Análise quantitativa em Cromatografia Líquida (LC)

Análise quantitativa

Compreende os métodos e técnicas usados para quantificar os componentes de uma amostra.

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Relembrando conceitos...

Cromatografia Líquida

Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes entre duas fases: móvel e estacionária (ambas líquidas). Cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais destes.

Cromatografia em Coluna (CC)

Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Cromatografia em Papel (CP)

Cromatografia Líquida de alta Eficiência (CLAE)

Entre outros...

Injeção Migração Eluição3

Relembrando conceitos...

Análise qualitativa

Compreende os métodos e técnicas usados para identificação dos componentes de uma amostra.

CLAE� Identificação pelo tempo de retenção (tR).

Tempo (min)Tempo (min)

Res

po

sta

do

det

ecto

r

Res

po

sta

do

det

ecto

r

Amostra Padrão 4

Análise quantitativa

Conhecimento do problema

Conhecimento do universo

Escolha do método

Amostragem

Homogeneização

Eliminação de interferentes

Análise

Expressão dos resultados

Tratamento prévio

Tratamento de dados

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Métodos de quantificação

�Normalização Interna;

�Normalização de área;

�Padronização Externa;

�Padronização Interna;

�Superposição de matriz;

�Adição de padrão.6

Normalização Interna

% A = (Área de A / Área total ) x 100

Indica a quantidade de um componente em relação aos outros componentes na amostra.

7

Tempo (min)

Res

po

sta

do

de

tect

or

� Vantagens

• É simples e prática, sendo ideal para análises de rotina em que a exatidão não é um fator importante;

• Independe do volume injetado;• Independe da estabilidade do aparelho;• Não é necessária a utilização de padrões.

� Desvantagens

• Não se aplica a amostras complexas• Exige o registro de todos os componentes• Não é adequada para análise de traços• Assume que todos os componentes injetados na coluna são

eluídos;• Assume que o detector apresenta a mesma resposta para

todos os componentes da mistura.

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_____________________________________Normalização interna

Exemplo

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Figura. Cromatograma em CLAE-DAD de mistura

flavonoídica. Condições cromatográficas: coluna Inertsil

Prep-ODS (250 x 6 mm, 10 µm); Temp. de 30°C; 1,4

mL.min-1. 265 nm.

� Perkin Elmer (Séries 200):

• TotalChrom Software

•LaPNaT (Lab. 627 – IQ/UFRJ)

Normalização de áreas

• Preparam-se diferentes soluções padrão com massas conhecidas (m);

• Obtem-se a área de cada um dos picos;

• Calcula-se a razão A/m (fator de resposta).

% A = [(Área de A / F) / (∑ Áreas / ∑ F )] x 100

10

Tempo (min)

Res

po

sta

do

de

tect

or

�Vantagens

• As mesmas que a normalização interna, atrelado ao fato de que nesse caso o resultado é mais exato;

�Desvantagens

• não se aplica a amostras complexas;• exige o registro de todos os componentes;• não é adequada para análise de traços;• utiliza vários padrões;

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_____________________________________Normalização de área

• Preparam-se uma série de soluções padrão contendo a substância de interesse;

• Os padrões são injetados no sistema cromatográfico;

• A partir das áreas dos padrões constrói-se gráfico: área x concentração;

• Injeta-se a amostra com o analito de concentração desconhecida;

• A concentração da substância de interesse pode ser determinada por interpolação gráfica ou através da equação da reta determinada por regressão linear.

Padronização externa

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Padronização externa

Padronização externa

Padronização externa

Padronização externa

Padronização externa

Padronização externa

Padronização externa

Padronização externa

Curva analítica

Em técnicas instrumentais, a relação linear simples, descrita pelo modelo:

f(x) = b0 + b1x

geralmente, é válida em um determinado intervalo de massa ou concentração da espécie medida.

21

22

Curva analítica

Atenção:

Faixa linear

dinâmica.

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Limite de detecção (LD)

O limite de detecção representa a menor concentração da substância em análise que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, utilizando um determinado procedimento experimental.

Importante: O LD pode ser calculado com base na relação sinal/ruído (3:1).

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Limite de quantificação (LQ)

O limite de quantificação representa a menor concentração da substância em exame que pode ser medida, utilizando um determinado procedimento experimental.

Importante: LQ pode ser calculado utilizando a relação sinal-ruído (10:1).

�Vantagens:

• Pode ser usada de maneira pontual, relacionando a área da substância de interesse na amostra com a área de apenas um padrão, independe da detecção dos demais picos;

• Utilizada para amostras complexas;• Pode ser utilizada na análise de traços.

�Desvantagens

• Depende da estabilidade do sistema cromatográfico;• É afetado por erros durante a introdução da amostra no

sistema cromatográfico;• Não considera efeito de matriz.

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_____________________________________Padronização externa

Exemplo

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54321A5 – solução padrão

Maior concentração

2-4 –solução padrãoConcentrações intermediárias

1 – solução padrão Menor concentração

A - amostra

Legenda:

Densitometria computacional: quantificação em CCD

Aplicação da amostra

Marta Olech, Łukasz Komsta, Renata Nowak, Łukasz Cies´la, Monika Waksmundzka-Hajnos. Investigation of antiradical activity of plant material by thin-layer chromatography with image processing. Food Chemistry 132,549–553, 2012.

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54321A

Após eluição

ExemploDensitometria computacional: quantificação em CCD

Densitograma

Olech, M.; Komsta, Ł.; Nowak, R.; Cies´la, Ł.; Waksmundzka-Hajnos, M. Investigation of antiradical activity of plant material by thin-layer chromatography with image processing. Food Chemistry, 132, 549–553, 2012.

Padronização interna

A padronização interna é uma técnica na qual um padrão é injetado concomitantemente à amostra desconhecida, isto é, ele é dissolvido na própria amostra e servirá de base para os cálculos quantitativos do alvo analítico a partir de uma relação de áreas.

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Da escolha do padrão interno:

• Não pode estar presente na amostra;

• Deve estar disponível em elevado grau de pureza;

• Deve ter comportamento cromatográfico similar ao da substância a ser analisada;

• Deve estar numa concentração próxima a da substância de interesse na amostra (devendo esta ser previamente estimada);

• estável, não-reativo;

• Deve ser bem resolvido dos outros picos.

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Um analista deseja determinar a concentração da substância A em uma amostra de água por cromatografia líquida de alta eficiência. Para isso, escolheu um padrão interno (PI) adequado e preparou vários padrões contendo o PI e a substância A em água destilada, obtendo os seguintes resultados:

Exercício

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Qual a concentração da substância A na amostra de água?

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�Vantagens:

• O volume de injeção não influi no resultado;

• útil, especialmente pelo fato de que independe de pequenas mudanças em variáveis experimentais, como temperatura da coluna e tamanho da amostra.

�Desvantagens

• Dificuldade de encontrar uma substância candidata a padrão interno para o sistema em análise.

_____________________________________Padronização interna

Superposição de matriz

O método de superposição de matriz consiste na adição do padrão da substância em diversas concentrações em uma matriz similar à da amostra, isenta da substância, e construção do gráfico de calibração relacionando as áreas obtidas com as concentrações do padrões.

� Vantagens• Compensa o efeito da matriz ou de possíveis interferentes;• Sua principal vantagem sobre o método de padronização externa é que fornece

uma melhor correspondência com a composição da amostra.

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� Desvantagem• Não Proporciona a magnitude do efeito de co-extratos e aumenta o custo e

o tempo das análises.

Adição padrão

• É o método utilizado nos casos em que não é possível a mimetização da matriz sem a presença da substância de interesse;

• Consiste na adição de diferentes concentrações de padrão da substância de interesse à matriz, que já contém determinada quantidade da substância de interesse;

• A matriz permanece quase inalterada após cada adição, a única diferença é concentração da substância de interesse.

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Adição padrão

Adição padrão

Adição padrão

Adição padrão

Adição padrão

Adição padrão

Comparação entre métodos

Queiroz, S. C. N.; Collins, C. H.; Jardim, I. C. S. F. MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E/OU CONCENTRAÇÃO DE COMPOSTOS ENCONTRADOS EM FLUIDOS BIOLÓGICOS PARA POSTERIOR DETERMINAÇÃO CROMATOGRÁFICA. Quim. Nova, Vol. 24, No. 1, 68-76, 2001. 40

Figura. Interrelação entre os diferentes métodos de construção da curva analítica.