Purificarea și caracterizarea enzimelor · Purificarea și caracterizarea enzimelor Etape Alegerea sursei enzimatice Prepararea extractului Separarea cromatografica verificarea purit

Purificarea și caracterizarea enzimelor

Etape

Alegerea sursei enzimatice

Prepararea extractului

Separarea cromatografica

verificarea purității

Metode de separare fizică / concentrare

dializa

ultrafiltrarea

centrifugarea

monitorizarea activității enzimatice

Imobilizarea enzimelor

2. Purificarea și caracterizarea enzimelor

2.1. Prepararea

extractuluimicroorganisme

plante

Alegerea sursei

Procariote

(archea, eubacterii)

Eucariote

Drojdii

Fungi

ciuperci

tirozinaza

muscată

tutun

Spanacnitroreductaza

E.Wilson,Spinach enzyme break down explosives,

Chem. Eng. News, 1998, 76 (33),40

R.Blasco,P.J. Aparicio, F. Castillo,

Archives of Microbiology,1995, 4,248–253


2.1. Alegerea sursei

plante

Alegerea sursei

Arabidopsis thaliana

glicozil transferaza

Organism model în biologia

plantelor

genom mic 114.5 Mb/125 Mb total

5 cormozomi

http://oregonstate.edu/

Tehnologia ADN-ului recombinat

bacterii, fungi

origine

animalăFicat de porcesteraza

Ficat de calAlcool dehidrogenaza



Organisme marine superioare (mușchi)

http://fishes-images.blogspot.ro/

macrou Atka

http://wdfw.wa.gov/fishing

creveți Botan

http://www.iowadnr.gov/

crap

http://www.dpi.nsw.gov.au/

păstrăv curcubeu

http://barnegatshellfish.org/

scoici Saint-Jacques

transglutaminaza

Kevin Ahern's Biochemistry



Organisme marine superioare

proteaze

http://www.sea-ex.com/

Crab de noroi

http://www.fao.org/figis/

sardină pion portocaliu

http://www.seafoodsource.com/

doradă

http://www.fooduniversity.com/

calcan

http://www.bim.ie/media/bim/

Pește roșu de adîncime

amilază



Organisme marine superioare

ch

imo

trip

sin

a

pepsină

http://blog.turners-seafood.com/

cod atlantic

http://www.river2seausa.com/

Rac de râu

http://oceana.org/marine-life/

crevete alb

http://nergard.no/sites/

capelinul arctic

http://www.sciencewithmyrt.com/

Bureți marini

Bacterii asociate

cu bureți marini

(act. extracelulară)

bacterii heterotrofe

(apa de mare)

A.Feby, S. Nair,

AdvBiosciBiotech, 2010, 1,330-337


2.1. Surse de enzime din plante/animale utilizate în tehnologiile alimentare

Enzima Sursa Actiunea asupra

alimentelor

Aplicații

În industria

alimentară

-amilaza Semnițele cerealelor

(grâu, orz)

Hidroliza amidonului la

oligozaharide

Fabricarea pâinii

Fabricarea berii

-amilaza Cartofii dulci Hidroliza amidonului la

maltoza

Fabricarea

siropului din malț

papaina Latexul necopt al

fructului de papaya

Hidroliza proteinelor

alimentare sau din

industria alcoolului

Frăgezirea cărnii,

prevenirea

tulburării berii

bromelaina Tulpina sau sucul de

ananas


musculare sau din țesutul

conjunctiv

Frăgezirea cărnii

ficina latexul smochinelor Asemeni bromelainei Asemeni papainei

și bromelainei

Cost mare de

producție




alimentelor

Aplicații

În industria alimentară

Tripsina Pancreas

bovin/porcin


alimentare

Producerea de hidrolizate

pentru aromatizarea

mâncării (înlocuiește

proteinazele microbiene)

Chimozina Stomacul vițeilor Hidroliza k-caseinei Coagularea laptelui în

industria brânzeturilor

Pepsina Stomacul bovinelor Asemeni chimozinei și

hidroliza generală a

caseinelor din lapte

Se găsește alaturi de

chimozină în “cheag”

Lipaza

Esterază

Laringele caprelor

sau mieilor

Hidroliza trigliceridelor Intensificarea aromelor în

brânzeturi: modificarea

funcțiilor grăsimilor prin

transesterificare

Lipoxigenaza Soia Oxidarea acizilor grași

nesaturați din făinuri

Îmbunătățire a aluatului

de pâine




alimentelor

Aplicații

În industria alimentară

Lizozima Albușul de ou Hidroliza peretelui

polizaharidic al celulei

bacteriene

Prevenirea defectelor de

umflare din brânză de

către bacterii care

formează spori

Lactoperoxidaza Zer-stomacul

bovinelor tinere

Oxidarea tiocianatului

la hipotiocianat

(OSCN-)

Sterilizarea la rece a

laptelui

Localizarea enzimelor

- enzime solubilizate în diferite lichide biologice (sânge, urină,

lichid cerebrospinal, citoplasmă, mediu cultură microbiană);

- enzime fixate pe diverse structuri tisulare și subcelulare

Markeri enzimatici

Localizare într-o formațiune subcelulară


2.1. Surse de enzime - microorganismele

biology-igcse.weebly.com

IntracelularăSaccharomyces

Extracelulară Candida și Streptomyces

Invertaza

Intracelularădrojdie

Extracelulară mucegaiuri

β-Galactozidaza


2.2. Metode de separare

fizică / concentrare

ultrasonicarea

Omogenizarea extractului

cicli inghetare-dezghetare

Ruperea

membranelor

celulare

distrugerea enzimatica

a membranei celulare

ultrasonicare

celulele procariote

eucariote

țesuturi animale• zgomotoasă

• reproductibilitatea (denaturare)

2.2. Metode de separare fizică / concentrare


2.2. Metode de separare fizică / concentrare

presa franceza


celulele bacteriene P = 20.000 psi (1360 atm)

Vmin= 40mL samples• scumpă

• zgomotoasă

• timp îndelungat funcționare/curățare

Omogenizatorul

Manton-Gaulin

http://slideplayer.com/

cicli inghetare-dezghetare distrugerea membranei celulare

2.2. Prepararea extractului

joy-of-bioprocess.blogspot.com

- Utilizarea lizozimului

- Utilizarea detergentilor

www.plospathogens.org


celulele bacteriene

animale

+ ieftină•reproductibilitatea (denaturare)

2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor

A. Precipitarea la pH = pI

Papaina (papaia) pI = 8,85

Ureaza (fasole) pI = 5 - 5,1


EP0220921A3(1) subtilizină Carlsberg

(2) enzimă din Bacillus sușa

(3) enzimă din Bacillus sp.

(4) enzimă din Bacillus sp. filmus

(5) enzimă din Bacillus firmus

(6) enzimă din Bacillus sacchariticus

https://patentimages.storage.googleapis.com/EP0220921A2/imgb0009.png

https://patentimages.storage.googleapis.com/EP0220921A2/imgb0009.png

B. Precipitarea cu (NH4)2SO4

precipitat

Precipitarea fracțiunilor

care contin HSA

a) Inainte de adaugarea sarii;

b) Suspensie de precipitat proteic in

solutie 85% de sulfat de amoniu;

c) Precipitat proteic - centrifugare

60 min la 5000 rpm.



Precipitarea extractului de cucumisină

(serin protează din pepene galben)

Gagaoua M, Hafid K (2016) Three Phase

Partitioning System, an Emerging Non-

Chromatographic Tool for Proteolytic

Enzymes Recovery and Purification.

Biosens J, 5:134

doi:10.4172/2090-4967.1000134

B. Precipitarea cu NH4(SO4)2




C. Precipitarea cu PEG


M C, Madhusudhan, Kv, Raghavarao & Nene, Sanjay. (2008).

Integrated process for extraction and purification of alcohol

dehydrogenase from Baker’s yeast involving precipitation and aqueous

two phase extraction. Biochemical Engineering Journal. 38. 414-420.


D. Precipitarea cu solventi organici


Acetona

EtOH

Kalikreina urinară porcină

fracționare cu 50 - 75 % acetonă

Tschesche H., Mair G., Förg-Brey B., Fritz H. (1976) Isolation of Procine

Urinary Kallikrein. In: Sicuteri F., Back N., Haberland G.L. (eds) Kinins.

Advances in Experimental Medicine and Biology, vol 70. Springer, Boston,

MA

M. A. Mariño, S. Freitas and E. A. Miranda,

Brazilian Journal of Chemical Engineering,

32, 02, 325 - 333, 2015

1.3. Dializa

Amestec

supus

dializei

Sac de

dializa

A B

Solutie tampon

enzima

Molecule mici

difuzie



http://www.spectrumlabs.com/

https://www.thermofisher.com/

Saci de dializa

(esteri celuloza)

http://static.coleparmer.com/

https://www.thermofisher.com/



https://www.gbiosciences.com



https://schoolworkhelper.net/

Ultrafiltrarea

N2 (presiune)

Sticla

sinterizata

Ultrafiltrat

Membrana

Magnet pentru

agitareSolutia de enzimă

supusa concentrarii

Agitator magnetic

Membrane semipermeabile

- Acetat de celuloza

- Nylon

- polivinilidena

Mai rapida decat dializa

Concentrarea probei

http://www.sigmaaldrich.com/



Membrane semipermeabile

-presiune-

www.ebay.tv

http://www.emdmillipore.com/

Membrane

semipermeabile/centrifugare

www.fishersci.com



Ultrafiltrarea

Centrifugarea

rPrecede operatii

sonicare

precipitare

Separarea

M

forma

densitate

natura

solventului

Viteze mici < 6000 rpm

Particule mai mari

nucleu celulele roșii



m0(1 – v)2r = fv = fdr

dt

Centrifugarea



v =dr

dt

m0(1 – v)2r

f=

Viteza de sedimentare

Coeficientul de sedimentare

s =v

2r

m0(1 – v)

f=

Ultracentrifugarea

Viteze mari > 20000 rpm

Organite celulare

mitocondrii reticulul

endoplasmatic

1 Svedberg = 1S = 1 x 10-13 s

Hemoglobina 4,5 S

Mioglobina 1,8 S



http://image.slidesharecdn.com/

http://www.visionlearning.com/

http://www.biologydiscussion.com/

Ultracentrifugarea



Ultracentrifugarea



https://www.slideserve.com/nira



anticoagulant



Diferențe între ser și plasmă

Documents

Purificarea și caracterizarea enzimelor · Purificarea și caracterizarea enzimelor Etape Alegerea sursei enzimatice Prepararea extractului Separarea cromatografica verificarea purit