RÉSULTATS

INTRODUCTION

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Production d’ingrédients laitiers fonctionnalisés par des microorganismes producteurs de composés antifongiques

L. Garnier1, F. Valence2, A. Pawtowski1 , N. Pinon2 , F. Deniel1, L. Galerne1, N. Frotté1, B. Camier2, E. Coton1 et J. Mounier1

1 Université de Brest, EA 3882, Laboratoire Universitaire de Biodiversité et Ecologie Microbienne, ESIAB, Technopôle Brest-Iroise, 29280 Plouzané, France. 2 INRA, UMR1253 Science et Technologie du Lait et de l'Œuf, F-35042 Rennes, France.

Contact: lucille.garnier@univ-brest.fr www.researchgate.net/profile/Garnier_Lucille

Levures

Champignons filamenteux

Yaourt

Crème fraiche

Fromage

Insatisfaction des consommateurs

Limitation des possibilités

d’exportation

Pertes économiques

Méthodes préventives

Bonnes Pratiques d’Hygiène

Systèmes de filtration de l’air

Emballages sous atmosphère

modifiée

Impact des contaminations fongiques des produits laitiers Moyens de maîtrise des contaminations fongiques dans les produits laitiers

Barrières traditionnelles

Traitement thermique

Ajout de NaCl/sucre

Fermentation

Conservateurs chimiques

Nouvelle méthode

Biopréservation

Utilisation de métabolites

antifongiques issus de

cultures

« bioprotectrices »

QUESTIONS SCIENTIFIQUES I

Quelle est la diversité des contaminants fongiques des produits et de l’environnement laitiers?

II Quels sont les microorganismes présentant une activité antifongique dans un

milieu laitier?

III Parmi ces microorganismes, lesquels présentent une activité dans un produit

réel?

I - Caractérisation de la diversité des contaminants fongiques présents dans les produits laitiers et leur environnement

Crème fraiche Yaourt Fromage Crème

Collecte des échantillons

Isolement et purification des contaminants

Identification des contaminants par séquençage

• Domaine D1-D2 du gène codant l’ARNr 28S • Région ITS • Portion du gène codant la β-tubuline • EF1-α

Champignons filamenteux

Levures

II - Criblage haut-débit du potentiel antifongique de 703 isolats bactériens et fongiques par fermentation de deux substrats laitiers

505 isolats bactériens

198 isolats fongiques

703 isolats criblés… … cultivés dans 2 fractions laitières…

LH: Lait Low Heat reconstitué à 10% + émulsion de

MGLA à 45% (30g MG/l final)

UF: Perméat d’ultrafiltration 6X (stérilisé par filtration 0.22µm) complémenté à 10g/l d'extrait de levure + pourpre de bromocrésol

…et testés contre 4 cibles fongiques, représentatives de la diversité des

contaminants fongiques des produits laitiers,…

Mucor racemosus

Penicillium commune

Galactomyces geotrichum

Yarrowia lipolytica

…en duplicats.

11360

cultures

Incubation à 12°C jusqu’à 8

jours et évaluation de la

croissance fongique

Retentat: rétentat d’ultrafiltration de lait

entier concentré 5 fois (final fat

concentration finale en MG de 45%,

présure (0,03%), inoculé avec un ferment

lactique mésophile et un indicateur de

pH)

Après fermentation (20h) des fractions

laitières par les isolats, 100µl du

milieu fermenté (Fermentat) ont été

ajoutés à la surface de chaque mini

fromage

Incubation 1h à 30°C

and 72h à 20°C 1 puits = 1 mini-fromage

(~2g)

Retentat + Fermentat

Inoculation avec 50 spores

ou cellules de 4 cibles

fongiques

(1 cible/plaque)

Retentat + Fermentat + Cible

fongique

Retentat + fraction laitière non

fermentée

Retentat + Cible fongique

Évaluation de la croissance fongique et score attribué à l’activité

antifongique des fermentats

Aspect visuel

Effet antifongique Aucun Faible Fort Inhibition

totale

Score 0 1 2 3

Exemple de l’effet du milieu LH fermenté par Lactobacillus sp. sur la croissance de P. commune

III – Caractérisation de l’activité antifongique de 2 fermentats après validation et optimisation de leur activité antifongique – exemple d’une contamination par P. commune

Fromage blanc

Fermentat lyophilisé

1 et 2% Inoculation avec P. commune

(50 spores en surface)

Lecture et photo tous les jours

à partir de 9 jours et

comparaison avec les témoins

Incubation à 10 °C

pendant 14 jours Témoin négatif (T-) = (ni fermentat ni cible)

Témoin positif (T+) = (cible sans fermentat)

Témoin avec un conservateur chimique (TS) = (Sorbate à 0,08%)

I - Diversité des contaminants fongiques dans des produits laitiers et dans l’environnement industriel

Diversité des champignons filamenteux (n=132) en fonction du

biotope d’origine (genre)

Diversité des levures (n=43) en fonction du biotope d’origine (genre)

No

mb

re d

e le

vure

s N

om

bre

de

cham

pig

no

ns

fila

men

teu

x

0

10

20

30

40

50

60

70

Acremonium Cladosporium Epicoccum

Exophiala Fusarium Galactomyces

Lewia Microascus (Scopulariopsis sp.) Mucor

Penicillium Phaeosphaeria Phoma

Sordariomycetes Sporodiobolus Stereum

Thamnidium Thanatephorus

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Cream

(n=3)

Cream

cheese

(n=13)

Dairy

environment

(n=63)

Drink (n=5) Fresh

cheese

(n=15)

Hard cheese

(n=48)

Unknown

(n=17)

Yoghurt

(n=8)

Candida Cryptococcus DebaryomycesKluyveromyces Meyerozyma PichiaRhodotorula Trichosporon Yarrowia

II – Principaux résultats du criblage des isolats bactériens et fongiques

Répartition des scores obtenus

par les fermentats UF Répartition des scores obtenus

par les fermentats LH

3,7% 8,2%

88,1%

Forte activité antifongique (score de 2 ou 3)

Faible activité antifongique (score de 1)

Pas d'activité antifongique (score de 0)

0,3% 2,6%

97,2%

Forte activité antifongique (score de 2 ou 3)

Faible activité antifongique (score de 1)

Pas d'activité antifongique (score de 0)

92,2%

1%

3,8% 1% 1% 1%

Lactobacillus

Aureobasisium

Mucor

Rhodotorula

Torulaspora

Verticillium

Répartition par genre, des isolats cultivés en LH, présentant une forte

activité antifongique

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

L. brevis L. buchneri L. casei L.

harbinensis

L.

plantarum

L. reuteri L.

rhamnosus

2 3

Répartition des hauts scores d’activité antifongique obtenus avec du LH

fermenté en fonction de l’espèce de Lactobacillus sp. considérée Nombre de

souches

III – Effet antifongique de LH fermenté par L. paracasei L117 ou L. rhamnosus

CIRM1952 sur le développement de P. commune à la surface d’un fromage blanc

CONCLUSIONS

J9 J10 J11 J12 J13 J14

T-

T+

TS

L. paracasei

1%

L. paracasei

2%

L.

rhamnosus

1%

L.

rhamnosus

2%

Fro

mag

es

bla

ncs

co

nta

min

és

par

P. c

om

mu

ne

Colloque SFR ScInBioS_IBSAM 07 juin 2016

Retard de croissance de 1 jour observé pour LH – L.

paracasei à 1%

Retard de croissance de 1 jour observé et physiologie de P.

commune affectée par LH - L. paracasei à 2%

Retard de croissance de 3 jours observés pour LH – L.

rhamnosus à 1%

Retard de croissance de 4 jours observés pour LH – L.

rhamonsus à 2%

L’étude de la diversité des contaminants fongiques des produits laitiers et de leur environnement a permis la mise en place d’une collection de 175 isolats composée de 43 levures et 132 champignons filamenteux. Au sein de cette collection, 4 cibles fongiques représentatives de cette diversité et issues de produits contaminés ont été utilisées lors des criblages: M. racemosus, P. commune, G. geotrichum et Y. lipolytica. Le criblage de l’activité antifongique de la collection a permis la sélection de 22 isolats bactériens appartenant aux genres Lactobacillus et Propionibacterium. Chacune de ces souches est capable de retarder la croissance de 2 à 4 cibles fongiques. Il a également permis la sélection de 11 isolats fongiques, appartenant aux genres Aureobasisium, Candida, Exophiala, Mucor, Phoma, Pichia, Torulaspora et Trichoderma, capables de retarder la croissance de 1 ou 2 cibles fongiques chacun. De plus, il est important de noter l’impact du substrat de fermentation sur l’activité antifongique des différents isolats. L’optimisation de l’activité antifongique des souches d'intérêt a été réalisée et a permis la sélection de 4 souches bactériennes et 1 souche fongique pour la réalisation de challenge-tests sur produits réels. L’activité antifongique de certains ingrédients fermentés a été validée dans des produits réels et les conditions d’application de l’ingrédient antifongique dans ces produits ont été définies.

Des chalenge-tests à l’échelle pilote vont être réalisés prochainement et l’identification des composés et des mécanismes impliqués dans l’activité antifongique des ingrédients obtenus est en cours. Ainsi, la finalité du projet est d’obtenir un ingrédient antifongique et 100% laitier.

PERSPECTIVES