Proteínas de Interés Farmaceutico.Genética Molecular

▪ El ácido desoxiribonucleico (ADN) contiene la información necesaria para la síntesis de proteínas. El descubrimiento del código genético abrió la posibilidad de obtener péptidos y/o proteínas a gran escala a partir de diversos organismos en los cuales no se producen de manera natural. A las proteínas obtenidas de esta manera se les conoce como PR. Éstas se pueden producir en microorganismos como bacterias, hongos, virus y levaduras, así como en líneas celulares cultivables de insectos, plantas y de mamíferos (Jonasson et al., 2002; Palomares et al., 2004), sistemas de expresión de proteínas “sin células” y también en animales y plantas trangénicas (Farrokhi et al., 2009).

▪ La sobreexpresión de PR ofrece la ventaja de producir grandes cantidades de la proteína de interés con características similares a la proteína natural y de manera relativamente fácil y rápida. Esta tecnología cuenta con al menos 35 años y por su aplicación tanto en la industria farmacéutica y alimentaria, como en la investigación científica, se encuentra entre los desarrollos más importantes del siglo XX (Porro et al., 2005).

Conceptos GeneralesProteina: ▪ Moléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos. Son macromoléculas

compuestas por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. La mayoría también contienen azufre y fósforo. Las mismas están formadas por la unión de varios aminoácidos, unidos mediante enlaces peptídicos. El orden y disposición de los aminoácidos en una proteína depende del código genético, ADN, de la persona.

▪ Las proteínas constituyen alrededor del 50% del peso seco de los tejidos y no existe proceso biológico alguno que no dependa de la participación de este tipo de sustancias.

Biofármaco:▪ Son producidos por organismos genéticamente modificados (genetically modified organisms GMOs). A diferencia de las

proteínas de origen natural, las proteínas recombinantes pueden ser producidas en grandes cantidades lo que ha permitido cubrir la creciente demanda actual. En contraste con las proteínas no humanas obtenidas de animales como por ejemplo la insulina de cerdo, las proteínas recombinantes son idénticas o difieren ligeramente respecto a las proteínas nativas de origen humano, por lo que las reacciones inmunológicas adversas disminuyen significativamente

Vector:▪ Un vector génico es un agente que transfiere información genética, por algún medio, de un organismo a otro. Son

utilizados en biotecnología un Vector de clonación para portar el ADN recombinante desde una célula donadora hasta la célula receptora en los que se inserta el gen que se quiere transferir. A continuación se infecta la célula hospedadora con ese vector recombinante, obteniéndose la célula transgénica.

▪ Un vector con el que los científicos experimentan son los plásmidos, con los que es posible insertar genes foráneos al núcleo de una célula. Otros vectores génicos son los bacteriófagos y cósmidos. También se puede considerar vectores genéticos a los virus, puesto que en el curso de su ciclo insertan información genética en las células que invaden.

Procedimiento para producir una PR ▪ consiste en introducir el ADN que codifica para la proteína de interés en un vector de

sobreexpresión (plásmidos, virus, cósmidos). El vector contiene un origen de replicación que le permite copiarse dentro de la célula hospedera, una región promotora que permite la producción de la proteína de interés, un sitio de clonación múltiple (SCM), que es una región que contiene diversos sitios de restricción que permiten la inserción de ADN entre ellos y en algunos casos, genes de resistencia a antibióticos y genes reporteros, que facilitan la selección de las colonias de bacterias que tendrían el vector con la información genética insertada.

▪ Por ejemplo, para crear un plásmido recombinante, se lleva a cabo un procedimiento de ligación que permite insertar dentro del SCM del vector, un segmento de ADN que corresponde al marco de lectura funcional, que contiene la información para la generación de la proteína de interés. Al producto de este vector, más el fragmento de ADN codificante (inserto), se denomina “construcción”. El siguiente paso es la “transformación”, ésta se realiza al insertar la construcción dentro de la célula hospedera y ésta se convierte en una fábrica celular de la proteína de interés (Palomares et al., 2004). La bacteria Escherichia coli es uno de los sistemas de sobreexpresión más utilizados para la producción de PR.

Funciones de las proteínas▪

Las funciones principales de las proteínas en el organismo son: Ser esenciales para el crecimiento. Las grasas y carbohidratos no las pueden sustituir, por no contener nitrógeno.

▪ Proporcionan los aminoácidos esenciales fundamentales para la síntesis tisular.▪ Son materia prima para la formación de los jugos digestivos, hormonas, proteínas plasmáticas,

hemoglobina, vitaminas y enzimas.▪ Funcionan como amortiguadores, ayudando a mantener la reacción de diversos medios como el plasma.▪ Energéticamente, las proteínas aportan al organismo 4 Kcal de energía por cada gramo que se

ingiere.

▪ Actúan como catalizadores biológicos acelerando la velocidad de las reacciones químicas del metabolismo. Son las enzimas.Actúan como transporte de gases como oxígeno y dióxido de carbono en sangre. (hemoglobina).

▪ Actúan como defensa, los anticuerpos son proteínas de defensa natural contra infecciones o agentes extraños.Permiten el movimiento celular a través de la miosina y actina (proteínas contráctiles musculares).

▪ Resistencia. El colágeno es la principal proteína integrante de los tejidos de sostén.▪ Las proteínas están mayormente presentes en alimentos de origen animal: carnes, huevos, leche y en

menor proporción en vegetales como la soja, legumbres, cereales y frutos secos.

De la farmacéutica a la biofarmacéuticaLa biotecnología ha impactado el área de la medicina, principalmente con su contribución al conocimiento a nivel molecular de la causa de diversas enfermedades, lo cual ha generado una revolución en la industria farmacéutica con la producción de biofármacos contra enfermedades específicas. Un biofármaco es una molécula biológica con fines terapéuticos obtenida a partir de un organismo vivo, ya sea a partir de bacterias, hongos, células animales, levaduras, entre otros. Estas moléculas presentan mayor acción terapéutica y menos reacciones secundarias, al ser prácticamente homólogas a las producidas por el organismo. Esto se traduce en que el paciente en la actualidad puede acceder a tratamientos más eficaces y seguros. La gran mayoría de estos biofármacos son proteínas recombinantes. La obtención de proteínas recombinantes se logra mediante la inserción del gen que expresa la proteína de interés en un organismo diferente.

La expresión de estas proteínas se ha convertido en una herramienta muy popular, ya que es posible obtener altas cantidades de proteína con bajos costos de producción y altas purezas de una o varias proteínas de interés. que expresa la proteína de interés en un organismo diferente. La expresión de estas proteínas se ha convertido en una herramienta muy popular, ya que es posible obtener altas cantidades de proteína con bajos costos de producción y altas purezas de una o varias proteínas de interés.

Un claro ejemplo de esto es el interferón beta 1a y 1b, el cual ha elevado la calidad de vida de los pacientes diagnosticados con esclerosis múltiple.La importancia de las proteínas terapéuticas recombinantes se ha incrementado exponencialmente en los últimos 30 años.

Esquema de Producción de biofármacos

La fase inicial “upstream” (cuesta arriba) de producción de biofármacos consiste en el diseño del sistema de expresión que implica la elaboración mediante ingeniería genética, del vector de clonación del gen que codifica la proteína de interés en la célula hospedera adecuada. La segunda fase “downstream” (cuesta abajo) se enfoca al proceso de purificación, evaluación del control de calidad y validación de dicho producto. En términos generales, la producción de proteínas recombinantes sigue el siguiente esquema: 1) tratamiento con enzimas de restricción de un vector de clonación y del ADN que contiene el gen que

codifica la proteína de interés, 2) ligamiento del gen con el vector para obtener el ADN recombinante (ADNr), 3) internalización y replicación (clonación) del ADNr en una célula hospedera y 4) expresión del gen en la proteína 2 . Los vectores más conocidos son plásmidos bacterianos que se caracterizan por replicarse en forma independiente al cromosoma de la bacteria. Los vectores son moléculas de ADN bicatenario que actúan como vehículos de clonación cuya función es acarrear y expresar el gen en la célula hospedera. Los virus también son empleados como vectores de clonación ya que se aprovecha su capacidad de introducir y replicar su genoma en la célula 3 . El diseño del vector basado en técnicas de ingeniería genética y la elección de la célula hospedera determinan en gran parte, las características de la proteína recombinante, las estrategias de su purificación, rendimiento y el costo de su producción

Sistemas de expresión*a).Bacterias Para la expresión de proteínas no glicosiladas recombinantes suele emplearse a la E. coli como célula hospedera. A escala industrial, el cultivo de E. coli para la producción de proteínas recombinantes suele llevarse a cabo en medios químicamante definidos 8 . Los medios sintéticos facilitan el aislamiento y purificación del producto y reducen el costo de su producción. En términos generales, los vectores de clonación para E. coli contienen: el gen que codifica la proteína de interés, un origen de replicación que determina el número de copias del vector, un marcador de selección que puede ser un gen de resistencia a antibióticos (como ampicilina, kanamicina y tetraciclina), un promotor que regula la transcripción del gen insertado (inserto) y un gen de terminación de transcripción A nivel laboratorio, la ampicilina es el marcador frecuentemente empleado en la selección de bacterias recombinantes, sin embargo, a escala industrial, la ampicilina no es el antibiótico de elección en la producción de bioterapéuticos para uso humano debido a su probable efecto alergénico. Otra estrategia de obtención de proteínas recombinantes en E. coli incluye su producción intracitoplásmica. Este método no requiere que la proteína sea solubilizada ni renaturalizada para un correcto replegamiento (refolding),. Otro sistema de expresión en E. coli incluye la producción de proteínas recombinantes insolubles en forma de cuerpos de inclusión citoplásmica12. Este sistema tiene como ventaja un alto rendimiento del producto sin embargo se precisan métodos costosos para replegar el producto 8 y para eliminar las proteínas y ADN de la célula hospedera12 por ello, su aplicación a escala industrial resulta económicamente desventajosa. Algunos productos biofarmacéuticos recombinantes aprobados para su aplicación y producidos en E. coli incluyen: insulina (hormona), Ecokinase (anticoagulante), citocinas como interferon alfa 2b (IFN-α−2b), IFN-β-1a y al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) entre muchos otros 13 .

b). Levaduras La producción de proteínas recombinantes comerciales se ha basado también, en el cultivo en medios químicamente definidos de levaduras como Pichia pastoris (P. pastoris) y S. cerevisiae 14. Los vehículos de clonación empleados en levaduras suelen acarrear como promotores al gene PGK (3-phosphoglycerate kinase, 3- fosfoglicerato quinasa), ADH1 (alcohol dehydrogenase1, alcohol deshidrogenasa 1), fosfatasa ácida y genes del cluster GAL (galactosa)5,15,16.. En la industria biofarmacéutica, los sistemas de expresión con levaduras son altamente valorados ya que pueden realizarse en medios químicamente definidos y además no se requiere remover endotoxinas bacterianas, ambos aspectos reducen el costo de la producción del producto. Se han logrado obtener cepas recombinantes de S. cerevisiae capaces de llevar a cabo la N-glicosilación (adición de carbohidratos al grupo R del aminoácido asparagina de la proteína) de proteínas heterólogas15. A pesar de la habilidad de las levaduras de glicosilar proteínas, la composición de los azúcares de estas glicoproteínas difiere de la proteína nativa de origen animalLas glicoproteínas provenientes de levaduras pueden tener una vida media baja debido a que al unirse a receptores de manosa expresados en la superficie de macrófagos, son captadas y eliminadas por estas células fagocíticas14. Lo anterior ha limitado la aplicación de levaduras en sistemas de expresión de proteínas heterólogas humanas que no requieren ser glicosiladas. Esta limitante, ha motivado la búsqueda de sistemas alternativos de expresión en levaduras diferentes a S. cerevisiae que han probado ser más eficientes para la producción de glicoproteínas de naturaleza humana como es el caso de la cepa recombinante Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) coagulación VIIa y VIII 7

Un acercamiento a un proceso de producción de proteínas terapéuticas recombinantes*

Imagen http://www.medigraphic.com/pdfs/residente/rr-2009/rr093c.pdf

PerspectivasLa demanda de proteínas recombinantes terapéuticas de consumo humano se ha convertido en una realidad comercial y ha aumentado dramáticamente durante los últimos años, salvando un número incontable de vidas gracias a la casi accesibilidad ilimitada de estas proteínas. Más de 80 proteínas recombinantes están aprobadas para consumo humano y al menos en 2008 se aprobaron 13 más de ellas. Además, existen más de 360 nuevas medicinas en desarrollo (www.phrma.org). Aunque mucho se ha avanzado, la producción de proteínas recombinantes constituye un campo que necesita ser mucho más estudiado, más aún cuando los precios de muchos de estos medicamentos son altos y de difícil acceso en países en vías de desarrollo. Una de las estrategias que se deberá seguir debe estar encaminada a desarrollar nuevos procesos más eficientes y menos costosos de producción de proteínas terapéuticas idénticas a las aprobadas y que normalmente se conocen como biofármacos de segunda entrada (o biogenéricos).

BASES DE DATOS DE SECUENCIAS GENÉTICAS

▪ En los últimos años los avances en la secuenciación de genes han culminado en la elucidación de la secuencia completa del genoma humano, así como de otros organismos. Esta información se ha depositado en bases de datos electrónicas disponibles para la comunidad científica, organizadas en librerías que contienen los genomas completos, por ejemplo, la Librería Mayor de Genomas Microbianos (EMGLib, por sus siglas en inglés, http://pbil.univ-lyon1.fr/ emglib/emglib.html) contiene todos los genomas de bacterias secuenciados a la fecha (Perrière et al., 1999).

▪ Existe un gran número de páginas electrónicas con bases de datos de genes, difieren básicamente en la información proporcionada, ya sea por el tipo de organismo de estudio o por la aplicación y estudios en los que se han enfocado. Una de las bases de datos más utilizada por la comunidad científica es la del Centro Nacional para la Información en Biotecnología (NCBI, por sus siglas en inglés, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Esta base de datos almacena la información referente a secuencias genómicas en el Banco de Genes (GenBank). Además, contiene un índice de artículos científicos y una recopilación de enfermedades genéticas humanas (Perrière et al., 1999).

▪ Otras bases de datos disponibles y de libre acceso son: El banco de datos de proteínas (PDB, por sus siglas en inglés; http://www.pdb.org/pdb/home/home.do), la iniciativa de Estructura de Proteínas del Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos (NHI por sus siglas en inglés, http://www. nigms.nih.gov/Initiatives/PSI/) y la base de datos SPINE del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI, por sus siglas en inglés, http://www.ebi.ac.uk/euprojects/index.html). Estas bases de datos proporcionan la información de los genes que codifican para la proteína de interés.

▪ En algunos casos la información de la región codificante está completa, pero en otros, se pueden encontrar etiquetas de fragmentos expresados (conocidas como EST, por sus siglas en inglés). Estas regiones son de gran utilidad para completar la región codificante de la proteína que se desea estudiar y a partir de allí iniciar con el proceso de producción de PR. Esta propiedad es muy importante, ya que se puede investigar una proteína determinada de un organismo sin que sea necesario conocer su genoma completo, por ejemplo, se puede hacer una búsqueda de secuencias similares conocidas de otros organismos en estas bases de datos y es posible encontrar el gen completo, o bien sólo fragmentos, que mediante el uso de primers degenerados (que son formados a partir de secuencias conservadas en todos los organismos) se pueden obtener los fragmentos restantes del gen mediante la técnica del PCR.

SÍNTESIS DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES ▪ La ARN polimerasa (ARNpol) es una enzima que realiza una de las funciones más

importantes de la célula: la transcripción del ADN. Este es el proceso por el cual se genera una copia de ARN mensajero (ARNm) a partir de un molde de ADN. En eucariontes y procariontes este proceso se lleva a cabo por un sistema complejo de proteínas que conforman la ARNpol, sin embargo, en organismos como los bacteriófagos (p.ej. fago T7), la ARNpol es menos compleja: se compone por una sola subunidad y es capaz de realizar todo el proceso de transcripción, como su homóloga en organismos superiores.

FÁBRICAS BIOLÓGICAS PARA LA PRODUCCION DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

▪ Se han desarrollado una gran variedad de sistemas de expresión, tanto procariontes como eucariontes para la producción de PR. Los organismos más utilizados son: bacterias, levaduras, insectos, plantas y células de mamíferos (Basile y Peticca, 2009). En algunos de ellos se utiliza el microorganismo completo (p.ej. E. coli) y en otros se utilizan células derivadas del organismo (p.ej. cultivos vegetales, células de insecto o de mamífero) o bien, se puede implementar la expresión de proteínas libre de células.

▪ Los sistemas más utilizados para la producción de proteínas recombinantes en EUA y Europa son los microorganismos, con un 55 % (del cual 39 % corresponde a E. coli y un 15 % a levaduras ) y células de mamífero, específicamente células de ovario de hámster (CHO), con un 35 % (Rader, 2008).

▪ La bacteria E. coli, es uno de los sistemas más utilizados para la producción de PR. Esta bacteria tiene la capacidad de crecer rápidamente y con alta densidad en medios de cultivo de bajo costo. Además, en el mercado hay una gran disponibilidad de cepas mutantes, un ejemplo es el sistema BL21 de Invitrogen® que carece de las proteasas lon y ompT, esto repolimerasa T7 y que permite disminuir la sobreexpresión basal, haciendo más estable la expresión de la PR.

Algunos ejemplos de PR producidas en esta bacteria E.coli

▪ son proteínas para usos industriales, como renina, amilasas, proteasas y celulasas, proteínas terapéuticas, como insulina, hormonas de crecimiento e interferones, entre muchas otras (Lesley y Wilson, 2005). Otras bacterias que también han sido utilizadas como modelo para la producción de PR son: Lactococcus lactis y Bacillus subtilis, pero en menor grado (Morello et al., 2008; Nijland y Kuipers, 2008).

▪ Otro de los organismos utilizados para producir PR son las levaduras. Las más usadas son Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae, en las cuales se han expresado cientos de proteínas diferentes (Cregg et al., 2000; Mattanovich et al., 2004; Porro et al., 2005). Generalmente las levaduras, al igual que las líneas celulares de insectos y mamíferos se utilizan para sobreexpresar proteínas que son tóxicas o que no se pueden plegar correctamente en E. coli (Kost et al., 2005; Oker-Blom y Vuento, 2003). Además, estos sistemas pueden realizar modificaciones post-traduccionales, excretar la PR al medio de cultivo y también se obtienen rendimientos mayores al 50 % (Gräslund et al., 2008)

▪ La expresión transitoria del gen (por sus siglas en inglés: TGE) en células de mamífero es una importante tecnología para la generación de PR. La TGE, cumple todos los requisitos en materia de cantidad y calidad de los productos. Para las líneas celulares CHO y HEK293 se han optimizado protocolos que permiten la producción de proteínas con un alto rendimiento (Geisse y Fux, 2009). Por otro lado, en el 2009, Basile y Peticca utilizaron al parásito Leishmania tarentolae como modelo para la expresión de genes heterólogos.

Bibliografía▪ http://www.zonadiet.com/nutricion/proteina.htm▪ Gamboa RA, Trujillo RMA, 2009. Consultado en: http://

www.medigraphic.com/pdfs/residente/rr-2009/rr093c.pdf▪ Drago MES, Sainz TRE, 2006. Consultado en: http://

www.redalyc.org/pdf/579/57937106.pdf▪ Guevara-Hernández E, López-Zavala AA, Jiménez-Gutiérrez LR y Sotelo-

Mundo RR, 2013. Consultado en: http://www.biotecnia.uson.mx/revistas/articulos/24-Articulo%202.pdf