of 106/106
PROFIL PERTUMBUHAN KALUS DAUN LEMBAGA BIJI TANAMAN JATROPHA CURCAS PADA MEDIA WHITE DENGAN MENGGUNAKAN TEKNIK KULTUR JARINGAN SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi Oleh : Christophorus Aditya Nugraha NIM: 028114135 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PROFIL PERTUMBUHAN KALUS DAUN LEMBAGA BIJI …repository.usd.ac.id/2840/2/028114135_full.pdf · Pada hari ke-20 terjadi pertumbuhan maksimum kalus dimana hal ini juga memperlihatkan

  • View
    0

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of PROFIL PERTUMBUHAN KALUS DAUN LEMBAGA BIJI …repository.usd.ac.id/2840/2/028114135_full.pdf ·...

  • PROFIL PERTUMBUHAN KALUS DAUN LEMBAGA BIJI

    TANAMAN JATROPHA CURCAS PADA MEDIA WHITE

    DENGAN MENGGUNAKAN TEKNIK KULTUR

    JARINGAN

    SKRIPSI

    Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

    Program Studi Ilmu Farmasi

    Oleh : Christophorus Aditya Nugraha

    NIM: 028114135

    FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

    YOGYAKARTA 2007

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • ii

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • iii

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • HALAMAN PERSEMBAHAN

    “Pergilah ke Rakyat, mulailah dari apa yang mereka punya, bekerjalah bersama mereka,

    hasilkanlah sesuatu yang berguna bagi mereka, dan apabila mereka sudah mendapatkan atas apa

    yang mereka butuhkan, biarlah mereka yang berkata : “kami sudah bekerja dan menghasilkan

    sesuatu bagi kami”

    (Mao Tse) “Jika anda berpikir ke depan, taburlah benih. Jika

    anda berpikir 10 tahun ke depan, tanamlah sebatang pohon. Jika anda berpikir 100 tahun ke

    depan, didiklah Rakyat.”

    (Kuan Tsu)

    ”Sesungguhnya segala sesuatu yang tidak kamu lakukan untuk salah seorang dari yang paling hina ini, kamu tidak melakukannya juga untuk

    Aku.” Sebab, Iman tanpa perbuatan itu kosong.

    (Mat 25:45)

    ^âÑxÜáxÅut{~tÇ ~tÜçt~â |Ç| àxÜâÇàâ~M

    UtÑt~ wtÇ \uâ áxutzt| àtÇwt ~tá|{ wtÇ ut~à|~âA ^xwât tw|~~â? Utçâ wtÇ gÉÑtÇ tàtá áxztÄtÇçtA

    ctÜt át{tutà çtÇz àxÜ~tá|{A TÄÅtÅtàxÜ~âA

    UtÇzát wtÇ axztÜt~â.

    iv

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • v

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • INTISARI Tanaman jarak pagar (Jatropha curcas) di Indonesia saat ini masih belum

    digunakan secara luas untuk bahan pengobatan. Masyarakat Indonesia sering menggunakan tanaman ini sebagai antiseptik, laksatif dan purgatif. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh informasi tentang golongan terpenoid antara kalus hasil budidaya in-vitro dengan biji dari tanaman asalnya.

    Penelitian ini merupakan penelitian non-eksperimental deskriptif dengan rancangan acak lengkap pola searah. Eksplan yang berasal dari daun lembaga biji tanaman Jatropha curcas ini ditumbuhkan pada media White dengan penambahan zat pangatur tumbuh yakni Naphthaleneacetic acid (NAA) : Benzylaminopurine (BAP) (2:2). Pengamatan dilakukan terhadap waktu inisiasi kalus, ukuran bobot kalus basah awal dan akhir, grafik pertumbuhan dan hasil KLT kalus dengan biji tanaman asalnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa waktu inisiasi kalus pada media White dengan konsentrasi zat pengatur tumbuh 2 : 2 (NAA : BAP) yakni 4 hari. Pada hari ke-20 terjadi pertumbuhan maksimum kalus dimana hal ini juga memperlihatkan fase stasioner. Kandungan air dalam kalus menunjukkan peningkatan saat waktu tanam dan mulai tetap pada hari ke-4 hingga ke-32. Kalus daun lembaga yang berasal dari biji tanaman Jatropha curcas memiliki bercak kromatografi lapis tipis yang sama dengan biji tanaman asalnya dengan menggunakan teknik multiple elution sebanyak 3 kali dengan harga Rf pada kalus sebesar 0,275. Kata kunci : Jatropha curcas, kalus, kultur jaringan.

    vi

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • ABSTRACT

    In Indonesia, at present “jarak pagar” (Jatropha curcas) still widely used as a medicine yet. Indonesian people used this plant as an antiseptic, lacsative and also purgative. The goal of this research is to get some information about the comparison of terpenoid between callus from in-vitro cultivation and seed from the original plant. This research was a non-experimental descriptive observation using complete randomly arrangement. And then, the explant from cotyledon of Jatropha curcas seed was planted at White medium with concentration of growth hormone 2: 2 for Naphthalene acetic acid: Benzylaminopurine. The variable of observation for this research are time of initiate callus, weight of callus after planted and after harvest and also Thin Layer Chromatography profile of callus and seed from the plant. The result shows that the time of initiate callus in White medium with the concentration of NAA and BAP (2: 2) are 4 days. At the 20th day there was maximum growth of callus, and it means the stationer phase. The callus water contains get increased when planting and then get stationer from day 4th till 32nd days. The callus from cotyledon of Jatropha curcas has Thin Layer Chromatography spot which is similar with the seed from the plant using multiple elution technique at 3 times with Rf about 0,275. Keyword : Jatropha curcas, callus, tissue culture.

    vii

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • KATA PENGANTAR

    Syukur dan terima kasih ke Hadirat Sang Pencipta atas segala rahmat

    tuntunan dan pendampingan serta kasih yang telah dilimpahkan kepada penulis

    sehingga dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Profil Pertumbuhan

    Kalus Daun Lembaga Biji Tanaman Jatropha Curcas Pada Media White

    Dengan Menggunakan Teknik Kultur Jaringan” sebagai salah satu syarat

    untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi.

    Penelitian hingga tahap penulisan skripsi ini tidak akan dapat selesai,

    tanpa bantuan serta doa dari beberapa pihak. Oleh karena itu, penulis

    mengucapkan terima kasih kepada :

    1. Keluarga besar terutama BAPAK dan IBU atas segala doa, nasehat dan

    pengorbanannya yang telah mendorong dan menyemangati. Bayu dan Topan

    atas doa, pengertian, bantuan dan selalu mengingatkan hingga penulis mampu

    menyelesaikan skripsi ini.

    2. Bapak Ignatius Yulius Kristio Budiasmoro, M.Si., selaku Dosen Pembimbing

    Skripsi yang telah meluangkan waktu untuk memberikan banyak masukan

    pengetahuan, kesabaran dan diskusi dalam membimbing selama penelitian dan

    penulisan skripsi ini.

    3. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji Skripsi yang telah

    bersedia menguji dan memberikan saran demi kesempurnaan skripsi ini.

    4. Ibu Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji Skripsi yang telah

    bersedia menguji dan memberikan saran demi kesempurnaan skripsi ini.

    viii

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 5. Seluruh dosen (khususnya Bpk. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., Bpk Dr. Sabikis

    dan Bpk Dr. Pudjono, S.U., Apt.) dan karyawan (terutama Bpk Kasiran)

    Fakultas Farmasi atas bimbingan selama 4 tahun ini.

    6. Seluruh laboran Fakultas Farmasi, terutama laboran Laboratorium Biologi

    (Mas Sigit, Mas Wagiran, Mas Andri dan Mas Sarwanto) atas segala bantuan

    dan dukungannya selama ini.

    7. Teman-teman seperjuangan yang penelitiannya di Laboratorium Kultur

    Jaringan (Pak Eko, Vicky, Dony, Melisa dan Ancol). Vero, Mina, Ratna dan

    Christin yang telah bersedia membagikan pengetahuan selama penelitian

    8. Tjun Liong S.Farm., dan Valentino Dhiyu Asmoro, S.Farm., yang telah ambil

    bagian dalam proses dan dinamika melalui diskusi dan debat selama di

    Fakultas Farmasi serta seluruh teman-teman kelompok E angkatan 2002 atas

    kebersamaan dan bekerjasamanya dalam segala hal dan teman-teman kelas C

    yang lain.

    9. Sahabat dan teman yang selalu mengingatkan dan mengajarkan arti

    kedewasaan dan perjuangan. Heni (atas segala dukungan, perhatian dan kasih

    sayang serta telah memberi “warna dan rasa” hidupku). Tedy, Mbatu, Okhi

    dan Yoyo (yang telah mengajariku arti sebuah perjuangan untuk berbuat bagi

    sesama). Teman-teman BEMU 2005, Insadha 2004 dan seluruh civitas

    akademika Universitas Sanata Dharma (yang telah mendewasakanku untuk

    mengerti apa arti sebuah kepemimpinan), Bayu, Sumin, Bani, Felix dan Ibu

    Bapak kost (yang telah bersedia berbagi keceriaan selama berada di kost).

    ix

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 10. Bangsa dan Negara Republik Indonesia atas keindahan alam, keanekaragaman

    hayati dan masyarakat yang plural serta para Pahlawan Nasional (Bung Karno,

    Ki Hajar Dewantara, Tan Malaka, Rm. Magunwijaya dll) yang telah

    memberikan inspirasi bagiku.

    11. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah mendukung,

    membantu dan mendoakan penulis sehingga dapat menyelesaikan skripsi ini.

    Semoga Hyang Maha Kuasa selalu memberikan dan membalas rahmat kasih,

    kebaikan dan ketulusan yang telah dirasakan penulis selama ini.

    Dalam penelitian dan penulisan Skripsi ini masih banyak kekurangan yang

    masih harus diperbaiki. Maka dari itu, penulis masih mengharapkan banyak

    masukan saran dan kritik demi kesempurnaan karya skripsi ini sehingga dapat

    lebih bermanfaat bagi masyarakat luas.

    Yogyakarta, 10 Februari 2007

    Penulis.

    x

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • DAFTAR ISI

    Halaman

    HALAMAN JUDUL…………………………………………………………. i

    HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING……………………………… ii

    HALAMAN PENGESAHAN………………………………………………… iii

    HALAMAN PERSEMBAHAN………………………………………………. iv

    PERNYATAAN KEASLIAN KARYA………………………………………. v

    INTISARI…………………………………………………………................... vi

    ABSTRACT……………………………………………………………………. vii

    KATA PENGANTAR…………………………………………….................... viii

    DAFTAR ISI…………………………………………………………………... xi

    DAFTAR TABEL……………………………………………………………... xvi

    DAFTAR GAMBAR………………………………………………………….. xvii

    DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………….. xviii

    BAB I. PENGANTAR

    A. Latar Belakang……………………………………………......................... 1

    B. Permasalahan…………………………………………………................... 2

    C. Keaslian Penelitian…………………………………………….................. 3

    D. Manfaat Penelitian……………………………………………................... 3

    E. Tujuan Penelitian…………………………………………......................... 4

    BAB II. PENELAHAAN PUSTAKA

    A. Tanaman Jatropha curcas………………………………………………... 5

    xi

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 1. Nama daerah……………………………………………………………… 5

    2. Nama ilmiah……………………………………………………………… 5

    3. Morfologi………………………………………………………………… 5

    4. Kandungan kimia…………………………………………….................... 7

    5. Khasiat dan Kegunaan……………………………………….................... 8

    B. Terpenoid ………………………………………………………………... 10

    C. Kultur Jaringan Tanaman…………………………………………………12

    1. Kultur jaringan…………………………………………………………… 12

    2. Kalus………………………………………………………....................... 14

    3. Eksplan………………………………………………………………….... 15

    4. Menabur eksplan…………………………………………………………. 16

    5. Sub kultur…………………………………………………........................ 18

    6. Pertumbuhan kalus……………………………………………………….. 18

    D. Media Kultur Jaringan……………………………………………………. 19

    1. Unsur makro………………………………………………….................... 20

    2. Unsur mikro……………………………………………………………… 21

    3. Vitamin………………………………………………………................... 22

    4. Zat pengatur tumbuh dan hormon......…………………………................. 23

    5. Bahan pemadat media…………………………………………................. 25

    6. Sukrosa………………………………………………………………….... 26

    7. Lingkungan……………………………………………………................. 26

    E. Sterilisasi ……………………………………………………................... 28

    F. Kromatografi Lapis Tipis………………………………………………... 31

    xii

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 1. Fase diam………………………………………………………………… 32

    2. Fase gerak………………………………………………………………... 33

    3. Penempatan cuplikan………………………………………….................. 33

    4. Elusi……………………………………………………………………… 34

    5. Deteksi…………………………………………………………………… 34

    6. Penilaian kromatografi…..…………………………………….................. 35

    G. Keterangan Empiris.……………………………………………………… 37

    BAB III. METODOLOGI PENELITIAN

    A. Jenis dan Rancangan Penelitian…………………………………………. 38

    B. Definisi Operasional….………………………………………………….. 38

    C. Bahan dan Alat……….………………………………………………….. 39

    1. Bahan…………………………………………………………………….. 39

    2. Alat……………………………………………………………................. 41

    D. Tata Cara Penelitian….………………………………………………….. 42

    1. Determinasi tanaman…………………………………………………….. 42

    2. Pemilihan eksplan………………………………………………………... 42

    3. Pengumpulan bahan……………………………………………………… 42

    4. Pembuatan stok…………………………………………………………... 43

    5. Pembuatan media……………………………………………………….... 44

    6. Sterilisasi…………………………………………………………………. 45

    7. Penanaman eksplan……………………………………………………..... 46

    8. Inisiasi kalus…………………………………………………………….... 47

    9. Subkultur…………………………………………………………………. 47

    xiii

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 10. Pemanenan kalus…………………………………………………………. 48

    11. Analisis pertumbuhan kalus…………………………………………….... 48

    12. Pembuatan serbuk………………………………………………………... 49

    13. Uji KLT ekstrak kalus daun lembaga dan biji tanaman Jatropha curcas.. 50

    E. Analisis Hasil…………………………………………………………….. 51

    BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

    A. Determinasi Tanaman Jatropha curcas…...……………………………… 52

    B. Penentuan Eksplan………………………………………………………... 52

    C. Waktu Inisiasi Kalus..…………………………………………………….. 55

    D. Deskripsi Kalus………………………………………………………….... 57

    E. Subkultur………………………………………………………………….. 59

    F. Analisis Profil Pertumbuhan Kalus……………………………………….. 60

    1. Pola pertumbuhan kalus…………………………………………………... 60

    2. Persen kadar air...………………………………………………………..... 62

    G. Pengeringan dan Pembuatan Serbuk…………………………………….... 64

    H. Kromatografi Lapis Tipis………………………………………………..... 66

    BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN

    A. Kesimpulan……………………………………………………………….. 76

    B. Saran…………………………………………………………………........ 76

    DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………........ 78

    LAMPIRAN…………………………………………………………………... 81

    BIOGRAFI PENULIS………………………………………………………... 89

    xiv

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • DAFTAR TABEL

    Halaman

    Tabel I. Data kromatografi lapis tipis dengan fase gerak

    n-hexane : aseton : methanol (80:15:5) dan fase diam silika

    gel GF 254 yang dicelupkan pada larutan AgNO3 2,5%

    di semprot dengan reagen vanillin-sulfat........................................ 70

    Tabel II. Data kromatografi lapis tipis dengan fase gerak

    n-hexane : aseton : methanol (80:15:5) dan fase diam silika

    gel GF 254 yang dicelupkan pada larutan AgNO3 2,5%

    di semprot dengan reagen antimon-triklorida ................................ 72

    xv

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • DAFTAR GAMBAR

    Halaman

    Gambar 1. Foto pertumbuhan kalus dari waktu ke waktu………………. 58

    Gambar 2. Pola pertumbuhan kalus dari waktu ke waktu……………….. 60

    Gambar 3. Persen kadar air………..……………………………………... 63

    Gambar 4. Struktur isoprene……………………………………………... 68

    Gambar 5. Kromatogram kalus dan biji Jatropha curcas setelah

    di semprot dengan reagen vanillin-sulfat…………………….. 74

    Gambar 6. Kromatogram kalus dan biji Jatropha curcas setelah

    di semprot dengan reagen antimon-triklorida………………... 75

    xvi

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • DAFTAR LAMPIRAN

    Halaman

    Lampiran 1. Surat determinasi tanaman…………….………………….….. 81

    Lampiran 2. Foto-foto hasil penelitian……………………………….……. 82

    Lampiran 3. Komposisi media white………………………………….….... 86

    Lampiran 4. Hasil penimbangan pemanenan kalus dari hari ke hari............. 87

    Lampiran 5. Persen kadar air......................................................................... 88

    xvii

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • BAB I

    PENGANTAR

    A. Latar Belakang

    Penelitian ini merupakan bagian dari rangkaian besar penelitian untuk

    mengeksplorasi budidaya tanaman Jatropha curcas khususnya dengan

    menggunakan metode kultur jaringan. Pengembangan budidaya tanaman Jatropha

    curcas ini dilakukan dalam rangka penggunaannya sebagai tanaman obat.

    Jatropha curcas berpotensi menghasilkan jenis metabolit sekunder yang

    bermanfaat dalam bidang farmasi salah satunya yakni terpenoid yang dapat

    digunakan sebagai bahan anti-bakteri (Roberto Can Aké, dkk, 2004). Masyarakat

    Indonesia biasanya menggunakan daun tanaman ini untuk penyakit eksim, jamur

    dan mencegah masuk angin bagi bayi.

    Untuk membudidayakan kalus tanaman Jatropha curcas yang nantinya

    dapat menghasilkan terpenoid yang diharapkan, maka digunakan dua macam ZPT

    yakni Naphthaleneacetic acid (NAA) dan Benzylaminopurine (BAP) merupakan

    golongan hormon sintetis (zat pengatur tumbuh) dimana NAA mempunyai fungsi

    untuk menginisiasi dan BAP untuk mendorong pertumbuhan kalus. NAA

    merupakan golongan ZPT auksin sedangkan BAP adalah golongan ZPT sitokinin.

    NAA dan BAP mempunyai kelebihan dibandingkan dengan ZPT golongan auksin

    dan sitokinin yang lain, diantaranya yaitu NAA dan BAP relatif tahan terhadap

    pemanasan terutama saat proses sterilisasi media, sifat kimia NAA dan BAP stabil

    1

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 2

    terhadap penguraian yang dilakukan oleh enzim-enzim yang dikeluarkan oleh sel

    (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

    Profil pertumbuhan kalus merupakan salah satu parameter untuk

    mengetahui fase pertumbuhan dari kalus yang sedang dikulturkan yakni fase lag,

    eksponensial dan penuaan (George dan Sherrington, 1984). Pengolahan kultur

    kalus dengan menggunakan sistem bioreaktor memerlukan profil pertumbuhan

    kalus untuk mengetahui waktu yang tepat saat pemanenan ataupun penggantian

    media kultur sehingga metabolit sekunder yang dihasilkanpun dalam keadaan

    optimal (Misawa, M., 1994). Dalam dunia kefarmasian, teknik kultur jaringan

    sangat bermanfaat dalam produksi metabolit sekunder yang bernilai ekonomi

    dengan cara mengambil metabolit sekunder yang dihasilkan dengan melakukan

    pada suatu bioreaktor dimana sistem ini dapat menghasilkan sejumlah besar

    metabolit sekunder dalam waktu yang singkat (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

    Biji tanaman ini mengandung banyak terpenoid (Sinaga, 2005) sehingga

    daun lembaga biji digunakan sebagai eksplan untuk dikembangkan secara kultur

    jaringan. Media White merupakan medium dasar dengan konsentrasi garam-

    garam mineral yang rendah dimana tanaman berkayu lebih suka media yang

    berkonsentrasi rendah (Rao dan Lee cit Katuuk, 1979).

    B. Perumusan Masalah

    Permasalahan dalam penelitian ini adalah :

    1. Apakah potongan daun lembaga dari biji tanaman Jatropha curcas dapat

    membentuk kalus dengan teknik kultur jaringan ?

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 3

    2. Seperti apakah profil pertumbuhan kalus daun lembaga dari biji tanaman

    Jatropha curcas dalam media White dengan konsentrasi tertentu

    Naphthaleneacetic acid (NAA) dan Benzylaminopurine (BAP) ?

    3. Apakah kalus daun lembaga yang berasal dari biji tanaman Jatropha curcas

    mengandung golongan terpenoid yang sama dengan biji tanaman asalnya?

    C. Keaslian penelitian

    Sejauh pengamatan peneliti hingga penelitian ini disusun, belum ada

    penelitian tentang profil pertumbuhan kalus daun lembaga dari biji tanaman

    Jatropha curcas L. pada media White dengan menggunakan teknik kultur

    jaringan.

    D. Manfaat penelitian

    1. Manfaat teoritis

    Dengan dilakukannya penelitian ini diharapkan hasilnya dapat membantu

    pengembangan ilmu farmasi khususnya mengenai kultur kalus daun lembaga dari

    biji tanaman Jatropha curcas untuk menghasilkan metabolit sekunder yang

    diinginkan yakni golongan terpenoid.

    2. Manfaat praktis

    Penelitian ini diharapkan dapat menjadi salah satu sarana informasi untuk

    memproduksi metabolit sekunder daun lembaga dari biji tanaman Jatropha curcas

    secara cepat dan efisien dengan menggunakan teknik kultur jaringan yakni dengan

    menggunakan sistem bioreaktor.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 4

    E. Tujuan Penelitian

    1. Tujuan umum

    Penelitian ini dilakukan untuk mengembangkan teknik kultur jaringan

    pada daun lembaga dari biji tanaman Jatropha curcas.

    2. Tujuan khusus

    Berdasarkan pada latar belakang dan permasalahan yang ada, maka tujuan

    dari penelitian ini adalah :

    a. Mengetahui bahwa daun lembaga dari biji tanaman Jatropha curcas dapat

    membentuk kalus dengan teknik kultur jaringan.

    b. Mengetahui bentuk profil pertumbuhan kalus daun lembaga dari biji tanaman

    Jatropha curcas dalam media White dengan konsentrasi tertentu

    Naphthaleneacetic acid (NAA) dan Benzylaminopurine (BAP)

    c. Membandingkan hasil KLT kalus daun lembaga yang berasal dari biji tanaman

    Jatropha curcas dengan biji tanaman asalnya untuk mengetahui kesamaan

    kandungan golongan terpenoidnya.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 5

    BAB II

    PENELAAHAN PUSTAKA

    A. Uraian Tanaman Jatropha curcas L.

    1. Nama daerah

    Nawaih nawas (Aceh); Jarak kosta (Melayu); Jirak (Minangkabau); Jarak

    gundul, Jarak iri, Jarak pager, Jarak cina (Jawa); Bintalo (Gorontalo); Bindalo

    (Buwol, Sulawesi); Malate, Maka male (Seram) (Sinaga, 2005).

    2. Nama ilmiah

    Tanaman Jatropha curcas termasuk dalam familia Euphorbiacea. Genus

    dari tanaman ini adalah Jatropha L. (Anonim, 2005a).

    3. Morfologi

    Jatropha curcas sangat baik untuk beradaptasi pada daerah dengan

    kondisi yang kering atau kurang subur. Pertumbuhan Jatropha curcas yang baik

    justru pada daerah yang panas yaitu pada daerah tropis. Jatropha curcas ini

    mempunyai toleransi yang tinggi terhadap kondisi iklim dan tidak sensitif

    terhadap lama waktu penyinaran matahari. Tanaman ini merupakan spesies yang

    sangat mudah untuk beradaptasi, namun ketangguhan tanaman ini berasal dari

    kemampuannya untuk dapat tumbuh pada lahan kritis dan kondisi iklim yang

    kering (Anonim, 2005a).

    Tanaman Jatropha curcas merupakan tanaman perdu atau pohon kecil,

    bercabang-cabang tidak teratur, tinggi sekitar 1–7 meter. Batangnya berkayu,

    silindris, bercabang, berkulit licin, memiliki tonjolan-tonjolan bekas tangkai daun

    5

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 6

    yang gugur. Bila dipatah-patahkan atau terluka, batangnya akan mengeluarkan

    getah putih, kental dan agak keruh (Sinaga, 2005).

    Tanaman ini merupakan tanaman berdaun tunggal, tersebar di sepanjang

    batang. Permukaan atas dan bawah daun berwarna hijau, tetapi permukaan bawah

    lebih pucat dari permukaan atas. Daun lebar, berbentuk jantung atau bulat telur

    melebar, dengan panjang dan lebar hampir sama, yaitu sekitar 5–15 cm. Helai

    daun bertoreh, berlekuk bersudut 3 atau 5. Pangkal daun berlekuk dan ujung dari

    pangkal daun meruncing. Tulang daun menjari dengan 5–7 tulang utama. Tangkai

    daun panjang, sekitar 4–15 cm (Sinaga, 2005).

    Tanaman ini mempunyai bunga majemuk bentuk malai, berwarna kuning

    kehijauan, berkelamin tunggal, berumah satu. Baik bunga jantan maupun betina

    Jatropha curcas ini tersusun dalam rangkaian berbentuk cawan, muncul di ujung

    batang atau di ketiak daun. Jatropha curcas memiliki bunga dengan kelopak 5

    buah berbentuk bulat telur, panjang sekitar 4 mm. Benang sari dari tanaman

    Jatropha curcas mengelompok pada pangkal, warna kuning. Jatropha curcas

    pada tangkai putik berukuran pendek berwarna hijau, dan kepala putik

    melengkung keluar berwarna kuning. Mahkota pada putik Jatropha curcas

    berjumlah 5 buah, berwarna agak keunguan (Sinaga, 2005).

    Buah Jatropha curcas ini berupa buah kotak berbentuk bulat telur,

    diameter 2–4 cm, berwarna hijau ketika masih muda dan kuning jika sudah

    masak. Buah tanaman ini terbagi menjadi 3 ruang, masing-masing ruang berisi

    satu biji (Sinaga, 2005).

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 7

    Ketika biji Jatropha curcas sudah masak ditandai dengan adanya

    perubahan warna dari hijau menjadi kuning, sekitar 2 hingga 4 bulan dari masa

    fertilisasi. Lapisan kulit yang tipis hitam tersebut didalamnya terdapat biji

    Jatropha curcas (Anonim, 2005b), tiap buah terdapat 3 biji, berbentuk elips,

    ruang biji berbentuk segitiga elips, 1.5-2 x 1-1.1 cm (Anonim, 2005a). Biji

    berbentuk bulat telur memanjang agak bengkok. Sisi cekung dibagi dua di tengah

    oleh rafe. Panjang 1.5 cm sampai 2 cm, diameter 10 mm hingga 12 mm. Pada

    pangkal biji terdapat tonjolan seperti karunkula. Kulit luar biji (testa) agak rapuh,

    warna hitam, tidak rata, agak kasar. Kulit dalam (tegmen) berwarna putih, tipis

    berkerut dan beralur-alur. Inti biji berwarna putih sampai kekuning-kuningan.

    Lembaga berupa selaput tipis yang lebar, terdapat di antara keping biji (Anonim,

    1995a).

    4. Kandungan kimia

    Pada genus Jatropha secara keseluruhan mempunyai senyawa metabolit

    sekunder lainnya yakni lignan, diterpen, triterpen dan peptida siklik (Roberto et

    all, 2004). Tanaman Jatropha curcas mengandung bahan kimia diantaranya

    triakontranol, kaempesterol, stigmasterol, iteksin, dan asam sianida (HCN). Pada

    daun tanaman ini mengandung saponin, flavonoida, tannin, terpenoid dan

    senyawa polifenol. Sedangkan batang tanaman ini mengandung sponin,

    flavonoida, tannin dan senyawa–senyawa polifenol. Getah Jatropha curcas

    mengandung tannin 11–18 persen. Pada bagian biji tanaman Jatropha curcas

    mengandung berbagai senyawa alkaloid, saponin, terpenoid dan sejenis protein

    beracun yang disebut kursin (Sinaga, 2005).

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 8

    5. Khasiat dan kegunaan

    Berdasarkan jurnal yang diacu dalam penelitian ini dikatakan bahwa

    terpenoid yang berasal dari daun dan akar tanaman jarak dapat digunakan sebagai

    bahan anti-bakteri (Roberto Can Aké, dkk, 2004). Bagian dari akar, batang, daun

    dan buah dari tanaman ini sudah digunakan secara luas pada pengobatan

    tradisional di banyak daerah belahan Afrika barat. Biji dari Jatropha curcas sudah

    digunakan sebagai bahan purgatif, anti-helmantik, dan baik digunakan untuk

    mengatasi penyakit kulit, asam urat, ascites dan paralisis. Minyak dari biji

    tanaman ini sudah digunakan sebagai bahan tambahan pada terapi penyakit

    rematik, gatal-gatal dan penyakit parasit kulit serta terapi pada demam, jaundice

    dan gonorrhoea, sebagai diuretik dan larutan penyegar mulut. Pada beberapa

    daerah tertentu di Afrika, masyarakat mengunyah biji untuk mendapatkan efek

    laksatif. Biji Jatropha curcas juga sudah mulai disarankan dalam pengobatan

    sebagai bahan chemotherapeutic yang tersedia pada dosis non-letal (Adam, 1974).

    Keadaan ini mungkin dilaporkan karena biji Jatropha curcas mempunyai aktivitas

    anti-helmantik. Terdapat laporan dari Gabon bahwa 1-2 buah biji cukup untuk

    mempunyai aktivitas sebagai bahan purgatif; bila dosis ditingkatkan maka dapat

    mengakibatkan kematian (Anonim, 2003). Penyebab kematian diantaranya

    disebabkan oleh adanya senyawa toksik yakni cursin dengan cara merusak

    dinding pembuluh darah (Perry dan Metzger, 1980).

    Getah dari Jatropha curcas diaplikasikan secara langsung pada luka dan

    bahan pembalut luka serta sebagai bahan astrigen untuk membersihkan mulut,

    gusi dan terapi luka pada lidah dan mulut. Di Nigeria batang digunakan dengan

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 9

    cara dikunyah. Getah mempunyai daya antibiotik melawan Candida albicans,

    Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus dan

    Streptococcus pyrogens. Selain itu juga mempunyai efek sebagai bahan anti-

    koagulasi pada darah (Anonim, 2005a). Getah dari Jatropha curcas mengandung

    sebuah alkaloid yang dikenal dengan sebutan jatrophine, dimana dipercayai

    mempunyai efek anti-kanker. Juga digunakan secara eksternal pada penyakit kulit

    dan rematik serta luka terbuka pada daerah tertentu (Anonim, 2006b). Getah juga

    digunakan secara topikal untuk bee dan wasp stings (Duke, 1983).

    Ekstrak metanol dari daun Jatropha curcas menghasilkan perlindungan

    pada kultur sel lymphoblastoid manusia melawan efek sitopatik dari plasma HIV.

    Infusa daun digunakan sebagai bahan diuretik, untuk mandi, terapi batuk, dan

    sebagai terapi konvulsan serta penangkal serangan penyakit. Daun juga digunakan

    untuk terapi jaundice, demam, sakit rematik, cacingan dan pertumbuhan janin

    yang buruk pada ibu hamil. Daun memproduksi getah yang mempunyai efek

    haemostasis; daun ini digunakan untuk membungkus luka. Di Ghana, abu bakaran

    daun diaplikasikan melalui injeksi rektal untuk terapi haemorrhoids (Anonim,

    2005a).

    Akar dari Jatropha curcas memperingan pembengkakkan akibat tetanus

    dan rasa sakit akibat luka, disentri dan jaundice. Dilaporkan bahwa akar

    digunakan sebagai bahan anti-bisa dari gigitan ular. Akar juga digunakan dalam

    bentuk sediaan dekok yang mempunyai fungsi sebagai cairan penyegar mulut

    yang biasanya dicampurkan pada permen karet dan pasta gigi. Selain itu juga

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 10

    digunakan untuk mengobati penyakit skabies, cacing pita dan eksim (Duke,

    1983).

    B. Terpenoid

    Terpen merupakan senyawa hasil kondensasi linear asam asetat dengan

    dua atom karbon. Asam asetat melalui berbagai cara akan menjadi asam malonat

    yang akhirnya akan menjadi beberapa senyawa terpen. Senyawa ini banyak

    terdapat dalam berbagai jenis tanaman sebagai komponen minyak atsiri. Terpen

    merupakan senyawa hidrokarbon jenuh atau tidak jenuh dengan jumlah atom

    karbon (C) kelipatan 5 (Soemarno cit. Mursyidi, 1990).

    Menurut Soemarno (cit. Mursyidi, 1990), istilah terpen kemudian diganti

    dengan terpenoid mengingat senyawa hidrokarbon tersebut mempunyai gugus

    fungsional yang mengandung atom O dan diketahui bahwa biosintetik terpenoid

    merupakan polimerisasi senyawa isopren. Terpenoid biasanya digolongkan

    menjadi :

    1. Monoterpenoid dengan jumlah atom C = 10.

    2. Seskuiterpenoid dengan jumlah atom C = 15.

    3. Diterpenoid dengan jumlah atom C = 20.

    4. Sesterpenoid dengan jumlah atom C = 25.

    5. Triterpenoid dengan jumlah atom C = 30.

    6. Tetraterpenoid dengan jumlah atom C = 40.

    Secara kimia, terpenoid umumnya larut dalam lemak dan terdapat di

    dalam sitoplasma sel tumbuhan. Kadang-kadang minyak atsiri terdapat di dalam

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 11

    sel kelenjar khusus pada permukaan daun, sedangkan karotenoid terutama

    berhubungan dengan kloroplas didalam daun dengan kromoplas di dalam daun

    bunga (petal). Biasanya ekstraksi terpenoid dari jaringan tanaman dilakukan

    dengan cara memakai petroleum eter, eter atau kloroform dan dapat dipisahkan

    secara kromatografi pada silika gel atau alumina. Pemeriksaan golongan terpenoid

    dilakukan dengan cara dilakukan penyemprotan dengan asam sulfat pekat dan

    kemudian diteruskan dengan pemanasan (Harbone, 1987).

    Banyak jenis macam terpenoid sudah diidentifikasi dan diketahui peran

    aktif dalam berbagai macam tanaman. Sifat yang cukup kelihatan yaitu dalam

    mengatur pertumbuhan. Dua dari golongan utama pengatur tumbuh ialah

    seskuiterpenoid absisin dan giberelin yang mempunyai kerangka dasar

    diterpenoid. Selain itu golongan karotenoid juga turut berperan bagi tanaman

    yakni sebagai pigmen pembantu pada fotosintesis. Golongan terpenoid lain yang

    turut membantu tanaman yakni mono- dan seskuiterpen dimana berfungsi untuk

    memberi bau dan wangi khas yang sudah diketahui (Harbone, 1987).

    Masih dalam dugaan bahwa terpenoid ini turut berperan pada antaraksi

    antara tanaman dengan hewan, misalnya sebagai alat komunikasi dan pertahanan

    pada serangga. Pada suatu terpenoid tertentu yang tidak mudah menguap telah

    diimplikasikan sebagai hormon kelamin pada fungus (Harbone, 1987). Terpenoid

    diminati untuk diteliti lebih jauh yakni untuk mengetahui sejauh mana peran

    terpenoid sebagai pelindung terhadap serangga yang pada akhirnya dapat

    dikembangkan sebagai bahan penolak serangga bagi manusia (Robinson, 1991).

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 12

    Pada golongan diterpenoid, perhatian besar telah diberikan kepada

    segolongan ester diterpenoid rumit yang diisolasi dari tanaman sekeluarga

    Euphorbiaceae yang mempunyai aktivitas sebagai antimikrobial, anti tumor

    karena efek sitotoksiknya (Roberto et all, 2004), antileukimia dan senyawa

    pengiritasi kulit kuat yang pada akhirnya juga sangat bermanfaat sebagai bahan

    penelitian sebagai kontrol positif terhadap proses iritasi kulit dan tentunya juga

    tingkat iritasi ini telah di standarisasi terlebih dahulu (Robinson, 1991).

    Manusia telah melakukan penelitian dan pengembangan terpenoid dalam

    rangka untuk meningkatkan taraf kesehatan masyarakat terutama digunakan

    sebagai tanaman obat-obatan. Diantaranya telah menunjukkan berbagai macam

    aktivitas fisiologis manusia yakni gangguan menstruasi, malaria, kerusakan hati,

    fungisida, patukan ular, diabetes dan sebagainya (Robinson, 1991).

    C. Kultur Jaringan Tanaman

    1. Kultur jaringan

    Jenis pembiakan secara vegetatif yang paling mutakhir dan terus

    dikembangkan adalah kultur jaringan. Menurut Suryowinoto (1991) cit Katuuk

    (1989), kultur jaringan dalam bahasa asing disebut sebagai tissue culture, weefsel

    cultuus atau gewebe kultur. Kultur adalah budidaya dan jaringan adalah

    sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. Maka, kultur

    jaringan adalah membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil

    atau planlet yang mempunyai sifat seperti induknya dalam lingkungan aseptis.

    Pelaksanaan teknik kultur jaringan ini berdasarkan teori sel yang dikemukakan

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 13

    oleh Schleiden dan Schwann, yaitu bahwa sel mempunyai kemampuan autonom

    yaitu kemampuan tiap sel untuk tumbuh tanpa harus berdiferensiasi namun tiap

    sel tadi secara otomatis terkarakterisasi untuk tumbuh menjadi organ baru bagi

    tanaman; bahkan memiliki kemampuan totipotensi (Hendaryono dan Wijayani,

    1994) yakni kemampuan tiap sel, darimana saja bagian sel itu diambil dan apabila

    diletakkan dalam lingkungan yang sesuai akan dapat tumbuh menjadi tanaman

    yang sempurna (Suryowinoto, 1991 cit Hendaryono dan Wijayani 1994). Kultur

    jaringan merupakan salah satu jenis pembiakan vegetatif dan termasuk dalam

    kultur in vitro (Katuuk, 1989).

    Dari teori sel Schleiden dan Schwann, umumnya kemampuan totipotensi

    ini lebih banyak dimiliki oleh bagian tanaman yang juvenil, muda, dan banyak

    dijumpai pada daerah-daerah meristem tanaman (Santoso dan Nursandi, 2002).

    Sebab, jaringan meristem keadaannya selalu membelah, sehingga diperkirakan

    mempunyai zat hormon yang mengatur pembelahan (Hendaryono dan Wijayani,

    1994).

    Macam-macam jenis kultur jaringan yang telah berkembang dan

    digunakan secara luas saat ini antara lain : kultur meristem yaitu budidaya

    jaringan dengan menggunakan eksplan dari jaringan muda atau meristem; kultur

    pollen yaitu kultur jaringan dengan menggunakan eksplan dari pollen atau benang

    sari; kultur protoplas yaitu kultur jaringan dengan menggunakan eksplan dari

    protoplas, dimana protoplas itu sendiri yakni sel hidup yang telah dihilangkan

    dinding selnya; kultur kloroplas yaitu kultur jaringan dengan menggunakan

    kloroplas untuk keperluan fusi protoplas (memperbaiki sifat tanaman dengan

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 14

    membuat varietas baru); Silangan protoplas/fusi protoplas yaitu menyilangkan dua

    macam protoplas menjadi satu, kemudian dibudidayakan sampai menjadi tanaman

    kecil yang mempunyai sifat baru (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

    Budidaya meristem atau embrio bertujuan untuk menumbuhkan kalus dari

    eksplan yang ditanam. Eksplan merupakan potongan jaringan atau organ yang

    dikulturkan (Hendaryono dan Wijayani, 1994; Katuuk, 1989 ).

    Beberapa keunggulan pembiakan vegetatif melalui kultur jaringan adalah

    dapat memperbanyak dengan cepat kultivar hibrida baru yang berasal dari satu sel

    untuk kegunaan komersil, dapat menciptakan tanaman baru bebas dari penyakit

    yang disebabkan oleh virus, dapat memperbanyak tanaman yang sukar

    diperbanyak dengan memakai biji, dapat memperoleh tanaman induk yang sama

    sifat genetiknya dalam jumlah yang banyak, dan dapat menghasilkan tanaman

    baru sepanjang tahun (Katuuk, 1989).

    2. Kalus

    Kalus sebenarnya adalah proliferasi massa jaringan yang belum

    terdiferensiasi. Massa sel ini terbentuk pada seluruh permukaan irisan eksplan,

    sehingga semakin luas permukaan irisan eksplan semakin cepat dan semakin

    banyak kalus yang terbentuk. Dengan pengambilan metabolit sekunder dari kalus,

    biasanya malah dapat diperoleh kandungan lain yang lebih banyak jenisnya,

    karena seringkali timbul zat-zat terpenoid atau persenyawaan-persenyawaan

    lainnya yang sangat berguna khususnya dalam bidang pengobatan (Hendaryono

    dan Wijayani, 1994). Teknik kultur jaringan dicirikan oleh kondisi kultur aseptik,

    penggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap dan ZPT (Zat

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 15

    Pengatur Tumbuh), serta kondisi ruang kultur yang suhu dan pencahayaannya

    terkontrol (Yustina, 2003).

    Kumpulan sel pada kalus ini belum diketahui jelas apa fungsinya. Kalus

    yang terbentuk ini diharapkan terjadi morfogenesis dengan cara pengkulturan

    yang berulang-ulang dari media lama ke media yang baru. Teknik pemindahan

    eksplan ini disebut subkultur (Hendaryono dan Wijayani, 1994; Katuuk, 1989).

    Benzilaminopurin (kelompok sitokinin) dan Naftalen Asam Asetat

    (kelompok auksin sintesis) merupakan dua kelompok ZPT yang sering

    ditambahkan dalam media kultur. Penggunaan bersama kedua jenis ZPT ini dapat

    memberikan pengaruh interaksi terhadap diferensiasi jaringan. Kombinasi ZPT

    antara sitokinin group dengan auksin group dengan metode Mohr merupakan

    kunci keberhasilan dalam kultur jaringan. Metode ini bertujuan untuk mengetahui

    berapa dosis kombinasi ZPT auksin dan sitokinin yang dapat memberikan

    pertumbuhan yang paling baik terhadap eksplan yang digunakan (Hendaryono dan

    Wijayani, 1994).

    3. Eksplan

    Eksplan adalah bagian tanaman yang sesuai, yang kemudian dijadikan

    semacam benih untuk membentuk pertumbuhan selanjutnya (Wetherell, 1982).

    Besarnya ukuran eksplan yang ditanam dalam beberapa kasus menentukan

    terbentuknya kalus atau tidak. Eksplan yang berukuran kecil akan cenderung

    kalus, sedangkan eksplan yang ukurannya lebih besar potensial untuk

    bermorfogenesis (Bionde dan Thorpe, 1981).

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 16

    Menurut Soegihardjo (1990), bahan eksplan dapat dipilih sebagai berikut

    dengan tumbuhan yang dimaksud :

    a. Gymnospermae : tunas kecambah steril atau bagian floem

    b. Graminal : lembaga, mesokotil, akar atau bagian batang

    c. Dicotyledoneae : kecambah steril (akar, hipokotil, keping biji), batang, umbi

    dan daun

    d. Zingiberaceae dapat digunakan rimpang muda yang bertunas atau biji.

    Menurut George dan Sherington (1984), semakin besar eksplan yang

    digunakan maka semakin besar kemungkinan eksplan akan terkontaminasi oleh

    mikroorganisme. Oleh karena itu perlu dicari ukuran eksplan yang minimun dan

    efektif. Eksplan yang terlalu kecil tidak akan tumbuh secepat eksplan yang

    ukurannya terlalu besar. Biasanya eksplan yang terlalu kecil daya tahannya

    kurang. Ukuran yang paling baik adalah jika sel berjumlah sekitar 20.000-25.000

    buah (Thorpe cit. Katuuk, 1989).

    Macam eksplan, ukuran, umur dan cara pembudidayaan akan

    mempengaruhi berhasil tidaknya kultur jaringan tanaman dan apakah

    morfogenesis akan dapat diimbas dari kultur jaringan tanaman tersebut. Aturan

    sederhana yang mungkin dapat digunakan sebagai pegangan adalah bahwa kita

    harus menggunakan tanaman sumber eksplan yang sehat dan tumbuh kuat,

    memilih jaringan yang muda dan menggunakan eksplan yang cukup besar

    (Whetherell, 1982).

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 17

    4. Menabur eksplan

    Menabur eksplan dilakukan didalam laminar air flow dengan kondisi

    aseptik. Sebelum kita bekerja di dalam laminar air flow ini, semua perhiasan yang

    digunakan seperti cincin, jam tangan dan sebagainya harus dilepas, dan tangan

    harus dibasuh dahulu dengan alkohol 70%. Dalam menabur eksplan, pekerja harus

    menggunakan masker penutup mulut atau hidung (Hendaryono dan Wijayani,

    1994).

    Penanaman eksplan atau penaburan eksplan dilakukan secara aseptik pada

    media padat dan ditekan pelan-pelan agar terjadi persinggungan yang baik antara

    eksplan dan media. Selanjutnya media ditutup dengan penutup botol media erat-

    erat untuk mencegah penguapan dan inkubasi dilakukan ditempat gelap dengan

    penyinaran pada suhu (25±3)0C (Dixon, 1985).

    Untuk eksplan yang berupa daun diletakkan telungkup atau telentang,

    tetapi berdasarkan pengalaman posisi terbaik adalah bagian dorsal menghadap ke

    atas atau ditelungkupkan. Untuk batang atau tunas yang melekat di batang

    (cabang) ditancapkan atau diletakkan horisontal. Eksplan yang berupa kepingan

    atau irisan tipis dapat diletakkan sedemikian rupa sehingga bagian permukaan

    yang luas melekat erat pada media (Soegihardjo, 1990).

    Beberapa hari kemudian akan terbentuk kalus pada permukaan eksplan.

    Terbentuknya kalus karena pembelahan sel yang cepat dari sel-sel tanaman. Kalus

    juga terbentuk karena adanya luka dari bagian tanaman (George dan Sherrington,

    1984).

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 18

    5. Subkultur

    Menurut Hendaryono dan Wijayani (1994) sub kultur adalah usaha untuk

    mengganti media tanam kultur jaringan dengan media yang baru, sehingga

    kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kalus atau protokormus dapat dipenuhi.

    Dengan pertumbuhan kalus pada tempat yang tertutup, lama kelamaan akan dapat

    menyebabkan terjadinya akumulasi dari metabolit toksis serta dapat menyebabkan

    pengeringan dalam media sehingga dapat pecah. Cara pemindahan dilakukan

    dengan cara memindahkan kalus ke media baru (segar) dalam keadaan aseptik

    (Soegihardjo, 1989).

    Subkultur dilakukan setiap 4 minggu untuk media yang tersedia 30 ml.

    Pada dasarnya pemindahan kalus sangat beragam tergantung dari kecepatan

    pertumbuhan kalus (Soegihardjo, 1989).

    6. Pertumbuhan kalus

    Mulai dari waktu subkultur atau penaburan inokulum, ada tiga tahap

    perkembangan dari kalus, yaitu induksi pembelahan sel, tahap pembelahan sel

    aktif dan tahap pembelahan sel lambat atau sel berhenti membelah. Laju

    pertumbuhan kalus biasanya ditetapkan secara kuantitatif dengan parameter

    indeks pertumbuhan atau pertambahan bobot kalus basah. Pertambahan bobot

    kalus basah merupakan selisih antara bobot kalus basah pada periode tertentu

    dikurangi bobot kalus mula-mula atau bobot inokulum.

    Selanjutnya dari kurva pertumbuhan kalus yang menyatakan hubungan

    antara pertumbuhan bobot kalus basah dengan umur kalus dapat diketahui fase-

    fase pertumbuhan kalus antara lain :

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 19

    a. fase lag, yaitu fase dimana belum terjadi pertumbuhan kalus secara nyata. Ini

    terjadi beberapa waktu setelah kalus di subkultur serta merupakan masa

    adaptasi kalus dengan media yang baru. Pada fase ini pertambahan bobot

    kalus hanya sedikit dan hampir terlihat mendatar pada kurva.

    b. fase eksponensial, yaitu fase dimana mulai terjadi pertumbuhan kalus.

    Pertambahan bobot kalus mulai terlihat nyata dan diikuti fase linier dimana

    pertumbuhan kalus terus menaik secara eksponensial seperti garis lurus ke atas

    dan berhenti.

    c. fase penuaan, yaitu fase dimana pertumbuhan kalus mulai menurun dan

    menjadi berhenti. Kalus tidak dapat tahan hidup pada fase ini dalam waktu

    yang lama. Sel-sel mulai mati media pertumbuhan kelebihan muatan dan

    nutrien telah habis digunakan, sehingga kematian sel menjadi lebih cepat

    (George dan Sherrington, 1984).

    D. Media Kultur Jaringan

    Nutrisi atau unsur- unsur yang dibutuhkan oleh jaringan tanaman

    dikelompokkan menjadi dua, yaitu :

    a. Garam-garam anorganik yang dibedakan lagi menjadi dua, yaitu unsur makro

    (unsur yang dibutuhkan dalam jumlah besar) dan unsur mikro (unsur yang

    dibutuhkan dalam jumlah sedikit tetapi harus tersedia).

    Jenis- jenis yang termasuk unsur makro adalah Nitrogen, Fosfor, Kalium,

    Sulfur, Kalsium, dan Magnesium. Sedangkan unsur mikro meliputi Klor,

    Mangan, Besi, Tembaga, Seng, Bor, dan Molibdenum.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 20

    b. Garam- garam organik yang terdiri dari sukrosa, vitamin, dan zat pengatur

    tumbuh (ZPT).

    1. Unsur makro

    Kegunaan masing-masing unsur makro yang diperlukan bagi tumbuhan

    untuk dapat bertahan hidup dan mendukung pertumbuhannya akan dijabarkan

    berikut ini :

    a. nitrogen (N). Nitrogen berpengaruh dalam menaikkan daya tumbuh tanaman.

    Unsur ini sangat penting dalam proses pembentukan klorofil, terpenoid, asam inti,

    beberapa hormon tumbuhan serta asam amino. Bila tanaman kekurangan nitrogen,

    akan terlihat pada warna daun yang ada yakni menguning, sedangkan bila terlalu

    banyak menyebabkan perkembangan vegetatif akan lebih besar daripada

    perkembangan buah. Sumber nitrogen pada media kultur berasal dari amonium

    (NH4+) dan yang paling penting nitrat (NO3-). Jumlah amonium yang digunakan

    berkisar 2-8 mM sedang nitrat sekitar 25-40 mM.

    b. fosfor (P). Dalam jaringan meristematik serta daerah yang cepat pertumbuhan

    biasanya banyak terdapat fosfor. Terlalu banyak fosfor dalam media dapt

    menghambat pertumbuhan eksplan. Hal ini disebabkan oleh adanya persaingan

    penyerapan unsur lainnya seperti seng (Zn), besi (Fe) dan tembaga (Cu). Sumber

    fosfor dalam media diberikan dalam bentuk natrium hidrofosfat (NaH2PO4.H2O)

    atau kalium hidrofosfat (KH2PO4).

    c. potasium (K). Potas adalah unsur yang berguna untuk pembelahan sel, sintesa

    karbohidrat dan protein, pembuatan klorofil serta untuk mereduksi nitrat. Potas

    harus diberikan dalam media dengan konsentrasi 20 mM malah adakalanya dapat

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 21

    melebihi lagi. Bentuk ikatan potasium yang banyak digunakan dalam media kultur

    yakni KNO3 dan KH2PO4.

    d. magnesium (Mg). Magnesium adalah elemen utama dalam molekul klorofil.

    Selain itu magnesium bekerja sebagai aktivator enzim. Dalam media kultur sering

    diberikan dalam bentuk MgSO4.7H2O.

    e. belerang (S). Belerang terdapat dalam beberapa molekul protein, berguna

    untuk perkembangan akar. Belerang diberikan dalam bentuk MgSO4.7H2O atau

    {Ca(NO3)2.4H2O}.

    2. Unsur mikro

    Kegunaan masing-masing unsur mikro yang diperlukan bagi tumbuhan

    untuk dapat bertahan hidup dan mendukung pertumbuhannya akan dijabarkan

    berikut ini :

    a. besi (Fe). Besi berperan dalam sintesis klorofil. Dalam media kultur zat besi

    terlebih dahulu dicampurkan dengan EDTA (Asam Etilen Diamin Tetraasetik).

    Zat besi tidak boleh dicampurkan secara langsung ke dalam media dikarenakan

    sifat zat besi yang tidak mudah larut sehingga dapat menimbulkan endapan.

    b. mangan (Mn). Pada tanaman yang tumbuh di tanah, kekurangan mangan dapat

    menyebabkan klorotik (tanaman berwarna pucat) dan sering menunjukkan bintik-

    bintik hitam yang tidak lain adalah kematian setempat. Dalam media kultur

    jaringan, unsur ini berguna untuk membentuk membran kloroplas.

    c. boron (B). Memegang peranan penting dalam perombakan gula. Media kultur

    yang kekurangan boron dapat mengakibatkan sintesa sitokinin dalam media

    terganggu. Bila kebanyakan boron dapat mengakibatkan tanaman mati.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 22

    d. seng (Zn). Seng merupakn unsur yang penting dalam pembentukan protoplas.

    Tanaman yang berkecukupan seng mampu memproduksi auksin IAA endogenous.

    e. kobalt (Co). Kegunaan kobalt dalam kultur jaringan adalah untuk

    pembentukan asam inti dan juga untuk mengikat unsur nitrogen.

    f. tembaga (Cu). Tembaga berperan dalam proses konversi energi.

    g. yodium (I). Unsur yodium tidak terlalu diperlukan dalam media, namun sering

    digunakan. Beberapa asam amino sering juga mengandung yodium.

    h. molibdenum (Mo). Zat ini berguna dalam proses pengikatan nitrogen dari

    atmosfer menjadi nitrat dengan bantuan bakteri pengikat N. Selain itu juga

    berguna dalam proses pembentukan klorofil. Bila diberikan secara berlebihan

    dapat merusakkan jaringan tanaman.

    3. Vitamin

    Walaupun dalam jumlah kecil, pemberian vitamin dalam media kultur

    merupakan suatu keharusan lantaran tanaman yang dikulturkan tersebut belum

    mampu untuk membuat vitaminnya sendiri. Adapun jenis vitamin yang sering

    diberikan : thiamin HCl dimana berfungsi sebagai koenzim yang membantu daur

    asam organik dalam proses respirasi; nicotinamida yaitu suatu koenzim yang

    menjadi aktif dalam reaksi cahaya; myo-inositol adalah alkohol gula; asam

    panthothenik adalah suatu jenis vitamin B yang bekerja aktif sebagai koenzim dan

    berfungsi dalam metabolisme zat lemak; vitamin B6 adalah koenzim yang

    membantu reaksi kimia dalam proses metabolisme; choline sebagai terpenoid

    yang ada dalam vitamin B kompleks dan riboflavin dimana dikenal dengan

    vitamin B2.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 23

    4. Zat pengatur tumbuh (ZPT) dan hormon

    Terdapat sebuah perbedaaan antara hormon dan zat pengatur tumbuh.

    Moore (1989) (cit. Santoso dan Nursandi 2004) mencirikan atau membedakan zat

    tersebut yakni :

    a. hormon tanaman adalah senyawa organik dan bukan merupakan nutrisi yang

    aktif dalam jumlah kecil (< 1mM) yang disintesis pada bagian tertentu, umumnya

    ditranslokasikan ke bagian lain tanaman di mana senyawa tersebut menghasilkan

    suatu respon secara biokimia, fisiologis dan morfologis.

    b. zat pengatur tumbuh (ZPT) adalah senyawa organik dan bukan merupakan

    nutrisi yang dalam konsentrasi rendah (

  • 24

    dengan kenaikan volume sel. Dengan adanya kenaikan sintesa protein, maka dapat

    digunakan sebagai sumber tenaga dalam pertumbuhan (Hendaryono dan

    Wijayani, 1994). Pengaruh auksin dalam mikropropagasi antara lain adalah untuk

    menginduksi pertumbuhan kalus, pembentukan klorofil serta morfogenesis

    (Katuuk, 1989). Mekanisme kerja dari auksin yang dapat merangsang

    pertumbuhan yaitu auksin merangsang sekresi H+. Ion K+ diambil masuk ke

    dalam sel untuk mengimbangi pengeluaran H+ yang menurunkan potensial air

    dalam sel sehingga mengakibatkan pengembangan sel. Jenis auksin sintetik yang

    sudah ada diantaranya NAA (a-naphtalene acetic acid), 2.4-D (2.4

    Dichlorophenoxy acetic acid), IBA (3-indole butyric acid), PCPA (P-

    chlorophenoxy acetic acid), IAA (3-indole acetic acid). IAA adalah juga hormon

    tumbuhan yang disintesis oleh tumbuhan itu sendiri (hormon alami).

    b. Sitokinin. Dalam alam terbuka, sitokinin diantaranya berfungsi mengatur

    pertumbuhan melalui pembelahan sel, membantu mengawasi perkecambahan biji

    dan menunda penuaan. Sedangkan pada kultur jaringan sitokinin berfungsi

    mengatur pertumbuhan serta morphogenesis. Pemberian sitokinin dengan kadar

    yang relatif tinggi, differensiasi kalus akan cenderung ke arah pembentukan

    primordia batang atau tunas (Hendaryono dan Wijayani, 1994). Sitokinin

    diproduksi didalam akar, namun demikian penambahan di dalam media masih

    tetap diperlukan. Jika yang akan dikulturkan yakni akar, maka sebaiknya sitokinin

    tidak ditambahkan. Sebaliknya apabila eksplan yang akan dikulturkan adalah

    pucuk tunas dimana produksi sitokininnya sedikit, maka diperlukan penambahan

    sitokinin di dalam media. Jenis auksin sintetik yang digunakan BAP (N6-benzyl

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 25

    amino purine), BA (benzyl adenin) dan FAP (N6-furfurylamino purine) (Katuuk,

    1989).

    5. Bahan pemadat media

    Media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat dimana eksplan tumbuh.

    Media tanam sangat mutlak keberadaannya karena pada media ini terdapat semua

    zat yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan (Hendaryono dan

    Wijayani, 1994). Eksplan yang dikulturkan harus selalu bersinggungan dengan

    medianya, tetapi tidak boleh tenggelam sehingga aerasinya baik. Media tanam

    tersebut dapat berbentuk cair atau padat. Pada media padat diperlukan bahan

    pemadat media. Idealnya, bahan pemadat media harus dapat disterilkan dengan

    autoklaf dan gel yang terbentuk ini tidak dapat dicerna oleh enzim-enzim tanaman

    serta tidak bereaksi dengan komponen media yang lainnya (Yusnita, 2003).

    Zat pemadat media yang sering digunakan yakni berupa agar-agar. Agar

    adalah berupa campuran polisakarida dari galaktosa yang diekstrak dari ganggang

    laut. Umumnya dapat membentuk gel atau memadat pada suhu 40-450C dengan

    titik cair 80-900C. Bentuk cair atau padat dari agar dapat bersifat balik (Yusnita,

    2003). Menurut Katuuk (1989) agar memiliki sifat dapat mengikat air. Dengan

    semakin tinggi konsentrasi dari agar tadi maka makin kuat dalam mengikat air.

    Kepekatan agar yang terlalu tinggi mengakibatkan sulitnya bagi eksplan untuk

    mengambil sumber hara yang terlarut dalam media. Kepekatan yang biasa

    digunakan yaitu berkisar antara 0.6-0.8%. media yang kurang kadar garam dan

    hormonnya akan lebih keras dibandingkan dengan media yang tinggi kadar garam

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 26

    dan hormonnya. Penggunaan agar biasanya sebanyak 8-10 g/l air suling

    (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

    6. Sukrosa

    Sukrosa adalah sumber energi yang diperlukan untuk induksi kalus

    (Hendaryono dan Ari, 1994), karena dalam kondisi in-vitro tanaman tidak bersifat

    autotrof. Hal ini disebabkan botol tempat tumbuh kultur bukan ditempat yang

    ideal untuk mendukung proses pertumbuhan yakni proses fotosintesis karena

    ditempatkan di tempat yang gelap (Pierik, 1987).

    Konsentrasi sukrosa optimum yang sering digunakan dalam proses

    pengkulturan berkisar 2-3% atau 20.000-30.000 mg/l (Yusnita, 2003). Tetapi

    konsentrasi sukrosa ini juga tergantung pada tipe dan umur eksplan (Pierik, 1987).

    7. Lingkungan

    Bagi tanaman yang hidup in-vitro, 5 faktor lingkungan utama yang harus

    dipenuhi ialah cahaya, suhu, pH, kelembaban dan wadah/botol kultur.

    a. cahaya. Cahaya sangat penting bagi kehidupam mikroorganisme. Bagi tanaman

    in-vitro cahaya berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan yang disebut

    fotomorfogenesis. Sehubungan dengan fotosintesis, cahaya belum begitu terlalu

    penting bagi kultur jaringan tanaman. Pertumbuhan sel kultur jaringan yang

    teratur pada dasarnya tidak dihambat oleh cahaya, malah sebaliknya pembelahan

    sel mula-mula pada eksplan serta pertumbuhan jaringan kalus acapkali

    dihambat/dibatasi oleh persoalan cahaya.

    b. suhu. Pada umumnya kultur jaringan memerlukan suhu sebesar 25-300C.

    Namun untuk pertumbuhan optimum hal ini akan berbeda-beda pada tiap spesies

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 27

    serta jenis eksperimen yang dilakukan. Suhu yang rendah dapat mempengaruhi

    perkembangan embrio.

    c. pH. Keasaman dan kebasan media juga merupakan faktor lingkungan eksplan

    yang sangat menentukan. Pada umumnya pH yang paling disukai untuk

    pertumbuhan sel adalah antara 5-6. Tetapi menurut penelitian dilaporkan bahwa

    walaupun sudah diatur, pH akan turun sebanyak 0.5 sesudah autoklaf. Kultur

    menjadi asam disebabkan oleh pembentukan asam-asam organik.

    d. kelembaban. George dan Sherrington (1984) melaporkan bahwa dalam

    penelitian Lane tentang kelembaban relatif, dia menemukan pertumbuhan tidak

    normal yang menyebabkan matinya sel. Hal ini bisa terjadi bila kelembaban

    dalam botol turun sampai 95%.

    e. wadah/botol kultur. Ukuran wadah kultur biasanya juga mempengaruhi

    pertumbuhan serta morfogenesis in-vitro. Hal ini barangkali disebabkan oleh

    perbedaan konsentrasi CO2 yang tersedia, etilen, gas lain yang berada dalam

    wadah (Katuuk, 1989).

    Beberapa media dasar yang pada umumnya diberi nama sesuai dengan

    nama penemunya, antara lain adalah :

    a. Medium dasar Murashige dan Skoog (MS) : digunakan untuk hampir semua

    macam tanaman, terutama tanaman herbaceus. Media ini mempunyai konsentrasi

    garam-garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+.

    b. Medium dasar B5 atau Gamborg : digunakan untuk kultur susupensi sel

    kedele, alfafa, dan legume lain.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 28

    c. Medium dasar White : Medium ini merupakan medium dasar dengan

    konsentrasi garam-garam mineral yang rendah.

    d. Medium Vacin Went (VW) : digunakan khusus untuk medium anggrek.

    e. Medium dasar Nitsch dan Nitsch : digunakan untuk kultur tepungsari (pollen)

    dan kultur sel.

    f. Medium dasar Schenk dan Hildebrandt : digunakan untuk kultur jaringan

    tanaman monokotil.

    g. Medium dasar Woody Plant Medium (WPM) : digunakan untuk tanaman yang

    berkayu.

    h. Medium dasar N6 : digunakan untuk tanaman serelia terutama padi

    (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

    E. Sterilisasi

    Pekerjaan yang paling berat dalam kultur jaringan yakni menciptakan serta

    memelihara kondisi aseptis. Jalan yang paling baik untuk mengatasi kehadiran

    mikrobial adalah dengan menciptakan semua yang berhubungan dengan kegiatan

    kultur jaringan bebas mikrobial, mulai dari material tanaman, perlengkapan,

    lingkungan hingga pada cara kerja. Alat maupun teknik aseptik ada bermacam-

    macam :

    1. Sterilisasi basah

    Cara sterilisasi panas basah adalah dengan menggunakan uap air. Alat yang

    digunakan pada sterilisasi ini adalah autoklaf. Alat ini biasanya digunakan

    untuk mensterilisasikan media, bahan dan instrumen yang digunakan selama

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 29

    proses pengkulturan. Hampir semua mikroba mati sesudah diberi uap air

    dengan suhu 1210C selama 10-20 menit. Lama sterilisasi ada aturannya yakni

    media 20-75 ml selama 15-20 menit dengan suhu 1210C, media 75-500 ml

    selama 20-25 menit dengan suhu 1210C, media 500-5000 ml selama 25-35

    menit dengan suhu 1210C dan peralatan gelas/kertas selama 30 menit dengan

    suhu 1300C. Manfaat mensterilkan dengan menggunakan autoklaf adalah

    prosesnya cepat, sederhana serta sanggup membasmi virus tertentu. Namun

    selain itu ada kekurangan yakni dapat menurunkan pH sekitar 0.3-0.5 unit,

    dapat merusak substansi yang mudah menguap, bila pemanasan terlau tinggi

    gula akan membatu sehingga dapat menjadi racun dalam media.

    2. Sterilisasi panas kering

    Untuk mensterilkan dengan suhu tinggi dan kering dipakai oven. Biasanya

    oven digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang tidak mudah terbakar

    misalnya bahan yang terbuat dari bahan gelas atau logam. Namun tidak semua

    alat dari bahan logam harus disterilkan dengan cara ini, alat-alat seperti mata

    pisau serta skapel tidak dapat disterilkan dengan cara ini sebab dapat merusak

    ketajaman pisau/alat. Biasanya sterilisasi untuk suhu 1600C memerlukan

    waktu 45 menit, 1700C selama 18 menit, 1800C selama 7.5 menit dan 1900C

    selama 1.5 menit. Suhu harus selalu tetap di kontrol karena pada suhu 1700C

    kertas mulai hancur.

    3. Sterilisasi memakai nyala

    Instrumen yang telah disterilkan dari oven, dikeluarkan dari bungkusnya

    kemudian dicelup ke dalam alkohol 70% kemudian disterilkan lagi dengan

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 30

    nyala, baru boleh dipakai. Setelah beberapa saat instrumen harus dicelupkan

    ke dalam etanol kemudian dibakar. Perlakuan ini berjalan terus selama

    kegiatan inokulasi yang berlangsung di dalam kotak transfer.

    4. Ultra filtrasi

    Beberapa komponen dalam media tanaman tidak stabil dan dapat terurai pada

    suhu yang tinggi. Bahan itu meliputi protein, vitamin, asam amino serta sari

    tanaman. Untuk sterilisasi, bahan ini ditapis dengan filter. Ayakan mempunyai

    lobang dengan ukuran bermacam-macam 0.2-1.0 mikron. Hasil filtrasi

    kemudian dituang dalam media.

    5. Bahan kimia

    Bahan kimia digunakan untuk membasmi mikrobial. Biasanya bahan kimia

    yang digunakan hanya untuk mensterilkan bagian permukaan saja meliputi

    material tanaman, instrumen, tangan pekerja serta ruangan/kotak transfer.

    Bahan yang biasa dipakai :

    a. Alkohol digunakan untuk mensterilkan material tanaman, instrumen,

    permukaan ruang dan kotak kultur. Untuk material tanaman dipakai alkohol

    tujuh puluh persen.

    b. Kalsium hipoklorida (Ca(OCl)2) merupakan salah satu bahan pencuci yang

    paling efektif dan kurang merusakkan jaringan.

    c. H2O2 adalah bahan pencuci yang baik karena sifatnya yang mudah terurai,

    sehingga material tanaman hanya dibilas satu kali saja.

    d. Sublimat (HgCl2) adalah bahan yang sangat beracun baik bagi tanaman,

    manusia dan hewan.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 31

    6. Cahaya

    Ruang dan kotak transfer sukar untuk disterilkan hanya dengan menggosok

    alkohol atau bahan kimia pada permukaan. Untuk itu dipakai lampu

    germicidal dengan sinar ultraviolet. Keterbatasan menggunakan sinar

    ultraviolet yakni untuk bagian yang tidak terkena cahaya maka tidak bisa

    disterilisasi, sinar ultraviolet hanya mampu mematikan bentuk bakteri dan

    jamur bukan untuk spora (Katuuk, 1989).

    F. Kromatografi Lapis Tipis

    Teknik identifikasi dan pemisahan senyawa fisikokimia yang paling

    banyak dipakai adalah teknik kromatografi. Selain menggunakan teknik

    kromatografi kertas (KKt), cara terbaik untuk memisahkan dan mengidentifikasi

    senyawa fenol sederhana adalah dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Kelebihan

    KLT adalah keserbagunaan, kecepatan, dan kepekaannya (Harborne, 1987).

    Senyawa fenol dideteksi setelah hidrolisis jaringan tanaman (segar atau

    kering) dalam suasana asam, basa, atau setelah pemekatan ekstrak tanaman

    (Harborne, 1987). Senyawa yang dipisahkan berupa larutan, ditotolkan pada fase

    diam dalam bentuk bercak atau garis. Fase diam yang terdiri atas bahan butiran

    halus, ditempatkan pada pelat penyangga gelas atau logam. Campuran akan

    dipisahkan berupa larutan akan ditotolkan dan menghasilkan bercak. Fase diam

    ini kemudian diletakkan dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan

    pengembang yang sesuai (fase gerak). Pemisahan terjadi selama perambatan

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 32

    kapiler (pengembangan), dan bercak pemisahan dideteksi dengan pereaksi-

    pereaksi yang lazim untuk senyawa yang dimaksud (Stahl, 1985).

    1. Fase diam

    Lapisan dibuat dari salah satu fase diam yang khusus digunakan untuk

    kromatografi lapis tipis yang dihasilkan oleh berbagai perusahaan. Dua sifat yang

    penting dari fase diam adalah besar partikel serta homogenitasnya, karena adesi

    terhadap penyokong sangat tergantung pada mereka. Partikel yang butirannya

    sangat besar tidak akan memberikan hasil yang baik dan salah satu alasan untuk

    menaikkan hasil pemisahan adalah menggunakan fase diam yang butirannya

    halus. Sebelum digunakan lapisan disimpan dalam lingkungan yang tidak lembab

    serta bebas dari uap laboratorium (Sastrohamidjojo, 2002).

    Kebanyakan fase diam yang digunakan adalah silika gel. Silika gel yang

    digunakan kebanyakan diberi pengikat (binder), yang dimaksudkan untuk

    memberi kekuatan pada lapisan, serta menambah adesi pada gelas penyokong.

    Pengikat yang paling sering digunakan yaitu kalsium sulfat. Tetapi biasanya

    dalam perdagangan, silika gel telah diberi pengikat dan diberikan nama dengan

    kode silika gel G (Sastrohamidjojo, 2002).

    Untuk memisahkan terpena berdasarkan jumlah ikatan rangkap ialah

    menggunakan plat KLT silika gel yang waktu penyaputannya menggunakan

    bubur silika gel yang dibuat dengan larutan 2.5% AgNO3 dalam air, sebagai

    pengganti air (Harbone, 1987).

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 33

    2. Fase gerak

    Pada kromatografi lapis tipis, fase gerak biasanya terdiri dari atas satu atau

    beberapa pelarut. Fase ini bergerak terhadap fase diam, yaitu suatu lapisan

    berpori, karena ada gaya kapiler. Pelarut yang digunakan harus mempunyai

    kualitas analitik dan bila diperlukan, sistem pelarut multikomponen ini harus

    berupa suatu campuran sesederhana mungkin dengan maksimum tiga komponen

    (Stahl, 1969).

    Pada saat penggunaan fase gerak campuran beberapa pelarut organik

    sebaiknya mempunyai kepolaran yang serendah mungkin. Salah satu alasan

    penggunaan itu untuk mengurangi serapan dari setiap komponen dari campuran

    pelarut. Pelarut mempunyai sifat kepolaran yang tinggi dalam campuran akan

    mengakibatkan perubahan sistem menjadi sistem partisi dan campuran larutan

    fase gerak dapat dikatakan baik jika dapat memberikan kekuatan bergerak sedang

    (Sastrohamidjojo, 2002).

    3. Penempatan cuplikan

    Penotolan sampel pada kromatografi lapis tipis menggunakan alat

    mikropipet berujung runcing. Pada penotolan sampel diusahakan sedekat mungkin

    dengan lempeng. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan cuplikan sedapat

    mungkin larutan yang mudah menguap dan mempunyai polaritas rendah. Garis

    akhir dapat dibuat dengan menandai lapisan dengan jarak rambat fase gerak

    sepuluh hingga lima belas sentimeter (Sastrohamidjojo, 2002).

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 34

    4. Elusi

    Bila sampel telah ditotolkan, lapisan kemudian dimasukkan ke dalam

    bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap pelarut fase

    gerak yang digunakan. Lempeng fase diam dicelupkan dalam fase gerak sedalam

    kira-kira 0.5-1.0 cm. Bejana kromatografi ditutup rapat untuk meyakinkan

    homogenitas atmosfer dalam bejana, maka dinding dalam bejana dilapisi dengan

    lembaran kertas saring yang ujungnya direndam dalam fase gerak

    (Sastrohamidjojo, 2002).

    Dalam kromatografi lapis tipis terdapat dua metode pengembangan yaitu :

    a. Pengembangan sinambung, yakni membiarkan bagian atas lempeng menjulur

    keluar melalui sebuah celah pada tutup bejana kromatografi. Bila fase gerak telah

    mencapai celah itu maka akan terjadi penguapan yang sinambung, mengakibatkan

    aliran pelarut yang tetap pada lempeng (Anonim, 1995b).

    b. Pengembangan berulang, yakni setelah dilakukan pengembangan kemudian

    dikeringkan lalu dikembangkan lagi pada sistem pelarut yang sama ataupun yang

    berbeda hingga didapatkan pemisahan yang baik. Ini sangat berguna pada

    pemisahan senyawa yang mempunyai perbedaan polaritas (Moffat, 1986).

    5. Deteksi

    Pada kromatografi lapis tipis, bercak dari senyawa umumnya tidak

    berwarna sehingga untuk menentukan bercak tersebut dapat dilakukan secara

    fisika dan kimia.

    a. Fisika. Metode-metode fisika yang sering digunakan meliputi fluoresensi sinar

    ultraviolet serta pencacahan radioaktif. Pada senyawa-senyawa yang dapat

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 35

    berfluoresensi maka bercak akan terlihat di bawah sinar ultraviolet. Namun jika

    senyawa tersebut tidak berfluoresensi ditentukan dengan indikator fluoresensi

    pada fase diam sehingga pada bercak akan terlihat hitam sedangkan tempat yang

    tanpa bercak berfluoresensi (Stahl, 1969).

    b. Kimia. Metode kimia yang sering digunakan untuk mendeteksi bercak pada

    kromatografi lapis tipis dengan menyemprotkan suatu pereaksi kimia. Senyawa-

    senyawa organik dapat dilakukan dengan penyemprotan H2SO4 pekat. Untuk

    pembentukan warna yang optimal diperlukan suhu 2000C kurang lebih selama 10

    menit, noda yang akan teramati berwarna hitam. Cara ini efektif untuk

    menentukan bercak tetapi tidak baik untuk identifikasi (Sastrohamidjojo, 2002).

    6. Penilaian kromatografi

    Jarak pengembangan senyawa pada kromatografi lapis tipis biasanya

    dinyatakan dengan angka Rf atau hRf .

    Jarak rambat bercak Rf = Jarak rambat fase gerak

    Angka Rf berjarak antara 0.00-1.00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal.

    Sedangkan hRf ialah angka Rf dikalikan faktor 100 menghasilkan nilai berjarak 0-

    100.

    Dalam mengidentifikasi bercak pada pelat kromatogram lazimnya

    menggunakan harga Rf (retardation factor). Rf didefinisikan sebagai jarak yang

    ditempuh oleh senyawa dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh garis depan

    pengembang. Karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0 (Markham, 1988).

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 36

    Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi harga Rf dalam kromatografi

    lapis tipis adalah :

    a. sifat dari penyerap serta derajat aktivitasnya.

    b. tebal serta kerataan lapisan; ketidakrataan lapisan penyerap akan

    menyebabkan aliran pelarut menjadi tidak rata pada daerah plat sehingga harga Rf

    juga tidak sama.

    c. kemurnian fase gerak; pelarut yang tidak murni akan memberikan pemisahan

    yang tidak baik. Demikian pula jika fase gerak yang digunakan berupa campuran,

    maka perbandingan yang dipakai harus diperhatikan.

    d. kejenuhan bejana kromatografi; pemisahan yang dilakukan dalam bejana yang

    mempunyai kejenuhan tidak sama mengakibatkan harga Rf tidak sama.

    e. suhu; pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini untuk

    mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh

    penguapan atau perubahan fase. Jumlah cuplikan yang berlebihan memberikan

    tendensi noda berbentuk ekor yang akan mengakibatkan kesalahan harga Rf.

    f. kesetimbangan; pada bejana kromatografi yang tidak jenuh dengan uap pelarut

    akan menyebabkan pada saat pengembangan untuk permukaan pelarut yang

    cekung dan ini akan mengakibatkan fase gerak lebih cepat merambat pada bagian

    tepi daripada bagian tengah. Hal ini mengakibatkan kesalahan dalam penentuan

    harga Rf (Sastrohamidjojo, 1991).

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 37

    G. KETERANGAN EMPIRIS

    Penelitian tentang profil pertumbuhan kalus daun lembaga dari biji

    tanaman Jatropha curcas L. pada media White dengan menggunakan teknik

    kultur jaringan ini diharapkan dapat memberikan gambaran mengenai daun

    lembaga dari biji tanaman Jatropha curcas yang dapat membentuk kalus dengan

    teknik kultur jaringan, bentuk profil pertumbuhan kalus daun lembaga dari biji

    tanaman Jatropha curcas dalam media White dengan konsentrasi tertentu

    Naphthaleneacetic acid (NAA) dan Benzylaminopurine (BAP) serta

    membandingkan hasil KLT kalus daun lembaga yang berasal dari biji tanaman

    Jatropha curcas dengan biji tanaman asalnya untuk mengetahui kesamaan

    kandungan golongan terpenoidnya.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 38

    BAB III

    METODOLOGI PENELITIAN

    A. Jenis dan Rancangan Penelitian

    Penelitian profil pertumbuhan kalus daun lembaga biji tanaman Jatropha

    curcas pada media White dengan menggunakan teknik kultur jaringan ini,

    termasuk dalam jenis penelitian non-eksperimental deskriptif dengan rancangan

    acak lengkap pola searah yakni subjek uji tidak mendapatkan perlakuan selama

    penelitian dan setiap sampel mempunyai kesempatan yang sama untuk dilakukan

    pencuplikan dimana sifat penelitian ini adalah melaporkan (mendeskripsikan)

    hasil data yang ada selama penelitian.

    B. Definisi Operasional

    1. Daun lembaga yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun lembaga dari

    biji yang terdapat di dalam buah tanaman Jatropha curcas yang berusia ± 2

    bulan dari saat berbunga, bagian yang dipergunakan adalah daun lembaga tidak

    termasuk mata tunasnya. Daun lembaga inilah sebagai subjek uji penelitian.

    2. Inisiasi kalus adalah terbentuknya kalus pertama kali yang ditandai dengan

    bintik putih pada pinggir eksplan.

    3. Bobot kalus basah awal adalah hasil pengurangan bobot media + botol + kalus

    dengan bobot botol + media pada saat subkultur.

    4. Bobot kalus kering adalah bobot kalus pada saat pemanenan dan sudah

    mengalami proses pengeringan di dalam oven pada suhu 40-500C, sampai

    38

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 39

    diperoleh kalus dengan bobot konstan yaitu antara penimbangan yang pertama

    dan berikutnya selama 1 jam tidak berbeda 0.5 mg.

    5. Pertumbuhan kalus adalah bobot kalus basah akhir dikurangi dengan bobot

    kalus basah awal.

    6. Waktu inisiasi adalah waktu yang dibutuhkan oleh eksplan untuk

    menumbuhkan kalus yang dihitung dari saat penanaman eksplan sampai hari

    pertama kalus mulai tumbuh/muncul.

    7. Persen kadar air adalah bobot kalus basah dikurangi dengan bobot kalus kering

    lalu dibagi dengan bobot kalus basah dikali dengan 100%.

    8. Metabolit sekunder yang terkandung di dalam kalus sama dengan metabolit

    yang ada pada biji menandakan bahwa keduanya sama-sama menghasilkan

    metabolit yang sama yakni golongan terpenoid.

    9. Konsentrasi zat pengatur tumbuh yaitu Naphthaleneacetic acid (NAA) dan

    Benzylaminopurine (BAP) dalam media White yang digunakan adalah 2:2.

    C. Bahan dan Alat

    1. Bahan

    Bahan utama yang dibutuhkan untuk proses kultur jaringan yang nantinya akan

    ditumbuhkan yakni daun lembaga dari biji yang terdapat di dalam buah tanaman

    Jatropha curcas. Biji yang digunakan yakni berasal dari buah tanaman Jatropha

    curcas yang diambil dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata

    Dharma, Dusun Paingan, Desa Maguwohardjo, Kecamatan Depok, Kabupaten

    Sleman, Yogyakarta.

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 40

    a. Bahan-bahan kimia yang digunakan antara lain :

    1). bahan untuk kultur jaringan tanaman

    a). bahan media kultur:

    (1). unsur-unsur makro

    (a). kalium nitrat, Merck, Germany, 105063.

    (b). kalium klorida, Merck, Germany, 104936.

    (c). kalsiumnitrat-tetrahidrat, Merck, Germany, 102121.

    (d). magnesiumsulfat-heptahidrat, Merck, Germany, 105886.

    (e). natriumdihidrogenfosfat-monohidrat, Merck, Germany, 106346.

    (f). natrium sulfat, Merck, Germany, 106649.

    (2). unsur-unsur mikro

    (a). asam borat, Merck, Germany, 100165.

    (b). besi (II) sulfat-heptahidrat, 103965.

    (c). kalium iodida, Merck, Germany, 105043.

    (d). mangansulfat-tetrahidrat, BDH Limited Poole, England, 10153.

    (e). sengsulfat-heptahidrat, Merck, Germany, 108883.

    (3). vitamin

    (a). asam nikotinat, Calbiochem, US dan Canada, 481918.

    (b). piridoksin (B6), Bratako, Chemika, Bandung, Indonesia.

    (c). tiamin (B1), Bratako, Chemika, Bandung, Indonesia.

    (4). sumber karbon : sukrosa, Merck, Germany, 107653.

    (5). agar, Mkr Chemicals.

    (6). zat pengatur tumbuh

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 41

    (a). 6-bensilamino-purin, Sigma Chemicals, Germany, B-3408.

    (b). 1-naphthylasetic acid, Merck, Germany, S.22687.743.

    b). desinfektan

    (1). alkohol 70% derajat kemurnian teknis.

    (2). natrium hipoklorida, Bayclin.

    2). bahan untuk kromatografi lapis tipis :

    a). aseton, Merck, Germany, 100014.

    b). asam sulfat, Merck, Germany, 100731.

    c). etil-asetat, Merck, Germany, 109623.

    d). kloroform, Merck, Germany, 102445.

    e). metanol, J.T. Baker, USA, 9070-68.

    f). n-hexane, Merck, Germany, 104367.

    g). antimon triklorida, Merck, Germany, 107838.

    h). perak nitrat, Merck, Germany, 101512.

    i). plate KLT Silica-Gel GF 254, Merck, Germany, 5553.

    j). vanilin, Merck, Germany, 8510.

    k). asam asetat glasial, J.T Barker, USA, 9573-05.

    2. Alat

    a. Alat yang digunakan selama proses kultur jaringan : botol kultur (Schott

    Duran), alat-alat gelas, glassfine, pinset, skapel, autoklaf (YX 400Z Shanghai

    Sanshen, Medical Inst, Co, LTD), oven (Marius Instrument, German),

    inkubator (Heraeus Tamson, Holland), pemanas listrik (Ika Combimag, RCT,

    German), Timbangan analitik (Scaltec), Laminar Air Flow, lampu UV, kertas

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 42

    pH, kertas saring, sprayer, refrigerator (Sharp) sterear dan aluminium foil

    (Heavy-Duty, Total-Wrap).

    b. Alat untuk penyarian : alat gelas, waterbath.

    c. Alat untuk KLT : lempeng KLT silika gel GF 254, bejana KLT, alat gelas,

    pipa kapiler, penyemprot bercak, lampu UV 254 dan 365 nm.

    D. Tata Cara Penelitian

    1. Determinasi tanaman

    Determinasi tumbuhan Jatropha curcas dilakukan di Laboratorium

    Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

    Yogyakarta dengan menggunakan acuan buku “Flora of Java” (Backer dan Van

    den Brink, 1963; 1985).

    2. Pemilihan eksplan

    Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun lembaga dari

    biji Jatropha curcas yang telah disterilkan terlebih dahulu. Sterilisasi dilakukan

    dengan cara melewatkan eksplan di atas api bunsen, namun hati-hati jangan

    sampai mengenai lidah api bunsen (terbakar) karena eksplan ini tidak terlalu tahan

    panas. Apabila terlalu panas maka eksplan akan gosong. Kriteria daun lembaga

    dari biji yang digunakan yakni masih muda (masih berair), kenyal (seperti jelly),

    dan yang digunakan bagian tengah daun lembaga.

    3. Pengumpulan bahan

    Bahan utama yang digunakan adalah buah Jatropha curcas yang diambil

    dari tanaman Jatropha curcas yang tumbuh sehat dan subur dengan spesifikasi

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 43

    diameter buah yakni 3-3.5 cm sebagai parameter pemilihan buah yang akan

    digunakan. Daun lembaga yang berasal dari biji dimana biji tersebut terdapat di

    dalam buah tanaman Jatropha curcas, adalah buah yang masih segar, muda dan

    bersih (sehat). Sedangkan biji yang digunakan sebagai pembandingnya diperoleh

    dari buah yang sudah tua berwarna kuning kehitaman yang berumur ± 5 bulan

    dari saat berbunga. Buah kemudian dicuci dan dikupas untuk diambil bijinya

    kemudian dibelah dan di iris tipis-tipis kemudian dikeringkan. Hal ini dilakukan

    untuk menghentikan reaksi enzimatik yang mungkin terjadi di dalam jaringan

    tumbuhan sehingga tidak terjadi penurunan kadar zat aktif. Pengeringan dianggap

    cukup bila irisan yang didapatkan telah rapuh dan mudah dipatahkan. Tanaman

    Jatropha curcas diambil dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata

    Dharma, Dusun Paingan, Desa Maguwohardjo, Kecamatan Depok, Kabupaten

    Sleman, Yogyakarta.

    4. Pembuatan stok

    a. pembuatan larutan stok hara makro. Stok makro White dengan kepekatan

    lima mililiter/liter. Pembuatan dimulai dengan pertama-tama menyiapkan gelas

    piala dengan ukuran 500 ml yang diisi dengan 300 ml aquades kemudian

    masukkan 8000 mg kalium nitrat aduk hingga jernih. Tambahkan 30000 mg

    kalsium nitrat dihidrat aduk lagi hingga jernih lalu tambahkan 72000 mg

    magnesium sulfat heptahidrat aduk hingga jernih kemudian tambahkan 6500 mg

    kalium klorida dan aduk hingga homogen, 16500 mg natrium dihidrogenfosfat

    hidrat, 20000 mg natrium sulfat kemudian aduk hingga homogen. Lalu tambahkan

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 44

    aquadest hingga tanda. Untuk 1 liter media dibutuhkan 5 ml larutan dari stok

    makro.

    b. pembuatan larutan stok hara mikro. Stok mikro White dengan kepekatan lima

    mililiter/liter. Pembuatan dimulai dengan pertama-tama menyiapkan gelas piala

    dengan ukuran 500 ml yang diisi dengan 300 ml aquades kemudian masukkan 700

    mg mangan sulfat tetrahidrat aduk hingga jernih. Tambahkan 300 mg seng sulfat

    heptahidrat aduk lagi hingga jernih lalu tambahkan 150 mg asam borat aduk

    hingga jernih kemudian tambahkan 75 mg kalium iodida dan aduk hingga

    homogen kemudian tambahkan 250 mg besi (II) sulfat lalu di aduk hingga

    homogen. Kemudian tambahkan aquadest hingga tanda. Untuk 1 liter media

    dibutuhkan 5 ml larutan dari stok mikro.

    c. pembuatan larutan stok vitamin. Stok vitamin White dengan kepekatan 5 ml/L.

    Pembuatan dimulai dengan pertama-tama menyiapkan gelas piala dengan ukuran

    lima ratus mililiter yang diisi dengan 300 ml aquades kemudian masukkan 10 mg

    thiamin HCl aduk hingga jernih. Tambahkan 50 mg asam nikotinat aduk lagi

    hingga jernih lalu tambahkan 10 mg piridoksin HCl aduk hingga jernih. Lalu

    tambahkan aquadest hingga tanda. Untuk 1 liter media dibutuhkan 5 ml larutan

    dari stok vitamin.

    5. Pembuatan media

    Aquadest sebanyak kurang lebih 300 ml dipanaskan dalam Beaker Glass

    seribu mililiter. Masukkan bahan- bahan nutrisi makro ke dalam Beaker Glass,

    sambil terus diaduk dengan pengaduk stirer. Larutan stok hara mikro sebanyak 5

    ml dimasukkan dalam campuran media. Stok vitamin sebanyak 5 ml selanjutnya

    PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  • 45

    juga dimasukkan dalam campuran media. Berturut- turut masukkan 30 g sukrosa

    dan 8-10 g agar. Selanjutnya tambahkan aquadest sampai kurang lebih 1000 ml,

    aduk, dan panaskan sampai jernih. Setelah jernih dan mendidih, angkat Beaker

    Glass dari pemanas. Tambahkan zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin.

    Tambahkan zat pengatur tumbuh auksin (Naphthaleneacetic acid (NAA)) dan

    sitokinin Benzy