PRODUKSI LIPASE DARI Aspergillus niger DALAM BIOREKATOR

ERLENMAYER

ABSTRAK

Percobaan mengenai aktivitas enzim lipase yang diproduksi oleh Aspergillus niger

pada bioreaktor erlenmeyer 100 ml telah dilakukan. Medium fermentasi terdiri

MgSO4.7H2O 0,5 g/l, KH2PO4 1 g/l, NaNO3 3 g/l, pepton 30 g/l, glukosa 10 g/l

dan 1% (w/v) minyak . Proses fermentasi dilakukan selama 5 hari. Aktivitas lipase

tertinggi 4800 U/ml terjadi pada hari ke-2. pH media pada aktivitas tertinggi

sebesar 4. Mukosa habis dikonsumsi pada hari ke-2.

PENDAHULUAN

Fermentasi adalah proses yang memanfaatkan kemampuan mikroba untuk

menghasilkan metabolit atau enzim yang diinginkan di bawah kondisi optimal

atau suatu lingkungan yang dikendalikan (Crueger dan Crueger, 1984).

Proses pertumbuhan mikroba merupakan tahap awal proses fermentasi

yang dikendalikan terutama dalam pengembangan inokulum agar dapat diperoleh

sel hidup. Pengendalian dilakukan dengan pengaturan kondisi medium, komposisi

medium, suplai O2 dan agitasi. Jumlah mikroba dalam fermentor juga

dikendalikan sehingga tidak terjadi kompetisi dalam penggunaan nutrisi.

Pengendalian diperlukan karena pertumbuhan biomassa dalam suatu medium

fermentasi dipengaruhi oleh banyak faktor baik ekstraseluler maupun intraseluler.

Faktor intraseluler meliputi struktur, mekanisme dan genetika, sedangkan faktor

ekstraseluler meliputi kondisi lingkungan seperti pH, suhu dan aerasi (Crueger

dan Crueger, 1984).

Dalam prose fermentasi terdapat dua komponen penting yaitu biokatalis

berupa enzim atau sel mikroba dan kondisi lingkungan. Lingkungan optimal dapat

dicapai dengan menempatkan wahana yang disebut bioreaktor (Mangunwidjaya

dan Suryani, 1994). Bioreaktor menjadi wahana penting dalam industri yang

menggunakan reaksi-reaksi biokimiawi yang dikatalisis oleh sel atau enzim.

Salah satu enzim yang bisa dihasilkan dari proses fermentasi adalah enzim

lipase. Lipase merupakan kelompok enzim yang secara umum berfungsi dalam

1

hidrolisis lemak, mono-, di-, dan trigliserida untuk menghasilkan asam lemak

bebas dan gliserol (Falony, et al., 2006). Enzim ini juga digunakan dalam

hidrolisis triasilgliserol (TAG) menghasilkan diasilgliserol (DAG) dan asam

lemak bebas (Putanto, et al., 2006).

Gambar 1. Reaksi hidrolisis trigliserida (Berg et al., 2006)

DAG adalah ester gliserol dengan dua molekul asam lemak. DAG

digunakan sebagai bahan pengemulsi dan penstabil produk-produk makanan,

kosmetika, dan farmasetika. Lipase terbukti dapat digunakan sebagai biokatalis

untuk meningkatkan kualitas crude palm oil (CPO) yang lebih baik yaitu minyak

sehat (healthy oil).

Pemanfaatan enzim lipase di dalam industri pangan maupun non pangan

semakin meningkat. Pada industri pangan, lipase banyak digunakan dalam industri

susu (hidrolisis lemak susu), industri roti dan kue (meningkatkan aroma dan

memperpanjang umur simpan), industri bir (meningkatkan aroma dan

mempercepat fermentasi), industri bumbu (meningkatkan kualitas/tekstur), serta

pengolahan daging dan ikan (meningkatkan aroma dan mengubah lemak).

Sedangkan pada industri non pangan, lipase digunakan pada industri kimia dan

obat-obatan (transesterifikasi minyak alami), industri oleokimia (hidrolisis

lemak/minyak), industri detergen (melarutkan spot minyak/lemak), industri obat-

obatan (mempermudah daya cerna minyak/lemak dalam pangan), kedokteran

(analisis trigliserida dalam darah), industri kosmetik (mengubah lemak), dan

industri kulit (mengubah lemak dalam jaringan lemak). Pemanfaatan lipase pada

industri lemak dan minyak untuk mengubah bentuk fisik dan kimia minyak dan

lemak alami menjadi produk yang bernilai tambah lebih tinggi.

Lipase dapat dihasilkan dari tanaman, hewan, manusia, yeast, jamur, dan

bakteri. Kelompok yeast yang dapat manghasilkan lipase adalah dari Candida

rugosa, dan dari kelompok jamur adalah Aspergillus niger dan Penicillium

2

aurantiogriseum . Adapun pada kelompok bakteri, lipase yang dihasilkan adalah

dari genera Bacillus, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Arthrobacter,

Chromobacterium, Serratia, Vibrio, Aeromonas, dan Staphyloccus (Nurosid,

2008).

Kapang adalah penghasil enzim yang diproduksi secara ekstraseluler.

Produksi lipase oleh kapang dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya, pH,

suhu, sumber karbon dan sumber nitrogen (Rani and Panneerselvam, 2009).

Lipase ekstraseluler telah dikenal sebagai biokatalis yang selektif dan efisien pada

beberapa industri misalnya biosensor, kimia, farmasi, pestisida makanan,

kosmetik dan detergen (Pera, et al., 2006).

Kapang Aspergillus niger merupakan salah satu sumber penghasil enzim

lipase. Aspergillus niger merupakan mikroba jenis kapang yang dapat tumbuh

cepat dan tidak membahayakan karena tidak menghasilkan mikotoksin. Selain itu,

penggunaannya mudah karena banyak digunakan secara komersial dalam

produksi asam sitrat, asam glukonat dan beberapa enzim seperti amilase,

pektinase, amilo-glukosidase dan selulase. Aspergillus niger memiliki daya

amilolitik dan proteolitik yang cukup baik, serta dapat menghasilkan enzim fitase

ekstraselluler. Hasil fermentasinya dapat digunakan sebagai sumber protein sel

tunggal (PST) dan media biakannya sebagai sumber energi potensial.

Kapang merupakan mikroba yang 80% kebutuhan substratnya dipenuhi

oleh makromolekul yang memiliki rantai karbon. Beberapa jenis kapang diketahui

tumbuh pada habitat yang mengandung minyak, misalnya tandan kelapa sawit

(Rifaat, et al., 2010).

Produksi lipase memerlukan sumber karbon yang dapat berasal dari lipid

atau karbohidrat. Untuk memproduksi enzim lipase pada umumnya menggunakan

induser berupa minyak zaitun untuk memacu produksinya (Falony, et al., 2006).

Pada praktikum ini memanfaatkan minyak goreng sawit sebagai induser, karena

minyak goreng sawit ini merupakan produk lokal yang keberadaannya melimpah.

3

BAHAN DAN METODE

Bahan yang digunakan dalam percobaan adalah kapang Aspergillus niger,

Potato Dextrose Agar, minyak 1% (b/v), ekstrak khamir 1 g/l, MgSO4.7H2O 0,5

g/l, KH2PO4 1 g/l, NaNO3 3 g/l, pepton 30 g/l, glukosa 10 g/l.

Alat yang digunakan adalah spektrofotometer, tabung reaksi, gelas ukur,

timbangan, vortex, erlenmeyer, labu ukur, pipet, kertas pH, shaker, autoklaf,

kertas saring, oven, alat titrasi dan alat vakum.

Regenasi Kultur Aspergillus niger

Aspergillus niger dari stok kultur ditumbuhkan pada media PDA miring

dan diinkubasi pada suhu ruang. Setelah berumur 5 hari, Aspergillus niger siap

untuk digunakan.

Pembuatan Media Propagasi

Pembuatan media propagasi dilakukan dengan melarutkan 0,05 g

MgSO4.7H2O, 0,1 g KH2PO4, 0,3 g NaNO3, 0,1 g ektrak khamir, 3 g pepton dan 1

g glukosa dengan 100 ml aquades pada erlenmeyer, yang sebelumnya sudah

ditambah dengan minyak 1% sebanyak 2. Pada saat pembuatan media, larutan

gula dipisahkan dengan bahan media lainnya. Selanjutnya media diatur pH-nya

menjadi 7 dan disterilisasi pada suhu 121oC, selama 15 menit.

Pembuatan Media Fermentasi

Pembuatan media fermentasi dilakukan dengan melarutkan minyak 1%

(b/v), ekstrak khamir 1 g/l, MgSO4.7H2O 0,5 g/l, KH2PO4 1 g/l, NaNO3 3 g/l,

pepton 30 g/l, glukosa 10 g/l. Pada saat pembuatan media, larutan gula dipisahkan

dengan bahan media lainnya. Volume untuk seluruh erlenmeyer adalah 1,2 liter.

Selanjutnya media diatur pH-nya menjadi 7 dan disterilisasi pada suhu 121oC

selama 15 menit.

Produksi Lipase

Kapang Aspergillus niger yang telah tumbuh pada media agar miring,

diberi aquades steril sebanyak 10 ml. Kemudian spora A. niger dilepaskan dari

4

agar dengan menggunakan ose. Selanjutnya spora A. niger diinokulasi pada media

propagasi sebanyak 5% (v/v) dan diinkubasi pada inkubator goyang (shaker) pada

suhu kamar selama 24 jam.

Suspensi A. niger yang sudah tumbuh pada media propagasi

diinokulasikan pada kedua jenis bioreaktor sebanyak 5% (v/v) dan diinkubasi

pada inkubator goyang (shaker) pada suhu kamar. Selanjutnya pengamatan dan

pengambilan sampel dilakukan setiap hari selama hari.

Pengukuran pH

Pengukuran pH dilakukan dengan mengambil sampel dengan volume

tertentu, kemudian kertas pH dimasukkan ke dalam suspensi tersebut. Selanjutnya

hasil pengukuran dibandingkan dengan indikator pH

Pengukuran Biomassa

Pengukuran biomassa dilakukan dengan mengambil sampel dengan

volume tertentu, kemudian disaring pada kertas saring yang telah dikeringkan dan

diketahui bobotnya. Selanjutnya kertas saring yang telah berisi biomassa

dikeringkan dalam oven 50oC sampai beratnya konstan. Biomassa dihitung

sebagai bobot residu kering hasil penyaringan per ml cairan kultivasi.

Pengukuran Gula Pereduksi

Pengukuran gula pereduksi dilakukan dengan memasukkan 1 ml sampel ke

dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan pereaksi DNS sebanyak 3 ml.

Selanjutnya dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit kemudian

didinginkan. Setelah itu sampel diukur absorbansinya dengan menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm. Selanjutnya nilai absorbansi

diplotkan pada kurva standar untuk dapat mengetahui nilai kadar gula sisa.

Pengukuran aktifitas enzim

Pengukuran aktifitas enzim dilakukan dengan memasukkan 2 g minyak

filma ke dalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan 4 ml buffer asetat 0,05 M pH

5.6, 1 ml CaCl2 1 M dan 1 ml larutan enzim. Selanjutnya campuran larutan

5

tersebut d

diinaktiva

PP 1% 2-3

jambu.

HASIL P

Gambar 2

diinkubasi

asi dengan a

3 tetes dan

ENGAMA

Ko

. Hubungan

pada hot

aseton:butan

dititrasi den

plate stir

nol (1:1) 10

ngan KOH

er 30oC s

0 ml. Setelah

0,01 N sam

selama 1 j

h itu ditamb

mpai terbent

jam. Kemu

bahkan indi

tuk warna m

udian

ikator

merah

ATAN

Tabel 1. DData kurva standar gluukosa

onsentrasi (mM)

0 50

100 150 200 250

AUlanga

00,0180,2010,4550,6790,888

n antara Kon

bsorbansi (n 1 Ula

nsentrasi glu

(λ550) angan 2

0,073 0,091 0,274 0,528 0,752 0,961

ukosa dengan Absorbaansi pada 5550 nm

6

Gambar

Gam

PEMBAH

Se

sempurna

3. Hubunga

mbar 4. Hubu

HASAN

lama masa

seperti bo

an antara bi

gula sisa

ungan antar

a inkubasi,

ola yang m

iomassa yan

a ( ) dan p

ra biomassa

dihasilkan

sel A. n

menandakan

ng dihasilka

pH larutan (

a ( ) denga

n ( )

niger pada

terbentukn

an ( ) deng

)

an aktivitas

mulanya

nya miselia

gan konsent

trasi

lipase yangg

berbentuk

a dengan uk

bulat

kuran

7

yang hampir seragam. Hal ini berarti kultur tersebut secara keseluruhan mendapat

asupan nutrisi yang sama sehingga dapat tumbuh secara seragam. Namun pada

perkembangan selanjutnya terjadi kompetisi yang bila dilihat tampak pada

kepadatan sel yang terdapat dalam labu erlenmeyer. Pengocokan yang kurang

merata mengakibatkan sebagian sel berada di atas permukaan dan sebagian tetap

berada di bagian bawah permukaan. Sel yang terdapat di atas permukaan

menghasilkan spora berwarna hitam, sel yang kurang intens kontak dengan media

berakibat pada kurang produktif dalam menghasilkan enzim lipase karena

inducernya berada di larutan.

Penambahan minyak pada media berfungsi sebagai inducer untuk

merangsang agar sel dapat menghasilkan enzim lipase seperti yang diungkapkan

oleh Pera et al (2006) bahwa penambahan minyak zaitun (olive oil) merangsang

pembentukan enzim lipase A. niger strain MYA 135 dibanding dengan media

tanpa penambahan minyak zaitun.

Biomassa

Dari percobaan diperoleh hasil terjadinya peningkatan biomassa selama

masa inkubasi dengan jumlah total biomassa yang terbentuk sebanyak 26,42 g/l.

Terjadi peningkatan jumlah biomassa sebanyak 195%. Peningkatan biomassa ini

sejalan dengan penurunan konsentrasi gula sebagai substratnya.

Pola pertumbuhan A.niger meningkat hingga hari ke 2, kemudian

cenderung mendatar hingga hari ke 3 dan terjadi penurunan pada hari ke-4.

Kenaikan yang terjadi pada hari ke-5 tidak tampak signifikan sehingga dapat

dianggap konstan karena konsentrasi glukosa pada hari ke-5 sudah habis.

pH

Nilai pH lingkungan merupakan faktor yang sngat menentukan dalam

pembentukan miselia dan produksi enzim lipase pada A niger (Rifaat et al., 2010).

Pada masa inisial, pH kultur awal adalah 6, hal ini menurut penelitian Falony et al

(2006) merupakan pH optimum untuk aktivitas lipase dan pada pH ini juga

mendukung kestabilan enzim lipase dari A. niger J1. Hal serupa juga diperoleh

dari penelitian Crueger et al (1993) yang menggunakan A. niger tipe lain.

8

Pada 48 jam setelah inkubasi, terjadi penurunan pH hingga mencapai 4

dari nilai pH awal 6. Hal ini dapat dijelaskan dengan melihat aktivitas enzim

lipase yang terbentuk selama kurun waktu tersebut. Sel memproduksi lipase pada

kurun 48 jam pengamatan, sehingga terjadi degradasi trigliserida (minyak)

menjadi asam lemak yang bersifat asam karena gugus karboksil yang ada di

ujungnya. Akumulasi asam lemak yang terbentuk megakibatkan tingginya

konsentrasi ion hidrogen yang berakibat pada penurunan pH larutan.

H3C-(CH2)n-COOH H3C-(CH2)n-COO- + H+

Ionisasi asam lemak pada larutan menghasilkan ion hidrogen (H+) yang berakibat pada penurunan pH larutan.

Selama masa inkubasi terjadi fluktuasi pH yang menandakan terjadinya

metabolisme, hal ini ditandai dengan menurunnya konsentrasi glukosa karena

dikonsumsi oleh sel untuk pertumbuhannya. Nilai pH pada awal reaksi adalah 6

kemudian menurun setelah 48 jam pertama menjadi 4.

Setelah hari ke-2 terjadi trend peningkatan pH hingga khirnya mencapai

pH 5,5. Hal ini diakibatkan oleh terakumulasinya produk hasil metabolisme

A.niger yaitu berupa amonia (NH3) yang bersifat basa. Terbentuknya amonia

dapat terjadi akibat metabolisme protein yang terpotong menjadi asam amino

untuk kemudian tereksresi sebagai amonium akibat aktivitas amonifikasi.

Kenaikan pH pada hari ke-3 menandakan terjadinya konsumsi asam lemak

bebas oleh sel untuk pemenuhan kebutuhan sumber karbon dan energinya.

Akibatnya, pH larutan kembali meningkat hingga pH 5,5 di akhir masa inkubasi.

Sumber Karbon

Karbon merupakan komponen utama sel, sehingga asupan karbon

merupakan hal yang snagat penting. Berbagai sumber karbon yang bisa dipakai

untuk produksi enzim lipase seperti laktosa, fruktosa, xylosa, glukosa dan gliserol

(Rodriguez et al., 2006). Rifaat et al (2010) memperlihatkan bahwa berbagai

sumber karbon memberikan pengaruh yang berbeda pada hasil produksi biomassa

dan aktivitas lipase yang dihasilkan. Hasil penelitian tersebut memberikan hasil

bahwa karbohidrat sebagai sumber karbon lebih bagus untuk produksi bimassa

sementara trigliserida lebih baik untuk produksi lipase dengan aktivitas lipase

9

tertinggi dihasilkan pada media yang mengandung minyak zaitun sebagai sumber

karbonnya.

Sumber Nitrogen

Produksi lipase memerlukan sumber nitrogen yang dapat berupa nitrogen

organik dan anorganik. Sumber nitrogen anorganik berada dalam bentuk NO3- ,

efektif untuk produksi lipase tetapi bukan untuk produksi biomassa sel. Pepton,

Malt ekstrak, kasein, yeast ekstrak, dan corn steep liquor merupakan sumber

nitrogen kompleks untuk produksi lipase. Freire et al. dalam Rifaat 2010

menyatakan bahwa pepton mengandung kofaktor asam amino yang sesuai dengan

kebutuhan fisiologis untuk produksi lipase. Pepton juga berpengaruh terhada

produksi lipase pada Aspergillus sp. dan Fusarium sp (Rifaat, 2010). Kadar

pepton yang digunakan sebagai sumber nitrogen berpengaruh terhadap aktivitas

lipase dan produksi biomassa sel (Rodriguez et al, 2006).

Pada praktikum ini, digunakan tiga sumber nitrogen yaitu : NaNO3, Yeast

ekstrak dan pepton yang telah terbukti efektif untuk meningkatkan produksi

lipase. Adapun hasil aktivitas lipase terbesar diperoleh pada hari ke-2 sejumlah

4800 U/ml.

Dari beberapa penelitian terdahulu, semua sumber nitrogen telah diuji

pengaruhnya terhadap produksi lipase. Akan tetapi, untuk urea tidak dapat

digunakan sebagai sumber nitrogen karena bersifat toksik bagi kultur (Rifaat,

2010).

Aktivitas Lipase

Enzim lipase yang dihasilkan paling tinggi pada hari ke-2 sebesar 4800

U/ml. Aktivitas tertinggi menandakan bahwa kemampuan untuk menghidrolisis

trigliserida paling tinggi, sehingga akan dihasilkan asam lemak bebas paling

tinggi. Dari gambar 4 terlihat bahwa pada hari ke-2 nilai pH kultur paling rendah,

hal ini sebagai akibat dari pelepasan asam lemak hasil hidrolisis. Setelah hari ke-3

aktivitas enzim menurun secara drastis yang menandakan bahwa tidak ada

aktivitas lagi setelah hari ke-3.

10

Aktivitas lipase yang dihasilkan sangat tergantung pada komposisi media

yang dipakai. Pada percobaan pemakaian substrat glukosa dengan penambahan

minyak zaitun menstimulasi pembentukan lipase (Rifaat et al., 2010). Penrunan

pada hari ke-3 menandakan bahwa waktu pemanenan terbaik enzim ini adalah

pada hari ke-2, karena pada hari berikutnya telah terjadi kerusakan enzim yang

ditandai dengan rendahnya aktivitas enzim tersebut. stabilitas enzim lipase yang

dihasilkan sangat rendah karena lifetime-nya yang singkat. Hal ini kemungkinan

diakibatkan oleh karena substrat untuk pertumbuhannya (glukosa) telah habis,

sehinga sel tidak menghasilkan enzim lagi tapi memakainya untuk memenuhi

kebituhan sumber nutrisinya. Glukosa merupakan gula yang sederhana sehingga

dimanfaatkan pada waktu awal, dan setelah glukosa habis sel baru memanfaatkan

trigliserida sebagai nutrisinya.

KESIMPULAN

Aktivitas lipase tertinggi 4800 U/ml terjadi pada hari ke-2. pH media pada

aktivitas tertinggi sebesar 4. Mukosa habis dikonsumsi pada hari ke-2.

DAFTAR PUSTAKA

Berg, J.M., J.L. Tymoczko, and L. Stryer. 2006. Biochemistry 5th Ed. W.H. Freeman and Company. New York. 1514 p

Cruege, W. dan A. Crueger. 1984. Biotechnology. A Textbook of Industrial

Microbiology. Science Associates, Inc. Sunderland, MA. 01375 Falony, G., J. C. Armas, J. C. D. Mendoza and J. L. M. Hernández. 2006.

Production of Extracellular Lipase from Aspergillus niger by Solid-State Fermentation. Food Technol. Biotechnol. 44 (2) 235–240

Mangunwidjaja, D. dan A. Suryani. 1994. Teknologi Bioproses. Penebar

Swadaya. Pera, L. M., C. M. Romero, M. D. Baigori and G. R. Castro. 2006. Catalytic

Properties of Lipase Extracts from Aspergillus niger. Food Technol. Biotechnol. 44 (2) 247–252

Putranto, R. A., D. Santoso, T. P. Suharyanto, A. Budiani. 2006. Karakterisasi gen

penyandi lipase dari kapang Rhizopus oryzae dan Absidia corymbifera. Menara Perkebunan. 74(1). 23-32

11

12

Rani, C. and A. Panneerselvam. 2009. Influence of Environmental and Nutritional

Parameters on Lipase Production. ARPN Journal of Agricultural and Biological Science. 4(5). 39-43

Rifaat, H. M., A. A. El-Mahalawy, H. A. El-Menofy and S. A. Donia. 2010.

Production, Optimization and Partial of Lipase from Fusarium oxysporum. Journal of Applied Sciences in Environmental Sanitation. (5)1: 39-53

Rodriguez, J.A., J.C. Mateos, J. Nungaray, V. Gonza’lez, T. Bhagnagar, S.

Roussos, J. Cordova and J. Barrati. 2006. Improving lipase production by nutrient source modification using Rhizopus homothallicus cultured in solid state fermentation. Process Biochemistry 41:2264–2269