Proteome & Proteomics

厚德博学精诚济世

分子生物学第一章绪论分子生物学第三章人类基因组计划

Proteome & Proteomics

分子生物学第二章染色体与基因


分子生物学第三章人类基因组计划

Proteome & Proteomics 定义 Proteome ：

1994 年，由澳大利亚 Macguarie 大学的 Wilkins等首先提出：“蛋白质组指的是一个基因组所表达的全部蛋白质” (proteome indicates the proteins expressed by a genome)

“proteome” 是由蛋白质一词的前几个字母“ prote” 和基因组一词的后几个字母“ ome” 拼接而成

蛋白质组 (Proteome) : 细胞内的全部蛋白质




Proteomics 定义蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究

细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学最早是在 1995 年提出的，它在本质上指的是

在大规模水平上研究蛋白质特征：表达水平（量）翻译后的修饰（成熟与调控）蛋白与蛋白相互作用（信号通路）等由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代

谢等过程的整体而全面的认识




Proteome 与 Genome 关系互补的角度 / 空间来研究细胞的分子架

构相辅相成 Genome --- 导演

RNome --- 编剧

Proteome--- 演员




Proteome 与 Genome 区别稳定性

Proteome --- 静态 Genome --- 动态

修饰化程度 Proteome --- 高 Genome --- 底

复杂程度 Proteome --- 高（ 20aa + 高度多样性修饰） Genome --- 底（ 4nt ）

特异性 Proteome --- 组织和细胞特异性 Genome --- 无组织和细胞特异性




功能蛋白质组 (functional proteome) 1997 年，由 Cordwell 和 Humphery-Smith

提出的，它指的是在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质。

功能蛋白质组只是总蛋白质组的一部分，通过对功能蛋白质组的研究，既能阐明某一群体蛋白质的功能，亦能丰富总蛋白质数据库，是从生物大分子 ( 蛋白质、基因 ) 水平到细胞水平研究的重要桥梁环节。




功能蛋白质组



蛋白质组学研究思路与方法

策略、技术、工具




蛋白质组研究相关网站蛋白质组学研究依赖生物信息学和网络技术

http://www.proteomeworks.bio-rad.com 蛋白质组研究技术、信息等 http://www.proteinpathways.com 发现新蛋白及新作用 ( 新药开发 ) http://www.proteome.med.umich.edu 蛋白质组研究相关企业、各种

仪器来源、新闻等 http://www.proteome.co.uk 各种蛋白质组研究相关信息 http://www.micromass.co.uk 介绍蛋白质鉴定的先进仪器 http://www.expasy.ch 蛋白质鉴定专家系统， Swiss Institute of Bioi

nformatics http://expasy.proteome.org.au 蛋白质鉴定专家系统， Australian Pr

oteome Analysis Facility http://expasy.cbr.nrc.ca 蛋白质鉴定专家系统， Canadian Bioinfor

matics Resours




主要专业术语及其英文对照和缩写 IPG-IEF：固相 pH 梯度等电聚焦（ immobilized p

H gradients isoelectric focusing） SDS- PAGE ：十二烷基磺酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电

泳（ Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis ） 2-DE ：双向电泳 (Two Dimensional Electrophoresis)

HPLC ：高效液相色谱（ High performance Liquid Chromatography ）

MALDI-TOF MS ：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（ Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry)




研究策略与技术两条互补的实验流程

基于凝胶的工作流程

（ Gel-based workflow ）基于液相色谱的工作流程

（ LC-based workflow ）




蛋白质组学实验室所需的条件




双向凝胶电泳（ 2DE ）是等电聚焦电泳和 SDS-PAGE的组合

即先进行等电聚焦电泳（按照 pI 分离）然后再进行 SDS-PAGE （按照分子大小）凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图




蛋白质组研究的基本技术 2D-SDS-PAGE ：

样品制备第一向 IPG-IEF 电泳 IPG 平衡第二向 SDS-PAGE 电泳染色（银染）及图谱分析目标蛋白获取及其鉴定（ MC 分析）




2DE结果图谱




蛋白质组研究的基本技术 --- 样品预分离样品的制备（预处理）：

组织细胞细胞器（线粒体、叶绿体、细胞核）




蛋白质组研究的基本技术 --- 蛋白提取重要性：

在制备时丢失的蛋白永远不能在后面实验中弥补把蛋白质看作具有独特而奇妙性质的实体

原则：使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修

饰（如酶性或化学性降解等）完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白




蛋白质组研究的基本技术 --- 蛋白提取步骤：

破碎沉淀蛋白去除杂质




蛋白质组研究的基本技术 --- 蛋白提取样品制备流程 --- 破碎

尽可能减少蛋白水解 / 其它形式蛋白降解原则机械法（超声波法、高压法、机械匀浆法

）化学法（去污剂法、酶裂解法）物理法（液氮研磨法、循环冻融法、渗透

法、玻璃珠破碎法）




蛋白质组研究的基本技术 --- 蛋白提取样品制备流程 --- 沉淀蛋白

去杂浓缩后蛋白可溶性是关键 TCA- 丙酮沉淀法三氯醋酸（ TCA ）沉淀法 – 引起降解 / 修

饰丙酮沉淀法硫酸铵沉淀法 – 影响 IEF

醋酸铵沉淀法 – 步骤繁琐




2D 电泳结果影响因素分析




蛋白质组研究的基本技术 --- 蛋白提取样品制备流程 ---- 去除杂质

关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰核酸的清除（ DNase/Rnase ）多糖的清除（超离心、 TCA沉淀等）去污剂的清除（丙酮沉淀法等）盐离子和外源带电小分子的清除（透析、

TCA- 丙酮沉淀法）





可能原因：样品含高丰度 Pr

可能原因： TCA残留致使 Pr丢失





可能原因： Tris 质量不好可能原因： Urea 不纯




蛋白质组研究的基本技术 --- 蛋白提取样品制备注意事项：

蛋白质水解 ---- 蛋白酶抑制剂 (PMSF 等 )

特殊样品的制备 (低丰度、强碱性蛋白质（核糖体）、极端分子量 )

样品定量重复性




2D-SDS-PAGE 重复性

The same protocol and sample, however not the same resultsRec: similar; cir: different




2-DE 第一向 IPG-IEF 电泳

IEF 是一种根据样品的等电点不同而使它们在 pH 梯度中相互分离的一种电泳技术

将等电点不同的蛋白质混合物加入有 pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的 pH位置上，形成分离的蛋白质区带

从而得知其等电点信息



分子生物学第三章人类基因组计划IEF 的基本条件

step 1step 2step 3total

voltage Time Volt-Hours Ramp

250 20min －－－ Linear4000

40002hr －－－－－－ 10,000V-hr

Linear

Rapid5 hr 14,000V-hr

7 cm

step 1step 2step 3

total

total

step 1step 2step 3

11 cm

17 cm

250

2508000

1000010000

8000

20min

20min2.5hr

2.5hr

－－－

－－－

－－－－－－

－－－－－－

20,000V-hr

40,000V-hr

～ 30,000V-hr

～ 50,000V-hr

5.3 hr

7 hr

LinearLinear

LinearLinear

Rapid

Rapid




IPG-IEF 电泳




2-DE 第二向垂直 SDS-PAGE 电泳

聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。 SDS 与蛋白质形成雪茄状带负电荷复合物，从而消除了蛋白间的电荷及形状差异，电泳速度仅与分子量有关

从而得知其分子量信息




第二向垂直 SDS-PAGE 电泳凝胶浓度与其对应的分离范围

胶浓度分离范围 (KD) 5% 36-200 7.5% 24-200 10% 14-200 12.5% 14-100 15% 14-60




第二向垂直 SDS-PAGE 电泳步骤：

溶液配置 (Buffer 、 Bis-Acr 、 AP 、 TEMED)

灌胶电泳

Ettan Dalt twelve 电泳系统




第二向垂直 SDS-PAGE 电泳

Ettan Dalt six 电泳系统




2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测染色： 1 ）考马斯亮兰染色法；

2 ）银染法；

3 ）负染法；

4 ）荧光染色法；

5 ）放射性同位素标记法等




2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测图像扫描和分析—— Image Scanner II




2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测全自动斑点切取系统（ Ettan Spot Picker ）




2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测质谱或MALDI-TOF MS

质谱分析基本原理是使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生相反的速度色散——离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。




2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测 MALDI-TOF MS

样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测，常用来测蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子




2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测通过质谱分析，可以获得分析样品的分子量、

分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息

SARS 病毒 N 蛋白整体分子量



蛋白质功能研究技术




蛋白质功能研究技术酵母双杂交




蛋白质功能研究技术 Co-IP 技术




蛋白质功能研究技术 Co-IP&Pull down



蛋白质组在医学研究中的现状和前景




蛋白质组在医学研究中的现状和前景人类疾病的蛋白质组研究

直肠癌：Sanchez 等对 15例结肠癌和 13

例正常人的结肠上皮进行 2-DE 。建立了包括 882 和 861 个斑点的结肠癌及正常人结肠粘膜的标准胶图。结果发现在分子量为 13kD 和 pI值为 5.6处的蛋白质仅出现在结肠癌的组织中。经鉴定为：钙粒蛋白 B（ calgranulin B ）及钙卫蛋白（ calprotectin ）




蛋白质组在医学研究中的现状和前景人类疾病的蛋白质组研究

肝癌 --- 醛糖还原酶膀胱癌 ---醛糖还原酶、 Trp-tRNA合成酶、 IFN-γ诱导的 r3 ， SOD 及 35.8kD 和11.2kD两未知蛋白

扩张型心肌病 --- 8 种蛋白质




蛋白质组在医学研究中的现状和前景致病微生物的蛋白质组研究

检测博氏疏螺旋体与免疫有关的蛋白质弓形体抗原的检测白色念珠菌 ---- 对真菌细胞壁蛋白分析筛选抗药真菌药物



蛋白质组学研究趋势




蛋白质组学研究趋势在应用研究方面

蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一

在技术发展方面研究方法将更强调各种方法间的整合和互

补，以适应不同蛋白质的不同特征蛋白质组学与其它学科的交叉互动

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