Presentado por: Kennyer Aguirre lvaro Hernndez Deisy Oquendo

Sntesis de los PHAsLos polihidroxialcanoatos (PHAs) son una serie de polisteres sintetizados por algunos gneros bacterianos como material de reserva cuando el medio de cultivo se encuentra desbalanceado con limitacin en nitrgeno, fosforo, azufre, magnesio y/o oxigeno y con exceso de fuente de carbono.

Sntesis de los PHAsEn la sntesis del polmero, los monmeros que le darn origen a este se clasifican en: Monneros de cadena corta (3-5 atomos C). Monmeros de cadena media (6 14 atomos

de C).

Sntesis de los PHAsLa razn por la cual un PHAs se forma como un polmero de cadena corta o media est relacionada directamente con la enzima encargada de la sntesis (sintasa) ya que esta tiene una especificidad de sustrato que puede actuar sobre monmeros con diferente nmero de tomos de carbono.

Sntesis de los PHAsEn la siguiente figura se puede ver los tipos de enzimas segn 4 microorganismos capaces de producir PHAs, Las PHA sintasas clase I tienen como microorganismo modelo Ralstonia eutropha, estn compuestas de una sola clase de subunidad (PhaC), y actan sobre tiosteres CoA de varios 3 hidroxialcanoatos de cadena corta.

Rutas MetablicasLa composicin monomrica de los biopolmeros de PHAs es muy variada, depende de las rutas metablicas por las cuales fueron sintetizados y por la fuente de carbono externa que se usa como materia prima para dicha ruta. Provienen bsicamente de tres vas metablicas: La degradacin de azucares mediante la obtencin de

AcetilCoA La degradacin de cidos grasos (-oxidacin) Biosntesis de cidos grasos (Aldor & Keasling, 2003).

Sntesis desde los azcares:La ruta conduce a la formacin de acetil-CoA. A continuacin la ruta utiliza 3 enzimas en secuencia: PhaA (beta ketotiolasa), una enzima que provoca la

condensacin de una molcula de Acetil-CoA en AcetoacetilCoA.

PhaB

(hidrolasa acetoacetilCoA reductasa-NADPH dependiente), una enzima que provoca mediante la prdida de una molcula de agua, la incorporacin de un radical OH y la formacin de un intermediario: (R) -3- hidroxiacilCoA. CoA sintetizados.

PhaC (polimerasa) que une en cadenas los (R) -3-hidroxiacil

Sntesis desde los azcares:

Sntesis a partir de la Beta-oxidacin de cidos grasosSe utilizan cuatro enzimas y se sintetiza el sustrato clave -3- hidroxiacilCoA. Las enzimas que actan en secuencia son: (R) Acil-CoA transferasa, que genera la formacin de una molcula

de acil-CoA. Acil-CoA deshidrogenasa reduce la molcula de Acil-CoA mediante la prdida de una molcula de agua, a trans-2-enoilCoA. La enoil-CoA hidratasa genera el intermediario (S) -3hidroxiacilCoA. Finalmente la epimerasa cambia de conformacin, sintetizndose (R) -3-hidroxiacilCoA.

Sntesis a partir de la Beta-oxidacin de cidos grasos

Sntesis desde la biosntesis de novo de los cidos grasosRepresenta un desvo desde la ruta de sntesis de cidos grasos, el comienzo de la ruta involucra el acetil-CoA, luego de la siguiente manera: La acetil-CoA carboxilasa (13) lo convierte en malonil-CoA. La ACP-maloniltransfereasa (14) se adiciona un grupo ACP

convirtindose en ACP-malonil. La 3-acetoacil-ACP sintasa dependiente de NADPH (15) lo transforma en 3-ketoacil-ACP. La 3-cetoacil-ACP-reductasa (16) genera el (R) -3- hidroxiacil ACP. Finalmente se liberndose el grupo ACP gracias a la accin de la 3hidroxiacil ACP CoA transacilasa (19) generando (R) 3- hidroxiacil ACP y permitiendo la polimerizacin en PHAs.

Sntesis desde la biosntesis de novo de los cidos grasos

Rutas Metablicas

Rutas MetablicasDe las tres rutas mencionadas, son los azucares los sustratos ms empleados puesto que son los de mayor abundancia en la naturaleza bien sea como monosacridos o polisacridos, es por eso que la mayora de las investigaciones encontradas para la produccin de PHAs a partir de Ralstonia eutropha tiene como sustrato los carbohidratos. La cual se basa en la siguiente ecuacin:

Produccin en lotesEs normalmente inducida por una alimentacin limitada de algn nutriente, generalmente nitrgeno, y un exceso en la fuente de carbono desde el comienzo de la fermentacin y se detiene despus de un tiempo, cuando se ha alcanzado la fase estacionaria, o el tiempo que la cintica del microorganismo hayan demostrado que sea la forma ms eficiente de llevar a cabo la fermentacin.

Produccin en lotes alimentadosEs el mtodo ms usado para alcanzar una alta densidad celular e inducir en determinado tiempo la limitacin de nutrientes, as la etapa de crecimiento se puede controlar y en el momento de alcanzar altas densidades celulares se induce la limitacin de nutrientes. Durante la fase de limitacin de nutrientes la concentracin de material celular residual (equivalente a toda la biomasa que no es PHA) se mantiene casi constante, de tal modo que el aumento de la biomasa total se debe a la acumulacin de PHA en el citoplasma del microorganismo.

Produccin en continuoEsta clase de proceso se lleva a cabo generalmente en dos bioreactores en serie, lo cual permite aumentar la productividad en 1.7 veces ms comparado con una sola etapa. El rendimiento de la fermentacin se ve afectado por la temperatura, pH, radio de alimentacin de carbono/nitrgeno, la concentracin de sustratos, la concentracin de elementos trazas, la concentracin de iones, la intensidad de agitacin y el oxgeno disuelto.

Produccin en continuoLos costos inherentes a la etapa de fermentacin se deben principalmente a la aireacin y temperatura de operacin. Para disminuir estos costos los trabajos se enfocan principalmente en la mejora de los rendimientos de los microorganismos, y en la disminucin de requerimientos de calor y aireacin. Un ejemplo de esto es la bsqueda de microorganismos anaerobios o micro anaerobios que sean productores de PHB que tengan rendimientos viables para un escalado a nivel industrial. La modificacin gentica tambin es una alternativa para disminuir la dependencia al oxgeno, de tal forma que microorganismos que son aerobios se vuelvan micro aerobios, es decir que necesiten pequeas cantidades de oxgeno para sus procesos metablicos.

Descripcin del procesoEl proceso de produccin de PHB, utiliza al microorganismo R. eutropha y el proceso de fermentacin se lleva a cabo como lote alimentado, en dos pasos. Durante el primer paso, se lleva a cabo el crecimiento de las clulas a 30C, en el medio de cultivo con sales minerales y melaza como fuente de carbn y energa, y la cantidad estimada como requerida de fosfato, para que el microorganismo genere crecimiento en la biomasa.

Descripcin del procesoEn la segunda etapa se induce la generacin del PHB mediante la limitacin de la fuente de nitrgeno, mientras que la melaza se sigue alimentando hasta alcanzar la cantidad de PHB esperada. El proceso consta bsicamente de la fermentacin con el microorganismo, posteriormente se da un calentamiento (a 80 C) para desnaturalizar a las enzimas y as detener la actividad celular, se somete a una primera centrifugacin donde se elimina agua del medio, despus se somete a una agitacin con un surfactante (tween 80) como un pretratamiento para proteger al PHB de degradacin con el tratamiento posterior.

Descripcin del procesoEnseguida se mezcla con hipoclorito de sodio el cual se utiliza para digerir todos aquellos componentes diferentes al PHB. Se somete a una nueva centrifugacin donde se eliminan restos de biomasa, hipoclorito de sodio as como agua que estaba contenida en la clula y surfactante, obteniendo como torta en la centrifugacin el PHB, el siguiente paso es una floculacin o lavado propiamente, se somete a una ltima centrifugacin donde se elimina el exceso de agua y por ltimo se pasar a un flash dryer para secarlo y obtener de esta forma nuestro polvo de PHB, nuestro producto sale con el 99 % de pureza en donde las impurezas son restos de protena.

Diagrama de Bloques

Proceso de separacinDespus de la fermentacin, el siguiente paso es el aislamiento y purificacin del PHB. En este nivel, el PHB es extrado del citoplasma celular y para ello la membrana celular es destruida y el PHB es disuelto en solventes. Es as como el PHB queda separado de la biomasa residual. El proceso de separacin se puede dividir en tres partes: Pretratamiento Extraccin Purificacin

El pretratamiento se realiza para debilitar la membrana celular y as realizar la disrupcin celular de una forma ms fcil. Este pretratamiento se puede dar con: calor, lcalis, sales o por congelamiento.

Extraccin con solventes La extraccin de PHA con solventes es el mtodo ms

antiguo. La accin del solvente puede ser dividida en 2 etapas, en la primera modifica la permeabilidad de la membrana celular y en la segunda disuelve el PHA. Los principales solventes utilizados son: Hidrocarburos

clorados (cloroformo, 1,2.dicloroetano, cloruro de metileno), solventes de carbonatos cclicos (carbonato de propileno y etileno), solventes halogenados (cloroetanos y cloropropanos), solventes no halogenados, alcoholes, steres, amidas y cetonas, entre otros

Extraccin con solventes Este tipo de extraccin a pesar de su eficiencia en cuanto a

la pureza del PHA obtenido, requiere grandes cantidades de solvente por gramos de PHA extrado. Adems las repercusiones ambientales y en la salud humana que conllevan su uso hacen que sea necesario combinarlo o sustituirlo por otros mtodos de extraccin que tengan un mejor rendimiento y sobre todo disminuyan los impactos ambientales.

Digestin La digestin puede ser qumica o enzimtica. La digestin

qumica consiste en el uso de diferentes agentes qumicos para destruir componentes de la membrana celular como lpidos, carbohidratos, protenas y enzimas. De acuerdo con el agente qumico usado la digestin puede ser con biosurfactantes, hipoclorito de sodio, hipoclorito de sodio y cloroformo, surfactante hipoclorito, surfactante-quelatos. La digestin enzimtica consiste en el uso de enzimas para degradar la membrana celular. Diferentes enzimas proteolticas tienen altas selectividades en disoluciones de protenas y pocos efectos sobre la degradacin del PHA. La digestin enzimtica puede ser complementada por otros mtodos de extraccin como el de solventes y tambin por pretratamientos de la biomasa.

Congelamiento y descongelamiento Los cristales de hielo se forman y crecen durante el congelamiento,

rompen mecnicamente la integridad del interior de la membrana celular, hacindola mas permeable. Se ha visto que la congelacin lenta no funciona tan bien como la rpida. La congelacin rpida lesiona ms especficamente las membranas celulares produciendo lisis celular.

Autlisis Es un proceso por el cual las clulas inducen su propia destruccin. Se

produce la activacin de seales que inducen la liberacin de enzimas que degradan las organelas y membranas de las mismas clulas. Los lisosomas son vesculas de limitadas por membrana plasmtica que

contiene una batera de enzimas hidrolticas: fosfatasa cida, ribonucleasa, proteasa, sulfatasa, lipasa, glucuronidasa. Por s mismo es un mecanismo lento. Lo que se hace es transformar

cepas afn de hacer mucho mas activos estos sistemas auto-lticos, introduciendo genes que codifican antibiticos y enzimas que degraden mas rpidamente las distintas organelas y membranas celulares.

Tipos de Biorreactores En el proceso de produccin de los PHA descrito en el anterior

diagrama, se utilizan reactores de tanque agitado, donde se maneja el medio de cultivo y estos son seleccionados por que son fciles de construir desde el proceso de re escalamiento en el laboratorio, como se muestra en la siguiente figura:

Tipos de BiorreactoresDonde: A: Entrada de Buffer B: Entrada medio de cultivo C: Medidor de pH D: Salida de medio E: Entrada de medio F: Medidor de Temperatura

Tipos de Biorreactores

Tipos de BiorreactoresEn estos tipo de reactores se maneja un rango de volmenes de operacin que va desde 400 a 43000 L, segn la capacidad de produccin de la planta. La presin y Temperatura de operacin es de 150 psi y 37C respectivamente.

Tipos de BiorreactoresEl tipo de agitacin es de 3 turbinas, Rushton de 6 aspas planas. Como se muestra a continuacin:

GRACIAS POR SU ATENCIN PREGUNTAS ???