Proteínas de Interés Farmaceutico

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    18-Feb-2016

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proteinas de interes farmaceutico

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<p>Protenas de Inters Farmaceutico.Gentica Molecular El cido desoxiribonucleico (ADN) contiene la informacin necesaria para la sntesis de protenas. El descubrimiento del cdigo gentico abri la posibilidad de obtener pptidos y/o protenas a gran escala a partir de diversos organismos en los cuales no se producen de manera natural. A las protenas obtenidas de esta manera se les conoce como PR. stas se pueden producir en microorganismos como bacterias, hongos, virus y levaduras, as como en lneas celulares cultivables de insectos, plantas y de mamferos (Jonasson et al., 2002; Palomares et al., 2004), sistemas de expresin de protenas sin clulas y tambin en animales y plantas trangnicas (Farrokhi et al., 2009). La sobreexpresin de PR ofrece la ventaja de producir grandes cantidades de la protena de inters con caractersticas similares a la protena natural y de manera relativamente fcil y rpida. Esta tecnologa cuenta con al menos 35 aos y por su aplicacin tanto en la industria farmacutica y alimentaria, como en la investigacin cientfica, se encuentra entre los desarrollos ms importantes del siglo XX (Porro et al., 2005). Conceptos GeneralesProteina: Molculas formadas por cadenas lineales deaminocidos. Son macromolculas compuestas por carbono, hidrgeno, oxgeno y nitrgeno. La mayora tambin contienen azufre y fsforo. Las mismas estn formadas por la unin de varios aminocidos, unidos mediante enlaces peptdicos. El orden y disposicin de losaminocidosen una protena depende del cdigo gentico, ADN, de la persona.Las protenas constituyen alrededor del 50% del peso seco de los tejidos y no existe proceso biolgico alguno que no dependa de la participacin de este tipo de sustancias.Biofrmaco:Son producidos por organismos genticamente modificados (genetically modified organisms GMOs). A diferencia de las protenas de origen natural, las protenas recombinantes pueden ser producidas en grandes cantidades lo que ha permitido cubrir la creciente demanda actual. En contraste con las protenas no humanas obtenidas de animales como por ejemplo la insulina de cerdo, las protenas recombinantes son idnticas o difieren ligeramente respecto a las protenas nativas de origen humano, por lo que las reacciones inmunolgicas adversas disminuyen significativamenteVector:Unvector gnicoes un agente que transfiere informacingentica, por algn medio, de un organismo a otro. Son utilizados enbiotecnologaunVector de clonacinpara portar elADN recombinantedesde una clula donadora hasta la clula receptora en los que se inserta el gen que se quiere transferir. A continuacin se infecta la clula hospedadora con ese vector recombinante, obtenindose laclula transgnica.Un vector con el que los cientficos experimentan son losplsmidos, con los que es posible insertar genes forneos al ncleo de una clula. Otros vectores gnicos son los bacterifagosycsmidos. Tambin se puede considerar vectores genticos a losvirus, puesto que en el curso de su ciclo insertan informacin gentica en las clulas que invaden.</p> <p>3Procedimiento para producir una PR consiste en introducir el ADN que codifica para la protena de inters en un vector de sobreexpresin (plsmidos, virus, csmidos). El vector contiene un origen de replicacin que le permite copiarse dentro de la clula hospedera, una regin promotora que permite la produccin de la protena de inters, un sitio de clonacin mltiple (SCM), que es una regin que contiene diversos sitios de restriccin que permiten la insercin de ADN entre ellos y en algunos casos, genes de resistencia a antibiticos y genes reporteros, que facilitan la seleccin de las colonias de bacterias que tendran el vector con la informacin gentica insertada. Por ejemplo, para crear un plsmido recombinante, se lleva a cabo un procedimiento de ligacin que permite insertar dentro del SCM del vector, un segmento de ADN que corresponde al marco de lectura funcional, que contiene la informacin para la generacin de la protena de inters. Al producto de este vector, ms el fragmento de ADN codificante (inserto), se denomina construccin. El siguiente paso es la transformacin, sta se realiza al insertar la construccin dentro de la clula hospedera y sta se convierte en una fbrica celular de la protena de inters (Palomares et al., 2004). La bacteria Escherichia coli es uno de los sistemas de sobreexpresin ms utilizados para la produccin de PR. Funciones de las protenas</p> <p>Las funciones principales de las protenas en el organismo son: Ser esenciales para el crecimiento.Las grasasy carbohidratos no las pueden sustituir, por no contener nitrgeno.Proporcionan losaminocidos esenciales fundamentales para la sntesis tisular.Son materia prima para la formacin de los jugos digestivos, hormonas, protenas plasmticas, hemoglobina,vitaminasy enzimas.Funcionan como amortiguadores, ayudando a mantener la reaccin de diversos medios como el plasma.Energticamente, las protenas aportan al organismo 4 Kcal de energa por cada gramo que se ingiere.Actan como catalizadores biolgicos acelerando la velocidad de las reacciones qumicas del metabolismo. Son las enzimas.Actan como transporte de gases como oxgeno y dixido de carbono en sangre. (hemoglobina).Actan como defensa, los anticuerpos son protenas de defensa natural contra infecciones o agentes extraos.Permiten el movimiento celular a travs de la miosina y actina (protenas contrctiles musculares).Resistencia. El colgeno es la principal protena integrante de los tejidos de sostn.Las protenas estn mayormente presentes en alimentos de origen animal: carnes, huevos, leche y en menor proporcin en vegetales como la soja, legumbres, cereales y frutos secos.De la farmacutica a la biofarmacuticaLa biotecnologa ha impactado el rea de la medicina, principalmente con su contribucin al conocimiento a nivel molecular de la causa de diversas enfermedades, lo cual ha generado una revolucin en la industria farmacutica con la produccin de biofrmacos contra enfermedades especficas. Un biofrmaco es una molcula biolgica con fines teraputicos obtenida a partir de un organismo vivo, ya sea a partir de bacterias, hongos, clulas animales, levaduras, entre otros. Estas molculas presentan mayor accin teraputica y menos reacciones secundarias, al ser prcticamente homlogas a las producidas por el organismo. Esto se traduce en que el paciente en la actualidad puede acceder a tratamientos ms eficaces y seguros. La gran mayora de estos biofrmacos son protenas recombinantes. La obtencin de protenas recombinantes se logra mediante la insercin del gen que expresa la protena de inters en un organismo diferente. La expresin de estas protenas se ha convertido en una herramienta muy popular, ya que es posible obtener altas cantidades de protena con bajos costos de produccin y altas purezas de una o varias protenas de inters. que expresa la protena de inters en un organismo diferente. La expresin de estas protenas se ha convertido en una herramienta muy popular, ya que es posible obtener altas cantidades de protena con bajos costos de produccin y altas purezas de una o varias protenas de inters.Un claro ejemplo de esto es el interfern beta 1a y 1b, el cual ha elevado la calidad de vida de los pacientes diagnosticados con esclerosis mltiple.La importancia de las protenas teraputicas recombinantes se ha incrementado exponencialmente en los ltimos 30 aos. Esquema de Produccin de biofrmacosLa fase inicial upstream (cuesta arriba) de produccin de biofrmacos consiste en el diseo del sistema de expresin que implica la elaboracin mediante ingeniera gentica, del vector de clonacin del gen que codifica la protena de inters en la clula hospedera adecuada. La segunda fase downstream (cuesta abajo) se enfoca al proceso de purificacin, evaluacin del control de calidad y validacin de dicho producto. En trminos generales, la produccin de protenas recombinantes sigue el siguiente esquema: tratamiento con enzimas de restriccin de un vector de clonacin y del ADN que contiene el gen que codifica la protena de inters, ligamiento del gen con el vector para obtener el ADN recombinante (ADNr), internalizacin y replicacin (clonacin) del ADNr en una clula hospedera y expresin del gen en la protena 2 . Los vectores ms conocidos son plsmidos bacterianos que se caracterizan por replicarse en forma independiente al cromosoma de la bacteria. Los vectores son molculas de ADN bicatenario que actan como vehculos de clonacin cuya funcin es acarrear y expresar el gen en la clula hospedera. Los virus tambin son empleados como vectores de clonacin ya que se aprovecha su capacidad de introducir y replicar su genoma en la clula 3 . El diseo del vector basado en tcnicas de ingeniera gentica y la eleccin de la clula hospedera determinan en gran parte, las caractersticas de la protena recombinante, las estrategias de su purificacin, rendimiento y el costo de su produccinSistemas de expresin*a).Bacterias Para la expresin de protenas no glicosiladas recombinantes suele emplearse a la E. coli como clula hospedera. A escala industrial, el cultivo de E. coli para la produccin de protenas recombinantes suele llevarse a cabo en medios qumicamante definidos 8 . Los medios sintticos facilitan el aislamiento y purificacin del producto y reducen el costo de su produccin. En trminos generales, los vectores de clonacin para E. coli contienen: el gen que codifica la protena de inters, un origen de replicacin que determina el nmero de copias del vector, un marcador de seleccin que puede ser un gen de resistencia a antibiticos (como ampicilina, kanamicina y tetraciclina), un promotor que regula la transcripcin del gen insertado (inserto) y un gen de terminacin de transcripcin A nivel laboratorio, la ampicilina es el marcador frecuentemente empleado en la seleccin de bacterias recombinantes, sin embargo, a escala industrial, la ampicilina no es el antibitico de eleccin en la produccin de bioteraputicos para uso humano debido a su probable efecto alergnico. Otra estrategia de obtencin de protenas recombinantes en E. coli incluye su produccin intracitoplsmica. Este mtodo no requiere que la protena sea solubilizada ni renaturalizada para un correcto replegamiento (refolding),. Otro sistema de expresin en E. coli incluye la produccin de protenas recombinantes insolubles en forma de cuerpos de inclusin citoplsmica12. Este sistema tiene como ventaja un alto rendimiento del producto sin embargo se precisan mtodos costosos para replegar el producto 8 y para eliminar las protenas y ADN de la clula hospedera12 por ello, su aplicacin a escala industrial resulta econmicamente desventajosa. Algunos productos biofarmacuticos recombinantes aprobados para su aplicacin y producidos en E. coli incluyen: insulina (hormona), Ecokinase (anticoagulante), citocinas como interferon alfa 2b (IFN-2b), IFN--1a y al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-) entre muchos otros 13 .</p> <p> b). Levaduras La produccin de protenas recombinantes comerciales se ha basado tambin, en el cultivo en medios qumicamente definidos de levaduras como Pichia pastoris (P. pastoris) y S. cerevisiae 14. Los vehculos de clonacin empleados en levaduras suelen acarrear como promotores al gene PGK (3-phosphoglycerate kinase, 3- fosfoglicerato quinasa), ADH1 (alcohol dehydrogenase1, alcohol deshidrogenasa 1), fosfatasa cida y genes del cluster GAL (galactosa)5,15,16.. En la industria biofarmacutica, los sistemas de expresin con levaduras son altamente valorados ya que pueden realizarse en medios qumicamente definidos y adems no se requiere remover endotoxinas bacterianas, ambos aspectos reducen el costo de la produccin del producto. Se han logrado obtener cepas recombinantes de S. cerevisiae capaces de llevar a cabo la N-glicosilacin (adicin de carbohidratos al grupo R del aminocido asparagina de la protena) de protenas heterlogas15. A pesar de la habilidad de las levaduras de glicosilar protenas, la composicin de los azcares de estas glicoprotenas difiere de la protena nativa de origen animalLas glicoprotenas provenientes de levaduras pueden tener una vida media baja debido a que al unirse a receptores de manosa expresados en la superficie de macrfagos, son captadas y eliminadas por estas clulas fagocticas14. Lo anterior ha limitado la aplicacin de levaduras en sistemas de expresin de protenas heterlogas humanas que no requieren ser glicosiladas. Esta limitante, ha motivado la bsqueda de sistemas alternativos de expresin en levaduras diferentes a S. cerevisiae que han probado ser ms eficientes para la produccin de glicoprotenas de naturaleza humana como es el caso de la cepa recombinante Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) coagulacin VIIa y VIII 7</p> <p>Un acercamiento a un proceso de produccin de protenas teraputicas recombinantes*</p> <p>Imagen http://www.medigraphic.com/pdfs/residente/rr-2009/rr093c.pdfPerspectivasLa demanda de protenas recombinantes teraputicas de consumo humano se ha convertido en una realidad comercial y ha aumentado dramticamente durante los ltimos aos, salvando un nmero incontable de vidas gracias a la casi accesibilidad ilimitada de estas protenas. Ms de 80 protenas recombinantes estn aprobadas para consumo humano y al menos en 2008 se aprobaron 13 ms de ellas. Adems, existen ms de 360 nuevas medicinas en desarrollo (www.phrma.org). Aunque mucho se ha avanzado, la produccin de protenas recombinantes constituye un campo que necesita ser mucho ms estudiado, ms an cuando los precios de muchos de estos medicamentos son altos y de difcil acceso en pases en vas de desarrollo. Una de las estrategias que se deber seguir debe estar encaminada a desarrollar nuevos procesos ms eficientes y menos costosos de produccin de protenas teraputicas idnticas a las aprobadas y que normalmente se conocen como biofrmacos de segunda entrada (o biogenricos).BASES DE DATOS DE SECUENCIAS GENTICAS </p> <p>En los ltimos aos los avances en la secuenciacin de genes han culminado en la elucidacin de la secuencia completa del genoma humano, as como de otros organismos. Esta informacin se ha depositado en bases de datos electrnicas disponibles para la comunidad cientfica, organizadas en libreras que contienen los genomas completos, por ejemplo, la Librera Mayor de Genomas Microbianos (EMGLib, por sus siglas en ingls, http://pbil.univ-lyon1.fr/ emglib/emglib.html) contiene todos los genomas de bacterias secuenciados a la fecha (Perrire et al., 1999). Existe un gran nmero de pginas electrnicas con bases de datos de genes, difieren bsicamente en la informacin proporcionada, ya sea por el tipo de organismo de estudio o por la aplicacin y estudios en los que se han enfocado. Una de las bases de datos ms utilizada por la comunidad cientfica es la del Centro Nacional para la Informacin en Biotecnologa (NCBI, por sus siglas en ingls, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Esta base de datos almacena la informacin referente a secuencias genmicas en el Banco de Genes (GenBank). Adems, contiene un ndice de artculos cientficos y una recopilacin de enfermedades genticas humanas (Perrire et al., 1999)....</p>