7/29/2019 PROPIONAT CO2

1/5

CHEMISTR Y : CARSON A ND R UBEN4 R u b e n , H a s s i d a n d K a m e n , J o u r . Am . C h e m . S o c . , 6 1 , 6 6 1 ( 1 9 3 9 ) .' R u b e n , K a m e n , H a s s i d a n d D e V a u l t , S c i e n c e , 9 0 , 5 7 0 ( 1 9 3 9 ) .s A d d i t i o n a l e v i d e n c e t o b e p u b l i s h e d s h o r t l y .7 M c A l i s t e r , J o u r . G e n . P h y s i o l . , 2 2 , 6 1 3 ( 1 9 3 9 ) .8 E m e r s o n a n d L e w i s , Am . J o u r . B o t a n y , 2 6 , 8 0 8 ( 1 9 3 9 ) .9 C f . v a n N i e l , A n n . R e v . B i o c h e m . , 6 , 6 0 6 ( 1 9 3 7 ) ; G a f f r o n , I b i d . , 7 , 9 8 6 ( 1 9 3 9 ) .

C2 A SSIMILA TION BY PROPIONIC ACID BACTERIA STUDIEDBY THE USE OF RADIOACTIVE CARBONBy S . F . C A R S O N AND S . RUBEN

HOPKINS MARINE STATION OF STANFORD U N I V E R S I T Y , P A C I F I C GROVE, C A L I F O R N I A ,AND THE DEPARTMENT OF CHEMISTRY OF THE U N I V E R S I T Y OF C A L I F O R N I A

C o m m u n i c a t e d May 1 5 , 1 9 4 0Th e s t u d i e s o f Wood a n d Werkman1 2 , 3 a s w e l l a s t h e w o r k o f P h e l p s ,

J o h n s o n a n d P e t e r s o n 4 h a v e s h o w n t h a t p r o p i o n i c a c i d b a c t e r i a c a n u t i l i z eC O 2 d u r i n g t h e f e r m e n t a t i o n o f g l y c e r o l . I n t h e a b s e n c e o f C O 2 t h i s f e r -m e n t a t i o n c a n b e a d e q u a t e l y r e p r e s e n t e d b y t h e e q u a t i o n : 5CH20H CH3

- ICHOH = CH2 + H20CH20H COOH

I n t h e p r e s e n c e o f C O 2 t h e f o r m a t i o n o f p r o p i o n i c a c i d i s a c c o m p a n i e d b yt h e a p p e a r a n c e o f s u c c i n i c a c i d i n a m o u n t s c l o s e l y e q u i m o l a r w i t h t h eq u a n t i t y o f a b s o r b e d C O 2 .T h i s made i t s e e m p o s s i b l e t h a t C O 2 b e c o m e s c o n v e r t e d i n t o s u c c i n i c a c i db y c o m b i n a t i o n w i t h a 3 - c a r b o n c o m p o u n d . Th e f o r m a t i o n o f s u c c i n i ca c i d d u r i n g t h e f e r m e n t a t i o n o f p y r u v a t e , d e x t r o s e a n d g a l a c t o s e b y E s c h e r .c o l i , p a r t i c u l a r l y i t s d e p e n d e n c e u p o n t h e C O 2 p a r t i a l p r e s s u r e , 6 s u p p o r t st h i s v i e w .I t i s a p p a r e n t t h a t i m p o r t a n t i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e m e c h a n i s mt h r o u g h w h i c h C O 2 i s u t i l i z e d c a n b e o b t a i n e d b y t h e u s e o f r a d i o a c t i v eC O 2 . 7 We h a v e e m p l o y e d t h i s a p p r o a c h i n a s t u d y o f t h e f e r m e n t a t i o n o fg l y c e r o l b y P r o p i o n i b a c t e r i u m p e n t o s a c e u m .Th e b a c t e r i a w e r e g r o w n a n a e r o b i c a l l y i n y e a s t e x t r a c t - g l y c e r o l m e d i ai n t h e p r e s e n c e o f C O 2 f o r 3 t o 6 d a y s . F o r t h e e x p e r i m e n t s c e l l s f r o m 2 5 0t o 5 0 0 m l . o f s u c h c u l t u r e s w e r e c e n t r i f u g e d , w a s h e d a n d s u s p e n d e d i n 0 . 5p e r c e n t p h o s p h a t e b u f f e r a t pH 7 . 0 w i t h a n d w i t h o u t a d d e d s u b s t r a t e s .Th e s u s p e n s i o n s w e r e s h a k e n a t 3 0 C . i n t h e p r e s e n c e o f N 2 a n d C * 0 2 8 f o r

4 2 2 P R O C . N . A . S .

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2/5

CHEMISTRY: CARSON AND RUBEN3 0 t o 4 0 m i n u t e s . A f t e r c e n t r i f u g i n g o f f t h e c e l l s , p r o p i o n i c a c i d a n d s u c -c i n i c a c i d w e r e a d d e d t o t h e s u p e r n a t a n t l i q u i d t o p r o v i d e c a r r i e r s f o r t h es m a l l q u a n t i t i e s o f r a d i o a c t i v e m e t a b o l i c p r o d u c t s . Th e v o l a t i l e a n d n o n -v o l a t i l e a c i d s w e r e s e p a r a t e d by e x h a u s t i v e s t e a m d i s t i l l a t i o n ; t h e c e l l sw e r e b o i l e d g e n t l y w i t h a c i d f o r a f e w m i n u t e s a n d s e p a r a t e d f r o m t h e a c i de x t r a c t b y c e n t r i f u g a t i o n . S p e c i a l c a r e w a s t a k e n t o r e m o v e a l l t r a c e s o fd i s s o l v e d C * 0 2 b e f o r e r a d i o a c t i v i t y m e a s u r e m e n t s w e r e m a d e . Th e r e -s u l t s o f a n e x p e r i m e n t c a r r i e d o u t i n t h e p r e s e n c e o f 2 p e r c e n t g l y c e r o l a r es u m m a r i z e d i n t a b l e 1 .

TABLE 1B A C T E R I A + 2 PER CENT G L Y C E R O L + C * O 2 FOR 4 0 MINUTESPER CBNT OP

TOTAL C* ASSIMILATEDaV o l a t i l e a c i d s 7 2 . 0N o n - v o l a t i l e a c i d s 1 0 . 0B o i l e d c e l l e x t r a c t 1 7 . 5C e l l s a f t e r e x t r a c t i o n 0 . 5

A l l m e a s u r e m e n t s a r e c o r r e c t e d f o r d e c a y a n d a r e t h er e f o r e c o m p a r a b l e .

T h e a b o v e t a b l e s h o w s t h a t 7 2 p e r c e n t o f t h e C * 0 2 t a k e n u p b y t h e c e l l sc a n b e r e c o v e r e d i n t h e v o l a t i l e a c i d f r a c t i o n a n d o n l y 1 0 p e r c e n t i n t h en o n - v o l a t i l e a c i d f r a c t i o n . Th e b o i l e d c e l l e x t r a c t c o n s i s t e d m a i n l y o fa c i d s c a r r i e d down w i t h t h e c e l l s .Th e a c t i v i t y i n t h e v o l a t i l e f r a c t i o n w a s f o u n d t o b e r e s t r i c t e d t o p r o p i -

o n i c a c i d b y a D u c l a u x d i s t i l l a t i o n . Th e C* c o n t e n t o f s u c c e s s i v e d i s t i l -l a t e s i s c o m p a r e d i n t a b l e 2 w i t h t h e t i t r a t i o n v a l u e s o b t a i n e d w i t h p u r ep r o p i o n i c a c i d d i s t i l l e d u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s .TABLE 2

PER CBNTP ER CENT PER CENT ACIDITY BY TITRATIONVOLUMB OF DISTILLATE RADIOACTIVITY FOUND FOR PURB PROPIONIC ACID

2 0 . 0 2 3 . 0 2 4 . 54 0 . 0 4 5 . 0 4 6 . 76 0 . 0 6 5 . 0 * 6 7 . 08 0 . 0 8 4 . 0 8 5 . 1

1 0 0 . 0 1 0 0 . 0 1 0 0 . 0

Th e a g r e e m e n t b e t w e e n t h e r a d i o a c t i v i t y a n d t i t r a t i o n m e a s u r e m e n t s i sr e m a r k a b l y g o o d . T h i s r e s u l t e x c l u d e s t h e p r e s e n c e o f more t h a n 5 % o o fC* i n o t h e r f a t t y a c i d s ( f o r m i c , a c e t i c , e t c . ) .Th e r a d i o a c t i v e c o m p o n e n t o f t h e n o n - v o l a t i l e a c i d f r a c t i o n was i d e n t i -f i e d a s s u c c i n i c a c i d i n two w a y s . Th e d i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n t s o f t h e non-

V O L . 2 6 , 1 9 4 0 4 2 3

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CHEMISTRY: CARSONAND RUBENv o l a t i l e m a t e r i a l b e t w e e n w a t e r a n d e t h y l e t h e r by t i t r a t i o n a n d r a d i o -a c t i v i t y m e a s u r e m e n t s a r e c o m p a r e d i n t a b l e 3 .

TABLE 3D I S T R I B U r I O N C O E F F I C I E N T S( 1 0 M I . A q u e o u s P h a s e + 9 0 M l . E t h e r )

TITRATION RADIOACTIVITYK 7 . 4 6 . 0

I n a d d i t i o n , t h e n o n - v o l a t i l e m a t e r i a l w a s s u b l i m e d a n d t h e s p e c i f i c a c -t i v i t y ( . . ) o f t h e v a r i o u s f r a c t i o n s i s s h o w n i n t a b l e 4 .\ s u c c i n i c a c i d

TABLE 4S U B L I M A T I O N SPBCIFIC ACTIVITY(RADIOACTIVITY

FRACTION \SUCCNIC A C I D )1 ( 2 1 0 - 2 2 0 0 C . ) 9 . 52 ( 2 2 0 - 2 4 0 C . ) 9 . 9

No r a d i o a c t i v e m a t e r i a l came o f f b e l o w 2 1 0 C . I t s e e m s q u i t e r e a s o n -a b l e t o c o n c l u d e t h a t t h e r a d i o a c t i v i t y i s m a i n l y d u e t o s u c c i n i c a c i d .Th e r e m a r k a b l e r e s u l t t h a t s o much o f t h e r a d i o a c t i v e c a r b o n i s f o u n di n p r o p i o n i c a c i d m i g h t b e e x p l a i n e d b y a s s u m i n g a r e v e r s i b l e r e a c t i o nCH8CH2COOH + C O 2 a COOHCH2CH2COOH. E x p e r i m e n t s w e r e p e r -f o r m e d t o t e s t t h i s h y p o t h e s i s b y t h e a d d i t i o n o f p r o p i o n i c a c i d a n d s u c c i n i ca c i d s t o c e l l s u s p e n s i o n s i n t h e p r e s e n c e o f C * O 2 . I n o r d e r t o r e d u c e t h ea m o u n t o f g l y c e r o l a n d r e s e r v e p r o d u c t s i n t h e c e l l m a t e r i a l , t h e b a c t e r i aw e r e c e n t r i f u g e d f r o m t h e m e d i u m i n w h i c h t h e y w e r e g r o w n , a n d s u s -p e n d e d i n p h o s p h a t e b u f f e r f o r 3 h o u r s ; t h i s p r o c e d u r e w a s t h e n r e p e a t e d ,a n d i m m e d i a t e l y b e f o r e e x p o s u r e t o C * 0 2 t h e y w e r e a g a i n w a s h e d . T h er e s u l t s o f t h i s e x p e r i m e n t a r e s h o w n i n t a b l e 5 .

TABLE 5C E L L S U S P E N S I O N I N PHOSPHATE BUFFER EXPOSED TO C*Os FOR 3 0 MINUTES

RADIOACTIVITY OFTOTAL C* ASsILATBD V O L A T I L B ACIDSUBSTRATE (ARBITRARY UNITS) NON-VOL. ACID

N o t h i n g 5 . 3 0 . 70 . 4 p e r c e n t Na p r o p i o n a t e 4 . 8 0 . 7 80 . 2 p e r c e n t Na s u c c i n a t e 4 . 5 0 . 22 . O p e r c e n t g l y c e r o l 1 0 0 . 0 3 . 1

I n a f u r t h e r e x p e r i m e n t t h e c e l l s w e r e s u s p e n d e d i n p h o s p h a t e b u f f e r f o r7 h o u r s a n d t h e n c e n t r i f u g e d a n d w a s h e d a s a b o v e . Th e r e s u l t s a r e sum-m a r i z e d i n t a b l e 6 .

4 2 4 PROC N . A . S .

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VL2610 CHEMISTRYY: CARSON AND RUBENTABLE 6

C E L L S U S P E N S I O N IN PHOSPHATE BUFFER EXPOSED TO C * O 2 FOR 30 MINUTESRADIOACTIVITY OF

TOTAL C * A S S I M A T B D V O L A T I L B A C I DS U B S T R A T E ( A t B I T R A R Y U N I T S ) NON-VOL. A C I DN o t h i n g 2 . 3 0 . 4 12 p e r c e n t g l y c e r o l 1 0 0 . 0 3 . 0 , 3 . 82 p e r c e n t g l y c e r o l + 0 . 4

p e r c e n t Na p r o p i o n a t e 8 5 . 0 2 . 4T h e a d d i t i o n o f p r o p i o n i c a c i d i n t h e a b s e n c e o f g l y c e r o l h a s l i t t l e i f a n ye f f e c t o n t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e C* b e t w e e n t h e p r o p i o n i c a n d s u c c i n i c

a c i d s o r o n t h e t o t a l C* t a k e n u p . T h i s i s e v i d e n c e a g a i n s t t h e f o r m a t i o no f s u c c i n i c a c i d f r o m C O 2 a n d p r o p i o n i c a c i d . Th e p r e s e n c e o f g l y c e r o l n o to n l y h a s a n e n o r m o u s e f f e c t o n t h e C * 0 2 u p t a k e , b u t a l s o i n c r e a s e s t h er a t i o o f r a d i o a c t i v e c a r b o n i n p r o p i o n i c a c i d a n d s u c c i n i c a c i d . I t s e e m sq u i t e l i k e l y i n v i e w o f t h e s e r e s u l t s t h a t p r o p i o n i c a n d s u c c i n i c a c i d s a r ef o r m e d v i a r e a c t i o n s b e t w e e n C O 2 a n d g l y c e r o l o r i n t e r m e d i a t e p r o d u c t sa r i s i n g d u r i n g i t s f e r m e n t a t i o n . P y r u v i c a c i d , w h i c h c o u l d b e a p o s s i b l ei n t e r m e d i a t e , w a s f o u n d t o b e i n a c t i v e ( < 0 . 5 % ) .T h e d a t a s o f a r p r e s e n t e d c o u l d f i n d a n e x p l a n a t i o n o n t h e b a s i s o f am e c h a n i s m s u c h a s :

g l y c e r o l>-- a c i d l p r o p i o n i c a c i d( i n t e r m e d i a t ep r o d u c t )1 1 + C o 2C 4 - d i b a s i c a c i d z s u c c i n i c a c i d

I n t h i s c a s e o n e w o u l d e x p e c t t h e r a d i o a c t i v e c a r b o n atom t o b e l o c a t e di n t h e c a r b o x y l g r o u p s . F u r t h e r e x p e r i m e n t s a r e i n p r o g r e s s t o t e s t t h i sh y p o t h e s i s .T h e r e s u l t s o f t h e a b o v e e x p e r i m e n t s a r e o f g e n e r a l i n t e r e s t a l s o i n c o n -n e c t i o n w i t h a m a j o r p r o b l e m e n c o u n t e r e d i n t r a c e r e x p e r i m e n t s w i t hl a b e l e d c a r b o n , n a m e l y , t h e s y n t h e s i s o f r a d i o a c t i v e m o l e c u l e s s t a r t i n g w i t hC * O 2 . I n many c a s e s s y n t h e t i c o r g a n i c m e t h o d s r e s u l t i n p o o r y i e l d sd e s p i t e t i m e - c o n s u m i n g a n d p a i n s t a k i n g e f f o r t . I n s u c h i n s t a n c e s t h e u s eo f a p p r o p r i a t e m i c r o 6 r g a n i s m s t o p e r f o r m t h e d e s i r e d s y n t h e s i s m ay b eh i g h l y d e s i r a b l e . We m ay c i t e t h e a b o v e e x p e r i m e n t s a s an e x a m p l e . I n3 0 m i n u t e s t h e b a c t e r i a c o n v e r t e d o v e r 8 0 p e r c e n t o f t h e a s s i m i l a t e d C * 0 2i n t o p r o p i o n i c a n d s u c c i n i c a c i d s , w h i c h a r e t h u s made r e a d i l y a v a i l a b l e f o rt r a c e r e x p e r i m e n t s .I t i s a p l e a s u r e t o t h a n k D r . M. D . Kam en a n d P r o f e s s o r E . 0 . L a w r e n c e

V O L . 2 6 , 1 9 4 0 4 2 5

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CHEMISTR Y : H . A . BARKER, ET A L .o f t h e R a d i a t i o n L a b o r a t o r y f o r t h e i r i n t e r e s t , a n d f o r m a k i n g t h e r a d i o -a c t i v e c a r b o n a v a i l a b l e . We a r e i n d e b t e d t o P r o f e s s o r C . B . v a n N i e la n d P r o f e s s o r H . A . B a r k e r f o r m uch a d v i c e a n d a s s i s t a n c e .1 B i o c h e m . J o u r . , 3 0 , 4 8 ( 1 9 3 6 ) .2 I b i d . , 3 2 , 1 2 6 2 ( 1 9 3 8 ) .3 I b i d . , 3 4 , 7 ( 1 9 4 0 ) .

4 B i o c h e m . J . , 3 3 , 7 2 6 ( 1 9 3 9 ) .6 C . B . v a n N i e l , T h e P r o p i o n i c A c i d B a c t e r i a , H a a r l e m ( 1 9 2 8 ) .6 E l s d e n , B i o c h e m . J o u r . , 3 2 , 1 8 7 ( 1 9 3 8 ) .7 R u b e n , H a s s i d a n d Kamen, J o u r . Am . C h e m . S o c . , 6 1 , 6 6 1 ( 1 9 3 9 ) .8 Th e s y m b o l C * w i l l b e u s e d t o r e p r e s e n t c a r b o n l a b e l e d by t h e r a d i o a c t i v i t y o f s o m eo f i t s a t o m s . Th e i s o t o p e i s C" a n d w a s p r o d u c e d i n t h e B e r k e l e y c y c l o t r o n ; i t h a s ah a l f - l i f e o f 2 1 m i n u t e s .

THE REDUCTION OF RADIOACTIVE CARBON DIOXIDE BYMETHANE-PRODUCING BACTERIABy H . A . B A R K E R , S . RUBEN AND M. D . KAMEN

D I V I S I O N O F PLANT N U r R I T I O N , DEPARTMENT OF C H E m M I S T R Y , RADIATION LABORA-T O R Y , U N I V E R S I I Y O F C A L I F O R N I A

C o m m u n i c a t e d May 1 5 , 1 9 4 0S e v e r a l y e a r s a g o ' i t was s h o w n t h a t t h e f o r m a t i o n o f m e t h a n e i n t h e

f e r m e n t a t i o n o f e t h y l a n d b u t y l a l c o h o l s a n d o f b u t y r i c a c i d b y i m p u r ec u l t u r e s o f m e t h a n e - p r o d u c i n g b a c t e r i a i s a c c o m p a n i e d b y t h e d i s a p p e a r -a n c e o f a n e q u i - m o l e c u l a r q u a n t i t y o f c a r b o n d i o x i d e . I n t h e f e r m e n t a t i o no f e t h y l a l c o h o l , f o r e x a m p l e , t h e r e a c t i o n c a n b e r a t h e r c l o s e l y d e s c r i b e db y t h e e q u a t i o n :

2 C 2 H 5 O H + C 0 2 -2CH3COOH + CH4 ( 1 )Th e s a m e r e a c t i o n h a s r e c e n t l y b e e n s h o w n 2 t o b e c a r r i e d o u t b y p u r e c u l -t u r e s o f M e t h a n o b a c t e r i u m O m e l i a n s k i i .A s t o t h e m e c h a n i s m o f t h e a b o v e r e a c t i o n , i t s e e m e d q u i t e l i k e l y t h a t t h ea c e t i c a c i d a r i s e s b y a n o x i d a t i o n o f e t h y l a l c o h o l , c a r b o n d i o x i d e b e i n gs i m u l t a n e o u s l y r e d u c e d t o m e t h a n e . T h i s w o u l d b e i n a c c o r d a n c e w i t h

t h e v i e w o r i g i n a l l y a d v a n c e d b y P r o f e s s o r C . B . van N i e l t h a t t h e m e t h a n ef e r m e n t a t i o n o f o r g a n i c a s w e l l a s o f i n o r g a n i c c o m p o u n d s i s a p r o c e s s o fo x i d a t i o n b y means o f c a r b o n d i o x i d e w h i c h c a n b e r e p r e s e n t e d b y t h eg e n e r a l e q u a t i o n : 4H2A + C 0 2 -4A + CH4 + 2 H 2 0 ( 2 )w h e r e H2A i s a n o x i d i z a b l e m o l e c u l e a n d A i s i t s o x i d a t i o n p r o d u c t . C o n -c l u s i v e p r o o f i n f a v o r o f t h i s m e c h a n i s m , h o w e v e r , was l a c k i n g . F u r t h e r -m o r e , n o d i r e c t e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e c o u l d b e o b t a i n e d i n s u p p o r t o f t h e

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