1

2

3

Proizvodnja poliklonskih protutijela

-pripravci protutijela utječu i na specifičnost metoda i na njihovu osjetljivost

-specifičnost metode?

-osjetljivost metode?

-izbor vrste za proizvodnu protutijela ovisi i o količini antigena na raspolaganju i o željenoj

količini antiseruma

4

Svojstva imunogena

•različitost od vlastitog

•molekularna masa

•kemijski sastav i heterogenost

•podložnost preradi (procesiranju) i prikazivanju (prezentaciji)

Svojstva biološkog sustava

•genotip imunizirane životinje

•adjuvanti

•doza imunogena i način unošenja (nekoliko imunizacija u razmacima –

hiperimuni serumi (visoka konc. specifičnih protutijela)

• male neimunogenične

molekule (steroidi, lijekovi ..)

se konjugiraju na nosače

5

AFINITETNA KROMATOGRAFIJA

HETEROGENI ANTISERUMI

-razlikuju se od jedne do druge životinje

-sadrže nepoželjna nespecifična i križno-

reagirajuća protutijela

-odstranjivanje protutijela neželjenih

specifičnosti iz poliklonskih preparacija

protutijela je dugotrajno, rezultira velikim

gubitkom željenih protutijela i nije dovoljno

učinkovito u reduciranju heterogenosti

antiseruma

-direktna biokemijska purifikacija

monoklonskih protutijela iz poliklonskog

antiseruma nije moguća !!!

6 POLIKLONSKI ANTISERUM MONOKLONSKA PROTUTIJELA

7

Proizvodnja monoklonskih protutijela tehnikom hibridoma

-1975. Köler i Milstein (Nobelova nagrada 1984.)

-fuzionirali normalne B stanice (plazma stanice) s mieloma stanicama --- hibridne stanice (HIBRIDOMA)

-hibridoma stanice neograničeno se uzgajaju u kulturi stanica i luče protutijela

Kultura stanica

-primarne limfatičke stanice (dobivene izolacijom limfocita iz krvi, limfe ili limfatičkih organa) mogu se

propagirati samo određeno, ograničeno vrijeme

-stanične linije (nastale od tumorskih stanica, ili stanica transformiranih kancerogenima ili virusima) mogu

se propagirati neograničeno u kulturi stanica

• 1. stanična linija dobivena 1940. - mišja L stanica fibroblasta

• 1950.-tih HeLa stanica - humani cervikalni tumor

• do danas je uspostavljeno na stotine staničnih linija

-hibridne stanice (hibridom – klon stanica nastalih proliferacijom fuzioniranih stanica, imortalizirane stanične

linije)

8

Priprema hibridnih staničnih linija (hibridoma)

stanice mijeloma

9

http://highered.mheducation.com/olc/dl/120110/micro43.swf

VIDEO: Monoclonal Antibody Production (McGraw-Hill)

10

Hipoksantin Aminopterin Timidin medij

11

Hipoksantin Aminopterin Timidin medij

12

AMINOPTERIN (antifolatna tvar, inhibitor sinteze purina)

Hipoksantin Aminopterin Timidin medij

13 HGPRT – hipoksantin-guanin fosforibozil transferaza

TK – timidin kinaza

Hipoksantin Aminopterin Timidin medij

Pričuvni put sinteze purina i timidilata

AMINOPTERIN (antifolatna tvar, inhibitor sinteze purina)

14

Hipoksantin Aminopterin Timidin medij

Pričuvni put sinteze purina i timidilata

TK – timidin kinaza HGPRT – hipoksantin-guanin fosforibozil transferaza

AMINOPTERIN (antifolatna tvar, inhibitor sinteze purina)

Mieloma stanice: HGPRT- / TK-

15

Hipoksantin Aminopterin Timidin medij

16

Alternativi pristupi – “zamjena”

PROIZVODNJA MONOKLONSKIH PROTUTIJELA

17

Upotreba monoklonskih protutijela

-identifikacija fenotipskih markera koji su jedinstveni za određene tipove stanica – moderna klasifikacija

limfocita i ostalih leukocita prema vezanju monoklonskih protutijela koja su specifična za određene

populacije stanica (CD markeri – clusters of differentiation)

-imunodijagnostika – dijagnosticiranje sistemskih i infektivnih bolesti

-funkcionalna analiza molekula na površini stanica ili izlučenih iz stanica

-dijagnosticiranje tumora – tumor-specifična monoklonska protutijela u detekciji tumora

-imunoterapija tumora in vivo

-injiciranje pacijentima monoklonska protutijela u dijagnostičke ili terapijske svrhe - PROBLEMI!

KOJI PROBLEMI?

18

Ljudski organizam prepoznaje mišja protutijela kao strana – dolazi do anti-izotipskog odgovora – HAMA

odgovori (human antimouse antibody)

vrlo brzo se odstrane mišja protutijela iz krvotoka čovjeka i time se smanji njihova terapeutska

učinkovitost

cirkulirajući imuni kompleksi mogu uzrokovati alergijske reakcije, pa čak i po život opasne reakcije

(nakupljanje u bubrezima)

HUMANA MONOKLONSKA PROTUTIJELA

• upotreba tehnike hibridoma za proizvodnju humanih monoklonskih protutijela – mnogi tehnički problemi,

veliki izazov

(pokušavaju se razviti ljudske mieloma stanične linije kao fuzijski partneri s karakteristikama imortalnog rasta, osjetljivosti

na HAT selekciju i izostanak proizvodnje vlastitih protutijela; jer ljudske B stanice ne tvore učinkovito hibridome s

mišjim mielomskim staničnim linijama)

• alternativne metode stvaranja protutijela – pomoću rekombinantne tehnologije DNA - TEHNIKE

GENETIČKOG INŽENJERSTVA

19

KIMERNO MIŠJE-

LJUDSKO

PROTUTIJELO

-mišje varijabilne

domene

-ljudske

konstantne

domene

HUMANIZIRANO

PROTUTIJELO

-mišje CDR-ove

-ostatak molekule

je ljudski

-uvelike smanjio

problem anti-

izotipskog

odgovora (HAMA

odgovora)

20

21 http://www.kyowa-kirin.co.jp/antibody/english/about_antibody/history.html

KYOWA Hakko Kirin Co., Ltd.

22

23

Transgenični miševi (Ig knockout, HAC transgenični)

sadrži sve lokuse koji kodiraju teške lance i λ lance ljudi