom nukleozid podrazumeva se jedinjenje, koje se sastoji od neke baze i šećera. Nukleozidi spadaju u glikozide, jer nastaju sjedinjavanjem baze i šećera izdvajanjem jednog molekula vode:

Nukleozidi su N-glikozidi u kojima je prvi C-atom šećera β-glikozidno vezan za azotov atom pirimidinskog prstena na položaju 3, a kada nukleozid ima purinsku bazu, onda na položaju 9 purinskog prstena.

U nukleozidima i nukleotidima ugljenikovi atomi šećera obeleženi su brojevima od 1' do 5'.

Imena nukleozida se grade prema imenu baze, koja se nalazi u njihovom molekulu. Pirimidinski derivati imaju nastavak -idin, a purinski -ozin. Evo imena najpoznatijih nukleozida:

Baza Nukleozid Baza Nukleozid

Citozin Citidin Adenin Adenozin

Uracil Uridin Gvanin Gvanozin

Timin Timidin Hipoksantin Inozin

Imena dezoksiribonukleozida imaju prefiks -dezoksi: 2'-dezoksicitidin, 2'-dezoksiuridin itd.

Nukleozidi se bolje rastvaraju u vodi nego same baze. Kao i svi glikozidi oni su relativno stabilni u baznoj sredini i lako se hidrolizuju u prisustvu kiselina, produkti hidrolize su slobodne baze i pentoze. Specifični enzimi (nukleozidaze) ubrzavaju hidrolitičko razlaganje nukleozida.

Pirimidinski i purinski nukleozidi mogu se iz smese, koja se nalazi u hidrolizatu, da razdvoje hromatografskim metodama.

Nukleotidi. — Nukleotidi sadrže pored baze i šećera i fosfornu kiselinu, koja je estarski vezana za jednu od alkoholnih grupa šećera. U ćeliji ima slobodnih nukleotida u znatnim količinama. Oni se dobijaju parcijalnom hidrolizom nukleinskih kiselina dejstvom enzima-nukleaza. Nukleotidi koji sadrže D-ribozu zovu se ribonukleotidi, a oni koji imaju 2-dezoksiribozu nazivaju se dezoksi-ribonukleotidi.

U dezoksiribo-nukleotidima fosforna kiselina može da esterifikuje hidroksilnu grupu na položaju 3' ili 5' dezoksiriboze, a kod ribonukleotida na položaju 2', 3' ili 5' riboze. Međutim, slobodni ćelijski nukleotidi imaju

ostatak fosforne kiseline na položaju 5' i riboze i dezoksiriboze. Poznati su, takođe, i ciklični monofosfatni estri adenozina.

Imena nukleotida grade se na dva načina kako je prikazano u tabeli (7.1)

Tabela 7.1

Baza Ribonukleotid Dezoksiribonukleotid

CitozinCitidin-moncfosfat (CMP)Citidilna kiselina

Dezoksi-citidin monofosfat (d-CMP)

UracilUridin-monofosfat (UMP)Uridilna kiselina

Dezoksi-uridin monofosfat (d-UMP)

TiminTimidin-monofosfat (TMP)Timidilna kiselina

Dezoksi-timidin monofosfat (d-TMP)

AdeninAdenozin-5'-monofosfat(AMP) ili Adenilna kis.

Dezoksi-adenozin-5'-monofosfat (d-AMP)

GuaninGuanozin-5'-monofosfat(GMP)ili Guanilna kis.

Dezoksi-guanozin-5'-monofosfat (d-GMP)

HipoksantinInozin-5'-monofosfat(IMP) ili Inozinska kis.

Dezoksi-inozin-5'-monofosfat (d-IMP)

Slika 7.1 - opšta formula ribonukleotid 5-monofosfata i ciklične adenilne kiseline (C-AMP)

Na donjoj slici je data opšta formula nukleozid 5'-monofosfata i cikličnog adenozin-monofosfata (ciklične adenilne kiseline).

Mononukleotidi su jake kiseline, jer sadrže fosfornu kiselinu, koja daje protone u rastvoru (pK''~ 1,0—6,2). Kod fiziološkog pH slobodni nukleotidi se nalaze u obliku:

R—O—PO32-

gde R predstavlja nukleozidni ostatak.

7.3 NUKLEOZID 5'-DlFOSFATI (NDP) i 5'-TRIFOSFATI (NTP)

Svi poznati ribonukleozidi i 2'-dezoksiribonukleozidi nalaze se slobodni u ćeliji u obliku 5'-difosfata i 5'-trifosfata. Ostaci fosforne kiseline u ovim jedinjenjima se obeležavaju simbolima α, β i γ. Najvažniji su adenozin-difosfat (ADP) i adenozin--trifosfat (ATP). I u ovim jedinjenjima ostaci fosforne kiseline disosuju i daju tri i četiri protona u rastvor. Iz istog razloga oni grade komplekse sa dvovalentnim katjonima Ca2+ i Mg,2+ odnosno nalaze se u obliku MgNTP (npr. MgATP).

Nukleozid 5’-difosfati i trifosfati igraju važnu ulogu u intermedijernom metabolizmu. Naročito je važan sistem ATP-ADP, kao jedini prenosilac hemijske energije. U njima je drugi i treći ostatak fosforne kiseline vezan visoko energetskiom vezom. O ovim jedinjenjima biće kasnije govora. Visokoenergetske veze obeležavaju se znakom ~. Prelaz ATP-a u ADP je reverzibilan.

Mnogi nukleozid difosfati i trifosfati igraju ulogu koenzima u reakcijama gde se prenose pojedine grupe i celi molekuli sa jednog jedinjenja na drugo. Tako uridin-trifosfat aktiviše molekule glukoze, koja u obliku uridin-difosfat-glukoze prenosi kod sinteze glikogena.

Slično je citidin-difosfat holin prenosilac holina u biosintezi lecitina.

Pored pirimidinskih i purinskih nukleotida poznati su i takvi, koji sadrže kao bazu jedan od vitamina B grupe. Tako nikotinamid mononukleotid ima za bazu amid nikotinske kiseline (vitamin-PP); flavin-mononukleotid ima za bazu vitamin B2. Svi koenzimi su nukleotidnog karaktera i o njima će biti opširno govora u poglavlju o koenzimima.

Ne treba da se zaboravi da su NTP polazni materijal za sintezu ribo- i dezok-siribo-nukleinskih kiselina (RNK i DNK). U toku sinteze nukleozid 5'-trifosfati gube pirofosfatnu grupu (krajnje dve fosforne kiseline) i u obliku nukleozid 5'-mono-fosfata ugrađuju se u lanac RNK i DNK.

7.4 BIOLOŠKA SINTEZA NUKLEOTIDA

Purinske i pirimidinske baze i odgovarajući nukleotidi nastaju u organizmu od prostih jedinjenja.

Ispitivanjem sa jedinjenjima obeleženim radioaktivnim elementima (C14 i N15) ustanovljeno je, da pojedini atomi u purinskom prstenu potiču od: glicina, aktivne mravlje kiseline, asparaginske kiseline, glutamina i ugljendioksida.

Slika 7.2 - Poreklo pojedinih atoma u purinskom prstenu

Sinteza purinskih nukleotida polazi od riboze-5'-fosfata na koji se postepeno nadograđuje purinski prsten. Energija za ovu sintezu dobija se od adenozintrifosfata. Prvi proizvod sinteze je inozinska kiselina, koja se nalazi slobodna u mišićima. Od nje nastaju i adenozin-5'-fosfat i guanozin-5'-fosfat.

Nastajanje adenilne i guanilne kiseline od inozinske kiseline

Pirimidinske baze nastaju od asparaginske kiseline i karbamil-fosfata. Jedan od najvažnijih proizvoda ove sinteze je orotska kiselina. Vezivanjem orotske kiseline sa ribozilpirofosfatom nastaje njen nukleotid, koji dekarboksilacijom prelazi u uridin-5'-fosfat. Svi ostali pirimidinski nukleotidi nastaju od uridin-5'-trifosfata.

7.5 STRUKTURA DEZOKSIRIBONUKLEINSKIH KISELINA

Dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) sastoje se od velikog broja mononukleotida povezanih u obliku dugačkog lanca. Pojedini nukleotidi u lancu DNK spojeni su preko fosforne kiseline. Fosforna kiselina jednog nukleotida estarski je vezàna sa 3'-alkoholnom grupom dezoksiriboze drugog nukleotida.

Molekulska težina polinukleotidnih lanaca u dezoksiribonukleinskim kiselinama dostiže vrednost od preko 100 miliona.

Dezoksiribonukleinske kiseline sadrže od purinskih baza: adenin i gvanin, od pirimidinskih citozin i timin. Prisustvo timina je karakteristično za DNK, a uracila za RNK (ribonukleinske kiseline).Analizom DNK različitog porekla nađeno je da one sadrže jednake količine purinskih i pirimidinskih baza. Koliko ima adenina, toliko ima i timina, a gvanina imaju koliko i citozina.

SADRŽAJ BAZA U DNK RAZLIČITOG POREKLA

Adenina Gvanina Citozina Timina

sadržaj u %

DNK iz čovečije jetre 30,3 19,5 19,9 30,3

DNK iz žita 27,3 22,7 22,8 27,1

DNK iz Sarcina lutea13,4

37,1 37,117,4

Dezoksiribonukleinske kiseline životinjskog porekla sadrže više adenina i timina nego guanina i citozina, dok je kod bakterija odnos obrnut.

Pojedine dezoksiribonukleinske kiseline razlikuju se po sadržaju baza i njihovom redosledu. Do danas nisu pronađene metode koje bi omogućile da se odredi redosled (sekvenca) baza u DNK i zbog toga se danas ne zna mnogo o njihovoj primarnoj strukturi. Sigurno je, međutim, da redosled baza u dezoksiribonukleinskim kiselinama (primarna struktura) određuje koja se genetska informacija prenosi.

Slika 7.3 - Dezoksiribonukleinska kiselina (deo lanca)

Molekulska težina DNK je vrlo velika i iznosi preko 100 miliona. Tako velike čestice tj. molekuli mogu se videti pod elektronskim mikroskopom kao dugačke niti. Građene su u obliku dvostrukih spirala. Spirale DNK su međusobno povezane vodoničnim vezama, koje nastaju između baza jedne i druge spirale.

Adenin iz jedne spirale gradi vodoničnu vezu sa timinom druge i obrnuto. Isto tako gvanin i citozin povezuju dve spirale preko svojih vodoničnih veza. Znači da svakom adeninu jedne spirale odgovara timin u drugoj, a svakom gvaninu citozin. Ovo objašnjava zašto DNK sadrže iste količine adenina i timina, a gvanina koliko i citozina.

Slika 7.4 - Sparivanje baza (timin-adenin i citozin-gvanin) vodoničnim vezama

Zbog sparivanja baza preko vodoničnih veza svaka spirala je kopija druge, odnosno redosled baza jedne spirale je komplementaran redosledu druge. Na primer neka bude redosled:

I spirale A–G–T–G–A–A–G–T–C–G–G–C onda je redosled u II spirali: T–C–A–C–T–T–C–A–G–C–C–G (A-adenin; T-timin, G-gvanin- i C-citozin)

Na slici 7.5 je šematski predstavljena dvostruka spirala DNK — dezoksiribonukleinske kisline. Baze jednog lanca su šrafirane, a drugog ne, ostatak D-dezoksiriboze je predstavljen znakom š, a ostatak fosforne kiseline tačkom. Iz lanca obe spirale vire baze, koje se međusobno povezuju vodoničnim vezama i tako daju kompaktnost molekula DNK.

Slika 7.5 - Dvostruka spirala DNK po Watson-u i Crick-u, 5-D-dezoksiriboza, P-ostatak fosforne

Prvu sintezu DNK »in vitro« uspeo je da izvede Kornberg 1956 godine iz dezoksiribonukleotid-trifosfata (dATP, dGTP, dTTP i dCTP) pod dejstvom enzima DNK— polimeraze, koji je izolovao iz ekstrakta Escherichia coli. Za sintezu DNK je bilo takođe potrebno prisustvo »starter« (polazne) DNK, koja je služila kao model (matrica) novonastaloj DNK. Redosled baza u novonastaloj DNK bio je komplemen-taran početnoj DNK. Naime, tamo gde je u lancu polazne bio adenin u novoj je bio timin i obrnuto. Isto tako tamo gde je bio gvanin u polaznoj, u novoj je bio citozin i obrnuto. Ovu sintezu možemo da predstavimo hemijski:

enzim → Komplementarna DNK+4 n pirofosfata

Poznato je da je najvažnija karakteristika naslednih faktora ili gena identično udvajanje. Zbog te njihove sposobnosti prenose se kroz hiljade generacija karakteristične osobine jedne vrste. Pošto je svaki gen izgrađan od samo njemu specifične DNK ili je segment molekula DNK specifične strukture, to je posle Kornberg-ovog otkrića i na osnovu Watson-Crick-ovog modela molekula DNK identično udvajanje gena dobilo svoje biohemijsko objašnjenje.

Prilikom identičnog udvajanja (tj. pre deobe ćelije) dolazi do odvijanja spirale DNK »majke« i dva lanca se odvajaju. U ćeliji se nalaze slobodni dezoksi-nukleotidtrifosfati, čija se količina dvostruko povećava pre mitoze ćelije. Dejstvom enzima polimeraza dolazi do sparivanja slobodnih nukleotida sa nukleotidima odvijenih lanaca DNK »majke«. Pošto se adenin sparuje sa timinom, a citozin sa gvaninom, svaki odvojeni lanac DNK »majke« dobija novi lanac, koji ima isti redosled baza kao što je bio u lancu od koga se odvojio. Na taj način nastaju od jednog molekula DNK dva nova potpuno identična molekula DNK.

Slično kao što se proteini denaturišu zagrevanjem i DNK su osetljive na povišenje temperature. Zagrevanjem DNK u rastvoru soli na 70°—80° dolazi do cepanja vodoničnih veza između spirala i one se odvajaju. Pri zagrevanju se menjaju i fizičke osobine DNK, smanjuje se viskozitet, menja ugao skretanja polarizovane ravni i dr.

Interesantno je spomenuti da se pažljivim hlađenjem takvog rastvora DNK može postići, da te dva odvojena lanca ponovo spiralizuju.

7.6 RIBONUKLEINSKE KISELINE I SINTEZA PROTEINA

Ribonukleinske kiseline (RNK) su po svojoj strukturi vrlo slične DNK. Sastoje se od velikog broja nukleotida koji sadrže D-ribozu, fosfornu kiselinu i jednu bazu: adenin, gvanin, citozin ili uracil. U RNK se nikada ne nalazi timin. Izgled njihovih molekula nije tako dobro ispitan kao molekula DNK, tako da se ne može sa sigurnošću reći da se sastoje od dvostruko spiralizovanih lanaca nukleotida.

RNK učestvuju u sintezi proteina. Ima ih vrlo mnogo u ćelijama u kojima se vrši sinteza proteina, kao što su ćelije koštane srži, jetre, pankreasa i dr.

Prema biološkoj funkciji poznate su tri vrste RNK: ribozomske (r-RNK) i informacione (m-RNK), koje imaju veliku molekulsku težinu i niskomolekularne, transferne ili prenosilačke, ribonukleinske kiseline (t-RNK).

Ribozomske r-RNK, kao što im samo ime kaže, nalaze se u ribozomima. To su submikroskopske čestice ergastoplazme, koje se sastoje najvećim delom od r-RNK, proteina i male količine niskomolekulskih jedinjenja. Molekulska težina normalnih ribozoma iznosi oko 3 miliona. Oni pod određenim uslovima (različite koncentracije Mg++ jona) reverzibilno prelaze u čestice molekulske težine 550 000 i čestice M.T. = 1 100 000, koje se mogu izolovati na ultracentrifugi kao 30 S odnos-no 50 S čestice.

Informacione (»messenger« = glasnik) m-RNK imaju molekulsku težinu od 100 000 do 1 miliona. Nalaze se u jedru (nukleusu) i u citoplazmi labilno vzane za ribozome. Redosled baza u m-RNK je kopija odgovarajućih gena ili segmenat molekula DNK specifične strukture. One se sintetišu u jedru na taj način što se dvostruka spirla jedne od DNK odvije na mestu, koje odgovara genu. Slobodni nukleotidi, kojih ima u jedru, se po principu sparivanja baza vezuju na odvijenoj spirali DNK. Na taj način nastaje RNK čiji je redosled baza komplementaran redosledu baza na tom mestu DNK.

Slika 7.6 - Shematski predstavljeno udvajanje (replikacija) DNK na odvijenim lancima DNK »majke« (P-ostatak fosforile kiseline D-dezoksiriboze, A-adenin,

T-timin. G-gvanin i C-citozin).

Nastala m-RNK odlazi iz jedra u citoplazmu, gde služi kao radna kopija za sintezu proteina. U poslednjih dvadesetak godina je eksperimentalno dokazano da redosled baza u m-RNK određuje koje će se aminokiseline međusobno povezati.

Slika 7.7 - Deo molekula ribonukleinskek kiseline

Slika 7.8 - Odvijanje spirale DNK i nastajanje mesta (engl. »pufì«) prema kojem se sintetišu m-RNK (Weiss i Hurwitz 1960).

i po kom redosledu. drugim rečima, m-RNK diriguje sintezu proteina. Tako su Nierenberg, Matthaei, i Ochoa prvi uspeli da in vitro sintetišu proste RNK, koje su se sastojale od desetak istih nukleotida. Jedna tako sintetizovana RNK sadržavala je 12 molekula uridin-monofosfata (uracil-riboza-fosforna kiselina: U—R—P). Njena uprošćena napisana formula je:

151

Stavljajući ovu RNK u smešu aminokiselina i u prisustvu odgovarajućih enzima, dokazali su da je posle izvesnog vremena nastao sledeći tetrapeptid: fenilalanil-fenilanil-fenilalanil-fenilalanin. Na ovaj način su pokazali da triplet baza: uracil-uracil-uracil u m-RNK diriguje ugrađivanje aminokiseline fenilalanina u peptidni lanac. Sličnim ispitivanjima su otkriveni tripleti baza i drugih aminokiselina, koji su izneti u sledećoj tabeli.

U tabeli znači: U-uracil, C-citozin. A-adenin. G-gvanin.

Iz donje tabele proizlazi da pojedinim aminokiselinama odgovara po nekoliko tripleta baza.

Svaki redosled od po tri baze u m-RNK određuje kojim će se redom ugrađivati određene aminokiseline u proteinima. Tripleti baza u m-RNK se nazivaju »code« (»sifre«).

»POZNATE ŠIFRE« (tripleti baza) u m-RNK

Ova istraživanja su objasnila na koji način živi organizmi sintetišu proteine uvek istog sastava. Svaka m-RNK diriguje sintezu njoj odgovarajućeg proteina. Pošto su m-RNK kopije gena, to je sinteza proteina genetski dirigovana.

Isto tako su i svi hemijski procesi u živoj materiji genetski dirigovani, jer teku pod dejstvom bioloških katalizatora-enzima, koji su proteinskog

karaktera. Povezanost između DNK i RNK u sintezi proteina prikazana je na sl. 7.9.

Siika 7.9 - Odnos između DNK, RNK i sinteze proteina

Prenosilačke (transferne) ribonukleinske kiseline (t-RNK) se nalaze rastvorene u citoplazmi. Njihova molekulska težina je relativno mala i kreće se od 20.000 do 30 000. Kao što im samo ime kaže one prenose aminokiseline do m-RNK, gradeći s njima intermedijerna jedinjenja. Prenošenje aminokiselina se odvija u više stepena.

Kao i kod svih sinteza, koje se odigravaju u živoj materiji, tako i kod sinteze proteina, aminokiseline se prvo obogaćuju energijom ili kako se to obično kaže dovode se na viši energetski nivo. To je način da se hemijski aktivišu i postanu reaktivne. Slobodne aminokiseline, koje se nalaze u citoplazmi, postaju aktivne vezivanjem za aktivirajući enzim. Energiju za ovu aktivaciju daje adenozin-trifosfat (ATP), koji takođe učestvuje u reakciji:

1. Aminokiselina+ATP+enzim→aminokiselina–adenilat–enzim+pirofosfat.

Tako nastali aktivni kompleks aminokiselina-adenilat-enzim reaguje sa odgo-varajućom t-RNK, pri čemu aminokiselina prelazi na t-RNK.

2. Aminokiselina–adenilat–enzim+t-RNK→aminokiselina–t-RNK+AMP+ enzim.

Za svaku aminokiselinu postoji njoj specifičan aktivirajući enzim, koji katali-zuje obe reakcije: aktivaciju i vezivanje aminokiseline za t-RNK. Isto tako svakoj aminokiselini odgovara bar jedna t-RNK, koja sadrži triplet baza komplementaran tripletu za tu aminokiselinu na m-RNK. Na primer: t-RNK koja prenosi aminokiselinu fenilalanin sadrži triplet adenin-adenin-adenin. Jedino takav triplet može da se spari sa »code« (šifrom) za tu aminokiselinu na m-RNK, koja glasi uracil-uracil-uracil.

Sinteza proteina iz kompleksa aminokiselina-t-RNK odvija se na polizomima (=ergozomi). To su agregati od tri do deset ribozoma vezanih za lančasti molekul m-RNK. Prenošenje kompleksa aminokiselina-t-RNK na ribozome katalizuju tzv. prenosni enzimi, koji se nalaze u citoplazmi. Energiju za prenošenje daje gvanozin-trifosfat (GTP) tako da se za prenošenje svakog ekvivalenta aminokiseline troši ekvivalenat gvanozin-trifosfata.

Mada mnoge činjenice o toku sinteze proteina nisu objašnjene kao npr. počinjanje i završavanje peptidnog lanca, zatim da jedna ista m-RNK može da služi kao matrica vise peptidnih lanaca itd. osnovne konture sinteze su eksperimentalno dokazane. Na molekul m-RNK vezuju se ribozomi, koji se sastoje od čestica veličine 50S i 30S. Na veću česticu se vezuje kompleks amino kiseline-t-RNK sa kojom počinje peptidni lanac. Na manju ribozomalnu česticu se vezuje kompleks sledeće aminokiseline peptidnog lanca. Ona prelazi na veću ribozomalnu česticu (50 S), pri čemu nastaje peptidna veza sa prvom amino kiselinom, a njena t-RNK se oslobađa. Nastali dipeptid ostaje na većoj ribozomalnoj čestici. Sada se na manju česticu (30S) vezuje sledeći kompleks aminokiseline-t-RNK, koji odgovara tripletu baza na m-RNK. I ona prelazi na veću česticu gradeći sa prethodno nastalim dipeptidom tripeptid. Postupak se tako ponavlja i nastaju tetra, penta odnosno polipeptid. Peptidni lanac ostaje vezan za veću ribozomalnu česticu, koja se pri ugrađivanju svake nove amino kiseline pomera za tri baze na m-RNK. Energiju za kretanje ribozoma po lančastom molekulu m-RNK daje gvanozin-trifosfat. Na sl. 7.10 šematski je prikazano nastajanje peptidnog lanca iz kompleksa aminokiselina-t-RNK na ribozomu.

Slika 7.10 - Shema ugrađivanja aktivisanih aminokiselina-t-RNK u peptidni lanac na česticama ribozoma. Polipeptidna-t-RNK. vezana je za veću česticu (50 S), a

za manju česticu (30 S) je vezana sledeća aminokiselina-t-RNK .Svaka sledeća aminokiselina-t-RNK mora da odgovara šifri na m-RNK po kojoj se

pomeraju ribozomalne čestice.

Na kraju je važno da se napomene da su šifre (»code«) za pojedine amino-kiseline na m-RNK univerzalne (zajedničke) za sve žive organizme. Dokazano je, naime, da dodavanjem sintetisanih ribonukleinskih kiselina (nazvanih poli-uridin ili poli-citozin) bezćelijskim ekstraktima bakterija, viših biljaka ili životinja, nastaju isti peptidi.

UKRATKO:

Zapis o redosledu aminokiselinskih ostataka proteina jedinke, pa i njenih osobina, nose posebna hemijska jedinjenja, prirodni polimerni makromolekuli, nukleinske kiseline. To su ključni molekuli života u kojima su „deponovane“ genetske informacije, a koje se prenose sintezom proteina. Od iskazivanja genetske informacije do sinteze biološki aktivnih proteina uključeni su mnogi, veoma složeni i dobro regulisani procesi.

Nukleinske kiseline su polimeri koji se satoje od osnovnih jedinica , monomera, nukleotida. Pod uticajem baza, kiselina ili enzima, nukleotidi hidrolizuju i nastaju tri vrste proizvoda, sastavni delovi nukleotida: monosaharidi, grupa heterocikličnih baza i fosforna kiselina. Od monosaharida tu su dve pentoze, riboza i dezoksiriboza, (a po njima i kiseline koje ih sadrže nazivamo ribonukleinska (RNA) i dezoksiribonukleinska (DNA) kiselina). Heterociklične baze koje ulaze u sastav nukleinskih kiselina su derivati purina i pirimidina, tzv. purinske i pirimidinske baze. Od purinskih baza tu su: adenozin (A) i guanin (G), a od pirimidinskih: citozin (C), uracil (U) i timin (T).

DNA i RNA sadrže različite vrste azotnih baza. Tako se u DNA nalaze timin, citozin, adenozin i guanin, a u RNA uracil, citozin, adenozin i guanin.

U nukleinskim kiselinama azotne baze su kovalentno vezane za pentoze, za ribozu u RNA i dezoksiribozu u DNA. Ovako nastala jedinjenja su nukleozidi.

Vezivanjem fosforne kiseline estarskom vezom za C-5 atom pentoze u nukleozidima nastaju nukleotidi, monomeri nukleinskih kiselina. Esterifikacijom nukleozida adenina fosfornom kiselinom nastaje nukleotid adenilna kiselina. Postoje i nukleotidi sa više ostataka fosforne kiseline. Ako sadrže tri ostatka ove kiseline vezane za nukleozid nazivaju se nukleozid trifosfati. Takav je nrp. Adenozin trifosfat (ATP).

Nukleotidi su važni sastojci, pa se njihova sinteza odvija u svim ćelijama. Katabolizmom sintetizovanih nukleoproteina ili nukleoproteina hrane nastaju nukleinske kiseline, koje se razgrađuju hidrolizom do purinskih i pirimidinskih baza. Kao krajnji proizvod katabolizma purinskih baza nastaje mokraćna kiselina, a pirimidinskih ureja.

Pirimidinski nukleotidi se sintetizuju iz prostih prekursora, glutamina, ATP i CO₂. Prvi proizvod u nizu međuproizvoda je karbamoil fosfat. On se kondenzuje sa asparaginskom kiselinom a zatim se zatvara prsten i posle oksidacije nastaje orotonska kiselina. Iz orotonske kiseline nastaju timidin (TMP) i citidin monofosfat (CMP).

Nukleotidi su u nukleinskim kiselinama međusobno vezani fosfodiestarskim vezama. Fosforna kiselina je istovremeno esterifikovana hidroksilnom grupom dezoksiriboze (u položaju 5´) i hidroksilnom grupom sledećeg nukleotida (u položaju 3´). Tako nastaje „kičma“ nukleinskih kiselina koju čine naizmenično raspoređeni ostaci fosforne kiseline i pentoza, dok su azotne baze smeštene bočno.

Nukleinske kiseline se međusobno razlikuju prema sekvenci, redosledu azotnih baza. Redosled ugrađivanja 4 azotne baze (A, G, C, T) u molekul DNA predstavlja „zapis“ koji na određen način daje podatke o redosledu aminokiselinskih ostataka u proteinima koje treba sintetizovati.

Pored primarne strukture značajan je i prostorni raspored ovih makromolekula, njihova sekundarna i tercijarna struktura. Vatson i Crick su pretpostavili da se molekuli DNA sastoje iz dve polinukleotidne niti koje međusobno grade spiralu orjentisanu oko iste ose. Ove se niti drže vezane vodoničnim vezama koje se grade između azotnih baza i to adenina i timina ili citozina i guanina.

Osnovna uloga DNA je da čuva i prenosi genetske informacije. Ove se informacije nalaze zapisane u redosledu azotnih baza, a prenose na potomke procesom koji se naziva replikacija. O tome kakav protein treba da se sintetizuje informacije se čitaju sa DNA. Ovo čitanje zapisa sa DNA naziva se transkripcija, a sinteza koja se vrši prema dobijenoj informaciji je translacija.

Replikacija DNA je proces samoproizvodnje ove nukleinske kiseline. To je proces „kopiranja“ kojim nastaju molekuli DNA-potomaka i koji nosi iste genetske informacije kao i DNA-roditelji.

Transkripcija se vrši sa jednog dela DNA i sastoji u sintezi ribonukleinskih kiselina (RNA). Postoje više vrsta RNA. To su informaciona RNA (iRNA ili mRNA), ribozomalna RNA (rRNA) i transportna RNA (tRNA). One se razlikuju po hemijskoj strukturi i biološkoj ulozi. Da bi počela transkripcija genetskog zapisa sa

određenog dela DNA, dvostruka spirala se na tom mestu delimično razdvaja. Na razdvojenom delu započinje i vršu se sinteza novog polinukleotidnog lanca. Slobodni nukleotidi se ređaju kao po „kalupu“ i vezuju za nit vodoničnim vezama prema principu o sparivanju baza. Poređani nukleotidi se spajaju fosfodiestarskim vezama uz katalitičko delovanje DNA-zavisne RNA polimeraze. Kako nastali ribonukleinski lanci nose „prepisane“ informacije sa dela DNA ova se RNA naziva informaciona RNA. Za prepisivanje svakog posebnog gena stvara se posebna iRNA. Noseći zapis iRNA izlazi iz jedra u odlazi do ribozoma.

U sastav ribozoma ulazi kako veći broj proteina i drugih supstanci, tako i jedna posebna vrsta RNA, ribozomalna RNA (rRNA). Za sintezu proteina pored informacije koju nosi iRNA, funkcionalne jedinice, „aparata“ za sintezu u kome se nalazi rRNA, neophodan je i način efikasnog i tačnog dopremanja odgovarajućih aminokiselina potrebnih za sintezu proteina. Za ovo biranje i dopremanje aminokiselina odgovorne su posebne RNA, transportne RNA (tRNA).

Sekvenca aminokiselina proteina nalazi se zapisana u molekulima DNA redosledom azotnih baza. Svaka aminokiselina u ovim zapisima označena je posebnom „šifrom“, koja se sastoji iz tri azotne baze ili tripleta koji nazivamo kodon. Kodoni svih aminokielina čine genetski kod.

U procesima replikacija DNA ili transkripcije i sinteze proteina mogu se dogoditi greške. Ovakve greške nazivaju se mutacijama i sastoje se najčešće u zameni pojedinih azotnih baza u genetskom kodu. Mutacije mogu nastati prirodnim putem, spontano ili pod uticajem različitih hemijskih i fizičkih agenasa.

Translacija je proces biosinteze proteina koji se sastoji u prevođenju sekvence baza zapisane u iRNA u sekvencu aminokiselina u molekulu proteina. Proces biosinteze se odvija na ribozomima i predstavlja jedan od najsloženijih procesa u kojem učestvuje velik broj enzima i drugih biomolekula. Proteini se mogu sintetizovati iz slobodnih aminokiselina samo se one prethodno moraju „aktivirati“ uz učešće ATP-a i posebnih enzima. „Aktivirane“ aminokiseline se vezuju za transportne RNA. U svakom tRNA postoji posebna grupa od tri azotne baze, triplet, koje služe za prepoznavanje „mesta“ na iRNA, odnosno kodona gde aminokiselinu treba dopremiti. Ovaj triplet baza koji prepoznaje svoj kodon naziva se antikodon. Prevođenje informacije sadržane u kodonima na iRNA u sekvencu aminokiselina vrši se uz učešće

ribozoma, a u osnovi je sparivanje baza. Antikodon prepoznaje odgovarajući kodon i dovodi potrebnu aminokiselinu na odgovarajuće mesto.

Oko 2000 bolesti čoveka su direktno ili indirektno posledica promena u informacijama koje nose i koje se prepisuju sa DNA. Ove se promene, pre svega, ogledaju u sintezi promenjenih proteina, od kojih su posebno značajne izmenjene aktivnosti enzima.

KOENZIMI I VITAMINI

8.1 UVOD

Vitamini su bitni organski sastojci hrane, koji u malim količinama pomažu i održavaju normalni razvoj životinja i mikroorganizama. Organizam ne može sam da ih sintetiše, osim iz njihovih direktnih prethodnika — provitamina. Neke vitamine sintetišu bakterije crevne flore.

Vitamini su otkriveni relativno kasno, jer se u hrani nalaze u malim količinama, a mnogi od njih su vrlo nestabilni. Međutim, odavno je bilo poznato da mornari, koji se na svojim dugotrajnim putovanjima ne hrane svežim voćem i povrćem, oboljevaju od skorbuta. Isto tako je bolest beri–beri bila poznata kod istočnih naroda. Danski lekar Eijkman konstatovao je (1897 g.), da od beri–beri oboljevaju osobe, koje se hrane poliranim pirinčem. Početkom XIX veka su Hopkins, Pekelharing, Osborne, Mendel, McCollum i dr. dokazali na eksperimentalnim životinjama, da potpuna hrana mora da sadrži — pored ugljenih hidrata, masti, belančevina, mineralnih materija, vode — i male količine izvesnih akcesornih ili dijetalnih faktora. Funk je 1911 g. izolovao iz opne i spoljne površine pirinča jednu kristalnu supstancu, koja je lečila bolest beri–beri. Izolovana supstanca je imala karakter amina i Funk joj je dao ime vitamin (lat. vita=život). Posle toga je otkriven u raznim vrstama hrane čitav niz ovakvih akcesornih supstanci, za koje se pokazalo da su bitne za normalni razvoj životinja. One su vrlo različitog hemijskog sastava, mnoge nisu amini, ali se ime vitamin zadržalo za celu grupu ovih jedinjenja. Usvojeno je da se vitamini obeležavaju početnim slovima latinske azbuke: A, B, C, itd.

Količine vitamina koje su svakodnevno potrebne, su male. Jedino je vitamina C potrebno 75 mg dnevno, a svih ostalih ispod ili najviše par miligrama. Iz toga proizlazi da vitamini nisu hranljive materije u običnom smislu reči, već da imaju katalitičke funkcije kao sastavni delovi koenzima i prostetičnih grupa.

Nedostatak vitamina dovodi do zastoja normalnog razvoja i rastenja životinja, i avitaminoznih stanja. Upadljivo je da se kod mnogih avitaminoza javljaju promene na koži i sluzokožama. Na eksperimentalnim životinjama je pokazano, da nedostatak vitamina izaziva metaboličke poremećaje, koji se javljaju pre pojave simptoma avitaminoze.

8.2 PODELA

Vitamine klasifikujemo, prema njihovoj rastvorljivosti, u dve grupe:

I. Vitamine rastvorljive u vodi i

II. Vitamine rastvorljive u mastima

U prvu grupu spada vitamin C (=askorbinska kiselina) i vitamini B–grupe. Vitamini A, D, E i K grupe su vitamini rastvorljivi u mastima.

8.3 VITAMINI B–GRUPE

U vitamine B–grupe (B kompleks) spadaju vrlo različita jedinjenja, pa je to, s hemijijskog gledišta, najnehomogenija grupa vitamina. Prema predlogu R. J. Williams–a u grupu B vitamina ubrajaju se svi oni akcesorni faktori, koji su sastavni delovi koenzima i prostetičnih grupa.

Na osnovu ove definicije u B vitamine ubrajamo: niacin, laktoflavin (=B2) i liponsku kiselinu, koji učestvuju u prenošenju vodonika kod raznih bioloških oksidoredukcija. Zatim sve one koji su sastavni delovi transfernih koenzima. Tu spadaju: tiamin, pantotenska kiselina, piridoksin, biotin i folna kiselina. Neki od njih su, takođe, koenzimi izomeraza, liaza i ligaza. U B vitamine spada i kobalamin (=B12) kao koenzim jedne intramolekulske izomeraze.

Vitamini B–grupe nalaze se obično u hrani zajedno. Zbog toga je kod ljudi i životinja nepoznata avitaminoza, koja se javlja kao posledica nedostatka samo jednog vitamina B–grupe. Za razliku od vitamina rastvornih u mastima, čije rezerve može životinja da čuva i u jetri, rezerve vitamina rastvornih u vodi su neznatne.

Najveći broj vitamina B–grupe ne nalaze se u organizmu slobodan, već vezan u obliku koenzima. Koenzim može, po svom hemijskom sastavu, da bude estar fosforne kiseline i vitamina (npr. piridoksal–fosfat) ili pirofosforne kiseline (kao tiamin–pirofosfat). Veliki broj koenzima je nukleotidnog karaktera. Tu spadaju: Nikotinamid–adenin–dinukleotid (NAD+), nikotinamid–adenin–dinukleotid–fosfat (NADP+), flavin–nukleotidi (FMN i FAD), koenzim A i koenzim kobalamin. kao i adenozin–trifosfat (ATP), uridin–trifosfat (UTP) i citidin–trifosfat (CTP)

8.4 NIACIN, LAKTOFLAVIN I LIFONSKA KISELINA

Ova tri vitamina B–grupe obradićemo zajedno, jer učestvuju u istom tipu enzimskih reakcija — oksidoredukcijama.

Niacin se ne nalazi u organizmu slobodan, već vezan u obliku koenzima nikotinamid–adenin–dinukleotida (NAD+) i nikotinamid–adenin–dinukleotid–fosfata (NADP+).

Hemijsko ime niacina je nikotinska kiselina (piridin–3–karbonska kiselina). Nikotinska kiselina i njen amid (niacinamid) nastaju u organizmu iz aminokiseline triptofana. Pošto triptofana ima samo u potpunim belaručevinama, a u biljnim ga nema (kao npr. zeinu iz kukuruza), ljudi čija je glavna hrana kukuruzno brašno oboljevaju od jedne bolesti poznate pod imenom pelagra. Ona nastaje zbog nedostatka niacina, koji je praćen i nedostatkom drugih vitamina B–grupe (tiamin, laktoflavin, piridoksin). Niacin je poznat i pod imenom P—P faktor (=pelagra preventive factor).

Nikotinska kiselina je bela kristalna supstranca, rastvorna u vodi i stabilna na vazduhu i višoj temperaturi. Nalazi se u mesu, jetri, kvascu, nepoliranom pirinču, a nema je u belom brašnu.

Do danas su poznata dva koenzima. koja sadrže amid nikotinske kiseline: nikotinamid–adenin–dinukleotid (NAD+) i nikotinamid–adenin–dinukleotid–fosfat (NADP+). NAD+ se ranije zvao difosfopiridin–nukleotid (DPN), a NADP+ tri–foslopiridin–nukleotid. NAD+ je otkrio Harden kao kofaktor alkoholnog vrenja, a Euler sa saradnicima ga je izolovao iz bezćelijskog ekstrakta kvasca. NADP+ je izolovan iz crvenih krvnih zrnaca (Warburg i Christian 1934 g.).

Oba koenzima imaju istu osnovnu strukturu nukleotida: sadrže dve baze nikotinamid i adenin, koje su N — glikozidnom vezom vezane za ribozu. Nikotinamid se nalazi u obliku piridinijum soli. Preko pirofosforne kiseline povezana su oba nukleozida u dinukleotid. Nikotinamid–adenin–dinukleotid–fosfat ima treći ostatak fosforne kiseline vezan na ribozu adenozina u položaju 2'. Zbog pozitivnog naelektrisanja piridinskog prstena u oba dinukleotida, njihova skraćena formula se piše NAD+ i NADP+ kad su u oksidovanom stanju.

Prilikom redukcija NAD+ i NADP+ dolazi do vezivanja vodonika za piridinski prsten, koji na taj način gubi aromatični karakter, a azot u prstenu pozitivno nalektrisanje.

Redukcija može da se prati merenjem absorpcije svetlosti na 340 nm gde redukovani koenzimi imaju maksimum. Ova osobina ss koristi za određivanje aktivnosti enzima, čiji su koenzimi NAD+ ili NADP+ (Warbug–ov optički test). Oksido–redukcija koenzima piše se skraćeno:

Funkcija NAD+ i NADP+ sastoji se u reverzibilnom primanju i otpuštanju vodonika u različitim procesima biološke oksidacije. Npr. pri oksidaciji primarnih ili sekundarnih alkohola, vodonik preuzima NAD+:

Riboflavin (=vitamin B2) poznat i pod imenom laktoflavin sastavni je deo flavin–nukleotida (FMN i FAD). Riboflavin se sastoji iz dimetilizoaloksazinskog prstena za koji je na položaju 9 vezan alkohol

D–ribitol. Hemijsko ime riboflavina je: 6,7–dimetil–9 N–ribitil–izo–aloksazin.

Riboflavin je narandžasto–žuta kristalna supstanca, rastvorna u vodi i stabilna na povišenoj temperaturi, naročito u kiseloj sredini. Vodeni rastvor riboflavina fluorescira žuto–zeleno.

Riboflavin je vrlo rasprostranjen u prirodi. Nalazi se u mleku, mesu, jajima, voću i lisnatom povrću. Mnoge bakterije,

gljivice i plesni ga sintetišu.

Liponska ili tio–oktanska kiselina je prvo otkrivena kao faktor rastenja izvesnih mikroorganizama. Liponska kiselina je ciklični disulfid, koji u bočnom lancu sadrži karboksilnu grupu. Preko karboksilne grupe je kiselinsko–amidnom vezom vezana za enzim.

Liponska kiselina je kofaktor oksidativnih dekarboksilacija. Ona u ovom komplikovanom procesu učestvuje u oksidaciji »aktivnog acetaldehida«, preuzimajući ostatak sirćetne kiseline i vodonik. Primanjem vodonika se redukuje u derivat dihidroliponske kiseline

8.5 TIAMIN

Tiamin, ranije poznat pod imenom aneurin ( = vitamin B 1), je antiberi–beri ili antineuritični faktor. Prvi ga je izolovao Funk iz pirindžane ljuske.

Tiamin je bela kristalna supstanca, koja se dobro rastvara u vodi, slabije u etanolu, a ne rastvara se u etru i hloroformu. U suvom stanju

je stabilan pri zagrevanju do 100°; zbog toga se kuvanjem hrane neznatno razara. Tiamin se danas dobija na veliko sintetskim putem.

Molekul tiamina se sastoji iz pirimidinskog i tiazolovog prstena. Prstenovi su međusobno povezani preko kvarternernog azota tiazola, tako da je tiamin uvek pozitivno naelektrisan.

Pored slobodnog tiamina u organizmu se nalazi i pirofosfat vitamina, koji se zove tiaminpirofosfat i skraćeno se obeležava TPP. Pirofosforna kiselina je u tiaminpirofosfatu estarski vezana za alkoholnu grupu tiazolovog prstena.

Tiaminpirofosfat je, pored NAD+ i NADP+, jedan od najranije poznatih koenzima. On u procesu oksidativne dekarboksilacije piruvata učestvuje u dekarboksilaciji i prenosu »aktivnog acetaldehida«. Zbog toga je ranije nazivan »kodekarboksilaza«, što je danas zamenjeno pravilnijim imenom »kodekarboksilaza«, jer se radi o gubitku CO2.

Nedostatak tiamina dovodi do poremećaja u metabolizmu glukoze, zbog nagomilavanja pirogrožđane kiseline.

Tiamin je, takođe, koenzim transketolaza, enzima fosfoglukonatnog puta.

Mnoge bakterije sintetišu tiamin. Tako bakterije crevne flore mogu potpuno da zadovolje potrebe životinje u ovom vitaminu.

U sirovom ribljem mesu, nekim bakterijama i biljkama postoji enzim (tiaminaza), koji cepa vezu između pirimidinskog i tiazolovog prstena u tiaminu:

-

Zato se pojavljuju simptomi polineuritisa (=B1 avitaminoza) kod životinja, koje se hrane sirovim ribljim mesom ili hranom, koja sadrži antitiaminske supstance. Neke bakterije sadrže antitiaminske supstance, koje nisu enzimskog karaktera.

8.6 PANTOTENSKA KISELINA

R. J. Williams je izolovao pantotensku kiselinu i dokazao, da je ona faktor rastenja kvasca. Kasnije se pokazalo da ona leči dermatitis pilića, sprečava slepilo miševa i depigmentaciju pacova.

Pantotenska kiselina je vrlo rasprostranjena. Nalazi se u jetri, bubrezima, obranom mleku, kupusu, karfiolu, paradajzu i kvascu.

Pantotenska kiselina je žuta, viskozna, zejtinjava supstanca, stabilna pri za–grevanju i prema oksidacionim i redukcionim sredstvima. Ona je derivat β–alanina, koji je peptidno vezan za pantoinsku kiselinu (=β, β–dimetil–α, γ–dihidroksibuterna kiselina):

Pantotenska kiselina se ne nalazi slobodna u prirodi. U nekim bakterijama (Lactobacillus bulgaris) je vezana za cisteamin ( = β–aminoetantiol) gradeći jedinjenje poznato pod imenom pantetein. U živoinjskom organizmu pantotenska kiselina je sastavni deo koenzima A, To je dinukleotid, koji se sastoji od pantetein––fosfata i adenozin–3',5'–difosfata:

Najvažnije jedinjenje koenzima A je acetil–koenzima A, poznato i pod imenom »aktivna sirćetna kiselina«. U njemu je ostatak sirćetne kiseline vezan za koenzim visoko–energetskom tioestarskom vezom (33,5 kJ/mol). Koenzim A se skraćeno piše KoA–SH, a acetil–koenzim A: H3C—CO—S—KoA.

Acetil–koenzim A nastaje u organizmu iz glukoze ili masnih kiselina, koji u obliku acetil–koenzima A ulaze u ciklus trikarbonskih kiselina (=ciklus limunske kiseline).

»Aktivna sirćetna kiselina« učestvuje, u mnogobrojnim biološkim procesima kao što su: biosinteza masnih. kiselina i sterola, nastajanje acetsirćetne kiseline kao i različitih acetiliranih derivata (acetilholina, N–acetil–šećera i dr.).

8.7 PIRIDOKSIN (VITAMIN B6)

Piridoksin i njegova dva derivata, piridoksal i piridoksamin, imaju aktivnost vitamina B6. Sva tri derivata se nalaze u životinjskoj i biljnoj hrani (žumancetu jajeta, mesu, mleku, ribljem mesu).

Piridoksin, poznat i pod imenom adermin, je bela kristalna supstanca rastvorna u vodi i alkoholu. Osetljiv je na svetlost i prema alkalijama. Sam piridoksin je stabilan pri zagrevanju, dok se njegovi derivati, piridoksal i piridoksamin, raspadaju.

Vitamini B6 su derivati piridina. Piridoksal je aldehidni, a piridoksamin amino derivat piridoksina ( = 2–metil–3–hidroksi– 4,5–di (hidroksimetil)–piridin):

Fosfatna jedinjenja vitamina B6, piridoksal–fosfat i piridoksamin–fosfat, su prostetične grupe velikog broja enzima (amino–transferaza, dekarboksilaza, različitih liaza i sintetaza). U toku enzimskog razlaganja aminokiselina piridoksal–fosfat gradi sa amino kiselinom intermedijerno jedinjenje tipa Schiff–ove baze. Nastalo

jedinjenje se dalje razlaže na različite načine u zavisnosti za koji je apoenzim vezan piridoksal–fosfat. Tako se dejstvom amino–transferaza aminokiselina transaminira, dejstvom dekarboksilaza gubi CO2 i daje amin, a dejstvom okzidaza se oksiduje.

Eksperimentalno je dokazano da piridoksal–fosfat igra bitnu ulogu i u metabolizmu nezasićenih masnih kiselina, kao i u biološkoj sintezi masti iz proteina.

8.8 BIOTIN

Biotin je poznat kao vitamin H ili koenzim R (Ko—R). On je faktor rastenja izvesnih vrsta kvasaca i bakterija: Clostridium, Rhizobium, Staphylococcus i dr. Nedostatak ovog vitamina kod pacova poznat je kao »bolest belanceta jajeta«. Ona se javlja kad se životinje hrane duže vremena sirovim belancetom, jer se biotin vezuje za jedan protein belanceta (avidin) gubeći svoje vitaminsko dejstvo.

Biotin je dijetalni faktor i ljudi i viših životinja, ali zbog toga što ga sintetišu bakterije crevne flore, retko dolazi do avitaminoze biotina. Vrlo je rasprostranjen, a naročito ga ima mnogo u jetri, bubrezima, odakle je prvo i izolovan (Du Vigneaud i sar.).

Biotin kristališe u obliku duguljastih, tankih iglica, rastvara se u vodi i etanolu, a ne rastvara ss u etru i hloroformu. Postojan je pri zagrevanju.

Po svojoj hemijskoj strukturi, biotin je ciklični derivat uree, koji sadrži tiofenski prsten (=2'–keto–3,4–imidazolidotiofan–2–n–valerijanska kiselina).

Biotin se obično nalazi vezan s lizinom (biocitin), a u proteinima je peptidno vezan za –amino grupu lizina.

Biotin je prostetična grupa mnogobrojnih enzima (karboksilaza), koji katalizuju vezivanje CO2 (acetil–KoA karboksilaza, piruvat karboksilaza i dr.)

U toku reakcije, CO2 se vezuje s biotinom gradeći „aktivni ugljen dioksid" (karboksi–biotin enzim"), labilno jedinjenje, koje lako predaje CO2 supitratu.

Biološke fiksacije CO2 su endergonske reakcije i zbog toga se odvijaju u prisustvu davaoca energije ATP–a.

Biotin u obliku »aktivnog ugljen dioksida« učestvuje u sintezi masnih kiselina, oksalsirćetne kiseline, ureje, purina kao i u metabolizmu triptofana.

8.9 FOLNA KISELINA

Vitamini folne kiseline su vrlo rasprostranjeni u prirodi, a naročito ih ima u lisnatom povrću (spanaću, karfiolu) po čemu su i dobili ime (foliage = lišće). Ima ih i u kvascu, jetri, bubrezima. Bakterije crevne flore nekih životinja (svinje, kunića) sintetišu ove vitamine.

Svi vitamini ove grupe su derivati pteroil–glutaminske ili folne kiseline. Molekul folne kiseline sastavljen je od tri komponente:

1.) Azotne baze pteridina, koja se sastoji od pirimidinskog i pirazinskog prstena. Pteridini su žuti pigmenti, koji su prvi put izolovani iz leptirovih krila.

2.) p–amino benzojeve kiseline, koja je faktor rastenja mnogih mikroorganizama i

3.) glutaminske kiseline, koja je peptidno vezana na pteroilnu grupu

Vitamini ove grupe razlikuju se međusobno ili po broju ostataka glutaminske kiseline ili po strukturi pteridinskog prstena. Tako folna kiselina nekih bakterija sadrži tri, a mnoga životinjska tkiva sedam ostataka glutaminske kiseline. U ovu grupu vitanina spada i Leucovorin, faktor rasta Leuconostoc citrovorum bakterija. Leucovorin je redukovani oblik folne kiseline, koji na N5 ima ostatak mravlje kiseline .

Iako se folna kiselina ubraja u vitamine, aktivan je njen tetrahidro–derivat, poznat pod imenom koenzim F. To je aktivna grupa hidroksi–

metil i formil–transferaza, enzima koji prenose C1–ostatak. Ostaci od jednog ugljenikovog atoma, koji nastaju razlaganjem histidina i serina, ne oslobađaju se u obliku mravlje kiseline, već se odmah vezuju za koenzim F. Tako nastaje »aktivni C₁« ili »aktivna mravlja kiselina«, koja je po svojoj hemijskoj strukturi N 10–formil–tetrahidrofolna kiselina.

Vitamini folne kiseline, zajedo sa B12 vitaminima, imaju ulogu koenzima u biosintezi purina i timina, bitnih za sintezu DNK. Zbog toga su od velike važnosti za normalni razvoj eritrocita, granulocita, trombocita i svih drugih ćelija.

8.10 VITAMIN B12

Vitamin B12a (kobalamin), poznat prvo kao faktor antiperniciozne anemije, izolovan je iz ekstrakta jetre 1948 g. (E. L. Smith). Posle toga dobijeni su vitamini B12 kao sporedni proizvodi iz tečnosti, koja ostaje posle fermentacije Streptomyces griseus i drugih specijalnih mikroorganizama. Danas se za medicinske svrhe dobijaju iz tih tečnosti veće količine vitamina B12.

Vitamina B12 ima najviše u jetri, manje u mleku, jajima i mesu, a u biljnoj hrani ih nema. Pod pogodnim uslovima bakterije crevne flore mogu da sintetišu ovaj vitamin.

Cijankobalamin (sadrži cijanidni jon) je crveno obojena kristalna supstanca, koja sadrži azota, fosfora i kobalt. Rastvara se u vodi, alkoholu, acetonu i optički je aktivan. Stabilan je pri zagrevanju u neutralnoj sredini, a u kiseloj i alkalnoj se raspada.

Struktura vitamina B12 je vrlo komplikovana. Svi sadrže prsten sličan porfirinu, sa kobaltom u centru. U kobalamid–koenzimu kobalt je u dvovalentnom stanju, Kobalt je kovalentno vezan za četiri pirolova prstena, za 5,6–dimetil–benzimidazol i u koenzimu za 5'–desoksiadenozin. Kobalamid–koenzim se vrlo teško izoluje, jer se

na svetlosti i u prisustvu anjona kobalt oksiduje u trovaletno stanje. Pri tome se anjon, a najlakše cijanidni jon, vezuje na mesto 5'–desoksiadenozina.

Zamenom cijanidnog jona u cijankobalaminu nekim drugim anjonom, dobijaju se drugi vitamini ove grupe. Tako je vitamin B12

b - hidroksokobalamin, B12 c nitritokobalamin.

Na koji načinn vitamini B₁₂ sprečavaju pojavu perniciozne anemije nije još potpuno objašnjeno. Naprotiv, njegova funkcija u nizu na izgled različitih biohemijskih reakcija je poznata. Kobalamin je koenzim intramolekulskih transferaza, enzima koji katalizuju premeštanje atomskih grupa unutar molekula i nastajanje izomernih jedinjenja. Tako npr. pri prelazu metil–malonil–koenzima A u sukcinil––koenzim A dolazi do premeštanja —CO—S—KoA grupe:

Isto tako kobalamin učestvuje u dismutaciji vicinalnih glikola u odgovarajući al–dehid. Npr.

Prisustvo kobalamin–koenzima je neophodno, takođe, pri redukciji ribonukleotid––trifosfata u odgovarajuće dezoksiribonukleotid–trifosfate.

UKRATKO:

Vitamini su potrebni čoveku za normalan rast i razvoj i normalno odvijanje metaboličkih procesa. Čovekov organizam ne može sam sintetizovati vitamine, već mora njih i njihove prekursore unositi hranom.

Vitamini su hemijski veoma različita jedinjenja, a prema rastvorljivosti dele se na one rastvorljive u mastima (A, D, E, i K) i one rastvorljive u vodi (tiamin, riboflavin, piridoksin, cijanokobalamin, niacin, pantotenska kiselina, lipoična kiselina, folna kiselina, inozitol i askorbinska kiselina). Uloga vitamina u metabolizmu je u tome što su mnogi od njih koenzimi ili prostetične grupe enzima, pa su potrebni za održavanje aktivnosti mnogih enzima.

Vitamin A (Akseroftol) je po hemijskoj strukturi izoprenoid koji sadrži β-jononski prsten na koji se nastavlja ugljenikov lanac od 9 C atoma. Nastaje iz karotina. Hipovitaminoza A izaziva tzv. kokošje slepilo, tj. nemogućnost adaptacije vida u mraku. Kod dece izaziva smetnje u rastu. Hipervitaminoza A izaziva toksične efekte s gubitkom kose, abdominalnim tegobama, pucanjem noktiju.

Vitamin B1 (Tiamin) se sastoji od pirimidinskog prstena i tiazolskog prstena koji su vezani preko kvarternog N-atoma. Biološka mu je funkcija – koenzim dekarboksilaze α-ketokiselina i koenzim aldehid-transferaze. Njegov deficit odražava se u raznim organima s najtežim oštećenjem neuromuskularnog sistema. Izaziva bolest beri-beri.

Vitamin B2 (Riboflavin) se satoji iz izoaloksazina na koji je vezan D-ribitol. Biološka mu je funkcija da kao FMN i FAD sudeluje kao koenzim nekih oksido-reduktaza koje se zajedničkim imenom nazivaju flavoproteini. Tako je potreban za aktivnost NADH dehidrogenaze u lancu disanja, piruvat dehidrogenaze, α-ketoglutarat dehidrogenaze, dehidrogenaze D-aminokiselina i ksantin dehidrogenaze. Nedostatak riboflavina izaziva pojavu fisura u uglovima usana, poremećaj vida, dermatitis, a ponekad i zastoj u rastu.

Niacin je derivat piridina. Može nastati iz triptofana. Deo je koenzima NAD i NADP. Njegov deficit izaziva pelagru.

Vitamin B6 (Piridoksin) je derivat piridina, koenzim je aminotransferaza i dekarboksilaza aminokiselina. Nedostatak izaziva poremećaj sličan epilepsiji verovatno zbog smetnji u metabolizmu glutaminske kiseline.

Vitamin H (Biotin) je derivat ureje vezan s tiofanskim prstenom. Biološka uloga mu je da je prostetična grupa enzima koji katalizuju karboksilacije.

Vitamin B12 (Kobalamin) je hemijski kompleksno jedinjenje koje sadrži porfirinu sličan korinski prsten s helatno vezanim centralnim atomom kobalta. Biološka mu je uloga da služi kao koenzim nekih enzima koji sudeluju u pretvaranju metilmalonil-koenzima A u sukcinil-koenzim A i sintezi metionina iz homocisteina i metiltetrahidrofolata, te u pretvaranju ribonukleotida u dezoksiribonukleotide. Deficit kobalamina izaziva pernicioznu anemiju. Isto tako nedostatak kobalamina izaziva i subakutnu kombinovanu degeneraciju leđne moždine.

Folna kiselina se sastoji od pteridinskog prstena, p-aminobenzojeve kiseline i peptidno vezane glutaminske kiseline. Biološka joj je uloga da služi kao koenzim enzima u metabolizmu jednokarbonskog ostatka, metabolizmu metionina i histidina te biosintezi purina i pirimidina. Deficit folne kiseline može se javiti kod slabe apsorpcije u crevima. U deficitu se javlja makrocitna, megaloblastna anemija.

Vitamin C (Askorbinska kiselina) je jak reducent, jer se reverzibilno lako oksiduje u dehidroaskorbinsku kiselinu. U metabolizmu askorbinska kiselina deluje kao donor vodonika u nekim enzimskim reakcijama. Ovaj vitamin je potreban za hidroksilaciju prolina, tirozina, DOPA i nekih intermedijera adrenokortikoida. Njegov deficit dovodi do skorbuta.

Vitamin D (Kalciferol) je sterolne strukture u kojoj je B-prsten otvoren. Funkcija kalciferola je da pospešuje mineralizaciju kosti, što se postiže stimulacijom apsorpcije kalcijuma i fosfora u crevu. Deficit ovog vitamina izaziva poremećaj u mineralizaciji kostiju, što kod odraslih rezultira pojavom osteomalacije, a kod dece rahitisom.

Vitamin E (Tokoferol) je sastavljen od osam sličnih jedinjenja, a svi oni imaju izraženo antioksidativno delovanje. Hemijski su slični hinonima s izoprenoidnim bočnim lancem. Ne zna mu se tačno biološka uloga, a njegov nedostatak se može dovesti u vezu sa mišićnom distrofijom.

Vitamin K (Filohinon) ima strukturu naftohinonskog prstena s bočnim izoprenoidnim lancem. Njegov deficit izaziva sklonost krvarenju i smetnje u koagulaciji krvi.

Pantotenska kiselina sa cisteaminom stvara pantetin koji je deo koenzima A i multienzimskog kompleksa za sintezu masnih kiselina. Deficit se retko javlja, a simptomi su mu poremećaji nervnog sistema.

HORMONI

9.1 UVOD

Endokrinologija je nauka o produktima strukturno i funkcionalno specijaliziranih žlezda i njihovom delovanju u održavanju biohemijskog i fiziološkog integriteta organizma. Za razliku od ostalih žlezda koje svoje produkte luče putem kanalića, ove žlezde nemaju takvih odvodnih kanalića nego svoje sekrete luče direktno u krv, zbog čega su jako vaskularizirane. Zato se nazivaju žlezde s unutarnjim izlučivanjem ili endokrine žlezde. U njima se stvaraju aktivne supstance, hormoni (od grčkog hormon — stimulišejući, ekscitirajući). Hormoni se iz žlezda izlučuju direktno u cirkulaciju s kojom se prenose u druge delove tela i tamo deluju na organizam.

Hormoni održavaju i regulišu celokupni metabolizam i time održavaju homeostazu, tj. konstantnost hemijskog sastava krvne plazme i ostalih telesnih tečnosti, normalnu funkciju organizma te kontrolišu rast i razvoj pojedinih delova tela. Svaki hormon ima svoje specifične funkcije. Tako seksualni hormoni regulišu razvoj polnih karakteristika, aldosteron iz nadbubrežne žlezde kontroliše ravnotežu vode i soli u organizmu itd. Međutim, često je regulacija metaboličkih procesa rezultat delovanja više hormona. Najbolji je primer regulacija metabolizma ugljikohidrata i koncentracije glukoze u krvi, u čemu sudeluju inzulin i glukagon iz pankreasa, glukokortikoidi i adrenalin iz nadbubrežne žlezde, kortikotropin i somatropin iz hipofize, pa i tiroksin iz tiroideje.

Funkcija endokrinog tesno je povezana s funkcijom nervnog sistema i samo se zajedničkom neurohumoralnom regulacijom održava konstantnost unutrašnje sredine organizma. To se može videti na već spomenutom održavanju ravnoteže vode i soli, u kojem sudeluju hormoni kore nadbubrežne žlezde. Ali, osim hormona, u održavanju balansa sudeluju krvni pritisak, brzina cirkulacije i dilatacija odnosno vazokonstrikcija krvnih sudova, što sve reguliše nervni sistem. Prema tome, za normalnu funkciju organizma i odvijanje metaboličkog procesa svi endokrini i nervni faktori moraju biti usklađeni. Svako narušavanje tog sklada izaziva poremećaje u regulaciji što se manifestuje u obliku raznih bolesti.

9.2 PRINCIPI HORMONALNE REGULACIJE

Regulacija lučenja nekih hormona obuhvata funkciju na tri nivoa. Ključnu ulogu u tome ima hipofiza koja se zato i naziva nadređena žlezda (master gland).Prednji režanj hipofize (adenohipofiza) luči nekoliko tzv. tropnih ili trofičnih hormona, koji deluju na lučenje drugih, perifernih endokrinih žlezda. Svaki tropni hormon deluje na određenu perifernu endokrinu žlezdu, koja u odnosu na tropni hormon predstavlja njegovu ciljnu (target) žlezdu.

Tabela 9.1 - Tropni hormoni i njihove ciljne žlezde

Hormon prednjeg režnja hipofize Ciljna endokrina žlezda

Tirotropin (tiroidni stimulišejući hormon, TSH) tiroideja

Kortikotropin (adrenokortikotropni hormon, ACTH)nadbubrežna žlezda (kora)

Somatropin (somatotropni hormon, hormon rasta, STH)nema posebne žlezde,celi organizam

Folitropin (folikularni stimulišejući hormon, FSH) jajnik

Lutropin (luteinizirajući hormon, LH) jajnik

Prolaktin (luteotropni hormon, laktogeni hormon, LTH) mlečne žlezde

Na izlučivanje hipofiznih tropnih hormona utiče hipotalamus. U hipotalamusu se stvaraju specifični peptidi, tzv. liberini ili releasing-faktori koji se prenose u hipofizu putem hipotalamo-hipofiznog vaskularnog sistema i izazivaju u hipofizi otpuštanje odgovarajućih tropnih hormona (CRF, kortikotropni relizing-faktor, TRF-tirotropni relizing-faktor itd.). Na taj način hipotalamus kontroliše lučenje hipofize, a ova lučenje perifernih endokrinih žlezda. To ćemo ilustrovati na primeru hipofizno-nadbubrežnog sistema, tj. regulacije lučenja hormona kore nadbubrežne žlezde:

neurosekret (kortikoliberin, CRF) prenosi se u prednji režanj hipofizeCRF stimuliše u hipofizi lučenje kortikotropina (ACTH), a ovaj

deluje u nadbubrežnoj (suprarenalnoj) žlezdi i stimuliše u njoj lučenje kortikosteroidnih hormona u krv.

Slika 9.1 - Regulacija lučenja kortikosteroida hipofizno-nadbubrežnim sistemom

Ta regulacija vrši se mehanizmom negativne povratne sprege. Smanjena koncentracija kortikosteroida u krvi delom stimuliše hipotalamus da luči više neurosekreta, što opet stimuliše lučenje ACTH iz hipofize, a delom deluje direktno na hipofizu da luči više ACTH. Kortikotropni hormon pak sa svoje strane uzrokuje pojačanu aktivnost nadbubrežne žlezde da luči više kortikosteroida u krv. Viša koncenracija kortizola u krvi deluje inhibitorno, deluje na hipotalamus da smanji sekreciju neurosekreta, što smanjuje lučenje ACTH i konačno kortikosteroida.

Navedeni mehanizam povratne sprege iziskuje dodatno tumačenje.

Regulacija povratnom spregom. Regulacija povratnom spregom (feedback-regulacija) može biti pozitivna ili negativna. Ako neki agens (stimulus) X povisuje varijablu A koja sa svoje strane povisuje drugu varijablu B, povišenje B može povratno uticati na A na dva načina: ili povišenje B uzrokuje dalje povišenje A, u kojem slučaju je to pozitivna regulacija povratnom spregom (pozitivni feedback), ili povišenje B izaziva smanjenje A, u kojem slučaju je to negativna regulacija povratnom spregom (negativni feedback). Naravno da se pozitivna ili negativna regulacija odnose i na suprotan slučaj, tj. sniženje A snizuje B, a ovaj onda snizuje A u slučaju pozitivne regulacije, ili sniženje A snizuje B koji onda povratno povisuje A u slučaju negativne regulacije povratnom spregom.U slučaju regulacije kortizola kortikoliberin (X) stimuliše ACTH (A) koji izaziva pojačano lučenje kortizola (B), a kortizol mehanizmom negativne povratne sprege deluje na smanjenje lučenja ACTH.Regulacija mehanizmom povratne sprege, i to pre svega negativna, vrlo je važna ne samo u kontroli hormonalne sekrecije nego uopšteno u metaboličkim procesima.

9.3 DELOVANJE HORMONA

Hormoni deluju hemijski izazivajući fiziološke reakcije u organizmu. Koliko je danas poznato, hemijsko delovanje hormona izaziva dve vrste reakcije:

aktivaciju adenilat-ciklaznog sistema i

kontrolu, odnosno indukciju genske aktivnosti

9.3.1 AKTIVACIJA SISTEMA ADENILAT-CIKLAZE

Na ovaj način deluju hormoni čije je delovanje brzo. Takvi su hormoni insulin, glukagon i neki peptidni hormoni kao vazopresin. Ti hormoni stimulišu adenilat-ciklazni sistem u ćelijskoj membrani. Hormon menja specifični receptor na membrani tako da se adenilat-ciklaza alosterički

aktivira te prevodi ATP u 3', 5'-ciklo AMP (cAMP). Stvoreni cAMP (naziva se još drugi glasnik, second messenger) izaziva u ćeliji aktivaciju nekih enzima i deluje na prenos u ćelijskoj membrani povećavajući propusnost membrane.

Stvoreni cAMP se brzo razgrađuje u ćeliji delovanjem jedne fosfodiesteraze na AMP i zato mu je delovanje brzo i kratko. Kofein i teofilin su inhibitori fosfodiesteraze i time produžavaju delovanje cAMP jer sprečavaju njegovu razgradnju (tome se pripisuje i terapeutsko delovanje kofeina).

9.3.2 KONTROLA GENSKE AKTIVNOSTI

Neki hormoni deluju na indukciju, tj. pojačanu sintezu odredjenih proteina i enzima u ciljnom organu. Smatra se da na taj način deluju neki steroidni hormoni.

Slika 9.2 - Delovanje hormona preko sistema adenilat-ciklaze

Slika 9.3 - Delovanje hormona na indukciju proteina

Hormon se preko citoplazmatskog receptora translocira na receptor u ćelijskom jezgru i veže s molekulom proteinskog represora koja blokira DNA. Na taj se način DNA deblokira i omogućava sintezu informacione RNA (mRNA), koja prelazi u citoplazmu i na ribosomima služi kao kalup za sintezu proteina i enzima.

Izgleda da neki hormoni deluju preko oba navedena mehanizma, i indukcijom i aktivacijom adenilat-ciklaze. Za hormone je karakteristično da deluju u vrlo malim količinama.

9.4 PODELA HORMONA

Hormoni su po hemijskoj građi vrlo različiti jedinjenja, a delovanje im je zavisno upravo od hemijske strukture. Najmanje promene u toj strukturi izazivaju promene u delovanju. Tako npr. ulazak jedne metilne grupe u aminogrupu noradrenalina menja ovaj u adrenalin, čija je aktivnost mnogo slabija. Isti je slučaj s vrlo aktivnim estradiolom, koji hidroksilacijom na C 16 atomu prelazi u vrlo slabo aktivni estriol, itd.

Prema građi, hormoni se dele na:

steroidne hormone (seksualni hormoni, kortikosteroidi),

hormone nastale od aminokiselina (tiroksin, adrenalin),

peptidne hormone (vazopresin, insulin, glukagon),

proteinske hormone (somatropin, prolaktin, tirotropin i dr.)

Pregled raznih hormona, odgovarajućih žlezda koje ih luče te njihovih ciljnih organa i načina delovanja prikazan je u tabeli 9.2.

Tabela 9.2 - Hormoni, endokrine žlezde, ciljni organi i delovanje

Hormon Žlezda Ciljni organ Delovanje

Steroidni hormoni

estrogeni (E2,E3)

jajnik (folikul) ženski akcesorni organi

proliferacija uterusa, razvoj sekundarnih polnih karakteristika

progesteron jajnik (žuto telo)

ženski akcesorne reproduktivne strukture

priprema jajne stanice za implantaciju, održanje trudnoće

testosteron semenik muški akcesorni organi

razvoj sekundarnih polnih karakteristika

aldosteron nadbubrežna žlezda (kora)

bubrežni tubuli,celo telo

metabolizam soli - retencija Na, glukoneogeneza

kortizol nadbubrežna žlezda (kora)

celo telo metabolizam ugljenohidrata, masti,protein,antiimflamatorno, rezistencija na infekcije

Aminokiselinski hormoni

tiroksin (T4) štitnjača celo telostimulacija oksidacije, metabolička aktivnost organatrijoditironin

(T3)štitnjača celo telo

adrenalinnadbubrežna žlezda (srž)

simpatički receptori, etra,mišići,masno tkivo delovanje simpatikusa,

glikogenoliza, otpuštanje masti

noradrenalin

Peptidni hormoni

liberini hipotalamus hipofiza (prednji režanj)

stimulacija tropnih hormona

kortikotropin (ACTH)

hipofiza(prednji režanj)

kora nadbubrežne žlezde

stimulacija stvaranja i sekrecije kortikosterioda

vazopresin antidiuretski hormon (ADH)

hipofiza(zadnji režanj)

arteriole, bubrežni kanali

povišenje krvnog pritiska, fakultativna reapsorpcija vode

oksitocin hipofiza(zadnji režanj)

glatki mišići (uterus, mlečne žlezde)

kontrakcije uterusa, transport sperme, laktacija

Tabela 9.2. Nastavak

Hormon Žlezda Ciljni organ Delovanje

melanotropin (melanoforni stimulišejući hormon MSH)

hipofiza (srednji režanj)

koža tamnjenje kože

parathormon (PTH)

paratiroideja kosti, bubreg, gastroin-testinalni trakt

regulacija i mobilizacija kalcijuma i fosfora

kalcitonin (tirokalcitonin)

štitnjača snižavanje kalcijuma u krvi

relaksin jajnik simfiza, uterus relaksacija, porodaj

inzulin gušterača razna tkiva snižavanje glukoze u krvi, lipogeneza

glukagon gušterača jetra povisuje koncentraciju glukoze u krvi

Proteinski hormoni

somatropin (hormon rasta,STH)

hipofiza (prednji režanj)

celo telo rast, metabolizam, metabolizam glukoze

tirotropin (TSH) hipofiza (prednji režanj)

štitnjača stimulacija stvaranja i sekrecije tiroidnih hormona

folitropin (FSH) hipofiza (prednji režanj)

jajnik, semenik rast folikula, sekrecija estrogena i ovulacija, spermatogeneza

lutropin (LH) hipofiza (prednji režanj)

jajnik, semenik stvaranje žutog tela, islučivanje progesterona, izlučivanje androgena

prolaktin (laktogeni hormone LTH, LMTH)

hipofiza (prednji režanj)

mlečna žlezda stimulacija mlečnih žlezda i sekrecija mleka

eritropoetin bubreg koštana srž sazrevanje eritrocita

sekretin gastrointestinalni trakt

gušterača izlučivanje alkalnog soka

pankreozimin gastrointestinalni trakt

gušterača sekrecija enzima

Tabela 9.2. Nastavak

Hormon Žlezda Ciljni organ Delovanje

holecistokinin gastrointestinalni trakt

žučni mehur kontrakcija i pražnjene

enterogastringastrointestinalni trakt želudac inhibicija sekrecije

gastringastrointestinalni trakt želudac lučenje kiseline

koriogonadotropin posteljica (HCG)

posteljica jajnikstimulacija stvaranja seksualnih hormona

9.5 POREMEĆAJI HORMONSKE SEKRECIJE I PRINCIPI LABORATORIJSKE DUAGNOSTIKE

Poremećaji hormonalnog izlučivanja mogu biti dvojaki. Ili se luči suviše hormona ili premalo. Uzroci takođe mogu biti dvojaki. Poremećaj može izazvati primarni defekt u samoj endokrinoj žlezdi, kao što je slučaj prekomernog lučenja hormona kod tumora žlezda (npr. feohromocitom), ili sekundarni, zbog poremećaja u kontrolnom mehanizmu lučenja nekog hormona.

Utvrdivanje uzroka poremećaja, radi li se o defektu same žlezde ili o poremećaju kontrolnog mehanizma, primarni je zadatak endokrinološke dijagnostike. Laboratorijski nalazi su pri tome vrlo važni. Određuje se koncentracija pojedinih hormona u krvi i urinu, a često je potrebno izvesti i tzv. stimulativne i supresivne testove.

Stimulativni testovi rade se za ispitivanje nedovoljne sekrecije hormona. U tu svrhu se bolesniku daje odgovarajući preparat tropnog hormona, koji normalno stimuliše izlučivanje i nakon toga meri koncentracija hormona. Ako se pri tome sekrecija hormona pojača, to dokazuje da nema primarnog defekta žlezde. Ako se pak sekrecija hormona ne intenzivira i žlezda ne reaguje, to ukazuje da je defekt u samoj endokrinoj žlezdi.

Kod supresivnih testova bolesniku se daje preparat koji inhibira sekreciju ispitivanog hormona, a zatim meri koncentracija hormona. Ako se sekrecija ne smanji, to ukazuje da je prisutan poremećaj kontrolnog mehanizma. Takav je test, na primer, test s deksametazonom koji inhibira izlučivanje kortikotropina. Ako se posle toga smanji sekrecija kortizola ili ukupnih 17-oksosteroida, to pokazuje da je kontrolni

mehanizam delatan, a ako takav učinak izostane, to pokazuje da je poremećen kontrolni mehanizam hipotalamus-hipofiza-nadbubrežna žlezda. Ti se testovi rade kod prekomernog izlučivanja hormona.

9.6. STEROIDNI HORMONI

Svi steroidni hormoni imaju osnovnu strukturu koja se sastoji od ciklopentanoperhidrofenantrenskog prstena. Taj prsten sadrži tri hidrirana šesteročlana prstena, fenantren, na koje je vezan još jedan peteročlani prsten. Steroidni hormoni imaju do 21 C-atom. Prsteni se označavaju velikim početnim slovima, a C-atomi brojevima:

Ova osnovna struktura steroida ima prostornu konfiguraciju stolice:

Istu osnovnu strukturu imaju steroli i žučne kiseline. U steroidne hormone ubrajaju se polni hormoni i kortikosteroidi. Polni hormoni su androgeni, estrogeni i progesteron. Na 10. i 13. C-atomu steroidnog prstena vezane su metilne grupe, a na 17. C-atomu sporedni lanac po kojem se pojedine grupe sterola i steroida međusobno razlikuju (tabela 9.3).

Tabela 9.3 - Broj C-atoma u pojedinim steroidnim jedinjenjima

Dužina lanca na 17. C-atomu Ukupni broj C-atoma u molekuli

Steroli (holesterol) 8-10 27-29

Zučne kiseline 5 24

Kortikosteroidi i progesteron 2 21

Androgeni — 19

Estrogeni — 18

Trodimenzionalna struktura steroida rezultira u pojavi različitih izomera, što je vrlo važno za njihovo fiziološko delovanje. Prsteni A i B imaju dva zajednička C-atoma (5. i 10.), te s obzirom na položaj H-atoma na C-5. i CH3 grupe na C-10. atomu u odnosu na ravan prstena, postoje 2 izomerna oblika.

Ako su H i CH3 grupa obe iznad ravni prstena, to se smatra normalnom ili cis-formom. Ako je H ispod ravni prstena, onda je to trans ili alo-izomer. Isto je i s B/C i C/D-prstenima, ali oni su kod prirodnih steroidnih hormona uvek u trans-obliku.

Taj prostorni smeštaj supstituenata označava se prema položaju metilnih grupa (C-18. i C-19.), koje leže uvek iznad ravni prstena. Cis-položaj, iznad ravni prstena, označava se kao β-konfiguracija i s punom crtom, dok je α-konfiguracija označena isprekidanom crtom i označava da je supstituent orijentisan ispod ravni ciklopentanoperhidrofenantrena.

Razni steroidni hormoni su derivati tri osnovna ugljovodonika, estrana, androstana i pregnana, iz kojih nastaju uvođenjem dvostrukih veza i supstituenata na mesto vodikovih atoma ili bočnog lanca na C-17. Atomu ciklopentanoperhidrofenantrenskog prstena.

Kada se upotrebljavaju hemijski nazivi za steroidne hormone, uzimaju se razni prefiksi kojima se označavaju karakteristike prstena i prisutnost supstituenata.

Tabela 9.4 - Prefiksi i sufiksi u označavanju steroida

Prefiksi i sufiksi Šta označava

Prefiks

hidroksi- ili oksi- prisutnost hidroksilne grupe

keto- ili okso prisutnost ketonske grupe

deoksi-ili dezoksi- zamena OH-grupe s vodonikom

dehidro- gubitak vodonikovih atoma sa susednih C-atoma

dihidro- adicija dva vodonikova atoma

cis- prostorna konfiguracija supstituenta

trans- prostorna konfiguracija supstituenta

α- supstituent u trans-položaju prema CH3 na C-10.

β- supstituent u cis-položaju prema CH3 na C-10.

epi-izomerija na nekom C-atomu koji nije zajednički dvama prstenima

Δn položaj dvostruke veze u molekulu (n označava broj C-atoma na kojem je dvostruka veza)

Sufiks

-al aldehidna grupa

-ol hidroksilna grupa

-on ketonska grupa

-an zasićeni ugljikovodonik

-en nezasićeni ugljikovodonik

Broj C atoma

Matični ugljovodonik Hormon Napomena

C18

5α —estranEstradiol - 17β /Estra-1,3,5/10/trien-3,17p-diol/

Estran ima samo jednu CH3 grupu i nema bočnog lanca. To su jedini steroidi koji poseduju aromatični prsten /A/

5β-estranEstratrien

/Estra-1,3,5/10/-trien

C19

5a-androstanAndrosteron /3α — hidroksi — 5α — androstan— 17 —on

Androstan nema bočnog lanca na C—17.Ima dve CH3 grupe

5β-androstanEtiokolanolon /3α-hidroksi-5β-androstan-17-on

Broj C atoma

Matični ugljovodonik Hormon Napomena

C21

5α —pregnan Estradiol - 17β /Estra-1,3,5/10/trien-3,17p-diol/

Pregnan ima dve CH3 grupe i etilnu grupu na C-17 koja je u cis položaju prema metilnim gru-pama

5β-pregnan Pregnandiol /5β - pregnan - 3α,20α - diol /

Slika 9.4 - Osnovni ugljovodonici i hormoni koji iz njih nastaju

Upotrebu navedenih prefiksa i sufiksa prikazujemo na primeru kortizola:11β, 17α, 21-trihidroksipregn-4-en-3,20-dion (kortizol)

Iz navedene hemijske oznake za kortizol vidi se da su na osnovnom pregnanskom ugljovodoniku (pregn) tri vodonika zamenjena hidroksilnim grupama u položaju 11, 17. i 21, i to da je OH na 11. C-atomu u β-položaju, dok je OH na 17. C-atomu u α-položaju, da je između C-4. i C-5. atoma dvostruka veza (4-en) te da su na trećem i dvadesetom C-atomu dve ketonske grupe (3,20-dion).

9.6.1 BIOSINTEZA STEROIDNIH HORMONA

Steroidni hormoni nastaju iz holesterola, a kako biosinteza holesterola započinje od acetata, to se acetat i holesterol podjednako mogu smatrati pretečama steroida. U nadbubrežnim žlezdama, jajnicima i semenicima steroidni se hormoni stvaraju od acetata ili holesterola nizom reakcija u kojima sudeluju razni enzimi iz grupe hidroksilaza, dehidrogenaza, izomeraza i desmolaza (liaza). Upravo o prisutnosti pojedinih enzima u pojedinim od navedenih endokrinih žlezda zavisi koji se hormoni sintetizuju u toj žlezdi. Tako se kortikosteroidi stvaraju samo u nadbubrežnoj žlezdi, jer samo kora nadbubrežne žlezde sadrži dve hidroksilaze, 11-hidroksilazu i 21-hidroksilazu, potrebne za sintezu kortikosterona. Osim ovih hidroksilaza, za sintezu kortizona i kortizola potrebna je i 17 α-hidroksilaza. Bočni lanac holesterola na 17. C-atomu otcepljuje se katalitičkim delovanjem desmolaza. Delovanjem 17, 20-desmolaze otcepljuje se celi lanac pa nastaju androgeni, steroidi s 19 C-atoma, a delovanjem 20, 22 desmolaze razlaže se veza izmedu 20. i 22. C-atoma, pa nastaje pregnenolon steroid s 21 C-atomom.

Izomeraze kataliziraju premeštaj dvostruke veze. Posebno je važna Δ-ketosteroid-izomeraza koja premešta dvostruku vezu izmedu 5. i 6. C-atoma u poziciju između 4. i 5. C-atoma. Dehidrogenaze katalizuju reverzibilne oksidoredukcijske reakcije u kojima sudeluju NAD ili NADP, odnosno njihove redukovane forme. Tako postoje 3 a-hidroksisteroid dehidrogenaza, 3 β-hidroksisteroid dehidrogenaza, 11 β-hidroksisteroid dehidrogenaza, 17 α-hidroksisteroid dehidrogenaza i dr. Delovanje tih enzima može se videti na primeru stvaranja progesterone.

Slika 9.5. -Biosinteza progesterona iz holesterola

U jetri se steroidni hormoni konjuguju s glukuronskom i sumpornom kiselinom, čime im se povećava rastvorljivost u vodi, te se tako konjugovani izlučuju iz tela urinom. Metabolizam steroidnih hormona, koji osim konjugacije obuhvata procese hidroksilacije i dehidrogenacije, odvija se najvećim delom u jetri, a manjim i u bubregu te gastrointestinalnom traktu. Metaboličkim se procesima hormoni većinom inaktiviraju.

9.6.2 HORMONI KORE NADBUBREŽNE ŽLEZDE

Kora nadbubrežne žlezde luči niz hormona. Pod kontrolom hipotalamusa iz adenohipofize se izlučuje kortikotropin (ACTH), koji stimuliše nadbubrežnu žlezdu na stvaranje nekoliko hormona što ih zajednički nazivamo kortikosteroidi. Međutim, uz kortikosteroide koji se stvaraju samo u korteksu nadbubrežne žlezde, tu se manjim delom stvaraju još androgeni, estrogeni i progesteron, koji se inače većim delom stvaraju u testisima (androgeni) i ovariju (estrogeni, progesteron). Svi kortikosteroidi sadrže 21 C-atom, te svi imaju dvostruku vezu između 4 i 5 atoma (Δ4), ketonsku grupu na C-3. atomu i na C-17. bočni lanac — CO —CH2OH u β-položaju. Neki imaju na C-17. atomu još OH-grupu u a-položaju te ketonsku ili β-hidroksi grupu na 11-atomu. Svi imaju metilne grupe vezane na C-10. i C-13. atomu, osim aldosterona kojem je metilna grupa na C-13. atomu zamenjena aldehidnom grupom.

Slika 9.6 - Hemijska struktura kortikosteroida

Razni kortikosteroidi, iako su strukturno svi vrlo slični, imaju različito fiziološko delovanje. Te razlike u biološkoj aktivnosti uzrokovane su supstituentima na 11. i 17. ugljinikovom atomu, odnosno 13. C-atomu kod aldosterona.

Kortikosteroidi ispoljavaju regulatorno delovanje na metabolizam ugljenohidrata, soli i vode. Prema tome na koji od tih procesa deluju, dele se na glukokortikoide i mineralokortikoide.Fiziološko delovanje na metabolizam ugljenohidrata, suprotno insulinu, i to u smislu stimulacije glukoneogeneze, razgradnje lipida i proteina imaju sledeći glukokortikoidi: kortikosteron, 11-dehidrokortikosteron, kortizol i kortizon.

Mineralokortikoidi su aldosteron i 11-dezoksikortikosteron. Oni kontrolišu promet vode i soli, delujući na prolaz natrijuma i kalijuma kroz ćelijske

membrane, na reapsorpciju natrijuma i ekskreciju kalijuma u bubrezima. Zato se još nazivaju salt and water-hormonima.Od navedenih kortikosteroida samo koncentracija kortizola deluje pomoću mehanizma negativne povratne sprege na lučenje ACTH. Kontrola aldosterona nije samo zavisna od ACTH, nego i od jetrenog angiotenzina i bubrežnog renina, koji svojim delovanjem na krvni pritisak sudeluju u regulaciji prometa vode i soli. Glavni androgeni hormoni nadbubrežne žlezde su androstendion i dehidroepiandrosteron. Ta dva hormona ispoljavaju samo blago androgeno delovanje, a deluju i anabolički. Nemaju bočnog lanca na C-17. atomu pa sadrže samo 19 C-atoma.

Biosinteza hormona kore nadbubrežne žlezde

Svi hormoni kore nadbubrežne žlezde nastaju preko holesterola iz aktivnog acetata. Holesterol, pregnenolon i progesteron su na raznim stupenima u metaboličkom procesu od acetata, pa svi oni mogu biti prekursori kortikosteroida, androgena i estrogena. U biosintezi ovih hormona sudeluje niz enzima.

Holesterol nastao iz acetata preko mevalonske kiseline, prelazi u pregnenolon. Ova se reakcija odvija tako da se deo bočnog lanca holesterola otcepi katalitičkim delovanjem enzima 20,22-dezmolaze. Od pregnenolona daljnje reakcije mogu teći u dva smera. Jedan je put da dehidrogenacijom i izomerizacijom pregnenolon prelazi u progesteron, koji hidroksilacijom na C-21. atomu prelazi u 11-deoksikortikosteron, a ovaj daljnjom hidroksilacijom na C-ll. atomu u kortikosteron, te de-lovanjem 18-hidroksilaze i 18-dehidrogenaze njegova metilna grupa na C-18. atomu prelazi u aldehidnu grupu i tako nastaje aldosteron.

Ako na progesteron prvo deluje 17 α-hidroksilaza, nastaje iz progesterona 17α-hidroksiprogesteron, koji daljnjom hidroksilacijom prelazi u 11-dezoksikortizol i ponovnom hidroksilacijom u kortizol. Kortizol konačno prelazi u kortizon, koji umesto hidroksilne grupe na C-ll. atomu ima ketonsku grupu. Hormone koji nastaju tim putem određujemo zajedno kao tzv. 17-oksogene steroide. Drugi put je da hidroksilacijom pregnenolona na C-17. atomu nastaje 17β-hidroksipregnenolon. Delovanjem 17,20-desmolaze iz ovog nastaju androgeni, i to prvo

dehidroepiandrosteron koji izomerizuje u androstendion, a ovaj delovanjem 17-β dehidrogenaze u testosteron. Testosteron se redukuje i dehidrogenizuje u androsteron odnosno etioholanolon. Ti se androgeni odredjuju zajedno kao 17-oksosteroidi .

Na kraju androstendion i testosteron aromatizacijom A-prstena mogu preći u estron ili estradiol.

Metabolizam hormona kore nadbubrežne žlezde

Inaktivacija i razgradnja kortikosteroida zbiva se u jetri. Tu se uz Δ4-5β-reduktazu i 3α-dehidrogenazu redukuje dvostruka veza izmedu 4. i 5. C-atoma i keto-grupa na C-3. atomu, te nastaju tetrahidroderivati (3α-hidroksi-5β-dihidro jedinjenja) koji se konjuguju s glukuronskom i sumpornom kiselinom i izlučuju mokraćom. Izlučuje se i nešto heksahidro-jedinjenja ili kortola, koji nastaju daljnjom redukcijom keto-grupe na C-20. atomu, te malo 11-oksi ili 11-keto-17-ketosteroida, koji nastaju otcepljenjem lanca na C-17. atomu. Na slici 9.8 prikazan je metabolizam kortizola, a na isti se način metaboliziraju kortizon, kortikosteron, aldosteron, 11-dezoksikortizol i 11-dezoksikortikosteron.

Navedeni se metabolitički put menja u slučaju deficita enzima potrebnih za normalnu sintezu kortikosteroida. Takav je slučaj u adrenogenitalnom sindromu, kada se zbog toga stvara više metabolita koji se pod normalnim uslovima inače stvaraju samo u vrlo malim količinama. U pomanjkanju 21-hidroksilaze, koja katalizira prelaz 17α-hidroksiprogesterona u kortizol, nastaje tako pregnantriol i nje-govi derivati. Osim toga, budući da se ne stvara kortizol koji negativnom povratnom spregom koči izlučivanje ACTH, ovaj se poslednji nekontrolisano luči i stimuliše nadbubrežnu žlezdu izazivajući njezinu hiperplaziju i pojačano stvaranje drugih C-21 hormona i androgena.Isto se tako u nedostatku 21-hidroksilaze ne stvara aldosteron, što dovodi do gubitka Na i CI, tzv. salt loosing sindroma.

Kortikosteroidi u krvi

Od svih 17-hidroksikortikosteroida u krvi na kortizol otpada oko 80%. Kortizol se u plazmi nalazi delom vezan za albumine i jedan α-globulin koji ga-specifično veže i naziva se transkortin (CBG, Cortisol binding globulin). Transkortin se stvara u jetri. Njegova je funkcija da štiti kortizol od inaktivacije i konjugacije u jetri. Time se osigurava dovoljno kortizola u cirkulaciji. Fiziološki je aktivan samo slobodni, nevezani kortizol, kojeg ima u plazmi oko 6% ukupnog kortizola.

Hipotalamus, adenohipofiza i kora nadbubrežne žlezde čine tzv. osovinu hipotalamus-hipofiza-nadbubrežna žlezda. ACTH se iz hipotalamusa pod uticajem kortikoliberina (CRF) izlučuje periodično.Razmaci u lučenju

ACTH kraći su ujutro, a duži naveče. Kortizol se luči pet do deset minuta nakon stimulacije ACTH-om.

Slika 9.7 - Biosinteza hormona nadbubrežne žlezde

Slika 9.8 – Metabolizam kortizola

Zato je koncentracija kortizola u plazmi veća ujutro, između 7 — 9 sati, a najniža pre spavanja. Taj se ritam gubi kod hiperfunkcije nadbubrežne žlezde.

Estrogeni u trudnoći, pri uzimanju kontraceptiva i terapiji, izazivaju porast koncentracije transkortina u plazmi, pa zato i koncentracije kortizola, ali je taj kortizol vezan i nije fiziološki aktivan.

Kortikosteroidi se određuju i u krvi i u urinu. Određivanjem koncentracije u plazmi utvrđuje se intenzivnost lučenja i delovanja na tkiva, dok podaci o dnevnom izlučivanju kortikosteroida u urinu daju uvid u funkclju kore nadbubrežne žlezde;

Slika 9.9 - Stvaranje pregnantriola i njegovih derivata u adrenogenitalnom sindromu zbog deficita 21-hidroksilaze i blokiranog pretvaranja

hidroksiprogesterona u kortizol

Poremećaji funkcije nadbubrežne žlezde

Određivanje kortikosteroida, androgenih hormona i ACTH te supresivni i stimulativni testovi važni su za evaluaciju funkcije nadbubrežne žlezde i hipofize. Poremećaji funkcije nadbubrežne žlezde mogu izazvati hiperfunkciju ili hipofunkciju žlezde, a hipofunkcija može biti primarna zbog poremećaja same nadbubrežne žlezde ili sekundarna zbog nedostatka ACTH i poremećaja kontrolnog mehanizma. Hiperfunkcija nadbubrežne žlezde očituje se u prekomernom lučenju kortizola, što je slučaj kod Cushingova sindroma. Uzrok toj bolesti može biti karcinom ili adenom kore nadbubrežne žlezde ili hiperplazija nadbubrežnih žlezda zbog prekomernog lučenja ACTH, do čega dolazi kod bazofilnog adenoma hipofize te ektopičnog stvaranja ACTH u bronhijalnom adenomu ili karcinomu, adenomu pankreasnih ostrvaca multiplih endokrinoloških adenoma ili Zollinger-Ellisonova sindroma

Hiperaktivnost suprarenalnih žlezda može rezultirati i pojačanim lučenjem aldosterona u primarnom aldosteronizmu (Connov sindrom) ili prekomernim izlučivanjem androgena kod hiperplazije ili karcinoma nadbubrežne žlezde.

Hipofunkcija nadbubrežne žlezde, Addisonova bolest, posledica je propadanja kore nadbubrežne žlezde zbog tuberkuloze, idiopatske atrofije kao posledice autoimunih procesa, ili amiloidoze, infekcije ili metastaza u nadbubrežnoj žlezdi. Disfunkcija nadbubrežnih žlezda u adrenogenitalnom sindromu rezultat je deficita pojedinih enzima, potrebnih za sintezu kortizola.

Laboratorijski nalazi u bolestima nadbubrežne žlezde

Krv za odredivanje kortizola ili 17-hidroksikortikosteroida uzima se u 8 ili 9 sati ujutro i oko 20 ili 23 sata naveče, da bi se ispitao ritam lučenja. Normalna je koncentracija kortizola u serumu uveče oko polovine koncentracije ujutro. Kod Cushingova sindroma jutarnje su i večernje koncentracije povišene, iako se može ujutro naći i normalna koncentracija. Međutim, izostaje ritam lučenja. Slobodni kortizol ili 11-hidroksikosterodi su povišeni u urinu, a deksametazon ne suprimira koncentraciju u serumu, osim ako je uzrok bolesti hiperfunkcija hipofize. Izlučivanje 17-oksogenih steroida jako je povećano u urinu ako je uzrok bolesti karcinom nadbubrežne žlezde ili ektopično lučenje ACTH (adenom bronha), za razliku od mogućih normalnih vrednosti kod hiperfunkcije hipofize ili adenoma nadbubrežne žlezde. Sličnu sliku u urinu daju i 17-oksosteroidi.

Za difefenciranje uzroka Cushingova sindroma vrlo je korisno odredivanje koncentracije ACTH u serumu. Koncentracija mu je jako snižena u tumoru nadbubrežne žlezde, pa se ponekad ne može ni registrovati, dok je osetno povišena ako je uzrok bolesti ektopično stvaranje ACTH, ili umereno povišena ako je uzrok bolesti poremećaj hipofize. Stimulacija s ACTH ili tetrakozaktrinom ne izaziva reakciju u slučaju tumora nadbubrežne žlezde, dok kod hiperplazije reakcija je normalna ili malo intenzivnija.

Test s metopironom obično izaziva pojačano izlučivanje kortikosteroida mokraćom ako je Cushlngov sindrom izazvan hiperplazijom nadbubrežne žlezde, a reakcija obično izostaje, ako je uzrok karcinom ili adenom nadbubrežne žlezde.

Kod hipofunkcije nadbubrežne žlezde treba utvrditi je li hipofunkcija primarna, tj. Addisonova bolest, ili sekundarna. U oba slučaja koncentracija je kortizola odnosno 11-hidroksikortikosteroida u serumu niska, a isto tako i izlučivanje 17-oksogenih i 17-oksosteroida. Za diferencijalnu dijagnozu ključni je test odredivanje koncentracije ACTH u serumu.

U Addisonovoj je bolesti koncentracija ACTH visoka zbog niske koncentracije kortizola u serumu (kontrola povratnom spregom), dok je kod sekundarne hipofunkcije ACTH u serumu snižen, bilo da je poremećaj (npr. tumor) u hipofizi, bilo u hipotalamusu. Takode, stimulacijom s ACTH ili tetrakozaktrinom kod Addisonove bolesti izostaje reakcija, dok u sekundarnoj hipofunkciji reakcija nastupa tek postupno. Osim tih endokrinoloških testova za dijagnozu Addisonove bolesti važno je određivanje elektrolita.

U krizama kod te bolesti postoji deficit aldosterona, pa to izaziva gubitak natrijuma u urinu i često hiponatremiju, hiperkalemiju i metaboličku acidozu.

Pregled biokemijskih promena i karakterističnih nalaza u poremećajima funkcije nadbubrežne žlezde prikazan je u tabeli 9.4

9.7 MUŠKI POLNI HORMONI — ANDROGENI

Androgeni deluju na polni sistem muškaraca i uzrokuju razvoj muških sekundarnih polnih karakteristika. Izlučuju se pod kontrolom hipofize, koja luči hormon što stimuliše intersticijske ćelije (LH) testisa na stvaranje androgena. Po hemijskoj strukturi, to su steroidi s 19 C-atoma. Neki od ovih hormona, ali ne svi, imaju dvostruku vezu izmedu 4. i 5. C-atoma, a na C-3. atomu imaju hidroksilnu ili ketonsku grupu. Biološka aktivnost im zavisi od suptituenta na C-17. atomu. Glavni androgeni hormoni su testosteron, epitestosteron, androstendion, androstan i de-hidroepiandrosteron.

Slika 9.10 - Hemijske strukture androgena

Biološki je najaktivniji testosteron, a tu aktivnost odreduje OH-grupa na C-17. atomu u β-položaju. Promenom prostornog položaja ove hidroksilne grupe u α-položaj, kao što je to kod epitestosterona, jako se smanjuje aktivnost dok ketonsku grupu, poseduju samo oko 12 % odnosno 10 % biološke aktivnosti testosterone.

Androgeni se stvaraju u semenicima, nadbubrežnoj žlezdi i jajniku. Testosteron se stvara uglavnom u semenicima, dok se dehidroepiandrosteron stvara samo u nadbubrežnoj žlezdi. Androstendion se stvara, osim u testisima i nadbubrežnoj žlezdi, i u ovariju.

Biosinteza androgenih hormona

Kao što je prikazano na slici 9.11, androgeni nastaju preko pregnenolona i progesterona, iz acetata i holesterola koji su zajednički prekursori svih steroidnih hormona. Katalitičkim delovanjem 17,20-dezmolaze odvaja se bočni lanac na C-17. atomu hidroksiprogesterona i nastaju androgeni. Androstendion se dalje redukuje u testosteron delovanjem 17 β-hidroksisteroidne dehidrogenaze. Ova zadnja reakcija je reverzibilna, a ravnoteža reverzibilne reakcije u testisima pomaknuta je u smeru stvaranja testosterona, dok je u ovariju jako pomaknuta u smeru stvaranja androstendiona. Na isti se način u nadbubrežnoj žlezdi iz_17α-hidroksipregnenolona sintetizuje dehidroepiandrosteron. koji se može dalje oksidovati u androstendion i preći u testosteron.

Slika 9.11 - Biosinteza androgenih hormona

Metabolizam androgenih hormona

Testosteron i dehidroepiandrosteron prelaze, kao što se vidi, u androstendion. Pri tome na testosteron deluje 17β-hidroksisteroidna dehidrogenaza, a na dehidroepiandrosteron izomeraza i 3β-hidroksisteroidna dehidrogenaza. Redukcijom dvostruke veze u androstendionu između 4. i 5. C-atoma i dehidrogenacijom na C-3. atomu nastaju 2 izomera: a-izomerni oblik ili androsteron i etioholanolon koji ima H na C-5. atomu u β-položaju. Katalitičkim delovanjem 3β-hidroksisteroid dehidrogenaze nastaje pak epiandrosteron s OH-grupom na C-3. atomu u β-položaju.

Delovanjem 11-hidroksilaze metabolički nastaju 11-oksigenirani 17-ketosteroidi, androsteron i 11β-hidroksiandrostendion, koji se dalje metabolizuju u tetra-hidroderivate, a ovi mogu nastati i iz kortizola i kortizona..

U jetri se metaboliti androgena konjuguju sa sumpornom ili glukuronskom kiselinom, te se kao sulfati i glukuronidi izlučuju urinom. Dehidroepiandrosteron se konjuguje sa sumpornom kiselinom, dok se androsteron, etioholanolon i 11-oksigenirani 17-oksosteroidi izlučuju većinom kao glukuronidi. Svi ti metaboliti androgena u urinu nazivaju se zajedničkim imenom 17- oksosteroidi (17-ketosteroidi.)

U krvi je oko 98 % (muški) do 99 % (žene) cirkulirajućeg testosterona vezano za albumine i globuline. Biološki je aktivan samo slobodni testosteron.

Slika 9.12 - Metabolizam androgena

Dijagnostičko značenje ispitivanja androgenih hormona

Izlučivanje androgenih hormona i njihovih metabolita u urinu daje uvid u funkciju muških gonada, kao i u funkciju nadbubrežne žlezde u oba spola. Ta jedinjenja u urinu nazivamo zajedničkim imenom 17-oksosteroidi. Muškarci normalno izlučuju oko 45 μmola, a žene oko 35 μmola dnevno.

Smanjeno izlučivanje 17-oksosteroida nalazi se u muškaraca u primarnom (Klinefelterov sindrom) i sekundarnom hipogonadizmu (panhipopituitarizam) te u Addisonovoj bolesti. U žena je u Addisonovoj bolesti to sniženje još jače izraženo, jer je u njih nadbubrežna žlezda relativno više zastupljena kao izvor androgena.

Povećano izlučivanje 17-oksosteroida pojavljuje se u muškaraca kod tumora testisa, a u žena u hirsutizmu odnosno virilizmu, te kod hiperplazije i karcinoma nadbubrežne žlezde muškaraca i žena. Medutim, nalazi ukupnih 17-oksosteroida u urinu nisu uvek dovoljni za diferencijalnu dijagnostiku disfunkcije gonada ili nadbubrežne žlezde te ovarija, pa se pretrage proširuju i na određivanje pojedinih androgena, gonadotropina (LH) i stimulativne testove te na određivanje testosterona u serumu. Izlučivanje androsterona i etioholanolona, koji nastaju pre svega u semenicima, te samog testosterona u serumu ukazuje na funkciju testisa, dok je izlučivanje dehidroepiandrosterona pokazatelj funkcije nadbubrežne žlezde.

Za dijagnozu adrenogenitalnog sindroma važan je odnos 17-ketosteroida i 11 β-oksigeniranih -17-ketosteroida, koji je kod blokirane 11β-hidroksilacije i, zbog toga, onemogućenog stvaranja kortizola, povećan (normalno 0,10 —0,62). Stimulativni testovi provode se stimulacijom korionskim gonadotropinom (HCG, human choriogonadotropic hormone), klomifenom ili lutropinom (LH).

Radioimunološki testovi omogućuju danas i određivanje testosterona u krvnom serumu. Testosterona u serumu muškaraca ima prosečno oko 23 nmol/L, a u žena oko 1,7 nmol/L. Budući da se testosteron u muškarca stvara i izlučuje iz testisa, njegova je koncentracija zavisna od funkcije Leydig-ovih ćelija. Kod žena nastaje metabolički iz ostalih androgena i zavisi od funkcije nadbubrežne žlezde i ovarija.

Testosteron je u serumu muškaraca snižen u primarnom i sekundarnom hipogonadizmu različite geneze (Klinefelterov sindrom i druge hromosomalne promene, hipopituitarizam, enzimski defekti sinteze androgena). Takođe je snižena koncentracija testosterona u zakasnelom pubertetu dečaka, a njegova niska koncentracija je, osim niskog

gonadotropina, u impotenciji prvi znak poremećaja u osi hipotalamus-hipofiza i poremećene kontrole lučenja androgena. Povišena koncentracija testosterona nalazi se u malignim tumorima testisa i hiperplaziji te u tumoru nadbubrežne žlezde kod muškaraca i žena. Kod žena je povišen u hirsutizmu i virilizmu zbog tumora nadbubrežne žlezde i ovarija te kod bolesti policističnih jajnika.

Vidimo da promene koncentracije serumskog testosterona i urinom izlučenih 17-oksosteroida uglavnom koreliraju, ipak u nekim slučajevima valja odredivati oboje. Naprimer, u žena s hirsutizmom i virilizmom ovi mogu biti posledica tumora ovarija, karcinoma ili hiperplazije nadbubrežne žlezde. Ako je testosteron u serumu visok, a izlučivanje 17-oksosteroida normalno ili malo povećano, androgeni obično potiču iz ovarija, dok su kod karcinoma ili hiperplazije nadbubrežne žlezde i testosteron u serumu i 17-oksosteroidi u urinu visoki.

9.8 ŽENSKI POLNI HORMONI - ESTROGENI

Biosinteza estrogena

Estrogeni nastaju na jedinstvenom putu biogeneze steroidnih hormona iz acetata preko holesterola i progesterona, a mogu nastati i iz androgena. Sinteza progesterona i testosterona već je pre opisana. Daljnji put biosinteze estrogena odvija se na taj način da se prsten A steroidne strukture aromatizuje. Pri tome se prvo hidroksiluje CH3 grupa na C-19. atomu, što katalizira enzim 19-hidroksilaza. Time nastaje 19-hidroksitestosteron na koji dalje deluje enzim 19-oksidaza i prevodi ga u 19-oksotestosteron. Na 19-oksotestosteron deluje zatim enzim 10,19 desmolaza, pa se C-19. i vodonik sa C-l. atoma otcepljuju kao formaldehid, a izmedu C-l. i C-10. nastaje dvostruka veza. Nastali 3-okso-androst-l(10), 4-dien spontano se aromatizuje u estradiol-17β. Na analogan način nastaje iz androsten-diona estron. Iako su reakcije izmedu testosterona i androstendiona kao i estradiol-17β i estrona reverzibilne, ipak je put nastanka estradiola iz testosterona važniji.

Biosinteza estrogena u trudnoći razlikuje se od one u negravidnih žena. U trudnoći ie glavni izvor estrogena placenta, a izlučivanje estrogena tokom trudnoće postupno raste i do deseterostrukih količina. I dok se u jajniku najvećim delom stvara estradiol-17β, koji se tek metabolizuje u krajni svoj produkt estriol, placenta najvećim delom luči već stvoreni estriol. Međutim, placenta nema potrebnih enzima za sintezu estrogena iz prekursora acetata, holesterola i progesterona, nego koristi već stvoreni testosteron i androstendion u organizmu majke ili fetusa. U posteljici se samo izvodi aromatizacija A-prstena za koju posteljica poseduje potrebne enzime. Placenta ne poseduje ni enzim 16α-

hidroksilazu, nego se ta nalazi u suprarenalci i jetri fetusa. Tako placenta prima već gotovi prekursor hidroksiliran na C-16. atomu potreban za stvaranje estriola, pa je glavni prekursor placentarnog estradiola 16α-dehidroepiandrosteron koji luči suprarenalka fetusa kao sulfatni konjugat.

Osim enzima potrebnih za aromatiziranje A-prstena, placenta poseduje i vrlo aktivnu sulfatazu i Δ5-3β-hidroksisteroid dehidrogenazu-izomerazu potrebne za hidrolizu konjugovanog 16α-hidroksi-dehidroepiandrosterona i pretvaranje Δ5 u Δ4 derivat. Kako se u fetusu stvara prekursor 16a-hidroksi-dehidroepian-drosteron sulfat, a u placenti nastavlja daljnje pretvaranje u estriol, govorimo o fetoplacentarnoj jedinici koja stvara estriol. Zato će poremećaji u fetusu ili u placenti rezultirati smanjenom produkcijom estriola, pa je izlučivanje estriola u urinu dobar pokazatelj fetoplacentarnog statusa.

Slika 9.14 - Biosinteza estrogena

Slika 9.15 - Stvaranje estriola tokom trudnoće

Metabolizam estrogena

Metabolizam estrogena dosta je složen proces, u kojem se stvara niz derivata koji su otkriveni tek zadnjih nekoliko godina, a dijagnostički značaj nekih od tih jedinjenja nije još ni danas sasvim jasan. Direktna hidroksilacija estradiola u estriol je neznatna, estradiol-17β oksiduje se u estron, a ovaj se dalje hidroksilira u 16α-hidroksiestron, koji se najvećim delom redukuje direktno u estriol, dok se u trudnoći, kao što smo videli, estriol stvara iz fetalnog 16 a-hidroksidehidroepiandrosterona.

Drugi put je oksidacija estriola u 16-okso-estradiol-17β kao i stvaranje l6β-hidroksiestrona koji se redukuje u 16-epiestriol. Metaboliziranjem se takođe stvaraju 17-epiestriol (17α-hidroksi-jedinjenje) i 16,17-epiestriol (16β-OH i 17α-OH) iz njihovih prekursora 16α-hidroksiestrona i 16β-hidroksiestrona, ali stvaranje ova dva epimera estriola je neznatno. Krajnji metabolički produkti se konačno konjuguju u jetri s glukuronskom ili sumpornom kiselinom, pa postaju bolje rastvorljivi u vodi i kao takvi mogu se izlučivati u urinu.

U poslednje se vreme utvrdilo da se estron u negravidnih žena metabolizira dalje i hidroksilacijom na C-2. atomu i da se tako stvaraju katehol-estrogeni (2-hidroksiestron, 2-hidroksiestradiol, 2-hidroksiestriol i njihovi odgovarajući metoksi derivati). Taj metabolički put je intenzivniji u hipertireoidizmu.

Kliničko značenje

Estrogeni se određuju u serumu i urinu, a imaju kliničko značenje i u trudnoći i za procenu funkcionalnog stanja jajnika negravidnih žena.

Koncentracija estrona u serumu se tokom menstrualnog ciklusa ne menja znatnije zbog njegova ekstragonadalnog stvaranja, pa nema nekog većeg kliničkog značenja. Takođe nema većeg značaja ni određivanje koncentracije estriola u serumu tokom ciklusa, jer nastaje uglavnom iz estradiola. Dijagnostički se najvredniji podaci dobijaju određivanjem biološki najaktivnijeg estrogena, estradiola-17β, koji se luči iz jajnika, pa daje korisne podatke o ovarijalnoj funkciji u negravidnih žena. Koncentracija estradiola-7β tokom ciklusa pokazuje 2 maksimuma. Tokom prvih 6-7 dana ciklusa koncentracija estradiola-17β u serumu je uglavnom niska i konstantna. Nakon toga počinje polagano rasti, da bi dosegla maksimum dan pre otpustanja LH. Smatra se da upravo porast estradiol-17β pospešuje otpuštanje LH. Posle ovulacije koncentracija estradiol-17β se snizuje, a nakon toga sledi ponovni porast kad se stvori žuto telo. Posle ovog drugog maksimuma koncentracija se ponovno

smanjuje, ali tokom lutealne faze ciklusa ostaje ipak malo viša nego u proliferativnoj fazi.

Patološki povećane koncentracije nalaze se u feminizaciji kod muškaraca, ginekomastiji i tumorima koji produciraju estrogene, a može se gdekad naći i u cirozi jetre.

Snižena koncentracija estradiola-17β nalazi se u primarnom i sekundarnom hipogonadizmu i Turnerovu sindromu. Abnormalnosti u koncentraciji serumskog estradiola-17β nalaze se i pri poremećaju menstrualnog ciklusa u žena.

Određivanje estrogena posebno je važno u žena u trudnoći za ocenu placentarne funkcije. U tu se svrhu najviše određuje estriol u urinu, ali u nekim slučajevima i u serumu.

Slobodni, nekonjugovani estriol raste u serumu tokom trudnoće, pa se na osnovu koncentracije u serumu može odrediti i starost fetusa, jer je koncentracija najviša tokom 35-36. nedelja trudnoće. Abnormalno visoka koncentracija estriola u serumu upozorava na opasnost prevremenog porođaja.

9.9 PROGESTERON

Progesteron je steroid s 21 C-atomom. Sadrži keto-grupu na C-3. atomu i dvostruku vezu izmedu C-4. i C-5. atoma, koji uzrokuju njegovu biološku aktivnost. Radikal CH3CO- koji se nalazi na C-17. atomu nije toliko važan za njegovo biološko delovanje.

To je ženski polni hormon koji zajedno s estrogenima sudeluje u regulaciji menstrualnog ciklusa. Zadatak progesterona je da pripremi uterus za primitak muških semenih ćelija kao i da kasnije reguliše trudnoću.

Kod negravidnih žena progesteron se stvara i luči iz žutog tela (corpus luteum), a za vreme trudnoće je glavni izvor tog hormona placenta. Nešto malo progesterona stvara se i u suprarenalci i testisima, jer se progesteron stvara kao intermedijer tokom biosinteze kortikosteroida i androgenih hormona.

Biosinteza i metabolizam progesterona

Progesteron nastaje iz acetata preko holesterola i pregnenolona. Nastali progesteron se zatim redukuje. Redukovati se mogu keto-grupe na C-3 i C--20. atomu te dvostruka veza (Δ4). Redukcijom i konjugacijom hormon gubi svoju fiziološku aktivnost. Redukcijom keto-grupa i dvostruke veze nastaju uvek po 2 izomera koji se razlikuju po prostornoj orijentaciji vodonika na C-5. atomu.

U tim procesima redukcije sudeluje nekoliko enzima. Katalitičkim delovanjem Δ-4-5β-reduktaze nastaje pregnandion, a delovanjem Δ-4-5a-reduktaze njegov izomer alopregnandion. Redukciju keto-grupa kataliziraju 3a-hidroksisteroid dehidrogenaza i 3β-hidroksisteroid dehidrogenaza, odnosno 20a i 20β-hidroksisteroid dehidrogenaza, pa nastaju izomeri s OH-grupama u α odnosno β položaju. Tokom metaboliziranja progesterona prvo se redukuje dvostruka veza izmedu 4. i 5. C-atoma, pa nastaju pregnandion i alopregnandion. Zatim se redukuje keto-grupa na C-3. atomu, pa nastaju pregnanolon i alopregnanolon, te konačno, redukcijom na C-20 atomu nastaju pregnandiol i alopregnandiol. Kao konačni produkt najvećim delom stvara se pregnandiol koji se u jetri konjuguje s glukuronskom kiselinom i kao takav izlučuje urinom.

Zato je određivanje pregnandiola u urinu dobar pokazatelj sinteze progesterone.

Slika 9.16 - Metabolizam progesterona

Kliničko značenje.

Koncentracija progesterona u serumu (plazmi) u toku folikularne faze, kada u serum dospeva samo hormon nastao u nadbubrežnoj žlezdi, niska je i kreće se od 0,06 do 2,86 nmol/L. Nakon ovulacije, kada stvoreno žuto telo sintetizuje progesteron, koncentracija se u serumu tokom 3 do 5 dana naglo povisuje na vrednosti oko 19 do 95 nmol/L i zadržava narednih 6 dana. Onda se naglo smanjuje i dan pre menstruacije doseže vrednosti kao u folikularnoj fazi. Ako ne dode do ovulacije, izostaje i porast koncentracije progesterona. Zato se odredivanjem koncentracije progesterona u serumu dobivaju podaci o ovulaciji i funkciji žutog tela.

Koncentracija progesterona u serumu snižena je kod insuficijencije žutog tela, membranozne dismenoreje, ljuštenja endometrija ili premenstrualne tenzije.

Povećana koncentracija progesterona u serumu nalazi se pak kod kongenitalne hiperplazije nadbubrežne žlezde uzrokovane deficitom 11 β, 17β ili 21β-hidroksilaze koje sudeluju u metabolizmu progesterona, kao i kod tumora jajnika.

U trudnoći se progesteron stvara u placenti, pa kako trudnoća napreduje, tako raste i koncentracija progesterona u serumu, čak i do vise od 600 nmol/L pre poroda. Kako koncentracija u serumu dosta varira od dana do dana, potrebno je progesteron u serumu češće odredivati da bi mogle da se procene smetnje u ciklusu ili abnormalnoj trudnoći.

Slične podatke koji se dobivaju direktnim određivanjem progesterona, dobivaju se i određivanjem urinarnog izlučivanja prognandiola, glavnog produkta metabolizma progesterona, tj. podatke o ovulaciji i funkciji žutog tela tokom menstrualnog ciklusa, a u graviditetu o funkciji placente. Muškarci izlučuju samo do oko 2 (μmol/L pregnandiola koji se stvara iz progesterona i 11-deoksikortikosterona u suprarenalci. Kod žena s normalnim menstrualnim ciklusom tokom folikularne faze izlučuje se slično kao i kod muškaraca, ali u lutealnoj fazi nakon ovulacije i stvaranja žutog tela izlučivanje pregnandiola se povećava i dostiže maksimum, lutealni maksimum, izmedu 21. i 24. dana ciklusa. Isto kao što je slučaj s progesteronom u serumu, ako ne dođe do ovulacije, izostaje i porast urinarnog pregnandiola.

Povećano izlučivanje pregnandiola u urinu nalazi se u kongenitalnoj hiperplaziji nadbubrežne žlezde usled deficita 17 β i 21 β-hidroksilaze, tumora jajnika, lutealne ciste jajnika i korionepitelioma. U trudnoći je

tokom prvog trimestra urinarni pregnandiol nešto veći nego u lutealnoj fazi ciklusa, a kako se lučenje progesterona iz placente povećava, tako raste i izlučivanje pregnandiola u urinu. Maksimum doseže oko 32. do 36. nedelje trudnoće, nakon čega se počinje lagano smanjivati, da bi se 4 do 5 dana posle porođaja snizio na vrednosti kao u negravidnih žena.Manje izlučivanje pregnandiola nego što je normalno za razne faze trudnoće nalazi se kod toksemije i eklampsije, intrauterine smrti fetusa, insuficijencije placente zbog hroničnog nefritisa, esencijalne hipertenzije ili dijabetesa te bolesti jajnika.

9.10 PROTEINSKI HORMONI

Hipofiza, pankreas i paratireoidna žlezda luče mnoštvo hormona koji su proteinske prirode. Najveći broj proteinskih i polipeptidnih hormona luči hipofiza. Prednji režanj luči sedam hormona: hormon rasta, prolaktin, lutropin, folitropin, melanoforni stimulirajući hormon, tirotropin i kortikotropin. Druga dva hormona, vazopresin i oksitocin, luči zadnji režanj hipofize. Folikularni stimulirajući hormoni, lutropin i prolaktin, nazivaju se zajedničkim imenom gonadotropini.

Hormon rasta

Hormon rasta ili somatotropin (STH) je kiseli protein, molekulske mase oko 21000. Luči se pod dejstvom liberina za STH iz hipotalamusa. STH stimuliše rast kostiju i drugih tkiva, te ima anaboličko i dijabetogeno delovanje. Na koncentraciju STH u serumu utiče: ishrana, fizička aktivnost, san, stres, koncentracija glukoze, NEFA, insulin i glukagon. Koncentracija STH u serumu povišena je u akromegaliji i gigantizmu, a snižena kod dvarfizma.

Kortokotropin

Kortikotropin (ACTH) je polipeptid sastavljen od 39 aminokiselina. ACTH reguliše funkciju nadbubrežne žlezde i lučenje kortikosteroida. Pospešuje mobilizaciju masti iz depoa i oksidaciju masnih kiselina te sintezu glikogena. Zbog uticaja na glikogenezu, može izazvati hipoglikemiju. Povišene koncentracije ACTH u serumu ili plazmi nalaze se u Adisonovoj bolesti, hiperplaziji nadbubrega, u stresu, posle adrenalektomije, u hipoglikemiji kod insulinske terapije i posle davanja metirapona. Niske koncentracije ACTH nalaze se kod karcinoma nadbubrega i kod panhipopituitarizma.

Tirotropin

Tirotropin (TSH) je glikoprotein molekulske mase oko 25000. Luči se iz prednjeg režnja hipofize pod dejstvom tiroliberina (TRF) iz hipotalamusa. TSH kontroliše lučenje hormona štitne žlezde.

Gonadotropini

Humani gonadotropini stvaraju se u hipofizi i placenti. U prednjem režnju hipofize stvaraju se folitropin (FSH) i lutropin (LH), koji se zajedno nazivaju humani hipofizni gonadotropini (HPG). U trofoblastima posteljice stvara se korijski gonadotropin (HCG) koji se fiziološki izlučuje samo u trudnoći.

FSH I LH iz hipofize izlučuju bazofilne ćelije u prednjem režnju koje označavamo kao gonadotropne ćelije. Sinteza i lučenje gonadotropina regulisani su kompleksnim odnosom hipotalamusa, hipofize i gonada. FSH kod žena utiče na rast folikula, te uz malo LH deluje na lučenje estrogena iz folikula. Kod muškaraca FSH stimuliše spermatogenezu. Kod žena LH izaziva ovulaciju folikula i lučenje progesterone iz žutog tela, a kod muškaraca LH stimuliše stvaranje testosterona u ćelijama testisa.

FSH i LH su glikoproteini sastavljeni od nekovalentno vezanih α i β-podjedinica. Gonadotropini se u cirkulaciji javljaju u najmanje 4 molekularna oblika, a molekularni se oblici u hipofizi izgleda razlikuju od onih u cirkulaciji.

Izlučivanje gonadotropina iz hipofize reguliše se međusobnim delovanjem gonadoliberina (GnRH) iz hipotalamusa i hormona iz jajnika odnosno semenika. Kod dece i odraslih (sem žena u postmenopauzi) sekreciju FSH i LH kontroliše negativna povratna sprega hormona iz gonada. U toku normalnog menstrualnog ciklusa promene nivoa FSH i LH uslovljavaju fiziologiju reprodukcije. Naročito je brz i visok porast LH u toku periovulacionog razdoblja, koji prethodi ovulaciji, dok je porast FSH u tom razdoblju manji. U toku poslednjih dana ciklusa koncentracija FSH je nešto viša nego LH. Time se reguliše u narednom ciklusu rast i razvoj folikula, oslobađanje jajne ćelije iz folikula i stvaranje žutog tela i menstruacija. Vrednost FSH raste do petog dana folikularne faze ciklusa, a zatim opada, dok estradiol iz jajnika raste. Istovremeno počinje porast LH koji povišeni estradiol ne suprimira. Time završava sazrevanje folikula i dolazi do porasta progesterona u serumu.Kod muškaraca se regulacija lučenja FSH i LH takođe zasniva na negativnoj povratnoj sprezi s testosteronom iz testisa. LH stimuliše

Leydigove ćelije testisa na stvaranje testosterona, a ovaj zatim suprimira LH, dok regulacija FSH još nije sasvim razjašnjena.Povišene koncentracije gonadotropina, osim perovulacionog porasta, ukazuju na ispad funkcije gonada ili poremećaje u osovini hipotalamus-hipofiza, ali su ove potonje ređe. Snižene vrednosti FSH I LH ukazuju na poremećaj sistema hipotalamus-hipofiza ili pojavu tumora koji producira steroidne hormone.

Prolaktin

Prolaktin je vrlo važan hormon u reprodukcionom ciklusu čoveka. Po građi je polipeptid molekulske mase oko 20000. Dominantna regulacija sekrecije prolaktina iz laktotropnih ćelija adenohipofize je inhibitorno delovanje prolaktostatina (PIF), iz hipotalamusa. Izgleda da dopamin deluje na oslobađanje PIF-a. Hipoglikemija i hipotireoza uzrokuju porast prolaktina u cirkulaciji, verovatno inhibirajući prolaktostatin preko serotoninergičnih puteva. S druge strane L-Dopa, kao prekursor dopamina i kateholamina u specifičnim hipotalamusnim centrima, dovodi do inhibicije izlučivanja prolaktina.

Insulin

Insulin se stvara u β-ćelijama Langerhansovih ostrvaca u pankreasu. On je polipeptid. Sastoji se od dva lanca, koji su spojeni sa dva disulfidna mosta. Molekulska masa mu je 6000. Insulin deluje na ciljne organe, jetru, mišiće i masno tkivo vezujući se za specifične insulinske receptore na plazma membranama, te tako vezan preko jednog “drugog glasnika” uzrokuje promene u membrani i njenoj propustljivosti. Redukcijom disulfidnih veza insulin se inaktivira. To se događa u jetri delovanjem glutationa. Fiziološko delovanje insulina je u kontroli metabolizma ugljenih hidrata. Insulin snižava koncentraciju glukoze u krvi. Osim delovanja na metabolizam ugljenih hidrata, insulin deluje i na promet lipida pojačavajući lipogenezu i smanjujući lipolizu u masnom tkivu. Takođe sprečava stvaranje ketonskih tela. Deficit insulin uzrokuje dijabetes melitus. Povišena koncentracija insulina u plazmi nalazi se kod tumora pankreasa, akromegalije i gigantizma. Smanjena koncentracija se nalazi u dijabetesu.

Hormoni štitne žlezde

Štitna žlezda ili tiroideja je mala endokrina žlezda ispred dušnika i grla. Teška je oko 25 do 30 g. Ima oblik leptira s dva lobusa koje povezuje istmus. Lobusi su oko 4 cm visoki, 1,5 cm široki i oko 2 do 4 cm debeli, a sadrže sferične folikule od oko 300 μ. U epitelnim ćelijama folikula stvaraju se tiroidni hormoni vezani za protein-tiroglobulin, glavni sastojak koloida u folikulama. U folikulama se stvaraju dva hormona, tiroksin i trijodtironin. U posebnim ćelijama, C-ćelijama, stvara se treći hormon štitne žlezde, kalcitonin ili tireokalcitonin. Dok tiroksin i trijodtironin deluju na metabolizam celog organizma, kalcitonin deluje na metabolizam kalcijuma. Funkcija tiroideje ispituje se određivanjem prva dva navedena hormona i ovde ćemo govoriti samo o njima.Tiroksin je već dugo poznat, izolovao ga je 1915. godine Kendal, a njegovu hemijsku strukturu razjasnio je 1928. godine Harington. Tiroksin ili, kako se još naziva, T4 je 3,5,3',5'-tetrajodtironin, α trijodtironin ili T3 je 3,5,3'-trijodtironin.

Oba hormona nastaju iz tirozina pod kontrolom polipeptidnog hormona koji stimuliše njihovo lučenje, tirotropina, TSH (thyroid stimulating hormone), a luči ga prednji režanj hipofize (adenohipofiza). Regulacija lučenja tiroidnih hormona predstavlja negativnu regulaciju mehanizmom povratne sprege, a u nju su uključeni hipotalamus, hipofiza, tireoideja i koncentracija slobodnog T4 i T3 u cirkulaciji (slika 9.17).

Slika 9.17 - Regulacija stvaranja i lučenja tiroidnih hormona

Tiroidni relizing faktor TRH ili tiroliberin iz hipotalamusa stimuliše lučenje TSH iz adenohipofize, a ovaj stimuliše stvaranje i lučenje T3 i T4. Porast koncentracije slobodnog tiroksina, a verojatno i trijodtironina, u kstracelularnoj tečnosi koči lučenje TSH, što onda rezultira manjim

lučenjem T4 i T3 iz štitne žlezde. Obratno, sniženje koncentracije hormona u cirkulaciji stimuliše lučenje TSH iz hipofize, pa se luči više hormona iz štitne žlezde.

Biosinteza hormona tiroideje. Za sintezu hormona štitne žlezde potreban je jod. Jod se brzo apsorbuje u crevu i u obliku jodida prelazi u krv, iz koje ih tiroideja apsorbuje pa se jod akumulira tako da tiroideja sadrži oko 20 puta veću koncentraciju nego krvna plazma. Akumulacija jodida u tiroideji je enzimski proces. Delovanjem jedne peroksidaze jodid se oksiduje u aktivni jod i veže na tirozilne ostatke tiroglobulina.

Slika 9.18 - Biosinteza i metabolizam hormona tiroideje. Na slici su navedeni agensi koji koče stvaranje hormona

Fiziološko delovanje hormona štitne žlezde je kompleksno. Oni deluju na ceo organizam pospešujući utrošak kiseonika i stvaranje toplote. Potrebni su za rast, a deluju i na razvoj i polno sazrevanje. Kako je za biosintezu hormona potreban jod, nedostatak joda u hrani izaziva miksedem ili eutiroidnu gušu. Osim nedostatka joda, hipotiroidizam se javlja i u Hashimotovoj bolesti zbog prisustva antitiroidnih antitela. Hipertiroidizam se javlja kad su produkcija i lučenje tiroidnih hormona povećani. Uzroci hipertireoze su Basedovljeva bolest, pojava čvorova u tiroideji, prekomerno davanje hormona štitne žlezde, ili davanja joda, kao i tumori hipofize.

Kateholamini

Kateholamini su zajednički naziv za aktivne amine koji sadrže benzolski prsten s dve hidroksilne grupe (katehol). To su hormoni: adrenalin, noradrenalin i dopamin. Stvaraju se u hromafinskim i nervnim ćelijama u srži nadbubrega. Kateholamini se u telu stvaraju iz tirozina. Hidroksilovanjem tirozina dobija se dopa, a njenom dekarboksilacijom noradrenalin. Sintetizovani kateholamini se krvlju prenose do ciljnih tkiva i u njima izazivaju brze metaboličke odgovore na stres. Pored delovanja na krvne sudove i rad srca, kateholamini utiču na metabolizam ugljenih hidrata povećavajući glikogenolizu i glukoneogenezu. Utiču i na metabolizam lipida stimulišući mobilizaciju masnih kiselina.

UKRATKO:

Da bi organizam dobro funkcionisao potrebna je dobra međusobna usklađenost raznih procesa. Da bi se ostvarila kvalitetna koordinacija neophodan je prenos potrebnih „poruka“ od jednog do drugog organa. Prenos ovih poruka ostvaruje se posebnim signalima nervnog i endokrinog sistema. Ovi sistemi imaju osobinu da sintetizuje i izlučuju posebna hemijska jedinjenja koje nazivamo hemijski glasnici. Hemijski glasnici, koje sintetizuju neuroni čine neuro-hormone, a druge posebne ćelije sintetizuju „klasične“ hormone.

Hormoni se sintetizuju u vrlo malim količinama u posebnim organima, endokrinim žlezdama. Iz ovih žlezda se direktno izlučuju u krv. Neki se hormoni izlučuju u aktivnom obliku, a neki kao neaktivni prethodnici. Hormoni se krvlju prenose do mesta gde treba dostaviti „poruku“, tj. do mesta delovanja. To su posebna tkiva, specifična za svaki hornom, ciljna tkiva. Na ćelijama ciljnih tkiva nalaze se receptori sa kojima hormoni „prepoznajući“ ih, reaguju na specifičan način i nizom hemijskih reakcija izazivaju metabolički efekat u ćeliji.

Hormoni regulišu i održavaju celokupan metabolizam, sastav krvi i drugih telesnih tečnosti, normalno funkcionisanje organa, vrše kontrolu i obezbeđuju rast i razvoj različitih tkiva, organa i celokupnog organizma. Skoro da nema procesa koji nije posredno ili neposredno pod uticajem jednog ili više hormona.

Po hemijskoj strukturi hormoni se dele na: a) oligopeptidne i proteinske; b) derivate aminokiselina i c) steroidne hormone.

Glavnu ulogu u regulaciji lučenja, pa i delovanja većine hormona imaju hipotalamus i hipofiza. Hipofiza se sastoji od prednjeg i zadnjeg režnja, koji imaju različite endokrine uloge. Hipofiza je anatomski povezana sa hipotalamusom koji kontroliše i reguliše njen rad. Ova kontrola hipotalamusa ostvaruje se sekrecijom posebnih hemijskih jedinjenja kroz nervna vlakna i krvne sudove. Hipotalamus reaguje na signale koji dolaze i iz viših moždanih centara tako što se u posebnim ćelijama hipotalamusa sintetuzuju specifična hemijska jedinjenja hipotalamusni faktori oslobađanja, hormoni oslobodioci ili liberali.

Liberini su mali peptidi koji se satoje od 3 do 12 aminokiselinskih ostataka, neuro-sekretorne supstance koje čine vezu između nervne i humoralne regulacije. Hipotalamus sintetizuje 8 do 9 faktora oslobađanja. Najjednostavnije strukture (tripeptid) je hormon

oslobodioc tireotropnog hormona (TRH). Najsloženije građe (10 aminokiselinskih ostataka) je hormon oslobodioc genadotropnih hornoma (GnRH). Svi hormoni oslobodioci prenose se krvlju do hipofize gde u prednjem režnju ovog organa stimulišu sintezu i lučenje jedne druge grupe polipeptidnih hormona. To su tropni hormoni čija je uloga da pronađu ciljna tkiva druge endokrine žlezde i prenesu „poruku“ o sintezi odgovarajućeg hormona.

Svaki hormon oslobodioc utiče na sekreciju specifičnog tropnog hormona, a svaki tropni hormon na sintezu specifičnog hormona u perifernoj endokrinoj žlezdi. Npr.TRH→TSH→tiroideja→tiroksin;GnRH→FSH→testisi→testosteron ili GnRH→LH→ovarije→estrogeni hormoni ili GnRH→LH→žuto telo→ progesteron; CRH→ACTH→kora nadbubrega→kortikosteroidi.

Od tropnih hormona najjednostavnije strukture je kortikotropni hormon (ACTH) koji utiče na rad nadbubrega. Drugi tropni hormoni su glikoproteini, kao što su tireotropni hormon (TSH) koji podstiče rad tireoideje i sintezu gonadotropnih hormona (FSH i LH). Ovi tropni hormoni sastoje se iz dve α i β-podjedinice, međusobno vezane nekovalentnim vezama. Za biološku aktivnost odgovorna je β-podjedinica. Intenzitet sinteze hormona hipotalamusa, hipofize i perifernih endokrinih žlezda regulisan je u većini slučajeva fiziološkim mehanizmima od kojih je najčešći mehanizam povratne sprege.

Mnogi hormoni ostvaruju svoje delovanje vezivanjem za membranske receptore. Takvi su npr. kortikotropni i tireotropni hormoni. Vezivanjem ovakvih hormona za membranske receptore stimuliše se aktivnost enzima adenilat ciklaze. Ovaj enzim katalizuje reakciju pretvaranja ATP-a u adenozin-3,5-ciklični monofosfat (cAMP). Ovaj proizvod dovodi do aktiviranja potrebnih enzima unutar ćelije i do potrebnog odgovora promenom ćelijskog metabolizma.

Postoje i hormoni takve hemijske strukture da lako ulaze u ćeliju. Ovakvi hormoni pronalaze svoje receptore u samoj ćeliji, obično u citoplazmi.

Adenofiza (prednji režanj) luči veći broj hormona, proteina složene strukture. Jedan deo su tropni hormoni, a drugi deluju direktno na metabolizam u ćelijama mnogih organa (hormon rasta i prolaktin). Hormon rasta je značajan za rast i razvoj. On stimuliše sintezu proteina i katabolizam lipida, deluje kao antagonist insulinu. Preterana sekrecija hormona rasta dovodi do gigantizma, nedostatak do patuljastog rasta.

Zadnji režanj hipofize (neurohipofiza) luči dva hormona oligopeptida: antidiuretički hormon (ADH) ili vazopresin i oksitocin. ADH ima važnu ulogu u kontroli zapremine vanćelijske tečnosti, time kontroliše i krvni pritisak. Oksitocin deluje na mišiće maternice izazivajući njihovo grčenje i upotrebljava se u ginekologiji.

Paratiroidni hormon je osnovni proizvod lučenja paratireoideje. Glavna uloga mu je u regulaciji metabolizma kalcijuma i fosfora. Na metabolizam ovih utiče i kalcitonin koji je antagonist parathormonu, kao i vitamin D. Parathormon stimuliše veću apsorpciju Ca i P u crevima, povećava reapsorpciju Ca u bubrezima i resorpciju kostiju. Osim toga, pod uticajem parathormona intenzivnija je i sinteza aktivnog oblika vitamina D. Vitamin D deluje na metabolizam Ca i fosfora slično parathormonu, a kalcitonin je njihov antagonist. Poremećaji u metabolizmu kalcijuma i fosfora dovode do povećanja ili smanjenja koncentracije ovih elemenata u krvi. Tako su povećane koncentracije kalcijuma u krvi posledica povećane sekrecije parathormona ili intoksikacije vitaminom D. Usled loše ishrane ili neizlaganja UV zracima ili smanjenja sekrecije parathormona u krvi se smanjuje količina kalcijuma. Povećane koncentracije fosfora su posledica povećanih koncentracija vitamina D ili smanjene sekrecije parathormona. Poremećaji u metabolizmu Ca i P preduslov su mnogih bolesti. Najčešća posledica je nestvaranje ili gubitak koštane mase. Takve bolesti su, na primer, rahitis kod dece, osteomalacija ili osteoporoza kod odraslih.

Štitna žlezda ili tiroideja proizvodi i luči dva hormona, tiroksin (T4) i trijodtironin (T3). Sinteza ovih hormona je složena i da bi se ostvarila neophodno je da se određene količine joda, koncentrišu u ćelijama tiroideje i da se pretvore u oblik pogodan za ugrađivanje u molekul tiroidnih hormona. Tireotropni hormon stimuliše ulaženje joda u ćelije tiroideje. Ovaj proces se odvija uz utrošak energije i nasuprot koncentracijonom gradijentu. Nastali hormoni tiroideje prelaze direktno u krv. U krvi se vežu za poseban protein tiroksin vezujući globin, sve dok ih ne apsorbuju ciljna tkiva. Hormoni tireoideje stimulišu mnoge metaboličke procese, sintezu i katabolizam proteina ili lipolizu. Usled povećanja lučenja hormona tiroidne žlezde nastaje hipertiroidizam. Ovo stanje karakterišu povećane aktivnosti oksidativnih procesa, katabolizam proteina, masti i ugljenih hidrata. Najduže poznata bolest je Bazedovljeva (ili Graveova) bolest. Usled smanjene sekrecije nastaje hipotiroidizam. Hipotiroidizam može biti posledica poremećaja u radu hipofize, ali

i nedostatka joda u ishrani. Posledice su povećanje štitne žlezde i gušavost (struma).

Nadbubreg je ednokrina žlezda koja se satoji od srži i kore. Kora sintetizuje steroidne hormone, a srž hormone derivata aminokiselina. Iz aminokiselina fenilanalina i tirozina sintetizuju se adrenalin i noradrenalin. Hidroksilovanjem tirozina dobija se dopa, a njenom dekarboksilacijom noradrenalin. Adrenalin, noradrenalin i dopa nazivaju se zajedničkim imenom kateholamini. Sintetizovani kateholamini se krvlju prenose do ciljnih tkiva i u njima izazivaju brze metaboličke odgovore na stres. Pored delovanja na krvne sudove i rad srca, kateholamini utiču na metabolizam ugljenih hidrata u jetri i mišićima povećavajući glikogenolizu i glukoneogenezu. Kateholamini utiču i na metabolizam lipida stimulišući mobilizaciju masnih kiselina.

Mnogi hormoni su po hemijskom sastavu steroidi. Svi steroidni hormoni sadrže u osnovi steroidno jezgro a međusobno se razlikuju po vrsti i broju supstituenata. Razlikujemo tri grupe steroidnih hormona: a) kortikosteroidi (C21 – kortizol, aldosteron, progesteron); b) androgeni (C19 – testosteron) i c) estrogeni ( C18 – estradiol, estron). Kortikosteroidi se sintetizuju u kori nadbubrega, dok su glavna mesta sinteze androgena i estrogena muške i ženske polne žlezde. Kora nadbubrega se sastoji iz tri sloja ćelija a svaki sloj je odgovoran za sintezu druge vrste steroida, spoljašni za glukokotrikoide, srednji za mineralokortikoide, a unutrašnji za adrenalne androgene. Sinteza steroidnih hormona je složeni proces koji obuhvata veći broj reakcija, katalizovanih mnogim enzimima. Od holesterola počinje sinteza svih steroidnih hormona. Iz holesterola nastaje u prvoj reakciji pregnenolon. Ovaj deo biosintetičkog puta je zajednički za sve steroidne hormone. Da bi se sintetizovali mineralokortikosteroidi, prvo se gradi progesteron. On se menja tokom niza reakcija i kao krajnji proizvod nastaje aldosteron. Od svih reakcija posebno je značajna oksidacija metil grupe u položaju 18. Glukokortikoidi se sintetišu takođe iz progesterona, koji se hidroksiluje u položaju 17, a iz ovog intermedijata nastaje kortizol, glavni predstavnik ove grupe hormona. Iz ovog intermedijata sintetizuju se i adrenalni polni hormoni, androgeni i estrogeni. Estrogeni su hormoni sa najmanjim brojem C-atoma u molekulu. Sintetizuju se odvajanjem metil grupe u položaju 18 i obrazovanjem jednog aromatičnog prstena.

Način regulisanja biosinteze nije isti za sve grupe steroidnih hormona nadbubrega. Tako se koncentracija kortizola u krvi reguliše mehanizmom povratne sprege i sintezom hormona hipotalamusa i hipofize dok se koncentracija mineralokortikoida kontroliše drugim mehanizmima. Jetra je važan organ u kome se odigrava katabolizam steroidnih hormona. Katabolizmom glukokortikoida nastaju 17-hidroksikortikosteroidi, a kabolizmom androgena, 17-ketosteroidi. Poznate su nasledne bolesti koje nastaju kao posledica delimičnog ili potounog nedostatka nekog od enzima u biosintezi steroidnih hormona. Za ove bolesti karakteristični su: određena klinička slika i povećanje koncentracije nekih steroidnih hormona ili intermedijata, u krvi ili mokraći. Zavisno od toga koja je vrsta intermedijata povećana, dokazuje se i poremećaj aktivnosti određenog enzima. Najčešće nedostaje 21-hidroksilaza, pa nastaje enzimski „blok“ i dolazi do nagomilavanja 17α-hidroksiprogesterona. Usled nedostatka 17α-hidroksilaze ne odvija se sinteza kortizola, pa je više stimulisana sinteza aldosterona.

Glavni glukokortikoidni hormon je kortizol. Kortizol je veoma značajan hormon. Posebno zato što utiče na mnoge procese koji predstavljaju odgovor organizma na stres. Pored antizapaljenskog i imunosupresivnog delovanja, kortizol značajno utiče na metabolizam ugljenih hidrata ali i proteina i lipida. U jetri stimuliše glikogenolizu i sintezu glukoze iz aminokiselina. Tako dovodi do, potrebnog u stresu, povećanja nivoa glukoze u krvi. Kontrola glukoregulacije je pod uticajem i drugih hormona. Zbog značaja koji imaju u metabolizmu ugljenih hidrata ova grupa hormona je nazvana glukokortikoidima. Poznate su mnoge bolesti u čijoj osnovi leže poremećaji u sintezi i sekreciji steroidnih hormona nadbubrega. Kod Cushingove bolesti dolazi do hiperprodukcije kako gluko- tako i mineralokortikoida i adrenalnih androgena, zbog čega nastaju poremećaji u glukoregulaciji, retenciji natrijuma, a kod žena se zapaža i pojava maskulinizacije. Delimični ili potpuni nedostatak funkcije nadbubrega javlja se kao posledica tumora, tuberkuloznih ili autoimunih procesa. Takva je Adisonova bolest koju karakteriše nedostatak gluko- i mineralokortikoida, pa nastaje hipoglikemija, gubitak elektrolita i teška dehidratacija.

Najvažniji mineralokortikoid je aldosteron. On učestvuje u regulaciji optimalnog sadržaja eletrolita i zapremine telesnih tešnosti. Ovaj hormon stimuliše u distalnim tubulima reapsorpciju natrijuma i zajedno sa njim pasivnu reapsorpciju vode. Regulacija sinteze i

delovanja aldosterona značajno se razlikuje od one kod glukokortikoida. Signali za sintezu aldosterona su smanjenje količine natrijuma, ekstraćelijske tečnosti i sniženi krvni pritisak. Ovi signali dovode do aktiviranja posebnog regulacionog, renin-angiotenzinskog sistema.

Muški polni hormoni su androgeni. Glavno mesto sinteze androgena su muške polne žlezde, testisi i semenici. Ovde se sintetizuje najvažniji predstavnik androgena, testosteron. Međutim, iako u manjim količinama, androgeni se sintetuzuju i u kori nadbubrega. Glavni androgeni nadbubrega su dehidroepiandrosteron i androsteron. Sinteza u testisima počinje kada se iz hipofize sekretiraju folikulostimulišejući (FSH) i luteinizirajući (LH) hormoni. LH stimuliše sintezu androgena, a FSH spermatogenezu. Androgeni hormoni određuju primarne i sekundarne muške karakteristike. Utiču i na druge metaboličke procese dovodeći do povećanih koncentracija lipoproteina, hemoglobina ili erotrocita. Određivanje androgena i metabolita značajni su za dijagnozu virilizacije kod žena i naslednih defekata u steroidogenezi.

Ženski polni hormoni ili estrogeni sintetizuju se u jajnicima a za vreme trudnoće i u placenti. Male količine estrogena stvaraju se i u testisima i nadbubregu. Najvažniji estrogeni su estron i estradiol. Oni su C-18 steroidi, čiji je A prsten steroidnog jezgra aromatičnog karaktera. Retki su poremećaji praćeni povećanom sintezom estrogena.

Progesteron je još jedan značajan steroidni hormon koji sintetizuje žuto telo jajnika. On se stvara u određenim fazama menstrualnog ciklusa i za vreme trudnoće. Pored toga on je značajan intermedijat u biosintezi svih steroidnih hormona. Smanjen sadržaj progesterona u trudnoći ukazuje da preti pobačaj ploda. Jajnike stimulišu na sekreciju estrogena hormoni hipotalamusa i hipofize. Estrogeni utiču na razvoj sekundarnih seksualnih karakteristika. Tokom trudnoće koncentracije estrogena i progesterona rastu da bi bile najveće u toku porođaja. Nedostatak estrogena posle menopauze dovodi do povećanja LDL i osteoporoze.

BIOLOŠKE OKSIDACIJE

10.1 MITOHONDRIJE

Biološke oksidacije i proizvodnja adenozintrifosfata odigrava se u mitohondrijama. Mitohondrije su najbolje ispitane ćelijske organele, koje se nalaze u citoplazmi svih eukariotskih ćelija, izuzev eritrocita sisara i anaerobnih plesni. Njihov broj je relativno konstantan za svaki određeni tip ćelija. Jedna jedina ćelija jetre pacova ima preko 1 000 mitohondrija. Unutar ćelije one su smeštene u neposrednoj blizini struktura koje troše energiju odnosno ATP. Npr. u mišićnim ćelijama su smeštene uz miofibrile. U nekim ćelijama npr. jetre, kreću se po citoplazmi, dok su u mišićnim ćelijama manje ili više fiksirane.Mitohondrije se vrlo mnogo razlikuju po veličini, obliku, kristi, strukturi i smeštaju. U jetrenim ćelijama su elipsastog skoro okruglog oblika, u bubrežnim i srčanim su cilindrične u fibroblastima su končaste. Najbolje su ispitane mitohondrije jetre pacova, čija dužina iznosi 2 μ, a širina nešto manje od 1μ5[5]. One imaju iste dimenzije kao bakterije.Mitohondrije imaju dve membrane: spoljnu i unutrašnju. Spoljna membrana je obavija, nije naborana već glatka. Ona je permeabilna za većinu niskomolekulskih jedinjenja. Unutrašnja membrana gradi mnogobrojne uzdužne nabore, koji se zovu kriste (cristae). U mitohondrijama jetre kriste su retke i nepravilne, dok su u ćelijama srca, bubrega, mrkog masnog tkiva mnogobrojne, tako da ispunjavaju unutrašnji lumen mitohondrija (slika 10.1).

Slika 10.1 - Struktura kristi u mitohondrijama jetre (a) i mrkog masnog tkiva pacova (b)

Zbog nabrane strukture, površina unutrašnje membrane je vrlo velika. Npr. 1 ml mitohondrija mišića slepog miša ima površinu sobe od 50 m2. Zapremina kristi se menja u toku disanja.Unutrašnja membrana mitohondrija je kontinuirana i obrazuje dva unutrašnja prostora: matriks i intermembranski prostor. Matriks je gelu 5

slična, polučvrsta faza, koja sadrži oko 50% proteina. Mitohondrije, koje imaju mnogo kristi, imaju malo matriksa i obrnuto. U nekim mitohondrijama se nalaze ribozomi. Ultrastruktura spoljne i unutrašnje membrane je različita. Na unutrašnjoj strani unutrašnje membrane nalaze se pravilno raspoređene sferne čestice, čiji je prečnik 80—90 Å 6[6]. Ove čestice se nazivaju elementarne čestice. Njih nema na spoljnoj strani unutrašnje membrane, niti na spoljnoj membrani.

Slika 10.2 - Ultrastruktura mitohondrija: skematski (a) i slikovno prikazana (b)

Aktivnost mitohondrija dolazi od mnogobrojnih enzima i drugih faktora, koji su smešteni unutar njihove strukture i na obema membranama. Struktura mitohondrija, koja se sastoji od više odvojenih prostora, omogućava da su pojedini enzimski sistemi međusobno odvojeni. Ovo

6

ima velikih prednosti: 1) postiže se veća lokalna koncentracija reaktanata, nego da su enzimi ravnomerno raspoređeni; 2) mogućno je njihovo usmereno kretanje prema jednoj ili drugoj strani unutrašnje membrane i 3) može da se podesi redosled reakcija. U tabeli 13.1 je dat raspored enzima odnosno funkcionalna organizacije mitohondrija.

Tabela 10.1 Raspored enzima u mitohondrijama

Mesto nalaženja Funkcija Enzimi

Spoljna membrana

aktivacija masnih kiselinaTiokinaza masnih kiselina,

monoamin-oksidaza

prostor između membrana

reakcije između nukleotida

Miokinaza (ATP+AMP → 2 ADP) nukleozid-difosfat-kinaza:

(ATP + UDP → ADP +UTP)

Unutrašnja membra

Prenos vodonika i elektrona dobijanje ATP-a citohromi,dehidrogenaza ćilibarne

kiseline, β-hidroksi-buterne kiseline i α-glicero-fosfata; dehidrogenaze NADH,enzimi sinteze ATP-a transfere karnitin-masne kiseline-Koenzim A.

prenošenje masnih kiselina

drugi transportni sistemi

matriks

dehidrogenaze i drugi enzimi CLK oksidacija masnih kiselina

citratsintaza, izocitratdehidrogenaza,fumaraza, malat-dehidrogenaza, akonitaza enzimi (β-oksidacije masti, dehidrogenaza glutaminske kis., transaminaze enzimi ciklusa ureje, piruvat-karboksilaza PEP-karboksikinaza

desaminacije i transaminacije sinteza ureje

inicijalne reakcije glukoneogeneze

U matriksu se nalaze rastvorni enzimi, iako su neki od njih kompleksni enzimski sistemi. Oni katalizuju većinu reakcija ciklusa limunske kiseline (CLK), neke stupnjeve glukoneogeneze, β-oksidaciju masnih kiselina i metabolizam aminokiselina sve do nastajanja ureje. U unutrašnjoj membrani mitohondrija su smeštene sve važne dehidrogenaze, svi citohromi i faktori, koji učestvuju u sintezi ATP-a.Zbog velike metaboličke aktivnosti, mitohondrije primaju i oslobađaju mnogobrojne metabolite. Neki od njih kao O₂, CO₂, ureja, piruvat, aceto-acetat i β-hidrok-sibutirat prolaze bez prepreka kroz membrane mitohondrija. Drugi metaboliti kao što su: nukleotidi, di- i tri-karbonske

kiseline, masne kiseline i katjoni nisu permeabilni. Njihovo ulaženje i izlaženje kroz unutrašnju mitohondrijalnu membranu reguliše nekoliko mehanizama, o kojima će kasnije biti govora, pošto prvo razmotrimo procese biološke oksidacije i oksidativne fosforilacije.

10.2 ORGANIZACIJA RESPIRATORNOG LANCA

Odvajanje unutrašnje membrane mitohondrija od spoljne i matriksa, pokazalo je da ona sadrži enzime respiratornog lanca: dehidrogenazu NADH, dehidrogenazu ćilibarne, β-hidroksibuterne kiseline i α-glicerofosfata, i citohrome b, c, a i a₃. U unutrašnjoj membrani su identifikovani i enzimi sinteze ATP-a, koji omogućavaju da se energija, koja se oslobađa u toku oksidacije,konzerviše u obliku ATP-a.Organizacija sastavnih delova respiratornog lanca objašnjena je na više načina. Tako su frakcionisanjem unutrašnje membrane odvojena četiri kompleksna enzimska sistema. Kompleks I je flavoenzim koji vrši reoksidaciju NADH koji pritiče iz CLK, pomoću ubihinona (UQ). Kompleks II vrši oksidaciju ćilibarne kiseline (sukcinata). Kompleks III oksiduje redukovani ubihinon (UQH2) na račun citohroma c, a kompleks IV je citohrom oksidaza, koja oksiduje citohrom c, koji se redukovao u kompleksu III, pomoću kiseonika.

Slika 10.3 - Funkcije kompleksa enzima I-IV izolovanih iz mitohondrija (Fp: flavoenzim NHFe: nehemsko gvožće)

Pomoću specifičnih inhibitora ustanovljeno je da flavoenzimi respiratornog lanca nisu autonomni u transportu elektrona, odnosno vodonika (H°), već su povezani sa citohromima, ubihinonom i elektron-transfernim flavoproteinima (ETF)). Oni isto tako ne mogu direktno da reaguju sa kiseonikom, već njihovu reoksidaciju vrši ubihinon (UQ). Zbog toga se pretpostavlja da su kompleksi I—IV, koji učestvuju samo u oksidaciji NADH i sukcinata, povezani preko ubihinona i citohroma c. Isto tako, ,pošto ETF i dehidrogenaze masnih kiselina čine 80% mitohondrijalnih proteina, njihov odnos prema delovima respiratornog lanca je od velikog značaja. Verovatno je da elektron-transferni flavoproteini povezuju neke enzime matriksa, dehidrogenaze masnih kiselina, glicerolfosfat dehidrogenazu i druge flavoenzime, sa ubihinonom.

Pored toga u mitohondrijama se nalaze »strukturni proteini«, hidrofobnog karaktera, koji enzimske komplekse respiratornog lanca, kao neka vrsta cementa, povezuju po jednom određenom redu.

Slika 10.4 - Struktura respiratornog lanca

10.3 BIOLOŠKE OKSIDO-REDUKCIJE

Oksidacija i redukcija su nerazdvojan, komplementaran proces: u reakciji oksidacije jedne supstancije mora istovremeno da se redukuje druga. Mada je oksidacija prvobitno značila sjedinjavanje sa kiseonikom, ovaj proces je u organskoj hemiji obuhvatio više tipova hemijskih promena. Kod svih tipova oksido-redukcije dolazi do prenosa elektrona ili kako se kaže redukcionih ekvivalenata. Supstranca koja se oksiduje gubi elektrone, a ona koja se redukuje, prima elektrone. U toku oksido-

redukcije oksidaciono sredstvo prima elektrone i redukuje se, a redukciono sredstvo gubi elektrone i oksiduje se:

Prvobitni pojam oksidacije može se predstaviti oksidacijom acetaldehida u sirćetnu kiselinu, gde se broj kiseonikovih atoma povećava za jedan:

Pošto kiseonik ima težnju da primi dva elektrona, to je adicija jednog kiseonika ekvivalentna gubitku dva elektrona. Obrnuti proces, gubitak kiseonika, je redukcija. Oksidativan je i proces pri kome organsko jedinjenje gubi vodonik (dehidro-genacija), kao pri oksidaciji etanola u acetaldehid:

Kod dehidrogenacije je prenos elektrona povezan s prenosom vodonika (H°). Pošto gubitak vodonika, znači i gubitak njegovog elektrona, to je dehidrogenacija oksidativan proces. Oksidaciono sredstvo je, u ovom slučaju, akceptor vodonika. I u jednom i u drugom slučaju dolazi do prenosa elektrona, odnosno kiseonikovih i vodonikovih atoma. Na osnovu gornjeg izlaganja, povećanje pozitivne valence metala je oksidativan proces, jer dolazi do gubitka elektrona:Većina oksidacija u biološkim uslovima se dešava uz prenos ekvivalenata od dva elektrona.Enzimi (oksidoreduktaze) koji katalizuju biološke oksidacije deluju u zajednici sa grupom koenzima, prostetičnih grupa ili prenosilaca elektrona. U transportu elektrona od organskih supstrata do kiseonika učestvuju tri glavne grupe oksido-reduktaza. Po redu njihovog učešća, to su:

Dehidrogenaze koje imaju koenzim NAD ili NADP, tzv. piridin specifične dehidrogenaze.

Dehidrogenaze koje sadrže FAD ili FMN kao prostetičnu grupu, i

Citohromi, čija je prostetična grupa neki hem.

Primeri PN-specifičnih dehidrogenaza opisani su u procesima glikolize i CLK. U respiratornom lancu su zastupljene piridin -nukleotid (PN) specifične dehidrogenaze.

Procesi oksidacije teku u mitohondrijama, koja prima iz citozola tekuće obroke supstrata, prerađuje ih i oslobađa produkte. Kada radi optimalno, respiratorni lanac mitohondrija liči na tekuću traku u fabrici.

Slika 10.5 - Stacionarno stanje respiratornog lanca

Svaki stepen procesa oksidacije radi konstantnom brzinom, molekuli svakog prenosioca su naizmenično u redukovanom i oksidovanom stanju, da bi se struja elektrona održavala. Proces je dinamičan, tako da je u svakom momentu odnos svakog prenosioca u oksidovanom i redukovanom obliku konstantan. Pošto svaki prenosilac ima karakteristični apsorpcioni spektar, koji se menja kada on prelazi iz redukovanog u oksidovano stanje, može da se izmeri redoks-stanje svakog učesnika, kao i njihov redosled. Na slici 10.5 dato je stacionarno stanje respiratornog lanca iz koga se vidi, da se prenosioci, koji se nalaze na početku lanca, pretežno nalaze u redukovanom stanju, a na kraju lanca preovladava oksidovani oblik. Znači da početni članovi lako daju elektrone, a oni krajnji ih primaju, sve do kiseonika kao krajnjeg akceptora elektrona.

10.4 REDOKS-POTENCIJALI

Utvrđivanje redosleda komponenata respiratornog lanca izvršeno je merenjem redoks-potencijala svakog člana. Redoks potencijal je kvantitativna mera sposobnosti jedne supstance da redukcuje drugi. Analogno je izražavanju jačine kiseline na osnovu njenog pK. U slučaju respiratornog lanca, vrednost redoks potencijala određuje dve veličine: 1) redukujuću sposobnost jednog člana i 2) koliko se energije dobija kod njegovog prelaska u oksidovani oblik.Težnja neke supstance X da daje elektrone, odnosno njen redoks potencijal, može da se izmeri pomoću pogodnog električnog kruga. Najjednostavnije je da se dve posude povežu, kao što je na slici 10.6 predstavljeno. U posudi A

se nalazi rastvor supstance X (»redukujućeg sredstva«), a u B rastvor supstance Y, označene kao oksidaciono sredstvo, jer može da prima elektrone. Povezivanjem dve posude, kao što je na slici prikazano, počeće da se kreću elektroni iz posude A u B. Struju elektrona će da registruje galvanometar, koji ustvari meri elektromotronu silu (EMS). Ako je poznat apsolutni elektrodni potencijal EA i EB u dva suda, tada će EMS biti jednaka razlici elektrodnih potencijala:

ΔE = EA - EB

U praksi se uvek mora u polućeliji B da uzme poznata referentna elektroda. Obično se uzima standardna vodonična elektroda, koja se sastoji od komadića platine uronjene u 1 M- rastvor H+jona (t.j. HCl). Ona pokazuje redukcioni potencijal reakcije:

H2↔2H+ + 2epod pritiskom vodonika od 1 atmosfere na 25°C. Po definiciji potencijal vodonične elektrode pod tim uslovima (pH = 0, 25°C,1 atm)7[7] iznosi 0.U slučaju da druga ćelija (A), lakše predaje elektrone vodoničnoj ćeliji, ona ima negativni elektrodni potencijal. Obrnuto, ako ona lakše prima elektrone, tada je njen potencijal pozitivniji od vodonične elektrode. U tom slučaju je vodonik redukciono sredstvo i elektroni će teći prema pozitivnoj elektrodi u kojoj će se dešavati redukcija. Znači da svaka polućelija može da se redukuje ili oksiduje u zavisnosti od redoks-potencijala druge ćelije i, naravno, svog potencijala. Izmereni potencijal se izražava kao redoks potencijal i obeležava sa Eh.Treba naglasiti da redoks par: voda/kiseonik:

ima vrlo pozitivni standardni redukcioni potencijal od +0,815 V. Voda prema tome ima malu težnju da gubi elektrone i daje molekulski kiseonik. Drukčije rečeno, kiseonik ima veliki afinitet prema elektronima, koji je veći od bioloških akceptora elektrona kao što su NAD, flavoproteini i citohromi.

7

Slika 10.6 - Redoks merenje potencijala

U tabeli 10.2 su dati redoks potencijali nekih supstrata i prenosilaca elektrona. Na vrhu liste su oni, koji su najjača redukciona sredstva, odnosno oni koji lako gube elektrone. Na dnu liste su oni koji lako primaju elektrone. Elektroni će normalno da teku od jednog para na drugi, po redu datom u tabeli. Npr. NAD+ je pogodan akceptor elektrona od piruvata, ali ne od sukcinata. Redosled komponenata respiratornog lancaje u saglasnosti sa ovim vrednostima standardnih redukcionih potencijala i izgleda ovako:

NADH → Fp → UQ → b → c1 → c → a → a3

Prema tome, respiratorni lanac je neka vrsta kompleksa polućelija različitog redoks-potencijala, gde elektroni teku od onih sa negativnijim potencijalom prema onima sa pozitivnijim, sve do kiseonika, koji ih prima gradeći vodu.

Tabela 10.2 - Standardni redukcioni potencijali nekih bioloških redoks sistema

Veličina redoks potencijala zavisi od temperature, pH i koncentracije X, ili tačnije od odnosa koncentracija redukovanog i oksidovanog oblika (X red/X oks.). Kada se ove vrednosti standardizuju: 25°C, pH = 7 i 1 M koncentracije X red. i X oks., dobijeni potencijal se naziva standardni redoks-potencijal i obeležava se Eo'. Iz defmicije je jasno da je to srednji potencijal kada se u polućeliji nalazi 50% oksidovanog i 50% redukovanog oblika.Na slici 10.7 je prikazan odnos veličine redoks-potencijala (Eh) u zavisnosti od procenta redukovanog oblika u polućeliji.

Slika 10.7 - Veličina redoks-potencijala u odnosu na procenat redukcije

Кriva na slici 10.7 liči na titracionu krivu slabe kiseline za koju važi Henderson-Hasselbalch-ova jednačina:

Poznata Nernstova jednačina redoks potencijala ima isti oblik:

gde je R=8,31 J K-1 mol-1 gasna konstanta, T=temperatura u °K, n = broju izgubljenih elektrona pro mol, F=9,65x104 Cmol-1 — Faraday-ova konstanta. Zamenom ovih vrednosti u gornju jednačinu i prevođenjem u dekadne logaritme, dobija se da je:

Vrednosti [Xoks] i [Xred] označavaju molarne koncentracije oksidovanog i redukovanog oblika.Pomoću gornje jednačine, koristeći standardni redoks potencijal i uzimajući stvarni odnos redukovanog i oksidovanog oblika prenosioca elektrona u mitohondrijama može da se izračuna postojeći redoks potencijal. Tako je npr. standardni potencijal citohroma c Eo= +0,25 V, a u mitohondrijama iznosi +0,28 V, jer je odnos oksidovanog citohroma c (75%), prema redukovanom (25%) tri, pa je Eh=+0,25+0,059 log 3 = + 0,25V.Vidimo, ako ima više oksidovanog oblika, redoks-potencijal daje pozitivniji, ako bi bilo više redukovanog, bio bi negativniji.

10.5 KONZERVISANJE ENERGIJE U RESPIRATORNOM LANCU

Za sve svoje životne potrebe ćelija dobija energiju oksidacijom hranljivih sastojaka do CO2 i H20. Tako se oksidacijom glukoze do laktata dobija -197 kJ, a oksidacijom do CO2 i H20 skoro 15 puta više, odnosno -2 880kJ:

Glukoza → 2 laktata ΔG = -197 kJGlukoza + 6 O2→ 6CO2 + 6H2O ΔG = -2880 kJ

Pod aerobnim uslovima se, dakle, dobija daleko više energije, jer su se svi vodonikovi atomi glukoze oksidovali u H2O.Oksidativna razgradnja ili respiracija odigrava se u tri stupnja, kao što smo u ranijim izlaganjima videli, a to su:

Nastajanje acetil-Koenzima A oksidativnom razgradnjom piruvata, masnih i aminokiselina,

Oksidacija acetil-ostatka do CO2 i četiri para vodonika u Krebs-ovom ciklusu i

Oksidacija četiri para vodonika, koji su se vezali za NAD i redukovali ga u NADH, prenošenjem njegovih elektrona u respiratornom lancu sve do kiseonika.

Promena slobodne energije u respiratornom lancu proporcionalna je veličini redoks-potencijala (Eh) , broju prenesenih elektrona (n) i konstanti F (Faraday-eva konstanta):

ΔG = -nF·Eh

ili ako uzmemo standardne uslove:ΔG°'= -nF·E°'

Pomoću ove jednačine može da se izračuna promena slobodne energije za svaki stupanj prenosa elektrona u respiratornom lancu, polazeći od supstrata pa sve do kiseonika. Na slici 10.6 se vidi kako je ukupna promena slobodne energije oksidacije NADH, koja iznosi —220 kJ, raspoređena na pojedine prenosioce elektrona. Energija se postupno oslobađa u više »paketa«, koji su negde veći (strmiji), a negde manji.Energija oksidacija se ne oslobađa u vidu toplote, jer se svi procesi u ćeliji (odnosno u mitohondrijama) odigravaju na konstantnoj temperaturi. Ova energija se ugrađuje u jedan endergonski proces, u kome iz adenozin difosfata i neorganskog fosfata (Pi) nastaje adenozin-trifosfat (ATP):

ADP + Pi → ATP + H2O ΔG° = + 31kJOvu sintezu katalizuju enzimi, koji se nalaze u unutrašnjoj membrani mitohondrija, a zovu se adenozin-trifosfataze.Pojavu, da je korišćenje energije bioloških oksidacija povezano sa fosforilacijom opazili su Warburg i Christian 1939 g. Ovaj proces se zove oksidativna fosforilacija. Ona može da se odigrava na nivou supstrata i u respiratornom lancu. Pomoću gornje reakcije se slobodna energija oksidacija hvata i čuva vezana u obliku ATP-a. U ćeliji centralno mesto u ekonomisanju energijom ima ATP. To je jedino jedinjenje, koje preuzetu energiju može dalje da preda endergonskim reakcijama. Povezivanje egzergonskih s endergonskim reakcijama zove se u biohemiji kuplovanje. Sistem ATP/ADP povezuje procese u kojima se oslobađa energija, s onima, koji je troše.U respiratornom lancu je na tri mesta promena slobodne energije prenošenja, elektrona dovoljno velika, da može da obezbedi energiju za

sintezu jednog mola ATPa To su mesta fosforilisanja. Na drugim mestima u lancuje promena slobodne energije relativno mala i možda nije dovoljna za sintezu ATP-a. Tri mesta fosforilisanja se vide na slici.Slika 10.8 - Oslobađanje energije tokom prenosa dva elektrona u respiratornom

lancu

Belitser je prvi primetio da, kada se meri potrošnja kiseonika u toku disanja homogenata jetre u prisustvu supstrata (npr. piruvata), dodani neorganski fosfat prelazi u organski, vezan za ATP. Eksperimentalno je utvrđeno da je odnos nastalog ATP-a po atomu utrošenog kiseonika (P/O) u proseku 3. Na taj način je potvrđeno da u respiratornom lancu postoje tri mesta na kome se dobija energija. U tabeli 10.3 je dat odnos P/O za svaki od stepena oksidacije piruvata u ciklusu limunske kiseline.

Tabela 10.3 - P/O za svaki stepen oksidacije piruata u ciklusu limunske kiseline

Iz tabele se vidi da oksidacijom piruvata nastaje 15 mola ATP-a, a zato je potrebna energija od 15 x 31 kJ = 465 kJ. Oksidacijom piruvata do CO2 i H2O oslobodi se — 1190 kJ, od kojih se sačuva u obliku ATP-a 465 kJ odnosno 39%. U toku kompletne oksidacije glukoze do CO2 i H2O u procesu glikolize i CLK nastaje 36 mola ATP-a:

U procesu glikolize:

Glukoza+2 Pi+2 ADP+2 NAD+ → 2 piruvata+2 NADH+2 H++2 ATP+2 H2O

U ciklusu limunske kiseline:

2 piruvata+5 O2 + 30 ADP + 30 Pi → 6 CO2 + 30 ATP + 34 H2OPored toga nastaju još 4 ATP-a oksidacijom dva molekula NADH, koji se stvara kod aerobnog prelaženja glukoze u piruvat:

2 NADH+2 H++O2+4 Pi+4 ADP → 2 NAD++4 ATP+6 H2OIskorišćenje promene slobodne energije, koja se dobija oksidacijom glukoze (–2880kJ) iznosi 39%.

10.6 MEHANIZAM OKSIDATIVNE FOSFORILACIJE

Videli smo da se znatan deo slobodne energije oksidacija može da sačuva u obliku ATP-a. Da spomenemo da postoji još jedan alternativni proces, koji

troši energiju, a to je prenos katjona kroz unutrašnju mitohondrijalnu membranu. Postoje takođe i drugi putevi koji kompetiraju sa fosforilacijom ATP-a. Jedan od njih je prenošenje vodonika od NAD+ na NADPH. U svim tim slučajevima mora da postoji neki mehanizam pomoću koga se slobodna energija oksidacija prevodi u druge oblike energije.Mehanizam nastajanja ATP-a u oksidativnom stupnju glikolize objašnjenje pre 50 godina. To je primer oksidativne fosforilacije na nivou supstrata (slika 10.7). Bitnu ulogu u ovom procesu imaju SH-grupe enzima, gliceraldehid-3-fosfatdehidrogenaze. Oksidacijom — SH grupe nastaje tio-acilna veza RCO~ S — E, koja je bogata energijom (~). Ona se u prisustvu neorganskog fosfata cepa u drugi energetski bogati intermedijer R-CO-P (1,3-difosfoglicerat), koji prenosi fosfatnu grupu na ADP. Ukupna reakcija je egzergonska.Mehanizam oksidativne fosforilacije u respiratornom lancu objasnio je Mitchel, za šta je dobio Nobelovu nagradu 1978 g. Ona se odigrava u unutrašnjoj membrani mitohondrija, pod katalitičkim dejstvom kompleksa adenozin-trifosfataza. Oksidativna fosforilacija u mitohondrijama je vrlo osetljiv proces, za koji je neophodno da je unutrašnja membrana mitohondrija intaktna. Onaje vrlo osetljiva na specifične inhibitore npr. 2,4-dinitrofenol. Ovi inhibitori onemogućuju povezani rad oksidacije sa fosforilacijom i zato se nazivaju dekopulatori oksidativne fosforilacije. Oni takođe inhibiraju bubrenje izolovanih mitohondrija u prisustvu ATP-a.Mitchel-ovo objašnjenje oksidativne fosforilacije u respiratornom lancu polazi od činjenice da se pri prenošenju elektrona od vodonikovih atoma, stvaraju protoni:

2H → 2H+ + 2ePošto je unutrašnja membrana mitohondrija nepermeabilna za protone stvara se gradijent protona, koji aktivira enzime sinteze ATP-a, tako da nastaje ATP. Protoni se pojavljuju u respiratornom lancu na svakom mestu, gde je prenos vodonika povezan sa prenosom elektrona (slika 10.8).Oni se pojavljuju u jednom pravcu: Npr:

FADH2 + 2Fe3+ → FAD + 2Fe2++2H+

a troše se u suprotnom:2Fe2++ ½ O2+2H+ → 2 Fe3++2 H2O

Slika 10.9 - Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (primer oksidativne fosforilacije na nivou supstrata)

Ako procesi u respiratornom lancu teku od jedne strane unutrašnje membrane prema drugoj, onda se najednoj dešava potrošnja protona, a na drugoj njihovo otpuštanje. Na slici 10.10 je pokazano kako u toku oksidacije NADH respiratorni niz tri puta savija, sa jedne na drugu stranu membrane. Pri tome se tri para protona potroše na strani okrenutoj matriksu, a izbace se na spoljnu stranu. Rezultat ovakvog kretanja protona je povećanje pH (suvišak OH-) na strani matriksa, a na spoljnoj stran membrane smanjenje pH (višak H+) Mitchel je pomoću osetljivih aparata

registrovao ove promene pH.

Rezultat oksidacije jednog NADH je prenos 6H+ od unutrašnje strane membrane prema spoljnoj. –SH2 na slici 10.9 označava oksidaciju sukcinata, koja se odigrava u dva prelaženja četiri protona.Zbog ovakvog kretanja protona od jedne na drugu stranu membrane stvara se gradijent elektrona preko membrane:

Svaki gradijent stvara silu, koja teži da tera protone natrag u matriks (protonmotorne i elektromotorne sile). Mitchel je dokazao da gradijent protona daje energiju za nastajanje ATP-a.

10.7 TRANSPORT METABOLITA KROZ MEMBRANU MITOHONDRIJA

Unutrašnja membrana nije permeabilna za sve rastvorne supstance, i zbog toga je njihova koncentracija unutar matriksa veća, a brzine njihovih reakcija su vrlo velike. Međutim, mitohondrije moraju da budu na neki

Slika 10.10 - Premeštanje protona kroz unutrašnju mitohondrijalnu membranu

način povezane sa svojom intracelularnom okolinom i zato postoji selektivni transport kroz unutrašnju membranu. Spoljna membrana je permeabilna za sve molekule, izuzev onih najvećih.Selektivni transport kroz membranu odigrava se posredstvom permeaza ili prenosioca, koji je specifičan prema supstratu koji prenosi ili nekoj njegovoj strukturnoj osobini. Brzina prenosa, pored toga, slično brzini enzimskih reakcija dostiže maksimum kod jedne određene koncentracije supstrata koji prelazi. Selektivni transport je osetljiv na specifične inhibitore.Neke rastvorene supstancije kao što su: piruvat, masne kiseline i ketonska tela, koje su osnovni supstrat mitohondrijalnih oksidacija, prolaze kroz unutrašnju membranu bez specifičnog prenosioca. Ove monokarbonske kiseline prolaze u obliku nedisosovanih molekula:

Nedisosovani molekuli ovih kiselina ne utiču na jonsku ravnotežu membrane i, pošto se potpuno oksiduju do CO2 i H2O, one ne utiču ni na osmotsku ravnotežu.Dikarbonske i trikarbonske kiseline ciklusa limunske kiseline (CLK) ne prolaze slobodno kroz unutrašnju membranu, kao monokarbonske kiseline. Pošto su one jače kiseline, nalaze se uglavnom u obliku jona. One, dakle, moraju da se transportuju u obliku svojih anjona. Da bi se održala elektroneutralnost membrane, mora jedan drugi anjon da se kreće u suprotnom pravcu. Na slici 10.11 je prikazan transport intermedijera CLK i fosfata kroz unutrašnju membranu mitohondrija. U ovom slučaju je fosfat suprotni anjon koji neutrališe prolaz malata i sukcinata. Fumarat i oksalacetat ne mogu da prođu kroz unutrašnju mitohondrijalnu membranu.Citrat, izo-citrat i α-ketoglutarat, takođe, prolaze kao anjoni. Njihov suprotni anjon je malat, a ne fosfat.Videli smo da je dobijanje ATP-a u mitohondrijama jedna od njihovih primarnih funkcija. Zbog toga je ulaženje ADP-a u

Slika 10.11 - Transport fosfata i intermedijera CLK kroz mitohondrijalnu

membranu

mitohondrije i izlaženje ATP-a iz mitohondrija važan proces. Pokazano je da se i on odigrava posredstvom specifičnih permeaza (prenosilaca) osetljivih na ihibitor atraktilozid.I ovaj prenosni sistem radi na principu suprotnog jona. Ovde se recipročno pomeraju dva anjona ADP3- u mitohondrije, a ATP4- iz mitohondrije u odnosu 1:1. Jedan negativan naboj više ATP-u kompenziran je potencijalnim gradijentom protona, odnosno izlaženjem H+. Zbog ovog recipročnog pomeranja koncentracija ADP+ATP unutar mitohondrija se održava na konstantnom nivou.Unutrašnja membrana mitohondrija je nepermeabilna prema katjonima (Na+,K+ ili Mg2+) i anjonima (Cl–, Br–, NO3

–). Vrlo mnogo je studiran uticaj Ca2+ jona, koji ubrzava disanje mitohondrija, a sprečava sintezu ATP-a. On odvaja prenos elektrona od oksidativne fosforilacije (dekopulator). Zapaženo je da dolazi do taloženja kalcijum fosfata u matriksu, koji se vidi pod elektronskim mikroskopom. Pošto inhibitori prenosa elektrona (npr. CN–) inhibiraju i ulaženje Ca2+ u mitohondrije, to je dokaz da je to aktivni proces, energetski zavisan od sinteze ATP-a. U odsustvu kiseonika ili ATP-a, Ca2+joni se ne nagomilavaju u matriksu.I drugi katjoni (Na+ i K+) mogu aktivno da se nagomilavaju u mitohondrijama, samo je njihov transport neznatan u odnosu na Ca2+. U svakom slučaju prenos katjona i oksidativna fosforilacija su dva alternativna procesa, koja troše energiju disanja.

10.8 ZAOBILAZNI SISTEMI (SHUTTLE) KOJI POVEZUJU MATRIKS SA CITOPLAZMOM

Unutrašnja membrana je nepermeabilna za: NAD+, NADH, koenzim-A i acil koenzim A. Ova jedinjenja se nalaze i u matriksu i u citoplazmi odvojeni unutrašnjom membranom. Ona se, dakle, nalaze u dva rezervoara (»pool«-a), intra- i ekstra-mitohondrijalnom »pool«-u. Vrlo često je potrebno da ova jedinjenja pređu iz jednog rezervoara u drugi. U ovakvim situacijama postoje putevi, koji zaobilaze nepermeabilnost membrane prema NADH, acetil i acil-koenzima A. Ovi putevi se nazivaju »shuttle« (šatl) sistemi. Oni povezuju tri glavna metabolična puta:

glikolizu, oksidaciju i sintezu masnih kiselina.Slika 10.12 - Glicerolfosfatni i malatni zaobilazni put („shuttle“) prenošenje

redukcionih ekvivalenata (NADH) iz citoplazme u mitohondrije

Kada se povećaju zalihe NADH u citoplazmi, njegovi redukcioni ekvivalenti (H°), prenose se u mitohondrije pomoću glicerol-fosfatnog puta. Ovaj zaobilazni put ide tako, da NADH prvo reaguje sa dihiroksiaceton-fosfatom, koji preuzima reduk-cione ekvivalente

prelazeći u glicerol-3-fosfat. Reakciju katalizuje glicerol-fosfat-dehidrogenaza:

Slika 10.13 - Acetil-koenzim A zaobilazni („shuttle“) sistemi

Nastali glicerol-3-fosfat prolazi kroz unutrašnju membranu i dejstvom mitohondrijalnog enzima (glicerol-3-fosfat dehidrogenaze) prelazi ponova u dihidroksiaceton--fosfat. Svoje redukcione ekvivalente je predao flavoenzimu i oni će se oksidovati do H20. Ponovo nastali dihidroksiaceton-fosfat izlazi iz mitohondrija i može ponova da prenese vodonik citoplazmatskog NADH (slika 10.12) Ovaj zaobilazni put unosi redukcione ekvivalente iz citoplazme u mitohondrije, a ne u suprotnom smeru. Za prenošenje redukcionih ekvivalenata sa NADH iz mitohondrija u citoplazmu i obrnuto, znači koji radi reverzibilno, postoji malatni »shuttle«.

Dejstvom citoplazmatične malat-dehidrogenaze, NADH predaje vodonikove atome oksalacetatu, koji se redukuje u malat. Malat ulazi u mitohondriju, pomoću specifičnog prenosioca i prelazi dejstvom mitohondrijalne malat-dehidrogenaze ponova u oksalacetat. Unutar mitohondrija oksalacetat se transaminacijom prevodi u aspartat, koji može da prođe membranu preko specifičnog prenosioca. Slična transaminaza se nalazi i u citoplazmi.Malatni »Shuttle« zbog toga radi u oba pravca.Oksidacija masnih kiselina, koje se mobilizuju iz adipoznog tkiva, dešava se u mitohondrijama. Da bi se oksidovale, one se prvo »aktivišu« dejstvom tiokinaze, koja se nalazi na spoljnoj membrani mitohondrija. Aktivne masne kiseline vezane za koenzim A ne mogu da prođu unutrašnju membranu. Zaobilazni put prenošenja viših masnih kiselina, karnitinski »shuttle« prikazanje na slici 10.13. U ovom zaobilaznom putu dejstvuju dve acil-transferaze, koje prenose kiselinski ostatak masne kiseline sa koeazima A na karnitin. One se nalaze sa svake strane unutrašnje membrane

Prenošenje acetil-koenzima A iz mitohondrija u citoplazmu, gde se odigrava sinteza masnih kiselina, omogućava citratni »shuttle«. Unutar mitohondrija dejstvom ci-trat-sintaze, acetil-koenzim A se kondenzuje s oksalacetatom gradeći citrat. Citrat izlazi iz mitohondrija pomoću specifičnog prenosioca. U citoplazmi citrat predaje acetil-ostatak koenzimu A dejstvom specifične ligaze, i ostaje oksalacetat (slika 10.13)

UKRATKO:

Oksidativni metabolizam se odigrava u mitohondrijama.

Mitohondrije imaju dve membrane, spoljnu i unutrašnju. Spoljna je permeabilna za većinu niskomolekulskih jedinjenja. Unutrašnja gradi mnogobrojne uzdužne nabore (kriste) i zbog toga joj je površina jako velika.

Unutrašnja membrana obrazuje dva unutrašnja prostora: matriks i intermolekulski prostor.

U matriksu se nalaze rastvorni enzimi. Oni katalizuju većinu reakcija CKL, β-oksidaciju masnih kiselina, neke stepene glukoneogeneze i metabolizam aminokiselina.

U unutrašnjoj membrani mitohondrija smeštene su sve važne dehidrogenaze, svi citohromi i faktori koji učestvuju u sintezi ATP-a.

Promena slobodne energije u respiratornom lancu proporcionalna je veličini redoks-potencijala, broju prenesenih elektrona i Faradejevoj konstanti.

U mehanizmu nastajanja ATP-a bitnu ulogu imaju SH-grupe enzima gliceraldehid-3-fosfatdehidrogenaze. Oksidacijom SH-grupa nastaje tio-acilna veza koja je bogata energijom. Ona se u prisustvu neorganskog fosfora cepa u 1,3-difosfoglicerat koji prenosi fosfatnu grupu na ADP.

Dobijanje ATP-a je primarna funkcija mitohondrija.

BIOHEMIJSKE FUNKCIJE TELESNIH TEČNOSTI I ORGANA

11.1 BIOHEMIJA KRVI

Krv je viskozna tečnost koja se sastoji od ćelija i plazme. Na eritrocite otpada više od 99% ćelija; to znači da leukociti nemaju praktično nikakvog udela u fizičkim osobinama krvi. Plazma je deo ekstracelularne tečnosti, a tečnost u ćelijama je deo intracelularne tečnosti. Hematokrit krvi je onaj procenat koji u krvi čine ćelije. Ako, dakle, kažemo da neko ima hematokrit 40, to znači da 40% volumena krvi čine ćelije, a ostakat od 60% čini plazma. Hematokrit bitno utiče na viskozitet krvi, što je on veći to je veća viskoznost. Na viskoznost krvi utiču i koncentracija i vrste belančevina u plazmi. Plazma je deo vanćelijske tečnosti. Ona je gotovo identična intersticijskoj tečnosti koja se nalazi između ćelija u tkivima, no među njima postoji jedna bitna razlika: u plazmi ima oko 7% belančevina, dok intersticijska tečnost ima oko 2% proteina. Belančevine plazme dele se na albumin, globuline i fibrinogen. Glavna funkcija albumina je uspostavljanje osmotskog pritiska na kapilarnoj membrani. Taj pritisak, nazvan koloidno-osmotski pritisak, sprečava filtraciju plazme iz kapilara u intrasticijske prostore. Globulini se dele na tri glavne vrste: alfa, beta i gama. Alfa-globulini i beta-globulini obavljaju u cirkulaciji različite funkcije: vežu se sa drugim supstancama i tako ih prenose, predstavljaju supstrate iz kojih nastaju druga jedinjenja, prenose se kao belančevine iz jednog dela tela u drugi. Gama-globulini, a donekle i beta-globulini, imaju posebnu ulogu u odbrani organizma od infekcija, jer grade većinu antitela. Antitela štite organizam od infekcija i toksičnih agenasa te ga na taj način čine imunim. Fibrinogen je u plazmi veoma važan za procese zgrušavanja krvi. Krv je prenosioc hranljivih supstanci, ćelijskih ekskreta, hormona, elektorlita i ostalih sastojaka iz jednog dela tela u drugi. Glavna funkcija eritrocita je prenos hemoglobina, koji tkivima donosi kiseonik iz pluća. Sinteza hemoglobina počinje u eritroblastima i nastavlja se u normoblastima. Čak i mladi eritrociti, pošto napuste koštanu srž i pređu u krvotok, stvaraju još nekoliko dana hemoglobin. Budući da je gvožđe važno za sintezu hemoglobina, mioglobina i drugih supstanci kao što su citohromi, citohrom-oksidaza, peroksidaza i katalaza potrebno je razumeti kako se gvožđe iskorištava u organizmu. Ukupna količina gvožđa u telu iznosi oko 4 gr. približno 65% tog gvožđa nalazi se u hemoglobinu, oko 4% ima ga u mioglobinu, 1% u različim jedinjenjima koja sadrže hem i koja kontrolišu intracelularnu oksidaciju, 0,1% u transferinu u plazmi, a 15 do 30% usladišteno je uglavnom u obliku feritina. Gvožđe se nakon apsorpcije iz tankog creva veže odmah za beta-globulin transferin kojim se prenosi u plazmu. Gvožđe je veoma labavo vezano za globulin pa se

lako može predati bilo kojoj ćeliji u telu. Višak gvožđa može se uskladištiti u svim ćelijama, naročito u ćelijama jetre gde ga ima oko 60%. U ćelijama se gvožđe veže sa apoferitinom s kojim gradi feritin. Protein apoferitin ima veliku molekulsku težinu te se za njega mogu vezati bilo male bilo velike količine gvožđa. To gvožđe odloženo u feritnu, zove se rezervno gvožđe. Kad je ukupna količina gvožđa u telu veća od količine koju može primiti feritin, ono se skladišti u veoma teško rastvorljivom obliku zvanom hemosiderin. Kad eritrociti prožive svoj vek i raspadnu se, ćelije EPR fagocituju oslobođeni hemoglobin, iz kojeg se zatim otpušta gvožđe. To se gvožđe ili ponovo skladišti u feritinu ili se upotrebljava za ponovnu sintezu hemoglobina. Eritrociti posle prelaska iz koštane srži (u kojoj nastaju) u krvotok žive 120 dana i potom se raspadaju. Starenjem eritrocita njihova membrana slabi, kad postane veoma krhka, ona može prsnuti pri prolasku kroz neko suženo mesto u cirkulaciji. Čim se hemoglobin oslobodi iz eritrocita on se odmah fagocituje i razgradi. Gvožđe se transferinom prenosi bilo do koštane srži gde služi za sintezu novih erotrocita, bilo u jetru gde se skladišti u obliku feritina. Hem se u ćelijama EPR pretavara u nekoliko faza u žučni pigment bilirubin koji se zatim otpušta u krv i putem jetre izlučuje u žuč. Nedostatak eritrocita dovodi do anemije. Najčešći uzroci anemije su: a) gubitak krvi, b) aplazija koštane srži, c) poremećaji u sazrevanju eritrocita, d) hemoliza eritrocita koja može nastati zbog: trovanja lekovima; naslednih bolesti; fetalne eritroblastoze. U teškim anemijama viskoznost krvi se jako smanjuje. Pojavljuje se hipoksija. Sve to dovodi do povećanog opterećenja srca.Leukociti su pokretne jedinice zaštitnog sistema u telu. Delom nastaju u koštanoj srži, a delom u limfnim čvorovima (limfociti); nakon toga prenose se krvlju u različita područja tela u kojima će se iskoristiti. U krvi normalno postoje pet vrsta leukocita. To su: polimorfonuklearni neutrofilni leukociti, polimorfonuklearni eozinofilni leukociti, polimorfonuklearni bazofilni leukociti, monociti i limfociti. U krvi ima i mnogo trombocita; to su delovi šeste vrste leukocita, megakariocita. Sve tri vrste polimorfonuklearnih leukocita pokazuju zrnastu strukturu, zbog čega se nazivaju granulocitima. Granulociti i monociti štite organizam od uzročnika zaraza fagocitozom. Jedan oblik delovanja limfocita je prianjanje uz štetne uzročnike i njihovo razaranje; ta uloga pripada imunološkom sistemu. Konačno, trombociti pokreću mehanizam zgrušavanja krvi. Svaka od tih funkcija na svoj način doprinosi zaštiti organizma. Osim leukocita, značajan doprinos odbrani organizma daje retukilo-ednoplazmatični sistem, koga ima svuda po telu. U EPR sistemu srećemo dve vrste ćelija: a) one koje potiču uglavnom od monocita te su

povećanjem svog volumena postale tkivni makrofagi; ima ih u različitim tkivima, a prianjaju uz zid krvnih i limfnih sudova. b) Limfocitne ćelije koje lutaju tkivima ili su uklopljene u posebna limfatična tkiva, kao što su limfni čvorovi.Leukociti imaju značajnu ulogu u upalnim procesima. Upala obuhvata skup uzastopnih promena koje nastaju u tkivima kao reakcija na oštećenje. Kad dođe do oštećenja, iz oštećenog tkiva oslobađa se u okolnu tečnost histamin i drugi humoralni faktori. To povećava lokalni protok krvi i propustljivost kapilara, što uzrokuje izlaženje velike količine tečnosti i proteina u tkivo, te se stvaraju lokalni edemi. Jedna od prvih posledica upale je „ograđivanje“ oštećenog područja, što otežava širenje bakterija. Kad dođe do oštećenja neutrofili se kreću ka oštećenom području. Prvo se prilepe za zid oštećenog kapilara, zatim dolazi do hemotaksije neutrofila prema oštećenom području. To se u krvi manifestuje povećanjem broja leukocita, nastalo kliničko stanje naziva se leukocitoza. Kad u koštanoj srži, zbog lekova ili ozračenja nakon eksplozije atomske bombe, prestane stvaranje leukocita nastaje kliničko stanje nazvano agronulocitoza, ako se ne leči, čovek najčešće umire veoma brzo. Leuhemijom se označava veoma povećan broj leukocita u krvi. Do neobuzdanog stvaranja leukocita može doći zbog maligne mutacije ćelija mijelogenog ili limfogenog reda. Leuhemije se obično dele u dve glavne grupe: limfatičke leuhemije i mijeloičke leuhemije. Prva je posledica metastatičkog rasta leuhemičkih ćelija na neuobičajenim mestima u telu. Leuhemičke se ćelije u koštanoj srži mogu tako brzo deliti da prodiru u okolnu kost koja zbog toga postaje lako lomljiva..bez obzira na to potiču li iz koštane srži ili iz limfnih čvorova, gotovo sve leuhemije zahvataju slezinu, limfne čvorove, jetru i druge dobro prokrvljene delove tela. U tim područjima ćelije brzo rastu i prodiru u okolno tkivo, što dovodi do njegovog razaranja. Za organizam je možda najvažnija posledica leuhemije da maligne ćelije iskorišćavaju za svoj rast goleme količine metaboličkih suptrata. Leuhemično tkivo stvara tako brzo nove ćelije da mu je potrebna silna količina hranljivih supstanci, naročito aminokiselina i vitamina. Zato dok leukemično tkivo raste, druga propadaju, što u krajnjem dovodi do smrti.

11.2 BIOHEMIJA BUBREGA

Bubreg je vrlo važan organ za život. Nalazi se retroperitonealno u lumbalnom predelu. Dug je oko 11 — 12 cm, širok 5 cm, debljine oko 3 cm, a težak oko 120 — 200 grama, Celi bubreg obavijen je vezivnom čaurom oko koje je sloj masnog tkiva koji ga učvršćuje.

Slika 11.1 - Bubrezi

Bubreg je građen od kortikalne (cortex, bubrežna kora) i medularne (medula, srž) supstance. Bubrežna medula sastavljena je od bubrežnih piramida s vrhovima prema hilusu, a između piramida nalaze se izdanci kortikalne mase. U piramidama se nalaze bubrežni kanalići koji završavaju na vrhu u papili kanalićem sa sitnim otvorom. Bubrežna kora je građena od žućkaste supstance. U njoj su crvenkasta Malpighijeva telešca sastavljena od spleta kapilara koje tvore glomerule i Bowmanove čaure koja obavija glomerule. Splet kapilara sastoji se od dovodne arteriole (vas afferens) i odvodne arteriole (vas efferens). Iz glomerula izlazi proksimalni tubul. Iz kore tubul silazi i nastavlja se u Henleovu petlju koja kroz kortikalni izdanak ulazi u piramidu medule. Henleova petlja je na silaznom kraku uža, a na uzlaznom šira. Uzlazni krak se vraća u koru i nastavlja u zavinuti tubul, distalni tubul, a ovaj ulazi u kanalić koji u vrhu piramide prelazi u ductus papilaris. Glomerul zajedno s tubulima čini nefron.

Slika 11.2 - Nefron

U proksimalnim tubulima epitelne ćelije imaju četkast pokrov (Brush border) koji je bogat enzimima (GGT, AAP, AP). U patološkim stanjima prelazak tih enzima u mokraću i kao rezultat toga pojačana enzimurija imaju dijagnostičko značenje, jer ukazuju na bubrežno oštećenje.

11.2.1 FUNKCIJA BUBREGA

Osnovna funkcija bubrega je uklanjanje nepotrebnih i zadržavanje supstanci potrebnih organizmu. Preko bubrega se obavlja:

eliminacija vode,

eliminacija soli,

eliminacija neisparljivih produkata metabolizma, prevenstveno metabolizma azotovih jedinjenja,

eliminacija štetnih i organizmu stranih supstanci, npr. stranih proteina, boja, lekova, otrova,

zadržavanje supstanci potrebnih organizmu: krvnih proteina, glukoze, elektrolita, aminokiselina itd.,

stvaranje amonijaka.

Sve to obavljaju funkcionalno sposobni glomeruli i tubuli bubrega. Prolaskom kroz bubrege krvna se tečnost »pročišćava« (odatle i pojam klirensa), od nepotrebnih i štetnih supstanci.

Ultrafiltracijom u glomerulima stvara se tzv. primarni urin prelaskom vode i niskomolekularnih jedinjenja koji se stvaraju tokom metaboličkih procesa. Na taj se način izlučuju iz organizma neki lekovi i otrovi. Zbog veličine molekule, proteini normalno ne prolaze glomerularni filtar, osim tragova proteina relativne molekularne mase manje od 70 000.

U bubrezima se nadalje reguliše ekskrecija katjona i anjona te stvara amonijak u tubularnom epitelu. Na taj način bubrezi sudeluju u sledećim, za život organizma važnim procesima:

1) U uklanjanju toksičnihsupstanci i otpadnih produkata metabolizma,

2) U regulaciji ravnoteže vode i soli, a time i u održavanju osmotske ravnoteže između krvne tečnosti i tkiva

3) U regulaciji acidobazne ravnoteže.

11.2.2 FUNKCIJA GLOMERULA

Ultrafiltracijom krvne tečnosti u glomerulima stvara se glomerularni filtrat ili primarni urin. Taj se proces filtracije vrši pod određenim pritiskom. Ovaj pritisak, koji se naziva efektivni filtracioni pritisak, rezultat je krvnog pritiska u glomerularnim kapilarama, s jedne strane, i koloidnog osmotskog pritiska krvne plazme te pritiska u Bowmanovoj kapsuli, s druge strane.

Na glomerularnu filtraciju utiču, osim filtracionog pritiska, filtraciona površina preko koje se filtracija vrši (normalno 1,56 m2) i minutni volumen krvnog protoka kroz bubrege (normalno oko 700 ml krvne plazme, odnosno 1200 ml krvi na 1,73 m2 površine tela). Filtraciona površina zavisi od broja glomerula koji su u određenom času u funkciji, jer je obično samo deo od ukupnog broja glomerula u funkciji. Zato je filtraciona površina promenjiva i prilagođava se potrebama veće ili manje filtracije. Kada su svi navedeni faktori normalni, glomerularna filtracija kreće se između 2 i 2,17 ml/s (120 do 130 ml/min), tj. toliko se stvara glomerularnog filtrata u 1 sekundi.

U slučajevima kada je neki od spomenutih faktora promenjen, javljaju se poremećaji koji obično rezultiraju smanjenjem glomerularne filtracije. Zato se ona javlja u stanjima kakva su glomerulonefritis, lezije bubrega i nefroskleroza, koja izazivaju morfološke promene, zbog čega se smanjuje filtraciona površina. Smanjenje glomerularne filtracije zbog sniženog efektivnog filtracionog pritiska nalazi se u stanjima praćenim dehidracijom ili hemokoncentracijom te u izrazito sniženom krvnom pritisku. Takva su stanja: šok, srčane bolesti, hemoragija, teške opekotine, teški prolivi ili povraćanja itd.

Zbog smanjene glomerularne filtracije manje se izlučuju otpadni produkti metabolizma iz organizma, što uzrokuje njihovo zadržavanje ili retenciju. Kako se urinom uklanjaju produkti metabolizma azotnih jedinjenja,

upravo je najizraženija retencija tih jedinjenja (ureja, kreatinin, mokraćna kiselina ili uopšteno NPN–azot).

11.2.3 FUNKCIJA TUBULA

Filtracijom stvoreni primarni urin prolazi kroz tubule. Prolaskom kroz bubrežne tubule iz glomerularnog filtrata se reapsorbuje oko 99% vode, tako da od 125 ml primarnog urina u mokraćnu bešiku dospeva samo oko 1 ml konačnog urina u minuti, ili 0,017 ml/s. Oko 80% vode koja ulazi u tubule reapsorbuje se u proksimalnom delu tubula, u silaznom delu Henleove petlje, izoosmotski u toku reapsorpcije raznih niskomolekularnih supstanci. To je tzv. obligatna reapsorpcija vode, a ostatak od oko 19% reapsorbuje se pod uticajem antidiuretskog hormona. Ova reapsorpcija može varirati i naziva se fakultativna reapsorpcija. Obligatna reapsorpcija vode određena je reapsorpcijom krutih supstanci, ona je konstantna, a od fakultativne reapsorpcije zavisi stvaranje urina sa specifičnom težinom većom od krvne plazme, jer je ona varijabilna i reguliše se fiziološkim potrebama organizma. Sekrecija antidiuretskog hormona iz zadnjeg režnja hipofize pod kontrolom je hipotalamusa, pa povrede hipofize ili hipotalamusa mogu smanjiti njegovo lučenje i, zbog toga, sposobnost tubularnog epitela da fakultativno reapsorbuje deo tečnost, što dovodi do pojave poliurije, tj. izlučivanja većih količina urina nego što je normalno.

Smanjenje fakultativne reapsorpcije usled smanjenog delovanja antidiuretskog hormona rezultira lučenjem urina manje specifične težine, hipostenurijom. Pri potpunom pomanjkanju antidiuretskog hormona izostaje potpuno fakultativna reapsorpcija u tubulima, te se luče velike količine, u ekstremnim slučajevima i do 30 L urina na dan, specifične težine jednake krvnoj plazmi. Izlučivanje takvog urina naziva se izostenurija. To se nalazi u bolesti nazvanoj diabetes insipidus.

Osim vode, u tubulima se reapsorbiraju i druge supstance sadržane u primarnom urinu. U proksimalnim tubulima reapsorbuju se natrijum, kalijum, hloridi, fosfor, aminokiseline, glukoza i neki druge supstance. U distalnim tubulima reapsorbiraju se hloridi, kalcijum, dok se neke supstance i secerniraju, kao kalijum, stvoreni amonijak, a tu se vrši i izmena jona i zakišeljavanje urina. Na taj način bubreg reguliše koncentracije mnogih supstanci u krvi. Glukoza se u proksimalnim tubulima reapsorbuje do koncentracije od oko 10 mmol/L (180 g/dl) u krvi, tj. oko 1,22 do 1,28 mmol (220 — 230 mg) u minuti, što predstavlja bubrežni prag za glukozu. Aminokiseline i joni se većim delom reapsorbuju, ureja oko 40%, a neke otpadne i štetne supstance se uopšte ne reapsorbuju, nego potpuno prelaze u konačni urin, čak se neke (neki lekovi, boje) i secerniraju u tubulima, što se obično odigrava u distalnim tubulima.

Konačni produkt svih tih procesa u bubrezima je izlučivanje oko 1 do 2 litre konačnog urina sa oko 60 g suve supstance (ureja, NaCl, soli kalija i kalcija, krea–tinin, urati i dr.).

Bubreg ima i endokrine funkcije, jer se u njemu stvaraju ili aktiviraju neki hormoni. U bubregu se stvaraju renin, prostaglandini i eritropoetin. Renin i prostaglandini sudeluju u regulaciji krvnog pritiska. U kori bubrega stvara se i kalikrein koji deluje na kininogenski supstrat pa nastaje kalidin, spoj vazodilatatorskog i natriuretskog djelovanja, a kalikrein je u vezi i s renin–angiotenzin sistemom koji utiče na aldosteron i time na koncentracije natrijuma i kalijuma u plazmi. Prostaglandini se stvaraju u bubrežnoj meduli i deluju takođe vazodilatatorski snizujući krvni pritisak, a deluju i na stvaranje renina. Eritropoetin pospešuje proliferaciju i sazrevanje ćelija crvene krvne loze u koštanoj moždini. Zbog toga se često kod insuficijencije bubrega javlja i anemija.

Nadalje u bubregu se razgrađuju inzulin, glukagon i aldosteron, a u bubregu se takođe stvara 1,25 (OH)2D3, aktivni oblik vitamina D.

Konačan sastav plazme i urina kod bubrežnih bolesti zavisi od odnosa između oštećenih glomerula i tubula i od broja oštećenih nefrona. Kad imamo:

A ) Smanjenu funkciju glomerula a normalnu funkciju tubula

Kod osoba sa niskom glomerularnom filtracijom moglo bi biti stimulisano izlučivanje ADH. Kada ADH deluje na distalni nefron, može se reapsorbovati relativno više vode nego rastvorenih supstanci; time se umanjuje zapremina i stvara se urin s mnogo većim osmolalitetom nego što ga ima plazma. Visoka osmolalnost urina potiče uglavnom od supstanci na koje tubuli aktivno ne deluju. Na primer, koncentracija ureje je mnogo veća u urinu nego u plazmi. Takva će reakcija distalnog dela nefrona biti samo u prisustvu ADH.Udeo izlučivanja ureje i kreatinina zavisi od brzine glomerularne filtracije. Kad brzina filtracije nije u ravnoteži s brzinom produkcije ovih supstanci, njihova koncentracija u plazmi će se povećati.Pri razgradnji ćelija oslobađaju se fosfat i urat, koncentracije u plazmi im rastu jer se abnormalno malo izlučuju filtracijom. Do proksimalnih tubula stiže ih manje, a ta se količina može reapsorbovati. Kad je smanjena zapremina filtrata dolazi do reapsorpcije natrijuma sa izoosnotskim mehanizmima, pa ga se manje može zameniti sa kalijumovim ili vodonikovim jonima. To ima dve važne posledice:Smanjenje izlučivanja vodonikovih jona u celom nefronu. Pošto se bikarbonat može sačuvati samo uz izlučivanje vodonikovih jona smanjiće se udeo bikarbonata u plazmi.

Smanjenje izlučivanja kalijuma u distalnom nefronu, što ima za posledicu zadržavanje kalijuma. Kalijum sei dalje može reapsorbovati proksimalno.

Lučenje aldosterona u sistemu biće maksimalno samo kada nisku glomerularnu filtraciju prati smanjen protok krvi u bubrezima. U takvim se slučajevima u distalnom nefronu reapsorbuje gotovo sav natrijum u zamenu za kalijumove i vodonikove jone, te u urinu ostane malo natrijuma.Zbog toga će rezultati analiza venske plazme i mokraće iz obolelog nefrona biti sledeći:U plazmi:Visoke koncentracije ureje i kreatinina;

Niska koncntracija bikarbonata i nizak pH;

Hiperkalemija;

Hiperurihemija i hiperfosfatemija.

U mokraći: Smanjem volumen;

Niska koncentracija natrijuma; samo kada je usporen protok krvi kroz bubrege (koji stimuliše izlučivanje aldosterona);

Visoka koncentracija ureje i zbog toga visoka osmolalnost, samo kada je stimulisano izlučivanje ADH.

B ) Smanjenu funkciju tubula uz normalnu funkciju glomerula

Kada su oštećene ćelije tubula, otežana je regulacija sastava i zapremine urina. Smanjena reapsorpcija rastvorenih supstanci iz proksimalnih tubula umanjuje izoosmotsku reapsorpciju vode na tom mestu. Smetnje se mogu pojaviti u smanjenoj sposobnosti reagovanja na ADH, zbog čega će se stvarati velika zapremina prekomerno razređenog urina. Tubuli ne mogu izlučivati vodonikove jone, pa ne mogu normalno apsorbovati bikarbonate ni zakiseliti urin.Ometena je i reapsorpcija glukoze, fosfata, magnezijuma, urata i aminokiselina. U plazmi mogu biti smanjenje koncentracije fosfata, magnezijuma i urata. Što će dovesti do sledećih rezultata:U plazmi:

Normalna koncentracija ureje i kreatinina, ( zbog normalne funkcije glomerula);

Zbog defekta proksimalnih ili distalnih tubula: niska koncentracija bikarbonata i nizak pH, kao i hipokalemija;

Zbog defekta proksimalnih tubula: hipofosfatemija, hipomagnezemija i hipourihemija.

U urinu:Zbog defekta proksimalnih i/ili distalnih tubula: povećana zapremina urina, povišen pH u odnosu na pH plazme;

Zbog defekta distalnih tubula: neadekvatno visoka koncentracija natrijuma, neadekvatno niska koncentracija ureje i zbog toga niska osmolalnost i pored stimulišenog lučenja ADH;

Usled defekta proksimalnih tubula: opšta aminoacidurija, fosfaturija, glikozurija.

Klinički sindromi bolesti bubregaPostoji spektar stanja s promenljivim odnosima između disfunkcije tubula i glomerula.Kada se brzina glomerularne filtracije smanjuje, zadržava će se supstance na koje tubuli mnogo ne utiču, na primer ureja i kreatinin. Njihov klirens pada, a njihove koncentracije u plazmi rastu, iako retko prelaze referentne vrednosti, sve dok brzina glomerularne filtracije nije približno 30% niža od normalne.Stepen retencije kalijuma, urata i fosfata zavisi od ravnoteže između stepena glomerularne retencije i gubitka zbog smanjene reapsorpcije u proksimalnim tubulima. Na glomerularnoj fazi odvaja se filtracijom tako malo da koncentracije u plazmi rastu premda je zakazala reapsorpcija, dok je u tubulima reapsorpcija kalijuma, urata i fosfata doduše smanjena, ali ipak više nego dovoljna za izjednačavanje retencije izazvane nedovoljnom filtracijom. Koncentracije u plazmi mogu biti normalne ili čak niske. Zapremina urina na sličan način zavisi od ravnoteže između volumena filtrata i dela tečnosti reapsorbovane u tubulima.Filtracija u glomerulima prestaje i bolesnik postaje anuričan, a na tubulima se i pored nedovoljne filtracije može toliko zaustaviti reapsorpcija da on trpi od poliurije. Budući da se normalno reapsorbuje

99% filtrirane vode, vrlo mali pad reapsorpcije može izazvati velik porast zapremine urina.Dok koncentracija ureje i kreatinina u plazmi najviše zavisi od funkcije glomerula, koncentracija tih supstanci u urinu gotovo potpuno zavisi od tubula. Kako god bio mali volumen glomerularnog filtrata, on uvek ima sastav ultrafiltrata plazme. Taj se sastav menja samo delovanjem tubula.Što je jače oštećena funkcija tubula, to su koncentracije urina sličnije koncentraciji plazme.Akutna oligurijaO oliguriji se govori kad je zapremina urina odrasle osobe manja od 400 ml na dan. To obično znači da je glomerularna filtracija usporena. Akutnu oliguriju sa neznatnim oštećenjem bubrega, ali usporenom glomerularnom filtracijom, izazivaju mehanički faktori koji umanjuju gradijent hidrostatičkog pritiska između bubrežnih kapilara i lumena tubula. Najčešći uzrok ovog sindoma je nizak pritisak u kapilarima. To se naziva renalna cirkulacijska insuficijencija i može biti posledica:Intravaskularnih gubitaka pune krvi (krvarenja), volumena plazme (zbog gastrointestinalnih gubitaka ili smanjenjog unosa);

Smanjenog pritiska zbog širenja krvnih sudova u šoku.

Ređa je oligurija izazvana porastom pritiska u lumenu tubula. To može biti vanbubrežna ili unutarbubrežna prepreka protoku tečnosti.Intrarenalna opstrukcija može nastati kad je lumen tubula začepljen hemoglobinom, mioglobinom, i ređe uratima i kalcijumkarbonatom. Ti slučajevi opstrukcije cilindrima ili edemom tubularnih ćelija obično su posledica direktnog oštećenja bubrega.Uzroci ekstrarenalne opsrtukcije mogu biti kamenci, neoplazme, kontrakcije ili hipertrofija prostate.Akutna oligurija zbog oštećenja bubrega nastaje često zbog nekog od napred navedenih stanja, a može biti izazvana i: septihemijom, različitim otrovima i akutnim glomerulonefritisom.Cirkulacijska insuficijencija bubrega je verovatno najčešći uzrok usporenog glomerularnog filtriranja, uz relativno normalnu funkciju bubrega. Obično nastaje kad je volumen cirkulacije smanjen usled krvarenja ili gubitka tečnosti u probavnom traktu. Uremiju zbog disfunkcije bubrega pojačava intenzivna razgradnja proteina. Akutno oligurično zatajivanje bubrega često sledi posle razdoblja redukovane glomerularne filtracije zbog nedovoljne cirkulacije kroz bubreg. Izlučivanje aldosterona bit će visoko samo kada je cirkulacija krvi kroz bubrege usporena.

Hronični zastoj bubrega nastaje posle epizode akutnog oliguričnog zastoja bubrega, ali je često i rezultat različih drugih patoloških stanja. U većini slučajeva akutnih oliguričnih stanja bubrezi su difuzno oštećeni i obuhvaćena je glavnina nefrona. U početku mogu glomeruli delovati dovoljno dobro da bi se održala koncentracija ureje i kreatinina u plazmi u okviru normalnih vrednosti, ali s vremenom broj oštećenih glomerula raste, pa raste brzina izlučivanja ureje a time i njena koncentracija u plazmi. Ako se propadanje nefrona nastavlja, stanje se sve više približava glomerularnom kraju spektra, dok konačno oligurija ne izazove nagli porast koncentracije ureje i kalijuma u plazmi. Ako se pacijent ne leči kraj mu je blizu.Sindrom pretežnog oštećenja bubregaU nekim su patološkim stanjima tubuli u većoj meri zahvaćeni nego glomeruli, no s vremenom propada celi nefron. Ćelije tubula mogu biti oštećene na različite načine:Taloženjem teško rastvorljivih supstanci u njima i oko njih. Faktori koji stvaraju predispodiciju za to su: hiperkalcemija, hiperurikemija, Bens Džonsova proteinurija.

Oštećenja egzogenim otrovima, napr. nefrotoksičnim lekovima, kao što su aminoglikozidi, amfotercin, ciklosporin itd.

Drugim otrovima, među njima teškim metalima.

Među uzročnicima koji zbog oštećenja bubrega izazivaju nagomilavanje metabolita ili neke druge toksične supstance u ćelijama, nalaze se: galaktozemija (galaktoza-1-fosfat) i nasledna nepodnošljivost fruktoze (fruktoza-1-fosfat) kao i Vilsonova bolest (bakar), cistinoza (cistin) i Fabrieva bolest (glikosfingolipidi).Nefrotični sindromPovećana je propustljivost glomerula u nefrotičnom sindromu. Kroz glomerule prolaze svi proteini sem onih sa najvećim molekulskim masama. Niska koncentracija ureje u plazmi je posledica pojačane glomerularne filtracije, napr. kod trudnica ili smanjenja sinteze naročito kod dece.Bubrežni kamenciBubrežni se kamenci obično sastoje od normalnih produkata metabolizma kojima je glomerularni filtrate često gotovo zasićen. Kamenci nastaju kad je visoka koncentracija jednog ili nekoliko sastojaka u glomerularnom filtrate i to zbog: normalne funkcije bubrega, ali male zapremine urina; promene pH mokraće, često usled delovanja bakterija; zastoja mokraće, zbog smetnji u pražnjenju bešike; nedostatka normalnih inhibitora.

Bubrežni kamenci mogu biti od kalcijumoksalata, kalcijumfosfata, od mokraćne kiseline, cistina ili ksantina. 70% bubrežnih kamenaca sadrži kalcijum.

11.3 BIOHEMIJA JETRE

Jetra je parenhimatozni organ smešten na desnoj strani abdominalne šupljine. Jetra odraslog čoveka teži oko 1200 do 1600 g, a sastoji se od dva režnja, lobusa, od kojih je desni oko šest puta veći od levog. Jetra je ovijena vezivnom ovojnicom, capsula fibrosa perivascularis, čiji traci ulaze u dubinu. Kroz jetrena vrata na donjem rubu, izmedu desnog i levog režnja, ulaze grane jetrene arterije i portalne vene. Jetra, naime, poseduje dvostruki cirkulacijski sistem. Oko 80% krvi ulazi u jetru portalnim krvotokom kroz portalnu venu, a oko 20% kroz hepatičnu arteriju. Hepatičnom arterijom jetra dobija hranu i kiseonik, a portalnim krvotokom dospevaju u jetru većinom sastojci koji se tu metaboliziraju. Ogranci portalne vene ulaze u prostore izmedu lobula i dalje se granaju u kapilare koje zrakasto ulaze u lobule i formiraju kapilarnu mrežu. Iz venoznih kapilara krv odlazi u centralnu venu koja prolazi sredinom lobula, a odatle u sabirne vene, i na kraju u 4 - 5 hepatičnih vena koje na gornjoj strani jetre ulaze u donju šuplju venu, vena cava inferior . Jetra je na taj način bogato snabdevena krvlju. Osim toga, u jetri je i mreža limfnih sudova kojom intersticijska tečnost i limfa dospevaju iz jetre u opštu cirkulaciju. Iz jetrenih ćelija izlaze žučne kapilare, kolangiole, koje takode čine mrežu između redova ćelija te izlaze iz lobula formirajući interlobularne kanaliće. Iz tih kanalića teče žuč u veće, ductus hepatici. Ti kanalići su omotani vezivnim tkivom i izlaze iz jetre te se spajaju u 5 — 6 cm dugi glavni kanal, ductus hepaticus communis. Ovaj pak s izvodnim kanalom žučne kese stvara ductus choledochus. Sistemom žučnih kanala izlučuje se žuč i u njoj supstance iz jetre u žučnu kesu.

Jetra je sastavljena od velikog broja lobula. Sredinom lobula prolazi centralna vena i paralelno portalnim delom grane portalne vene, hepatične arterije, žučni kanali i limfni sudovi. Portalna vena i jetrena arterija dovode krv koja protiče kroz posebne kapilare, sinusoide, odakle teče u centralnu jetrenu venu. Ćelije jetrenog parenhima raspoređene su zrakasto od sredine prema periferiji lobula i dele sinusoide, kapilare jetrene arterije i portalne vene. Druga vrsta ćelija, Kupfferove ćelije, rasporedene su uz zidove

Slika 11.3 - Jetra

sinusoida i pripadaju retikuloendotelnom sistemu. Odnos Kupfferovih i parenhimatoznih ćelija u tkivu jetre je 3 : 17.

Jetra ima vrlo važnu ulogu u nizu metaboličkih, kako kataboličkih tako i anaboličkih procesa, pa se stoga naziva »centralnom laboratorijom« organizma. U njoj se odvija veliki deo metabolizma ugljenohidrata, lipida, proteina i drugih azotnih jedinjenja. U jetri se takode vrše procesi detoksikacije, konjugacije i esterifikacije. Metaboličke funkcije vrše se u parenhimatoznim ćelijama hepatocitima, dok su Kupfferove ćelije deo retikuloendotelnog sistema i imaju sposobnost fagocitiranja. Danas je već poznato i koje subcelularne frakcije vrše pojedine od navedenih funkcija.

Slika 11.4 - Ćelija parenhima jetre

Mitohondrije sadrže enzime potrebne u metaboličkim reakcijama ugljenohidrata, proteina i lipida. U njima se odvijaju procesi oksidativne fosforilacije i stvaranja energetski bogatih jedinjenja (ATP). Ribozomi sadrže ribonukleinsku kiselinu (RNA) i tu se vrše procesi sinteze proteina i procesi konjugacije. U zrnastim i glatkim membranama endoplazmatskog retikuluma i ribozomima aktiviraju se aminokiseline za sintezu proteina, vrši se sinteza holesterola, konjugacija bilirubina i detoksikacija lekova i drugih organizmu stranih supstanci, dok se transport i sekrecija bilirubina pripisuje Golžijevom aparatu. Lizozomi sadrže razne enzime, npr. kisele hidrolaze, proteaze, a neki od njih sudeluju u metabolizmu žučnih boja, gvožđa i bakra. Do tih se saznanja došlo na temelju proučavanja pojedinih supcelularnih frakcija dobijenih frakcioniranim centrifugiranjem. Na taj način se može razdvojiti citosolska frakcija (citoplazma), mikrozomalna frakcija (ribozomi, zrnasti i glatki endoplazmatski retikulum), jezgro, mitohondrije i lizozomi. Takvo frakcioniranje izvodi se pomoću ultracentrifuge, centrifugiranjem na raznim brzinama

11.3.1 METODE ISPITIVANJA INTEGRITETA I FUNKCIJE HEPATOBILIJARNOG TRAKTA

Ispitujući kako jetra obavlja sve pomenute procese, dobija se uvid u njenu funkcionalnu sposobnost. Međutim, upravo zbog mnogostrukosti njene funkcije, potrebna su različita ispitivanja, jer se često dogada da sve funkcije jetre ne budu pogođene ili barem ne u istoj meri. Na primer, može se smanjiti detoksikaciona sposobnost jetre a da je metabolizam ugljenohidrata još normalan i sl. Osim toga, jetra je u svojoj funkcionalnoj delatnosti usko vezana i s drugim organima, pa je kadšto teško odvojiti hepatalni od ekstrahepatalnih faktora. Takođe, jetra poseduje veliku regenerativnu sposobnost i funkcionalnu rezervu, pa je ponekad

funkcionalno sposobna i pored uznapredovalih primarnih anatomskih promena ili sekundarnih promena zbog procesa u žučnim vodovima. Čak i kod ciroze jetre ili malignih tumora hepatobilijarnog trakta, zbog njihove relativne polagane progresije, jetra može neko vreme kompenzatorno održavati funkcionalnu sposobnost. Upravo zbog kompleksnosti problematike ispitivanja hepatobilijarnog trakta, u tim se ispitivanjima upotrebljava celi niz ili, kako se to kaže baterije testova, za koje se uvrežio naziv jetrene ili hepatalne probe.

Slika11.5 - Testovi za ispitivanje funkcije jetre

PROMENE AKTIVNOSTI ENZIMA U BOLESTIMA HEPATOBILIJARNOG TRAKTA

Određivanje aktivnosti raznih enzima u krvnom serumu ima u bolestima jetre i žučnih vodova vrlo veliku dijagnostičku vrednost. Poslednjih 30 godina, razvojem kliničke enzimologije, mnogo su se povećale mogućnosti ispitivanja hepatobilijarnog trakta i poboljšala diferencijalna dijagnostika tih bolesti. Dok su se pre laboratorijskim testovima mogli uglavnom registrirati samo funkcionalni poremećaji, a koji se katkad javljaju dosta kasno, u svakom slučaju tek nakon lezije tkiva, enzimatski testovi većinom ukazuju na anatomske promene, dakle već na samu leziju. Na propustljivost i integritet jetrenih ćelija ukazuju aktivnosti nekih enzima što pri procesima koji uzrokuju promene propustljivosti ćelijskih membrana ili nekrozu ćelija prelaze iz oštećenih ćelija u cirkulaciju, pa se time povećavaju aktivnosti tih

enzima u serumu ili plazmi. Na osnovu enzimske slike može se zato upoznati priroda i intenzitet patološkog procesa.

Enzimi hepatobilijarnog trakta mogu se svrstati u 3 grupe: enzimi koji se sintetizuju u jetri, indikatorski enzimi i enzimi lokalizirani u epitelu žučnih vodova. U bolestima hepatobilijarnog trakta, već prema vrsti oštećenja tkiva, funkcionalnoj insuficijenciji ili prisutnosti holostaze koja onemogućava normalnu sekreciju žuči, dolazi do promena aktivnosti mnogih enzima, kao aminotransferaza, aldolaze, laktat–dehidrogenaze, sorbit–dehidrogenaze, glutamat–dehidrogenaze, ceruloplazmina, leucin–aminopeptidaze, γ–glutamiltransferaze, alkalne fosfataze, 5–nukleotidaze, izocitrat dehidrogenaze, malat–dehidrogenaze, glukoza–6–fosfat–dehidrogenaze, ornitin–karbamiltransferaze, guanaze, adenozin–deaminaze i dr.

Kliničko značenje.

U infektivnom hepatitisu znatno je povećana aktivnost indi–katorskih enzima u serumu. Ti enzimi, zbog promene propusnosti ćelijske membrane i oštećenja tkiva uzrokovanih upalnim procesom, prelaze u većim količinama iz ćelija u krvnu cirkulaciju, što izaziva porast njihove aktivnosti ukrvnom serumu. Najviše raste aktivnost serumskih aminotransferaza, AST–a do 50, a ALT–a i do 100 puta više od granice referentnih vrednosti. Pri tome je karakteristično da je aktivnost ALT- a veća od aktivnosti AST-a tj. nalazi se inverzija kvocijenta AST/ALT, tzv. DeRitisovog kvocijenta, pa je ovaj u infektivnom hepatitisu manji od 1, i u proseku iznosi oko 0,63. Aktivnost ostalih indikatorskih enzima u serumu takođe je povišena, ali ne toliko kao aminotransferaza. Aktivnost aldolaze i glutamat–dehidrogenaze mogu porasti 10 — 15 puta iznad granice referentnih vrednosti, a laktat–dehidrogenaze i G–glutamiltransferaze nešto manje. Aktivnost sorbit–dehidrogenaze, enzima karakterističnog za jetru, može u serumu porasti i do 70 puta iznad normale. Za prognozu i ocenu težine bolesti značajan je upravo intenzitet porasta aktivnosti SDH i GLDH.

Slika 11.6 - Aktivnosti AST–a i ALT–a u jednom slučaju infektivnog hepatitisa

U teškim slučajevima bolesti aktivnosti tih enzima u serumu vrlo su velike, GLDH je veća od 20 U/L, a SDH od 50 U/L. Kako lezija ćelija prethodi slabljenju funkcije jetre. to i porast aktivnosti enzima, naročito aminotransferaza, počinje pre nego što se pojave patološki ispadi »klasičnih« testova. npr. porast koncentracije bilirubina u serumu, promena odnosa proteinskih frakcija koje se vide u elferogramu i flokulacionim testovima i dr. Tako aktivnost aminotransferaza u serumu počinje rasti i do 3 nedelje pre ostalih laboratorijskih pokazatelja, a to je važno za ranu dijagnozu akutnog hepatitisa.

Slika 11.7 -Tok promena aktivnosti enzima u serumu u lakšem slučaju infektivnog hepatitisa

Slika 11.8 - Tok promena aktivnosti enzima u serumu u teškom slučaju infektivnog hepatitisa

Aktivnosti enzima koji se nalaze u epitelu žučnih vodova ili se izlučuju putem žuči, kao alkalne fosfataze ili LAP–a u akutnom' hepatitisu, malo se povisuju, 2 - 3 puta, a ponekad se, iako ređe, nalaze i normalne aktivnosti, npr. alkalne fosfataze. Aktivnost GGT, budući da se nalazi uglavnom u epitelu žučnih vodova, ali je nešto ima i u jetrenom parenhimu, poraste nešto više, ali retko preko 200 U/L. Inače se uopšteno porast aktivnosti GGT u serumu smatra jednim od najosetljivijih znakova oštećenja jetre.

Aktivnost holinesteraze ne pokazuje neke značajnije promene, tek ukoliko se funkcionalna sposobnost jetre smanji, snizuje se aktivnost holinesteraze.

Aktivnosti enzima u serumu obično su normalne ili granične u perzistirajućem hroničnom hepatitisu. Nešto mogu biti povišene u serumu aktivnosti GGT i ornitin–karbamiltransferaze. Nasuprot tome, u agresivnom hroničnom hepatitisu aktivnosti indikatorskih enzima u serumu rastu slično kao i u cirozi jetre. DeRitisov kvocijent AST/ALT obično je iznad 1. Aktivnost GGT je visoka, a naročito u hepatitisu uzrokovanom alkoholom. Porast aktivnosti GLDH i veći porast aktivnosti AST–a od ALT–a ukazuju na nekrotične krize. U nekrotskim krizama (nekrotischer Schub) aktivnosti aminotransferaza, GGT, GLDH, SDH mogu biti vrlo visoke.

U hroničnom hepatitisu nalazi se već oslabljena funkcija jetre, a to uzrokuje često sniženu aktivnost holinesteraze.

Slika 11.9 - Aktivnosti enzima u serumu u bolesnika s kroničnim hepatitisom. (1 = gornja granica referentnih vrednosti)

U cirozi jetre povisuju se aktivnosti aminotransferaza do oko 5 puta, i obično AST–a više od ALT–a, a ostalih indikatorskih enzima, kao aldolaza, LDH, SDH, nešto manje. Aktivnost alkalne fosfataze takođe se umereno povisuje. Medutim, za cirozu je karakterističan jači porast aktivnosti GGT i GLDH. Aktivnost GGT je naročito vlsoka, i do 1000 U7L, ponekad i više, u cirozi alkoholičara. Taj porast GGT u cirozi alkoholičara posledica je toksičnog efekta alkohola na mikrosome i indukcije tog enzima alkoholom. Međutim, u cirozi aktivnosti enzima mogu biti i slabije povišene, nekad čak i normalne, a to zavisi od faze u kojoj se bolest nalazi. U terminalnoj fazi, kada je funkcionalno aktivno tkivo već umnogome redukovano. nemaju se više odakle enzimi izlučivati u cirkulaciju, pa se njihove

aktivnosti u serumu snizuju. Ali što više funkciia jetre slabi. sve se više snizuje aktivnost serumske holinesteraze, i to je karakterističan nalaz u cirozi jetre.

Slika 11.10 - Aktivnosti enzima u serumu u cirozi jetre. (1 = gornja granica referentnih vrednosti)

Enzimski testovi vrlo su korisni za razlikovanje hepatocelularnog i opstruktivnog ikterusa. U opstruktivnoj žutici obično su aktivnosti aminotransferaza i ostalih indikatorskih enzima umereno povišene u serumu, uz jači porast aktivnosti alkalne fosfataze, GGT, LAP i ceruloplazmina. Za razliku od hepatocelularne, u opstruktivnoj žutici obično je DeRitisov kvocijent normalan, tj. aktivnost AST–a je veća od ALT–a.

Za diferencijalnu dijagnozu je od važnosti i odnos aminotransferaza i alkalne fosfataze. Dok je ALT/AP u akutnom hepatitisu veći od 25, pa čak i od 50, u opstruktivnoj žutici taj je odnos obično oko 1 ili nešto veći ili manji. Enzimska slika katkad omogućava da se opstruktivni ikterus izazvan konkrementima razlikuje od onog izazvanog malignim procesom, jer je u ovom poslednjem slučaju

obično snižena aktivnost holinesteraze i jače povišena aktivnost alkalne fosfataze. Ako.su već prisutne metastaze, često se nalazi i jači porast aktivnosti aldolaze i LDH.

Slika 11.11. Aktivnosti enzima u serumu u opstruktivnoj žutici izazvanoj: a) kamencima, b) tumorom. (1 = gornja granica referentnih vrednosti)

U hepatocelularnom ikterusu s holostazom slika je mešana, pa nalazimo aktivnosti enzima u serumu koje ukazuju i na oštećenje jetre i na holostazu, tj. uz visoke aktivnosti aminotransferaza i ostalih indikatorskih enzima i relativno visoke aktivnosti alkalne fosfataze, GGT i LAP.

Korisne podatke u diferencijalnoj dijagnostici bolesti hepatobilijarnog trakta daje određivanje aktivnosti više enzima i njihovi međusobni odnosi

Tabela 11.2 - Aktivnosti enzima u bolestima hepatobilijarnog trakta

Grupa

Enzima b

Sindrom c d e f

a + e

II Aspartat–aminotransferaza

+ + +

+ + + + + + + + +

Alanin–aminotransferaza + + +

0 + + 0 0 + + +

Ornitin–karbamil–transferaza

+ + +

+ +

+ + + + + + + + +

Glutamat–dehidrogenaza + 0 + + +

+ + +

+ + + +

III Alkalna fosfataza 0 0 + + + + + +

+ +

+ + +

Ceruloplazrain 0 0 + + + + +

+ +

+ + +

g–glutamiltransferaza + + +

+ + + + + + + +

+ +

I Holinesteraza 0 0 0 0 0

Faktori koagulacije 0 — 0 0 0 0

Sindrom:

akutno difuzno oštećenje membrane (tip: akutnihepatitis) + povišeno

kronično difuzno oštećenje parenhima (tip: kompenzirana ciroza) — sniženo

diseminirane nekroze (tip: nekrotizirajući napad kod ciroze) — BEZ PROMENE

distrofija parenhimskih ćelija (tip: supakutna distrofija)

opstrukcija žučnih vodova (tip: ekstrahepatalna opstrukcija)

lokalna ekstrahepatalna opstrukcija (tip: metastaze u jetri)

a + e) (tip: holangioiitični oblik akutnog hepatitisa).

11.3.3 ŽUTICA (ICTERUS)

Povišenje koncentracije bilirubina u krvnom serumu (hiperbilirubinemija) ima za posledicu pojavu žute boje kože ili žutice.

To se prvo zapaža po žutim beloočnicama (sklere) i sluznici. Prema uzroku hiperbilirubinemije razlikujemo razne tipove žutice, a diferenciranje žutice jedno je od osnovnih problema u diferencijalnoj dijagnostici bolesti hepatobilijarnog trakta.

Razlikujemo četiri tipa žutice:

hemolitička žutica, uzrokovana povećanim raspadom eritrocita i razgradnjom hemoglobina,

opstruktivna žutica, uzrokovana zastojem u bilijarnom traktu,

hepatocelularna ili parenhimatozna žutica, uzrokovana poremećajem ekskretorne funkcije jetrenih ćelija i

funkcionalna žutica.

Metabolizam i lučenje bilirubina

Bilirubin nastaje nizom reakcija iz hemoglobina. Hemoglobin se oslobađa prilikom dezintegracije eritrocita u ćelijama retikuloendotelnog sistema, prvenstveno u slezini, koštanoj srži i jetri. Cepanjem metenskog mosta između prvog i drugog pirolnog prstena otvara se porfirinski prsten i nastaje biliverdin–gvožđe––globin, koji se naziva još koleglobin ili verdohemoglobin. Reakciju katalizuje enzim hemoksigenaza uz kiseonik i NADPH2. Tada se otcepljuje gvožđe i globin, a sam biliverdin redukuje u bilirubin delovanjem enzima biliverdin–reduktaze. Sve te reakcije odvijaju se u retikuloendotelnom sistemu (RES). Iz ćelija RES–a bilirubin dospeva u cirkulaciju te se u krvi veže na albumin i kao takav (pre se nazivao indirektni bilirubin) posebnim aktivnim transportnim sistemom ulazi u jetrene sinusoide i iz njih u ćelije jetrenog parenhima.Tu se odvaja albumin, a bilirubin se konjuguje u endoplazmatičnom retikulumu glukuronskom kiselinom u bilirubin—mono– I di–glukuronid.

Ovu reakciju katalizuje mikrosomalni enzim bilirubin–UDP–glukuronil–transteraza. Time nerastvorljivi bilirubin prelazi u rastvorljivi oblik. Ovaj konjugovani bilirubin pre se nazivao direktni bilirubin. Pri spomenutim procesima važan je aktivan transport bilirubina od sinusoida kroz jetrenu ćeliju do žučnih kanalića, u čemu igraju ulogu neke supcelularne frakcije, vakuole, lizosomi i Golžijev aparat. Naime, prvo se bilirubin vezan još za albumin koncentruje na površini sinusoidne membrane i onda ulazi u ćeliju i veže reverzibilno za dva proteina, ligandin i Z protein. Zatim se u organelama mikrosomalne frakcije (ribosomi, endoplazmatični retikulum) odvaja od transportnih proteina i konjuguje u glukuronid, te se takav preko Golžijevog aparata koncentruje na površini membrane žučnih kanalića i izlučuje u žuč. Sa žuči bilirubin dospeva u tanko crevo, gde se oslobodi iz glukuronida

delovanjem glukuronidaze i pod uticajem delovanja anaerobne crevne flore redukuje u urobilinogen. Urobilinogen se delom izlučuje preko debelog creva u stolici, a drugi deo urobilinogena vraća se enterohepatalnom cifkulacijom, portalnim krvotokom u jetru. Iz jetre se ponovo lzlučuje u tanko crevo, a delom preko plexusa hemorrhoidalesa u opštu cirkulaciju i dospeva u bubrege i izlučuje kao mokraćni urobilinogen u količini od 0,85 — 6,76 μmol (0,5 do 4 mg) dnevno.

Slika 11.12. Normalni metabolizam izlučivanje bilirubina

U hemolitičkoj žutici hemoglobin se razgrađuje u većoj količini u RES–u zbog hemolize eritrocita. Zbog toga se povećava koncentracija bilirubina vezanog za proteine u cirkulaciji. Ako produkcija bilirubina u RES–u poraste trostruko više od normalnog, jetra, iako zdrava i funkcionalno sposobna, ne može više svu tu količinu bilirubina primati i dalje metabolizirati, pa dolazi do žutice. Jetra pojačano me–abolizira bilirubin i izlučuje ga konjugovanog s glukuronatom u žuč i preko nje u crevo. Zbog toga raste i fekalni sterkobilinogen, što izaziva tamnu boju stolice. U žuči se takođe povećava koncentracija bilirubina I to izaziva predispoziciju za stvaranje žučnih kamenaca Sterkobilinogen se u većoj količini vraća enterohepatičnom cirkulacijom u jetru. Jetra opet ne može svu tu količinu primiti i ponovo izlučiti, pa više žučne boje dospeva krvotokom u bubrege te se više urobilinogena izlučuje urinom.

Slika 11.13 - Metabolizam bilirubina u hemolitičkoj žutici

U opstruktivnoj žutici stvara se normalno bilirubin u RES–u i dospeva putem krvi u jetru koja ga normalno konjuguje. Međutim, usled opstrukcije žučnih puteva (intrahepatalnih ili ekstrahepatalnih) ne može se izlučivati putem žuči u crevo, pa se vraća u krv i koncentracija mu raste. Kako je to bilirubin koji se u jetri već konjugovao s glukuronatom, koncentracija se povećava na račun konjugovanog bilirubina. Kako se bilirubin ne može izlučivati u crevo, tu se ne stvara urobilinogen, pa je stolica bleda, aholična. Nema ni enterohepatične cirkulacije urobilinogena, pa ni urobilinogena u urinu. Medutim, u urinu se pojavljuje bilirubin, jer serum sadrži visoku koncentraciju konjugovanog bilirubina koji pri prolazu krvi kroz bubrege lagano prolazi glomerularni filtar.

Slika 11.14. Metabolizam bilirubina u opstruktivnoj žutici

U hepatocelularnoj ili parenhimatoznoj žutici, uprkos normalnom metabolizmu hemoglobin u RES–u, funkcionalno insuficijentne ćelije jetre ne mogu metabolizirati i izlučiti sav nastali bilirubin. Ovaj

dospeva u jetru, prolazi kroz ćelije vraća se natrag u jetrene sinusoide i odatle u cirkulaciju, gde se zato njegova koncentracija povećava. Iz krvi prelazi i u urin, pa urin ima karakterističnu boju i žutu penu. Funkcionalno nesposobne ćelije izlučuju i manje bilirubina u žuč i crevo. Zato je smanjen i fekalni sterkobilinogen i stolica je blede boje, ali retko aholična, osim u vrlo teškom oštećenju jetre. Iz creva se sterkobilinogen enterohepatičnom cirkulacijom vraća portalnim krvotokom u jetru, ali kako je ova nesposobna da ga normalno ponovo primi i izluči u crevo, to više žučne boje prelazi u opšti krvotok i iz njega putem bubrega u urin.

Slika 11.15 - Metabolizam bilirubina u hepatocelularnoj ili parenhimatoznoj žutici

U funkcionalnoj hiperbilirubinemiji nema patoloških promena u jetri već ih uzrokuju promene u intracelularnom metabolizmu bilirubina, pa su osim bilirubina laboratorijski nalazi normalni.

U Gilbertovom sindromu poremećen je prenos bilirubina kroz ćelijske membrane do mesta konjugacije u mikrosomskom području. Smanjena je aktivnost bilirubin–UDP–glukuronil transferaze i konjugacija bilirubina, pa je u serumu povećana koncentracija uglavnom nekonjugovanog bilirubina, i do 80 μmol/L.

Crigler–Najjarova hiperbilirubinemija je vrlo retka, a uzrok joj je manjak bilirubin–UDP–glukuronil transferaze i rezultirajuća nemogućnost konjugacije bilirubina. Zato se u serumu povećava koncentracija nekonjugovanog bilirubina do vrlo visokih vrednosti. Odmah posle rođenja bilirubin se taloži u ganglijskim ćelijama mozga pa se pojavljuju neurološki simptomi. Dok su ostale funkcionalne hiperbilirubinemije relativno bezopasne, prognoza je u toj bolesti loša, i bolesnici obično umiru u prvoj godini života (tip I) ili kasnije (tip II).

Poremećaj ekskrecije konjugovanog bilirubina iz mikrosoma u žučne kapilare uzrok je Dubin–Johnsonove funkcionalne hiperbilirubinemije. Za tu je bolest zato karakteristična visoka koncentracija konjugovanog bilirubina u serumu (i do 180umol/L). Zbog poremećaja ekskrecije, povećana je i retencija BSP–a, dok su ostali laboratorijski nalazi normalni.

U funkcionalne hiperbilirubinemije ubrajaju se još tzv. šant hiperbilirubinemija, kojoj je uzrok prerano oslobađanje bilirubina u koštanoj srži, I Lucey–Driscollov sindrom, u kojem jedan inhibitorni faktor u krvi majke i deteta inhibira konjugaciju bilirubina, pa je povećana koncentracija nekonjugovanog bilirubina u krvotoku.

Osim navedene podele hiperbilirubinemija, zavisno od toga koji je bilirubin povećan, mogu se podeliti i na:

konjugovane (opstruktivni i hepatocelularni ikterus, Dubin–Johnsonov sindrom)

nekonjugovane (hemolitični ikterus, Gilbertova bolest, Crigler–Najjarova bolest, Lucy–Driscollov sindrom, šant hiperbilirubinemija).

Prema uzrocima moguća je podela hiperbilirubinemija i na:

premikrosomska (hemolitična, šant, Gilbertova bolest),

postmikrosomska (opstruktivna žutica, Dubin–Johnson, upalni procesi).

U pojedinim tipovima žutice nalaze se karakteristični laboratorijski nalazi žučnih boja u krvnom serumu, mokraći i stolici.

Tabela 11.3 - Žučne boje u serumu, stolici i urinu u raznim tipovima žutice

Bilirubin u serumu Urin

Tip žutice ukupni konjugovan nekonjugovan

Stofica boja

urobilinogen

bilirubin

Hemolitična blago povišen

smanjen tamna povišen negativan

Opstruktivna jako povišen povišen aholična

negativan pozitivan

Hepatocelularna

povišen proporcionalno težini oštećenja

povišen varira povišen pozitivan

Treba napomenuti da u opstruktivnoj žutici hiperbilirubinemija može biti vrlo intenzivna, i preko 400 umol/L, dok se kod hepatocelularne vrl retko susreću tako visoke koncentracije bilirubina.

11.3.4 ULOGA JETRE U METABOLIZMU PROTEINA

Kad se govori o »jetrenim« probama, tu se uvek podrazumevaju razni testovi koji ukazuju na raspodelu proteinskih frakcija u serumu. Pre su se u tu svrhu više koristili razni flokulacioni testovi, a danas elektroforeza proteina. U jetri se sintetizuju albumini, fibrinogen, protrombin i delomično neki globulini, kao α–globulini koji sadrže glukoproteine te lipoproteini iz α i β–globulina, dok se γ–globulini, koji su nosioci antitiiela. stvaraju uopšteno u ćelijama retikuloendotelnog sistema. U jetri se takođe odvijaju procesi transaminacije i deaminacije aminokiselina. Povišenje globulina koje se nalazi u pojedinim bolestima hepatobilijarnog trakta može biti odgovor na sniženje koncentracije albumina, ili odgovor retikulo–endotela na oštećenje jetrenog parenhima. Sniženje pak albumina u serumu posledica je nesposobnosti jetre da ih normalno sintetizuje. Isto tako, od funkcionalne sposobnosti jetre zavisi i koncentracija fibrinogena u plazmi. Prema tome, to su isključivo pokazatelji funkcionalne sposobnosti jetre i ne mogu se sasvim strogo klasifikovati po bolestima, nego više zavise od intenziteta smanjenja jetrene funkcije. Na primer, lakše oštećenje jetre kakvo se može javiti kod upalnog procesa u hepatitisu, obično izaziva čak blago povišenje fibrinogena, dok tek smanjena jetrena funkcija, budući da se fibrinogen sintetizuje u jetri, ima za posledicu smanjenje te sinteze i rezultira padom koncentracije fibrinogena u plazmi.

Obično je u akutnom hepatitisu malo snižena koncentracija albumina u serumu, uz relativni porast koncentracije globulina, ali se to ne mora uvek javljati. Kod teških i dugotrajnih bolesti javlja se i apsolutni porast koncentracije γ–globulina usled reakcije retikuloendotela. U infektivnom hepatitisu javlja se i porast koncentracije β–lipoproteina u serumu, pa se to katkad može zapaziti i u porastu β––globulina. Stoga, elferogram serumskih proteina u infektivnom hepatitisu obično pokazuje povišenje frakcije β i α–globulina, samo relativno, ili češće, i apsolutno. Flokulacioni testovi koji ukazuju na takve promene su povišeni sublimat–test, cink–sulfat–test, amonsulfat–test, produženi Weltmannov koagulacioni niz — svi oni pokazuju povećanje γ–globulina, te povišeni timol–test zamućenja i flokulacija zbog povećanja β–lipoproteina.

U cirozi jetre obično se nalazi inverzija albuminsko–glubulinskog kvocijenta, odnosno na elferogramu se vidi smanjenje albumina, do kojeg dolazi zbog smanjene sposobnosti jetre da ih sintetizuje, i povećanje γ–globulina. Međutim u dobro kompenzovanoj cirozi mogu proteini biti i normalni. Intenzitet hipoalbuminemije i povećanje γ–globulina zavise od težine oštećenja jetre, pa je to važno i prognostički.

Spomenute promene nisu tako izražene u hroničnom hepatitisu, pa su nalazi blaže patološki promenjeni ili čak i normalni, zavisno od funkcionalne sposobnosti jetre.

U opstruktivnoj žutici, u ranoj fazi i ako još nema oštećenja jetrenih ćelija, proteini i raspodela njihovih frakcija mogu biti i normalni, ali ubrzo porastu α2 –globulini koji se uopšteno povisuju u akutnim stanjima, a pogotovo u malignim bolestima. Zbog povišenja lipida u serumu, prvenstveno holesterola, do čega dolazi kod opstrukcije žućnih puteva, raste i koncentracija β–lipoproteina, odnosno β–globulina. U hroničnoj bilijarnoj opstrukciji smanjuje se i koncentracija albumina raste koncentracija γ-globulina, što je već znak sekundarnog oštećenja jetre. Novijeg je datuma i test na lipoprotein X, koji je pozitivan u serumu kod opstrukcije žučnih puteva. Mezenhimalna reakcija rezultira u povećanoj koncentraciji γ–globulina u hroničnim infekcijama ili kao posledica stvaranja homolognih antitela izazvanih dezintegracijom tkiva kod hepatocelularne nekroze, kao u agresivnom hroničnom hepatitisu. To se još bolje može pratiti određivanjem koncentracije pojedinih imunoglobulina. U infektivnom hepatitisu i primarnoj bilijarnoj cirozi nalazi se povišen IgM, u hroničnom agresivnom hepatitisu IgG. U portalnoj cirozi IgG, IgM i IgA–a koncentracije ta tri imunoglobulina nešto je u porastu i u perzistentnom kroničnom hepatitisu. U alkoholnoj cirozi raste uglavnom koncentracija IgG i IgA.

Slika 11.16. Elferogrami proteina u bolestima hepatobilijarnog trakta

Ovde su spomenuti proteini i njihove promene koncentracija u krvnoj tečnosti samo u vezi s bolesti jetre i žučnih vodova.

U jetri se sintetizuje i pralbumin čije je poluvreme života vrlo kratko. Elektroforetski se retko može dokazati, ali ga se može odrediti imunohemijskim metodama. Prema novijim podacima je koncentracija prealbumina u serumu smanjena u poremećajima jetrene funkcije, pa se određivanje prealbumina može takođe koristiti za ispitivanje funkcije jetre.

Razvojem imunohemijskih tehnika omogućeno je određivanje raznih proteina koji se u serumu nalaze u vrlo malim koncentracijama. Tako je zadnjih godina nađeno, da u akutnom hepatitisu i primarnom karcinomu jetre raste koncentracija ligandina u serumu , a u hepatalnim bolestima praćenim i oštećenjem bubrega koncentracija β2–mikroglobulina.

11.3.5 NEPROTEINSKA JEDINJENJA

Razgradnjom proteina nastaju u organizmu aminokiseline koje se u jetri deaminiraju te se stvara amonijak. Nešto amonijaka nastaje i delovanjem glutaminaze II u bubregu iz glntarnina, te iako se ovaj izlučuje urinom, suvišak prelazi na trag u krv.

Slika 11.17 - Krebsov ciklus sinteze ureje

Nastali amonijak, koji ie vrlo toksičan za organizam, detoksikuje se u jetri na taj način što sa CO2 stvara ureju. Taj proces sinteze ureje putem Krebsova ciklusa odvija se samo u jetri.

Kao što se vidi iz slike iz NH4 i CO2 nastaje uz utrošak 2 mola ATP karbamil–fosfat. Ta reakcija je ireverzibilna, a katalizuje je enzim

karbamil–fosfat–sintetaza čiji je koenzim N–acetil–glutaminska kiselina. Nastali karbamil–fosfat veže se s ornitinom preko njegove –aminogrupe uz enzim ornitin–karbamil–transferaza (OCT) i stvara se citrulin. Ovaj se sa asparaginskom kiselinom uz utrošak jednog mola ATP–a kondenzuje u arginino–jantarnu kiselinu. Tu reakciju katalizira enzim–sintetaza arginino–jantarne kiseline. Delovanjem arginin–sukcinat–dehidrogenaze razgrađuje se arginino–jantarna kiselina u arginin i fumarnu kiselinu. Konačno arginin delovanjem enzima arginaze, daje ureju i ornitin koji ulazi ponovno u ciklus i veže se s novom molekulom karbamil–fosfata. Ureja nastaje u tautomernoj formi i izoureja spontano prelazi u ureju. Vraćanjem ornitina u reakciju s novim karbamil–fosfatom zatvara se ovaj metabolički ciklus nazvan Krebs–Henseleitov ciklus sinteze ureje. Cela reakcija može se prikazati da se dva mola amonijaka, jedan iz glutaminske kiseline i drugi iz asparaginske kiseline vežu s CO2, uz utrošak 3 mola ATP–a, u ureju:

Za reakciju je potreban utrošak energije oko 59 kJ (14 kcal/mol). Sinteza ureje je efikasan put uklanjanja amonijaka tako da ga se, uprkos stvaranju relativno mnogo amonijaka, u krvi normalno nalazi samo oko 11—47 u.mol/L (11 do 70 g/dl). Tek kod teških oštećenja jetre slabi sinteza ureje, pa je povišenje koncentracije amonijaka u krvi loš prognostički znak. Povišenje krvnog amonijaka nalazi se u teškoj cirozi jetre i hepatičnoj komi.

Nešto amonijaka uklanja se i sintezom glutamina u mozgu, i ta se sinteza pojačava kad se zbog smanjenja sinteze ureje u jetri poveća koncentracija amonijaka u krvi. Zbog pojačane sinteze glutamina u mozgu (iz amonijaka i glutaminske kiseline) povećava se koncentracija glutamina u krvi, a u mozgu se smanjuje sadržaj glutaminske kiseline. Smanjenje sadržaja glutaminske kiseline i drugih međuprodukata ciklusa limunske kiseline uzrokuje smanjenje oksidativnog metabolizma u mozgu te nastupa koma.

Za određivanje amonijaka u krvi koriste se razne metode, a danas se uglavnom rade enzimske metode i titracija po Conwayu.

U terminalnoj fazi ciroze, trovanja hepatotoksičnim agensima kao CC14, arsenovim jedinjenjima ili fosforom, slabi sposobnost jetre da se u njoj normalno vrši deaminacija aminokiselina i sinteza ureje.

Normalno se u krvnom serumu nalazi 2,28 — 3,93 mmol/L ili 3 do 6 mg/dl aminokiselinskog N. U teškim oštećenjima jetre koncentracija može porasti i do 18 mmol/L odnosno 25 mg/dl.

Metode određivanja aminokiselina su fotometrijske s ninhidrinom i hromatografske.

Koncentracija ureje u lakšim oštećenjima jetre može čak i nešto porasti usled kompenzacijske sposobnosti jetre, ali u teškim oštećenjima slabi sinteza ureje i njena je koncentracija smanjena.

11.3.6 ULOGA JETRE U METABOLIZMU UGLJENIHHIDRATA

Jetra ima ključnu ulogu i u metabolizmu ugljenohidrata. U jetri se vrši glikogeneza, glikoliza, ciklus limunske kiseline, glikoneogeneza, glikogenoliza, a fruktoza i galaktoza se isključivo u jetri pretvaraju u glukozu i njene fosfatne estere. Nadalje se u jetri metabolizuju laktat i piruvat, te stvaraju ketonska tela. Treba, međutim, istaći da je funkcija jetre u metabolizmu ugljenohidrata obično poremećena tek kod teškog oštećenja jetre. Ti poremećaji mogu se zapaziti u: a) 'tendenciji prema niskoj koncentraciji glukoze u krvi natašte, b) smanjenoj toleranciji prema opterećenju glukozom (GTT), galaktozom (GALTTl fruktozom (FTT) c) smanjenoj glikogenolizi nakon opterećenja adrenalinom (ATT) d) glikozuriji, e) povećanoj koncentraciji mlečne kiseline.

U teškim funkcionalnim oštećenjima jetre, npr. cirozi jetre, može se naći smanjena tolerancija glukoze i smanjena glikogeneza.

Međutim, koncentracija glukoze u krvi natašte je varijabilna i ponekad izrazito snižena, ispod 2,2 mmol/L, zbog smanjene glikogenolize. Kriva GTT se može strmo uzdizati i dostiže maksimum unutar jednog sata, a vrednosti mogu doseći i oko 11 mmol/L (oko 200 mg/dl), ali se zatim polagano spuste i na hipoglikemične vrednosti. Međutim, kako na GTT utiču i mnogi drugi faktori, a i promene se nalaze samo u vrlo teškim funkcionalnim poremećajima jetre, taj se test malo koristi u dijagnostici hepatalnih bolesti. Bolje je raditi u tu svrhu galaktoza ili fruktoza––tolerans–test, koji su specifični za jetru. Smanjena tolerancija galaktoze i fruktoze javlja se u teškoj aktivnoj cirozi jetre, a nekad i u opstruktivnom ikterusu s teškim sekundarnim oštećenjima jetre.

11.3.7 ULOGA JETRE U METABOLIZMU LIPIDA

Jetra ima važnu ulogu u metabolizmu lipida. U tom se organu vrši sinteza masnih kiselina, fosfolipida, holesterola i lipoproteina. Nadalje se u jetri vrši esterifikacija holesterola i stvaranje žučnih

kiselina kao i metabolička razgradnja masnih kiselina, te stvaranje ketonskih tela. Zbog toga se mogu očekivati promene tih parametara pri smanjenom funkcionalnom kapacitetu jetre. U praksi se međutim u dijagnostici bolesti hepatobilijarnog trakta najviše određuje koncentracija holesterola i njegovih frakcija.

Iako se holesterol sintetizuje u raznim organima, on se najvećim delom sintetizuje u jetri iz aktivnog acetata, a jetra je takođe organ preko kojeg se holesterol izlučuje u žuč. Prema tome, holesterol je pokazatelj i sintetske i ekskretorne funkcije jetre. U jetri se, nadalje, vrši esterifikacija holesterola s masnim kiselinama. taj proces se odvija uz sudelovanje enzima acil–holesterol–acil–transferaze (ACAT), dok u krvi sudeluje enzim lecitin–holesterol–acil–transferaza (LCAT), pri čemu se masna kiselina prenosi s lecitina i

veže na C–3. atom holesterola.

Slika 11.18. Esterifikacija holesterola

Određivanje koncentracije ukupnog holesterola u serumu korisno je, pored ostalih laboratorijskih testova, za diferenciranje opstruktivnog i hepatocelularnog ikterusa. U opstruktivnom ikterusu koncentracija holesterola u serumu raste do visokih vrednosti, te postoji značajna torelacija i s povišenjem koncentracije bilirubina i aktivnosti alkalne fostataze. Pri tome raste uglavnom slobodni holesterol._Nasuprot tome, kod hepatocelularnog ikterusa holesterol je normalan ili tek slabije

povišen (npr. u ranoj fazi akutnog hepatitisa). Medutim, kod opstruktivnog ikterusa uzrokovanog malignom bolesti, obično izostaje porast serumskog holesterola, pa čak može biti normalan ili snižen. Uopšteno se kod malignih bolesti često nalazi niska koncentracija holesterola. Iako ta pojava još nije sasvim razjašnjena, neki autori to tumače neishranjenošću takvih bolesnika.

Teška oštećenja jetre, kakva se mogu naći u cirozi jetre ili toksičnom hepatitisu, smanjuju sintetsku i esterifikacijsku funkciju jetre, pa se u tim stanjima mogu ponekad naći vrlo niske koncentracije holesterola, čak ispod 2,6 mmol/L, i to naročito esterificiranog holesterola, pa mogu biti i manje od 20%, što se u Nemačkoj literaturi označava kao »Estersturtz« (nagli pad estera). Takav je nalaz uvek znak vrlo teškog oštećenja s jako oslabljenom funkcionalnom sposobnošću jetre.

Budući da se u jetri stvaraju fosfolipidi, pre se i odredivanje koncentracije fosfolipida koristilo u oceni funkcionalne sposobnosti jetre, pogotovo odnos koncentracije fosfolipida i ukupnog holesterola. Medutim, danas su ti testovi uglavnom napušteni.

11.3.8 ŽUČNE KISELINE

Žučne kiseline su steroidi s 24 C–atoma. Sve su to hidroksilirani derivati matične holanske kiseline. Prsteni A i B su im u cis–položaju, a bočni im se lanac sastoji od 5 C–atoma i završava karboksilnom grupom. Hidroksilne grupe su sve u α-položaju. Stvaraju se u jetri iz holesterola i imaju važnu ulogu pri varenju masti. Utiču na rastvorljivost holesterola u žuči i stimulišu lučenje jetrene žuči u žučnu kesu. U žuči se nalaze u mnogo većoj koncentraciji nego u plazmi.

U jetri se sintetizuju tzv. primarne žučne kiseline,holna i henodezoksiholna kiselina, iz kojih u crevu delovanjem crevnih bakterija nastaju sekundarne žučne kiseline, desoksiholna i litoholna kiselina.

Slika 11.19. Struktura žučnih kiselina: a)primarne, b) sekundarne žučne kiseline

Kao što se vidi na slici 11. 18., to su monohidroksi, dihidroksi i trihidroksi–derivati holanske kiseline. Najveći deo holesterola, oko 80 — 90%, metabolizuje se u jetri u žučne kiseline, i to predstavlia glavni put uklanjanja holesterola.

Biosinteza žučnih kiselina u jetri započinje hidroksilacijom holesterola na C–7. atomu. Nakon toga se prsten redukuje i dolazi do epimerizacije u C–3. položaju (kao intermedijer nastaje keton). Nakon redukcije, a delomično i nakon hidroksilacije na C–12. položaju dolazi do okidativnog skraćenja bočnog lanca: krajnja se metilna grupa hidroksiluje i oksiduje u karboksilnu te skrati mehanizmom β–oksidacije. Nastale slobodne žučne kiseline zatim se aktiviraju s ATP–om i koenzimom A te vežu s glicinom ili taurinom preko njihovih NH2 grupa).

Slika 11.20. Biosinteza žučnih kiselina u jetri

Konjugovane žučne kiseline se putem žuči izlučuju iz jetre u žučnu kesu, gde se u koncentriraju. Tako se snizuje pH žuči od 7,5 na oko 6 i time smanjuje stabilnost njihovih micelarnih kompleksa s holesterolom u žuči. Soli žučnih kiselina izlučuju se dalje sa žuči u tanko crevo, gde delovanjem 7α–dehidroksilaze iz crevnih bakterija prelaze u sekundarne žučne kiseline. Deo žučnih kiselina u crevu sudeluje kao emulgator u cepanju masti i zajedno sa oslobođenim masnim kiselinama ponovno se resorbuje kroz crevnu sluzokožu. Tu se te kiseline oslobađaju iz jedinjenja s taurinom i glicinom (uglavnom u kolonu) te enterohepatičnom cirkulacijom, portalnim krvotokom, vraćaju u jetru. U jetri se ponovno hidroksiluju u primarne žučne kiseline i izlučuju u žuč. Drugi deo žučnih kiselina, nakon dekonjugacije u kolonu, izlučuje se stolicom iz tela. Dnevno se na taj način stolicom izlučuje 294 — 551–μmola (120 — 225 mg) žučnih kiselina.

Kliničko značenje. Slobodne žučne kiseline se u plazmi vežu za albumine, manjim delom i za globuline. Referentne vrednosti zavise dosta od metode određivanja, a enzimskim metodama nađeno je 2,5 do 6,8 umol/L (125 — 341 g/dl) seruma. Zadnjih godina pridaje se

žučnim kiselinama sve veće dijagnostičko značenje, i to više ukupnim žučnim kiselinama nego pojedinima od njih. Koncentracija ukupnih žučnih kiselina u serumu povisuje se kod oštećenja jetre, naročito kod hroničnih bolesti kao što je ciroza jetre. Međutim, najviše se povećava njihova koncentracija kod opstruktivne žutice, pa je neki prihvataju i kao test za diferencijafnu dijagnostiku ikterusa. U urinu normalno nema žučnih kiselina, ali se pojavljuju u opstruktivnoj žutici, a ponekad i kod hepatocelularne žutice i oštećenia jetre.

UKRATKO:BIOHEMIJA KRVI

Krv je viskozna tečnost koja se sastoji od ćelija i plazme. Na eritrocite otpada više od 99% ćelija; to znači da leukociti nemaju praktično nikakvog udela u fizičkim osobinama krvi.

Hematokrit krvi je onaj procenat koji u krvi čine ćelije. Hematokrit bitno utiče na viskozitet krvi, što je on veći to je veća viskoznost.

Na viskoznost krvi utiču i koncentracija i vrste belančevina u plazmi. Plazma je deo vanćelijske tečnosti. Ona je gotovo identična intersticijskoj tečnosti koja se nalazi između ćelija u tkivima, no među njima postoji jedna bitna razlika: u plazmi ima oko 7% belančevina, dok intersticijska tečnost ima oko 2% proteina.

Belančevine plazme dele se na albumin, globuline i fibrinogen. Glavna funkcija albumina je uspostavljanje osmotskog pritiska na kapilarnoj membrani. Taj pritisak, nazvan koloidno-osmotski pritisak, sprečava filtraciju plazme iz kapilara u intrasticijske prostore.

Globulini se dele na tri glavne vrste: alfa, beta i gama.

Fibrinogen je u plazmi veoma važan za procese zgrušavanja krvi.

Krv je prenosioc hranljivih supstanci, ćelijskih ekskreta, hormona, elektorlita i ostalih sastojaka iz jednog dela tela u drugi.

Glavna funkcija eritrocita je prenos hemoglobina, koji tkivima donosi kiseonik iz pluća. Kad eritrociti prožive svoj vek i raspadnu se, ćelije EPR fagocituju oslobođeni hemoglobin, iz kojeg se zatim otpušta gvožđe. To se gvožđe ili ponovo skladišti u feritinu ili se upotrebljava za ponovnu sintezu hemoglobina. Eritrociti posle prelaska iz koštane srži (u kojoj nastaju) u krvotok žive 120 dana i potom se raspadaju. Nedostatak eritrocita dovodi do anemije. Najčešći uzroci anemije su: a) gubitak krvi, b) aplazija koštane srži, c) poremećaji u sazrevanju eritrocita, d) hemoliza eritrocita koja može nastati zbog: trovanja lekovima; naslednih bolesti; fetalne eritroblastoze. U teškim anemijama viskoznost krvi se jako

smanjuje. Pojavljuje se hipoksija. Sve to dovodi do povećanog opterećenja srca.

Leukociti su pokretne jedinice zaštitnog sistema u telu. Delom nastaju u koštanoj srži, a delom u limfnim čvorovima (limfociti); nakon toga prenose se krvlju u različita područja tela u kojima će se iskoristiti. U krvi normalno postoje pet vrsta leukocita. To su: polimorfonuklearni neutrofilni leukociti, polimorfonuklearni eozinofilni leukociti, polimorfonuklearni bazofilni leukociti, monociti i limfociti.

U krvi ima i mnogo trombocita; to su delovi šeste vrste leukocita, megakariocita.

U EPR sistemu srećemo dve vrste ćelija: a) one koje potiču uglavnom od monocita te su povećanjem svog volumena postale tkivni makrofagi; ima ih u različitim tkivima, a prianjaju uz zid krvnih i limfnih sudova; b) Limfocitne ćelije koje lutaju tkivima ili su uklopljene u posebna limfatična tkiva, kao što su limfni čvorovi.

Leukociti imaju značajnu ulogu u upalnim procesima. Upala obuhvata skup uzastopnih promena koje nastaju u tkivima kao reakcija na oštećenje.

Kad u koštanoj srži, zbog lekova ili ozračenja nakon eksplozije atomske bombe, prestane stvaranje leukocita nastaje kliničko stanje nazvano agronulocitoza, ako se ne leči, čovek najčešće umire veoma brzo.

Leuhemijom se označava veoma povećan broj leukocita u krvi. Do neobuzdanog stvaranja leukocita može doći zbog maligne mutacije ćelija mijelogenog ili limfogenog reda. Leuhemije se obično dele u dve glavne grupe: limfatičke leuhemije i mijeloičke leuhemije.

BIOHEMIJA BUBREGA:Normalna funkcija bubrega zavisi od normalne brzine filtracije i

normalne funkcije tubula

Usporena glomerularna filtracija izaziva: oliguriju; uremiju i zastoj izlučivanja drugih konačnih produkata metabolizma azota, među njima kreatinina, urata i fosfata; snižen sadržaj bikarbonata u plazmi i metaboličku acidozu; hiperkalemiju.

Oštećenje tubula izaziva: poliuriju. Mokraća je suviše razređena i sadrži više natrijuma nego što odgovara stanju hidratacije bolesnika; nisku koncentraciju bikarbonata u plazmi i metaboličku acidozu; hipokalemiju; hipofosfatemiju i hipourikemiju.

U većini bolesti bubrega postoje istovremeno smetnje u funkciji glomerula i tubula. Manifestacije bolesti zavise od njihovog odnosa i od ukupnog broja zahvaćenih nefrona.

Usporena glomerularna filtracija bez značajnog oštećenja bubrega može biti posledica smanjenja razlike između hidrostatičkog pritiska, plazme u kapilarama i tečnosti u lumenu tubula. Takvo stanje može nastati zbog nedovoljne cirkulacije kroz bubrege, ali i zbog postglomeluralne opstrukcije.

Na temelju analiza plazme ne može se razlikovati akutno oligurično oštećenje bubrega od nedovoljne cirkulacije.

Oliguriju zbog nedovoljne bubrežne cirkulacije uz srazmerno dobru funkciju tubula možemo od akutnog oliguričnog zastoja bubrega najbolje razlikovati pomoću kliničkih podataka. Kada se smatra da bi ipak trebalo izvršiti labotarorijske analize, najbolji je indikator koncentracija natrijuma u urinu. Ali nalaz je značajan samo kad je bubrežna cirkulacija u času izlučivanja urina takođe bila niska.

Koncentracije ureje i kreatinina u plazmi su u većini slučajeva odrazi promena bubrežnog klirensa. I jedni i drugi podaci su dovoljni za dijagnozu i praćenje razvoja disfunkcije glomerula. Funkcija tubula

može se ispitati merenjem sposobnosti bubrega da koncentruje mokraću.

Klirens testovi su manje precizni i tačni od analiza plazme.

Bubrežni kamenci nastaju zbog: visoke koncentracije njihovih sastojaka u urinu, bilo zbog oligurije, bilo zbog toga što ih se mnogo izlučuje; pH mokraće pri kojem se sastojci lako talože; i zastoja urina. Od 70% do 90% bubrežnih kamenaca sadrži kalcijum. Kamenci s kalcijumom su najčešće idiopatskog porekla, ali treba isključiti mogućnost da su nastali zbog hiperkalcemije, posebno one primarnog hiperparatireoidizma. Imamo još kamence od mokraćne kiseline, i retko od cistina, ksantina i oksalata.

BIOHEMIJA JETRE:Jetri pripada centralna uloga u mnogim metaboličkim procesima.

Bilirubin nastaje iz hemoglobina, konjuguje se u jetri, te se zatim izlučuje u žuči. U crevu se pretvara u sterkobilinogen (fekalni urobilinogen). Nešto reapsorbovanog urobilinogena izlučuje se mokraćom.

Metabolizam bilirubina može se ispitati merenjem koncentracije bilirubina u plazmi i pregledom stolice i mokraće.

Žutica je posledica povišene koncentracije bilirubina u plazmi. Povišena može biti samo nekonjugovana frakcija ili obe frakcije, što je najčešće kod odraslih.

Rezultati prvih biohemijskih analiza mogu biti tipični za jedan od tri patološka procesa ili za kombinovane poremećaje: oštećenje ćelija jetre, holestazu i smanjenu masu funkcionalnog tkiva. Uz svaki od tih procesa može, ali ne mora, postojati žutica.

Hiperbilirubinemija nekonjugovanog bilirubina bez konjugovanog, obično je znak hemolize. Kod novorođenčeta može hiperbilirubinemija biti prevelika za kapacitet vezivanja proteina, pa slobodni nekonjugovani bilirubin može prodreti u ćelije mozga te izazvati kernikterus.

Poznato je nekoliko urođenih mana u kojima postoji hiperbilirubinemija. Većinom su srazmerno bezazlene, ali sindrom Crigler-Najjara može izazvati kernikterus.

Određivanje enzimske aktivnosti od velikog je značaja za diferencijalnu dijagnostiku. Kliničko-hemijski testovi koji se koriste za ispitivanje funkcije jetre prema patomehanizmima mogu se grubo klasifikovati u testove:

Kojim se identifikuje poremećaj permeabilnosti parenhimskih ćelija jetre: povećanje ALT, AST, fruktozo-1-fosfat aldolaze, sorbitol dehidrogenaze, LAP i ornitin-karbomil transferaze u plazmi.

Koji ukazuju na nekrozu ćelije jetre: pojava GLDH i mitohondrijalne AST u plazmi.

Koji ukazuju na insuficijenciju mehanizma koji produkuju protein u EPR-u parenhinskih ćelija: smanjenje holinesteraze, albumina, nekih faktora koagulacije i fibrinogena u plazmi.

Koji ukazuju na opstrukciju u oblasti intra- ili ekstra-hepatičnih žučnih vodova: povećanje AP, LAP, ceruloplazmina i izvesnih žučnih kiselina u plazmi.

Koji ukazuju na proliferaciju mezenhinalnih frakcija u jetri: povećanje α2 i γ-globulina na elektroferogramu i patološki rezultati labilitetnih testova.

U svrhu “screening” testova za otkrivanje oboljenja jetre i sekundarnih poremećaja najbolje mogu poslužiti AST, ALT, γ-GT I ChE.

Literatura:

Guyton A. C. Temelji fiziologije čovjeka, JUMELA, Zagreb, 1980.

Voet D, Voet JG, Pratt C. Principle of Biochemistry: Life at the Molecular Level, J.Willey and Soons, New York, 2008.

Devlin TM. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, J.Willey and Soons, New York, 2005.

Sodeman W. A. Patološka fiziologija, Medicinska knjiga, Beograd-Zagreb, 1959.

Štraus B. Medicinska biohemija, JUMELA, Zagreb, 1988.

Alberts O, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson J. Molecular Biology of the Cell, Gerland Publishing, New York, 1994.

Devlin TM. Textbook of Biochemistry, Willey-Liss, New York, 1992.

Budecke E. Grundriss der Biochemie, Walter de Gruyter, Berlin, 1989.

Elliott WH, Elliott DC. Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, Oxford, 2009.

Đurđić V. Medicinska biohemija, Zavod za udžbenike i nastavna sredstva, Beograd, 1996.

Voet D, Voet JG. Biochemistry, J. Willey and Soons, New York, 1995.

Roskoski R. Biochemistry, W.B. Saunders, Philladelphia, 1996.

Riggs T, Chandler AM. Biochemistry, Springer Verlag, Berlin, 1995.

Motulsky V. Human genetics, Problems and Approaches, Springer Verlag, Berlin, 1997.

Matić G. Osnovi molekularne biologije, Zavet, Beograd, 1997.

Martin DW, Mayes PA, Rodwell VW, Granner DK. Harperov pregled biohemije, Savremena administracija, Beograd, 1989.

Frayn KN. Metabolic Regulation, A Human Perspective, Portland Press, London, 1996.

Karlson P. Biokemija, XI izd., Školska knjiga, Zagreb, 1982.

Zilva JF, Pannall PR. Klinička kemija u dijagnostici I terapiji, Školska knjiga, Zagreb, 1979.

Berkeš I, Berkeš-Tomašević P. Opšta i medicinska enzimologija, Medicinska knjiga, Beograd-Zagreb, 1975.

Williams RH. Textbook of Endocrinology, VI izd., W.B. Saunders Company,