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UNIVERSITE PARIS.DIDEROT (Paris 7) - Ecole Doctorale de l’Institut de Physique du Globe de Paris DOCTORAT de Géochimie Jennyfer MIOT Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des métaux/métalloïdes. ~ Oxydation du fer par des bactéries anaérobies neutrophiles et résistance au fer et à l’arsenic chez des eucaryotes unicellulaires de drainages miniers acides. Soutenance le 8 décembre 2008 Composition du jury : M. Géraldine Sarret Rapporteur M. Jean-Claude Block Rapporteur M. Marc Chaussidon Examinateur M. Patrick Forterre Examinateur M. François Guyot Directeur de thèse M. Karim Benzerara Co-directeur de thèse M. Guillaume Morin Co-directeur de thèse

Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

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Page 1: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

UNIVERSITE PARIS.DIDEROT (Paris 7)

-

Ecole Doctorale de l’Institut de Physique du Globe de Paris

DOCTORAT

de

Géochimie

Jennyfer MIOT

Processus microbiens de biominéralisation

et de détoxification des métaux/métalloïdes. ~

Oxydation du fer par des bactéries anaérobies neutrophiles et résistance au fer

et à l’arsenic chez des eucaryotes unicellulaires de drainages miniers acides.

Soutenance le 8 décembre 2008

Composition du jury :

M. Géraldine Sarret Rapporteur

M. Jean-Claude Block Rapporteur

M. Marc Chaussidon Examinateur

M. Patrick Forterre Examinateur

M. François Guyot Directeur de thèse

M. Karim Benzerara Co-directeur de thèse

M. Guillaume Morin Co-directeur de thèse

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Page 3: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

3

Remerciements.

Les 3 années que j’ai passées à l’IMPMC ont été très enrichissantes tant sur le plan

scientifique qu’humain. Je tiens à vous en remercier les uns et les autres.

Mes remerciements vont en premier lieu aux trois personnes qui ont encadré ces trois années

de doctorat. Je suis consciente de la chance immense que j’ai eue de travailler sous la

direction de Karim, Guillaume et François. Vous avez su me transmettre le grand plaisir que

vous avez de faire de la recherche, via des discussions scientifiques passionnantes, des idées à

foison de manips, de projets. Outre votre excellence scientifique, j’ai aussi pu apprécier vos

qualités humaines. Merci d’avoir su être à l’écoute tout en me laissant une grande liberté

pendant ces trois années. Je veillerai à faire bon usage de l’immense privilège que j’ai eu de

travailler et d’apprendre à vos côtés.

Je remercie vivement Fériel, qui a participé de très près aux projets constituant cette thèse.

J’aurais aimé avoir plus de temps pour apprendre la biochimie à tes côtés. Je n’oublierai pas

les très bons moments en attendant Côme et Mattéo, et après leur arrivée aussi bien sûr !

Un immense merci à Céline, qui m’a épaulée avec Fériel pour tout le travail technique de fond

indispensable à la réalisation de cette thèse, en particulier l’entretien des cultures, mais aussi

tout ce qui permet au labo de bio de fonctionner au quotidien.

Je remercie Kirsty, avec qui j’ai eu la chance d’apprendre le cemovis. Je te souhaite de beaux

jours pluvieux et venteux comme tu les aimes !

Merci à Sylvain pour sa participation très active aux manips de STXM.

Merci à Georges pour son aide lors des manips d’EXAFS et ses conseils de microbiologiste

avisé.

Merci à Emmanuelle pour son aide pour les manips d’épifluorescence.

Merci à tous ceux qui ont participé de près ou de loin à la mise en place et au déroulement de

ces projets, y compris à ceux de passage.

Merci à Dik et Yuheng pour les bons moments partagés au 7.1.28. Je n’oublierai pas les

discussions passionnantes sur la Guyane ni les cours de chinois accélérés. Merci à tous les

autres, en particulier les thésards avec qui j’ai passé trop peu de temps…

Merci à Olivier et à Côme de me donner tous les jours le sourire.

Page 4: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

4

Page 5: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

5

Sommaire

Introduction…………………………………………………………………….9

Chapitre 1. Biominéralisation du fer par des bactéries ferro-oxydantes anaérobies neutrophiles………………………………………………………31

1A. Biominéralisation du fer dissous par BoFeN1………………………………………...37 Problématique et objectifs de l’étude…………………………………………………37

Méthodologie…………………………………………………………………………37

Spectromicroscopie X (STXM) au seuil du Fe………………………………..37

Quantification des rapports Fe(II)/Fe(III) à l’aide des seuils L2,3 du fer en

XANES………………………………………………………………………...40

Estimation des dégâts d’irradiation…………………………………………..40

Principaux résultats et perspectives…………………………………………………...41

Encroûtement périplasmique………………………………………………….42

Globules membranaires……………………………………………………….42

Filaments d’exopolysaccharides minéralisés…………………………………42

Biominéralisation du calcium par BoFeN1……………………………….......43

« Iron biomineralization by anaerobic neutrophilic iron-oxidizing bacteria » (article #1)…...45

1B. Transformation de la vivianite par BoFeN1…………………………………………..83 Problématique et objectifs…………………………………………………………….83

Méthodologie…………………………………………………………………………83

Spectroscopie d’Absorption X (XAS)………………………………………….83

Principaux résultats et perspectives…………………………………………………...87

« Transformation of vivianite by anaerobic iron-oxidizing bacteria » (article #2)…………...89

1C. Biominéralisation extracellulaire du fer par une bactérie ferro-oxydante photo-

autotrophe…………………………………………………………………………………..117 Problématique et objectifs…………………………………………………………...117

Méthodologie………………………………………………………………………..118

Analyse des polymères organiques en STXM au seuil K du C………………118

Détermination des corrélations entre quantités de fer et de carbone organique

Principaux résultats et perspectives………………………………………………….119

Rôle des fibres lipo-polysaccharidiques dans le contrôle de la

biominéralisation du fer……………………………………………………………………..119

Existence d’un gradient redox le long des fibres minéralisées……………...120

Similarités des fibres observées avec les nanowires des bactéries ferri-

réductrices…………………………………………………………………………………...121

Bio-signatures potentielles…………………………………………………..121

Variabilité de la minéralogie des phases formées par SW2…………………123

« Extracellular iron biomineralization by photoautotrophic iron-oxidizing bacteria » (article

#3)…………………………………………………………………………………………...125

1D. Les premiers stades de la biominéralisation du fer et la fossilisation de protéines..145 Problématique et objectifs…………………………………………………………...145

Méthodologie………………………………………………………………………..145

Page 6: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

6

Cryo-Electron Microscopy of Vitreous Sections (CEMOVIS)………………145

Principaux résultats et perspectives………………………………………………….153

Fossilisation de protéines……………………………………………………153

Etapes de la biominéralisation du fer dans le périplasme…………………..153

Spectromicroscopie X en conditions hydrates……………………………….154

« Looking at the first stages of bacteria fossilization : evidences for the preservation of

proteins and cellular ultra-fine structures in microfossils » (article #4)…………………….157

1E. Etude préliminaire de la viabilité des cellules BoFeN1 lors de la biominéralisation du

fer……………………………………………………………………………………………171 Problématique et objectifs…………………………………………………………...171

Méthodologie………………………………………………………………………..172

Suivi de la croissance bactérienne et de l’encroûtement……………………172

Estimation de la viabilité à l’échelle de la population – Cultures en milieu

solide………………………………………………………………………………………...172

Modélisation des courbes de croissance bactérienne……………………….173

Principaux résultats………………………………………………………………….173

Effet du fer sur la courbe de croissance bactérienne………………………..173

Relation avec l’évolution du nombre de bactéries encroûtées………………174

Viabilité et encroûtement…………………………………………………….176

Perspectives méthodologiques………………………………………………………178

Evaluation de la viabilité à l’échelle de la cellule – Méthodes utilisant la

fluorescence…………………………………………………………………………………178

Chapitre 2. Biominéralisation du fer et détoxification de l’arsenic par des eucaryotes unicellulaires du genre Euglena………………………………..181

2A. Bioaccumulations de fer par E. mutabilis issue de l’AMD de Carnoulès et par E. gracilis………………………………………………………………………………………187 Problématique et objectifs…………………………………………………………...187

Méthodologie………………………………………………………………………..187

Principaux résultats et perspectives………………………………………………….187

« Intracellular iron accumulation in Euglena mutabilis from the Carnoulès arsenic-rich acid

mine drainage (Gard, France) and in the model microorganism Euglena gracilis” (article

#5)…………………………………………………………………………………………...189

2B. Détoxification et toxicité de l’arsenic (As(III) et As(V)) chez E. gracilis…………...207 Problématique et objectifs…………………………………………………………...207

Toxicité de l’arsenic…………………………………………………………207

Mécanismes de résistance à l’arsenic chez les procaryotes et chez les

eucaryotes…………………………………………………………………………………...207

Objectifs de cette étude………………………………………………………208

Méthodologie………………………………………………………………………..209

Utilisation de la spectroscopie d’absorption X pour l’analyse d’éléments traces

Principaux résultats et perspectives………………………………………………….209

« XAS study of arsenic coordination in Euglena gracilis exposed to arsenite »

(article #6)…………………………………………………………………………………...213

« Detoxification and high toxicity of As(V) in Euglena gracilis” (article #7)……………...219

Page 7: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

7

Conclusions & Perspectives…………………………………………………239

Bibliographie…………………………………………………………………251 Protocoles…………………………………………………………………….267 Lexique……………………………………………………………………….291

Page 8: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

8

Page 9: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

9

Introduction

Page 10: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

10

Page 11: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

11

La présence d’un système atmosphère-hydrosphère à la surface de la Terre participe à la

régulation du climat et fournit des niches écologiques, i.e. un ensemble de paramètres

permettant le développement et le maintien de la vie (Martin et al., 2006). Ce système a

évolué au cours des temps géologiques, imposant des contraintes variées aux organismes

vivants - en particulier en termes de sources d’électrons et d’énergie - et favorisant le

développement et l’évolution d’un certain nombre d’adaptations biologiques (adaptations

métaboliques et mécanismes de résistance). Au cours de cette thèse, nous avons étudié deux

systèmes biogéochimiques actuels (voir paragraphe 5.) dans le but de mieux comprendre

leurs adaptations à des environnements extrêmes (anoxie, fort taux de minéralisation, acidité,

concentrations élevées en éléments toxiques), qui présentent certaines analogies avec ceux de

la Terre archéenne. L’intérêt de l’étude de tels systèmes est double : il est permet d’une part

de mieux caractériser les mécanismes adaptatifs de systèmes biologiques actuels et de mieux

cerner leur rôle dans le cadre d’études environnementales (en particulier de milieux pollués).

En outre, il s’inscrit dans le cadre des recherches actuelles sur les roches archéennes,

fournissant des clés pour mieux déterminer la nature des signatures bio-minérales

potentiellement fossilisées dans les roches anciennes.

1. Les conditions d’apparition des premiers métabolismes sur la Terre primitive

anoxique

Les principales étapes de l’évolution de la bio-géosphère précambrienne sont résumées en

Figure I-1. Les dates présumées d’apparition de la vie sur Terre sont très incertaines et

discutées et s’échelonnent entre -3.8 (inlcusions carbonées d’Isua, Schopf et al., 2002) et -3.4

Ga (structures filamenteuses carbonées de Buck Reef Chert, Tice & Lowe, 2004) pour

l’apparition des premières formes de vie « complexes ». La composition de l’atmosphère est

alors très différente de celle de l’atmosphère actuelle, une des différences majeures résidant

dans le fait qu’elle est dépourvue d’O2 (anoxique) (Kasting & Tazewell-Howard, 2006). En

effet, l’oxygène produit par réactions photochimiques dans la haute atmosphère est maintenu

à de très faibles niveaux (< 10-10

.PAL, Present Atmospheric Level) par réaction avec les

émissions volcaniques réductrices (Martin et al., 2006). En revanche, la pression partielle en

CO2 est probablement très élevée (2-6 bars) induisant un fort effet de serre (en combinaison

avec le méthane) et une température de surface avoisinant les 70°C vers -3.3 Ga (Kasting &

Page 12: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

12

Figure I-1 : Quelques étapes de l’évolution de la biogéosphère précambrienne. De gauche à

droite : éons du Précambrien (ainsi que les ères du Protérozoïque); oxygénation progressive

de l’atmosphère à partir de -2.4 à -2.0 Ga (Farquhar et al., 2000) puis p(O2) actuelle atteinte

vers -600 Ma (Kerr, 2005) ; abondance des BIF ; évènements « Snowball » : glaciation

Pongola à -2.9 Ga, glaciation Makganyene à -2.3-2.2 Ga (Kopp et al., 2005), glaciation

sturtienne à -750 Ma et glaciation varangienne à -600 Ma ; Apparition des mitochondries

(d’après Hedges et al., 2004) et des plastes (d’après Hedges et al., 2004 et Douzery et al.,

2004) ; Quelques illustrations de la diversification de la biosphère, de bas en haut : (a) Plus

anciens microfossiles présumés, structures filamenteuses carbonées de Buck Reef Chert, vers

-3.4 Ga (Tice & Lowe, 2004), (b) 2-méthylhopanoïdes, plus anciens biomarqueurs de

cyanobactéries, à -2.7 Ga (Summons et al., 1999), (c) Plus anciennes traces fossiles

d’eucaryotes présumés, vers -2 Ga, fossile de Grypania spiralis (Han & Runnegar, 1992), (d)

Fossile d’acritarche (Tappania plana), vers -1.5 Ga (Javaux et al., 2001), (e) Faune

d’Ediacara signant la diversification des métazoaires vers -0.6 Ga (Kerr, 2005).

Premiers microfossiles présumés

Premiers biomarqueurs de cyanobactéries

Premiers eucaryotes présumés

Acritarches

Faune d’Ediacara

Anoxique

Oxygéné

pO2 actuelle

Evènements « Snowball »

Banded Iron Formations Mitochondries

Plastes

-3000

-2500

-2000

-1500

-1000

-543

Pro

téro

zo

ïqu

e

Pa

léo

-M

és

o-

o-

Arc

en

-3500

-4000

Te

mp

s,

en

Ma

Figure I-1

a

b

c

d

e

Premiers microfossiles présumés

Premiers biomarqueurs de cyanobactéries

Premiers eucaryotes présumés

Acritarches

Faune d’Ediacara

Anoxique

Oxygéné

pO2 actuelle

Evènements « Snowball »

Banded Iron Formations Mitochondries

Plastes

-3000

-2500

-2000

-1500

-1000

-543

Pro

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-3500

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en

Ma

Figure I-1

a

b

c

d

e

Page 13: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

13

Tazewell Howard, 2006, Robert & Chaussidon, 2006). Par conséquent, les océans archéens (-

3.8 à -2.5 Ga) seraient anoxiques, riches en CO2 dissous (pour certains auteurs), donc acides

(en considérant un équilibre avec les carbonates, on estime un pH de l’ordre de 5.5, Pinti,

2005) et chauds. Les interactions entre cette eau chaude chargée en CO2 et les roches de la

proto-croûte océanique contrôlent fortement la composition chimique de l’océan primitif. En

particulier, la carbonatation de la croûte océanique (remplacement des silicates par des

carbonates) permet de piéger une grande proportion du CO2 dissous, faisant remonter le pH

jusqu’à environ 6 (Grotzinger & Kasting, 1993). Par ailleurs, ces réactions eau-roche

solubilisent un certain nombre d’éléments chimiques réduits entrant dans la composition de la

croûte océanique. Des équivalents modernes de l’océan primitif pourraient être assez bien

représentés par les systèmes hydrothermaux actuels à l’aplomb des rides médio-océaniques,

qui émettent des panaches riches en gaz (H2, H2S, CH4) et éléments dissous (Fe2+

, Mn2+

)

réduits (Konhauser et al., 2007). Si sur la Terre actuelle, le fer susceptible d’entrer dans le

cycle d’oxydation-réduction est principalement libéré par l’altération de la croûte continentale

(environ 20 fois plus que par les sources hydrothermales, Canfield, 1998, voir Figure I-2.a), il

est probable que les sources hydrothermales délivraient des quantités de fer (Fe2+

) plus

élevées qu’à l’actuel sur la Terre archéenne (Canfield et al., 2006, voir Figure I-2.b). Au cours

de ce cycle d’oxydation-réduction, le fer réduit (Fe2+

) émis au niveau des systèmes

hydrothermaux est oxydé en Fe3+

, très insoluble, qui précipite sous forme d’importants dépôts

d’oxydes de fer (Figures I-2.a et I-2.b). Les traces qu’il nous reste de ces dépôts au cours de

l’Archéen constituent les plus grands gisements de fer à la surface de la planète, connus sous

le nom de Banded Iron Formations (BIF ou dépôts de fer rubanés). Ces dépôts manifestent

une différence essentielle entre les géochimies de surface actuelle et archéenne (Figures I-2.a

et I-2.b) et fournissent une signature de l’environnement de la biosphère primitive.

Page 14: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

14

Figure I-2.a : Cycle du fer moderne, d’après Lécuyer & Ricard (1999) : les flèches bleues

symbolisent le cycle du fer. Les flux correspondant aux volcanismes et à la subduction

représentent des flux de Fe(III) en mol.an-1

. Le fer issu du manteau, majoritairement réduit

(Fe(III)/Fe(II)=0.07) est progressivement oxydé jusqu’à la zone de subduction. L’oxydation

du fer de la croûte océanique (altération hydrothermale) est attribuée à 50% à des réactions

d’hydrolyse et à 50% à une oxydation biologique (Bach & Edwards, 2003), potentiellement

catalysée par des bactéries ferro-oxydantes (FeOB, voir e.g. Edwards et al., 2003). L’export

hydrothermal de fer sous forme particulaire ou dissoute dans l’océan est négligeable. Le perte

de Fe(III) dans le manteau au niveau des zones de subduction pourrait contribuer à 10-25% du

bilan total du fer mantellique et pourrait ainsi participer à la régulation de la production d’O2

photosynthétique à la surface de la Terre (Lécuyer & Ricard, 1999). Le fer d’origine

continentale est apporté à l’océan par l’érosion continentale (glaciers, rivières, apports de

poussières). Les flux correspondants représentent les flux de fer total « réactif », i.e. la plupart

des oxy(hyrdoxy)des de fer et les sulfures de fer (mais pas les silicates riches en fer, ni la

magnétite) (Raiswell, 2006). Ce fer d’origine continentale sédimente dans les océans, puis

entre en subduction. Le retour de fer du manteau vers le continent se fait via le volcanisme et

la tectonique (intégration de plateaux continentaux). L’encart bleu représente le principal

mode de précipitation du Fe(II) dissous dans les sédiments anoxiques de l’océan actuel, riche

en sulfates, faisant intervenir le couplage de la sulfato-réduction bactérienne (SRB) et de la

ferri-réduction bactérienne (DIR). L’encart gris représente le cycle biogéochimique du fer

dans les sols et sédiments (rivières ou lacs) à l’interface oxique-anoxique, faisant intervenir

des mécanismes abiotiques d’oxydation et de réduction du fer, ainsi que des mécanismes

catalysés par des bactéries ferri-réductrices (bio-réduction) et ferro-oxydantes (bio-oxydation)

et conduisant à la précipitation/dissolution de minéraux riches en Fe(II), Fe(III) ou Fe(II)-

Fe(III). Ces réactions de précipitation-dissolution contrôlent fortement la disponibilité des

éléments traces (tels que l’arsenic) susceptibles de s’adsorber à la surface des oxydes de fer ou

de co-précipiter avec les phases riches en fer.

Figure I-2.a

Fe3+ Fe2+

Fe(III)/Fe(II)=0.07Fe(III)/Fe(II)=0.22

HydrolyseFeOB

Croûte continentaleFe(III)=4-5.9.1020 kg

Volcanisme~5.1012 mol.an-1

Subduction~1,2.1013 mol.an-1

Apports terrigènes~5.1012 mol.an-1

Sédimentationpélagique

~5.1012 mol.an-1

Altération hydrothermale

~1,1.1013 mol.an-1

Basaltes~15 wt% Fe

Sédimentationprofonde

~3.1011 mol.an-1

Figure I-2

Oxique

Anoxique

Fe(II)

Fe(III)

(Bio

)ré

du

cti

on

Minéraux Fe(II)-(III)

Fe(OH)3

Fe(OH)3

(Bio

)ox

yd

atio

n

SO42-

H2SFe2+

FeS2

SRB

Fe(OH)3

DIR

Cycle moderne du fer

VolcanismeTectonique

~5.1011 mol.an-1

Exporthydrothermal

Figure I-2.a

Fe3+ Fe2+

Fe(III)/Fe(II)=0.07Fe(III)/Fe(II)=0.22

HydrolyseFeOB

Croûte continentaleFe(III)=4-5.9.1020 kg

Volcanisme~5.1012 mol.an-1

Subduction~1,2.1013 mol.an-1

Apports terrigènes~5.1012 mol.an-1

Sédimentationpélagique

~5.1012 mol.an-1

Altération hydrothermale

~1,1.1013 mol.an-1

Basaltes~15 wt% Fe

Sédimentationprofonde

~3.1011 mol.an-1

Figure I-2

Oxique

Anoxique

Fe(II)

Fe(III)

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Minéraux Fe(II)-(III)

Fe(OH)3

Fe(OH)3

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Figure I-2

Oxique

Anoxique

Fe(II)

Fe(III)

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Minéraux Fe(II)-(III)

Fe(OH)3

Fe(OH)3

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H2SFe2+

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SRB

Fe(OH)3

DIR

Cycle moderne du fer

VolcanismeTectonique

~5.1011 mol.an-1

Exporthydrothermal

Page 15: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

15

Figure I-2.b : Cycle du fer précambrien: Si la quantification des flux de fer à la surface de la

Terre précambrienne est très incertaine, il est couramment admis que le volcanisme était une

des principales sources de fer, sous forme de Fe(II) (Canfield, 1998) avec l’érosion

continentale. L’export hydrothermal de fer, probablement beaucoup plus important qu’à

l’actuel, conduisait à la dissolution de Fe(II) s’accumulant dans l’océan archéen à des

concentrations évaluées à 40-120 µmol.L-1

(Canfield et al., 2006), voire entre 1.8 et 3.6

mmol.L-1

à proximité directe des panaches hydrothermaux (Kump & Seyfrid, 2005,

Konhauser et al., 2007). L’encart A représente les mécanismes susceptibles de conduire au

dépôt de BIF dans l’océan archéen ou paléoprotérozoïque (d’après Konhauser et al., 2002 et

Konhauser et al., 2007), i.e. à des périodes où la pO2 atmosphérique était faible et la

concentration en sulfates dans l’océan également limitée. La précipitation d’oxydes de fer est

catalysée soit par de faibles teneurs en O2 dissous locales dans l’océan de surface, soit par

l’action des UV-A et UV-B (voir discussion dans le texte), soit par l’activité de bactéries

ferro-oxydantes phototrophes, pratiquant une photosynthèse anoxygénique (FeOB). Une

partie du Fe(III) précipité est de nouveau réduit par des bactéries ferri-réductrices (DIR),

conduisant à la formation de minéraux riches en Fe(II) (e.g. sidérite) ou à valence mixte (e.g.

magnétite). Ce dépôt des BIF se fait à une distance indéterminée de la source de Fe(II), en

alternance avec des bancs riches en silice. L’encart B présente des mécanismes susceptibles

d’expliquer la plus faible abondance des BIF à partir de 2.4-2.0 Ga. L’augmentation de la

teneur atmosphérique en O2 (Farquhar et al., 2000) conduit à une plus forte concentration en

O2 dissous dans l’océan, catalysant l’oxydation abiotique du Fe(II). De plus, la plus forte

teneur des eaux en sulfates a pu alimenter la sulfato-réduction (SRB) et soustraire du Fe(II)

dissous par précipitation sous forme de sulfures de fer (e.g. FeS2) (Johnson et al., 2008,

Canfield, 1998).

Figure I-2.b

Cycle précambrien du fer

Fe2+

DIR

Oxique

Anoxique

UV-A, UV-C

Zo

ne

ph

otiq

ue

Fe2+

FeOB

Fe(OH)3

Fe(OH)3

Minéraux Fe(II) Fe(OH)3

O2

Erosion continentale

Volcanisme

[Fe(II)dissous]=0.04-4 mmol.L-1

Altérationhydrothermale

?

Faible pO2, Faible [SO42-]: périodes de dépôt des BIF Présence d’O2, Forte [SO4

2-]: 2.4-2.0 Ga

Oxique

Anoxique

Fe2+

Fe2+

FeS2

O2

Fe(OH)3

SO42-

H2S

FeS2A B

FeSi

Subduction

SRBTransport

Exporthydrothermal

Fe2+ Fe3+

Figure I-2.b

Cycle précambrien du fer

Fe2+

DIR

Oxique

Anoxique

UV-A, UV-C

Zo

ne

ph

otiq

ue

Fe2+

FeOB

Fe(OH)3

Fe(OH)3

Minéraux Fe(II) Fe(OH)3

O2

Erosion continentale

Volcanisme

[Fe(II)dissous]=0.04-4 mmol.L-1

Altérationhydrothermale

?

Faible pO2, Faible [SO42-]: périodes de dépôt des BIF Présence d’O2, Forte [SO4

2-]: 2.4-2.0 Ga

Oxique

Anoxique

Fe2+

Fe2+

FeS2

O2

Fe(OH)3

SO42-

H2S

FeS2A B

FeSi

Subduction

SRBTransport

Exporthydrothermal

Fe2+ Fe3+

Page 16: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

16

2. Les BIF, biomarqueurs de métabolismes anaérobies ?

Les BIF sont des formations sédimentaires, composées d’une alternance de lits

centimétriques à métriques riches en fer (~20-40 poids-%) et de bancs riches en silice (~40-60

poids-% SiO2). Les minéraux porteurs de fer incluent l’hématite (FeIII

2O3), la magnétite

(FeII(Fe

III)2O4) et la sidérite (Fe

IICO3). Ces formations datent de l’Archéen (3.5-2.5 Ga) et du

Paléoprotérozoïque (2.5-1.8 Ga) et incluent le Groupe de Hamersley (Australie occidentale) et

le super-groupe du Transvaal (Afrique du Sud), qui sont épais de plusieurs centaines de

mètres, couvrent plus de 105 km² de surface et contiennent plus de 10

13 tonnes de fer (Klein,

2005).

Il est couramment admis que la source de fer est d’origine hydrothermale (Jacobsen &

Pimentel-Klose, 1988, Bau & Möller, 1993, Frei & Polat, 2007), qui aurait pu libérer du

Fe(II) dissous à des concentrations de l’ordre de 1.8 à 3.6 mM localement (Konhauser et al.,

2007, Kump & Seyfried, 2005). Cependant, la distance entre la source de fer et le lieu de

dépôt est très incertaine. Le Fe3+

étant très insoluble à pH neutre (Cornell & Schwertmann,

2003), il est généralement suggéré que le fer était transporté sous sa forme réduite soluble,

Fe2+

. Le redox moyen des couches riches en fer constituant les BIF étant Fe2.4+

(Klein, 2005),

des réactions d’oxydation ont donc conduit à la précipitation du Fe(II) émis au niveau des

sources hydrothermales et transporté vers les zones de dépôt. Plusieurs hypothèses sont

proposées pour expliquer ces réactions d’oxydation massive (voir la revue par Konhauser,

2007 et Figure I-2.b):

(1) Le Fe(II) pourrait être photo-oxydé dans des eaux acides (Cairns-Smith, 1978) ou à

pH neutre (Braterman et al., 1983) par les forts flux de photons ultraviolets atteignant

la surface de la Terre en l’absence de couche d’ozone. Des expériences reproduisant

plus finement la chimie de l’hydrosphère précambrienne, notamment prenant en

compte la richesse en carbonates et silicates de la colonne d’eau, concluent cependant

que ces mécanismes auraient joué un rôle négligeable dans le dépôt des BIF

(Konhauser et al., 2007). Elles suggèrent au contraire l’implication de mécanismes

biologiques.

(2) L’O2 produit par les microorganismes pratiquant la photosynthèse oxygénique pourrait

entraîner la précipitation d’oxy(hydroxy)des de Fe(III) dans des « oasis oxygénés » se

développant au sein de « blooms » de cyanobactéries.

(3) Un autre type de photosynthèse aurait pu entraîner de façon directe l’oxydation du

Fe(II) en Fe(III) : il s’agit d’une photosynthèse anoxygénique (ne produisant pas

Page 17: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

17

d’O2), utilisant le Fe(II) comme source d’électrons (à la place de l’H2O, par

comparaison avec la photosynthèse oxygénique). Plusieurs bactéries pourpres et vertes

ont été décrites qui présentent ce type de métabolisme (Widdel et al., 1993, Ehrenreich

& Widdel, 1994, Heising et al., 1999, Kappler & Newman, 2004), qui est considéré

comme une des formes les plus anciennes de photosynthèse (Xiong et al., 2000). Il a

été proposé que l’activité de tels microorganismes dans les océans précambriens

pourrait expliquer le dépôt de tout ou de la majeure partie des BIF (Konhauser et al.,

2002, Kappler et al., 2005).

Le Fe(III) précipité par l’une ou l’ensemble de ces réactions (abiotiques ou catalysées par

le vivant) est ensuite susceptible d’être réduit par des microorganismes utilisant le Fe(III)

comme accepteur final d’électrons, bouclant ainsi le cycle précambrien du fer (Figure I-2.b).

Il a été évalué qu’environ 70% du Fe(III) ainsi formé pourrait être recyclé dans la colonne

d’eau via l’activité de bactéries couplant la réduction du Fe(III) à l’oxydation du carbone

organique (Konhauser et al., 2005). Si une partie de la magnétite (oxyde de fer contenant 1

Fe2+

pour 2 Fe3+

) présente dans les BIF pourrait résulter d’une réduction abiotique

d’hydroxydes ferriques ou d’hématite par les kérogènes lors d’épisodes métamorphiques

(Ayers, 1972), la ferri-réduction bactérienne pourrait également expliquer en grande partie sa

présence dans les BIF.

3. L’apparition des premiers eucaryotes dans un environnement progressivement

oxydant

Plus aucun BIF n’est connu à la surface de la Terre après -1.8 Ga (mis à part les BIF

formés vers -750 et -600 Ma, dans les conditions très particulières imposées par les

glaciations sturtiennes et varangiennes (Evènements « Snowball »), voir Figure I-1),

suggérant la persistance d’un océan profond anoxique jusqu’à ces dates. En revanche, les

dépôts rouges riches en hématite (FeIII

2O3) se généralisent à partir de cette époque. Cette

séquence minéralogique suggère une augmentation progressive de la teneur atmosphérique en

O2. L’oxygénation progressive de l’atmosphère peut être finement tracée à l’aide des

compositions isotopiques du soufre enregistrées dans les roches. Il existe effectivement un

fractionnement indépendant de la masse pour de faibles teneurs en O2 (en raison de la

photolyse de SO2 induite par les UV en l’absence de couche d’O3), qui disparait en présence

de fortes teneurs en O2 (Farquhar et al., 2000). L’ensemble de ces données isotopiques et

Page 18: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

18

minéralogiques ont permis de retracer l’évolution de la pression partielle en O2 atmosphérique

au cours des temps géologiques : elle augmente progressivement de -2.4 à -2.0 Ga et après

une seconde augmentation vers -0.6 Ga (Canfield & Teske, 1996, Catling & Claire, 2005),

atteint des valeurs proches de la pO2 actuelle entre -0.6 Ga et -540 Ma (Figure I-1).

L’augmentation initiale progressive de la teneur en O2 atmosphérique est attribuée à l’activité

des cyanobactéries (qui pratiquent la photosynthèse oxygénique) dont le produit métabolique

aurait commencé à s’accumuler dans l’atmosphère après que les composés réduits exposés à

la surface de la Terre (gaz volcaniques, croûte) ont été oxydés (Kerr, 2005).

C’est dans ce contexte d’oxygénation initiale des environnements de surface que sont

apparus les premiers eucaryotes (Figure I-1). Les premiers fossiles eucaryotes sont cependant

très controversés. Souvent considéré comme le plus ancien fossile eucaryote, le fossile de

Grypania spiralis daté à -2 Ga (Han & Runnegar, 1992) pourrait en fait correspondre à de

larges filaments de cyanobactéries (Cavalier-Smith, 2002). Par ailleurs, les plus anciens

fossiles d’acritarches sont datés à -1.5 Ga (Javaux et al., 2001). Enfin, en se basant sur

l’utilisation de données moléculaires, l’apparition des mitochondries est estimée à environ -2

Ga (Hedges et al., 2004) et celle des plastes entre -1.5 Ga (Hedges et al., 2004) et -1.1 Ga

(Douzery et al., 2004). Cependant, il est suggéré que l’état anoxique et la forte teneur en

sulfures (Anbar & Knoll, 2002) dans l’océan profond jusque vers -1 Ga auraient limité le

développement des eucaryotes photosynthétiques, même si les pré-requis (du point de vue de

l’écologie et du cytosquelette) pour leur diversification étaient établis depuis -1.5 Ga environ

(Javaux et al., 2001). La première radiation évolutive de métazoaires enregistrée dans le

registre fossile (la faune d’Ediacara, constituée d’organismes à corps mou, -575 à -542 Ma)

fait suite à un épisode « Snowball » (Terre totalement recouverte d’une couverture de glace).

La disparition de ces groupes fossiles à la base du Cambrien pourrait être liée un évènement

anoxique majeur (Kimura & Watanabe, 2001) ou à la généralisation de la prédation (Bengtson

& Zhao, 1992). La diversification qui a suivi, qualifiée d’explosion cambrienne (-543 Ma), a

conduit à la mise en place de tous les grands plans d’organisation de métazoaires connus :

tous les phyla actuels étaient déjà présents au Cambrien et aucun nouveau phylum n’a émergé

au cours des 500 Ma suivants (Lopez-Garcia et al., 2006). Les Diplomonades actuels -

anaérobies aérotolérants et ne possèdant pas de mitochondries - seraient les descendants des

plus anciens eucaryotes d’un point de vue phylogénétique (Hedges et al., 2004).

Une des différences majeures entre l’évolution des procaryotes et des eucaryotes est donc

constituée par les propriétés redox des milieux dans lesquels ils se sont diversifiés : les

procaryotes ont initialement évolué dans des environnements anoxiques, tandis que la

Page 19: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

19

diversification des eucaryotes a opéré dans des environnements oxygénés (Raymond & Segrè,

2006), ce qui a laissé des traces observables très distinctes dans les protéomes (et

potentiellement les génomes) des organismes actuels (Dupont et al., 2006).

4. L’évolution de l’écologie de l’arsenic, reflet de l’oxygénation progressive de la

Terre ?

L’évolution des métabolismes utilisant l’arsenic et des mécanismes de résistance à ce

métalloïde toxique peut être considérée au regard de l’évolution géochimique de la surface de

la Terre, en particulier de l’oxygénation progressive de l’atmosphère. Le cycle de l’arsenic est

très fortement couplé au cycle du fer dans les environnements superficiels de la Terre actuelle.

En effet, les oxy-hydroxydes de fer ont la capacité d’adsorber ou de co-précipiter avec

l’arsenic, contrôlant ainsi sa mobilité dans l’environnement (Morin & Calas, 2006). Sur la

Terre actuelle, l’arsenic est libéré à de fortes concentrations dans différents systèmes, en

particulier dans certains cours d’eau résultant du drainage de déchets miniers (voir

paragraphe 5b.) ainsi qu’au niveau des systèmes hydrothermaux continentaux ou sous-

marins (e.g. Inskeep et al., 2004, Price et al., 2007). Ces environnements partagent de

nombreuses similitudes avec les environnements précambriens, dont ces fortes teneurs en

arsenic. En particulier, la forme réduite la plus commune de l’arsenic dans ces

environnements actuels – As(III) (ou arsenite) – devait prédominer sur la Terre archéenne

anoxique.

Divers métabolismes bactériens utilisent l’arsenic comme accepteur (réduction

dissimilatrice de l’As(V) ou arsenate) ou donneur d’électrons (oxydation de l’As(III) ou

arsenite) (Oremland & Stolz, 2003). L’oxydation de l’As(III) est liée à l’activité d’une

arsenite oxydase très conservée dans l’évolution (Aro, pour Arsenite oxidase) (Stolz et al.,

2006). La réduction bactérienne dissimilatrice de l’As(V) est quant à elle subordonnée à

l’activité d’une arsenate réductase (Arr, pour Arsenate reductase) (Stolz et al., 2006).

L’analyse phylogénétique très récente des séquences de ces enzymes chez différentes espèces

suggère qu’une sous-unité protéique de l’arsenite oxydase responsable de l’oxydation de

l’As(III) a émergé avant la divergence Archées/Bactéries, donc il y a plus de 3 Ga (Lebrun et

al., 2003). En revanche, Arr aurait évolué plus tardivement, non pas par modification d’Aro,

mais plutôt à partir de polysulfure réductases primitives (Duval et al., 2008). Cette évolution

peut être interprétée au regard de l’oxygénation progressive de l’atmosphère : tout d’abord, la

Page 20: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

20

présence d’As(V) à de fortes teneurs dans l’environnement nécessite la présence d’O2, ce qui

expliquerait que les métabolismes de respiration de l’As(V) se sont surtout diversifiés après

que l’atmosphère a été oxygénée, donc plus tardivement que les métabolismes d’oxydation de

l’As(III) (Duval et al., 2008). De plus, étant donnés les plus faibles potentiels redox des

sulfures (E0’(S0/HS

-)=-275 mV) et des thiosulfates (E0’(S2O3

2-/HS

-)=-400 mV), comparés au

potentiel redox du couple AsV/As

III (E0’(As

V/As

III)=-139 mV), il est probable que les

composés soufrés étaient disponibles pour des degrés d’oxydation de l’environnement plus

faibles que les composés arséniés, i.e. plus tôt dans l’histoire de la Terre. Ceci pourrait

expliquer l’ancestralité des métabolismes de réduction des sulfures sur les mécanismes de

réduction des arsenates (Duval et al., 2008).

Contemporaine de cette dernière étude, une analyse de la diversité microbienne dans le

site hydrothermal de Mono Lake a révélé la présence d’une bactérie pratiquant une

photosynthèse anoxygénique, utilisant l’As(III) comme donneur d’électrons (Kulp et al.,

2008). Une souche bactérienne chimiolithoautotrophe oxydant l’As(III) avait été

antérieurement identifiée sur ce même site (Oremland et al., 2002). L’identification de ces

métabolismes corrobore les résultats de Duval et al. (2008), impliquant que les métabolismes

bactériens fondés sur l’oxydation de l’As(III) remontent très probablement à l’époque de la

Terre primitive anoxique. Cependant, l’absence de séquences similaires à Aro dans les deux

souches identifiées à Mono Lake catalysant pourtant l’oxydation de l’As(III) et la présence de

séquences présentant une forte similarité avec Arr (sans que ces souches soient capables de

réduire l’As(V)) ouvre de nouvelles pistes pour reconsidérer l’évolution précoce des systèmes

bactériens d’oxydation-réduction de l’arsenic.

D’autres bactéries sont capables de tirer de l’énergie de l’oxydation anaérobie de l’As(III)

couplée à la réduction des nitrates (Rhine et al., 2006). L’As(V) produit par l’ensemble de ces

métabolismes pourrait avoir soutenu une biomasse primitive hétérotrophe utilisant l’As(V)

comme accepteur terminal d’électrons.

Ces métabolismes peuvent donner lieu à des minéralisations spécifiques, qui peuvent être

recherchées dans le registre fossile. Si ces minéralisations, souvent riches en Fe et As, ont été

bien caractérisées chez des microorganismes procaryotes actuels exposés à de fortes

concentrations en fer et arsenic dans le milieu naturel (Inskeep et al., 2004, Morin et al., 2003,

Benzerara et al., 2008), les signatures minérales potentielles laissées par des eucaryotes

exposés à ces mêmes conditions n’ont été que très peu étudiées jusqu’à présent (Mann et al.,

1987, Brake et al., 2001).

Page 21: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

21

Chez les eucaryotes, l’arsenic n’est pas utilisé comme métabolite. En revanche, comme

chez la plupart des procaryotes utilisant ou n’utilisant pas l’arsenic pour leur métabolisme, des

mécanismes de résistance à l’As(IIII) et à l’As(V) (voir Chapitre 2B pour un résumé de la

toxicité de ces deux éléments), ont été développés. Un résumé plus détaillé des connaissances

actuelles sur les mécanismes de résistance à l’arsenic chez les procaryotes et eucaryotes est

donné au Chapitre 2B. Le schéma de détoxification de l’arsenic est globalement le même chez

l’ensemble des procaryotes et eucaryotes étudiés jusqu’à ce jour. Cependant, les protéines

impliquées dans ces mécanismes résulteraient de chemins évolutifs distincts (Mukhopadhyay

& Rosen, 2002). Par ailleurs, les enzymes impliquées dans la détoxification de l’arsenic chez

les procaryotes ne semblent pas avoir de liens évolutifs avec les systèmes bioénergétiques

utilisant l’arsenic (Arr et Aro) (Silver & Phung, 2005). Si les mécanismes de résistance à

l’arsenic chez les eucaryotes ne dérivent pas de ceux connus chez les procaryotes, une

hypothèse à tester est leur potentielle parenté avec les mécanismes de résistance aux stress

oxydatifs développés chez les eucaryotes au cours de leur évolution sur une Terre oxygénée.

En effet, ces mécanismes de résistance aux stress oxydatifs ont pu être adaptés à la résistance

aux stress métalliques (Fahey et al., 1987), en particulier à l’arsenic.

5. Des modèles actuels des environnements et des métabolismes primitifs

Au cours de cette thèse, nous avons étudié deux systèmes procaryotes oxydant le Fe(II) en

conditions anoxiques et un système eucaryote pratiquant la photosynthèse oxygénique, tous

trois exposés à des conditions, dont certaines peuvent s’apparenter à celles régnant sur la

Terre primitive. Plus que simuler les conditions de l’Archéen, le recours à des

microorganismes modèles cultivables en laboratoire, issus d’environnements actuels extrêmes

(anoxie, forte minéralisation, concentrations élevées en métaux ou métalloïdes) permet

d’étudier les mécanismes fondamentaux de détoxification et de biominéralisation. L’étude des

biominéralisations induites par ces microorganismes actuels ouvre également la possibilité de

disposer, dans le futur, de bases tangibles qui permettront de rechercher des signatures de

métabolismes comparables dans des échantillons anciens. De plus, les outils de géochimie

isotopique étant de plus en plus utilisés pour la recherche de ces métabolismes anciens, il sera

intéressant de disposer au laboratoire de modèles bien contraints, tels que ceux étudiés au

cours de cette thèse, afin de mieux comprendre –dans le futur- l’origine des fractionnements

isotopiques mesurés en fonction des conditions de milieu. Enfin, l’utilisation de ces modèles

Page 22: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

22

issus d’environnements actuels présente un intérêt immédiat pour la compréhension de ces

milieux.

Nous avons fait le choix d’étudier deux systèmes modèles, permettant d’explorer des

questions scientifiques centrales à l’heure actuelle en biogéochimie:

(a) Des bactéries capables d’oxyder le Fe(II) sans utiliser O2 dans des conditions proches

de la neutralité acido-basique. Il s’agit d’un des modèles à tester pour la formation des BIF.

(b) Des eucaryotes vivant dans des milieux pollués présentant des analogies possibles

avec certains environnements anciens, en particulier très riches en Fe(II) et en arsenic.

5.a- La biominéralisation du fer par des bactéries ferro-oxydantes anaérobie.

Certains environnements actuels sont anoxiques, tels que l’océan profond (et en

particulier la croûte océanique profonde et les systèmes hydrothermaux), les sédiments

profonds de rivière ou la colonne d’eau profonde de certains lacs. Dans ces environnements,

la photosynthèse anoxygénique (dans les zones photiques) et la chimiolithoautotrophie sont la

face cachée de la productivité primaire observée à la surface de la Terre. Ces métabolismes

sont potentiellement quantitativement très importants sur la Terre actuelle. Par exemple, il a

été proposé sur la base de calculs thermodynamiques que l’énergie libérée par les interactions

eau-roches au niveau du plancher océanique pouvait alimenter une biomasse considérable

(Bach & Ewards, 2003). Plus particulièrement, les microorganismes catalysant l’oxydation du

fer ont joué un rôle primordial sur la Terre primitive (voir paragraphe 2.) et jouent encore un

rôle majeur sur la Terre actuelle. Outre leur contribution à la productivité primaire, ces

microorganismes participent au cycle du fer (Weber et al., 2006, Figures I-2.a et I-2.b), qui est

lui-même en interaction étroite avec les cycles de nombreux autres éléments métalliques,

potentiellement toxiques. L’arsenic, par exemple, a une forte affinité pour les oxydes de fer

avec lesquels il co-précipite ou à la surface desquels il peut s’adsorber (Morin & Calas, 2006).

L’état redox du fer contrôle donc en partie la mobilité de ces polluants.

Dans le cadre de cette thèse, nous avons cultivé deux souches bactériennes ferro-

oxydantes au laboratoire. Toutes deux sont des bactéries Gram-négatives, anaérobies et

neutrophiles :

• Rhodobacter sp., souche SW2 est une α-Proteobactérie isolée d’étangs de la

région de Hanovre (Ehrenreich & Widdel, 1994). Cette bactérie pourpre non

sulfureuse pratique une photosynthèse anoxygénique en conditions anoxiques,

Page 23: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

23

utilisant le Fe(II) comme source d’électrons et la lumière comme source d’énergie,

selon la réaction suivante :

4 Fe2+

+ CO2 + 11 H2O (+hν) � <CH2O> + 4 Fe(OH)3 + 8 H+ (Eqn 1)

où <CH2O> est une formule générique pour la matière organique et où le Fe(III)

précipite sous forme d’hydroxyde ferrique Fe(OH)3. Une description plus

complète de la physiologie de cette bactérie est détaillée dans Hegler et al. (2008).

En raison de son métabolisme, cette souche constitue un bon analogue des

bactéries pratiquant la photosynthèse anoxygénique qui auraient pu participer à la

mise en place des BIF (Konhauser et al., 2002, Kappler et al., 2005).

• Proche de la β-Proteobactérie Acidovorax sp., la souche BoFeN1 a été isolée de

sédiments du lac de Constance (Kappler et al., 2005a). Elle est hétérotrophe vis-à-

vis du carbone et couple l’oxydation du Fe(II) à la réduction des nitrates, selon

l’équation suivante :

2Fe2+

+ 5H2O + NO3- � 2Fe(OH)3 + 4H

+ + NO2

- (Eqn. 2)

où le Fe(III) précipite sous forme d’hydroxyde ferrique Fe(OH)3. Il est probable

qu’un tel métabolisme soit moins ancien que la photosynthèse anoxygénique

décrite ci-dessus, la présence de nitrates impliquant la présence de dioxygène sur

Terre.

Ces deux souches catalysent donc l’oxydation du Fe(II) en Fe(III) en conditions anoxiques.

Le Fe(III), très insoluble à pH neutre (Cornell & Schwertmann, 2003), précipite

instantanément. Les biominéralisations résultant de l’activité de ces microorganismes

anaérobies ont été très peu étudiées jusqu’à présent. Pourtant, les oxydes de fer sont

ubiquistes dans le registre fossile et la question de leur potentielle biogénicité a été souvent

posée (e.g. Little et al., 2004, Ivarsson et al., 2008). Les biominéralisations riches en fer

produites par des bactéries ferro-oxydantes présentent une grande variété (Figure I-3). La

plupart des études ont relevé la similarité entre les filaments d’oxydes de fer observés dans les

roches anciennes ou actuelles et ceux produits par des bactéries ferro-oxydantes micro-

aérobies telles que Gallionella ou Leptothrix (Fortin & Langley, 2005, Figure I-3).

Cependant, les signatures potentielles de l’activité passée de bactéries ferro-oxydantes

anaérobies n’ont jamais été observées dans les roches anciennes, probablement en raison de la

rareté des études portant sur ces métabolismes. Les preuves du rôle crucial des bactéries ferro-

oxydantes anaérobies dans les cycles géochimiques passés (voir supra et Konhauser, 1998;

Page 24: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

24

Kappler et al., 2005; Posth et al., 2008) et de leur implication potentielle dans la formation de

tubes dans des verres basaltiques sont ainsi très indirectes (e.g. Furnes et al., 2005; Benzerara

et al., 2007). Afin de tester ces hypothèses de biogénicité, une caractérisation fine des

biominéralisations formées par des bactéries ferro-oxydantes anaérobies est nécessaire. Un

des objectifs de cette thèse était donc de caractériser finement la minéralogie des phases

formées par ces deux souches bactériennes modèles, à l’aide d’outils essentiellement

microscopiques et spectroscopiques permettant de sonder la matière de l’échelle

micrométrique à l’échelle atomique (Chapitre 1). En particulier, les premiers stades de la

fossilisation des cellules (impliquant la formation de microfossiles) et la préservation de

matière organique (contenant des biomarqueurs potentiels) dans ces minéralisations a été

explorée (Chapitre 1D).

Par ailleurs, l’étude de ces systèmes a une portée plus fondamentale pour la

compréhension des mécanismes de biominéralisation et de détoxification. En effet, les

bactéries pratiquant l’oxydation du fer sont confrontées à la forte insolubilité du produit de

leur métabolisme, susceptible de créer une barrière limitant les échanges avec le milieu

extérieur en précipitant sur les structures cellulaires et menaçant donc potentiellement la

viabilité de ces microorganismes. La minéralisation massive de leur environnement pose donc

des questions fondamentales sur l’adaptation de ces souches à ces conditions extrêmes. Les

deux souches que nous avons utilisées au cours de cette thèse présentent des motifs de

biominéralisation distincts (Figure I-3), résultats possibles de degrés d’adaptation ou de

stratégies adaptatives différents, que nous avons parallèlement étudiés.

Page 25: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

25

Figure I-3 : Quelques illustrations de la variété des biominéralisations du fer. Images de

microscopie électronique à balayage sur des cellules entières (A à C) et de microscopie

électronique en transmission sur des coupes de cellules incluses en résine époxy (D à J).

Bactéries ferro-oxydantes neutrophiles microaérophiles : (A) et (D) cellules de Galionella sp.,

produisant des chaînes d’oxydes de fer (B) et (E) cellules de Leptothrix sp.(c), dans des tubes

(t) d’oxydes de fer (cellules prélevées dans des eaux stagnantes en forêt de Brocéliande,

Collaboration X. Châtelier, CAREN, Rennes). Bactéries neutrophiles anaérobies : (C) et (F)

cellules d’Acidovorax sp., souche BoFeN1 (c), présentant une minéralisation riche en fer dans

le périplasme (p) et sous forme de globules (g) à la surface de la cellule (Cultures, voir Miot

et al., soumis #1, p. 43), (G) Cellules de Rhodobacter sp., souche SW2 (c), entourée de

minéraux riches en fer (m), à distance de la cellule (Cultures, voir Schaedler et al., soumis).

Bactéries ferro-oxydantes acidophiles : (H) Cellule d’Acidithiobacillus ferroxidans entourée

d’hydroxyde de fer-arsenic (Cultures, Collaboration Marion Egal, Corinne Casiot, Laboratoire

Hydrosciences de Montpellier), (I) et (J) bactéries ferro-oxydantes issues de l’AMD de

Carnoulès (voir Benzerara et al., 2008) présentant une fine couche minéralisée interne et une

gangue minérale externe plus épaisse (flèches) (I) ainsi que des vésicules minéralisées

émergeant des cellules (flèches) (J).

Figure I-3

100nm

500 nm 500 nm 1 µm

C

H I J

500 nm 200 nm100 nm

F GE

C t Cp

g

C

m

1 µm

D

1 µm

A

1 µm

B

Figure I-3

100nm

500 nm500 nm 500 nm500 nm 1 µm1 µm

C

H I J

500 nm 200 nm100 nm

F GE

C t Cp

g

C

m

1 µm

D

500 nm500 nm 200 nm200 nm100 nm100 nm

F GE

C t Cp

g

C

m

1 µm

D

1 µm

D

1 µm

A

1 µm

B

Page 26: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

26

Ces études ont nécessité un certain nombre de développements méthodologiques,

présentés dans les chapitres précédant les articles composant cette thèse :

• La culture de bactéries en conditions anoxiques et la préservation du redox des

échantillons (Chapitre 1).

• La Spectromicroscopie X (STXM) aux seuils L2,3 du fer et la quantification des

rapports Fe(II)/Fe(III) à l’échelle sub-micrométrique (Chapitre 1A).

• La Spectroscopie d’Absorption X (XAS) au seuil K du fer pour la

détermination du redox et l’analyse de particules finement divisées (Chapitre

1B).

• La Spectromicroscopie X (STXM) au seuil du C et les méthodes de corrélation

Fe/C à l’échelle sub-micrométrique (Chapitre 1C).

• La Cryo-Microscopie Electronique de Sections Vitreuses (CEMOVIS) pour

l’observation en conditions natives des associations minéral-matière organique

(Chapitre 1D).

• Les techniques de microscopie en fluorescence et de culture en milieu solide

pour l’estimation de la viabilité bactérienne (Chapitre 1E).

5.b- La résistance aux métaux/métalloïdes chez un eucaryote photosynthétique :

Les drainages miniers acides (AMD ou Acid Mine Drainages) constituent un autre

type d’environnement actuel extrême présentant des similarités avec les environnements

passés de la Terre. Les AMD résultent de l’oxydation de déchets miniers riches en sulfures et

en particulier en pyrite (FeS2), sous l’action des eaux de pluie. L’oxydation de la pyrite est

spontanée en présence d’O2 ou de Fe3+

et elle acidifie les eaux en libérant des sulfates ou des

thiosulfates et du Fe2+

, selon la réaction suivante par exemple :

FeS2 + 6 Fe3+

+ 3 H2O � 7 Fe2+

+ S2O32-

+ 6 H+ (Eqn. 3)

Cette réaction d’oxydation peut être amplifiée par l’activité de microorganismes

chimiolithoautotrophes catalysant l’oxydation des sulfures, tels que Thiomonas sp. (Johnson

& Hallberg, 2005), Sulfobacillus sp. ou Acidithiobacillus caldus (Druschel et al., 2004). En

outre, la dissolution oxydative de la pyrite peut également être accélérée par l’activité de

microorganismes lithotrophes catalysant l’oxydation du Fe2+

par l’O2 dissous (réaction très

lente en conditions abiotiques, à pH acide), ce qui conduit à la régénération du Fe3+

dans ces

Page 27: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

27

systèmes (e.g. Acidithiobacillus ferroxidans, Johnson & Hallberg, 2003, Duquesne et al.,

2003), selon la réaction (4) :

4 Fe2+

+ O2 + 4 H+ � 4 Fe

3+ + 2 H2O (Eqn. 4)

Certaines bactéries et archées peuvent également oxyder le thiosulfate - produit de

l’oxydation de la pyrite (Eqn. 3) - et produire de l’acide sulfurique selon l’équation suivante :

S2O32-

+ 2 O2 + H2O � 2 H+ + 2 SO4

2- (Eqn. 5)

Enfin, le Fe3+

peut être hydrolysé selon la réaction suivante:

Fe3+

+ 3 H2O � Fe(OH)3 + 3 H+ (Eqn. 6)

L’ensemble de ces réactions libère des quantités massives de fer (1.6-1700 mg.L-1

, Johnson &

Hallberg, 2003, Casiot et al., 2004) et de sulfates (150-4900 mg.L-1

, Johnson & Hallberg,

2003, Casiot et al., 2004). Par ailleurs, les réactions (3), (5) et (6) libèrent des protons,

conduisant à une forte acidification des eaux, le pH variant généralement entre 0.5 et 6.5 dans

ces systèmes (Johnson & Hallberg, 2003).

Les sulfures et autres minéraux présents dans les déchets miniers à l’origine de ces

AMD sont généralement enrichis en métaux traces, tels que Zn, Mn, Cu, As qui sont donc

libérés au cours des réactions d’altération. L’arsenic, en particulier, est généralement présent

en substitution du soufre dans les pyrites, ou sous forme d’arsenopyrite FeAsS ou de löllingite

FeAs2. L’oxydation de l’arsenopyrite, selon le même principe que la réaction d’oxydation de

la pyrite (Eqn. 3), libère du fer et des sulfates, mais aussi de grandes quantités d’acide

arsénieux, selon la réaction suivante :

FeAsS + 11/4 O2 + 3/2 H2O � Fe2+

+ SO42-

+ H3AsO3 (Eqn. 7)

L’arsenic, libéré sous forme d’As(III) (arsenite), est ensuite oxydé, selon la réaction (8),

généralement catalysée par des microorganismes chimiolithoautotrophes (e.g. Thiomonas sp.,

Bruneel et al., 2003, Duquesne et al., 2007) :

H3AsO3 + ½ O2 � H2AsO4- + H

+ (Eqn. 8)

Dans les conditions de pH acides régnant dans les AMD, l’arsenic dissous est présent sous

deux formes dominantes très toxiques : H3AsIII

O3 et H3AsVO4. Si l’As(III) domine dans les

AMD, les concentrations en As(V) peuvent être également très élevées. Les concentrations

totales en arsenic peuvent avoisiner les 200 mg.L-1

(Morin & Calas, 2006), dépassant jusqu’à

20 000 fois les normes imposées pour les eaux potables (10 µg.L-1

, Smedley & Kinniburgh,

2002).

Par comparaison avec des eaux non polluées, les AMD présentent une faible diversité

bactérienne, dominée par des espèces impliquées dans les cycles du Fe et du S (Bruneel et al.,

2006). De même, la diversité eucaryote est très limitée, dominée par des champignons (Baker

Page 28: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

28

et al., 2004) et des algues (e.g. Euglena sp.). Le genre Euglena est l’un des seuls genres

eucaryotes adapté à ces conditions extrêmes, représenté par deux espèces ubiquistes dans les

AMD : E. mutabilis et E. gracilis (Kapfer et al., 1998, Casiot et al., 2004, Bruneel et al.,

2006). Ces deux espèces sont des eucaryotes unicellulaires acidophiles pratiquant la

photosynthèse oxygénique, ancrés proche de la racine des eucaryotes (Figure 1-4, Watanabe

& Gray, 2000, Hedges et al., 2004). Si les premières traces présumées d’Euglénoïdes dans le

registre fossile (Moyeria, Colbath & Grenfell, 1995) remontent au Silurien (-443 à -416 Ma),

les données moléculaires suggèrent une divergence avec les autres eucaryotes vers -1.9 Ga

(Hedges et al., 2004).

Si les métabolismes des procaryotes présents dans les AMD ne sont pas encore

parfaitement compris, beaucoup moins d’études encore se sont penchées sur les mécanismes

adaptatifs des eucaryotes rencontrés dans ces milieux extrêmes (Casiot et al., 2004). L’activité

des bactéries et archées, en particulier ferro-oxydantes ou arsenite-oxydantes, conduit

classiquement à la formation de biominéralisations riches en Fe et As pouvant participer à la

détoxification partielle des sites. Ces biominéralisations ont été bien caractérisées dans

certains AMD (Morin et al., 2003, Benzerara et al., 2008), ou dans des sites géothermaux de

chimie comparable (Inskeep et al., 2004). En revanche, les éventuelles biominéralisations

produites par des eucaryotes adaptés à ces conditions extrêmes n’avaient que très peu été

étudiées jusqu’à présent (Mann et al., 1987, Brake et al., 2001). De telles biominéralisations

d’origine eucaryote adaptés à des conditions acides, riches en Fe et As, s’apparentant

potentiellement à celles de certains environnements primitifs, pourraient guider la recherche

de fossiles eucaryotes dans des roches anciennes. De plus, les mécanismes de résistance de

ces eucaryotes aux conditions extrêmes des AMD, en particulier à l’arsenic, restaient jusqu’à

maintenant largement inexplorés. Un second volet de cette thèse a donc consisté en l’étude

des mécanismes de résistance d’E. mutabilis et E. gracilis à certaines des conditions extrêmes

des AMD. D’une part, E. mutabilis, collectée dans l’AMD de Carnoulès, a été étudiée dans le

cadre de la caractérisation de biominéralisations riches en fer produites par des eucaryotes

(Chapitre 2A). D’autre part, classiquement utilisée dans les études de phytotoxicité (Einicker-

Lamas et al., 2002, Mendoza-Cozatl et al., 2002, Aviles et al., 2003, Rochetta et al., 2006), E.

gracilis a été cultivée au laboratoire à pH acide en présence de fortes concentrations en Fe(II)

dissous et/ou arsenic, équivalentes aux concentrations rencontrées dans les AMD. Les

mécanismes de détoxification du fer et de l’arsenic ont ensuite été étudiés à l’aide d’outils

microscopiques, spectroscopiques et biochimiques (Chapitre 2). L’intérêt de l’utilisation de la

Page 29: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

29

Spectroscopie d’Absorption des Rayons X (XAS) pour l’analyse des métaux traces et son

couplage aux méthodes biochimiques est explicité au Chapitre 2B.

Page 30: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

30

Page 31: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

31

Chapitre 1.

Biominéralisation du fer par des

bactéries ferro-oxydantes anaérobies

neutrophiles

Page 32: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

32

Page 33: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

33

Dans le cadre de l’étude de la biominéralisation du fer par des bactéries ferro-oxydantes

anaérobies, nous avons cherché à caractériser les produits minéraux de deux métabolismes

microbiens : la photosynthèse anoxygénique en conditions anoxiques (souche SW2) et la

dénitrification ferreuse (souche BoFeN1). Bien que ces souches, toutes deux ferro-oxydantes,

soient cultivées dans le même milieu de culture (mis à part les nitrates et l’acétate présents

uniquement dans le milieu de culture de la souche BoFeN1) et au même pH (~ 7), les motifs

de biominéralisation observés chez ces deux bactéries sont très différents (voir Figure I-3):

l’oxydation du fer conduit à un encroûtement des structures cellulaires de BoFeN1, tandis que

le fer précipite presqu’exclusivement à distance des cellules de SW2. Avec l’objectif de

mieux comprendre in fine l’origine de cette différence, notre approche a consisté à coupler la

caractérisation minéralogique des phases formées au cours des cultures, de l’échelle

microscopique à l’échelle atomique, à l’analyse de leurs interactions avec les bactéries ou les

molécules organiques en présence. L’étude de l’interface minéral-matière organique a ainsi

fourni des contraintes sur les mécanismes de la biominéralisation du fer en conditions

anoxiques, ainsi que des marqueurs fossiles qui pourraient être recherchés dans le registre

géologique. Cette étude a consisté dans un premier temps à suivre l’évolution temporelle de la

minéralogie et du degré d’oxydation du fer dans les biominéralisations formées par la souche

BoFeN1 en présence de fer dissous (Chapitre 1A). Une part importante du Fe(II) présent à la

surface de la Terre étant immobilisée dans des phases solides, les mécanismes de

transformation du fer solide (ici un phosphate de Fe(II), la vivianite) par la même souche ont

ensuite été étudiés (Chapitre 1B). Une comparaison avec les biominéralisations formées par la

souche phototrophe SW2 est présentée au Chapitre 1C. Enfin, le Chapitre 1D met en évidence

les premières étapes de fossilisation d’une bactérie ferro-oxydante (BoFeN1) et fournit une

visualisation directe de protéines et d’une structure cellulaire fine (le peptidoglycane)

préservées dans un microfossile.

Les deux souches modèles utilisées ont été cultivées en conditions strictement anoxiques,

dans des milieux de culture de composition chimique similaire. Le travail avec des souches

anaérobies strictes a nécessité le développement et l’utilisation de protocoles adaptés, en

particulier pour la préparation des milieux de culture, mais aussi pour la préparation

d’échantillons en vue de leur caractérisation minéralogique.

Culture de bactéries en conditions anoxiques strictes. Un protocole de préparation du

milieu de culture sous une atmosphère N2/CO2 (80/20, v/v) a été employé, adapté d’après

Page 34: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

34

Widdel et al., 1993 (Figure 1-1, voir Protocoles p. 261). Le milieu de base, riche en phosphate

(4.4 mM), est tamponné par un tampon bicarbonate à pH ~ 7. Le fer est ajouté sous forme de

FeCl2 à 10 mM final dans le milieu de culture, avant inoculation des souches. Pour la culture

de la souche BoFeN1, des solutions de NaNO3 (source de nitrate) et d’acétate de sodium

(source de carbone organique) sont préalablement ajoutées à 10 mM et 5 mM final

respectivement. Les souches sont ensuite cultivées dans des flacons de 50 ou 100 mL, fermés

par un bouchon en butyl scellé, limitant les échanges avec l’atmosphère.

Figure 1-1. Schéma du protocole de préparation des milieux de culture pour les souches

BoFeN1 et SW2.

N2/CO2

(v/v: 90/10)

Milieu de base - agité et dégazé -

(NH4Cl, KH2PO4, CaCl2, MgSO4).

- Tampon NaHCO3, vitamines,

éléments trace.

- pH ~ 7,0.

Milieu dispensé dans des

flacons de culture

Addition de NO3-, acétate, FeII

(FeCl2)

Inoculation des souches

30°C

Addition de

FeII (FeCl2)

SW2 BoFeN1

N2/CO2

(v/v: 90/10)N2/CO2

(v/v: 90/10)

Milieu de base - agité et dégazé -

(NH4Cl, KH2PO4, CaCl2, MgSO4).

- Tampon NaHCO3, vitamines,

éléments trace.

- pH ~ 7,0.

Milieu dispensé dans des

flacons de culture

Addition de NO3-, acétate, FeII

(FeCl2)

Inoculation des souches

30°C

Addition de

FeII (FeCl2)

SW2 BoFeN1

Page 35: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

35

Figure 1-2. Quelques outils pour le conditionnement des échantillons en conditions

anoxiques. A : Chambre anaérobie utilisée pour la manipulation des échantillons en

conditions anoxiques (pO2 < 50ppm). B : Capillaire scellé inséré dans le goniomètre utilisé

pour la DRX. C : Fenêtres de nitrure de silicium scellées en conditions anoxiques sur un

porte-échantillon pour le STXM.

Analyses minéralogiques en conditions préservant le redox. Les premières analyses

(spectroscopie d’absorption des rayons X) que nous avons effectuées, ont révélé que les

échantillons analysés (phosphates de Fe(II) ou à valence mixte, très finement divisés) étaient

très sensibles à l’oxydation par le dioxygène de l’air. L’étude de la minéralogie des phases

formées et plus particulièrement de leur redox a donc nécessité le développement de

protocoles permettant de préserver le redox depuis la culture jusqu’à l’analyse. Une chambre

anaérobie (ou boîte à gants, Figure 1-2.) avec une atmosphère N2/H2 (5% maximum d’H2 dans

l’azote, l’H2 piégeant l’O2 sur des catalyseurs en Pt et assurant une pO2 constamment

inférieure à 50 ppm) a été employée pour la préparation de l’ensemble des échantillons. Une

centrifugeuse installée dans cette boîte à gants a permis de collecter les fractions solides des

échantillons à l’abri de l’O2. Le conditionnement des échantillons a ensuite été adapté à

chaque technique :

• Pour la microscopie électronique : les échantillons sont rincés et dilués dans une

solution anoxique (eau dégazée ou milieu de culture de base sans fer) avant dépôt sur

une grille MET.

A B C

Page 36: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

36

• Pour la Diffraction des Rayons X (DRX), les échantillons sont séchés sous vide,

broyés et dispensés dans des capillaires scellés avec de la colle glue, le tout dans la

boîte à gants.

• Pour la spectroscopie d’absorption des rayons X (XAS), les échantillons sont séchés

sous vide, broyés et dispensés dans un porte échantillon, le tout dans la boîte à gants.

• Pour la spectromicroscopie X (STXM), les échantillons rincés sont dilués dans une

solution anoxique (eau dégazée ou milieu de culture de base sans fer) avant dépôt sur

une membrane de nitrure de silicium. Une seconde membrane est délicatement

apposée à la première et l’ensemble est scellé à l’aide d’Epoxy.

Pour toutes ces préparations, les échantillons obtenus sont ensuite emballés dans un papier

aluminisé imperméable à l’O2, pour leur transport jusqu’au lieu d’analyse. Cette méthodologie

a été testée sur des échantillons de référence (e.g. vivianite). Malgré la très forte sensibilité à

l’oxydation par l’air de ces phosphates de Fe(II) finement divisés, cette méthode s’est révélée

être optimale pour la préservation du redox du fer dans nos échantillons. Aucune oxydation

détectable en spectroscopie d’absorption des rayons X (X-ray Absorption Near-Edge

Structure, XANES) n’a été observée pour les références les plus sensibles.

Page 37: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

37

Chapitre 1.A.

Biominéralisation du fer dissous par BoFeN1

Problématique et objectifs de l’étude. Les mécanismes de biominéralisation du fer par les

bactéries ferro-oxydantes anaérobies restent largement inexplorés. D’une manière générale,

du fait de la forte insolubilité du Fe(III) à pH neutre, l’oxydation bactérienne du Fe(II) conduit

à la précipitation rapide de minéraux riches en Fe(III) à proximité ou au contact direct des

structures cellulaires. Des études récentes suggèrent que différentes souches, utilisant

différents métabolismes, présentent des motifs de biominéralisation différents : ainsi, si la

souche SW2 reste majoritairement libre de précipités après l’oxydation complète du Fe(II) en

Fe(III) (Kappler & Newman, 2004), la souche dénitrifiante BoFeN1 est rapidement encroûtée

par les minéraux riches en Fe(III) formés au cours de l’oxydation du Fe(II) (Kappler et al.,

2005a). Les mécanismes permettant d’expliquer ces différents phénotypes ne sont cependant

pas encore connus. Une caractérisation et une localisation précises des produits de ces

métabolismes associés aux structures cellulaires sont donc requises pour mieux comprendre

ces phénomènes.

Dans l’article qui suit, la souche BoFeN1 a été cultivée en présence de Fe(II) dissous.

Les phases minérales résultant de l’oxydation bactérienne du Fe(II) et leur association avec

les structures biologiques ont été caractérisées à l’aide d’outils microscopiques et

spectroscopiques. En outre, le degré d’oxydation du fer dans ces phases minérales a été suivi

au cours de la culture à l’échelle sub-micrométrique. Cette étude fournit des clés pour mieux

comprendre les mécanismes de biominéralisation du fer en conditions anoxiques et à pH

neutre et ouvre par ailleurs des pistes pour la recherche de signatures de ces métabolismes

dans le registre fossile.

Méthodologie.

Spectromicroscopie X (Scanning Transmission X-ray Microscopy, STXM) au seuil du Fe.

Pour suivre l’évolution du degré d’oxydation du fer à l’échelle submicrométrique dans ces

échantillons, une technique de spectromicroscopie X, utilisant le rayonnement synchrotron a

été employée. Le STXM (Scanning Transmission X-ray Microscopy) est avant tout une

microscopie en balayage permettant d’imager des échantillons avec une résolution spatiale de

l’ordre de 25-50 nm, intermédiaire entre les microscopies électroniques et optique. Il fournit

Page 38: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

38

de plus une imagerie chimique de l’échantillon en utilisant la spectroscopie d’absorption des

rayons X (XANES, X-ray Absorption Near-Edge Spectroscopy ou NEXAFS, Near Edge X-

ray Absorption Fine Structure) mesurée à la même échelle spatiale et avec une résolution de

l’ordre de 0.1 eV. Il permet également de travailler dans des conditions plus

« environnementales » que d’autres techniques de microscopie ou de spectroscopie (par

exemple le MET), la chambre de l’échantillon étant à pression atmosphérique (généralement

sous He, donc anoxique) et non sous vide. Enfin, utilisant des rayons X de faible énergie (80

eV- 2100 eV), cette technique permet de caractériser, à l’échelle de 25 nm, à la fois des

éléments légers, tels que le carbone (seuil K, ~290 eV, difficilement accessible par les

techniques de spectroscopie X de haute énergie) et des éléments lourds comme le fer via leurs

seuils L (seuils L2,3, ~710 eV). Le spectre XANES obtenu sur un échantillon présente une

structure caractéristique de l’environnement électronique de l’atome central excité, qui permet

de déterminer la nature des groupements fonctionnels en présence (groupements

carboxyliques, cétones, amines, carbonates par exemple au seuil du C), la coordinance et/ou le

degré d’oxydation de l’élément (Fe(II) versus Fe(III) par exemple). Une description d’un

STXM et du principe d’acquisition des données (spectroscopie XANES et stacks) est donnée

en Figure 1A-1 (voir aussi Hitchcock, 2001 et Bluhm et al., 2006).

Page 39: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

39

Figure 1A.1. Principe de fonctionnement d’un STXM. A : Schéma d’un STXM. La chambre

de l’échantillon est sous pression atmosphérique d’hélium (l’air est pompé et remplacé par de

l’hélium), donc en anoxie. Le faisceau de rayons X est issu du rayonnement synchrotron. Un

monochromateur permet de sélectionner l’énergie du faisceau incident, qui est focalisé par des

lentilles sur l’échantillon. B : Une analyse chimique ponctuelle peut être réalisée en

transmission, à l’aide d’un détecteur de rayons X (e.g. photodiode), en scannant en énergie

autour du seuil d’absorption de l’élément d’intérêt (spectroscopie XANES). C : L’échantillon

peut aussi être scanné, i.e. déplacé dans le plan orthogonal au faisceau incident, permettant

d’obtenir une image de l’échantillon. Enfin, une série d’images peut être obtenue en

transmission, en faisant varier l’énergie des rayons X incidents par petits incréments (jusqu’à

environ 0.1 eV). Ainsi, on peut obtenir un spectre XANES pour chaque pixel de l’image.

Cette matrice de données à 3 dimensions (x, y, énergie) est appelée stack.

Faisceau de RX

(synchrotron)

monochromatique

Echantillon

(scanné)Détecteur

de RX

280 285 290 295 300

XANES C K-edge

Energie (eV)

Bactérie

Energie500 nm

…280

290

300

Photon Energy500 nm

Order Sorting Aperture

(OSA)

Zone Plate

=lentille

Chambre sous pression atmosphérique, anoxique (He)

Spectroscopie XANES En 2D, i.e. stacks

A

B C

Faisceau de RX

(synchrotron)

monochromatique

Echantillon

(scanné)Détecteur

de RX

280 285 290 295 300

XANES C K-edge

Energie (eV)

Bactérie

Energie500 nm

…280

290

300

Photon Energy500 nm

Order Sorting Aperture

(OSA)

Zone Plate

=lentille

Chambre sous pression atmosphérique, anoxique (He)

Spectroscopie XANES En 2D, i.e. stacks

Faisceau de RX

(synchrotron)

monochromatique

Echantillon

(scanné)Détecteur

de RX

280 285 290 295 300

XANES C K-edge

Energie (eV)

Bactérie

280 285 290 295 300

XANES C K-edge

Energie (eV)

Bactérie

Energie500 nm

…280

290

300

Photon Energy500 nm

Energie500 nm

500 nm

…280

290

300

Photon Energy500 nm

Order Sorting Aperture

(OSA)

Zone Plate

=lentille

Chambre sous pression atmosphérique, anoxique (He)

Spectroscopie XANES En 2D, i.e. stacks

A

B C

Page 40: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

40

Quantification des rapports Fe(II)/Fe(III) à l’aide des seuils L2,3 du fer en XANES. Dans le

cadre de l’étude des biominéralisations dans les cultures de bactéries ferro-oxydantes

anaérobies, nous avons développé une méthodologie donnant accès de façon semi-quantitative

aux rapports Fe(II)/Fe(III) à l’aide de données de STXM. Des stacks d’images ont été

enregistrés au seuils L2,3 du Fe, fournissant un spectre XANES en chaque pixel de la zone

d’intérêt. Les images enregistrées en transmission sont converties en densité optique, qui

s’exprime ainsi:

DO=-ln(I/I0)

où I représente l’intensité mesurée sur le pixel d’intérêt et I0 l’intensité en dehors de

l’échantillon (tenant compte de l’absorption résultant des deux membranes de nitrure de

silicium et plus généralement des contaminants éventuels présents tout le long du chemin

optique). Au seuil du fer, deux pics majeurs d’intensité relative variable sont observés à 707 et

710 eV environ. Ces deux pics sont généralement attribués au Fe(II) et au Fe(III)

respectivement. Cependant, l’approche consistant à faire une simple soustraction d’images à

ces deux énergies est très approximative et ne permet pas, par exemple, de quantifier les

rapports Fe(II)/Fe(III) dans des composés à valence mixte. Ici, des cartographies quantitatives

du Fe(II) et du Fe(III) ont été calculées en utilisant la routine « stack fit » du logiciel Axis

2000 (Hitchcock, 2001). L’algorithme calcule les spectres en chaque pixel avec une

combinaison linéaire de composés de référence (référence Fe(II) et référence Fe(III)) et d’une

constante, tenant compte de l’absorption de fond par les autres éléments que le fer (valeur de

l’OD sous le seuil).

Les spectres XANES extraits de régions d’intérêt (par exemple bactéries ou précipités

extracellulaires) sont également « fittés » pour estimer les proportions relatives de Fe(II) et de

Fe(III) dans les différentes zones de l’échantillon. Pour cela, l’aire sous les pics L2 et L3 des

spectres au seuil L2,3 du Fe est normalisée à 1. L’absorbance des composés contenant

majoritairement du Fe(II) est multipliée par un facteur correctif de 4/5, prenant en compte la

différence d’occupation des orbitales 3d entre les ions Fe2+

et Fe3+

(Thole et al., 1994). Les

spectres obtenus sont « fittés » avec des combinaisons linéaires des spectres normalisés de

références Fe(II) et Fe(III) en utilisant le code basé sur l’optimisation des gradients conjugués

(CGO) du logiciel Axis 2000.

Estimation des dégâts d’irradiation. En utilisant ces méthodes, les dégâts d’irradiation

(oxydation ou réduction potentielles du fer sous le faisceau de rayons X) en fonction du

Page 41: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

41

temps d’exposition de l’échantillon aux rayons X ont été évalués sur des composés de

référence Fe(II) d’une part et sur des bactéries (matière organique) encroûtées par des phases

complètement oxydées (Fe(III)) d’autre part (Figure 1A-2.). On observe que les dégâts

d’irradiation sont très limités pour les temps d’analyse classiquement utilisés. La

quantification des rapports Fe(II)/Fe(III) est donc relativement exacte, à condition que chaque

étape du protocole soit scrupuleusement respectée (préparation et transport des échantillons en

conditions anoxiques, analyse sous atmosphère d’He, temps d’analyse limité par stack).

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 50 100 150

Fe

(III)/

Fe t

ota

l

dt, ms

dt=0.8 ms

0.75

0.8

0.85

0.9

0.95

1

10 20 30 40 50 60 70

Fe

(III)/

Fe

to

tal

dt, ms

dt=0.8 ms

Figure 1A-2. Dégâts d’irradiation sur des références de phosphate de Fe(II) (a) et sur des

bactéries encroûtées par du Fe(III) (b). Evolution des rapports Fe(III)/Fe(total) en fonction du

temps de comptage par pixel et par pas d’énergie, estimés en fittant les spectres XANES au

seuil L2,3 du Fe enregistrés sur des références de phosphate de Fe(II) et de bactéries encroûtées

par du Fe(III) respectivement. Les courbes de tendance suivent une loi de Michaelis-Menton

de type y=ax/(b+x), avec a=0.3 et b=12 (r²=0.87) pour la vivianite et a=0.8 et b=-0.2 (r²=0.98)

pour les bactéries encroûtées. On observe donc une photo-oxydation sous le faisceau de

rayons X pour le phosphate de Fe(II) et une photo-réduction sous le faisceau X pour les

bactéries encroûtées. Par comparaison, le temps moyen d’analyse lors de nos mesures

habituelles des échantillons (par stack) est de 0.8 ms par pixel et par pas d’énergie. Les dégâts

d’irradiation sont donc limités.

Principaux résultats et perspectives. L’étude des biominéralisations produites par la souche

BoFeN1 cultivée en présence de Fe(II) en solution aqueuse a révélé la formation de

phosphates de fer, en interaction étroite avec la matière organique. Trois types de minéraux

coexistent, discriminés selon leur morphologie et leur localisation :

a b

Page 42: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

42

(1) Encroûtement périplasmique. Une couche minéralisée de 40 nm d’épaisseur (qualifiée

d’encroûtement), est localisée entre la membrane plasmique et la membrane externe de la

bactérie, i.e. dans le périplasme. Ces minéralisations sont associées à des accumulations de

protéines dans le périplasme et de façon amplifiée et asymétrique au niveau des pôles de la

bactérie, probablement en relation avec le vieillissement des cellules. Ces résultats suggèrent

qu’une étape de l’oxydation du fer pourrait avoir lieu dans le périplasme, comme cela a été

proposé pour la bactéries phototrophe Rhodobacter sp., souche SW2 sur la base de données

de biologie moléculaire (Croal et al., 2007, Jiao & Newman, 2007). En outre, l’accumulation

spécifique de protéines dans le périplasme des bactéries encroûtées pourrait suggérer une

nucléation préférentielle des phosphates de fer sur des composés protéiques (Benzerara et al.,

2004b, voir aussi le Chapitre 1D). Ces composés protéiques pourraient être des agrégats

s’accumulant de façon asymétrique aux pôles au cours de leur vieillissement (Arié et al.,

2006).

(2) Globules membranaires. Des globules de 100±25 nm de diamètre sont localisés à la

surface des bactéries, accolés à la membrane externe.

(3) Filaments d’exopolysaccharides minéralisés. Ces filaments pourraient servir de matrice à

la précipitation du fer à distance des bactéries (Chan et al., 2004). L’oxydation progressive du

Fe(II) en Fe(III) mise en évidence dans ces phases extracellulaires soulève la question des

mécanismes d’export du Fe(III) ou d’oxydants par la bactérie. En effet, le Fe(III) très

insoluble précipite quasi-instantanément dans un milieu à pH neutre. Si l’oxydation du fer a

lieu principalement au niveau périplasmique, il faut envisager l’export soit du Fe(III)

directement, qui pourrait être facilité par un miro-environnement à pH acide autour de la

bactérie (Kappler & Newman, 2004), soit de Fe(III) complexé à des molécules organiques le

solubilisant. Des nanophases colloïdales mises en évidence dans ces milieux de culture

pourraient aussi jouer un rôle important dans le transfert de Fe(III). Enfin, une dernière

possibilité serait l’export d’oxydants (par exemple certains produits de la réduction des

nitrates), réalisant l’oxydation du Fe(II) au contact des fibres polysaccharidiques

extracellulaires. Des études complémentaires biochimiques seront nécessaires pour identifier

de telles molécules potentiellement impliquées dans l’oxydation et /ou l’export du Fe(II) par

BoFeN1.

Les motifs très particuliers de biominéralisation du fer observés chez BoFeN1 ainsi

que les hétérogénéités redox du fer mises en évidence au cours de ces cultures pourraient

fournir des pistes pour la recherche de traces d’oxydation bactérienne anaérobie du fer dans le

registre fossile.

Page 43: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

43

Biominéralisation du calcium par BoFeN1. En complément des résultats précédents, nous

avons testé la capacité de la souche ferroxydante BoFeN1 à biominéraliser le calcium, dans le

but de déterminer si la précipitation périplasmique du fer est spécifique ou non de cet élément.

Pour cela, BoFeN1 est cultivée dans le même milieu de base que précédemment, sans fer mais

en présence de nitrates (10 mM), acétate (5 mM, qui sert alors de source de carbone et

d’électrons) et de calcium (10 mM, fourni sous forme de CaCl2). L’ajout de calcium dans le

milieu de culture entraîne la précipitation d’une phase blanche correspondant à de

l’hydroxylapatite (Ca10(PO4)6(OH)2) d’après les simulations thermodynamiques (JChess).

Après filtration à 0.2 µm de ce précipité, la concentration en Ca2+

est de l’ordre de 3.4 mM

d’après les simulations thermodynamiques, donc du même ordre de grandeur que la

concentration en Fe(II) utilisée dans les cultures de BoFeN1 en présence de Fe(II) dissous (3-

4 mM). Après 2 semaines de culture dans ce milieu enrichi en calcium dissous, les cellules

ont été observées en microscopie électronique à transmission, en mode STEM (Scanning

Transmission Electron Microscopy). Comme on peut le voir en Figure 1A-3., le calcium n’est

pas accumulé dans le périplasme, mais dans des inclusions intracellulaires, où il est déposé

sous forme de phosphates de calcium. Ce motif de biominéralisation du calcium diffère de ce

qui a été décrit pour d’autres bactéries Gram-négatives, qui précipitent dans les mêmes

conditions des phosphates de calcium dans le périplasme (Van Dijk et al., 1998, Benzerara et

al., 2004b).

La solubilité des phosphates de calcium ainsi que des phosphates de fer formés par

BoFeN1 dans les cultures en présence de calcium ou de Fe(II) dissous n’est pas connue.

Cependant, en utilisant les constantes de solubilité reportées dans la littérature, on note que

l’hydroxylapatite (phosphate de calcium, KS=10-110.6

, Narasaraju et al., 1978) est encore plus

insoluble que la vivianite (phosphate de Fe(II), KS= 10-36

, Nriagu et al., 1972) et que les

phosphates de Fe(III) tels que Fe2(HPO4)3 (KS=8.6x10-41

, Pierri & Dalas, 1998). Ces résultats

suggèrent donc que la précipitation de phosphates de fer périplasmiques n’est pas contrôlée

par la concentration en phosphate, mais plus probablement par l’oxydation du fer elle-même.

Une modélisation géochimique de la précipitation des phosphates de fer dans le périplasme,

s’appuyant entre autres sur les données acquises au cours de cette thèse et impliquant une

meilleure connaissance des valeurs de pH et des concentrations des différents éléments

chimiques dans le périplasme, permettrait dans le futur de mieux contraindre les mécanismes

de biominéralisation chez BoFeN1.

Page 44: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

44

Figure 1A-3. Minéralisation de phosphates de calcium par BoFeN1. A et B: images STEM

de bactéries présentant des dépôts intracellulaires denses aux électrons (blancs). C :

composition chimique de ces dépôts intracellulaires analysés en EDX. Le calcium est donc

accumulé sous forme de phosphates de calcium dans le cytoplasme.

500 nm 500 nm

1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

P Kαααα

K Kαααα

Ca Kαααα

Co

un

ts,

a.u

.

Energy, keV

A B

C

500 nm 500 nm500 nm 500 nm

1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

P Kαααα

K Kαααα

Ca Kαααα

Co

un

ts,

a.u

.

Energy, keV

A B

C

Page 45: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

45

Iron biomineralization by anaerobic neutrophilic iron-oxidizing bacteria

Jennyfer Miot (1), Karim Benzerara (1), Guillaume Morin (1), Andreas Kappler (2), Sylvain

Bernard (3), Martin Obst (4), Céline Férard (1), Fériel Skouri-Panet (1), Jean-Michel Guigner

(1), Nicole Posth (2), Matthieu Galvez (1), Gordon E. Brown Jr (5, 6), François Guyot (1).

(1) Institut de Minéralogie et de Physique des Milieux Condensés, UMR 7590, CNRS,

Universités Paris 6 et Paris 7, et IPGP.

140, rue de Lourmel. 75 015 Paris, France.

(2) Geomicrobiology Center for Applied Geoscience (ZAG), University of Tuebingen,

Sigwartstrasse 10, 72076 Tuebingen, Germany.

(3) Laboratoire de Géologie, Ecole normale supérieure, CNRS, 24 rue Lhomond, 75005

Paris, France.

(4) BIMR McMaster University Hamilton & Canadian Light Source, 101 Perimeter Road,

Saskatoon, SK, Canada, S7N OX4.

(5) Surface & Aqueous Geochemistry Group, Department of Geological & Environmental

Sciences, Stanford University, Stanford, CA 94305-2115, USA

(6) Stanford Synchrotron Radiation Laboratory, SLAC, Menlo Park, CA 94025, USA

*Corresponding author:

[email protected] ; Tel: 0033144279832; Fax: 0033144273785

Geochimica et Cosmochimica Acta

In press

Page 46: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

46

ABSTRACT

Minerals formed by bio-oxidation of ferrous iron (Fe(II)) at neutral pH, their

association with bacterial ultrastructures as well as their impact on the metabolism of iron-

oxidizing bacteria remain poorly understood. Here, we investigated iron biomineralization by

the anaerobic nitrate-dependent iron-oxidizing bacterium Acidovorax sp. strain BoFeN1 in the

presence of dissolved Fe(II) using electron microscopy and Scanning Transmission X-ray

Microscopy (STXM). All detected minerals consisted mainly of amorphous iron phosphates,

but based on their morphology and localization, three types of precipitates could be

discriminated: (1) mineralized filaments at distance from the cells, (2) globules of 100±25 nm

in diameter, at the cell surface and (3) a 40 nm-thick mineralized layer within the periplasm.

All of those phases were shown to be intimately associated with organic molecules.

Periplasmic encrustation was accompanied by an accumulation of protein moieties. In the

same way, exopolysaccharides were associated with the extracellular mineralized filaments.

The evolution of cell encrustation was followed by TEM over the time course of a culture:

cell encrustation proceeded progressively, with rapid precipitation in the periplasm (in a few

tens of minutes), followed by the formation of surface-bound globules. Moreover, we

frequently observed an asymmetric mineral thickening at the cell poles. In parallel, the

evolution of iron oxidation was quantified by STXM: iron both contained in the bacteria and

in the extracellular precipitates reached complete oxidation within 6 days. While a progressive

oxidation of Fe in the bacteria and in the medium could be observed, spatial redox (oxido-

reduction state) heterogeneities were detected at the cell poles and in the extracellular

precipitates after 1 day. All these findings provide new information to further the

understanding of molecular processes involved in iron biomineralization by anaerobic iron-

oxidizing bacteria and offer potential signatures of those metabolisms that can be looked for

in the geological record.

Page 47: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

47

1. INTRODUCTION

Iron-oxidizing bacteria and archeae may have a significant impact on the Earth’s

surface geochemistry, by taking part in the redox cycling of iron under both oxic and anoxic

conditions (e.g. Ghiorse, 1984; Konhauser, 1998; Fortin and Langley, 2005; Kappler and

Straub, 2005; Weber et al., 2006). Various micro-organisms can retrieve energy from the

aerobic oxidation of Fe(II) in oxic environments at acidic (Lazaroff et al., 1985; Clarke, 1997;

Kozubal et al., 2008) or neutral pH (Hallberg and Ferris, 2004). Over the last 15 years, the

discovery of bacteria capable of using Fe(II) as an electron donor under anoxic conditions and

at neutral pH has boosted interest in the study of these metabolisms. Among them, two are

potentially widespread in neutral-pH anoxic habitats (for instance in river sediments, lakes or

deep-sea environments) : (1) anoxygenic photosynthesis using Fe(II) as an electron donor

(Widdel et al., 1993; Ehrenreich and Widdel, 1994, Heising and Schink, 1998) and (2) iron

oxidation coupled to nitrate reduction (Hafenbradl et al., 1996; Straub et al., 1996; Benz et al.,

1998, Straub and Buchholz-Cleven, 1998, Kappler et al., 2005a).

Fe(II) oxidation driven by iron-oxidizing nitrate-reducing bacteria leads to the

formation of Fe(III) compounds. The chemistry and mineralogy of these Fe(III) compounds

depend on environmental conditions. Equation 1 summarizes this reaction with formation of

Fe(III) hydroxides:

2Fe2+

+ 5H2O + NO3- = 2Fe(OH)3 + 4H

+ + NO2

- (Eqn. 1)

Due to their low solubility at neutral pH (Cornell and Schwertmann, 2003), the Fe(III) by-

products of this reaction, represented here by iron hydroxides, precipitate rapidly in the direct

vicinity of the cells. However, the accurate localization of iron biominerals with respect to the

cellular ultrastructures remains unclear. Recent studies tend to indicate that different strains

(utilizing different metabolisms) exhibit different biomineralization patterns. For instance, the

nitrate-reducing iron-oxidizing β-proteobacterial strain BoFeN1 (Kappler et al., 2005a)

becomes encrusted with Fe(III) minerals as iron oxidation proceeds, whereas the

photosynthetic iron-oxidizing purple bacterium Rhodobacter ferroxidans strain SW2

(Ehrenreich and Widdel, 1994) does not encrust, even after complete oxidation of Fe(II)

(Kappler and Newman, 2004). It has been suggested that this is related to a differential

adaptation to iron oxidation, yet the mechanisms accounting for these two distinct phenotypes

are still poorly understood. A precise characterization and localization of iron-containing

Page 48: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

48

minerals associated with the cells is thus needed to better constrain these mechanisms. This in

turn might offer useful signatures for the search of the by-products of such metabolisms in the

geological record (e.g. Konhauser, 1998, Little et al., 2004).

In this study, we chose to focus on the iron-oxidizing nitrate-dependent strain

BoFeN1, phylogenetically close to the β-Proteobacterium Acidovorax sp. We used several

microscopic and spectroscopic techniques, in particular Transmission Electron Microscopy

(TEM), X-ray Absorption Spectroscopy (XANES: X-ray Absorption Near-Edge Spectroscopy

and EXAFS: Extended X-ray Absorption Fine Structure) and Scanning Transmission X-ray

Microscopy (STXM) to characterize the cell-mineral associations in batch cultures of

BoFeN1. The evolution of iron redox state and the association of organics with iron minerals

are documented at the sub-micrometer scale over the time course of a culture.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1. Bacterial strain and growth conditions

The nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing strain BoFeN1, isolated from Lake Constance

littoral sediments (Kappler et al., 2005a), was cultivated in freshwater mineral medium

prepared after Ehrenreich & Widdel (1994). Phosphate was provided as KH2PO4 at an initial

concentration of 4.3 mM. The bacteria were cultured in this medium complemented with 5

mM acetate (provided as sodium acetate) and 10 mM nitrate (provided as sodium nitrate) in

the presence or absence of Fe(II) (provided as FeCl2). Although BoFeN1 clearly oxidizes

metabolically Fe(II), it should be noted that it has not been demonstrated yet that BoFeN1

cells can use Fe as an energy source (Kappler et al., 2005a). The addition of Fe(II) at a total

concentration of 10 mM led to the precipitation of a whitish phase (consisting of Fe(II)-

phosphate, mostly vivianite Fe3(PO4)2), which was subsequently removed by filtration

through 0.22 µm Millipore filters, in an anoxic glovebox (p(O2) < 50 ppm). After filtration,

the medium contained 5.4 mM dissolved Fe(II) and 1.3 mM phosphate. For each culture, 25

mL of medium were transferred into a 58 mL serum bottle that was flushed with N2/CO2

(80% / 20%), closed with a butyl rubber stopper and crimped. BoFeN1 was inoculated (10%)

from an acetate-nitrate-grown culture (culture without iron). Cultures were incubated at 30°C.

Page 49: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

49

For TEM and STXM analyses, samples of the same culture were taken in an O2-free glove-

box at several subsequent time steps.

2.2. Analytical methods

Growth was followed by measuring the total soluble protein content using the

Bradford assay. One mL of culture was mixed with a solution of oxalic acid (pH 3, 0.2M) in

order to dissolve iron-bearing minerals and with 6.1 M trichloroacetic acid to precipitate

proteins. After centrifugation (11000 g, 30 min) and removal of the supernatant, proteins were

dissolved in 0.1 M NaOH at 60°C for 6 min. The absorbance of the samples was measured at

595 nm after reaction with the Bradford reagent (BioRad, microassay). Experiments were

conducted in duplicate.

In order to analyze dissolved iron, 200 µL of a culture suspension were sampled with a

syringe and filtered through 0.22 µm Millipore filter in an anoxic glovebox. The dissolved

Fe(II) content of the filtrate was determined by the ferrozine assay (Viollier et al., 2000) after

dilution in 1 M HCl.

2.3. Synthesis of model compounds

To determine the Fe redox state of the samples by STXM at the Fe L2,3-edges, we used

pure Fe(II)- and Fe(III)-phosphates as reference compounds. Both have been synthesized

under anoxic conditions. Fe(II)-phosphate was obtained by addition of 10 mM Fe(II) (as

FeCl2), 5 mM acetate and 10 mM nitrate in the growth medium, which led to the precipitation

of a whitish Fe(II)-phosphate phase. Fe(III)-phosphate was obtained by the addition of 10 mM

Fe(III) (as FeCl3), 5 mM acetate and 10 mM nitrate in the growth medium. Both precipitates

were rinsed twice with degassed distilled water and dried under vacuum inside an anoxic

glove-box. As shown by XRD, this Fe(II)-phosphate phase consisted of vivianite, whereas the

Fe(III)-phosphate was amorphous (Fig. 2). Based on TEM, XRD and XAS analyses, these

model compounds likely represented the closest analogues of the phases formed in the

BoFeN1 cultures. Therefore, we used experimental Fe L2,3-edge spectra of these model

compounds to analyze iron oxidation state of BoFeN1 in STXM experiments, instead of

goethite, hematite, or siderite. XAS data of the BoFeN1 samples were least-square fitted using

linear combinations of these two model compounds and of a 2-line ferrihydrite (Fh2L)

synthesized following the procedure by Schwertmann and Cornell (1991).

Page 50: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

50

2.4. Mineral characterization by X-ray diffraction

The bulk mineralogical composition was determined by X-ray diffraction (XRD)

measurement performed on the solid phase collected from a 13-day old culture compared to

Fe(II)- and Fe(III)-phosphate model compounds. Samples were prepared under anoxic

conditions in an anoxic glove-box. The culture was centrifuged (5000 g, 10 min). The solid

phase was rinsed twice using degassed distilled water and vacuum-dried. The powder was

grinded in an agate mortar and dispensed in a borosilicate capillary, that was sealed with glue

before analysis in the diffractometer. This preparation guaranteed strictly anoxic conditions

for XRD analyses. XRD measurements were performed with CoKa radiation on a

Panalytical® X’Pert Pro MPD diffractometer mounted in Debye-Scherrer configuration using

an elliptical mirror to obtain a high flux parallel incident beam and an X'Celerator®

detector to

collect the diffracted beam. Data were recorded in the continuous-scan mode within the 5 -

80° 2θ range with a step of 0.03°, and a counting time of 12 to 24 h per sample.

2.5. XAS analyses

2.5.1. XAS data collection

In order to limit Fe(II) oxidation under the X-ray beam and to enhance EXAFS signal

on our nano-sized and poorly ordered mineral phases, all data were recorded at 10-15 K using

a modified Oxford®

liquid He cryostat. Samples were transferred from the glove-box into a

liquid nitrogen bath and then into the cryostat, where they were placed under He atmosphere.

This procedure preserved anoxic conditions during sample transfer and analysis. EXAFS data

on all samples except the Fe(II)-phosphate and Fh2L, were recorded at the Fe K-edge, using a

Si(220) double-crystal monochromator on beamline 10-2 at the Stanford Synchrotron

Radiation Laboratory (SSRL). Monochromator was detuned 50% in order to reject harmonics.

Data on the final product of Fe(II) bio-oxidation by BoFeN1 were collected in fluorescence

detection mode using a 13-element Ge-array detector and a 3 ∆µ Mn filter to attenuate elastic

scattering. For EXAFS data collection, energy resolution was around 1 eV, with a beam size

of 2 x 3 mm2 achieved by vertical and horizontal focusing, with a Pt coated elliptic mirror. For

XANES data collection, resolution was improved using vertical slits of 0.25 mm height from

~1.5 to ~0.5 eV. Data on the Fe(III) phosphate model compounds were recorded in

transmission mode with an unfocused beam collimated by 2 × 3.5 mm2 slits , which explain

XANES data for this sample are not as well resolved as for other samples studied. Four

EXAFS scans were accumulated for each sample in order to obtain a reliable signal-to-noise

Page 51: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

51

ratio up to k = 11 Å-1

. No measurable change in iron oxidation state was observed during

beam exposure under these experimental conditions. XAS data of the Fe(II)-phosphate model

compound were recorded in transmission at 10K on the SAMBA beamline at the SOLEIL

(Source Optimisée de Lumière d'Énergie Intermédiaire du LURE) synchrotron using a

dynamical sagittal-focusing Si(111) monochromator. EXAFS data on the Fh2L were recorded

at 10 K on the D44 beamline at the Laboratoire pour l’Utilisation du Rayonnement

Electromagnétique (LURE) using a Si(111) double crystals monochromator. XANES data on

this sample were recorded in transmission mode at 10 K on the BM29 ESRF (European

Synchrotron Radiation Facility) beamline using a Si(111) double crystals monochromator. For

all experiments, energy was calibrated by using a double-transmission setup; the first

inflection point of the Fe metal foil K-edge was set at 7111.1 eV (Wilke et al. 2001).

2.5.2. XAS data analysis

X-ray absorption spectra were averaged using the SixPack software (Webb, 2004). EXAFS

data were extracted using the XAFS program (Winterer, 1997) following the procedure

detailed previously by Morin et al., 2008. Radial distribution functions around the Fe

absorber were obtained by calculating the Fourier transform (FT) of the k3χ(k) EXAFS

functions using a Kaiser-Bessel window within the 2.7 – 11 Å-1

k-range with a Bessel weight

of 2.5. Least-squares fitting of the unfiltered EXAFS functions was performed with the plane-

wave formalism, using a Levenberg-Marquard minimization algorithm. Ab initio phase shifts

and total amplitude functions employed in this fitting procedure were calculated with the

curved-wave formalism using the ab-initio FEFF 8 code (Ankudinov et al., 1998) and the

atomic positions from the crystal structure of goethite (Forsyth et al., 1968) and vivianite

(Fejdi et al., 1980). The fit quality was estimated within the 2.7 – 11 Å-1

k-range, using a

reduced χ2 of the following form:

χ2 = Nind / ( Nind - p ) Σ ( k

4 χ(k)exp – k4 χ(k)calc)

2 (Eqn. 2)

with Nind (the number of independent parameters) = (2∆k∆R)/π, p the number of free fit

parameters. The fitting procedure was performed on k4-weighted χ(k) functions in order to

emphasize the signal at high k values, which improves the accuracy of the fitted distances for

light backscattering atoms. Data are however displayed as k3-weighted χ(k) functions. The

χ(k) function of the BoFeN1 sample was also fit within the 3 – 10.5 Å-1

k-range by linear

least-squares fitting (LSF), using linear combinations of k3χ(k) spectra of the Fh2L and

Fe(III)-phosphate model compounds.

Page 52: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

52

2.6. Microscopic analyses

Two types of samples were prepared for TEM analyses. First, ultrathin sections were

prepared by ultramicrotomy. Cells were fixed for 2 hours in 1% glutaraldehyde at 4°C,

centrifuged (5000 g), rinsed three times in 0.1 N sodium cacodylate buffer (pH 7.2) for 18h at

4 °C. They were then post-fixed for 90 min in 1% OsO4 in the same buffer, rinsed three times

in distilled water, dehydrated in graded ethanol and propylene oxide-1,2 and progressively

embedded in epoxy resin (Epoxy, Fluka Chemika). Ultrathin sections (70 nm-thick) were cut

with a LEICA ultramicrotome (EM-UC6). After deposition on copper grids, they were stained

with uranyl acetate (2% w/v) and lead citrate (2 g.L-1

). The whole preparation was conducted

in air, since fixation with glutaraldehyde requires O2. As a consequence, TEM observations

could not allow the determination of the redox state of iron, which was determined by STXM

analyses (see infra).

For Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM), High-Resolution TEM

(HRTEM), tomography observations and Energy Dispersive X-ray Spectroscopy (XEDS)

measurements, whole cells were deposited on a carbon-coated 200-mesh copper grid after two

rinses in degassed distilled water and dried in an anoxic glove-box. STEM and HRTEM

observations, as well as XEDS analyses were performed with a JEOL2100 Microscope

operating at 200kV. STEM observations were performed in darkfield (DF) mode. XEDS

maps were acquired in STEM DF mode, with a focused electron beam (1 nm). Selected area

electron diffraction (SAED) patterns were obtained on areas of interest. Tomography was

performed using a JEOL2100 TEM, equipped with a LaB6 source, operating at 200 kV.

Samples were tilted between -60 and +50°, and images were acquired with Digital-

Micrograph at 1° steps.

2.7. Scanning Transmission X-ray Microscopy

2.7.1. Sample preparation

Preliminary STXM experiments showed that the samples are highly sensitive to

oxidation by O2. We thus developed a specific protocol to keep the samples under an anoxic

atmosphere from preparation to transfer into the microscope. Tests on the reference highly

O2-sensitive Fe(II)-phosphate showed that this protocol was efficient in preserving the sample

from any oxidation detectable by XANES. The entire preparation was performed in an anoxic

glove-box. 1 mL of a suspension of BoFeN1 culture (or of reference compounds) was

sampled at different stages of each culture (3 h to 6 days). Each sample was rinsed twice in

Page 53: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

53

degassed distilled water. 0.3 µL of each sample was then deposited on a silicon nitride

membrane (Norcada Inc., Canada) fixed on an aluminium sample holder and allowed to dry at

ambient temperature. A second silicon nitride membrane was then deposited in contact with

the first one and sealed with araldite. Sample holders were stored in sealed aluminised paper

(Protpack, UK) before transfer to the synchrotron. The sealed pockets were opened under a

nitrogen flow just before placing the sample inside the microscope, in which air had been

replaced by nitrogen. After sample transfer, nitrogen was replaced by helium at 1 atm.

2.7.2. STXM experiments

Some of the STXM observations at the Fe L2,3-edges were performed at the Swiss

Light Source (SLS, Villigen) at the PolluX beamline. Some of the observations at the Fe L2,3-

edges and all the observations at the C K-edge were performed at the spectromicroscopy

beamline 10ID-1 at the Canadian Light Source (CLS, Saskatoon). Additional information on

the PolluX beamline can be found in Bernard et al. (2007). The beamline 10ID-1 at the CLS

was described in detail by Kaznatcheev (2007). Both beamlines have an energy resolving

power E/∆E > 3000. The energy scales for this study were calibrated using the well-resolved

3p Rydberg peak of gaseous CO2 for the C K-edge and the major peak of hematite at 708.7

eV for the Fe L3-edge.

2.7.3. Data processing

Image stacks were acquired at the C K-edge and at the Fe L2,3-edges. They were

performed by scanning the sample in the x-y direction at each energy increment over the

energy range of interest. Potential sample damages caused by the incident photon beam (i.e.

changes of the Fe redox state) were quantified by monitoring spectral changes at the Fe L2,3-

edge with increasing dwell times up to several tens of ms (Fig.EA-1). However, no significant

changes were observed for typical dwell times used during analyses of the samples (i.e.

around 0.8 ms per energy- and image-point). The aXis2000 software-package (Hitchcock,

2001) was used for processing image stacks and XANES spectra. Images were recorded on

transmission scale and converted into optical density (OD) according to Equation (3).

OD = -ln(I/I0) (Eqn. 3)

wherein I represents the measured intensity at the point of interest and I0 represents the

intensity outside the sample that includes the absorption by silicon nitride windows.

Qualitative speciation maps were obtained by subtracting OD images obtained at an energy

below the absorption edge from OD-images taken at the energies of specific absorption peaks.

Page 54: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

54

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 50 100 150

Fe

(III)/

Fe t

ota

l

dt, ms

dt=0.8 ms

0.75

0.8

0.85

0.9

0.95

1

10 20 30 40 50 60 70

Fe

(III)/

Fe

to

tal

dt, ms

dt=0.8 ms

Figure EA-1. Beam radiation damage during STXM analyses of vivianite (a) and Fe(III)-

encrusted bacteria (b). Evolution of the Fe(III)/Fe(total) ratios as a function of dwell time,

estimated by fitting the XANES spectra at Fe L2,3-edges. Data were fitted by a Michaelis-

Menton law (y=ax/(b+x)), with a=0.3 and b=12 (r²=0.87) for vivianite and a=0.8 and b=-0.2

(r²=0.98) for Fe(III)-encrusted bacteria. The Fe(II)-phosphate is photo-oxidized, whereas the

Fe(III)-encrusted bacteria are photo-reduced. By comparison, spectra of the BoFeN1 samples

and model compounds were recorded with a dwell time of 0.8 to 1.5 ms per point and energy.

The beam radiation damage is thus very limited under our conditions of data collection.

Quantitative Fe-speciation maps were calculated from the image stacks by singular

value decomposition using the stack-fit routine in aXis2000. The algorithm fits the spectra of

each individual pixel with a linear combination of the two normalized reference spectra

(Fe(II)- and Fe(III)-phosphate model compounds) plus a constant, accounting for the

absorption background. Composite maps were obtained by overlaying on the same image the

Fe(II) (blue) and the Fe(III) (red) maps using a common intensity scale for both colour

channels.

XANES spectra were extracted from the stacks on regions of interest. For C K-edge

spectra, the edge jump was normalized to 1. For Fe L2,3-edges spectra, we normalized the area

below the L2 and L3 edges to 1 and multiplied the absorbance of the compounds containing

mainly Fe(II) (major peak at 707 eV) by a 4/5 correction factor to take into account the

difference in the occupancy of the 3d orbitals in Fe2+

and Fe3+

ions, neglecting the variation of

radial integrals (Thole et al., 1994). We fit the normalized spectra with linear combinations of

the normalized reference spectra of the Fe(II)- and Fe(III)-phosphate model compounds,

applying the CGO (Conjugate Gradient Optimization method) curve fit routine in Axis2000.

Fit results allowed estimating the Fe(III)/Fe(total) content of regions of interest. Standard

deviations (SD) were calculated from the deviation between the fit and the data and were

b a

Page 55: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

55

systematically less than 1%. Additionally, we performed duplicates (two independent cultures

and analyses) for the 1-day and 3-day old samples, that indicated a good reproducibility of the

Fe(III)/Fe(total) ratio estimations, with a standard deviation lower than 10%.

3. RESULTS

3.1. Bacterial growth and Fe oxidation by-products formed in BoFeN1 cultures

Bulk measurements on the cultures showed that starting from 4-6 mM of dissolved Fe(II),

iron was completely oxidized within 3 days, which coincided with the start of the stationary

phase of growth (Fig. 1). In contrast, no significant Fe(II) oxidation was observed in non-

inoculated samples over the duration of the experiment.

0

10

20

30

40

50

60

70

0

1

2

3

4

5

6

0 50 100 150

To

tal

pro

tein

co

nc

en

tra

tio

n,

µµ µµg

.mL

-1 Dis

so

lve

d F

e(II) c

on

ce

ntra

tion

, mM

Time, hours

Figure 1. Growth curve of BoFeN1 and Fe(II) consumption in the presence of acetate (5

mM), nitrate (10 mM) and ferrous iron over a period of 6 days. (■): Total protein

concentration, (○): Dissolved Fe(II) concentration.

Page 56: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

56

20 40 60 80 100

Rela

tiv

e in

ten

sit

y

Degrees 2θ (θ (θ (θ (CoKαααα)

V

V

VVV

V

VV

V

BoFeN1

Fe(III)-phosphate

Fe(II)-phosphate

Figure 2. X-Ray diffractograms of precipitates collected from BoFeN1 cultures after 13 days

and of reference Fe(II)- and Fe(III)-phosphate.

In the cultures, the oxidation of Fe(II) could be observed macroscopically by the

appearance of an orange precipitate. The solid phase, collected after 13 days of culture, was

XRD-amorphous (Fig. 2) and was therefore further characterized by XAS (Table 1, Fig. 3 and

EA-2). The position of the pre-edge of the BoFeN1 sample at 7113.7 eV indicated that iron

was mostly present as Fe(III) in the end-product of iron bio-oxidation by BoFeN1 after 13

days of culture (Fig. 3, Wilke et al., 2001), which is consistent with the shift of 2 eV in the

absorption maximum of the XANES spectrum compared to the Fe(II)-phosphate model

compound. Additionally, the shape of the pre-edge peak is consistent with a dominant

octahedral coordination of Fe(III) in this mineral. Best fits of the EXAFS data of this sample

and of the model compounds ferrihydrite, Fe(II)-, and Fe(III)-phosphates are listed in Table 1

and plotted in Fig. 3. The first- and second-neighbour shells in EXAFS data of the 13-day old

BoFeN1 culture consisted of oxygen, phosphate and iron ligands at 1.97±0.05 Å, 3.19±0.05 Å

and 3.52±0.05 Å respectively. These distances are consistent with those measured on the

reference amorphous Fe(III)-phosphate (Table 1), i.e. FeO6 octahedra sharing corners with

PO4 tetrahedra (Rose et al. 1996, Rose et al., 1997). The structure of this phase could thus be

close to the structure of iron arsenate proposed by Paktunc et al. (2008). The absence of Fe-Fe

Page 57: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

57

pairs at a distance of 3.0-3.2 Å, corresponding to edge-sharing FeO6 octahedra that are the

structural basis of all iron oxyhydroxides, rules out the possibility this phase would be an iron

oxyhydroxide with adsorbed phosphate. In contrast, our EXAFS results clearly indicate that

the final Fe-oxidation product in BoFeN1 cultures consists of a mixed Fe-PO4

(oxy)hydroxide. Additionally, a linear decomposition of the k3χ(k) function of the BoFeN1

sample with the k3χ(k) functions of Fh2L and of the amorphous Fe(III)-phosphate model

compound (Fig. EA-2) was performed. Although previous results clearly indicate that the iron

minerals are not composed of ferrihydrite, this decomposition allowed the local order of the

iron minerals formed in BoFeN1 cultures to be investigated. These results indicate that the

local structure of the minerals formed in BoFeN1 cultures is more ordered than the local

structure of the reference amorphous Fe(III)-phosphate, but remains very close to. Indeed, a

component having a local structure similar to Fh2L is more expressed in the BoFeN1 sample

than in the reference Fe(III)-phosphate. All these results are consistent with the production of

amorphous Fe(III)-phosphates in BoFeN1 cultures. This phase exhibits similarities in its

EXAFS signal with the natural oxidation product of vivianite, i.e. santabarbaraite (Pratesi et

al. 2003) but determining the exact nature of this mineral would need further investigations.

Page 58: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

58

3 4 5 6 7 8 9 10

5

k3χ

(k)) ))

k, Å-1

Fe(III)-phopshate

2L-Fh

BoFeN1

0 1 2 3 4 5 6

FT

Ma

gn

itu

de

R(Å)

2

Figure EA-2. Linear decomposition of 13-day old BoFeN1 culture with reference 2-line

ferrihydrite and amorphous Fe(III)-phosphate. a: unfiltered k3χ(k) data compared with the

spectra of the model compounds 2-line ferrihydrite (Fh2L) and Fe(III)-phosphate. b:

corresponding Fourier Transform. Solid line shows the data and dashed line the best fit. The

fit gives 21% 2L-Fh and 76% Fe(III)-phosphate respectively, with an Rfactor equal to ∑(fit-

exp)2/∑exp

2) = 5.6 10

-2.

Sample N (± 0.3)

Bond R (Å) (± 0.05)

σσσσ (Å)

(± 0.02)

E0 (eV) (± 3)

χχχχ2

2-line ferrihydrite 4.2 Fe-O 1.96 0.11 1 9.68 1.4 Fe-Fe 3.03 0.10 2.6 Fe-Fe 3.44 0.10

Fe(II)-phosphate 4.0 Fe-O 2.09 0.09 4 37.1 1.8 Fe-P 3.29

0.9 Fe-Fe 3.00

2.6 Fe-Fe 4.71

Fe(III)-phosphate 3.5 Fe-O 1.98 0.07 3 19.9 2.5 Fe-P 3.23 0.11

BoFeN1 4.5 Fe-O 1.97 0.10 1 10.7 1.3 Fe-P 3.19 0.05 0.3 Fe-Fe 3.52 0.05

TABLE 1. Fitting results for Fe K-edge EXAFS data of 13-day old BoFeN1 cultures and of

the 2-line ferrihydrite, Fe(II)- and Fe(III)-phosphate model compounds. Coordination number

(N), interatomic distance (R), Debye-Waller parameter (σ) and energy offset (E0). Fit quality

was estimated by a reduced χ2 parameter (see text).

a b

Page 59: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

59

7108 7110 7112 7114 7116

No

rma

lize

d a

bs

orb

an

ce

, a

.u.

Energy, eV

Fe(II)-phosphate

Fe(III)-phosphate

BoFeN1

2L-Fh

7113.7 eV

7111.8 eV

7100 7120 7140 7160 7180 7200

No

rma

lize

d a

bs

orb

an

ce

Energy, eV

Fe(II)-phosphate

Fe(III)-phosphate

7132 eV

7127.5 eV

BoFeN1

2L-Fh

3 4 5 6 7 8 9 10 11

k3χ

(k)) ))

k, Å-1

5

2L-Fh

BoFeN1

Fe(II)-phosphate

Fe(III)-phosphate

0 1 2 3 4 5

2L-FhF

T M

ag

nit

ud

e

R(Å)

5

BoFeN1

Fe(II)-phosphate

Fe(III)-phosphate

Figure 3. X-ray Absorption Spectroscopy measurements on the bulk cultures of BoFeN1

after 13 days. a: XANES spectra at the Fe Kα−edge of 13-day old BoFeN1 cultures and of

2L-ferrihydrite (Fh2L), Fe(III)- and Fe(II)-phosphate model compounds. b: unfiltered k3χ(k)

data compared with the spectra of the model compounds 2-line ferrihydrite (Fh2L), Fe(II)-

and Fe(III)-phosphate. c: corresponding Fourier Transforms. Solid lines show the data and

dashed lines the best fits of the k3χ(k) data (see Table 1).

a

c d

b

Page 60: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

60

3.2. Microscopic characterization of the precipitates formed in BoFeN1 cultures

The minerals formed in BoFeN1 cultures were further characterized by a set of

microscopic methods. As illustrated in Fig. 4, three different types of precipitates could be

discriminated, based on their morphology and localization with respect to the cells. (1)

mineralized filaments formed by assemblies of 95±30 nm in diameter spherules were

observed outside the cells, and usually in the vicinity of the cells. (2) 100±25 nm in diameter

globules covered the cell surface (Fig. 4a and 4c). The extracellular localization of these

globules, in contact with the cell outer membrane was confirmed by tomography performed

on mineralized bacteria (Fig. 4d and Movie EA3). (3) An electron dense layer outlining the

cell surface was observed both by STEM in Dark Field mode (Fig. 4a) and by TEM (Fig. 4d).

As shown by tomography on whole cells, this layer remained visible whatever the tilt angle

(from -60° to +50°, Fig. 4d and Movie EA3). TEM observations of stained thin sections

unambiguously indicated that this mineral layer was located within the periplasm, in between

the cytoplasmic and the outer membranes (Fig. 5a and 5b). This is consistent with the

observation of a rather constant thickness (40 nm) of this electron dense layer observed by

STEM in darkfield mode on samples of whole bacteria (Fig. 5c and 5d). In the following, we

refer to the formation of this mineral layer in the periplasm as “cell encrustation”. This

mineralization almost systematically displayed an asymmetric pattern at the cell poles: one

pole was heavily mineralized with thicknesses up to 350 nm, whereas the dense layer on the

opposite pole did not exceed 40 nm in thickness (Fig. 5c). Consistently with XRD and XAS

analyses, all three types of precipitates were amorphous by electron diffraction (Fig. 5b and

5c) and composed of Fe, P and O (Fig. 6).

Detection and mapping of organic molecules were performed using STXM at the C K-

edge (Fig. 7). Different biochemical compounds can be discriminated at this edge based on

their XANES spectra, in particular the energy position of their maximum absorption peaks

(e.g. Benzerara et al., 2004a). Fig. 7b, 7c and 7d show the maps of proteins (-(C=O)-(NH)-,

288.2-280 eV), polysaccharides (289.2-280 eV) and iron (708-700 eV) respectively on the

same area. The periplasmic iron-rich layer contained high amounts of organic carbon.

XANES spectra obtained on the periplasm of many cells were similar to whole bacteria

XANES spectra (Fig. 7e) and contained mostly amide functional groups characteristic of

proteins. In addition, different organic molecules were observed in association with

extracellular iron minerals (Fig. 7c and 7d). C K-edge XANES spectra recorded on these

phases exhibited major peaks at 288.6 and 289.9eV and were similar to XANES spectra of

reference polysaccharides (Fig. 7e).

Page 61: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

61

Figure 4. TEM and STEM observation of Fe-precipitates in BoFeN1 cultures. a: STEM

image (Dark Field) showing three cells and Fe-containing precipitates (bright areas). Three

types of precipitates can be observed (white arrows): mineralized filaments (F), globules at

the cell surface (G) and periplasmic encrustation (P) are pointed by white arrows. b: Electron

diffraction pattern obtained on a globule at the cell surface and showing diffuse rings

indicating that the globules are amorphous. c: High-resolution image of a single particle on a

filament, showing that it is amorphous. d: TEM tilt series (-60°, 0° and +50°, movie available

as Supporting Information EA-4) of an encrusted cell and mineralized filaments.

a b

5nm

c P

G

F

-60°°°° 0°°°° +50°°°° d

g

g

f

p

Page 62: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

62

Figure 5. TEM study of periplasmic encrustation within BoFeN1 cells after 6 days of

culture. a: TEM bright-field image of a transversal section of a BoFeN1 cell stained with U-

acetate and Pb-citrate b: TEM bright-field image of a detail of the BoFeN1 cell wall shown in

a. White arrows point the outer and inner membranes enclosing the precipitates. c: STEM

image (darkfield) of an encrusted cell. Bright areas are enriched in iron. White arrows point

the asymmetric mineral thickening at the poles, with the right pole being thicker than the left

pole. d: Intensity profile taken along the A-B line indicated from panel c, evidencing the 40-

nm thick encrustation within the periplasm. Such measurements can be processed all around

the cells and show the relatively constant thickness (except at one of the poles) of this

encrustation consistent with the width of the periplasm.

50nm 100nm

a b

c

1µm

0

50

100

150

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Inte

nsit

y,

a.u

.

Distance, µm

40nm 40nm

d

A

B

A B

Page 63: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

63

Figure 6. Chemical composition of minerals formed in BoFeN1 culture after 6 days of

culture. a: STEM image (darkfield) showing numerous cells of BoFeN1, most of which

containing periplasmic iron-rich precipitates. b, c and d: XEDS maps of Fe, P and O

respectively. e: XEDS spectra measured on extracellular mineralized filaments and on

bacteria.

Fe K 2 µm

b

2 µm

a

P K 2 µm

c

O K 2 µm

d

0 1 2 3 4 5 6 7

Co

un

ts

Energy, keV

200Fe Kαααα

Fe Kββββ

K KββββK Kαααα

Cl Kαααα

P Kαααα

Na Kαααα

Fe Lαααα

O Kαααα

C Kαααα

e

Bacteria Precipitates

Page 64: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

64

Figure 7. Spectromicroscopy study of organics associated with BoFeN1 biominerals. a:

STXM image of BoFeN1 bacteria and precipitates at 288.2 eV. b: map of proteins obtained

by subtracting the image at 280 eV converted into optical density units (OD) from the OD-

image taken at 288.2 eV (maximum absorption of proteins). Bacteria cells can be easily

detected on this map and show for some of them (e.g. left hand side) a higher protein

concentration at the periphery and especially at the poles. c: Map of carbon absorbing at 289.2

eV (maximum absorption of polysaccharides) showing the presence of exopolysaccharides in

the vicinity of the cells. d: Fe map obtained from the subtraction of the OD-image taken at

700 eV from the OD-image taken at 708.7 eV, showing a higher content of iron within the

periplasm of the cells and the presence of extracellular iron-rich precipitates. e: C K-edge

NEXAFS spectra of the BoFeN1 bacteria, organics associated with the extracellular

precipitates and of the reference compounds albumin (protein) and alginate (polysaccharide).

2µm 2µm

2µm 2µm

a b

c d

280 285 290 295 300

Op

tic

al

de

ns

ity,

a.u

.

Photon energy, eV

288.2eV

288.6eV289.9eV

Albumin

BoFeN1

Filaments

Alginate

e

Page 65: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

65

Figure 8. Temporal evolution of BoFeN1 encrustation. STEM images (darkfield) acquired

30 min. to 6 days after inoculation showing the progressive encrustation of the periplasm,

followed by the appearance of globules at the cell surface.

3.3. Spatial and temporal variations of cell encrustation among a bacterial

population

Aliquots of BoFeN1 cultures were sampled for STEM analysis 30 min, 3 h, 6h, 1 day, 3

days and 6 days after inoculation in order to follow the evolution of cell encrustation (Fig. 8).

In the first stage (30 min), a thin and discontinuous precipitation of Fe-phosphate started in

the periplasm. In addition, colloidal Fe-rich particles could be observed at the surface of the

cells. After 3 h, the periplasm was already completely encrusted. Globules located at the cell

surface were widespread in 6h-old cultures and restricted to cells showing encrustation of the

periplasm. After 3 days, a clear asymmetric mineral thickening was observed at the cell pole.

Finally, globules at the cell surface were more numerous and thicker in 6-day old cultures.

Superimposed to this general scheme, heterogeneities in the intensity of cell biomineralization

were noticed among the bacterial populations. As shown in Fig. 9, cells devoid of any

precipitate were observed in the cultures at each individual stage. These bacteria were

observed by STEM (Fig. 9a) and were also clearly identified by STXM, appearing on C maps

but not on Fe maps (Fig. 9b and 9c).

30min. 3h 6h

1 day 3 days 6 days

Page 66: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

66

Figure 9. Heterogeneity of encrustation among the bacterial population. a: STEM image a

BoFeN1 cells 6 days after inoculation, showing the coexistence of encrusted and non-

encrusted bacteria (white arrows). b: Map of proteins in a 1-day old culture obtained from the

subtraction of the OD-image taken at 280eV from the OD-image taken at 288.2eV. White

arrows point out non-encrusted cells. c: Iron OD-map of the same area as b obtained from the

subtraction of the OD-image taken at 700eV from the OD-image taken at 708.7eV. Non-

encrusted cells are not visible on this map.

Figure 10. Mapping of Fe(II) and Fe(III) in a 1-day old culture of BoFeN1. Stacks were

fitted by a linear combination of a reference Fe(II)-phosphate, a reference Fe(III)-phosphate

and a constant. a and b: Fe(II) and Fe(III) maps obtained by fitting the stack with a reference

Fe(II)-phosphate and a reference Fe(III)-phosphate respectively. These maps show two

705 710 715 720 725

Op

tic

al

de

nsit

y, a

.u.

Photon energy, eV

707eV

708.7eV

Fe(II)-phosphate

Fe(III)-phosphate

Precipitates

Oxidized spots in precipitates

Bacteria

e

2µm 2µm 1µm

a b c

1µm

0

0.4

Constant

Fe(II) 1µm

0

4.4

Fe(III) 1µm

3.0

0

Fe(II) Fe(III)

1µm

a b

c d

Page 67: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

67

encrusted cells and extracellular precipitates. c: Constant map (i.e. contribution of a constant

absorbance spectrum at each pixel) accounting for the absorption of all elements below the

absorption edge energy of Fe. d: Composite map obtained by overlaying the Fe(II)- and the

Fe(III)-maps of the same area (in blue and red respectively), showing the presence of highly

oxidized spots among the mixed-valence extracellular precipitates. e: NEXAFS spectra at the

Fe L2,3-edge extracted from different areas of the stack compared with the spectra of Fe(II)-

phosphate and Fe(III)-phosphate model compounds. Spectra (solid lines) were fit with

combinations of the two model compounds to estimate the proportions of Fe(II) and Fe(III)

(dashed lines). Numerical fit results are displayed in Table 2.

3.4. Evolution of iron redox state at the submicrometer scale in BoFeN1 cultures

The spatial distribution of iron redox states in BoFeN1 cultures was analyzed by STXM at

the Fe L2,3-edges (Fig. 10). Fe(II) and Fe(III) maps (Fig. 10a and 10b) were obtained by fitting

Fe L2,3-edges stacks with linear combinations of Fe L2,3-edges spectra of the Fe(II)- and

Fe(III)-phosphate model compounds and a constant (Fig. 10c). A colour composite of the

Fe(II) and Fe(III) maps (Fig. 10d) allowed the localization of oxidized versus reduced areas in

the samples. The two references (Fe phosphates) were also used for linear decomposition of

the XANES spectra extracted from the stacks on bacteria and extracellular precipitates (Fig.

10e). Best fits provided a quantitative estimation of Fe(II)/Fetotal and Fe(III)/Fetotal ratios

(Table 2) in the bacteria and in the extracellular precipitates. The optical density was

systematically checked to ensure that it was low enough to avoid oversaturation of the

absorption signal that could artefactually modify the Fe-redox ratio.

In 1-day old cultures, iron exhibited a mixed valence in bacteria as well as in extracellular

precipitates, with average Fe(III)/Fetotal ratios of 50±0.6% and 44±0.6% Fe(III) respectively

(Fig. 10 and Table2). Combining these results with the total Fe concentration (Fe(II) and

Fe(III) in a dissolved or particulate form, 5.4 mM) and the dissolved Fe(II) concentration

measured by spectrophotometry in the culture medium after 1 day of culture (3.6 mM), we

can estimate particulate Fe(II) and Fe(III) average concentrations in the medium of 0.95 mM

and 0.85 mM respectively. However, spatial heterogeneities of the Fe redox state were

detected within the extracellular precipitates (Fig. 10d): in particular, highly oxidized spots

(75±0.6%Fe(III)) were observed among the extracellular precipitates.

Following the same method, the temporal evolution of iron redox state was investigated

on samples collected 3 h to 6 days after inoculation. Fe(II)-Fe(III) composite maps (Fig. 11a

to 11e) showed a progressive evolution from a predominantly Fe(II) composition on the cells

and the extracellular precipitates (3-6 h) towards a completely oxidized, Fe(III) state in 6-day

Page 68: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

68

old samples. Accordingly, best fits of the XANES spectra of the bacteria (Fig. 11f and Table

2) evidenced a transition from a mixed valence Fe(II)-Fe(III) mineral (42±0.5% Fe(III))

towards an almost pure Fe(III) mineral (91.7±0.7% Fe(III)). The same trend was observed on

the extracellular precipitates (Fig. 11g and Table 2). These results parallel bulk measurements

of dissolved Fe(II) in the cultures (Fig. 1).

TABLE 2. Fe(III)/Fe(total) quantification obtained from the fit of Fe L2,3-edge NEXAFS

spectra extracted from stacks on bacteria and precipitates at different stages of the culture.

Fe(III)/Fe(total) values result from at least two spectra fits. Standard deviations (SD) were

calculated as the SD of the fit to the data. Values reported in this Table are means of the

standard deviations obtained for each fit.

Area Time, h Mean Fe(III)/Fe(total) Standard deviation Bacteria 3 0.42 0.005

6 0.450 0.004 24 0.50 0.006 72 0.65 0.008 144 0.917 0.007

Precipitates 3 0.37 0.006

6 0.349 0.004

24 0.44 0.006

72 0.66 0.007

Page 69: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

69

Figure 11. Evolution of iron redox state 3 h to 6 days after inoculation. a to e: Fe redox

mapping (after the same procedure as presented in Figure 8) after 3 h, 6 h, 24 h, 72 h and 144

h of culture. We observed the progressive oxidation of iron associated with bacteria and

extracellular precipitates. f and g: NEXAFS spectra at the Fe L2,3-edge obtained on bacteria

and extracellular precipitates respectively, collected on 3h-old to 6-days old cultures. Solid

lines show the data and dashed lines the fits. The numerical results of the fits are displayed in

b

c d e

a

3h 6h

1 day 3 days

2µm 2µm

1µm 2µm 2µm

Fe(II) Fe(III)

705 710 715 720 725

Op

tica

l d

en

sit

y, a

.u.

Photon energy, eV

3h

6h

1 day

3 days

6 days

Fe(II)-phosphate

Fe(III)-phosphate

707eV

708.7eV

Bacteria

705 710 715 720 725

Op

tic

al

de

ns

ity

, a

.u.

Photon energy, eV

3h

6h

1 day

3 days

Fe(II)-phosphate

Fe(III)-phosphate

707eV

708.7eV

Precipitates

f g

Page 70: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

70

Table 2. These results indicate the progressive oxidation of iron both at the contact of the

bacteria and in the extracellular precipitates.

4. DISCUSSION

4.1. Periplasmic and polar precipitation of iron phosphates

In the present study, we observed the precipitation of amorphous iron phosphates within

the periplasm of the anaerobic iron-oxidizing nitrate-reducing strain BoFeN1 (Fig. 4). In

contrast, in the anaerobic iron-oxidizing phototrophic purple bacteria strain SW2, the

periplasm is never encrusted and precipitation of iron mainly occurs outside the cells (Kappler

and Newman, 2004). The reason why these two strains, that both oxidize ferrous iron at

neutral pH, exhibit different biomineralization patterns remains unclear. Precipitation of

calcium and chromium phosphates within the periplasm has been reported in several other

Gram-negative bacteria exposed to elevated concentrations calcium (Benzerara et al., 2004b)

or chromate (Goulhen et al., 2006) respectively. This suggests that periplasmic mineralization

of phosphates is a widespread mechanism, not restricted to iron-oxidizing bacteria. Moreover,

the two latter studies proposed two separate processes to account for the preferential

precipitation of phosphate in the periplasm: (1) the achievement of supersaturation with the

phosphate phase within the periplasm and (2) the preferential nucleation of phosphate

minerals on periplasmic, possibly proteic, compounds. Regarding the achievement of

supersaturation, it should be noted that the culture medium was initially saturated with a

Fe(II)-phosphate phase (see medium preparation in Material and Method section). It is

generally assumed that the chemical composition within the periplasm is close to that of the

culture medium, given the high permeability of the outer membrane, due to the abundance of

porins (Nikaido, 2003; Wilks and Slonczewski, 2007). Slight variations of chemical activities

within the periplasm may locally increase supersaturation with a Fe-phosphate phase and

account for its precipitation at this location. For example, these variations may be triggered by

the recycling of phosphates involving the activity of phosphatases (e.g. Hirschler et al., 1990;

Blake et al., 1998), by local variations of pH and/or by the metabolic oxidation of iron. The

solubility of the amorphous Fe-phosphates detected in the present study is however unknown

and thermodynamic analyses will have to be conducted in the future to address that point.

Regarding a preferential nucleation of mineral phases within the periplasm, observations of a

Page 71: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

71

preferential crystallographic growth of apatite parallel to the cell surface and proteomics

studies have suggested that formation of Ca-phosphate in the periplasm may result from

nucleation on specific membrane-associated proteins (e.g. Benzerara et al., 2004b, Van Dijk

et al., 1998). In BoFeN1 cultures, we observed an accumulation of proteins in the periplasm

of iron-encrusted cells (Fig. 7). These periplasmic proteins could serve as nucleation sites for

precipitation of iron phosphate, but further investigations are needed to support this

hypothesis.

Proteins allocated to the periplasm are synthesized in the cytoplasm and translocated to

the periplasmic compartment, where they are ultimately folded and assembled (Miot and

Betton, 2004). It has been shown that various environmental stresses can enhance the

accumulation of misfolded proteins in the periplasm of E. coli, leading to the formation of

periplasmic inclusion bodies composed of protein aggregates (e.g. Arié et al., 2006).

Moreover, recent studies evidenced an asymmetric formation and accumulation of inclusion

bodies at the poles of E. coli, under non-stressing conditions (Lindner et al., 2008). This

asymmetric pattern was shown to be a direct consequence of aging: upon cell division, protein

aggregates segregate and accumulate in older poles relative to new poles. In the present study,

we observed both a periplasmic accumulation of proteins in iron-encrusted cells and an

asymmetric pattern of cell mineralization at the poles. These results are both suggestive of

protein aggregation and the possible relation with a preferential cell encrustation would be

interesting to study further. Alternatively, the preferential location of iron precipitates at the

cell poles might be reminiscent of iron oxide granules previously reported to accumulate at

the poles of the iron-reducing bacterium Schewanella putrefaciens (Glasauer et al., 2007).

These authors proposed that this polar location could result from a facilitated iron uptake at

the poles.

4.2. Evolution of iron redox state in the periplasm

Proteins involved in the transfer of electrons during iron oxidation by anaerobic nitrate-

dependent iron-oxidizing bacteria are not known nor localized yet. However, recent studies of

the anaerobic iron-oxidizing phototrophs Rhodopseudomonas palustris strain TIE-1 and

Rhodobacter ferroxidans strain SW2 suggested that a soluble decahaeme c-type cytochrome,

potentially playing a crucial role in iron oxidation, could reside in the periplasm (Croal et al.,

2007, Jiao and Newman, 2007). Similarly, in the acidophilic iron oxidizing bacterium

Acidithiobacillus ferroxidans, the electron transfer system coupled to iron oxidation is

expected to function in the periplasmic space (Bruscella et al., 2005) and in particular, the

Page 72: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

72

cytochrome c oxidase has been described as a membrane-bound protein (Yamanaka and

Fukomori, 1995). In the present study, significant amounts of Fe(III) within BoFeN1

periplasm were observed from the beginning of the culture, increasing over time. These

results strongly suggest that at least one of the steps of iron oxidation takes place in the

periplasm of this strain as well.

Given the high permeability of the outer membrane of Gram-negative bacteria, it is

likely that the higher the Fe(II) concentration in the culture medium, the higher the Fe(II)

concentration in the periplasm. Hypothesizing that Fe(II) oxidation occurs within the

periplasm of BoFeN1, the redox state of periplasmic iron phosphates is directly influenced by

the balance between soluble Fe(II) concentrations in the culture medium and Fe(III) formed

by metabolic oxidation. The following scenario can thus be proposed: at time zero, there is a

high concentration of Fe(II) in solution, and part of this iron is taken up and oxidized by the

bacteria, leading to the precipitation of a mixed-valence iron phase in the periplasm. Over the

course of culture growth, the concentration of dissolved Fe(II) in solution decreases and thus

the average iron redox state of the periplasmic precipitate increases. This scenario could

partly explain how the redox state of the periplasmic precipitate roughly follows the iron

redox state of the bulk solution. Moreover, in a scenario where Fe oxidation stops as soon as

precipitation occurs within the periplasm, one could expect to find a mixture of cells with

periplasmic precipitates exhibiting various iron redox states ranging from a mixed-valence

compound towards a pure Fe(III) compound in the latest stages of growth. In contrast,

although the number of analyses was inherently limited by the microscopy approach, the iron

redox state of the periplasmic precipitates was constant from one cell to another at a given

growth stage. Two hypotheses could account for these results: (1) a constant re-equilibration

of the redox state of the precipitates after their formation, or (2) an increasing fraction of

biomineralizing cells at a given stage compared to former stages (potentially caused by a

combination of growth and precipitation kinetics or by cell lysis). These hypotheses will have

to be assessed in future studies. Overall, the homogeneity of the iron redox state and the

colocalization of Fe and P evidenced by EDXS (Fig. 6) both suggest the existence of a single

Fe-phosphate phase at a given stage of the culture. Some authors have proposed the existence

of an autocatalytic process consisting in the oxidation of Fe(II) in solution by Fe(III)-

containing solids. Fakih et al. (2008) have observed a decreased autocatalytic effect of the

oxidation of Fe(II) associated with bacteria in cultures of Bacillus subtilis. While this process

may occur in BoFeN1 cultures, it should be noted that it would slow down the rate of Fe(II)

oxidation within the periplasm of BoFeN1 cells. However, the main trend we observe is the

Page 73: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

73

reverse, i.e. faster oxidation of Fe(II) on the cells, which likely results at first order from the

metabolic oxidation of Fe(II) by the bacteria.

4.3. Extracellular precipitation of iron phosphates

4.3.1. Role of organics in extracellular precipitation of iron phosphates

Extracellular mineralized filaments consisting of iron phosphates were shown to be

associated with exopolysaccharides (Fig. 7) in the BoFeN1 cultures. These precipitates

displayed a morphology (Fig. 4) and an organic content similar to the polysaccharide-

associated iron oxyhydroxide filaments described by Chan et al. (2004) in a neutral-pH

environment. These authors suggested that extrusion of polysaccharides localized iron

precipitation in proximity to the cell membranes, thus harnessing the proton gradient for

energy generation. In addition, this study showed that polysaccharide strands triggered the

nucleation of high aspect ratio pseudo-single crystals of akaganeite. In contrast, iron

phosphates formed by BoFeN1 are amorphous. However, our results suggest that EPS may

facilitate iron phosphate nucleation or aggregation of iron phosphate colloids outside the cells,

concomitantly with periplasmic encrustation.

4.3.2. Origin of extracellular Fe(III)

STXM analyses of the extracellular precipitates formed in BoFeN1 cultures highlighted a

local heterogeneity of iron redox state, with highly oxidized spots disseminated within a

mixed-valence iron phosphate matrix (Fig. 10). Furthermore, iron was almost completely

oxidized in the extracellular precipitates after three days of culture (Fig. 11 and Table 2).

These extracellular iron biominerals are reminiscent of those described in neutrophilic iron-

oxidizing phototroph cultures of R. palustris strain SW2 for instance (Kappler and Newman,

2004). Those authors have questioned the mechanisms involved in the transfer of Fe(III) from

the cells to the extracellular medium. Indeed, the presence of Fe(III) away from the bacteria is

somewhat surprising given the low solubility of Fe(III) at neutral pH (Cornell and

Schwertmann, 2003). The same question is relevant to BoFeN1, as we showed in the present

study that BoFeN1, in addition to mineral precipitation within the periplasm and on external

cell wall, has the ability to form extracellular Fe(III) mineral phases not bound to the cells.

Abiotic oxidation of Fe(II) by nitrite can first be considered. However, such processes have

been shown to contribute to a significant iron oxidation rate only in the presence of cell-bound

Fe(II) and not in the presence of aqueous Fe(II) (Coby and Picardal, 2005). Moreover, as

demonstrated by Kappler et al. (2005a), the kinetics of iron oxidation observed in BoFeN1

Page 74: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

74

cultures does not support an abiotic oxidation of iron by nitrites. Therefore, abiotic oxidation

of Fe(II) at distance from the cells via this mechanism is unlikely. Although significant

amounts of proteins were not detected in association with extracellular precipitates, lysis of

cells encrusted by Fe(III)-minerals could account in part for the presence of Fe(III)-rich spots

among the extracellular mixed-valence precipitates. Previous studies on R. ferrooxidans sp.

strain SW2 (Croal et al., 2004; Kappler and Newman, 2004; Croal et al., 2007) have

suggested some other mechanisms: (1) A production of Fe(III)-chelators exporting Fe(III)

away from the cells (this hypothesis may also partly explain the Fe isotope fractionation

produced by iron-oxidizing phototrophs (Croal et al., 2004)) (2) A local drop of pH around

the cells (Kappler and Newman, 2004), which may favor Fe(III) export.

4.4. Potential bio-signatures in the fossil record

Mineralized filaments composed of iron oxides have been widely described in ancient rocks

and their biogenicity questioned (e.g. Little et al., 2004, Ivarsson et al., 2008). Most of these

studies have noted the morphological similarity of these filaments with structures resulting

from iron oxidation by microaerobic bacteria such as Gallionella stalks and Leptothrix

sheaths (Fortin and Langley, 2005). However, potential signatures of the past activity of

anaerobic iron-oxidizing bacteria have never been observed in ancient rocks, probably as a

consequence of the scarcity of studies dealing with these metabolisms. Nevertheless,

anaerobic iron-oxidizing bacteria may have played a crucial role in driving ancient

geochemical cycles (Konhauser, 1998; Kappler et al., 2005b; Posth et al., 2008). Moreover,

the potential involvement of iron-oxidizing bacteria in the formation of tubes in basaltic glass

has been discussed (e.g. Furnes et al., 2005; Benzerara et al., 2007). In order to fully assess

the biogenic origin of iron minerals found in ancient rocks and their possible relationship with

the activity of past anaerobic iron-oxidizing bacteria, accurate and specific criteria are needed.

In the present study, minerals produced in BoFeN1 cultures were shown to consist of Fe-

phosphates. It is likely that using a different culture medium composition (for instance

carbonate instead of phosphate) would have led to a different mineralogy. The mineralogy of

the phases formed in the present BoFeN1 cultures is thus likely not innate to bacterial

anaerobic Fe oxidation at neutral pH. This issue should be addressed in future experiments in

which the chemistry of culture medium could be modified. Nevertheless, iron biominerals

produced in BoFeN1 cultures were shown to exhibit very specific patters that are probably

independent of the chemistry of the culture medium and more likely related to processes

triggered by this bacterial metabolism: a 40 nm-thick layer of iron minerals associated with

Page 75: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

75

high concentrations of protein moieties within the periplasm (Fig. 4), asymmetric

mineralization at bacteria poles (Fig. 4), and mineralized filaments composed of iron minerals

associated with polysaccharides (Fig. 4 and Fig. 7). These features are potential indicators of

these metabolisms that could be preserved and sought for in modern environments and in

ancient rocks. The preservation of such features during diagenesis and metamorphism, in

particular the preservation of local accumulations of proteins and polysaccharides associated

with the mineral precipitates will have to be assessed in future experiments. Looking for such

organic-mineral associations using spectromicroscopic methods (e.g. Bernard et al., 2007;

Lepot et al., 2008) would provide additional evidence of bacterial iron oxidation in the fossil

record.

5. CONCLUSIONS

The periplasm was revealed as a key location for iron oxidation in BoFeN1. Asymmetric

polar mineral thickening and accumulation of proteins within the periplasm of iron-encrusted

cells are suggestive of protein aggregation possibly promoting iron phosphate nucleation.

Exopolysaccharides were produced and released by the bacteria and potentially participate in

localizing the precipitation of extracellular iron phosphates at distance from the cells. The

progressive oxidation of these extracellular phases supports the hypothesis of a mechanism of

Fe(III) export. These results indicate that this encrusting strain (BoFeN1) shares similarities

with non-encrusting neutrophilic iron-oxidizing bacteria, such as SW2 (Kappler and Newman,

2004), suggesting that cell encrustation is not exclusive of Fe(III) export.

Page 76: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

76

Acknowledgments:

We gratefully acknowledge the support of an ANR “Jeunes Chercheurs” Grant (JM &KB).

The STXM measurements have been performed at the Swiss Light Source, Paul Scherrer

Institut, Villigen, Switzerland and the Canadian Light Source, Saskatoon, Canada. The CLS is

supported by NSERC, CIHR, NRC and the University of Saskatchewan. We thank Joerg

Raabe and George Tzvetkov for their expert support of the SLS STXM and Konstantine

Kaznatcheev, Chithra Karunakaran and Drew Bertwistle for their expert support of the CLS

STXM. We also thank Olivier Beyssac (ENS Paris) for his help in data collection at SLS.

Portions of this research were carried out at the Stanford Synchrotron Radiation Laboratory, a

national user facility operated by Stanford University on behalf of the U.S. Department of

Energy, Office of Basic Energy Sciences. The authors are indebted to the SSRL staff,

especially John R. Bargar, Joe Rogers and Samuel Webb, for their technical assistance during

the XAFS experiments. We also thank Georges Ona N’guema and Farid Juillot (IMPMC) for

their help in XAS data collection at the SSRL. We acknowledge the European Synchrotron

Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities and we would like to thank

Olivier Mathon for his assistance in using beamline BM29. We acknowledge the SOLEIL

Synchrotron for provision of synchrotron radiation facilities and we would like to thank

Stephanie Belin, Emiliano Fonda and Valerie Briois for their assistance in using the SAMBA

beamline. We would like to acknowledge Florian Hegler for his help cultivating the nitrate-

depending Fe(II)-oxidizing strain BoFeN1. The contribution from AK and NP was funded by

an Emmy-Noether fellowship and additional funding from the German Research Foundation

(DFG) to AK. This study was supported by a grant from Agence Nationale de la Recherche

(KB and JM). This is IPGP contribution No. xxx.

Page 77: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

77

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Page 82: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

82

Page 83: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

83

Chapitre 1.B.

Transformation de la vivianite par BoFeN1

Problématique et objectifs. Une des questions centrales de la géomicrobiologie est de

déterminer par quels mécanismes les micro-organismes peuvent extraire les éléments

chimiques essentiels à leur métabolisme à partir d’une source solide : contact direct, induction

de dissolution avec génération de systèmes transporteurs, etc... Cette question se pose de

manière évidente pour comprendre le comportement de la souche dénitrifiante BoFeN1 et

plus généralement des bactéries ferro-oxydantes à pH neutre ou quasi neutre car le Fe(II) est

majoritairement immobilisé dans des phases solides à la surface de la Terre (sous forme de

carbonates, de phosphates ou encore de silicates). Après avoir étudié au Chapitre 1.A. les

processus de biominéralisation du fer par la souche dénitrifiante BoFeN1 cultivée en présence

de Fe(II) en solution, nous nous sommes donc intéressés aux transformations minéralogiques

d’une phase solide insoluble, riche en Fe(II), la vivianite Fe(II)3(PO4)2.8H2O en présence de

ce microorganisme. La vivianite est l’un des porteurs de fer les plus importants dans les

environnements continentaux anoxiques (zones profondes anoxiques des lacs, sédiments de

rivières) et constitue le principal puits de phosphore dans les lacs (Nriagu & Dell, 1974,

Manning et al., 1991, Viollier et al., 1997, Sapota et al., 2006). Son choix a été suggéré par sa

synthèse in situ dans nos milieux de culture. Ce phosphate de Fe(II) est de plus très peu

soluble (Ks=10-36

, Nriagu et al., 1972) et est donc supposé être très stable en conditions

anoxiques : il était couramment admis que cette phase ne pouvait pas être transformée par des

bactéries ferro-oxydantes anaérobies. Dans l’article qui suit, nous avons étudié les

transformations minéralogiques de la vivianite, en équilibre avec une solution saturée en

Fe(II), en particulier en suivant l’évolution du degré d’oxydation du fer au cours de la culture.

Méthodologie.

Spectroscopie d’absorption X (XAS). Les phases riches en fer que nous avons caractérisées

au cours de cette thèse sont des particules de très petites tailles, avec une taille caractéristique

de l’ordre de quelques nanomètres de diamètre. En outre, les produits de l’oxydation

microbienne du fer dans les conditions de culture que nous avons appliquées, sont très

souvent amorphes. Afin de déterminer la minéralogie de ces particules finement divisées et

souvent amorphes, nous avons eu recours à la spectroscopie d’absorption des rayons X

(XAS), utilisant un rayonnement synchrotron de haute énergie. Les spectres obtenus peuvent

Page 84: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

84

être divisés en deux parties : la partie XANES (X-ray Absorption Near-Edge Structure)

s’étend depuis la partie avant le seuil d’absorption jusqu’à 50 eV après le seuil, tandis que la

partie EXAFS (Extended X-ray Absorption Fine Structure) des spectres s’étend au-delà de 50

eV après le seuil d’absorption.

Dans le cas des éléments de transition, le spectre XANES au seuil K permet

généralement d'accéder avec une bonne précision à l'état d'oxydation, au travers de la position

du seuil ou du maximum d'absorption (As, Se) ou par l'analyse des transitions du préseuil (V,

Cr, Mn, Fe) (Galoisy et al. 2001, Petit et al., 2001, Wilke et al. 2001, Berry et al. 2003). Il est

important de rappeler que, pour utiliser ces méthodes, il est très souvent nécessaire de

disposer d'un jeu de spectres expérimentaux de composés de références bien caractérisés sur

le plan chimique et structural, et représentant le mieux possible la diversité des formes

chimiques de l'élément analysé dans l'échantillon. En effet, les spectres XANES dépendent

non seulement du degré d'oxydation mais également de la structure et de la chimie locale, à

courte (coordinance, liaison chimique, nature du ligand) et à moyenne distance (structure

moléculaire ou cristalline).

Lorsque les rayons X interagissent avec un atome, ils éjectent un ou plusieurs

électrons de cœur (ou photoélectrons) si l’énergie du faisceau incident est supérieure au seuil

d’absorption de cet atome. Il est prédit que l’éjection provoque une onde sphérique, qui

interagit à son tour avec les atomes voisins, conduisant à la propagation d’ondes

rétrodiffusées. Les interférences constructives et destructives entre ces ondes émises par les

atomes absorbeurs et rétrodiffuseurs donnent lieu à des oscillations du coefficient

d’absorption. Ces oscillations fournissent la structure fine de la partie EXAFS des spectres

d’absorption des rayons X.

Une relation théorique peut être utilisée pour modéliser le signal EXAFS χ(k):

( ) ( )∑ −

−= )(2sin.2exp.

)(

2exp.

)()(

22

2

2

0kkRk

k

R

kR

SkANk asasas

as

as

ss ϕσλ

χ (Eqn. 1)

Où : 2

0 )(2

h

EEmk e −

=

est le vecteur d’onde, avec me la masse d’un electron,

Eo l’énergie du seuil

h la constante de Planck.

Les paramètres de l’Eqn. 1 décrivent la structure interne de l’échantillon (Ns, Ras, σas)

ou sont reliés à l’état électronique des atomes présents (As, So2, ϕas, λ).

Page 85: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

85

• NS et Ras sont respectivement le nombre d’atomes rétrodiffuseurs et la distance

absorbeur-diffuseur. En première approximation, NS est lié à l’amplitude du signal

EXAFS et Ras à la fréquence des oscillations. De plus, comme l’amplitude décroît en

1/R², l’EXAFS fournit seulement des informations pour les atomes les plus proches de

l’absorbeur, généralement jusqu’à une distance de 5 Å et au maximum 10 Å dans les

matériaux cristallisés très bien ordonnés.

• ϕas et As fournissent les informations nécessaires pour identifier les différents atomes.

ϕas représente le déplacement de phase dû aux variations de potentiel subies par l’onde

sphérique (passage par les potentiels des atomes absorbeurs et rétrodiffuseurs). As

correspond à la dépendance en énergie de l’amplitude de la rétrodiffusion du

photoélectron. Cependant, ces deux facteurs ne sont pas fortement contraints par

l’identité des atomes présents. On peut par exemple facilement distinguer O de S, mais

pas O de N, ni C de F par exemple.

• Le terme So2 explique les processus de perte inélastique. Le premier terme exponentiel

est un facteur d’atténuation, lié au libre parcours moyen du photoélectron (λ(k)). Le

second terme exponentiel est le facteur de Debye-Waller. C’est également un terme

d’atténuation qui permet d’expliquer les interférences destructives entre les ondes

rétrodiffusées des différents atomes voisins. Théoriquement, le facteur de Debye-

Waller est en fait limité au terme σas et explique les effets d’agitation thermique.

La contribution de toutes les paires d’atomes absorbeur-rétrodiffuseur crée les oscillations

observées. Ces termes sont donc sommés pour l’ensemble des atomes. De façon pratique, les

différents atomes sont regroupés en couches, correspondants aux atomes absorbeurs

identiques placés à des distances de l’atome central approximativement similaires.

Afin de préserver le degré d’oxydation du fer, outre les précautions prises lors de la

préparation et du transport des échantillons (voir supra), toutes les analyses XAS ont été

effectuées à basse température (10 K) (e.g. Wang et al., 2008). Au cours de ce travail, les

données XANES et EXAFS au seuil K du fer ont été enregistrées sur divers synchrotrons

(SSRL, ESRF, SOLEIL), en général en transmission, sauf pour certains échantillons dont

nous disposions en très faibles quantités qui ont été enregistrés en fluorescence. Les détails

concernant les lignes de lumière et les conditions d’expériences sont reportés dans les articles

correspondants. Les spectres EXAFS ont été extraits et normalisés selon les procédures

classiques en utilisant le programme de Winterer (1997). Les données EXAFS non filtrées ont

Page 86: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

86

été interprétées en utilisant le formule en ondes planes de l’EXAFS (Eqn. 1) à l’aide de

fonctions de phase et d’amplitude calculées selon une formulation en ondes courbes (FEFF8,

Ankudinov et al., 1998).

Dans le cadre de notre étude, la spectroscopie XANES a été employée pour déterminer

le redox global moyen des échantillons, l’analyse semi-quantitative du redox à l’échelle locale

étant réalisée en STXM. De plus, l’EXAFS nous a permis de déterminer la nature des phases

amorphes présentes dans nos échantillons, nous permettant ensuite d’utiliser des références

appropriées pour la décomposition des spectres XANES obtenus en STXM.

Figure 1B-1. Spectroscopie d’Absorption des Rayons X au seuil K du Fe (exemple de la

vivianite). A : Le spectre présente un seuil d’absorption dont l’énergie dépend de la nature de

l’élément absorbeur. Ce spectre est divisé en deux parties : le XANES qui donne des

informations sur la valence de l’atome central (Fe) et sur la géométrie et la nature des atomes

l’entourant ; l’EXAFS fournit des informations précises sur l’ordre local autour des atomes de

fer. B : Les prépics du fer fournissent une information semi-quantitative sur le ratio

Fe(II)/Fe(III). C et D : Le χ(k) (ici pondéré par un facteur k3 pour amplifier les oscillations à

grands k) et la transformée de Fourier obtenus par traitement de la partie EXAFS des spectres

7000 7200 7400 7600 7800 8000

Ab

so

rban

ce

no

rmalis

ée

Energie, eV

XANES EXAFS

Seuild'absorption

3 4 5 6 7 8

k3χ

(k)) ))

k, Å-1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

FT

Mag

nit

ud

e

R(Å)

A

B

C

D

7000 7200 7400 7600 7800 8000

Ab

so

rban

ce

no

rmalis

ée

Energie, eV

XANES EXAFS

Seuild'absorption

3 4 5 6 7 8

k3χ

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k, Å-1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

FT

Mag

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ud

e

R(Å)

A

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7000 7200 7400 7600 7800 8000

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Energie, eV

XANES EXAFS

Seuild'absorption

3 4 5 6 7 8

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0 1 2 3 4 5 6 7 8

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Energie, eV

XANES EXAFS

Seuild'absorption

3 4 5 6 7 8

k3χ

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k, Å-1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

FT

Mag

nit

ud

e

R(Å)

A

B

C

D

Page 87: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

87

permettent de déterminer la nature et l’agencement des atomes voisins du fer dans

l’échantillon.

Principaux résultats et perspectives. L’étude que nous avons menée sur des cultures de

BoFeN1 en présence de vivianite révèle la transformation progressive et totale de ce

phosphate de Fe(II) cristallisé en un phosphate de Fe(III) amorphe. Cette transformation passe

par la précipitation d’une phase intermédiaire verdâtre ayant la composition d’un phosphate

de Fe(II)-Fe(III) amorphe, spécifique de l’oxydation de la vivianite. Cette phase se transforme

ensuite progressivement en une phase rouille constituée de phosphate de Fe(III), présentant un

rapport Fe/P de 0.36 environ après 2 mois d’incubation.

Par ailleurs, les analyses STXM indiquent que le taux d’oxydation du fer est plus élevé

au contact des bactéries que dans les minéraux extracellulaires issus de la transformation de la

vivianite initiale. Ainsi, au cours de la culture, le fer présent à distance des bactéries est

toujours moins oxydé que le fer présent au contact direct des cellules. Ceci suggère que le

Fe(II) soluble est d’abord oxydé au niveau des bactéries, ce qui induit une sous-saturation du

milieu vis-à-vis de la vivianite, qui commence à se dissoudre et à exporter plus de Fe(II) vers

les cellules. En retour, soit le Fe(III) directement produit par les cellules, soit un oxydant, est

transporté vers les minéraux extracellulaires issus de la transformation de la vivianite, qui

ainsi s’oxydent progressivement.

Cette oxydation du fer, y compris à distance des microorganismes, est catalysée par les

bactéries, de façon directe (export de Fe(III) sous forme dissoute, complexée à des molécules

organiques ou sous forme de colloïdes) ou indirecte (export d’oxydants). Dans le but de

rechercher un oxydant potentiel du Fe(II) dans ce système, nous avons débuté des dosages des

espèces azotées (nitrates, nitrites) en collaboration avec le laboratoire Sisyphe (Anniet

Lavermann, Université Paris 6) dans les cultures de BoFeN1 en présence de vivianite ou de

Fe(II) dissous et dans des témoins abiotiques (vivianite + nitrites). En effet, si le rôle des

nitrates dans l’oxydation du Fe(II) peut être écarté (car le témoin abiotique vivianite + nitrates

ne s’oxyde pas dans le temps de l’expérience), le rôle potentiel des nitrites doit en revanche

être évalué. Les nitrites sont produits comme intermédiaires de la réduction des nitrates au

cours de l’oxydation du Fe(II) par BoFeN1 (Kappler et al., 2005a) et s’accumulent à des

concentrations de l’ordre de 1.5 mM dans le milieu de culture. Kappler et al. (2005a) ont

montré que le taux d’oxydation du Fe(II) dissous par les bactéries était nettement supérieur à

celui de l’oxydation abiotique du Fe(II) par les nitrites (d’un facteur 7 environ). Dans notre

Page 88: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

88

système, nous observons que l’oxydation du Fe(II) sur les précipités extracellulaires est 3 à 5

fois moins rapide que sur les bactéries. Ceci suggère que l’oxydation du fer qui précipite au

contact des bactéries est catalysée enzymatiquement par les cellules, tandis que l’oxydation

extracellulaire du fer pourrait résulter de la réaction chimique du Fe(II) avec des nitrites. Les

dosages complémentaires en cours permettront très probablement d’élucider ce point.

Dans l’hypothèse d’un export de Fe(III) depuis les cellules vers le milieu

extracellulaire, nos résultats suggèrent qu’une fraction colloïdale de phosphates de fer pourrait

intervenir. Une étude plus approfondie de cette fraction colloïdale pourrait apporter des

éléments importants dans la compréhension générale de la mobilité du Fe(III) à pH neutre

dans les systèmes naturels. En outre, dans les systèmes où l’oxydation du fer a été incomplète,

les hétérogénéités de degré d’oxydation du fer mises en évidence à l’échelle sub-

micrométrique pourraient constituer l’un des marqueurs permettant de rechercher ce type de

métabolisme dans des environnements actuels et anciens.

Page 89: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

89

Transformation of vivianite by anaerobic iron-oxidizing bacteria

Short running title: Oxidation of vivianite by iron-oxidizing bacteria

Jennyfer Miot (1), Karim Benzerara (1), Guillaume Morin (1), Sylvain Bernard (2), Olivier

Beyssac (2), Eric Larquet (1), Georges Ona-Nguema (1), Andreas Kappler (3), François

Guyot (1).

(1) Institut de Minéralogie et de Physique des Milieux Condensés, UMR 7590, CNRS,

Universités Paris 6 et Paris 7, et IPGP.

140, rue de Lourmel. 75 015 Paris, France.

(2) Laboratoire de Géologie, Ecole normale supérieure, CNRS, 24 rue Lhomond, 75005

Paris, France.

(3) Geomicrobiology Center for Applied Geoscience (ZAG), University of Tuebingen,

Sigwartstrasse 10, 72076 Tuebingen, Germany.

*Corresponding author:

[email protected] ; Tel: 0033144279832; Fax: 0033144273785

To be submitted to Geobiology

Page 90: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

90

ABSTRACT

In phosphate-rich environments, vivianite (FeII

3(PO4)2.8H2O) is an important sink for

dissolved Fe(II) and is considered as a very stable mineral due to its low solubility at neutral

pH. In the present study, we report the mineralogical transformations of vivianite in cultures

of the nitrate-reducing iron-oxidizing bacteria strain BoFeN1. Vivianite was first transformed

into a greenish phase consisting mostly of an amorphous mixed valence Fe-phosphate. This

precipitate became progressively orange and the final product of iron oxidation consisted of

an amorphous Fe(III)-phosphate (in the form of FeIII

14(PO4)5(OH)27). The sub-micrometer

analysis by Scanning Transmission X-ray Microscopy (STXM) of the iron redox state in

samples collected at different stages of the culture indicated that iron was progressively

oxidized at the contact of the bacteria and at distance of the cells in extracellular minerals.

Iron oxidation in the extracellular minerals was delayed by a few days compared to cell-

associated Fe, leading to local heterogeneities of redox within the samples. On the other hand,

at each time point, the variability of Fe redox state among the extracellular minerals was very

low. These results suggest that vivianite transformation proceeds through a dissolution-

precipitation pathway. Vivianite dissolution leads to the release of Fe(II) in solution, followed

by precipitation of a mixed valence Fe(II)-Fe(III) phosphate which progressively equilibrates

with the solution until Fe(II) is completely oxidized. Processes leading to the export of Fe(III)

or of an oxidant from oxidation sites on cells to extracellular minerals are discussed including

the possible role of colloids observed by cryo-transmission electron microscopy in the culture

medium and the possible role of nitrites.

Page 91: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

91

INTRODUCTION

A huge proportion of ferrous iron found at the Earth surface is immobilized in solid

phases. Basalts represent a significant surface reservoir, in which iron is incorporated in

diverse minerals, including sulphur minerals such as pyrite (FeS2) or ferrous sulphide (FeS),

titanomagnetite and Fe-silicates (Schippers & Joergensen, 2002, Edwards et al., 2003). At

distance from the ridge, Fe(II) is progressively oxidized into Fe(III) through abiotic and

possibly through microbial processes (e.g. Schippers & Joergensen, 2002). An increasing

number of studies have attempted to assess the capabilities of microbes such as iron-oxidizing

bacteria to oxidize solid-phase Fe(II) and to use it as source of energy. However, the

mechanisms by which microbes uptake Fe(II) from solid phases are still poorly understood,

especially under pH conditions close to neutrality.

A few microorganisms are known to oxidize soluble Fe(II) at neutral pH under strictly

anoxic conditions (e.g. Widdel et al., 1993; Ehrenreich and Widdel, 1994, Heising and

Schink, 1998): specifically, some bacteria use nitrate as an electron acceptor for the oxidation

of Fe(II) (Hafenbradl et al., 1996; Straub et al., 1996; Benz et al., 1998, Straub and Buchholz-

Cleven, 1998, Kappler et al., 2005a), following the reaction (Eqn. 1):

2Fe2+

+ 5H2O + NO3- = 2Fe(OH)3 + 4H

+ + NO2

- (Eqn. 1)

wherein the by-product of the soluble Fe(II) oxidation is symbolized as Fe(III)-hydroxides

Fe(OH)3 for simplicity. While most of the studies on Fe-oxidizing bacteria have used Fe(II)

under a soluble form, it has been shown that these bacteria can also enhance the dissolution

and oxidation of various solid-phase Fe(II) compounds, such as siderite (FeCO3), ferrous

sulphide (FeS) or magnetite (Fe3O4) (Weber et al., 2001, Schippers & Joergensen, 2002,

Kappler & Newman, 2004). Such metabolisms might thus play a crucial role in the

weathering of Fe(II)-bearing minerals and consequently impact the geochemical cycle of iron

and heavy metals in neutral-pH anoxic environments, such as river sediments, lakes or deep-

sea environments (e.g. Edwards et al., 2003).

In non marine environments and at high phosphate concentration, Fe(II) can be in the

form of amorphous or crystalline ferrous phosphate. In particular, vivianite (FeII

3(PO4)2.8H2O)

is considered as one of the most important sink of P in lakes (Nriagu & Dell, 1974, Manning

et al., 1991, Viollier et al., 1997, Sapota et al., 2006). This mineral, which is very stable

(KS=10-36

; Nriagu et al., 1972) controls partly the geochemical cycles of Fe and P and thereby

the trophic status of lakes. Illustrating that idea, Fe(II,III) salts additions can be used to

efficiently reduce P concentrations in eutrophic environments (see e.g. Frossard et al., 1996).

Page 92: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

92

Moreover, phosphate amendments are also commonly used for the remediation of polluted

environments: natural phosphate rocks (NPR) additions in acid mine drainages lead to the

immobilization of heavy metals as secondary metal phosphate precipitates within mining

wastes (Ueshima et al., 2004). In the same way, vivianite nanoparticles have been shown to be

efficient in immobilizing heavy metals in the environment (e.g. Liu et al., 2007). Both

treatments influence the precipitation or dissolution of iron-phosphate minerals, which depend

on redox conditions, pH, availability of dissolved elements (in particular P and Fe) and

organic matter content (Nriagu & Dell, 1974, Manning et al., 1991). All these parameters can

be affected by microbial activities, in particular by anaerobic iron bio-oxidation. However,

due to its low solubility at neutral pH (Nriagu et al., 1972), vivianite is supposed to remain

very stable under anoxic conditions and it is usually assessed that it can not be transformed by

anaerobic iron-oxidizing bacteria.

In this study, the nitrate-dependent iron-oxidizing bacteria strain BoFeN1 (Kappler et

al., 2005a) was cultured in the presence of vivianite. This mineral was initially at equilibrium

with a saturated solution and we studied the displacement of this equilibrium driven by iron

bio-oxidation. The resulting mineralogical transformations of vivianite and the oxidation of

Fe(II)-minerals were followed along the time course of a batch culture down to the

nanometer-scale, using a combination of Transmission Electron Microscopy (TEM) and

synchrotron-based Scanning Transmission X-Ray Microscopy (STXM). We evidence

significant mineralogical transformations of vivianite as well as a progressive oxidation of

dissolved and solid Fe(II) driven by bacteria.

MATERIALS AND METHODS

Bacterial strain and growth conditions

The nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing strain BoFeN1, isolated from Lake Constance

littoral sediments (Kappler et al., 2005a), was cultivated in freshwater mineral medium

prepared after Ehrenreich & Widdel (1994), containing 4.4 mM phosphate. BoFeN1 was

grown in this medium supplemented with 5 mM acetate (provided as sodium acetate) and 10

mM nitrate (provided as sodium nitrate) in the presence or absence of Fe(II) (provided as

FeCl2). The addition of Fe(II) at a total concentration of 10 mM led to the precipitation of a

white Fe-rich precipitate identified as vivianite and resulting in a dissolved Fe(II)

concentration of ~ 3 mM. For each culture, 25 mL of medium were transferred into a 58 mL

Page 93: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

93

serum bottle that was flushed with N2/CO2 (80% / 20%), closed with a butyl rubber stopper

and crimped. BoFeN1 was inoculated at 10% from an acetate-nitrate-grown culture (culture

without iron). Cultures were incubated at 30°C. For X-ray Absorption Spectroscopy (XAS),

X-ray Diffraction (XRD) and Scanning Transmission X-ray Microscopy (STXM) analyses,

samples of the same culture were collected at several time steps in an O2-free glove-box (pO2

< 50 ppm).

Analytical methods

Bacterial growth was followed by measuring the total content of soluble proteins using

the Bradford assay (Bradford, 1976). 1 mL of culture was mixed with 840 µL of a solution of

oxalic acid (pH 3, 0.2M) in order to dissolve iron-bearing minerals and with 160 µL of 6.1 M

trichloroacetic acid to precipitate proteins. After centrifugation (11000 g, 30 min) and

removal of the supernatant, proteins were dissolved in 1mL of 0.1 M NaOH at 60°C for 6

min. The absorbance of the samples was measured at 595 nm after reaction with the Bradford

reagent (BioRad, microassay).

In order to measure the concentration of dissolved iron, 100 µL of a culture suspension

or the abiotic control were sampled with a syringe and filtered through 0.22 µm Millipore

filter in an anoxic glove-box. The dissolved Fe(II) content of the filtrate was determined by

the ferrozine assay (Viollier et al., 2000) after dilution with 900 µL of 1 M HCl.

The composition of the culture medium was additionally simulated using the JChess

software taking into account the complete chemistry of the solution, including pH and gases

partial pressures. These simulations provided the theoretical concentrations of the dissolved

compounds and the nature of the solid phases precipitating in the medium at the

thermodynamic equilibrium.

Synthesis of model compounds

The Fe redox state of the samples was determined at the submicrometer-scale by using

STXM at the Fe L2,3-edges. The Fe(II) and Fe(III) reference end-members used for this study

were pure Fe(II)- and Fe(III)-phosphates. Both were synthesized under anoxic conditions.

Fe(II)-phosphate was obtained by adding 10 mM Fe(II) (as FeCl2), 5 mM acetate and 10 mM

nitrate to the growth medium, which led to the precipitation of a whitish phase identified as

pure vivianite by XRD. X-ray amorphous Fe(III)-phosphate was obtained by adding 10 mM

Fe(III) (as FeCl3), 5 mM acetate and 10 mM nitrate to the growth medium. Both precipitates

Page 94: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

94

were rinsed twice with degassed distilled water and dried under vacuum inside an anoxic

glove-box.

Mineral characterization by X-ray diffraction

The mineralogical compositions of the solid phases collected from 4-day, 16-day and

1-year old cultures, as well as of the Fe(II)- and Fe(III)-phosphate references were determined

by XRD. The whole sample preparation procedure described hereafter was carried out in an

anoxic glove-box in order to guarantee strict anoxic conditions for XRD analyses. The

cultures were centrifuged (5000 g, 10 min) and the solid phases were systematically rinsed

twice using degassed distilled water and vacuum-dried. The resulting powder was ground in

an agate mortar and dispensed in a borosilicate capillary that was sealed with glue before

analysis in the diffractometer. XRD measurements were performed with CoKa radiation on a

Panalytical® X’Pert Pro MPD diffractometer mounted in Debye-Scherrer configuration using

an elliptical mirror to obtain a high flux parallel incident beam and an X'Celerator®

detector to

collect the diffracted beam. Data were recorded in the continuous-scan mode within the 5 -

90° 2θ range with a step of 0.03°, and a counting time of 12 to 24 h per sample.

Bulk XAS analyses

XAS data were measured on the products of Fe(II) bio-oxidation by BoFeN1 at the Fe

K-edge. Samples were transferred from the glove-box into a liquid nitrogen bath and then into

the cryostat, where they were placed under He atmosphere. This procedure preserved anoxic

conditions during sample transfer and analysis. The data were recorded on beamline 10-2 at

the Stanford Synchrotron Radiation Laboratory (SSRL) using a Si(220) double-crystal

monochromator. Due to the low amount of sample available, data were collected on samples

mixed with cellulose, in fluorescence detection mode using a 13-element Ge-array detector

and a 3 ∆µ Mn filter to attenuate elastic scattering. Energy was calibrated by using a double-

transmission setup; the first inflection point of the Fe metal foil K-edge was set at 7111.1 eV

(Wilke et al. 2001). In order to limit Fe(III) reduction under the X-ray beam and to enhance

EXAFS signal on our nano-sized and poorly-ordered mineral phases, all data were recorded at

10-15 K using a modified Oxford®

liquid He cryostat. Details on the experimental setup and

on data acquisition for the reference samples are given in Supporting Information.

X-ray absorption spectra were averaged using the SixPack software (Webb, 2004).

EXAFS data were extracted using the XAFS program (Winterer, 1997) and were fit following

Page 95: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

95

classical procedures, as detailed previously in Miot et al., submitted (see Supporting

Information).

Analytical transmission electron microscopy

Two types of samples were prepared for TEM analyses. For conventional

Transmission Electron Microscopy (TEM) and Energy Dispersive X-ray Spectrometry

(EDXS) measurements, a drop of the culture medium was deposited and air-dried on a

carbon-coated 200-mesh copper grid after two rinses in degassed distilled water within an

anoxic glove-box. In that case, the redox state of iron was not preserved and TEM

observations were thus not used for that purpose.

For cryo-electron microscopy observations, grids covered with holey carbon films were

prepared and vitrified by flash freezing in liquid ethane (Adrian et al., 1984). Images were

recorded under low dose conditions (10 electrons per Ų) on a GATAN Ultrascan 1000 CCD

Camera.

Observations and EDXS analyses were performed with a JEOL2100F microscope operating at

200kV equipped with an Si(Li) diode. P/Fe atomic ratios were estimated from the EDXS

spectra using the IDFix software.

Scanning Transmission X-ray Microscopy

Sample preparation

We kept the samples under an anoxic atmosphere from preparation to transfer into the

microscope, following the method detailed in Miot et al., submitted. The entire preparation

was performed in an anoxic glove-box. One mL of a suspension of BoFeN1 culture (or of

reference compounds) was sampled at different stages of each culture (30 minutes to 6 days,

and 1 year). Each sample was rinsed twice in degassed distilled water. 0.3 µL of each sample

was sandwiched in between two silicon nitride membranes (Norcada Inc., Canada) that were

sealed under the anoxic atmosphere using epoxy. Using this protocol, we verified that we

could preserve the original redox state of iron of vivianite.

STXM experiments

STXM observations at the Fe L2,3-edges were performed on the PolluX beamline at the

Swiss Light Source (SLS, Villigen). Additional information on the PolluX beamline can be

Page 96: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

96

found in Bernard et al. (2007). This beamline has an energy resolving power E/∆E > 3000.

Energy calibration was achieved using the major absorption peak of hematite at 708.7 eV for

the Fe L3-edge.

Data processing

Image stacks were acquired at the Fe L2,3-edges. They were performed by scanning the

sample in the x-y direction at each energy increment over the energy range of interest.

Potential sample damages caused by the incident photon beam (i.e. changes of the Fe redox

state) were quantified by monitoring spectral changes at the Fe L2,3-edge with increasing

dwell times up to several tens of ms (Fig.SI-1). However, no significant changes were

observed for typical dwell times used during analyses of the samples (i.e. around 0.8 ms per

energy- and image-point). The aXis2000 software-package (Hitchcock, 2001) was used for

processing image stacks and XANES spectra. Images were recorded on transmission scale

and converted into optical density (OD) according to Equation (3).

OD = -ln(I/I0) (Eqn. 3)

wherein I represents the measured photon intensity at the point of interest and I0 represents the

intensity outside the sample that includes the absorption by silicon nitride windows.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 50 100 150

Fe(I

II)/

Fe t

ota

l

dt, ms

0.75

0.8

0.85

0.9

0.95

1

0 10 20 30 40 50 60 70

Fe

(III)/

Fe t

ota

l

dt, ms

Figure SI-1. Beam radiation damage on reference Fe(II)-phosphate (a) and on Fe(III)-

encrusted bacteria (b). Evolution of the Fe(III)/Fe(total) ratio as function of dwell time,

estimated by fitting Fe L2,3-edges XANES spectra recorded on reference Fe(II)-phosphate

and Fe(III)-encrusted bacteria respectively.

Quantitative Fe-speciation maps were calculated from the image stacks by singular

value decomposition using the stack-fit routine in aXis2000. The algorithm fits the spectra of

a b

Page 97: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

97

each individual pixel with a linear combination of the two normalized reference spectra

(Fe(II)- and Fe(III)-phosphate model compounds) plus a constant, accounting for the

absorption background. Composite maps were obtained by overlaying on the same image the

Fe(II) (blue) and the Fe(III) (red) maps using a common intensity scale for both colour

channels.

XANES spectra were extracted from the stacks on regions of interest. We normalized

the area below the L2 and L3 edges to 1 and multiplied the absorbance of the compounds

containing mainly Fe(II) (major peak at 707 eV) by a 4/5 correction factor to take into

account the difference in the occupancy of the 3d orbitals in Fe2+

and Fe3+

ions, neglecting the

variation of radial integrals (Thole et al., 1994). We fit the normalized spectra with linear

combinations of the normalized reference spectra of the Fe(II)-phosphate model compound

(vivianite) and of the 1-year old BoFeN1 sample standing for a Fe(III)-reference, applying the

CGO (Conjugate Gradient Optimization method) curve fit routine in Axis2000. Fit results

allowed estimating the Fe(III)/Fe(total) content of regions of interest. Standard deviations

calculated from the deviation between the fit and the data were systematically less than 1%.

Moreover, Fe(II) and Fe(III) maps were used to evaluate the variability of the Fe(III)/Fe(total)

ratio within each sample (i.e. at each stage of the culture): the Fe(II)-map was multiplied by

the 4/5 correction factor (see above) and added to the Fe(III)-map to obtain a Fe(total) map.

The Fe(III)-map was subsequently divided by the Fe(total) map. An histogram of the resulting

map was plotted, giving the number of pixels as a function of Fe(III)/Fe(total) ratio. These

histograms allowed discriminating the different populations of Fe according to their redox

state within the image. The mean Fe(III)/Fe(total) ratios were calculated as the maxima of

each peak in the histogram and the variability as the width at mid height of the peak.

RESULTS

XRD and XAS study of mineralogical transformations of vivianite in BoFeN1 cultures

Addition of 10 mM Fe(II) in the culture medium before inoculation of BoFeN1 led to the

instant precipitation of a white phase (Fig. 1a) characterized by XRD as vivianite (Fig. 2).

This phase was at the equilibrium with the solution that contained dissolved Fe(II) at around 3

mM, consistently with thermodynamic calculations taking into account the medium culture

composition and the solubility of vivianite ([Fe2+

]eq=3.4 mM, as indicated by JChess

Page 98: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

98

simulations). The concentration of soluble Fe(II) remained constant over the period of the

experiment in the abiotic control, whereas it dropped to undetectable levels within 5 days in

BoFeN1 cultures (Fig. 1b). Fe(II) consumption (oxidation) was related to bacterial growth,

with the stationary phase starting after 3 days of culture. Moreover, the progressive oxidation

of dissolved Fe(II) was associated with a macroscopic change of the colour of the precipitate

from white initially (vivianite) to green after 4 days of culture and finally orange after 16 days

(Fig. 1a), whereas no change in colour was observed in abiotic controls, in which the

precipitate remained white.

0

10

20

30

40

50

60

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 50 100 150 200

To

tal

pro

tein

co

nce

ntr

ati

on

, µµ µµg

.mL

-1 Dis

so

lved

Fe

(II) co

nce

ntra

tion

, mM

Time, hours

Figure 1. Growth of BoFeN1 in the presence of vivianite. a: Evolution of the colour of the

precipitates forming in the culture medium, before inoculation (Day 0) and after 4 and 16

days of culture. b: Growth curve of BoFeN1 and dissolved Fe(II) concentration in the

presence of acetate (5 mM), nitrate (10 mM), dissolved ferrous iron and vivianite over a

period of 7 days. (■): Total protein concentration, (○): Dissolved Fe(II) concentration in the

BoFeN1 culture, (X): Dissolved Fe(II) concentration in the abiotic control.

Day 0 4 days 16 days

b

a

Page 99: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

99

XRD analyses were performed on the successive phases formed in these cultures in order to

better understand this change in colour of the precipitates. These analyses revealed the

progressive transformation of crystalline vivianite into an amorphous compound

(characterized by XRD after 1 year of incubation, Fig. 2). The intermediate greenish phase (4-

day old precipitate) was mostly amorphous but still contained a small amount of vivianite and

possibly a Fe(III)-oxyhydroxynitrate phase (FeO(NO3)x(OH)1-x) previously described by

Schwertmann et al. (1996). All these different amorphous phases were further characterized

using XAS at the Fe K-edge (Fig. 3 and Table 1). Absorption maxima in the pre-edges of the

4-day old BoFeN1 sample were observed at 7111.8 eV and 7113.7 eV suggesting the

coexistence of Fe(II) and Fe(III) oxidation states after 4 days of culture (Fig. 3, Wilke et al.,

2001). In the 16-day old and the 1-year old samples, the position of the pre-edge at 7113.7 eV

indicated the transformation into a mostly Fe(III) mineral, consistently with the shift of 2 eV

in the absorption maximum of the XANES spectrum compared to the vivianite model

compound. Best fits of the EXAFS data of the BoFeN1 samples are compared to those of the

end-members amorphous Fe(III)-phosphate and vivianite in Fig. 3c and 3d. Corresponding

parameters are listed in Table 1. The first-neighbour shell in EXAFS data of the 4-day and the

1-year old BoFeN1 cultures is fitted with oxygen ligands at 2.08±0.05 Å and 1.98±0.05 Å

respectively. The second-neighbour shell of these two samples is fitted with phosphorus

ligands at 3.32±0.05 Å and 3.23±0.05 Å respectively. These distances are consistent with

those measured in vivianite and in the amorphous Fe(III)-phosphate, respectively (Table 1).

The 16-day old sample is fit with intermediate distances. All these results suggest the

progressive transformation of vivianite into an amorphous Fe(III)-phosphate.

Page 100: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

100

10 20 30 40 50 60 70 80

Co

un

ts,

a.u

.

Degrees 2θθθθ (Co Kαααα)

BoFeN1, 4 days

Vivianite

Fe(III)-phosphate

Viv

(6

.60 A

)

Fen

(2

.55 A

)

Fe

n (

1.5

1 A

)

BoFeN1, 1 year

Figure 2. X-Ray diffractograms of precipitates collected from BoFeN1 cultures after 4 days

and 1 year and of reference Fe(II)- and Fe(III)-phosphate. All peaks of the reference Fe(II)-

phosphate are explained by vivianite. Viv: vivianite, Fen: Fe(III)-oxyhydroxynitrate

(FeO(NO3)x(OH)1-x).

Sample N (± 0.3)

Bond R (Å) (± 0.05)

σσσσ (Å)

(± 0.02)

E0 (eV) (± 3)

χχχχ2

Fe(III)-phosphate 3.3 Fe-O 1.98 0.06 8 15 1.0 Fe-P 3.24 0.06 -

0.5 Fe-Fe 3.62 - -

BoFeN1, 1 year 4.0 Fe-O 1.98 0.09 2 5 1.7 Fe-P 3.23 0.08 - 0.2 Fe-Fe 3.57 - -

BoFeN1, 16 days 3.6 Fe-O 1.98 0.09 6 3 1.6 Fe-P 3.29 0.08 - 0.2 Fe-Fe 3.60 - -

BoFeN1, 4 days 3.5 Fe-O 2.08 0.09 10 52 1.0 Fe-P 3.32 0.05 - 0.2 Fe-Fe 3.66 - - 0.5 Fe-Fe 4.81 - -

Vivianite 3.8 Fe-O 2.10 0.10 10 7 1.5 Fe-P 3.30 0.08 -

0.4 Fe-Fe 2.96* - -

1.9 Fe-O 3.97* - - 1.7 Fe-Fe 4.70* - - 2.0 Fe-Fe 5.25* - - 4.3 Fe-Fe 6.29 - -

(*) fixed at values expected from the structure of vivianite (Fedji et al., 1980).

(-) kept equal to the free parameter placed above in the table.

TABLE 1. Fitting results for Fe K-edge EXAFS data of 4-day old, 16-day old and 1-year old

BoFeN1 cultures and of the 2-line ferrihydrite, Fe(II)- and Fe(III)-phosphate model

compounds. Coordination number (N), interatomic distance (R), Debye-Waller parameter (σ)

and energy offset (E0). Fit quality was estimated by a reduced χ2 parameter (see text).

Page 101: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

101

7108 7110 7112 7114 7116

No

rma

lize

d a

bs

orb

an

ce

, a

.u.

Energy, eV

Vivianite

Fe(III)-phosphate

BoFeN116 days

BoFeN11 year

BoFeN14 days

7113.7 eV

7111.8 eV

7100 7120 7140 7160 7180 7200

No

rma

lized

ab

so

rba

nc

eEnergy, eV

7132 eV

7127.5 eV

BoFeN11 year

2

Fe(III)-phosphate

BoFeN116 days

BoFeN14 days

Vivianite

3 4 5 6 7 8 9 10 11

k3χχ χχ

(k)

k (Å-1

)

10Fe(III)-phosphate

BoFeN1 - 16 days

BoFeN1 - 4 days

Vivianite

BoFeN1 - 1 year

0 1 2 3 4 5 6 7

FT

mag

nit

ud

e

R + ý (Å)

10

Fe(III)-phosphate

BoFeN1 - 16 days

BoFeN1 - 4 days

Vivianite

BoFeN1 - 1 year

Figure 3. X-ray Absorption Spectroscopy measurements on the bulk cultures of BoFeN1

after 4 days, 16 days and 1 year. a and b: pre-edges and whole XANES spectra at the Fe

K−edge of 4-day, 16-day and 1-year old BoFeN1 cultures and of Fe(III)-phosphate and

vivianite model compounds. c: unfiltered k3χ(k) data compared with the spectra of the model

compounds Fe(III)-phosphate and vivianite. d: corresponding Fourier Transforms. Dashed

lines show the data and solid lines the best fits of the k3χ(k) data (see Table 1).

b

c d

a

Page 102: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

102

TEM study of mineralogical transformations of vivianite in BoFeN1 cultures

To better determine the spatial relationships existing between the bacterial cells and

extracellular vivianite, TEM observations were performed at the same successive stages of the

culture. In BoFeN1 cultures, we observed the coexistence of extracellular and periplasmic

iron-rich precipitates. Both had a composition of Fe-phosphates. Periplasmic precipitates were

similar to those previously described in BoFeN1 cultures grown in the presence of soluble

Fe(II) only (Figure SI-2, Miot et al., submitted). The morphology and chemical composition

of the extracellular minerals were investigated by TEM, Cryo-TEM and EDXS (Fig. 4). In

abiotic controls, we observed vivianite platelets exhibiting a P/Fe atomic ratio estimated to

0.75±0.07 by EDXS, which is consistent with the stoechiometry of vivianite (Fe3(PO4)2, 8

H2O, theoretical P/Fe=0.67). In the presence of bacteria, the P/Fe ratio of the extracellular

minerals dropped to 0.55±0.12 after 2 days and to 0.36±0.15 after 2 months. In addition, we

observed that these extracellular minerals kept a platelet morphology. These TEM

observations are thus consistent with XRD and XAS analyses, suggesting the progressive

transformation of vivianite platelets into an amorphous Fe(III)-phosphate phase exhibiting a

P/Fe ratio of 0.36±0.15.

Figure SI-2: STEM images of BoFeN1 cells grown in the presence of vivianite (V). (A):

BoFeN1 cell with encrusted periplasm (p). (B): BoFeN1 cells with membrane bound globules

(g).

500 nm

V

p

g

A

B

500 nm

V

p

g

500 nm500 nm

V

p

g

A

B

Page 103: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

103

Figure 4. Electron microscopic study of Fe-rich minerals forming in BoFeN1 cultures. a: TEM image of vivianite precipitates forming in the non-inoculated culture medium. b: TEM

image of iron-phosphate minerals in a 2-day old culture of BoFeN1. The arrow points colloids

at the surface of the platelets. c: Cryo-TEM image of colloids in a 15-day old BoFeN1

culture. d: XEDS spectra measured on vivianite (abiotic control) and on extracellular

precipitates and colloids (spectrum multiplied by a factor 4) from a BoFeN1 culture. These

data highlight the presence of colloids having a composition of Fe-phosphate in BoFeN1

cultures.

Moreover, after 2 days of culture, colloidal particles (diameter < 10 nm) were observed at the

surface of the platelets (Fig. 4b). This observation is consistent with chemical measurements

of iron concentration in filtered culture medium. Indeed, iron concentrations were

systematically higher in 0.2-µm filtrates than in 10-kDa filtrates of the abiotic control as well

as the BoFeN1 culture supernatants. These measurements indicate that Fe-bearing particles of

a diameter < 200 nm (colloids) were present in solution. This < 200 nm mineral fraction was

imaged by cryo-TEM on a BoFeN1 culture frozen in a 100-nm thick film of amorphous ice

Control 2 days

50 nm 50 nm

100 nm 2.4 3.2 4 4.8 5.6 6.4 7.2

Co

un

ts,

a.u

.

Energy, keV

Colloids

Precipitates

Vivianite

Fe Kαααα

Fe KββββK Kαααα

P Kαααα

(x4)

A B

C D

Page 104: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

104

(Fig. 4c). This preparation retained only the <100 nm fraction of the culture. After exposure to

the electron beam and subsequent sublimation of the vitreous ice, we were able to detect

numerous colloids in the culture medium, with a diameter of 5.9±1.7 nm. Direct EDXS

analyses of these colloids under cryo-conditions revealed that they also had a composition of

iron phosphates (Fig. 4d). All these results indicate that in parallel to the transformation of the

vivianite platelet, there is a production of iron-phosphate colloids in BoFeN1 cultures.

Fe oxidation at the nanometer-scale in BoFeN1 cultures

The temporal evolution of iron redox state in extracellular as well as in cell precipitates was

analyzed in BoFeN1 cultures at the sub-micrometer scale by STXM analyses at the Fe L2,3-

edges (Fig. 5). As shown on Fe(II)-Fe(III) maps, bacteria and extracellular precipitates both

contained mainly Fe(II) at the beginning of the culture (30 min.) and both became

progressively oxidized over the course of the culture (Fig. 5). However, as shown on

histograms (Fig. 6c), the extracellular precipitates and the bacterial cells could be

discriminated at each time point according to their redox state: the extracellular precipitates

(solid lines) exhibit a lower Fe(III)/Fe(total) ratio than Fe-precipitates associated with bacteria

(dashed lines). Moreover, the Fe(III)/Fe(total) ratio measured on bacteria evolved from

0.28±0.19 (here deviation represents the intrinsic variability within the sample) after 3 h to

0.94±0.22 after 6 days of culture, indicating that iron associated with bacteria was completely

oxidized after 6 days of culture. In contrast, the Fe(III)/Fe(total) ratio measured on

extracellular precipitates evolved from 0.18±0.13 after 3 h towards 0.50±0.2 after 6 days of

culture, i.e. a fairly homogenous mixed-valence iron phase. Similar estimations could be

drawn by direct fitting of the XANES spectra extracted from bacteria and extracellular

precipitates respectively (Fig. 6a,b and Table 2). After 1 year, iron oxidation state was similar

on the bacteria and the extracellular precipitates. All these results indicate that iron oxidation

rate is slower in the extracellular precipitates than at the cell contact.

Page 105: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

105

Figure 5. Evolution of iron redox state 30 min. to 6 days and 1 year after inoculation. Fe

redox mapping after 30 min, 3 h, 1 day, 3 days, 6 days and 1 year of culture. We observe the

progressive oxidation of iron associated with bacteria and extracellular precipitates. Iron

oxidation in the extracellular precipitates is delayed with respect to iron associated with

bacteria.

TABLE 2. Fe(III)/Fe(total) quantification obtained from the fit of Fe L2,3-edge XANES

spectra extracted from stacks on bacteria and precipitates at different stages of the culture.

Fe(III)/Fe(total) values result from at least two spectra fits. Standard deviations (SD) were

calculated as the SD of the fit to the data. Values reported in this Table are means of the

standard deviations obtained for each fit.

Area Time Mean Fe(III)/Fe(total) Bacteria 3 h 0.27

1 day 0.65 3 days 0.91 6 days 0.99

Precipitates 0.5 h 0.17 3 h 0.17

1 day 0.26

3 days 0.59

6 days 0.62

30 min

3 h

3 h 1 day

3 days 6 days

1 year

Page 106: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

106

705 710 715 720 725

707eV

708.7eV

Bacteria

3h

1 day

3 days

Fe(II)-phosphate

Fe(III)-phosphate

6 days

1 year

Op

tica

l d

en

sit

y, a

.u.

Photon energy, eV

705 710 715 720 725

708.7eV

Precipitates

Op

tic

al d

en

sit

y, a

.u.

707eV

Photon energy, eV

3h

1 day

3 days

Fe(II)-phosphate

Fe(III)-phosphate

6 days

1 year

30 min

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Nu

mb

er

of

pix

els

Fe(III)/Fe(total)

3 h

1 day

3 days

6 days

0.18+/-0.13

0.28+/-0.19

0.27+/-0.13

0.39+/-0.2

0.80+/-0.18

0.50+/-0.2

0.94+/-0.22

0.55+/-0.12

50

Figure 6. a-b: XANES spectra at the Fe L2,3-edge obtained on bacteria and extracellular

precipitates respectively, collected on 30 min-old to 6-days old and 1 year-old cultures. Solid

lines show the data and dashed lines the best fits. The numerical results of the fits are

displayed in Table 2. c: Histograms obtained from the Fe(II) and Fe(III) stack maps, giving

the Fe(III)/Fe(total) ratio on precipitates (solid lines) and precipitates (dashed lines)

respectively. Numbers indicated on the plot are the means +/- the width at mid height of the

peaks. All these results indicate the progressive oxidation of iron at the contact of the bacteria

and the delayed oxidation of iron in the extracellular precipitates.

To summarize, our results indicate the progressive transformation of vivianite FeII

3(PO4)2, 8

H2O into (1) a green phase consisting of amorphous platelets composed of mixed valence Fe-

phosphate, with a P/Fe atomic ratio of 0.55 and eventually into (2) an orange phase consisting

a b

c

Page 107: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

107

of an amorphous Fe(III)-phosphate mineral in the form of platelets, with a P/Fe atomic ratio

of 0.36. Additionally, iron phosphate colloids were observed all along the culture. Finally,

iron oxidation rate was higher on the bacteria than on the extracellular precipitates.

DISCUSSION

Mineralogy of the oxidation products of vivianite in BoFeN1 cultures

Vivianite was progressively transformed into an amorphous Fe(III)-phosphate in BoFeN1

cultures (Fig. 2 and 3). This was documented by a progressive decrease of the vivianite

diffraction peaks in XRD (Fig. 2), by a change of the P/Fe ratio measured by EDXS on the

precipitates formed in the cultures (Fig. 4) and finally by the progressive change of the Fe-

redox state documented by XAS both at the bulk- (Fig. 3) and the submicrometer-scale (Fig. 5

and 6). An intermediate greenish iron-phosphate solid, identified after 4 days of culture,

exhibited a mixed Fe oxidation state, as assessed by XAS (Fig. 2 and 5, Table 1 and 2). The

homogeneity of the Fe redox state and of the P/Fe ratio at the few-nanometer scale suggests

that this solid consists of a single phase or of mixture of multiple phases that appears

homogeneous at the few-nanometer scale. In contrast, no greenish phase was identified when

BoFeN1 was cultured in the presence of soluble Fe(II) only (Miot et al., submitted),

suggesting that this green precipitate is a specific (intermediate) product of vivianite

oxidation. XRD pattern of the 4-day old sample was dominated by very broad diffusion bands

corresponding to nanocrystalline or amorphous material. Although, some Bragg peaks are

present, they could not be attributed unequivocally to any known mineral phase, excepts a

broad peak consistent with poorly ordered vivianite at 6.6 Å and two peaks at 2.25 Å and 1.51

Å that could be consistent with the XRD pattern of FeO(NO3)x(OH)1-x, which is a poorly

ordered compound with an akaganeite-like structure (Schwertmann et al., 1996). If present,

such a phase would modify the availability of nitrate in the medium. Unfortunately, due to its

ill-defined XRD pattern, this phase could not be identified unambiguously in our samples and

more investigations will be needed in the future to assess its presence.

Interestingly, a grey-greenish phase has been previously identified by XRD as carbonate-

bearing green rust in cultures of the nitrate-reducing iron-oxidizing bacteria Dechlorosoma

suillum in the presence of soluble Fe(II) (Chaudhuri et al., 2001). In contrast, the end-product

of iron-biooxidation by BoFeN1 did not exhibit the pattern characteristic of green rust by

Page 108: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

108

XRD (Fig. 2). The broad peak at d=10.5 Å (2θ=9.8°) could correspond to the (003) peak of a

phosphate-exchanged carbonate green rust, wherein phosphate partially replaces carbonate

groups in the interlayer, leading to a wider layer spacing (Hansen & Poulsen, 1999).

However, the resonance (006) peak was not observed in our diffraction patterns. Thus, it is

more likely that the broad peak at d=10.5 Å is due to an amorphous Fe-phosphate compound.

It is likely that under our culture conditions, the high P/Fe ratio in the system inhibited the

precipitation of green rust and favoured the precipitation of an amorphous Fe-phosphate as

end-product vivianite oxidation.

The green mixed-valence phase eventually turned progressively orange as Fe became

completely oxidized. This final product of iron bio-oxidation consisted of an amorphous

Fe(III)-phosphate as indicated by XRD and EXAFS results (Fig. 2 and 3, Table 1) similar to

the one formed in BoFeN1 cultures in the presence of soluble Fe(II) only (Miot et al.,

submitted). Amorphisation of vivianite by abiotic oxidation of iron can be ruled out, given the

precautions taken during all the experiments to preserve the Fe redox state from the culture to

the analyses. Moreover, this final product is structurally close to our reference Fe(III)-

phosphate (Fig. 3 and Table 1) and exhibits structural similarities with the natural oxidation

product of vivianite, namely santabarbaraite (Pratesi et al., 2003). According to the Fe-P and

Fe-Fe distances at 3.25 Å and 3.6 Å identified in the present study, the structure of this

amorphous Fe(III)-phosphate phase is likely similar to that of amorphous Fe(III)-arsenate

recently reported by Paktunc et al. (2008), where arsenate tetrahedra share corners with chains

of corner-sharing FeO6 octahedra. The absence of Fe-Fe bonds by edges (at 3.0-3.2 Å) that

are the basis of all iron oxyhydroxides, rules out the possibility this phase be an iron

oxyhydroxide with adsorbed phosphate. In contrast, our EXAFS results clearly indicate that

the final Fe-oxidation product in BoFeN1 cultures consists of a mixed Fe-PO4 hydroxide.

Mechanisms of bacteria-mediated oxidation of vivianite

Several previous studies have shown that the capability of a bacterial strain to oxidize Fe(II)

present in a solid phase depends on different parameters related to the solution chemistry and

to the mineralogy of the solid phase, and primarily to the solubility. For instance, nitrate-

reducing iron-oxidizing bacteria were shown to catalyze the oxidation of FeS2 at slightly

acidic pH values, based on NO3- and SO4

2- profiles (Postma et al., 1991, Engesgaard & Kipp,

1992), whereas no bio-oxidation of FeS2 was observed at pH 8 in a saline medium (Schippers

& Joergensen, 2002). In contrast, FeS oxidation has been reported under the latter conditions

Page 109: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

109

in the presence of nitrate-reducing iron-oxidizing bacteria (Schippers & Joergensen, 2002), as

well as in cultures of photoautotrophic iron-oxidizing bacteria at neutral pH (Kappler &

Newman, 2004). However, the same phototrophic strains were not able to oxidize magnetite,

pyrite or vivianite, which was suggested to result from the high insolubility of these minerals

(Kappler & Newman, 2004). In the present study, in spite of its very low solubility product

(Nriagu et al., 1972), vivianite was completely transformed within 16 days into an amorphous

Fe(III)-phosphate, which kept the platelet morphology of vivianite (Fig. 3 and Table 1). No

transformation of vivianite was observed in non-inoculated sterile media over the duration of

the experiment and hence bacterial activity is directly or indirectly responsible for vivianite

transformation and oxidation.

In addition, composite Fe(II)-Fe(III) maps indicate that iron oxidation started on the bacteria,

very early after inoculation (a few hours). After 3 days of culture, iron associated with

bacteria was almost completely oxidized, whereas the oxidation of extracellular minerals (i.e.

initially vivianite) was delayed with respect to intracellular iron, with only 50±20% iron

oxidized in the extracellular minerals after 6 days against 94±22% on the bacteria (Table 2).

The following scenario can tentatively be proposed: dissolved Fe(II) is first oxidized at the

contact of the bacterial cells. This would induce an undersaturation of the medium with

vivianite which would then dissolve, thus exporting more Fe(II) to the cells. Then, this Fe(II)

would be oxidized into Fe(III) by the bacteria. Fe(III) is highly insoluble at neutral pH, so the

precipitation is expected to occur on or within the cells. However, the progressive increase of

the Fe(III)/Fe(total) ratio that is observed in the extracellular mineral phases as well questions

the mechanisms that could transport Fe(III) to the extracellular minerals or oxidize Fe(II) in

situ in these minerals.

On the one hand, the persistence of the platelet morphology of the initial vivianite over the

time course of the culture suggests an epigenetic replacement of vivianite by amorphous

Fe(III)-phosphate. This preservation of morphology during the transformation of one solid

phase into another can be interpreted either as a mechanism of solid-state transformation or as

a transformation of a solid in the presence of a fluid phase by interface-coupled dissolution-

reprecipitation (Putnis & Putnis, 2007). However, the main issue is to determine where the

oxidation of Fe precipitating extracellularly takes place. Two scenarii can be proposed:

First, extracellular vivianite can be oxidized by an oxidant produced by BoFeN1 cells. As no

oxidation is observed in abiotic nitrate-rich controls over several days, oxidation by nitrates

can be discarded. Nitrites that have been shown to form as a product of nitrate reduction in

BoFeN1 cultures (Kappler et al., 2005a) can be considered. Kappler et al. (2005a) performed

Page 110: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

110

bulk measurements of nitrogen species in cultures of BoFeN1 in the presence of dissolved

Fe(II) only (no vivianite) and demonstrated that BoFeN1 cells mediate Fe(II) oxidation at a

faster rate than nitrites (around 7 times faster). This may be consistent with our observations

in the present study: Fe(II) oxidation occurs at a faster rate on the cells than in extracellular

precipitates (around 3 to 5 times faster). Hence, while Fe(II) oxidation on the cells results

from a direct cellular catalysis, Fe(II) oxidation outside the cells might result from oxidation

by nitrites.

Alternatively, Fe(III) may be exported from the cells. In that case, two scenario have been

proposed in the literature to explain how Fe(III), which is very insoluble at neutral pH, can be

transported to the extracellular medium: (1) a previous study on the phototrophic iron-

oxidizing bacteria Rhodobacter ferrooxidans sp. strain SW2 (Kappler & Newman, 2004) has

suggested that a local drop of pH around the cells may favour Fe(III) export. In the present

case, this local drop of pH would also enhance vivianite dissolution. (2) Kappler & Newman

(2004) have suggested a release of Fe(III) from the cells as an inorganic aqueous complex

and/or as a colloidal aggregate. In the present work, we show the presence of 5.9±1.7-nm

sized iron-phosphate colloids in BoFeN1 cultures. Although it was not possible to determine

the iron redox state of these colloids (due to their small size), we suggest that they could play

a role in Fe(III) export from the bacteria to the extracellular minerals.

In any case, our results suggest that vivianite transformation is driven by bacteria directly (i.e.

Fe(III) exported from the cells) or indirectly (i.e. involvement of nitrites). The question

whether they can retrieve energy from this reaction remains open. We observed that the total

protein concentration reached in stationary phase (Fig. 1) was not very different from the

concentration obtained in cultures performed in the presence of soluble Fe(II) only (Miot et

al., submitted). Moreover, additions of Fe(II) in cultures grown with dissolved Fe(II) only in

the stationary phase lead to a second exponential growth (data not shown). These results

indicate that dissolved Fe(II) was supplied at a limiting concentration in our system. This

could support the fact that vivianite is not used by the cells as an energy source. Further

investigations, including a complete mass balance of the chemical species involved in the

bacterial metabolism, are needed to verify this hypothesis.

In conclusion, in the presence of vivianite, BoFeN1 cells used rapidly soluble Fe(II) but had

also the capability to drive the complete transformation of vivianite into an amorphous

Fe(III)-phosphate. Colloildal iron-phosphate observed in this system might play a role in the

extracellular transfer of Fe(III) to the solid phases. This colloidal fraction could have been

Page 111: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

111

overlooked so far and has to be studied with more details given its potentially important role

in controlling the mobility of Fe(III) at neutral pH. The delay of Fe oxidation on extracellular

minerals compared to Fe associated with bacteria leads to a well-documented redox

heterogeneity at the sub-micrometer scale. Such redox heterogeneity corresponding to micro-

environments have been previously described in natural systems (e.g. Benzerara et al., 2005)

and could be tested as markers for the identification of such metabolisms in present

environments or in the geological record.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors are indebted to the SSRL staff, especially Serena DeBeer George, and Mike

Toney for their technical assistance during the XAS experiments. The authors also thank the

SSRL, LURE, SOLEIL and ESRF synchrotron facilities to have provided beamtime for this

study. This work was supported by the ECCO/ECODYN CNRS/INSU Program, by ACI/FNS

grant #3033, by SESAME IdF grant #1775, and by NSF-EMSI Grant CHE-0431425

(Stanford Environmental Molecular Science Institute). We are also grateful to Region Ile-de-

France for convention SESAME 2000 E1435 for the support to cryo-electron microscope

JEOL 2100F installed at IMPMC UMR 7590. This is IMPMC contribution #nnnn and IPGP

contribution #nnnn.

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Page 117: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

117

Chapitre 1.C.

Biominéralisation extracellulaire du fer par une bactérie ferro-oxydante

photoautotrophe

Problématique et objectifs. La seconde souche que nous avons étudiée au cours de cette

thèse, Rhodobacter sp., souche SW2 est une souche photosynthétique, qui utilise le Fe(II)

comme donneur d’électrons (photosynthèse anoxygénique) et synthétise des minéraux riches

en Fe(III) comme produit de son métabolisme. L’étude de cette souche présente un intérêt

fondamental pour l’étude de la mise en place des BIF. En effet, cette forme potentiellement

primitive de photosynthèse (Xiong et al., 2000) est invoquée par certains auteurs pour

expliquer le dépôt des ces immenses gisements de fer au Précambrien, lorsque l’atmosphère

était pauvre en O2 (Konhauser et al., 2002). De plus, il a été montré récemment que ces

bactéries produisaient un fractionnement isotopique du fer cohérent avec ce qui a été mesuré

dans certaines couches d’oxydes de BIF datés à -2.5 Ga (Croal et al., 2004). Cependant, les

mécanismes biologiques d’oxydation du fer pouvant expliquer ce fractionnement restent très

mal compris.

A l’opposé de la souche dénitrifiante BoFeN1 dont nos résultats précédents ont montré

qu’elle accumulait des minéraux riches en fer dans le périplasme, la souche SW2 a la

particularité de ne précipiter le fer qu’en dehors de la cellule (Kappler & Newman, 2004,

Schaedler et al., soumis). Bien que ces deux bactéries soient cultivées dans les mêmes

conditions (aux nitrates et à l’acétate près), elles présentent donc des réponses différentes à la

production de Fe(III) qui pourraient être le reflet de stratégies évolutives d’oxydation du fer

en conditions anoxiques distinctes. Tandis qu’il a été montré que d’autres bactéries, telles que

des espèces acidophiles des genres Gallionella et Leptothrix (Emerson & Revsbech, 1994,

Chan et al., 2004), produisaient des polymères organiques extracellulaires qui facilitent la

nucléation des oxydes de fer en dehors des cellules, l’existence de tels polymères chez les

bactéries ferro-oxydantes anaérobies neutrophiles n’a pas été démontrée jusqu’à présent.

Notre étude a donc consisté à caractériser les polymères organiques susceptibles de

contrôler la biominéralisation extracellulaire du fer chez SW2 en utilisant le STXM. Nos

résultats démontrent le rôle essentiel joué par les polymères organiques dans la

biominéralisation du fer et met en évidence pour la première fois l’existence d’un gradient

redox autour des cellules de SW2.

Page 118: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

118

Méthodologie.

Analyse des polymères organiques en STXM au seuil K du C. L’un des atouts majeurs du

STXM est la possibilité qu’il offre de caractériser les polymères organiques à l’échelle

nanométrique de façon qualitative et quantitative en fournissant l’accès aux énergies

d’absorption des éléments légers tels que le carbone. Afin de caractériser les fibres organiques

produites par SW2, nous avons donc effectué des analyses STXM au seuil K du C (autour de

280 eV). Les spectres XANES obtenus sont comparés à des spectres de référence afin

d’identifier les groupements fonctionnels présents et d’évaluer la nature biochimique des

molécules composant ces fibres. Il est en principe possible de quantifier les différentes

composantes car l’absorbance mesurée est directement proportionnelle à la concentration (ou

l’épaisseur) de cette composante (loi de Beer-Lambert). Pour obtenir des résultats quantitatifs,

les spectres des éléments de référence sont préalablement normalisés à une épaisseur de 1 nm.

Pour cela, un spectre XANES de référence est calculé à l’aide du logiciel aXis2000. Ce

spectre calculé ne présente pas de structures fines et simule donc uniquement le saut de seuil,

pour une épaisseur de 1 nm. La normalisation du spectre mesuré est obtenue en divisant le

spectre mesuré sur l’échantillon par ce spectre calculé. La quantification reste néanmoins

difficile dans notre cas, les composantes des structures organiques étudiées n’étant pas

déterminées de façon univoque, en raison de la grande variabilité des signatures XANES des

différentes classes de composés biochimiques, en particulier les lipides et les polysaccharides.

Détermination des corrélations entre les quantités de fer et de carbone organique. Nous

avons cherché à évaluer la corrélation entre les concentrations en fer et en carbone organique

dans les échantillons. Pour cela, après alignement des stacks aux seuils du fer et du carbone

enregistrés sur une même zone, nous avons calculé les cartes de spéciation du fer et du

carbone en utilisant la procédure de stack fit d’aXis2000 : après normalisation des spectres

des composés de référence à une épaisseur de 1 nm, les stacks enregistrés sur les échantillons

sont décomposés sur la base de ces spectres de référence et d’une constante. Nous avons ainsi

obtenu des valeurs proportionnelles aux quantités de fer et de carbone organique en chaque

pixel de la région analysée. Ces valeurs ont ensuite été reportées dans un graphe donnant la

quantité de Fe en fonction de la quantité de carbone organique en chaque pixel de l’image

(~2500 pixels au total) afin de vérifier l’existence de possibles corrélations (voir aussi Wan et

al., 2007).

Page 119: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

119

Principaux résultats et perspectives.

Rôle des fibres lipo-polysaccharidiques dans le contrôle de la biominéralisation du fer. La

biominéralisation du fer par SW2 est exclusivement extracellulaire, contrairement à ce qui a

été observé dans le cas de la souche dénitrifiante BoFeN1. Dans les cultures de SW2, des

fibres organiques ont été mises en évidence, qui émergent généralement d’un des pôles de la

cellule. L’analyse STXM de ces fibres montre qu’elles sont organiques et composées

majoritairement, soit d’un mélange de lipides et de polysaccharides, soit de lipo-

polysaccharides. En outre, nous mettons en évidence l’existence d’une corrélation linéaire

entre la quantité de fer précipité et la quantité de carbone organique sur ces fibres.

L’assemblage d’oxydes de fer sur des matrices organiques, telles que des filaments de

polysaccharides a été décrit dans le cas de bactéries ferro-oxydantes acidophiles (Chan et al.,

2004, Banfield et al., 2000, Nesterova et al., 2003) et neutrophiles (Miot et al., in press, voir p.

43). En outre, Archibald & Mann (1993) ont montré que la precipitation abiotique d’oxydes

de fer chargés positivement à la surface de microtubes lipidiques enrichis en sucres chargés

négativement pouvait conduire à l’obtention de matériaux composites organique-inorganique

présentant une forte ressemblance avec les textures que nous avons observées dans les

cultures de SW2. Les fibres organiques produites par SW2 pourraient présenter un certain

nombre de groupements fonctionnels hydrophiles (par exemple phosphates, sulfates,

hydroxyls) auxquels pourrait se lier le Fe(III), servant ainsi de point de nucléation pour

l’assemblage des oxydes de fer. Afin d’expliquer la relation linéaire entre les quantités de

carbone organique et de fer précipité sur ces fibres, le scénario suivant peut être proposé

(Figure 1C-2) : le fer pourrait initialement s’adsorber sur les fibres en quantité proportionnelle

à la quantité de ligands organiques carbonés présents à la surface des fibres. Ensuite, cette

relation linéaire est préservée tant que la taille des minéraux nucléés à la surface de ces fibres

reste limitée. La limitation de la taille des minéraux formés pourrait s’expliquer par l’action

des polymères organiques qui inhiberaient leur croissance (Nesterova et al., 2003).

Il est intéressant de noter qu’une relation différente entre les quantités de fer et de

carbone organique est observée sur les filaments polysaccharidiques minéralisés de BoFeN1

(Figure 1C-1). Dans ca cas, on observe un large intervalle de quantités de fer pour une

quantité de carbone donnée. Cette observation suggère un mécanisme de nucléation suivi

d’une croissance non limitée (contrairement à ce qui est observé pour SW2) des minéraux

riches en fer à la surface des filaments organiques. Les corrélations obtenues directement sur

les cellules minéralisées de BoFeN1 montrent en revanche une relation linéaire entre la

quantité de fer minéralisé et la quantité de carbone organique (essentiellement des protéines),

Page 120: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

120

suggérant que la croissance des minéraux riches en fer nucléés dans le périplasme de BoFeN1

est limitée (voir Chapitre 1D).

Figure 1C-1. A : Image STXM montrant la répartition des précipités riches en fer (rouge),

des protéines (vert) et des polysaccharides (bleu) et la zone d’analyse (ovale jaune) utilisée

pour la corrélation. B : Corrélation entre les quantités de fer et de carbone organique sur les

filaments polysaccharidiques minéralisés de la souche dénitrifiante BoFeN1 (> 5000 pixels).

On observe un large panel de quantités de fer pour une quantité de carbone organique donnée,

suggérant un mode de minéralisation de type nucléation-croissance.

Existence d’un gradient redox le long des fibres minéralisées. Nous avons mis en évidence

l’existence d’un gradient de redox du fer le long des fibres organiques produites par SW2,

avec des minéraux de plus en plus riches en Fe(III) relativement au Fe(II) à mesure que l’on

se rapproche de la cellule. Ce gradient peut être expliqué par deux modèles alternatifs, qui

pourraient cependant fonctionner en synergie (Figure 1C-2):

(1) Le Fe(II) pourrait être oxydé dans le périplasme et exporté à distance des cellules sous

forme de Fe(III) dissous (Kappler & Newman, 2004), de Fe(III) complexé à un ligand

organique (Kappler & Newman, 2004) ou de colloïdes (article #2, p. 87). En

particulier, l’existence d’un microenvironnement à pH acide autour des cellules

pourrait faciliter l’export de Fe(III) soluble. L’existence de colloïdes dans le milieu de

Qua

ntité

de

fer

Quantité de carbone organique

B

1 µm

FeProtéines

Polysaccharides

A

Qua

ntité

de

fer

Quantité de carbone organique

B

Qua

ntité

de

fer

Quantité de carbone organique

Qua

ntité

de

fer

Quantité de carbone organique

B

1 µm

FeProtéines

Polysaccharides

A

1 µm

FeProtéines

Polysaccharides

A

Page 121: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

121

culture de SW2 n’a pas été testée dans le cadre de cette étude et devrait être évaluée

dans le futur.

(2) L’oxydation du Fe(II) pourrait aussi se produire en dehors des cellules, directement au

contact des fibres, soit suite à la production d’un oxydant par les cellules, soit en

relation avec l’expression et l’activité enzymatique de Fe(II)-oxydases à la surface de

ces fibres.

Similarité des fibres observées avec les nanowires des bactéries ferri-réductrices. Les fibres

observées chez SW2 présentent des similarités morphologiques avec les nanowires décrits

chez la bactéries ferri-réductrice Shewanella oneidensis (Reguerra et al., 2005, Gorby et al.,

2006) et chez d’autres microorganismes. Les nanowires de Shewanella sp. sont des

appendices de 50 à >150 nm de diamètre et de quelques dizaines de microns ou plus de long.

Il a été montré qu’ils peuvent conduire un courant électrique et il a été proposé qu’ils sont

impliqués dans le transfert d’électrons depuis la bactérie jusqu’aux oxydes de fer solides. Les

fibres identifiées chez SW2 présentent un gradient de redox du fer reflétant une différence de

potentiel électrique entre les deux extrémités de la fibre (Fig. 1C-2). Il serait intéressant de

tester leur potentielle conductivité électrique dans le futur, afin d’évaluer si SW2 pourrait tirer

des électrons de l’oxydation du fer à distance sur ces fibres. En outre, dans le but de

déterminer plus précisément la composition biochimique exacte de ces fibres, des analyses

STXM complémentaires aux seuils de l’oxygène et de l’azote pourraient être réalisées. Enfin,

il serait particulièrement important de rechercher l’existence d’éventuelles enzymes

impliquées dans l’oxydation du fer dans ces fibres organiques.

Bio-signatures potentielles. Les caractéristiques des assemblages organique-minéral décrites

ici chez SW2 pourraient constituer des bio-signatures potentielles de métabolismes qui

pourraient avoir joué un rôle important sur la Terre archéenne. En particulier, les assemblages

de fibres organiques – minéraux riches en fer pourraient être recherchés dans des roches

anciennes, de même que les gradients redox observés le long de ces fibres. De telles

hétérogénéités redox reflétant l’existence de micro-environnements ont déjà été décrits dans

des systèmes naturels (Benzerara et al., 2007) et pourraient être recherchées pour

l’identification de tels métabolismes dans des environnements actuels ou dans le registre

fossile.

Page 122: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

122

Figure 1C-2. Schéma bilan des mécanismes potentiellement impliqués dans la

biominéralisation du fer chez SW2. L’oxydation du Fe(II) dans le périplasme libère des

électrons, qui pourraient être ensuite transportés par une chaîne de transporteurs d’électrons

jusqu’au CO2 dissous (HCO3-), qui est alors fixé (à l’aide d’une source d’énergie lumineuse,

hν) sous forme de matière organique (<CH2O>). Alternativement, l’oxydation du Fe(II)

pourrait se produire à distance des cellules, directement sur la fibre organique. On pourrait

imaginer que les électrons libérés par cette réaction seraient conduits via une chaîne de

transporteurs (non figurée sur ce schéma) jusqu’à la cellule pour la synthèse de matière

organique. Dans tous les cas, l’oxydation du Fe(II) libère du Fe(III), sous trois formes

possibles : Fe3+

soluble, Fe3+

complexé par un ligand organique ou sous forme de colloïdes

riches en Fe(III). En outre, il est possible que la cellule produise un oxydant non identifié à ce

jour. La minéralisation du Fe(III) sur la fibre pourrait débuter par une étape d’adsorption

faisant intervenir les potentiels groupements fonctionnels chargés négativement exposés sur la

surface de la fibre (symbolisés ici par un groupement hydroxyl). Après une étape de

nucléation, la croissance cristalline reste limitée. Cette précipitation d’oxydes de fer (goethite,

FeOOH) libère des protons qui pourraient d’une part amplifier l’acidité du

microenvironnement entourant la cellule, favorisant en conséquence la solubilité du Fe(III) et

d’autre part renforcer le gradient de protons de part et d’autre de la paroi cellulaire, qui

pourrait alimenter les ATPases. Enfin, les minéraux qui précipitent à proximité de la cellule

présentent un rapport Fe(III)/Fetotal plus élevé que les minéraux qui précipitent à distance de la

cellule. La différence de potentiel redox induite (∆Ε=Emax-Emin) peut être interprétée

comme une différence de potentiel électrique entre les deux extrémités de la fibre (∆Ψ).

pH min pH max

CYTOCYTO--

PLASMEPLASMEMb

PlMb

Ext

Ppl

H+H+

ADP

ATP

HCO3-+5H++4e-

<CH2O>+2H2O Fe2+

Fe3+

Fe3+ soluble

Fe3+-ligand organique

Fe2+Fe3+

e-

Colloïdes

e-

e-

HO-

Fe3+

1. Adsorption

2. Nucléation

3. Croissance

limitée

FIBREFIBRE

Fe3+

+2H2OFeOOH

+3H+

Fe(III)/Fetot

Fe(III)/Fetot

(hν)

E max E min∆Ε ⇒ ∆Ψ

MILIEU MILIEU

EXTERIEUREXTERIEUR

Oxydant?

pH min pH max

CYTOCYTO--

PLASMEPLASMEMb

PlMb

Ext

Ppl

H+H+

ADP

ATP

HCO3-+5H++4e-

<CH2O>+2H2O Fe2+

Fe3+

Fe3+ soluble

Fe3+-ligand organique

Fe2+Fe3+

e-

Colloïdes

e-

e-

HO-

Fe3+

1. Adsorption

2. Nucléation

3. Croissance

limitée

FIBREFIBRE

Fe3+

+2H2OFeOOH

+3H+

Fe(III)/Fetot

Fe(III)/Fetot

(hν)

E max E min∆Ε ⇒ ∆Ψ

MILIEU MILIEU

EXTERIEUREXTERIEUR

Oxydant?

Page 123: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

123

Légendes : Mb Pl = Membrane plasmique, Mb Ext = Membrane externe, Ppl = Périplasme.

Les échelles ne sont pas respectées.

Variabilité de la minéralogie des phases formées par SW2. En complément des résultats

présentés dans l’article qui suit, nous avons mis en évidence une variabilité de la minéralogie

des phases riches en fer formées dans les cultures de SW2. La souche a été inoculée dans

deux proportions différentes (1/10 et 1/100) dans un milieu de culture contenant du Fe(II) à 4-

6 mM, à partir d’une pré-culture effectuée en présence d’H2 et en l’absence de fer (pas de

minéraux dans l’inoculum). Comme le montre la Figure 1C-3, le Fe(II) est totalement

consommé (oxydé) en 10 jours dans les deux cas. Pourtant, l’analyse minéralogique par DRX

des produits d’oxydation dans ces deux conditions de culture montre que les minéraux formés

sont différents (Figure 1C-4): le produit de la culture inoculée au 1/100 est cristallin et

consiste en une goethite, tandis que le produit de la culture inoculée au 1/10 est totalement

amorphe. Dans le cas où SW2 est inoculé à partir d’une pré-culture en présence de fer

(l’inoculum contient alors des bactéries et des minéraux riches en fer produits dans la

préculture), un mélange d’amorphe et de goethite est obtenu, que les bactéries soient

inoculées au 1/10 ou au 1/100. Les analyses MET-EDX du produit amorphe obtenu suggèrent

qu’il s’agit d’un phosphate de fer. Le ou les paramètres contrôlant la cristallinité des phases

formées n’ont pas encore été identifiés. La minéralogie pourrait être contrôlée par la présence

éventuelle de minéraux riches en fer au début de la culture, par le taux d’oxydation initial du

Fe(II), par la durée de la phase de latence ou encore par l’état métabolique de l’inoculum

(inoculum en phase stationnaire ou en phase exponentielle). Ces paramètres n’avaient pas été

finement contrôlés au cours de ces expériences préliminaires. Il conviendra donc de reprendre

l’ensemble de ces paramètres afin d’identifier dans le futur ceux pouvant participer au

contrôle de la minéralogie des phases produites par SW2.

Page 124: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

124

0

1

2

3

4

5

6

0 2 4 6 8 10 12

SW2(H2)Fe*1/100SW2(H2)Fe*1/10

Co

nce

ntr

ati

on

en

Fe d

iss

ou

s, m

M

Temps, jours

Figure 1C-3. Courbes de croissance de SW2 cultivée en présence de 4-6 mM Fe(II), à partir

d’une pré-culture en H2, inoculée au 1/10 ou au 1/100.

20 40 60 80 100

Co

un

ts,

a.u

.

2θθθθ angle (°)

SW2, 1/100

Viv

(6.6

0 A

)

SW2, 1/10

Figure 1C-4. Analyse par DRX de la minéralogie des phases produites par SW2 cultivée en

présence de Fe(II) dissous, à partir d’une pré-culture en H2 inoculée au 1/10 ou au 1/100.

Tandis que le produit obtenu dans la culture inoculée au 1/10 est totalement amorphe, le

produit de la culture au 1/100 est cristallisé. Le pic indiqué à 6.60 A est attribué à de la

vivianite. Tous les autres pics sont expliqués par la goethite.

Page 125: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

125

Extracellular iron biomineralization by photoautotrophic iron-oxidizing bacteria

Jennyfer Miot (1), Karim Benzerara (1), Martin Obst (2), Andreas Kappler (3), Florian Hegler

(3), Camille Bouchez (1), François Guyot (1), Guillaume Morin (1).

(1) Institut de Minéralogie et de Physique des Milieux Condensés, UMR 7590, CNRS,

Universités Paris 6 et Paris 7, et IPGP.

140, rue de Lourmel. 75 015 Paris, France.

(2) BIMR McMaster University Hamilton & Canadian Light Source, 101 Perimeter Road,

Saskatoon, SK, Canada, S7N OX4.

(3) Geomicrobiology Center for Applied Geoscience (ZAG), University of Tuebingen,

Sigwartstrasse 10, 72076 Tuebingen, Germany.

*Corresponding author:

[email protected] ; Tel: 0033144279832; Fax: 0033144273785

To be submitted to Applied & Environmental Microbiology

Page 126: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

126

ABSTRACT

Iron oxidation at neutral pH by the phototrophic anaerobic iron-oxidizing bacteria

Rhodobacter sp. strain SW2 leads to the production of iron-rich minerals. These minerals

consist mainly of goethite (FeOOH), which precipitates exclusively outside the cells, mainly

on fibres emerging from one of the poles of the cell. Scanning Transmission X-ray

Microscopy (STXM) analyses performed at the C K-edge suggest that these fibres consist of a

mixture of lipids and polysaccharides or of lipo-polysaccharides. The iron and the organic

carbon contents on these fibres are linearly correlated at the 25-nm scale, which in addition to

the texture suggests that the fibres act as a template for the precipitation of the minerals,

followed by a limited crystal growth. Moreover, we demonstrate the existence of a gradient of

the iron redox state along the mineralized fibres at the micrometer-scale, with an increasing

reduced iron proportion at distance from the cells. This could be explained by an export of

Fe(III) from the cells and/or an oxidation of Fe(II) taking place outside the cells, directly at

the contact of the fibres. Furthermore, the redox gradient reflects a difference of electrical

potential in between the two extremities of the fibre. These fibres share morphological

similarities with the electrically conductive nanowires described in Shewanella oneidensis,

but the demonstration of their potential role in electron transfer to the cells from long-distance

iron oxidation would need further investigations.

Page 127: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

127

INTRODUCTION

Fe(II) can serve as a source of electrons for phylogenetically diverse microorganisms

that precipitate iron minerals as by-products of their metabolism (see e.g. 1-4). For example,

mixotrophic bacteria can couple the oxidation of Fe(II) to the reduction of nitrate in anoxic

and neutral-pH environments. Fe(III) being highly insoluble at neutral pH, this metabolism

leads to the formation of poorly- to well-crystallized iron minerals (3, 5, 6) that partly

precipitate within the cell periplasm in some strains (7). Similar Fe-minerals are also

synthesized by autotrophic bacteria that perform anoxygenic photosynthesis, using Fe(II) as

an electron donor and light as a source of energy for CO2 fixation (2, 8, 9), following Eqn 1:

HCO3- + 4 Fe

2+ + 10 H2O = <CH2O> + 4 Fe(OH)3 + 7 H

+ (Eqn 1)

However, the biological mechanisms of iron oxidation in these bacteria, and in

particular the way they cope with the formation of minerals within their ultrastructures are

still not fully understood. Indeed, iron minerals are potentially lethal since their precipitation

may alter cellular ultrastructures, but also catalyze the production of free radicals (10).

Recent genetic studies of the phototrophic iron-oxidizing bacteria Rhodobacter sp., strain

SW2 (11) and Rhodopseudomas palustris strain TIE-1 (12) have identified genes (fox and pio

operons respectively) encoding proteins specific for iron oxidation. Interestingly, Jiao &

Newman (12) suggested that one of these proteins could have a periplasmic localization.

However, on the contrary to what has been observed in some other phototrophic iron-

oxidizers (4) and in some nitrate-reducing iron-oxidizing bacteria (7), there is no iron-mineral

precipitation occurring within the periplasm of the purple non-sulfur iron-oxidizing bacteria

Rhodobacter sp. strain SW2 (4). Similarly to some other neutrophilic (4, 7) and acidophilic

iron-oxidizing bacteria (13, 1), this strain has indeed the ability to localize iron

biomineralization at distance from the cells, leaving large areas of the cells free of precipitates

(14). While it has been shown that the acidophilic Gallionella and Leptothrix genera for

example produce extracellular polymers that facilitate the nucleation of iron minerals outside

the cells (e.g. 15, 1), only little is known about the existence of such polymers in anaerobic

neutrophilic iron-oxidizing bacteria, and especially in the phototrophic strain SW2. In the

present study, we investigate iron biomineralization by the photoautotrophic iron-oxidizing

bacteria Rhodobacter sp. strain SW2. We use Scanning Transmission X-ray Microscopy

(STXM) to map and characterize organic polymers produced by the cells as well as the redox

state of iron at the 25-nanometer scale over the time course of a culture. These results

Page 128: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

128

demonstrate the primordial role of organic polymers in iron biomineralization and provide

first evidences for the existence of a redox gradient around SW2 cells.

MATERIALS AND METHODS

Bacterial strain and growth conditions. The phototrophic Fe(II)-oxidizing bacterium

Rhodobacter sp., strain SW2 (2), was cultivated in batch freshwater mineral medium prepared

after Ehrenreich & Widdel (8) buffered at pH 6.8 with bicarbonate in equilibrium with a

N2/CO2 (80/20) atmosphere . SW2 was grown in this medium with Fe(II) as an electron

donor. For experiments using Fe(II) as an electron donor, Fe(II) was added as FeCl2 at a total

concentration of 10 mM, which led to the precipitation of a white phase characterized as

vivianite Fe3(PO4)2 (7). This precipitate was removed prior to inoculation by filtration through

0.22 µm Millipore filters in an anoxic glovebox (p(O2) < 50 ppm). After filtration, the

medium contained 2 to 6 mM dissolved Fe(II). SW2 was inoculated at 100%. Cultures were

incubated at 20°C in the light. For STXM analyses, samples of the same culture were

collected in an O2-free glove-box (p(O2)<50 ppm) at several subsequent time steps (3 h, 4, 7,

11 and 15 days).

Dissolved Fe(II) measurement. The concentration of dissolved iron was followed over the

time course of the cultures. In that purpose, 200 µL of a culture suspension were sampled with

a syringe and filtered through 0.22 µm Millipore filter in an anoxic glovebox. The dissolved

Fe(II) content of the filtrate was determined by the ferrozine assay (16) after dilution in 1 M

HCl. In all samples, no measurable dissolved Fe(III) could be detected after reduction with

hydroxylamine hydrochloride.

Synthesis of model compounds for Fe redox analyses. To determine the Fe redox state of

the samples by STXM at the Fe L2,3-edges, a pure Fe(II) end-member and a pure Fe(III) end-

member are needed, both as close as possible in structure to the phases that are formed by

SW2. Pure Fe(II)-vivianite and goethite (FeOOH) were used as the Fe(II)- and Fe(III) end-

members respectively. The mineralogical purity of these compounds was checked by XRD

and the redox state of Fe in both compounds was also controlled by bulk XANES at the Fe K-

edge. Both reference minerals were rinsed twice with degassed distilled water and dried under

vacuum inside an anoxic glove-box.

Page 129: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

129

Mineral characterization by X-ray diffraction. The bulk mineralogical composition of the

solid phases formed in SW2 cultures was determined by X-ray diffraction (XRD)

measurement and compared to vivianite and goethite model compounds. Samples were

prepared under anoxic conditions in an anoxic glove-box. The cultures were centrifuged

(6500 rpm, 10 min). The solid phases were rinsed twice using degassed distilled water and

vacuum-dried. The powders were ground in an agate mortar and dispensed in borosilicate

capillaries that were sealed with glue before analysis in the diffractometer. This preparation

guaranteed strict anoxic conditions for XRD analyses. XRD measurements were performed

with CoKa radiation on a Panalytical® X’Pert Pro MPD diffractometer mounted in Debye-

Scherrer configuration using an elliptical mirror to obtain a high flux parallel incident beam

and an X'Celerator®

detector to collect the diffracted beam. Data were recorded in the

continuous-scan mode within the 5 - 80° 2θ range with a step of 0.03°, and a counting time of

12 to 24 h per sample.

Scanning Transmission X-ray Microscopy. The samples were constantly kept under an

anoxic atmosphere from preparation to transfer and analysis within the STXM microscope,

following the method detailed in Miot et al. (7). The entire preparation was performed in an

anoxic glove-box. 1 mL of a suspension of SW2 culture (or of reference compounds) was

sampled at different stages of each culture (3 h to 15 days). Each sample was rinsed twice in

degassed distilled water. 0.3 µL of each sample was dried on a silicon nitride window, then

sandwiched by addition of a second silicon nitride membranes (Norcada Inc., Canada), the

whole sealed under an anoxic atmosphere using epoxy.

Some of the STXM observations at the Fe L2,3-edges were performed at the Swiss

Light Source (SLS, Villigen) on the PolluX beamline. Some of the observations at the Fe L2,3-

edges and all the observations at the C K-edge were performed at the spectromicroscopy

beamline 10ID-1 at the Canadian Light Source (CLS, Saskatoon). Additional information on

the PolluX beamline can be found in Bernard et al. (17). The beamline 10ID-1 at the CLS was

described in detail by Kaznatcheev (18). Both beamlines have an energy resolving power

E/∆E > 3000. The energy scales for this study were calibrated using the well-resolved 3p

Rydberg peak of gaseous CO2 for the C K-edge and the major peak of hematite at 708.7 eV

for the Fe L3-edge.

Image stacks were acquired at the C K-edge and at the Fe L2,3-edges. They were

performed by scanning the sample in the x-y direction at each energy increment over the

Page 130: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

130

energy range of interest. Potential sample damages caused by the incident photon beam (i.e.

changes of the Fe redox state) were quantified by monitoring spectral changes at the Fe L2,3-

edge with increasing dwell times up to several tens of ms (7). However, no significant

changes were observed for typical dwell times used during analyses of the samples (i.e.

around 0.8 ms per energy- and image-point). The aXis2000 software-package (19) was used

for processing image stacks and NEXAFS spectra. Images were recorded on transmission

scale and converted into optical density (OD) according to Equation (2).

OD = -ln(I/I0) (Eqn. 2)

wherein I represents the measured intensity at the point of interest and I0 represents the

intensity outside the sample that includes the absorption by silicon nitride windows.

Qualitative speciation maps were obtained by subtracting OD images obtained at an energy

below the absorption edge from OD-images taken at the energies of specific absorption peaks.

NEXAFS spectra were extracted from the stacks on regions of interest. For Fe L2,3-

edges spectra, we normalized the area below the L2 and L3 edges to 1 and multiplied the

absorbance of the compounds containing mainly Fe(II) (major peak at 707 eV) by a 4/5

correction factor to take into account the difference in the occupancy of the 3d orbitals in Fe2+

and Fe3+

ions, neglecting the variation of radial integrals (20). We fit the normalized spectra

with linear combinations of the normalized reference spectra of the Fe(II)-phosphate and

goethite model compounds, applying the CGO (Conjugate Gradient Optimization method)

curve fit routine in Axis2000. Fit results allowed estimating the Fe(III)/Fe(total) content of

regions of interest. Standard deviations (SD) were calculated from the deviation between the

fit and the data and were systematically less than 1%. Fe(III)/Fe(total) ratio profiles were

obtained using the Fe(III) and Fe(II) OD-maps resulting from stack fits. Additionally, Fe(II)

and Fe(III) stack maps were used to evaluate the variability of the Fe(III)/Fe(total) ratio

within each sample (i.e. at each stage of the culture): the Fe(II)-map was multiplied by the 4/5

correction factor (see above) and added to the Fe(III)-map to obtain a Fe(total) map. The

Fe(III)-map was subsequently divided by the Fe(total) map. A histogram of the resulting map

was plotted, giving the number of pixels for each Fe(III)/Fe(total) ratio. This histogram

allowed discriminating the major areas with different Fe redox states within the image. The

mean Fe(III)/Fe(total) ratios were calculated as the maxima of each peak in the histogram and

the variability as the width at mid-height of the peak.

Spectra recorded at the C K-edge were normalized to 1-nm thickness and fit with

normalized reference albumin (protein), xanthan (polysaccharide) and 1,2-dipalmitoyl-sn-

glycero-3-phosphocholine (lipid, Hitchcock pers. comm..).

Page 131: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

131

Using aligned stacks recorded at the Fe L-edges and at the C K-edge on the same area

and normalized reference spectra (vivianite, goethite, albumin, xanthan, 1,2-dipalmitoyl-sn-

glycero-3-phosphocholine), we calculated Fe and C-speciation maps from image stacks by

singular value decomposition using the stack fit routine in aXis2000. The algorithm fits the

spectra of each individual pixel with a linear combination of the two normalized reference

spectra plus a constant, accounting for the absorption background. We subsequently obtained

numbers that are proportional to the amount of iron and of organic carbon for each pixel of

this area. Those values are then used to plot the amount of C relatively to the amount of Fe at

each pixel of the area (~2500 pixels in total) and assess the existence of possible correlations

(see ref 21 for additional explanations).

RESULTS

Association of iron minerals with organic carbon. As shown in Fig. 1, Fe(II) is almost

completely consumed (oxidized) within 10 days in cultures of SW2. In contrast, no significant

oxidation could be detected in abiotic controls. XRD analyses indicate that the end-product of

iron oxidation by SW2 is crystalline and consists of goethite (FeOOH) (Fig. 2).

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

0 2 4 6 8 10 12

Fe

co

nc

en

tra

tio

n,

mM

Time, days

Figure 1. Concentration of remaining soluble Fe(II) in SW2 culture at an initial Fe(II)

concentration of 4-6 mM over a period of 12 days.

Page 132: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

132

20 40 60 80 100

Co

un

ts, a.u

.

2θθθθ angle (°)

SW2

Viv

(6.6

0 A

)

Vivianite

Goethite

Figure 2. X-ray diffraction patterns of the precipitates collected from a 15-day old culture of

SW2, of goethite and of the reference vivianite used for STXM analyses. In the “SW2”

pattern, a vivianite peak is observed (Viv) and all other peaks are explained by goethite.

Cell-mineral assemblages were imaged by SEM (Fig. 3). In addition, iron-rich minerals were

localized with respect to the cells by analyzing the cultures using STXM at the Fe L2,3-edges.

Maps of Fe(II) and Fe(III) were obtained by fitting stacks with a linear combination of Fe(II)

and Fe(III) reference compounds. As shown on Fig. 3 and 4d, iron-rich minerals are

exclusively localized outside the cells, mostly on extracellular fibres and in a very low

proportion at the cell surface. Usually attached to one of the poles of the cell, extracellular

fibres are a few µm in length and a few nm in diameter (Fig. 3). Moreover, maps of organic

carbon reveal that these iron-bearing fibres are rich in organic carbon (Fig. 4b and 4c).

XANES spectra at the C K-edge obtained on these regions exhibit maxima of absorption at

285.2 eV, 287.4 eV and 288.6 eV, which can be attributed to alkene (C=C), aliphatic (C-C) or

carbonyl (C=O) and carboxylic (COOH) functional groups respectively (Fig. 3e, 22). The

biochemical indexation of such spectra is more difficult, given the significant variations of the

XANES signatures within some biochemical groups such as lipids or polysaccharides

(Hitchcock, pers. comm.). However, the XANES spectrum of the fibres can be reasonably

well fitted using a linear combination of polysaccharides, such as xanthan, and lipids, such as

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (fully saturated lipid). The peak at 285.2 eV

that is not well fitted in intensity with our set of reference spectra can be attributed to

additional unsaturated C=C bonds that could be present on the aliphatic tail of the fatty acid.

Page 133: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

133

Thus, our results suggest that organic fibres attached to SW2 cells consist of a mixture of

partially unsaturated lipids and polysaccharides or of lipo-polysaccharides. Less than 3% of

proteins might be present as well in these fibres. In contrast, XANES spectra at the C K-edge

obtained on bacteria have a maximum absorption at 288.2 eV that is unambiguously attributed

to the absorption of the peptidic bond, characteristic of proteins.

Figure 3. SEM micrograph showing fibres emerging from SW2 cell poles. From Schaedler

et al., submitted.

The existence of a correlation between the concentrations of Fe and of organic carbon

has been investigated separately on the cells and on the extracellular mineralized fibres (Fig.

5) by plotting the Optical Density (OD) levels measured on each pixel of the region of interest

on the Fe map and on the organic carbon map. Interestingly, the Fe and organic carbon

contents are correlated on the mineralized filaments (Fig. 5a) following a linear relation:

[Fe] = 2.5 [C] + 100, r=0.98 (Eqn. 3)

Given that iron associated with these fibres consists mainly of mineral precipitates, this

relation suggests that the amount of iron precipitated is proportional to the amount of organic

carbon.

Similarly, Fe and organic carbon contents are also correlated on the cells, following a linear

relation. It can be noted that the concentration of iron on the cells is however much lower than

on the fibres and may correspond either to very small precipitates forming directly at the cell

contact (Fig. 5b), or to adsorbed Fe.

Page 134: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

134

Figure 4. Spectromicroscopy study of organics associated with SW2 biominerals (3-day old

culture). The 3 different organic carbon maps (a, b, c) were obtained by fitting the stack with

a linear combination of albumin (protein), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

(lipid) and xanthan (polysaccharide). a: Map of proteins, mainly concentrated in the bacterial

cell. Scale bar: 500 nm. b: Map of lipids, mainly present in the extracellular fibre. Scale bar:

500 nm. c: Map of polysaccharides, mainly present in the fibre. Scale bar: 500 nm. d: Fe(III)

map obtained by fitting the stack at the Fe L-edge with reference goethite. Scale bar: 250 nm.

e: XANES spectra at the C K-edge obtained on bacteria and extracellular fibre respectively,

compared with the spectra of reference albumin, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-

phosphocholine (lipid) and xanthan (polysaccharide). The XANES spectrum of the fibre was

fitted with a linear combination of xanthan and 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

(dashed line) and yielded thicknesses of 1.31 and 1.28 nm respectively. These results indicate

that fibres are associated with extracellular iron-rich precipitates are composed of a mixture of

lipids and polysaccharides or of lipo-polysaccharides.

0

0 0

0

60 125

150 3.8

a b

c d

e

284 288 292 296 300

Op

tic

al

de

ns

ity

Photon energy, eV

0.01

albumin

bacteria

fibre

xanthan

lipid

285.2 eV

288.2 eV

289.2 eV

288.6 eV

287.4 eV

fit-fibre0

0 0

0

60 125

150 3.8

a b

c d

e

284 288 292 296 300

Op

tic

al

de

ns

ity

Photon energy, eV

0.01

albumin

bacteria

fibre

xanthan

lipid

285.2 eV

288.2 eV

289.2 eV

288.6 eV

287.4 eV

fit-fibre

Page 135: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

135

Figure 5. Correlation analysis of iron versus carbon content on a: extracellular filaments and

b: bacteria of a 3-day old SW2 culture. Fe and organic carbon contents were estimated at each

pixel of the STXM image presented in Figure 3 from the Fe(III), the polysaccharide (for the

extracellular fibres) and the protein (for the cell) maps respectively. These results indicate that

(a) iron content is proportional to organic carbon (mostly polysaccharides) content on

extracellular precipitates following: [Fe] = 2.5 [C] + 100, r=0.98 and (b) cells are covered by

a small amount of iron that is also proportional to organic carbon content.

Organic carbon content, a.u.

Organic carbon content, a.u.

Extracellular filament

Bacteria

Fe c

on

ten

t, a

.u.

a

b

Fe c

on

ten

t, a

.u.

Page 136: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

136

Iron redox state at the nanoscale. Using STXM at the Fe L2,3-edges, the evolution of iron

redox state in these extracellular iron-rich minerals was followed over the time course of a

culture (3 h to 15 days) at a spatial resolution of 25 nm. XANES spectra recorded on these

samples were fit with a linear combination of vivianite (Fe(II)-reference compound) and

goethite (Fig. 6, Fig. SI-1 and Table 1). Numerical results of these fits indicate that the

minerals that form initially in SW2 cultures are composed of mixed valence iron

(Fe(III)/Fe(total) = 0.39 after 3 h of culture). With time, iron contained in these minerals

becomes increasingly oxidized. After 7 days of culture, iron-rich minerals are mostly

composed of Fe(III) (Fe(III)/Fe(total) = 0.84) and the end-product of iron bio-oxidation by

SW2 is a pure Fe(III) compound (goethite obtained after 15 days).

705 710 715 720 725

Op

tica

l d

en

sit

y,

a.u

.

Photon energy, eV

Vivianite

707eV

708.7eV

15 days / goethite

11 days

7 days

4 days

3h

Figure 6. Evolution of iron redox state in SW2 cultures. Solid lines show the data and

dashed lines the best fits of the Fe L2,3-edges spectra of the minerals formed in SW2 cultures.

Numerical results of the best fits are displayed in Table 1. Spectra of 4 to 11-day old samples

were fit with a combination of reference goethite and vivianite. The spectrum of the sample

collected after 3h of culture was fit with a linear combination of reference Fe(III)-phosphate

and vivianite. These results indicate the progressive oxidation of iron into Fe(III) under the

form of goethite in SW2 cultures respectively.

Page 137: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

137

Sample Culture time Mean Fe(III)/Fetotal Standard deviation

SW2(H2), Fe* 3h 0.39 0.006 4 days 0.66 0.005 7 days 0.84 0.005 11 days 0.84 0.004 15 days 1

Table 1. Fe(III)/Fe(total) quantification obtained from the fit of Fe L2,3-edge NEXAFS

spectra extracted from stacks on precipitates collected at different stages of SW2 culture.

Fe(III)/Fe(total) values result from at least two spectra fits. Standard deviations (SD) were

calculated as the SD of the fit to the data. Values reported in this Table are means of the

standard deviations obtained for each fit.

0

5

10

15

20

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

OD

lev

el,

a.u

.

Fe(III)/Fe(total)

0.4+/-0.19

0.77+/-0.27

0.95+/-0.1

Figure SI-1. Spatial variability of the Fe(III)/Fe(total) within SW2 cultures at different

stages of the culture : (green) : 3h, (pink) : 4 days, (black): 7 days. Numbers are means +/-

width at mid-height of the peaks.

Local heterogeneities of the redox state of Fe were investigated at different stages of the

culture (Fig. 7). Fe(II) and Fe(III) OD-maps of the bacteria and associated extracellular iron-

rich minerals were obtained by fitting stacks recorded at the Fe L2,3-edges with a linear

combination of the Fe(II)- and Fe(III)-model compounds. Using these maps, Fe(II), Fe(III)

and Fe(total) intensity profiles were obtained along the mineralized fibres. Plotted in Fig. 7c

are the resulting Fe(III)/Fe(total) profiles obtained on extracellular fibres from the bacterial

pole (A) towards the end of the fibre at distance of the cell (B), at different time points (5 h

and 11 days). This analysis reveals a gradient of the redox state of Fe along the mineralized

Page 138: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

138

fibre, iron being systematically more oxidized at the cell contact than at distance from the

cells. This gradient can be observed over the time course of the culture, the average iron redox

state on the filaments increasing with time (Fig. 5 and Table 1). Near the end of the culture, as

iron is almost completely oxidized, the redox gradient is attenuated (11 days).

Figure 7. Iron redox gradient along the mineralized filaments associated with SW2 cells. a and b: STXM images taken at 702 eV of bacteria and associated extracellular filament after

5h and 11 days of culture respectively. c: Fe(III)/Fetotal ratios along the A-B profiles

displayed on panel a (●) and b (□) and corresponding linear curve fits (solid lines) following

the equation: y=0.67-0.26x, r=0.88 for the 5-h old sample and y=0.98-0.10x, r=0.82 for the

11-days old sample. Fe is more oxidized at the cell contact than at distance from the cells and

the Fe redox gradient attenuated with time.

a

A

B

1 µm 500 nm

A

B b

0 0.5 1 1.50.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

Fe

(III

)/F

e t

ota

l

Distance, µm

a

Page 139: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

139

DISCUSSION

Lipo-polysaccharidic fibres act as a template for iron biomineralization. Iron

biomineralization by the phototrophic SW2 strain occurs outside the cells (14, 4), producing

Fe-mineral located, partly as patches at the cell surface and leaving large areas uncovered, and

mostly on extracellular fibres (Fig. 3 and 4). This pattern of extracellular iron mineralization

differs from that produced by the anaerobic nitrate-reducing BoFeN1 strain that was shown to

mineralize iron within its periplasm (4, 7). In SW2 cultures, extracellular fibres emerge from

the cells usually at one of the cell poles (Fig. 3). These fibres show a XANES spectrum at the

C K-edge similar to that of a mixture of partly unsaturated lipids and polysaccharides (Fig. 4).

Processes of iron oxide particles assembly on organic carbon containing fibrils have been

widely described in the case of iron biomineralization in association with polysaccharides (1,

23, 24). It has been suggested that heterogeneous nucleation of iron oxides at the surface of

exopolysaccharides would proceed through binding to functional groups, leading to a

minimization of the surface energy that would consequently stabilize potentially unstable

nuclei (24) leading to mineral-organic assemblages with morphologies very similar to those

evidenced in SW2 cultures. Similar hypotheses can be driven for lipids. Indeed, it has been

shown by Archibald & Mann (25) that precipitation of positively-charged iron oxides at the

surface of negatively-charged lipid microstructures can lead to tubular organic-inorganic

composites (25). In particular, iron oxide (ferrihydrite, magnetite, lepidocrocite or goethite)

precipitation is activated by addition of low levels of sulphated derivatives on galacto-

cerebroside microtubules that template mineral assembly (25). These sugar-based lipids

exhibit a high negative charge that enhances the binding of Fe(III) cationic species by

electrostatic attraction. These binding sites could thus serve as initial foci for mineral

nucleation (25). Fibres identified in SW2 cultures may exhibit different types of hydrophilic

moieties that could bind Fe(III) (possibly phosphate, sulphate, hydroxyl groups) and serve as

foci for mineral nucleation. This could explain the organic-mineral assemblages consisting in

nanoparticles of iron oxides clustered at the surface of the organic fibres that are observed in

SW2 cultures as well as the existence of a linear relationship between the Fe and the organic

C content on these mineralized fibres (Fig. 5). The following scenario for iron precipitation

could thus be proposed: Fe could initially adsorb onto the fibres proportionally to the amount

of organic carbon binding ligands present at the surface of the fibres. Then, this linear

relationship can be preserved after nucleation of Fe-minerals at the surface of the fibres as

long as the size of the minerals remains small, as observed in the present study. In contrast,

Page 140: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

140

crystal growth would increase the Fe content for a given organic carbon content, leading in

turn to a wide range of Fe concentrations at a given organic carbon concentration. As shown

by Nesterova et al. (24), organic polymers can stabilize very small mineral particles and

inhibit further growth.

The organic fibres that act as a template for iron biomineralization in SW2 cultures are

elongated appendages emerging from one of the cell pole (Fig. 3). XANES spectroscopy

suggests that less than 3% of proteins might be present in these fibres. In contrast, contrary to

pili or flagella that are mostly composed of proteins, fibres observed in SW2 cultures are

mainly composed of lipids and polysaccharides. Further analyses will be required to elucidate

the origin and the detailed biochemical composition of SW2 fibres.

Mineralized fibres exhibit a Fe redox state gradient. The organic fibres record the redox

conditions along a section across the microenvironment surrounding SW2 cells. In this study,

we evidence a gradient of the Fe redox state along these organic fibres, with more oxidized

iron minerals at the cell contact and more reduced iron minerals precipitating at distance from

the cell. With time, as dissolved Fe(II) becomes completely oxidized, this redox gradient is

attenuated and mostly Fe(III)-minerals are observed at distance of the cells on the organic

fibres. Two different models that are not exclusive from each other could account for these

observations:

(1) Fe(II) could be oxidized within the periplasm and exported at distance from the cells.

Periplasmic oxidation is indeed suggested by previous reports of SW2 proteins that are

involved in the iron oxidation pathway and that exhibit motifs typical of periplasmic proteins

(11, 12). Oxidation within the periplasm is also supported indirectly by the observation of iron

precipitation within the periplasm in the anaerobic nitrate-reducing iron-oxidizer BoFeN1

strain (7). In this model, Fe(III) produced in the periplasm of SW2 cells would be exported

either as a soluble Fe(III)-organic ligand complex (14), as dissolved Fe(III) or as colloidal

particles (26). In particular, the acidic pH microenvironment reported around SW2 colonies

grown on agar plates could facilitate the export of dissolved Fe(III) (14, 27).

(2) Alternatively, iron oxidation could take place outside the cells, directly at the fibre contact.

No chemical oxidant is present in the strictly anoxic culture medium of SW2. Thus, this

model requires either the production of an oxidant by the bacteria that would oxidize

dissolved Fe(II) at the contact of the fibres, or the expression of an iron-oxidase at the surface

Page 141: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

141

of the fibres. In both cases, this would lead to the precipitation of Fe(III)-containing minerals

that could nucleate on the lipo-polysaccharidic template.

In both scenarii, as soluble Fe(II) is increasingly oxidized over the time course of a culture,

mixed-valence Fe-minerals would become increasingly oxidized, leading to a progressive

attenuation of the gradient of the Fe redox state along the fibres (Fig. 6). These two

mechanisms could coexist and work in synergy. By generating protons following (Eqn 5):

Fe2+

+ 2 H2O = FeO(OH) + 4 H+

+ 2 e- (Eqn 5)

iron oxidation at distance of the cells (on organic fibres) could in return facilitate the export of

Fe that is oxidized within the cell periplasm. The resulting additional Fe(III) could then

aggregate on the organic fibres, reinforcing the gradient of Fe redox along the fibres.

Fibres emerging from SW2 cells and acting as a template for iron mineralization show

similarities in morphology and size with the nanowires described in the dissimilatory iron

reducing bacteria Shewanella oneidensis (28, 29). These bacterial appendages are 50 to >150

nm in diameter and extend tens of microns or longer (29). They were shown to be electrically

conductive and were proposed to mediate electron transfer from bacteria to solid iron oxides,

without the need for a direct contact between the cell and the mineral surface (28, 29). The

chemical composition of these nanowires is however still unknown, although they have been

shown to contain cytochromes. Although the electrical conductivity of the fibres identified in

SW2 cultures is not demonstrated, the gradient of iron redox along these fibres reflects a

difference of electrical potential between the two extremities of the fibres. It can be tentatively

proposed that these bacteria may retrieve electrons from long-distance iron oxidation.

Oxidation and precipitation of iron at distance from the cells would also generate protons. As

proposed by Chan et al. (1) for other iron-oxidizers at acidic pH, these protons could harness

the proton gradient across the cell membrane potentially increasing energy generation. The

possibility that bacteria could retrieve energy from oxidation reactions taking place at distance

from the cells open new perspectives of research for the understanding of bacteria-mediated

metal oxidation. Further studies are now required to define the surface composition and

electrical properties of lipo-polysaccharidic fibres produced by SW2 and to localize the sites

of iron oxidation.

Page 142: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

142

ACKNOWLEDGMENTS

We gratefully acknowledge the support of an ANR “Jeunes Chercheurs” Grant (JM &KB).

The STXM measurements have been performed at the Canadian Light Source, Saskatoon,

Canada. The CLS is supported by NSERC, CIHR, NRC and the University of Saskatchewan.

We thank Konstantine Kaznatcheev, Chithra Karunakaran and Drew Bertwistle for their

expert support of the CLS STXM. The contribution from AK and FH was funded by an

Emmy-Noether fellowship and additional funding from the German Research Foundation

(DFG) to AK. This is IPGP contribution No. xxx.

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Page 145: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

145

Chapitre 1.D.

Les premiers stades de la biominéralisation du fer et la fossilisation de

protéines

Problématique et objectifs. L’activité bactérienne peut laisser des traces dans les

biominéraux, autrement dit des biosignatures pouvant être recherchées dans le registre fossile.

Dans le cadre de l’étude des biominéralisations du fer par la souche dénitrifiante BoFeN1,

nous nous sommes donc intéressés à la possible préservation de structures organiques dans

des cellules complètement minéralisées pouvant s’apparenter à des microfossiles bactériens. Il

est couramment admis que la matière organique, du fait de sa grande labilité, est rapidement

dégradée. Cependant, il a été montré que sa dégradation peut être efficacement atténuée voire

inhibée par l’adsorption sur des oxydes de fer, en particulier des oxyhydroxydes mal

cristallisés (e.g. Kaiser & Guggenberger, 2000). En retour, ceux-ci peuvent être stabilisés

(Kennedy et al., 2004). Dans l’article qui suit, nous montrons que des protéines peuvent être

préservées au sein des biominéralisations riches en fer formées dans le périplasme de

BoFeN1. En outre, nous avons suivi les étapes de la précipitation des minéraux riches en fer

dans la cellule en conditions quasi-natives. Nos résultats apportent de nouveaux éclairages

pour la compréhension des premières étapes de la biominéralisation périplasmique.

Méthodologie.

Cryo Electron Microscopy of Vitreous Sections (CEMOVIS). La cryo-microscopie

électronique en transmission de sections vitreuses est utilisée depuis une vingtaine d’années

environ par des équipes s’intéressant à la biologie cellulaire (Al-Amoudi et al., 2004a, Al-

Amoudi et al., 2004b) et moléculaire (e.g. Leforestier et al., 2001). Son intérêt en biologie

structurale repose sur le fait qu’elle offre la possibilité d’observer des échantillons biologiques

en coupe en MET dans des conditions natives : sans aucun traitement chimique préalable,

l’échantillon est congelé dans une glace vitreuse préservant les structures cellulaires dans leur

état hydraté-congelé. Quelques travaux en particulier traitent de la structure membranaire des

bactéries Gram-positives et Gram-négatives (Dubochet et al., 1983, Graham & Beveridge,

1994, Matias et al., 2003, Zuber et al., 2008). Dans le cadre de cette thèse, nous utilisons pour

la première fois cette technique en géomicrobiologie pour imager en conditions natives les

assemblages molécules organiques - minéraux.

Page 146: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

146

• Congélation des échantillons. L’observation d’échantillons biologiques en conditions

natives requiert la préservation de l’état hydraté des structures cellulaires. La solidification de

l’échantillon sans traitement chimique préalable est possible par congélation. Plusieurs types

de glace peuvent être obtenus en fonction des conditions de congélation. La glace vitreuse est

celle qui présente le plus de similarités structurales avec l’eau liquide. Elle peut être obtenue

par une congélation très rapide (1-2 ms) à très basse température (-196 °C) et sous haute

pression (2 kbars). Afin de préserver au mieux les structures biologiques, un cryoprotectant,

tel que le Dextran de haut poids moléculaire, peut être utilisé. Le protocole qui a été utilisé

dans le cadre de notre étude est le suivant :

- On effectue des prélèvements dans les cultures bactériennes, qu’on concentre et qu’on rince

par centrifugation douce (2000 g, 1 min.) et dilution dans du milieu de base (milieu de culture

sans fer, non inoculé) en conditions anoxiques (boîte à gants).

- En dehors de la boîte à gants, juste avant la congélation, on reprend les culots dans quelques

µL (volume à volume) de Dextran de haut poids moléculaire à 40% (dilution finale < 20%).

Les facteurs de dilution ont été mis au point afin que les échantillons soient suffisamment

concentrés pour l’observation, mais pas trop concentrés pour éviter la nucléation des cristaux

de glace sur les minéraux présents dans les cultures.

- On dépose une goutte de l’échantillon dans une planchette en aluminium, préalablement

recouverte d’hexadécène (92%) pour faciliter la congélation.

- On insère la planchette dans le porte-échantillon.

- On effectue la congélation à haute pression dans un congélateur Bal-Tech (Congélation

effectuée sur la plateforme de microscopie ultrastructurale de l’Institut Pasteur, Paris).

- Les planchettes congelées sont conservées dans l’azote liquide jusqu’à l’étape de coupe en

cryo-ultramicrotomie.

Page 147: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

147

Figure 1D-1. Coupe d’un échantillon à l’aide d’un cryo-ultramicrotome pour le CEMOVIS.

L’échantillon a été préalablement vitrifié dans un porte-échantillon (ici un tube en cuivre.

Dans le cadre de nos expériences, les échantillons étaient congelés dans des planchettes en

aluminium). Le porte échantillon est placé dans le bras articulé de l’ultramicrotome. Une

pyramide est taillée à sa surface (dimensions : ~ 20×20 µm²) à l’aide d’un couteau spécifique

(Cryotrim). Le passage de cette pyramide à plusieurs reprises sur la lame du couteau diamant

(bas) produit des rubans de coupes de l’échantillon. On peut préparer de nombreux rubans de

4-5 coupes (cf photo) ou un long ruban que l’on dépose au fur et à mesure qu’il est coupé sur

la grille MET. Dans tous les cas, la récupération des coupes est effectuée à l’aide d’un cil.

L’ensemble de ces opérations se déroule dans le chambre refroidie du cryo-ultramicrotome (-

140 °C).

rubans de coupes

Lame du couteau (diamant)

Bras articulBras articuléé de lde l’’ultramicrotomeultramicrotome

Porte-échantillon en cuivre

(tube)Echantillon

vitreux(noir)

Pyramide

rubans de coupes

Lame du couteau (diamant)

Bras articulBras articuléé de lde l’’ultramicrotomeultramicrotome

Porte-échantillon en cuivre

(tube)Echantillon

vitreux(noir)

Pyramide

Page 148: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

148

• Coupe des échantillons à froid. La coupe des échantillons vitrifiés a été réalisée à

l’aide d’un cryo-ultramicrotome Leica UC6-FC6 au Laboratoire de Physique des Solides

d’Orsay (Amélie Leforestier). Pour éviter la dévitrification des échantillons, la température de

l’ultramicrotome doit nécessairement rester inférieure à -135 °C. Nous travaillons donc dans

les vapeurs d’azote avec des outils tous préalablement refroidis (dans la chambre de

l’ultramicrotome ou dans l’azote liquide). Le moindre contact de l’échantillon avec un outil

non refroidi conduit à la dévitrification immédiate de l’échantillon. Lors de nos expériences,

nous avons systématiquement travaillé dans une chambre à -140 °C. Un des problèmes

important auquel nous sommes confrontés lors de la pratique de la cryo-ultramicrotomie est la

contamination par l’eau atmosphérique qui cristallise sous forme de neige dans

l’ultramicrotome et éventuellement sur l’échantillon (Figure 1D-2C). Pour limiter cette

contamination, le cryo-ultramicrotome est donc installé dans une pièce en atmosphère sèche

(humidité relative < 30%).

Une fois l’épaisseur d’aluminium coupée (à l’aide d’un cryotrim en carbure de

tungstène), une pyramide est taillée dans l’échantillon (à l’aide d’un cryotrim 45° diamant),

de préférence dans des zones non fracturées (Figure 1D-1). Le sommet de la pyramide est

ensuite taillé à l’aide d’un couteau diamant et des coupes de 50 nm d’épaisseur sont collectées

sur le couteau (vitesse de coupe : 0.4 nm/sec). Contrairement au principe de l’ultramicrotomie

à température ambiante, où les coupes sont collectées à la surface de l’eau remplissant un

réservoir à l’arrière du couteau, les coupes vitreuses sont directement prélevées sous forme de

rubans sur la lame de couteau à l’aide d’un cil, et déposées sur une grille MET recouverte

d’un film de carbone (membranes Lacey). Les coupes doivent être autant que possible étalées

sur la grille MET. Cette opération est rendue d’autant plus délicate qu’une forte électricité

statique règne généralement dans la chambre de l’ultramicrotome en raison de la très basse

température. Pour la limiter, un appareil antistatique est placé face au couteau lors de la coupe

et de la récupération des coupes.

Les coupes sont ensuite pressées sur la grille préalablement déposée sur un film

d’indium (pour favoriser l’adhésion des coupes). Cette étape est, elle aussi, cruciale. En effet,

une parfaite adhésion des coupes à la membrane de carbone est requise pour éviter que les

coupes ne bougent lors de l’imagerie en cryo-microscopie électronique (drift, Figure 1D-2D).

Les grilles sont ensuite stockées dans l’azote liquide jusqu’à observation au cryo-MET.

• Imagerie en cryo-microscopie électronique à transmission. Les grilles sont chargées

sur un porte-échantillon dans une chambre de transfert remplie d’azote liquide. Le porte-

Page 149: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

149

échantillon est ensuite inséré dans le microscope, dont la colonne a été préalablement

refroidie (~ -180 °C). L’imagerie en cryo-microscopie électronique à transmission est

particulière, puisqu’elle est effectuée sous faible dose d’électrons, afin de limiter les dégâts

d’irradiation sur les coupes vitreuses. En conséquence, les images obtenues présentent un

faible contraste. Plusieurs types de dégâts d’irradiation peuvent être observés en cas de trop

longue ou trop forte exposition aux électrons :

- Amorphisation (si présence de glace cristalline).

- Bubbling, lié à la libération de radicaux libres par la matière organique (Figure 1D-2E

et F). Il peut être utilisé pour vérifier la présence de matière organique associée à des

phases minérales.

- Sublimation de l’eau conduisant à une perte de masse. Ce dégât d’irradiation

augmente le contraste mais diminue fortement la résolution.

Pour éviter ces dégâts d’irradiation, une dose d’environ 10 électrons par Ų est couramment

utilisée. De plus, afin de limiter le temps d’exposition, la mise au point est effectuée sur une

zone différente de la zone à imager, et un nombre minimum d’images est pris sur une zone

donnée.

L’état vitreux des coupes est contrôlé en acquérant un diagramme de diffraction

électronique dans la coupe. Une glace vitreuse (Figure 1D-2B) présente des anneaux diffus.

Des spots de diffraction apparaissent lorsque la glace est cristalline.

La résolution maximale qui peut être obtenue en cryo-TEM est de l’ordre de 9-15 Å.

Des séries focales sont réalisées (défocalisation à différents ∆z) afin d’imager les structures

d’intérêt.

Les images obtenues nécessitent une interprétation, en particulier des artefacts induits par

la coupe (Figure 1D-2) :

- Les marques de couteau, très superficielles (donc n’affectant pas la structure des objets

congelés), indiquent la direction de coupe (Figure 1D-2G). Ces marques disparaissent

lorsque la zone a reçu une dose trop forte d’électrons. Cet artefact est donc un bon

indice de la dose d’électrons reçue par la zone imagée.

- La compression modifie l’épaisseur des structures coupées dans une direction (dans la

direction de coupe, indiquée par les marques de couteau, Figure 1D-2G). Elle dépend

de l’épaisseur de la coupe et de l’angle du couteau. Elle est cependant

unidirectionnelle et localement assez constante. Elle peut être quantifiée en comparant

l’épaisseur de structures organiques (par exemple la paroi cellulaire) dans la direction

de coupe (maximum de compression) et dans la direction orthogonale (minimum de

Page 150: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

150

compression). Cette compression doit être prise en compte lors de la détermination de

l’épaisseur de structures cellulaires.

- Les crevasses, limitées pour les coupes moins épaisses (< 50 nm), indiquent le sens de

la coupe (Figure 1D-2H). Elles peuvent fortement détériorer l’organisation interne des

structures coupées.

- Les ondulations à grande distance (~500 nm) sont liées à des problèmes de vibration

lors de la coupe. Elles peuvent être contrôlées en jouant sur la vitesse de coupe.

bc

c

mc

5 µm

A

100 nm

D

C

g

100 nm

mc

E

b

100 nm

F

b

mc

100 nm

Marques de couteau

-

Direction

de coupe

Compression

Mesure d’épaisseur

G

100 nm

H

Sens de coupe

Aplati

Courbé

500 nm

B

100 nm

g

bc

c

mc

5 µm

A

100 nm

D

C

g

100 nm

mc

E

b

100 nm

F

b

mc

100 nm

Marques de couteau

-

Direction

de coupe

Compression

Mesure d’épaisseur

G

100 nm

H

Sens de coupe

Aplati

Courbé

500 nm

B

100 nm

bc

c

mc

5 µm

A

100 nm

D

C

g

100 nm

mc

E

b

100 nm

F

b

mc

100 nm

Marques de couteau

-

Direction

de coupe

Compression

Mesure d’épaisseur

G

100 nm

H

Sens de coupe

Aplati

Courbé

500 nm

B

100 nm

bc

c

mc

5 µm

A

bc

c

mc

5 µm

A

100 nm

D

100 nm

D

C

g

100 nm

mc

C

g

100 nm

mc

E

b

100 nm

E

b

100 nm

F

b

mc

100 nm

F

b

mc

100 nm

Marques de couteau

-

Direction

de coupe

Compression

Mesure d’épaisseur

G

100 nm

Marques de couteau

-

Direction

de coupe

Compression

Mesure d’épaisseur

G

100 nm

H

Sens de coupe

Aplati

Courbé

500 nm

H

Sens de coupe

Aplati

Courbé

500 nm

B

100 nm

B

100 nm

g

Figure 1D-2. Principaux artefacts de coupe et dégâts d’irradiation interprétés dans des

cryosections. (A) : Vue à bas grandissement d’une cryosection (c) déposée sur une grille

MET (bc=barreau de cuivre de la grille MET), recouverte d’une membrane de carbone à trous

(mc) de type Lacey. (B) : Détail d’une cryosection partiellement dévitrifiée, aspect de la

Page 151: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

151

glace cristallisée. (C) : Contamination à la surface d’une cryosection : dépôt d’un cristal de

glace (g). (D) : Drift. L’encart montre la transformée de Fourier de la zone imagée, qui

présente une anisotropie marquée dans la direction de déplacement de la coupe. (E) et (F) :

Bubbling (b) de la matière organique respectivement dans une vésicule lipidique et dans des

filaments polysaccharidiques partiellement minéralisés. (G) : Utilisation des marques de

couteau pour déterminer la direction de coupe. Mise en évidence de la compression

orthogonalement à la direction de coupe et indication de la zone où pourrait être mesurée une

épaisseur. (H) : Mise en évidence du sens de coupe et interprétation des déformations subies

par les cellules (aplatissement et courbure).

• Structures cellulaires identifiables en CEMOVIS. Contrairement aux méthodes

classiques d’inclusion en résine (voir Protocoles p. 261), le CEMOVIS préserve les

échantillons dans un état hydraté-congelé, sans aucun traitement chimique préalable. Des

structures habituellement dégradées par les traitements chimiques imposés par l’inclusion en

résine peuvent alors être observées. En particulier, toute la complexité de la structure de la

paroi cellulaire est révélée par cette technique (Figure 1D-3A et B). On peut en effet

distinguer la présence d’une ligne de granules légèrement plus denses que le dextran dans le

périplasme, i.e. l’espace compris entre la membrane plasmique et la membrane externe. En

outre, des structures extracellulaires telles que des exopolysaccharides, peuvent également

être préservés, tandis qu’ils sont presqu’inévitablement dégradés par les méthodes d’inclusion

en résine. Différentes structures peuvent être distinguées dans le cytoplasme des bactéries :

des inclusions lipidiques (stockage intracellulaire), l’ADN partiellement condensé, les

ribosomes (Figure 1D-3C). Enfin, les différents stades de la division cellulaire, incluant la

mise en place de septae (invagination de la paroi cellulaire qui se met en place lors de la

division cellulaire), peuvent également être imagés (Figure 1D-3D et E).

Page 152: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

152

100 nm

Mem

bran

e in

tern

e

Mem

bran

e ex

tern

e

Pep

tidogl

ycan

e

Pér

ipla

sme

50 nm

ADN

VL

r

100 nm 500 nm

mc

100 nm

A B

C D E

100 nm

Mem

bran

e in

tern

e

Mem

bran

e ex

tern

e

Pep

tidogl

ycan

e

Pér

ipla

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50 nm

ADN

VL

r

100 nm 500 nm

mc

100 nm

A B

C D E

100 nm

Mem

bran

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tern

e

Mem

bran

e ex

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Pep

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50 nm

ADN

VL

r

100 nm 500 nm

mc

100 nm

100 nm

Mem

bran

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e

Mem

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Pep

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e

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ipla

sme

50 nm

ADN

VL

r

100 nm 500 nm

mc

100 nm

100 nm100 nm

Mem

bran

e in

tern

e

Mem

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tern

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e

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sme

50 nm

Mem

bran

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e

Mem

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Pep

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sme

50 nm

ADN

VL

r

100 nm

ADN

VL

r

100 nm 500 nm

mc

500 nm

mc

100 nm100 nm

A B

C D E

Figure 1D-3. Structures cellulaires observables en CEMOVIS. Images de cryosections de

BoFeN1. (A) et (B) : Structure de la paroi cellulaire. Dans le périplasme, localisée entre la

membrane plasmique et la membrane externe, une ligne de granules correspondant au

peptidoglycane peut être observée. (C) : Cellule dans le cytoplasme de laquelle on peut

observer des vésicules lipidiques (VL), l’ADN partiellement condensé et de nombreux

ribosomes (r). (D) : Fin de division d’une cellule (flèche). (E) : Mise en place d’un septum

lors de la division dans une bactérie en cours d’encroûtement (flèches).

g : cristaux de glace. mc : membrane de carbone.

Page 153: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

153

Principaux résultats et perspectives.

Fossilisation de protéines. La paroi cellulaire des bactéries non minéralisées est constituée

d’une membrane plasmique et d’une membrane externe délimitant un périplasme d’une

épaisseur de 41.6±7.2 nm, à l’intérieur duquel on distingue une ligne de granules de 6.6±1.4

nm d’épaisseur correspondant au peptidoglycane. Le peptidoglycane est un polymère de

glycosaminopeptide (liaison de N-acétyl-glucosamine avec l'acide N-acétyl-muramique par

des liaisons osidiques et liaison des chaines osidiques par des peptides) et assure la forme des

cellules ainsi qu’une protection mécanique et physique (e.g. Meroueh et al., 2006). Dans des

cellules complètement minéralisées, on observe que l’épaisseur du périplasme est préservée et

qu’une couche centrale de 6.2±1.5 nm persiste. Nos résultats suggèrent donc qu’il s’agit du

peptidoglycane et qu’il est préservé malgré la formation d’une couche de minéraux riches en

fer dans le périplasme.

Par ailleurs, les résultats de STXM obtenus au seuil K du C indiquent que des protéines sont

effectivement accumulées dans le périplasme des bactéries minéralisées. Les quantités de fer

et de protéines dans le périplasme de ces cellules sont corrélées linéairement, suggérant que

les protéines servent de point de nucléation aux minéraux riches en fer, dont la croissance est

limitée ou inhibée. Ces assemblages protéine-minéral sont directement visualisés en

CEMOVIS, les protéines apparaissant sous forme de globules de 8.2±1.8 nm de diamètre.

L’ensemble de ces résultats prouve que des protéines peuvent être fossilisées et les structures

cellulaires très fines comme le peptidoglycane préservées par des biominéralisations massives

de fer.

Etapes de la biominéralisation du fer dans le périplasme. Les étapes de la biominéralisation

du fer dans le périplasme de BoFeN1 ont été suivies en CEMOVIS. On observe que la

biominéralisation du fer débute dans le périplasme à la surface de la membrane plasmique ou

de la membrane externe. Les premiers nuclei de fer sont localisés en des points discrets de la

membrane. Leur croissance dans le périplasme s’effectue jusqu’à remplissage de toute

l’épaisseur de l’espace périplasmique. La couche biominéralisée de fer est alors discontinue

dans le périplasme. Enfin, à des stades tardifs, le périplasme est totalement encroûté et comme

indiqué précédemment, le peptidoglycane est préservé. Cette succession d’étapes est

cohérente avec les études génétiques de Croal et al. (2007) suggérant la localisation

périplasmique des enzymes impliquées dans l’oxydation du fer chez la souche phototrophe

SW2. En effet, même si cette interprétation reste très indirecte, on peut proposer que les sites

où l’on observe le début de nucléation des phases riches en fer correspondent à ces sites

Page 154: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

154

d’oxydation du fer. Dans ce cas, on observe une répartition discontinue des sites d’oxydation

du fer, qui pourrait expliquer la discontinuité de la couche minérale formée à des stades

intermédiaires de biominéralisation.

En complément, il serait intéressant dans le futur d’observer des cellules de la souche

phototrophe SW2 en CEMOVIS afin de tester si d’éventuelles différences morphologiques

(en particulier au niveau de la paroi cellulaire) pourraient expliquer les différences de motifs

de biominéralisation observés entre ces deux souches et afin d’étudier plus en détail

l’ultrastructure des fibres mises en évidence par STXM chez SW2 (Chapitre 1C) ainsi que la

disposition des premiers nuclei de goethite sur ces fibres.

Spectromicroscopie X en conditions hydratées. En complément des résultats présentés dans

l’article qui suit et toujours dans le souci d’observer et d’analyser les cellules biominéralisées

dans des conditions proches des conditions natives, nous avons initié des analyses en STXM

en conditions hydratées. Ces observations préliminaires ont été effectuées au Canadian Light

Source. Les échantillons ont été préparés en boîte à gants, en déposant une goutte de

l’échantillon entre deux fenêtres de nitrure de silicium, scellées avec de l’Epoxy et transférées

en conditions anoxiques dans la chambre du STXM (sous pression atmosphérique d’hélium).

Au seuil K du C, des filaments organiques extracellulaires, similaires aux filaments

d’exopolysaccharides décrits précédemment (voir Chapitre 1A) ont été observés (Figure 1D-

4). Au seuils L2,3 du Fe, on observe cependant que les échantillons pourtant précoces (4 h

après inoculation des souches en présence de Fe(II) dissous) sont très oxydés (Figure 1D-4). Il

est très probable que les dégâts d’irradiation sous le faisceau sont plus importants en

conditions hydratées qu’à sec (en raison de la déshydratation de l’échantillon et des réactions

de photolyse de l’eau). Ces dégâts devront être quantifiés dans le futur afin de tester la

possibilité d’utiliser ce dispositif expérimental pour la détermination du redox du fer en

conditions hydratées à l’échelle sub-micrométrique.

Page 155: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

155

Figure 1D-4. Analyse STXM dans l’eau de cellules de BoFeN1 cultivées en présence de

Fe(II) dissous et prélevées 4 h après inoculation. A : Cartographie du carbone organique

obtenue en faisant la soustraction d’une image acquise à 320 eV d’une image acquise à 280

eV. On observe la présence de filaments organiques extracellulaires entre les deux cellules.

B : Cartographie du Fe(II) (bleu) et du Fe(III) (rouge) sur une cellule partiellement

minéralisée. Une décomposition linéaire des spectres XANES enregistrés sur cette bactérie

indique qu’elle est composée à ~ 75% de Fe(III).

200 nm1 µm

A B

200 nm1 µm 200 nm1 µm

A B

Page 156: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

156

Page 157: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

157

Looking at the first stages of bacteria fossilization: evidences for the preservation of

proteins and cellular ultra-fine structures in microfossils.

Jennyfer Miot, Kirsty MacLellan, Guillaume Morin, Nicolas Boisset, Karim Benzerara.

Institut de Minéralogie et de Physique des Milieux Condensés, Institut de Physique du Globe

de Paris, UMR 7590, CNRS, Universités Paris 6 et Paris 7.

140, rue de Lourmel. 75 015 Paris, France.

Page 158: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

158

Fossilization is an exceptional process that can preserve very precisely the cellular

structures of multicellular eukaryotes through the replacement of organic matter by

minerals, as exemplified by the famous fossils of soft-bodied organisms from Ediacara

(e.g. Hagadorn et al., 2006, Raff et al., 2006, Yin et al., 2007). In contrast, deciphering

organic remains or imprints of prokaryotes in recent, ancient and extraterrestrial rocks

has been much more challenging and highly debated in the past (e.g. Schopf et al., 2002,

Brasier et al., 2002). This partly relies on the common belief that only very few details of

the ultrastructure of bacteria can be preserved by fossilization. Using a combination of

synchrotron-based X-ray microscopy and transmission electron cryo-microscopy, we

provide here an unprecedented view of protein-mineral assemblages formed during the

very first steps of fossilization of iron-oxidizing bacteria. Iron minerals precipitated

within the periplasm of these Gram-negative bacteria entomb protein globules as well as

the peptido-saccharidic polymers constituting the peptidoglycan. This provides strong

constraints on the mechanisms of biomineralization of microorganisms and highlights

very fine biochemical and structural details from bacteria that can be preserved during

the early stages of fossilization and that may have been overlooked so far.

Page 159: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

159

The finding of microfossils and/or mineral by-products formed by iron-oxidizing

bacteria may constitute evidences for the crucial role these bacteria may have played in the

past geochemical cycles and especially in the formation of Proterozoic massive iron deposits

known as Banded Iron Formations (Little et al., 2004, Konhauser, 1998; Kappler et al., 2005;

Posth et al., 2008). Indeed, iron-oxidizing bacteria produce a wide diversity of iron

biominerals with unique morphologies (Fortin & Langley, 2005). However, those criteria

remain ambiguous as complex morphologies can also be produced by abiotic processes

(Garcia-Ruiz et al., 2003). Iron minerals precipitated by iron-oxidizing bacteria in acidic or

pH-neutral environments are usually in close association with organic templates (Chan et al.,

2004, Miot et al., 2008) and may protect this organic matter from subsequent degradation

during diagenesis or thermal metamorphism (e.g. Kaiser & Guggenberger, 2000). However,

the fineness of the preservation of the organic structures achieved during the very first stages

of fossilization remains unevaluated. Here, we simulate experimentally the taphonomy of

anaerobic neutrophilic Fe-oxidizing bacterial cells by incubating them under specific

conditions where they biomineralize and thus form microfossils. We then analyse the

preservation of their ultrastructure down to the few nm-scale.

We used the anaerobic iron-oxidizing bacteria strain BoFeN1 (Kappler et al., 2005a)

that couples Fe(II) oxidation to nitrate reduction. Due to its high insolubility at neutral pH

(Cornell & Schwertmann, 2003), Fe(III) precipitates instantaneously within the periplasm of

the cells (Miot et al., 2008). The progressive mineralization of BoFeN1 cells was imaged

along the time course of a culture (5 hours to 2 weeks) using thin vitreous cryo-sections

prepared by high-pressure freezing and cryo-ultramicrotomy. Cryo-Electron Microscopy Of

VItreous Sections (CEMOVIS) was used to visualize directly cellular ultrastructures at the

nanometer-scale in their near-native frozen-hydrated state (Dubochet et al., 1983). Non-

mineralized cells observed by CEMOVIS can be observed at every stage of the culture and

exhibit numerous ribosomes, appearing as dense nanometric particles in the cytoplasm, as

well as large electron dense poly-β-hydroxy-butyrate storage granules (Fig. 1A). Additionally,

the cell wall of these cells shows an inner membrane and an undulating outer membrane

enclosing the periplasm. An electron dense granular layer corresponding to the peptidoglycan

can be observed within the periplasmic space (Zuber et al., 2006).

Page 160: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

160

Figure 1. CEMOVIS images of BoFeN1 cells at different stages of cell encrustation. A:

Non-mineralized cells. b and c: Mineralization starts at discrete places on the plasmic

membrane, within the periplasm. d: The mineral layer inside the periplasm is initially

discontinuous and grows in thickness. e: Heavily mineralised cells present a completely

mineralized periplasm. Scale bars: 100 nm.

After a few hours of culture in the presence of Fe(II), iron biomineralization intiates at

discrete sites within the periplasm, with iron nanoparticles attached to the periplasmic face of

the inner membrane (Fig. 1B). These particles then aggregate in a discontinuous layer along

the plasmic membrane (Fig. 1C). This layer grows in thickness within the periplasm until

reaching the contact with the outer membrane (Fig. 1D). At ultimate stages (~ 24 hours), the

Page 161: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

161

periplasm is completely and continuously encrusted with iron minerals (Fig. 1E). In the latest

stages of biomineralization, iron-rich globules start forming at the outer surface of the cells.

Recent genetic and biochemical studies of the anaerobic phototrophic iron-oxidizing bacterial

strain SW2 suggest that proteins involved in the pathway of iron oxidation may have a

periplasmic location (Jiao & Newman, 2007). Given the high insolubility of Fe(III) at neutral

pH, Fe oxidation and the precipitation of Fe(III) by-products may occur at the same location.

Hence, supporting Jiao & Newman (2007) results, the discrete sites on the inner membrane

where biomineralization is shown to initiate in BoFeN1 cells may correspond to the sites of

active iron oxidation.

Cells at the latest stages of biomineralization (older than 1 day) are good

candidates to represent microfossils that could be looked for in the fossil record: highly

insoluble iron-minerals fill the whole periplasm and hence preserve the morphology of these

cells. By acquiring iron and carbon maps with a 25-nm spatial resolution using STXM, we

moreover observed that organic molecules are fossilized by iron-minerals within the

periplasm of BoFeN1 cells (Fig. 2). In addition, NEXAFS (Near-Edge X-ray Absorption Fine

Structure) spectra measured at the C K-edge on mineralized cells show that this organic

carbon trapped within Fe-minerals in the cell wall corresponds mainly to proteins. In contrast,

non-mineralized cells exhibit a fairly homogeneous distribution of proteins within the

cytoplasm and the cell wall. Eventually, we demonstrate a linear correlation between the iron

and the protein contents within the cell wall of Fe-mineralized cells (Fig. 3). This supports

unambiguously the association of Fe-minerals with proteic moieties at the nanometer-scale.

Page 162: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

162

Figure 2. Overlay organic carbon- and iron-maps of mineralized and non mineralized cells

and corresponding XANES spectra at the C K-edge compared with reference albumin. The

periplasm of mineralized cells is enriched in proteic moieties. Scale bar: 500 nm.

Figure 3. Fe and organic C correlations on mineralized BoFeN1 cells, demonstrating the

linear relation between the Fe and organic carbon contents on these cells.

These protein-Fe associations were further studied down to the nanometre scale using

CEMOVIS. In non-mineralized cells (e.g. BoFeN1 cell grown without Fe(II)), the periplasm

has a thickness of 41.6±7.2 nm and encloses the peptidoglycan that appears as a 6.6±1.4 nm-

thick electron-dense granular layer (Fig. 4A). The periplasm and the peptidoglycan are

perfectly preserved in completely mineralized cells. First, the periplasm thickness (39.4±7.7

Page 163: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

163

nm) in mineralized cells is similar to the one measured in non-mineralized cells. Second, the

peptidoglycan can be recognized in the mineralized cells as it exhibits the same thickness

(6.2±1.5 nm), the same absolute electron density (which appears electron-transparent

relatively to surrounding electron-dense iron-rich minerals) and the same relative position

within the periplasm relatively to the two membranes as in non-mineralized cells. Finally, the

periplasm of highly mineralized cells shows a very granular texture (Fig. 5) with numerous

round-shaped granules of low density to electrons that measure 8.2±1.8 nm in diameter.

Based on STXM analyses and on their morphology, size and density to electrons, these

granules can be unambiguously identified as globular proteins encapsulated within iron

biominerals.

The identity of the proteins stored within the periplasm of BoFeN1 is not known but

reference to known proteins which notoriously impact the biomineralization of iron provides

some ideas on the possible processes that might account for the formation of the mineral-

protein assemblages evidenced in the present study. For example, proteins such as DNA-

protecting proteins during starvation (Dps) or eubacterial ferritins, which have a similar

morphology and size (inner and outer core diameter of 12 and 8 nm respectively) with the

granules observed in BoFeN1 (Fig. 5) can store up to 1000 iron atoms, in the form of

ferrihydrite or Fe-phosphate in Bacteria (Chasteen & Harrison, 1999) and Archea (Zeth et al.,

2004). Similarly, specific proteins such as those ferritins or the protein Mms6 in the

magnetotactic bacteria Magnetospirillum magneticum AMB-1 can act as an organic template

for iron mineral nucleation (Chasteen & Harrison, 1999, Zeth et al., 2004, Amemiya et al.,

2007). Based on what is known from these model proteins, the following scenario of iron

biomineralization in BoFeN1 periplasm can be proposed: iron nucleation initiates on

negatively charged residues exposed on the inner face of the proteins bound to the periplasmic

face of the inner membrane. At the same time, proteins progressively accumulate within the

periplasm, most probably upon cell aging (Lindner et al., 2008) and serve as additional sites

for iron nucleation. Once the iron nanoparticles have reached a critical size, mineral growth

proceeds, but is limited and results in very small mineral phases. This scenario is consistent

with the linear relationship between Fe and protein contents evidenced in mineralized

BoFeN1 cells and with the subtleness of the preservation of cellular ultrastructures.

Page 164: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

164

Figure 4. Histograms of the intensity of electron density along A-B profiles in the cell wall

of non-mineralized (A) and mineralized (B) BoFeN1 cells (CEMOVIS images). The location

and thickness of the plasma membrane, the outer membrane and the periplasm are displayed.

The periplasm and the peptidoglycan are preserved in heavily mineralized cells. Scale bars:

100 nm.

Page 165: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

165

Figure 5. CEMOVIS image of a mineralized BoFeN1 cell highlighting the presence of

electron-transparent globules of 8.2 ± 1.8 nm in diameter (inset) interpreted as protein

globules. Scale bar: 100 nm.

Whereas usual criteria of biogenicity rely on morphology or isotopic fractionations

(that are often difficult to attribute unequivocally to bacterial activity, especially in the case of

iron fractionation, Croal et al., 2004), processes such as iron biomineralization appear to be

efficient in sequestering organic molecules within iron minerals and in preserving very fine

ultrastructures such as the peptidoglycan. Although the preservation of such features after

diagenesis and metamorphism has yet to be investigated, proteins and the peptidoglycan

might be efficiently preserved by the iron minerals that armour them (e.g. Kaiser &

Guggenberger, 2000) and the latter in turn might be protected from recrystallization by

organic molecules (Kennedy et al., 2004).

High-resolution (spectro)microscopy analyses on modern bacterial systems should

promote a better understanding of the mechanisms of biomineralization and improve our

knowledge of potential biosignatures that might be looked for in the geological record.

Page 166: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

166

Materials and Methods.

Bacterial strain and growth conditions

The nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing strain BoFeN1, isolated from Lake Constance littoral

sediments (Kappler et al., 2005a), was cultivated in freshwater mineral medium prepared after

Ehrenreich & Widdel (1994), containing 4.3 mM phosphate. BoFeN1 was grown in this

medium complemented with 5 mM acetate (provided as sodium acetate) and 10 mM nitrate

(provided as sodium nitrate) in the presence or absence of Fe(II) (provided as FeCl2). The

addition of Fe(II) at a total concentration of 10 mM led to the precipitation of a white Fe-rich

precipitate resulting in a dissolved Fe(II) concentration of ~ 3 mM. For each culture, 25 mL of

medium were transferred into a 58 mL serum bottle that was flushed with N2/CO2 (80% /

20%), closed with a butyl rubber stopper and crimped. BoFeN1 was inoculated at 10% from

an acetate-nitrate-grown culture (culture without iron). Cultures were incubated at 30°C. For

X-ray Absorption Spectroscopy (XAS), X-ray Diffraction (XRD) and Scanning Transmission

X-ray Microscopy (STXM) analyses, samples of the same culture were taken in an O2-free

glove-box (pO2 < 50 ppm) at several time steps.

Synthesis of model compounds

The Fe redox state of the samples was determined at the submicrometer-scale by using

STXM at the Fe L2,3-edges. The Fe(II) and Fe(III) reference end-members used for this study

were pure Fe(II)- and Fe(III)-phosphates. Both were synthesized under anoxic conditions.

Fe(II)-phosphate was obtained by addition of 10 mM Fe(II) (as FeCl2), 5 mM acetate and 10

mM nitrate in the growth medium, which led to the precipitation of a whitish Fe(II)-phosphate

phase. Fe(III)-phosphate was obtained by the addition of 10 mM Fe(III) (as FeCl3), 5 mM

acetate and 10 mM nitrate in the growth medium. Both precipitates were rinsed twice with

degassed distilled water and dried under vacuum inside an anoxic glove-box.

Scanning Transmission X-ray Microscopy.

The samples were constantly kept under an anoxic atmosphere from preparation to

transfer and analysis within the STXM microscope, following the method detailed in Miot et

al. (2008). The entire preparation was performed in an anoxic glove-box. 1 mL of a

suspension of BoFeN1 culture (or of reference compounds) was sampled at different stages of

each culture (3 h to 15 days). Each sample was rinsed twice in degassed distilled water. 0.3

µL of each sample was dried on a silicon nitride window, then sandwiched by addition of a

Page 167: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

167

second silicon nitride membranes (Norcada Inc., Canada), the whole sealed under an anoxic

atmosphere using epoxy.

STXM analyses were performed at the spectromicroscopy beamline 10ID-1 at the

Canadian Light Source (CLS, Saskatoon). The beamline 10ID-1 at the CLS was described in

detail by Kaznatcheev (2007). This beamline has an energy resolving power E/∆E > 3000.

The energy scales for this study were calibrated using the well-resolved 3p Rydberg peak of

gaseous CO2 for the C K-edge and the major peak of hematite at 708.7 eV for the Fe L3-edge.

Image stacks were acquired at the C K-edge and at the Fe L2,3-edges. They were

performed by scanning the sample in the x-y direction at each energy increment over the

energy range of interest. Potential sample damages caused by the incident photon beam (i.e.

changes of the Fe redox state) were quantified by monitoring spectral changes at the Fe L2,3-

edge with increasing dwell times up to several tens of ms (Miot et al., 2008). However, no

significant changes were observed for typical dwell times used during analyses of the samples

(i.e. around 0.8 ms per energy- and image-point). The aXis2000 software-package

(Hitchcock, 2001) was used for processing image stacks and NEXAFS spectra. Images were

recorded on transmission scale and converted into optical density (OD) according to Equation

(2).

OD = -ln(I/I0) (Eqn. 2)

wherein I represents the measured intensity at the point of interest and I0 represents the

intensity outside the sample that includes the absorption by silicon nitride windows.

XANES spectra were extracted from the stacks on regions of interest. For Fe L2,3-

edges spectra, we normalized the area below the L2 and L3 edges to 1 and multiplied the

absorbance of the compounds containing mainly Fe(II) (major peak at 707 eV) by a 4/5

correction factor to take into account the difference in the occupancy of the 3d orbitals in Fe2+

and Fe3+

ions, neglecting the variation of radial integrals (Thole et al., 1994). We fitted the

normalized spectra with linear combinations of the normalized reference spectra of the Fe(II)-

and Fe(III)-phosphate model compounds, applying the CGO (Conjugate Gradient

Optimization method) curve fit routine in Axis2000. Fit results allowed estimating the

Fe(III)/Fe(total) content of regions of interest. Standard deviations (SD) were calculated from

the deviation between the fit and the data and were systematically less than 1%.

Spectra recorded at the C K-edge were normalized to 1-nm thickness and fit with

normalized reference albumin (protein) and xanthan (polysaccharide).

Using aligned stacks recorded at the Fe L-edges and at the C K-edge on the same area

and normalized reference spectra, we calculated Fe and C-speciation maps from image stacks

Page 168: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

168

by singular value decomposition using the stack fit routine in aXis2000. The algorithm fits the

spectra of each individual pixel with a linear combination of the two normalized reference

spectra plus a constant, accounting for the absorption background. We subsequently obtained

numbers that are proportional to the amount of iron and of organic carbon for each pixel of

this area. Those values are then used to plot the amount of C relatively to the amount of Fe at

each pixel of the area (~2500 pixels in total) and assess the existence of possible correlations

(see Wan et al., 2007 for additional explanations).

Vitrification and high pressure freezing.

Samples of BoFeN1 grown in the presence or absence of Fe(II), as described above, were

mixed with high molecular weight dextran (approximate mass 40kDa, Sigma-Aldrich, Buchs,

Switzerland) to give a 20% solution (v/v). Samples were placed into an aluminum planchette

with (Ø 2.0 mm sample cavity depth 100 µm; Waldner, Uetliburg, Switzerland) prior to

vitrification in a HPM 010 high pressure freezer (Bal-Tech, Baltzers, Liechtenstein).

Cryosectioning.

The planchettes were loaded into a FCS Ultracut S cryomicrotome held at -140°C (Leica) and

were trimmed at -140°C using a tungsten knife (Leica) followed by a diamond knife

(Diatome). Ultrathin sections were produced with a 35° cryo-immuno diamond cutting knife

(Diatome, Biel, Switzerland) at a nominal feed of 50 nm with a cutting speed of 0.8 mm/s.

Cryo-electron microscopy of vitreous sections.

Sections were transferred onto Lacey carbon covered 1,000-mesh copper grids (Agar

Scientific, Essex, United Kingdom). The grids were transferred into a Gatan cryo-holder

(Gatan, Warrendale, PA) kept at a temperature below −170°C and inserted into a Jeol 2100F

cryo-electron microscope (Jeol) equipped with a LaB6 cathode at an accelerating voltage of

200 kV. The electron dose was kept to a minimum during observation and recording. Images

were recorded at nominal magnifications ranging from 7,000 to 25,000 using a 2K CCD

camera (Gatan Inc, USA).

Page 169: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

169

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Page 171: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

171

Chapitre 1.E.

Etude préliminaire de la viabilité des cellules BoFeN1 lors de la

biominéralisation du fer

Problématique et objectifs. Au cours des chapitres précédents, nous avons abondamment

analysé les processus de biominéralisation au cours de l’oxydation du Fe(II) par BoFeN1. En

particulier, la précipitation de minéraux riches en fer dans le périplasme a été mise en

évidence (Chapitre 1A) et les étapes de cet encroûtement périplasmique ont été détaillées

(Chapitre 1D). La minéralisation du périplasme soulève cependant des questions

fondamentales d’importance. En effet, le périplasme est le lieu de transit de l’ensemble des

molécules prélevées ou exportées par la cellule depuis ou vers le milieu extérieur, en

particulier les nutriments et les déchets ou molécules toxiques (Nikaido, 2003). Son

encroûtement pourrait donc limiter les échanges avec le milieu extracellulaire. En

conséquence, l’encroûtement périplasmique de la bactérie BoFeN1 pourrait être létal.

Pourtant, nous avons fait différentes observations troublantes vis-à-vis de ce problème : tout

d’abord, il semble que l’on peut propager cette culture sur plusieurs générations, ce qui

indique qu’il reste des cellules vivantes même après plusieurs repiquages. De plus, nous avons

par exemple observé en microscopie de nombreuses cellules encroûtées en cours de division

(Figure 1E-2), ce qui pourrait signifier soit que l’encroûtement est plus rapide que le

processus de division, soit qu’une cellule peut se diviser même lorsqu’elle encroûtée. Enfin,

alors que certains ont proposé que l’encroûtement chez BoFeN1 est létal (peut-être en raison

d’une moins bonne adaptation de ces souches à l’oxydation du fer), on peut aussi imaginer

que l’encroûtement aurait lieu après la mort des cellules et n’aurait donc aucune conséquence

sur la viabilité. Des problématiques similaires ont été posées avec d’autres microorganismes

(e.g. Dupraz et al., soumis), dont certains utiliseraient la biominéralisation de structures

organiques comme protection contre l’encroûtement (Phoenix & Konhauser, 2008, Caldwell

& Caldwell, 2004, Schultze-Lam et al., 1992). L’ensemble de nos observations sur la souche

BoFeN1 nous a amené à tester plusieurs méthodes et à mettre au point des protocoles

spécifiques pour évaluer la viabilité des cellules de BoFeN1 au cours du processus de

biominéralisation du fer.

Page 172: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

172

Méthodologie.

Suivi de la croissance bactérienne et de l’encroûtement. Pour suivre l’évolution de

l’encroûtement des cellules au cours de la culture, des observations ont été effectuées au MET

en mode STEM. Du fait de la sensibilité de ce mode d’imagerie aux éléments lourds (qui

apparaissent blancs sur les images de MET), en particulier au Fe, les cellules encroûtées

peuvent être repérées rapidement. Des comptages du nombre de cellules encroûtées et du

nombre de cellule en cours de division (chacun effectué en duplicat, sur deux cultures

indépendantes) ont été effectués par cette technique à différents pas de temps au cours de la

culture de BoFeN1 en présence de Fe(II) dissous à une concentration initiale de 4-6 mM.

En outre, nous avons cherché à suivre l’évolution de la croissance bactérienne et de la

viabilité des cellules au cours de ces cultures. En raison de l’apparition de minéraux dans les

cultures réalisées en présence de fer, qui contribuent à troubler le milieu, il n’a pas été

possible de suivre la croissance bactérienne par les techniques classiques de

spectrophotométrie (e.g. OD 600 nm). Nous avons donc utilisé deux autres approches : la

première a consisté à suivre au cours du temps l’évolution de la concentration des protéines

solubles obtenues après lyse des cellules (voir Protocole p. 261). Celle-ci est au premier ordre

reliée directement à la quantité de cellules. Cependant, il n’est pas possible ainsi de distinguer

les cellules vivantes des cellules mortes non lysées. La deuxième approche a donc consisté à

suivre spécifiquement le nombre de cellules viables par étalement sur milieu solide (voir

Protocole p. 261). Cette seconde approche est détaillée ci-dessous.

Estimation de la viabilité à l’échelle de la population – Cultures en milieu solide.

L’estimation du nombre de cellules viables consiste à effectuer des étalements sur un milieu

solide de cellules prélevées à différents stades de la culture en présence de Fe(II) dissous.

Pour cela, un protocole de culture de BoFeN1 sur milieu solide en conditions anoxiques

strictes a été développé (voir Protocoles, p. 261). L’étalement sur milieu solide des cellules

prélevées dans la culture liquide à différents pas de temps conduit au développement de

colonies. En faisant l’hypothèse que chaque bactérie vivante au moment de l’étalement forme

une colonie par divisions successives (Colony Forming Unit, CFU), on peut évaluer le

nombre de bactéries viables au moment de l’étalement. Les colonies sont comptées après un

temps d’incubation de la boîte (à 30 °C) de 10 jours minimum. Ces expériences peuvent

donner des indications sur la relation viabilité/encroûtement à l’échelle de la population

bactérienne.

Page 173: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

173

Modélisation des courbes de croissance bactérienne. Une approche de la relation

viabilité/encroûtement consiste à modéliser la courbe de croissance bactérienne à l’aide d’un

modèle testant l’effet létal ou non de l’encroûtement. C’est avec cet objectif que les courbes

obtenues par dosage des protéines dans les cultures de BoFeN1 en présence ou en l’absence

de Fe(II) dissous ont été fittées à l’aide d’une équation logistique du type :

K

NKrN

dt

dN )( −= (Eqn. 1)

où : N est la quantité de protéines à un temps t,

r, le taux d’accroissement, i.e. taux de natalité - taux de mortalité.

K, la charge biotique maximum.

Cette équation s’intègre sous la forme :

)exp(1 rta

KN

−+= (Eqn. 2)

Avec : a = ln(K − No

No) et N0, la quantité initiale de protéines (inoculum).

Les simulations peuvent être interprétées en relation avec les courbes d’encroûtement et les

courbes de viabilité obtenues à l’aide des cultures en milieu solide (voir infra).

Principaux résultats.

Effet du fer sur la courbe de croissance bactérienne. Les courbes d’accroissement du

nombre de protéines totales obtenues sur des cultures en présence ou en l’absence de Fe(II)

dissous ont été simulées à l’aide de l’équation logistique (Eqn. 2, Figure 2E-1). Les résultats

numériques des fits sont donnés en Table 1E-1. Ils indiquent que la concentration de protéines

totales suit une loi logistique, classiquement obtenue pour les croissances bactériennes, avec

une phase de latence initiale, une phase exponentielle de croissance et enfin une phase

stationnaire. Ils montrent en outre que la charge biotique maximale (K) en l’absence de fer est

assez proche de celle estimée en présence de fer. La quantité finale de protéines est donc

relativement similaire en présence ou en l’absence de fer dans les cultures. De même, le taux

d’accroissement (r) n’est pas significativement différent dans les deux conditions de culture.

Des courbes de croissance mieux résolues dans la phase exponentielle pourraient cependant

permettre d’évaluer si les cultures suivent finement cette croissance de type logistique ou si

des écarts à cette loi, en particulier dans les cultures en présence de fer, peuvent être observés.

Page 174: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

174

0

5

10

15

20

25

30

0 1 2 3 4 5

Co

nc

en

tra

tio

n e

n p

roté

ine

s,

µg

.L-1

Temps, jours

Figure 2E-1. Courbes d’accroissement de la quantité totale de protéines de BoFeN1 cultivée

en l’absence (○) ou en présence de Fe(II) dissous à 5 mmol.L-1

(■). Les courbes en pointillés

correspondent aux fits par une équation logistique, dont les résultats numériques sont donnés

en Table 1E-1.

Culture K r N0 χχχχ² R

Sans Fe(II) 25.9±0.2 4.0±0.2 2.0±0.3 0.15 0.9998

5 mM Fe(II) 22.1±0.6 4.7±1.5 0.8±1.1 2.4 0.996

Table 1E-1. Résultats des fits des courbes d’accroissement de la quantité totale de protéines

de BoFeN1 présentées en Figure 2E-1 par une équation logistique (Eqn. 2). K, charge biotique

maximale ; r, taux d’accroissement ; N0, concentration initiale ; χ², moindres carrés du fit ; R,

coëfficient de régression du fit.

Relation avec l’évolution du nombre de bactéries encroûtées. Bien que la présence de fer

dans le milieu de culture ne semble pas modifier fondamentalement l’allure des courbes

d’accroissement de la quantité totale de protéines (au moins au premier ordre), nous avons

observé en MET, tout au long de ces cultures, de nombreuses cellules encroûtées, dont

certaines présentent des figures de division (Figure 1E-2). Ces cellules sont aisément repérées

en STEM grâce au contraste du fer. Selon le stade de croissance de la culture au moment de

l’observation, les cellules en cours de division peuvent être seulement partiellement (Figure

1E-2A) ou totalement (Figure 1E-2B) encroûtées dans le périplasme. Nous avons également

observé une cellule en début de division partiellement encroûtée en CEMOVIS. Une seule

Page 175: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

175

cellule présentant ces caractéristiques a pu être imagée, malgré l’acquisition de plusieurs

centaines d’images. La probabilité d’obtenir une coupe d’une cellule encroûtée en cours de

division dans le plan passant par le septum est en effet très faible. Il est intéressant de noter

qu’on observe de nouveau l’initiation de la minéralisation dans le périplasme en des sites

discrets (voir Chapitre 1D). En outre, on observe l’absence de minéralisations sur les portions

de membranes constituant le septum.

Nous avons également quantifié l’évolution du nombre de cellules encroûtées au cours de ces

cultures et l’avons comparé à l’évolution de la croissance bactérienne et au nombre de cellules

en cours de division estimé en STEM (Figure 1E-3). Nous observons de façon reproductible

un maximum d’encroûtement des cellules (proche de 100%) en pleine phase exponentielle de

croissance, après 1 jour de culture. Ce stade coïncide avec le maximum de cellules en cours

de division estimé en STEM. Ces observations posent clairement la question de la viabilité de

ces cellules encroûtées.

Figure 1E-2. Figures de division observées sur des bactéries BoFeN1 encroûtées. A et B : images STEM de bactéries issues de cultures âgées de 30 minutes et de 3 jours

respectivement, dont le périplasme est en cours d’encroûtement (A) ou complètement

encroûté (B). C : Image de CEMOVIS d’une coupe de cellule en cours de division et

d’encroûtement. On observe des particules de fer (denses aux électrons) dans le périplasme et

la mise en place d’un septum. On peut noter l’absence de particules minérales dans le septum.

Septum

50 nm

A B

C

Septum

50 nm

Septum

50 nm

Septum

50 nm

A B

C

Page 176: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

176

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Temps30min 3h 6h 1 jour 3 jours 6 jours

Figure 1E-3. Evolution du nombre de cellules encroûtées et du nombre de cellules en

division estimée en STEM au cours d’une culture de BoFeN1 en présence de 5 mmol.L-1

de

Fe(II) dissous. En blanc : rapport du nombre de cellules encroûtées sur le nombre total de

cellules imagées. En noir : rapport du nombre de cellules en cours de division sur le nombre

total de cellules imagées. Les barres d’erreur ont été calculées correspondent à l’écart-type

calculé à partir de deux séries d’observation sur deux cultures indépendantes.

Viabilité et encroûtement. L’évolution de la viabilité bactérienne a été suivie au cours de

cultures réalisées en présence ou en l’absence de Fe(II) dissous, en effectuant des étalements

sur milieu solide à différents stades de ces cultures (Figure 1E-4). Le nombre de cellules

viables initial est similaire dans les deux conditions de culture. Après 1 jour de croissance

(phase exponentielle), on observe dans les deux cas une augmentation du nombre de cellules

viables d’un facteur 10 par rapport au nombre de cellules viables inoculées, c’est-à-dire que la

croissance a compensé le facteur de dilution utilisé lors de l’inoculation (inoculations au

1/10). Cependant, si le nombre de viables reste ensuite constant (pendant les 4 jours

d’observation) dans les cultures en l’absence de fer, il chute dans les cultures en présence de

fer dès le deuxième jour de culture (entrée en phase stationnaire) et se maintient ensuite à des

valeurs proches du nombre de cellules viables initial. Ainsi, en présence de fer, il y a autant de

bactéries viables après 4 jours de culture que dans la culture à J0.

Ces résultats apportent plusieurs contraintes à la relation entre viabilité et encroûtement et

ouvrent un certain nombre de perspectives.

• Il est possible que l’encroûtement ait un effet létal sur les cellules. Dans ce cas, nos

résultats suggèrent que cet encroûtement est très rapide et peut donc fossiliser des

Page 177: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

177

cellules en plein stade de division. Dans cette même perspective, une façon de

réconcilier l’ensemble de ces résultats est d’imaginer que la relation entre le nombre

de bactéries vivantes et la quantité de protéines est différente selon que le milieu

contient du fer ou non. Ainsi, dans une culture en l’absence de fer, les cellules mortes

seraient rapidement dégradées. La quantité de protéines dosée serait donc

proportionnelle au nombre de bactéries vivantes, quel que soit le stade de la culture.

Un plateau est ainsi observé sur les courbes du nombre de protéines totales (Figure

1E-1) comme sur les courbes de viabilité (Figure 1E-4). En revanche, en présence de

fer, l’encroûtement périplasmique pourrait protéger les protéines de la dégradation. En

supposant que l’encroûtement a effectivement un effet létal, on pourrait donc

expliquer que la quantité de protéines reste constante (phase stationnaire) alors que le

nombre de bactéries viables diminue (à partir de J2). Cette interprétation est en outre

cohérente avec les résultats de spectroscopie et de microscopie présentés au Chapitre

1D, concernant la préservation de protéines par les phases minérales dans le

périplasme des bactéries.

• D’autre part, ces résultats suggèrent que le nombre de bactéries viables est identique

en début et en fin de culture en présence de fer. Ceci impliquerait qu’aucune

croissance ne sera observée dans une culture en présence de fer repiquée plusieurs fois

au 1/10 dans un milieu contenant du fer. Cette hypothèse pourra être facilement testée

dans le futur. Une autre possibilité est que le nombre de bactéries viables dans les

cultures en présence de fer augmente de nouveau d’un facteur 10 au-delà des 4 jours

de culture suivis lors de cette expérience. En effet, on peut imaginer que la viabilité

cellulaire augmente de nouveau lorsque tout le Fe(II) initialement présent dans le

milieu de culture a disparu de la solution par précipitation. Ce scénario serait cohérent

avec l’observation de la diminution du nombre relatif de bactéries encroûtées à partir

de 3 jours. Cette hypothèse pourra être testée dans le futur en reprenant les expériences

de viabilité mais sur une durée plus longue.

• Dans tous les cas, il est intriguant d’observer que le nombre relatif de bactéries

encroûtées est déjà très élevé (80%) dès le début de la culture (3 h), donc en pleine

phase exponentielle. Ce résultat suggère soit que l’encroûtement n’a pas d’effet sur la

mortalité cellulaire, soit que les cellules à des stades précoces d’encroûtement ont un

périplasme encore peu minéralisé et moins chargé en fer qui n’empêche ni leur activité

métabolique, ni leur division. Une estimation de la quantité de fer périplasmique

Page 178: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

178

moyenne dans les cellules au cours de la culture pourrait permettre de mieux

comprendre ces résultats.

104

105

106

107

0 1 2 3 4 5

CF

U / 1

0 µ

L

Temps, jours

Figure 1E-4. Evolution de la viabilité cellulaire dans des cultures de BoFeN1 en l’absence

(○) ou en présence (■) de Fe(II) dissous à 5 mmol.L-1

. La viabilité est évaluée par le nombre

d’unités formant des colonies (CFU) compté après étalement sur milieu solide de 10 µL de la

culture liquide suivie. Les barres d’erreur correspondent à l’écart-type calculé à partir d’au

moins deux étalements sur milieu solide d’une même culture en milieu liquide.

En conclusion, l’estimation de la viabilité cellulaire n’est pas triviale. En particulier, la

définition d’une bactérie vivante ou morte est problématique, puisque les différentes

approches méthodologiques fournissent des informations sur l’activité métabolique, la

division cellulaire ou bien la présence d’acides nucléiques, qui correspondent toutes à des

définitions différentes de ces notions. Nos résultats montrent toutefois les implications

diverses et importantes de telles expériences, qui devront être poursuivies et multipliées dans

le futur. Nous proposons ci-dessous quelques pistes méthodologiques complémentaires qui

pourraient être envisagées.

Perspectives méthodologiques.

Evaluation de la viabilité à l’échelle de la cellule – Méthodes utilisant la fluorescence. En

complément, nous pourrions tester des méthodes permettant d’évaluer la relation

viabilité/encroûtement à l’échelle de l’individu. Pour cela, nous recherchons une méthode

Page 179: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

179

permettant de déterminer sur une même cellule sa viabilité et son taux d’encroûtement. Dans

cette perspective, les techniques d’épifluorescence sont tout particulièrement intéressantes.

Par exemple, une technique telle que le FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) pourrait

fournir des informations à la fois sur l’activité d’une bactérie et sur son taux d’encroûtement.

En effet, des sondes (complémentaires d’ARNr plus ou moins spécifiques) couplées à des

molécules fluorescentes (fluorophores) peuvent être employées pour déterminer l’état

physiologique des bactéries : la présence de fluorescence indique la présence d’ARNr et le

taux d’ARN présent dans une cellule est en première approximation proportionnel à son

activité métabolique (Schmid et al., 2001). En outre, même si la résolution spatiale reste

nettement inférieure à celle d’un MET, l’imagerie à l’aide d’un microscope à épifluorescence

peut fournir des informations complémentaires sur la présence éventuelle de minéraux

associés aux structures cellulaires. Le FISH fournit de plus la possibilité d’envisager dans le

futur son couplage avec le MET. Il est en effet possible de coupler les sondes utilisées en

FISH à des billes d’or avant l’hybridation et d’observer ensuite ces billes d’or hybridées au

MET, de façon à obtenir une résolution spatiale accrue, autorisant à visualiser sans ambiguïté

le taux d’encroûtement des cellules. Différentes méthodes basées sur l’utilisation de sondes

fluorescentes ont donc été testées de façon préliminaire, en collaboration avec Emmanuelle

Gérard (Géobiosphère Actuelle et Primitive, IPGP).

• Estimation de la viabilité cellulaire par marquage des acides nucléiques au SYTO 9.

Nous avons effectué de premiers tests de viabilité à l’échelle de la cellule, à l’aide d’un kit de

viabilité (Molecular Probes, voir Protocoles p. 261) utilisant deux sondes fluorescentes

marqueurs des acides nucléiques : le SYTO 9 (vert) marque en principe toutes les cellules

indépendamment de leur état physiologique, tandis que l’iodure de propidium (PI, rouge) ne

pénètre que dans les cellules dont la paroi n’est pas intacte, donc en principe les cellules

mortes. Le protocole utilisé a donné de bons résultats pour les cultures de BoFeN1 en

l’absence de fer : on observe un mélange de bactéries vivantes et de bactéries mortes aux

différents stades de la culture. En revanche, on a observé que les sondes ne pénétraient pas

dans les cellules encroûtées (ni le SYTO 9, ni le PI), c’est-à-dire qu’il n’est pas possible de

déterminer si elles sont vivantes ou mortes. Ce biais rend donc difficile l’estimation des ratios

bactéries vivantes/bactéries mortes dans les cultures en présence de fer.

• Estimation de la viabilité cellulaire par la méthode FISH. Pour ces premiers tests,

différentes sondes ont été testées (voir Protocole p. 261). Plusieurs problèmes ont toutefois été

Page 180: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

180

rencontrés. Tout d’abord, les minéraux fluorescent. D’autre part, l’état physiologique des

cellules (phase exponentielle/stationnaire) n’avait pas été bien contrôlé, ce qui peut expliquer

les défauts d’hybridation observés avec la plupart des sondes. Enfin, la moins bonne

hybridation des cellules encroûtées pourrait être un biais lié, là encore, à une moins bonne

pénétration des sondes, hypothèse qui devra être testée et quantifiée dans le futur.

• Estimation de la vitalité cellulaire en épifluorescence. Un kit de vitalité est

disponible (Molecular Porbes), qui pourrait peut-être permettre de quantifier le taux d’activité

métabolique des cellules dans différentes conditions de culture. Il consiste à utiliser de la

résazurine non fluorescente qui peut être réduite par les cellules viables en résorufine

fluorescente (rouge). La pénétration de cette sonde dans les cellules encroûtées pourra être

testée dans le futur.

• Suivi de la division cellulaire dans une cellule anoxique. Afin de tester si des cellules

encroûtées peuvent effectivement se diviser complètement, une démarche très directe pourrait

consister à suivre en microscopie optique (en contraste de phase par exemple) plusieurs

bactéries encroûtées sur un laps de temps donné, dans le but d’observer une éventuelle

division. Ceci nécessiterait la mise au point d’une cellule anoxique dans laquelle les bactéries

seraient inoculées, puis observées in situ pendant au moins plusieurs heures afin d’avoir

l’opportunité d’observer une division.

Page 181: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

181

Chapitre 2.

Biominéralisation du fer et

détoxification de l’arsenic par des

eucaryotes unicellulaires du genre

Euglena

Page 182: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

182

Page 183: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

183

Le second volet de cette thèse a eu pour objectif de déterminer les adaptations biologiques

développées par des eucaryotes unicellulaires photosynthétiques, exposés dans le milieu

naturel à des concentrations très élevées en éléments lourds. Ces microorganismes – Euglena

mutabilis et Euglena gracilis – sont parmi les seuls eucaryotes présents dans les drainages

miniers acides (AMD). Dans le cadre de notre recherche, nous avons collecté des cellules d’E.

mutabilis dans l’AMD de Carnoulès (Figure 2.1).

La mine de Pb et Zn de Carnoulès, abandonnée en 1962, contient actuellement près de 1.5

Mt de stériles miniers, principalement constitués de quartz (75 poids-%) et de pyrite (5-15

poids-%). La pyrite contient 1 à 4 poids-% d’arsenic (Leblanc et al., 1996). Son altération par

les eaux de pluie libère de fortes concentrations d’arsenic dans le cours d’eau qui prend sa

source à la sortie des stériles, le Reigous. Ce cours d’eau présente un pH acide (2.7-3.4) et de

fortes teneurs en Fe(II) (0.7-1.7 g.L-1

) et en As (80-260 mg.L-1

) atteignant jusqu’à plus de 20

000 fois la limite fixée par l’OMS pour les eaux potables (10 µg.L-1

). A la source, l’arsenic

dissous est majoritairement présent sous forme d’As(III). Il précipite quelques dizaines de

mètres en aval sous l’action de bactéries arsenite-oxydantes (e.g. Thiomonas sp., Bruneel et

al., 2003, Casiot et al., 2003, Duquesne et al., 2007) et/ou ferro-oxydantes (e.g.

Acidithiobacillus ferroxidans, Duquesne et al., 2003, Casiot et al., 2003, Casiot et al., 2006)

sous forme d’hydroxysulfates de fer-arsenic (tooeleite) ou d’(hydr)oxydes amorphes de fer-

arsenic (Fe(III)-As(III) ou Fe(III)-As(V)) (Morin et al., 2003). Le taux de précipitation du fer

et de l’arsenic dans l’AMD, ainsi que la spéciation de ce dernier, présentent des variations

saisonnières, vraisemblablement liées à des variations de l’activité bactérienne (Casiot et al.,

2003, Morin et al., 2003). Si la concentration en As(V) dissous dans le Reigous est

négligeable en hiver, elle peut atteindre 100 mg.L-1

en été (Casiot et al., 2004). C’est à ces

conditions chimiques extrêmes, proches de celles régnant potentiellement dans des

environnements de la Terre primitive, que sont exposés les eucaryotes E. mutabilis (Casiot et

al., 2004) et E. gracilis (Arsène-Ploetze et al., soumis) : pH acide, fortes concentrations en fer

et en arsenic, fort taux de minéralisation.

Notre approche a donc consisté dans un premier temps à évaluer les adaptations de ces

deux eucaryotes aux fortes teneurs en fer dissous, via une étude microscopique d’E. mutabilis

directement prélevée dans l’AMD de Carnoulès et d’E. gracilis (Figure 2.2) cultivée en

laboratoire dans un milieu de culture à pH acide, enrichi en Fe(II) à des concentrations

proches de celles observées sur le terrain (Chapitre 2A). Dans le Chapitre 2B, nous étudions

les mécanismes de résistance à l’As(III) et As(V) dans des expériences de laboratoire sur

Page 184: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

184

l’espèce cultivable E. gracilis, exposée à des concentrations de l’ordre de celles mesurées

dans l’AMD de Carnoulès.

Figure 2.1. Le drainage minier acide de Carnoulès. Localisation géographique et coupe de

l’AMD du Reigous, depuis la source très riche en As(III) et Fe(II) dissous jusqu’au lieu de

prélèvement d’E. mutabilis. L’atténuation naturelle des concentrations en fer et arsenic

dissous dans le cours d’eau s’explique par l’activité de microorganismes (ba : bactéries) tels

qu’Acidithiobacillus ferroxidans ou Thiomonas sp. catalysant l’oxydation du Fe(II) ou de

l’As(III) par l’O2 et en conséquence la formation de phases minérales riches en fer et arsenic

(oxyhydroxydes de Fe(III)-As(III) ou de Fe(III)-As(V), tooeleite, Morin et al., 2003). Des

images MEB montrent la diversité morphologique de quelques bactéries et biominéraux

typiques de l’AMD de Carnoulès ainsi qu’une cellule d’E. mutabilis prélevée dans le cours

d’eau.

1 000 mg/L FeII

100 – 300 mg/L AsIII

600 mg/L FeII

50 - 100 mg/L AsIII

Thiomonas sp.

AsIII AsV

Oxy-hydroxydes FeIII-AsV

Acidithiobacillus ferrooxidans

FeII FeIII

Oxy-hydroxydes FeIII-AsIII

Tooéléite

E. mutabilis

1 000 mg/L FeII

100 – 300 mg/L AsIII

600 mg/L FeII

50 - 100 mg/L AsIII

Thiomonas sp.

AsIII AsV

Oxy-hydroxydes FeIII-AsV

Acidithiobacillus ferrooxidans

FeII FeIII

Oxy-hydroxydes FeIII-AsIII

Tooéléite

E. mutabilis

1 000 mg/L FeII

100 – 300 mg/L AsIII

600 mg/L FeII

50 - 100 mg/L AsIII

Thiomonas sp.

AsIII AsV

Oxy-hydroxydes FeIII-AsV

Acidithiobacillus ferrooxidans

FeII FeIII

Oxy-hydroxydes FeIII-AsIII

Tooéléite

E. mutabilis

Page 185: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

185

Figure 2.2. Ultrastructure d’E. gracilis. Coupe d’une cellule incluse en résine Epoxy et

contrastée (acétate d’uranyl et citrate de plomb) observée en MET. Chl : Chloroplaste ; V :

Vacuole de stockage (paramylon) ; M : Mitochondrie ; Nl : Nucléole ; Chr : Chromatine ;

EN : Enveloppe nucléaire ; G : Goulet ; F : Flagelle ; PC : Paroi cellulaire.

PC

Nl

Chr

EN

Chl

G

F

M

V

PC

Nl

Chr

EN

Chl

G

F

M

V

Page 186: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

186

Page 187: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

187

Chapitre 2.A.

Bioaccumulations de fer par E. mutabilis issue de l’AMD de Carnoulès et

par E. gracilis

Problématique et objectifs. E. mutabilis et E. gracilis sont parmi les seuls eucaryotes

adaptés aux conditions extrêmes des AMD, en particulier, capables de résister à de fortes

concentrations en Fe(II) dissous et en arsenic dissous. En comparaison, les procaryotes

présents dans ces environnements résistent également à ces concentrations chimiques

extrêmes via la biominéralisation de phases riches en fer et en arsenic : formation

d’hydroxysulfates de fer-arsenic (tooeleite) ou d’(hydr)oxydes amorphes de fer-arsenic

(Morin et al., 2003). Jusqu’à maintenant, la capacité des eucaryotes adaptés aux AMD à

minéraliser le fer et/ou l’arsenic n’a cependant été que très peu étudiée. Une étude d’E.

mutabilis prélevée dans l’AMD de Carnoulès a cependant suggéré par une méthode chimique

indirecte la possible accumulation de fer et d’arsenic par ces algues (Casiot et al., 2004). En

outre, des observations d’E. mutabilis prélevées dans des AMD ont suggéré la présence

d’oxydes de fer intracellulaires chez ces eucaryotes (Mann et al., 1987, Brake et al., 2001).

Notre étude a donc consisté à caractériser à l’échelle sub-micrométrique les potentielles

accumulations de fer et/ou d’arsenic chez E. mutabilis issue de l’AMD de Carnoulès et dans

l’algue modèle E. gracilis cultivée en présence de fortes concentrations en Fe(II) et As(III)

dissous.

Méthodologie. Afin de caractériser ces bioaccumulations, des méthodes microscopiques et

spectroscopiques ont été combinées :

• Microscopie électronique à transmission, en particulier sur des coupes ultrafines

obtenues par ultramicrotomie de cellules incluses dans une résine Epoxy (voir

Protocole p. 261).

• Spectroscopie en perte d’énergie (EELS) afin de co-localiser les associations

élémentaires dans les bioaccumulations intracellulaires.

• Spectromicroscopie X (STXM) au seuil du fer, afin de déterminer le redox du fer dans

les bioaccumulations de fer chez E. mutabilis.

Principaux résultats et perspectives. Cette étude a mis en évidence l’accumulation de fer

dans des vacuoles intracellulaires, sous forme de (poly)-phosphates de fer de taille

Page 188: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

188

nanométrique, aussi bien chez E. mutabilis que chez E. gracilis. Ces dépôts vacuolaires sont

systématiquement dépourvus d’As (concentrations inférieures au seuil de détection de l’EDX

dans les coupes de 70 nm d’épaisseur étudiées, i.e. environ 1%). L’analyse locale du redox du

fer dans ces bioaccumulations chez E. mutabilis a montré que le fer était présent

majoritairement sous forme de Fe(II). En outre, ces phosphates de Fe(II) sont associés à des

polymères de carbone organique. L’ensemble de ces observations fournit des clés pour une

éventuelle recherche de traces de l’activité de microorganismes eucaryotes dans le registre

fossile. Par ailleurs, le découplage entre les cycles du fer et de l’arsenic dans l’euglène

contraste fortement avec ce qui est connu des mécanismes d’immobilisation du fer et de

l’arsenic dans les AMD, qu’ils soient abiotiques ou catalysés par des bactéries.

Page 189: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

189

Intracellular iron accumulation in Euglena mutabilis from the Carnoulès arsenic-rich acid mine drainage (Gard, France) and in the model

microorganism Euglena gracilis.

Jennyfer Miot a,*

, Guillaume Morin a, Tae Hyun Yoon

b, Fériel Skouri-Panet

a,

Céline Férard a, Magali Zbinden

c, Karim Benzerara

a, Joël Briand

d, Corinne Casiot

e, Jean-

Pierre Lechaire f , Gordon E. Brown

g,h and François Guyot

a

a Institut de Minéralogie et de Physique des Milieux Condensés, UMR 7590, CNRS, Paris 6,

Paris 7 and Institut de Physique du Globe de Paris.

140, rue de Lourmel. 75 015 Paris, France b Laboratory of Nanoscale Characterization and Environmental Chemistry,

Department of Chemistry, Hanyang University, Seoul, 133-791, Korea c Laboratoire de Systématique, Adaptation, Evolution, UMR 7138, CNRS, Université Paris 6,

4, place Jussieu. 75 252 Paris cedex 05, France d Laboratoire d’Electrophysiologie des Membranes, EA 3514, Université Paris 7,

4, place Jussieu. 75 252 Paris cedex 05, France e Laboratoire Hydrosciences Montpellier, UMR 5569, CNRS, Université Montpellier 2,

Place E. Bataillon, 34095 Montpellier Cedex 05, France f Service de Microscopie Electronique, IFR 83, Université Paris 6,

9, quai St Bernard. 75 252 Paris cedex 05, France g Surface & Aqueous Geochemistry Group, Department of Geological & Environmental

Sciences, Stanford University, Stanford, CA 94305-2115, USA

h Stanford Synchrotron Radiation Laboratory, SLAC, Menlo Park, CA 94025, USA

To be submitted to

*Corresponding author:

Institut de Minéralogie et de Physique des Milieux Condensés, UMR 7590, CNRS,

Universités Paris 6 et Paris 7, et IPGP.

140, rue de Lourmel. 75 015 Paris, France

[email protected]

Tel: 0033144279832

Fax: 0033144273785

Page 190: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

190

ABSTRACT

The acidophilic microalga Euglena mutabilis, exposed to high Fe(II) and As(III)

concentrations was collected at the Carnoulès acid mine drainage. Analytical transmission

electron microscopy evidenced intracellular amorphous electron dense accumulations of iron

phosphates compartmentalized within vacuoles. Similar results were reproduced in laboratory

cultures of the model alga E. gracilis under high Fe(II) levels. In addition, we used

synchrotron-based Scanning Transmission X-ray Microscopy to investigate the Fe redox state

and the carbon content of these sub-micrometer-size accumulations. They were shown to

consist exclusively of Fe(II)-phosphate associated to organic carbon polymers. Arsenic, a

pervasive element at this acid mine drainage, was absent from these accumulations, both in E.

mutabilis, and in E. gracilis cultured in the presence of Fe(II) and As(III). The decoupling

between As(III) and Fe(II) pathways in these algae contrasts with what is known from abiotic

and bacteria-mediated processes in acid mine drainage systems and could possibly provide a

signature for such eukaryotic metabolisms in recent and ancient Fe/As rich natural systems.

Keywords: euglena, iron phosphate, bioaccumulation, acid mine drainage, arsenic,

spectromicroscopy.

Page 191: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

191

INTRODUCTION

Euglena mutabilis is a benthic photosynthetic unicellular eukaryote, ubiquitous in acid

mine drainage (AMD) and one of the few eukaryotes adapted to these extreme environments.

This green alga is tolerant to acidity (pH = 3), to several heavy metals (Zn, As, Pb) and to

elevated iron concentrations (0.7 g.L-1

to 12.1g.L-1

) (Kapfer, 1998; Brake et al., 2001, Casiot

et al., 2004). In the Carnoulès AMD (Gard, France), E. mutabilis is exposed to 0.6-1.0 g.L-1

of

Fe(II) and to 80-250 mg.L-1

of As(III), that latter value largely exceeding the current World

Health Organization maximum contaminant level (10 µg.L-1

). Intracellular red-brownish

granules were described in E. mutabilis cells collected from AMD (Brake et al., 2001) and

were interpreted as intracellular accumulations of the iron oxide lepidocrocite (Mann et al.,

1987). More recently, Casiot et al. (2004) proposed from an indirect chemical approach that

E. mutabilis cells sampled at the Carnoulès AMD, were able to accumulate arsenic and iron.

Besides, intracellular compartmentalization of copper was suggested to be part of a metal

detoxification pathway in another metal-resistant euglena, E. gracilis (Einicker-Lamas et al.

2002), closely related to E. mutabilis (Woongghi & Triemer, 2004). However, none of these

studies did provide a direct chemical and mineralogical characterization of iron and/or arsenic

accumulations in Euglenae.

Our study aimed at following the fate of iron in E. mutabilis cells collected at the Carnoulès

arsenic-rich AMD (France) and in E. gracilis cells cultured in the laboratory in the presence

of Fe(II) and As(III) at concentrations similar to those reached in the Carnoulès AMD.

Combination of Transmission electron microscopy (TEM), Scanning transmission electron

microscopy (STEM), both coupled to Energy Dispersive X-ray Spectrometry (EDXS),

Scanning Transmission X-ray Microscopy (STXM) and spectroscopic analyses (Electron

Energy Loss Spectroscopy (EELS) and X-ray Absorption Near-Edge Spectroscopy (XANES))

provided us with new insights into the nature of intracellular iron-rich accumulations in E.

mutabilis and E. gracilis.

MATERIALS AND METHODS

E. mutabilis sampling

E. mutabilis cells were collected from the Reigous AMD. This creek surges from the

Carnoulès abandoned mine (Gard, France, Figure 1) (Leblanc et al., 1996) and exhibits Fe(II)

Page 192: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

192

concentrations ranging from 1.0g.L-1

at the spring to 0.6g.L-1

30m downstream, as well as

high As(III) concentrations (up to 250mg.L-1

at the spring) (Casiot et al., 2003).

Green benthic mats of E. mutabilis are localized at the surface of Fe-As-rich bacterial

precipitates, mainly 30m downstream from the acidic spring (Casiot et al., 2004). The

eukaryotic mats were scraped with a stainless steel spatula, then placed in sterile plastic

capped vials and transported to the laboratory, where they were immediately processed. Cells

were separated from the sediments following the procedure by Casiot et al. (2004), which

uses the phototactic properties of these algae. The collected material was deposited in a sterile

Petri dish and was then recovered with three layers of Nylon filter. After 2 hours exposure to

artificial light, the two upper layers of Nylon were rinsed with 0.22 µm-filtered Reigous water

to recover the migrating cells. Cell shape and mobility, and presence of extracellular

precipitates were checked under a light microscope (up to x1000 magnification).

Figure 1. Map of the Carnoulès mining site and location of the sampling site of E. mutabilis

on a cross-section of the Reigous AMD.

E. gracilis culture

E. gracilis Z (n°1224-5d, Cambridge) was cultured at room temperature (20 +/- 2°C),

under permanent light exposure, in a culture medium composed of KH2PO4 (0.5 g/L),

Page 193: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

193

MgSO4.7H2O (0.5 g/L), CaCl2.2H2O (0.26 g/L), (NH4)2HPO4 (0.5 g/L) and a complement of

vitamins, zinc (as ZnSO4) and manganese (as MnSO4), at an initial pH of 3.2 (Briand &

Calvayrac, 1980). Lactic acid was supplied as a carbon source and its assimilation by the cells

progressively raised the pH of the culture medium up to pH 7 after 1 week of incubation. In

test cultures, iron (as FeSO4) and/or arsenic (as As(III)NaO2) were added at concentrations

close to those reached in the Carnoulès AMD: 100, 500 or 1000 mg.L-1

Fe and 200 mg.L-1

As.

These cultures were examined after 1 week of incubation.

Transmission Electron Microscopy

Intracellular structures were characterized in ultrathin sections by Transmission

Electron Microscopy (TEM). Cells were fixed for 2 hours in 1% glutaraldehyde at 4°C,

centrifuged (6,500 rpm), rinsed three times in 0.1 M acetic buffer (pH 4.4) for 18 hours at

4°C. They were then post-fixed for 90 minutes in 1% OsO4 in the same buffer, rinsed three

times in distilled water, dehydrated in graded ethanol and propylene oxide-1,2 and

progressively embedded in epoxy resin. Ultrathin sections (70 nm-thick) were cut with a

LEICA ultramicrotome (Ultracut E). Ultrathin sections, deposited on copper grids, were

stained with uranyl acetate (2% w/v) and lead citrate (2 g.L-1

) and observed in a PHILIPS 201

Transmission Electron Microscope at 80 kV.

Samples analyzed by Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) and

Energy Dispersive X-ray Spectroscopy (EDXS) were neither post-fixed, nor stained. The

70nm-thick sections were carbon-coated and observed in a Tecnai G2 F20 Microscope

operating at 200kV, in Dark Field (DF) and Bright Field (BF) modes. EDXS analyses were

performed with a focused electron beam (spatial resolution: 30 nm).

Energy Filtered Transmission Electron Microscopy (EFTEM) was performed on

70nm-thick non-osmicated and unstained sections in a LEO 912 TEM, equipped with a LaB6

source, operating at 120kV and 4µA. Parallel Electron Energy Loss Spectra (PEELS) and

Electron Spectroscopic Images (ESI) were acquired with a slow-scan CCD camera using the

ESIvision program. The exposure time was 1 second for each ESI. Each PEELS was acquired

for 1 second and the integration was maintained up to 3 seconds. For the spectra recorded at

the phosphorus L2,3-edge, a background subtraction was applied according to a power law.

Scanning Transmission X-ray Microscopy

Scanning Transmission X-ray Microscopy (STXM) observations were performed at

Page 194: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

194

the Advanced Light Source (ALS, Lawrence Berkeley National Laboratory) on branch line

11.0.2.2, following the same procedures as those described in Bluhm et al. (2006), Yoon et al.

(2004) or Benzerara et al. (2004). The synchrotron storage ring was operating at 1.9 GeV and

200-400 mA stored current. Energy calibrations were made using the well-resolved 3p

Rydberg peak of gaseous CO2 for the C K-edge and using the major peak of hematite at 709.5

eV for the Fe L2,3-edge. The STXM sample chamber was filled with He to minimize

attenuation of soft X-rays. The detector used was a Si photodiode or a PMT with a phosphor

scintillator. Image stacks were acquired at the C K-edge and at the Fe L2,3-edge. They were

performed by scanning the sample in the x-y direction at each energy increment over the

energy range of interest. X-ray Absorption Near-Edge Spectroscopy (XANES) spectra were

normalized and background subtracted by dividing each spectrum by a second one (I0) taken

at a location on the sample where the element of interest was absent. Possible beam damage

was monitored by looking at the changes in the C K-edge and FeL2,3-edge spectra over the

course of each experiment. However, no significant changes were observed. Axis2000

software (Hitchcock, 2001) was used to process the image stacks and XANES spectra.

Enhanced contrast images were obtained by subtracting the image taken at an energy just

above the absorption edge of interest from another image obtained at an energy below the

absorption edge of interest.

RESULTS AND DISCUSSION

Fe(II)-(poly)phosphate accumulation in E. mutabilis

TEM observations of E. mutabilis reveal the presence of intracellular electron dense

deposits compartmentalized within vacuoles (Figure 2a). Electron diffraction indicates that

these dense deposits are amorphous or poorly crystalline. They are composed of Fe and P,

with a Fe/P atomic ratio ranging from 0.5 to 1 as shown by EDXS (Figure 2a).

Page 195: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

195

Figure 2. STEM observations (Dark Field) of E. mutabilis collected from the Carnoulès

AMD and separated from the bulk sediment through Nylon filters and EDXS analyses of the

areas pointed by arrows: (a) intracellular electron dense deposits within or at the edge of

vacuoles and containing Fe, P and O. Carbon is also present (see Figure 4) but is

indistinguishable from the carbon of the TEM grid (b) extracellular precipitates containing Fe,

P, Al, S, As and O. Copper is due to sample holder. CW: cell wall, V: vacuole, Chl:

chloroplast.

Page 196: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

196

Owing to their submicrometer size, determination of the iron oxidation state in these

deposits is challenging. EELS proved difficult because of instability of the material under the

focused electron beam. STXM spectromicroscopy, a less destructive method, provides a 30

nm-scale spatial resolution combined to a very fine spectral resolution (< 0.1 eV, see e.g.

Hitchcock et al., 2003; Bluhm et al., 2006). The energy of the main absorption edge in

XANES spectra recorded at the Fe L2,3-edge provides insight into the local iron oxidation

state. Iron reference compounds exhibit two main absorption edges at 707 and around 709 eV

(Figure 3). The relative intensity of each absorption edge is directly related to the iron

oxidation state: in Fe(II) compounds (such as vivianite Fe3(PO4)2 • 8H2O), the former edge

(707 eV) is the most intense one, whereas in Fe(III) compounds (such as hematite Fe2O3) the

latter (709 eV) is predominant. The low quantity of iron in the nanometer-scale vacuolar

deposits in E. mutabilis thin sections accounts for the low signal obtained by X-ray absorption

spectroscopy (Figure 3). However, XANES spectra of these vacuolar accumulations indicate

unambiguously that iron is present mostly as Fe(II).

Figure 3. STXM analysis of E. mutabilis thin section: (a) STXM image below the C K-edge

(280 eV), (b) below the Fe L2,3-edge (700 eV) and (c) at 707 eV. (d) Fe map obtained by

subtracting image B from image C. (e) XANES spectra at the Fe L2,3-edge of a vacuolar

deposit and of reference vivianite and hematite. The red square in (a) corresponds to the zoom

shown in b, c and d.

Page 197: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

197

Then, Fe-bearing compounds were mapped at the submicrometer-scale in E. mutabilis

thin sections by acquiring energy-filtered images: subtraction of the image recorded at 700 eV

(below the Fe L-edge) from the image recorded at 707 eV provides a map of Fe(II) in the

study area. As shown in Figure 3, Fe(II) is co-localized with the electron-dense phases

deposited in E. mutabilis vacuoles. Fe(II) phosphates or linear Fe(II) polyphosphates have

compositions that can be expressed as FeII

(n+2)/2PnO(3n+1). As iron is present as Fe(II) and

knowing from EDXS that the Fe/P atomic ratio ranges from 0.5 to 1, we infer that the

composition of the vacuolar deposits ranges from FeII

2P2O7 (n=2, Fe/P=1) toward a

composition of long-chain iron polyphosphate FeIIP2O6 (n → ∞, Fe/P=0.5). Of course, these

phases may be partially hydrated.

The composition of these intracellular deposits, in which no arsenic was detected,

significantly differs from that of the extracellular minerals observed in the vicinity of E.

mutabilis cells (Figure 2b). Indeed, these extracellular precipitates are mainly composed of

iron, arsenic, phosphorus, aluminum, oxygen and sulfur and are amorphous by electron

diffraction. As reported in a previous study (Morin et al., 2003), similar precipitates,

appearing as yellow minerals observed beneath the E. mutabilis mats at the sampling station

(Figure 1), are mainly composed of amorphous Fe(III)-As(V) hydroxysulfates, that were

shown to result from the activity of As(III)-oxidizers, including Thiomonas sp. Similar phases

have also been described in hot springs (Inskeep et al. 2004). Accordingly, the extracellular

precipitates observed by TEM-EDXS in the present study could consist of a mixture of

bacterial Fe(III)-As(V) hydroxysulfates and of aluminum phosphate that may have formed in

the vicinity of the cells upon drying.

Additionally, we acquired STXM images on the same samples at the C K-edge. At this

edge, maximum absorption energies are specific of the type of carbon functional groups (e.g.

Benzerara et al., 2004; Dynes et al., 2006; Benzerara et al., 2008). Maps of organic carbon

polymers in E. mutabilis thin sections were obtained by subtracting the absorbance below the

C K-edge (280 eV) from the main absorbance of the peptidic bound in proteins (-(C=O)-

(NH)-, 288.2 eV). Comparison of the organic carbon map with the Fe(II) map of the same

area (Figure 4) underlines the systematic association of organic polymers with the vacuolar

Fe(II) phosphates in E. mutabilis, whereas no organics are detected in association with

extracellular iron-bearing minerals.

Page 198: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

198

Figure 4. STXM images of E. mutabilis thin section: (a) STXM image below the C K-edge

(280 eV), (b) organic carbon map obtained by subtracting the image at 288.2 eV from the

image at 280 eV, (c) Fe map obtained by subtracting the image at 707 eV from the image at

700 eV. Scale bars: 1 µm.

To our knowledge, the present work provides the first experimental evidence of

intracellular ferrous phosphates in E. mutabilis. Previous works reported optical microscope

observations of red-brown granules in E. mutabilis collected in AMD (Brake et al., 2001), that

were interpreted as iron oxides, possibly lepidocrocite (Mann et al., 1987). However, neither

direct relation between the granules and the iron minerals, nor direct evidence of intracellular

iron minerals, were provided in these studies. Here, we show that the iron-rich deposits

contain iron exclusively as Fe(II) and are not related to the red-brownish granules. Such

granules are not observed in fresh cells, but develop progressively upon a few days of storage

at the laboratory in a minimum medium without iron (KH2PO4 1 g.L-1

, MgSO4 0.25g.L-1

,

(NH4)2SO4 0.75g.L-1

) (Figure 5). These coloured granules might be attributed to the

degeneration of chloroplasts induced by the culture in a minimum medium (Buetow, 1968).

Page 199: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

199

Figure 5. Optical micrographs of (a) E. mutabilis cells from the Reigous AMD, after 5 days

of culture in a minimum medium, exhibiting red granules pointed by arrows and (b) fresh E.

mutabilis directly observed after sampling in the Reigous Creek. The arrow in b shows the

photoreception center (stigma). Extracellular minerals were identified as Fe(III)-As(V)

hydroxysulfates. Scale bars : 5 µm.

Iron (poly)-phosphate mineralization in the model eukaryote E. gracilis

In order to reproduce these biomineralization patterns in a model euglena amenable to

reproducible culture conditions, E. gracilis was cultured in the presence of ferrous iron and/or

arsenite at concentrations of the same order of magnitude as the concentrations measured in

the Carnoulès AMD. Culture of E. mutabilis in the laboratory was not possible because of the

low growth rates obtained in a minimum culture medium and because of contamination by

endogeneous bacteria and fungi in the rich medium used for E. gracilis. Moreover, E. gracilis

was shown to be phylogenetically very close to E. mutabilis (Woongghi & Triemer, 2004),

thus constituting a good analogue of E. mutabilis. We observed that growth kinetics of E.

gracilis does not depend on iron concentration (for initial iron concentrations ranging from 0

to 500 mg.L-1

), which suggests that E. gracilis is resistant to high Fe(II) concentrations.

Moreover, previous results indicated that this alga is also resistant to As(III) up to 200 mg.L-1

Page 200: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

200

(Miot et al., 2008).

Under these conditions, E. gracilis cells accumulate iron as electron dense deposits

(Figure 6), in association with phosphorus and oxygen (Figure 7), in the same way as what is

observed in E. mutabilis. Electron energy loss spectra recorded on these phases at the Fe and

P L2,3 edges and EFTEM images confirm the colocalization of Fe and P (Figure 7). In

contrast, electron dense accumulations are absent from the control cells cultured without iron

(Figure 6). Moreover, in a medium supplemented with both As(III) and Fe(II), no arsenic is

detected, neither in the vacuolar deposits nor elsewhere inside the cells. A previous study of

E. gracilis resistance to As(III) (Miot et al., 2008) showed that As(III) detoxification proceeds

via the glutathione pathway and leads to the export of arsenite from the cells.

Figure 6. TEM observations of E. gracilis cells (a) cultured without iron nor arsenic, (b) transferred twice in a 100 mg.L

-1 Fe(II) containing medium (3 weeks of culture) or (c)

cultured with 1000 mg.L-1

Fe(II) and 200 mg.L-1

As(III) during 7 days. Arrows indicate the

electron dense vacuolar deposits.

a

b c

Page 201: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

201

Figure 7. Elemental maps of electron dense deposits in E. gracilis cultured during 7 days in

a medium enriched with 500 mg.L-1

Fe(II), obtained by EFTEM microanalysis: Carbon pre-

edge image (at 250 eV, a), phosphorus (b) and iron (c) maps. Scale bars: 100 nm.

Fe/P ratios are constant from one deposit to another in a single cell and from cell to

cell. After 7 days of culture in a medium containing 100 or 500 mg.L-1

Fe (with or without

arsenic), Fe/P atomic ratios are close to 1. After 3 weeks of culture in a medium containing

100 mg.L-1

Fe, the deposits exhibit mean proportions of 66 +/-4% P and 33 +/-4% Fe, which

in turn gives an atomic Fe/P ratio of 0.5. As in E. mutabilis, these results suggest that

orthophosphate units do polymerize in the cells, the stoechiometry evolving from FeIII

PO4

(n=1) toward FeIII

P4O13 (n=4) or from FeII

2P2O7 (n=2) toward a composition of long-chain

iron polyphosphate (n → ∞). Alternatively, the evolution of the Fe/P ratio could also be

explained by the transformation of FeII

2P2O7 into FeIII

2P4O13, involving both Fe(II) oxidation

and phosphate polymerization. Determination of the local iron oxidation state in E. gracilis

cells would help to better constrain the stoechiometry of these mineral phases.

Biological and environmental implications

The biological role of the observed intracellular iron phases is still unknown. They

could play a detoxification role in Euglena cells exposed to very high Fe(II) concentrations in

AMD. Alternatively, they might have a similar function as iron polyphosphates often

described in prokaryotic cells (Lechaire et al., 2002) and in unicellular algae (Nagasaka et al.,

2004), that can be expressed in response to various stresses, such as light stress (Smillie &

Krotkov, 1960) or exposition to toxic compounds (Appanna & Hamel, 1996; Nishikawa et al.,

2003; Chavez et al., 2004; Nagasaka et al., 2004). Owing to their polymorphism, size

(between 500 nm and a few microns in diameter) and to their chemical content (phosphorus-

a

c

b

Page 202: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

202

rich electron dense material associated to divalent cations), E. mutabilis vacuolar ferrous

phosphates are comparable to the Ca polyphosphates accumulating within single membrane

intracellular acidic organelles, known as acidocalcisomes (Docampo et al., 2005; Miranda et

al., 2004). Relationships between the organelles observed in this study and acidocalcisomes

would deserve future structural and biochemical investigations.

In the Carnoulès AMD, iron is mostly immobilized by massive precipitation of

crystalline and amorphous iron-arsenic hydroxysulfates, which have been demonstrated to

result from bacterial activity (Morin et al., 2003). In contrast, the intracellular ferrous

phosphates in E. mutabilis cells do not contain arsenic, although it is known that both arsenite

and arsenate easily sorb on iron oxides and that arsenate usually substitutes to phosphate

groups (e.g. Morin et al. 2006 and references therein). These results are consistent with the

low concentration of intracellular arsenic reported by Casiot et al., 2004 in E. mutabilis from

the Carnoulès AMD, namely 336 µg.g-1

of dry weight corresponding to approximately 3

mg.L-1

arsenic in living cells (against 80-250 mg.L-1

in the Reigous water). The absence of

intracellular accumulation of arsenic in E. mutabilis contrasts with the behaviour of other

toxic elements in the model alga E. gracilis, such as Cu2+

and Zn2+

(Einicker-Lamas et al.,

2002), which have been found to accumulate within intracellular phosphate-rich phases. A

previous study investigating the mechanism of arsenic resistance in E. gracilis, highlighted

the role of the glutathione pathway (Miot et al., 2008) and the absence of intracellular arsenic

accumulation, potentially relying on an arsenic excretion pathway. This arsenic excretion

mechanism could thus adequately explain the low arsenic, iron-rich deposits observed in both

Euglenae. Noteworthy, the decoupling between As(III) and Fe(II) pathways in E. mutabilis

and in E. gracilis contrasts with what is known from abiotic and bacteria-mediated processes

in AMD systems (Morin & Calas, 2006) and could provide a signature of such eukaryotic

metabolisms in recent and ancient Fe/As rich natural systems.

ACKNOWLEDGMENTS

The authors are indebted to Dr. Guillaume Wang (CNRS-CECM, Vitry-sur-Seine) for STEM

imaging and microanalysis. This work was supported by the ECCO/ECODYN CNRS/INSU

Program, by ACI/FNS grant #3033, by SESAME IdF grant #1775, and by NSF-EMSI Grant

CHE-0431425 (Stanford Environmental Molecular Science Institute). This is IPGP

Page 203: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

203

contribution #nnnn.

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Page 207: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

207

Chapitre 2.B.

Détoxification et toxicité de l’arsenic (As(III) et As(V)) chez E. gracilis

Problématique et objectifs.

Toxicité de l’arsenic. Outre les fortes teneurs en fer dissous, les AMD tels que celui de

Carnoulès sont également très riches en arsenic. L’arsenic sous ses deux états redox As(III) et

As(V) en solution présente une forte toxicité vis-à-vis des organismes vivants. La toxicité de

l’As(III) est généralement attribuée à sa capacité à pénétrer dans les cellules de façon passive

via des aquaglycéroporines (Rosen, 2002) et à entraîner la production de radicaux libres dans

la cellule (Bau et al., 2002). Par ailleurs, la toxicité de l’As(V) est attribuée à la similarité

entre les deux oxyanions arsenate et phosphate. Ainsi, l’arsenate se substitute aux

groupements phosphate et aux têtes de choline dans les phospholipides de la membrane

plasmique (Tuan et al., 2008). L’arsenate peut aussi pénétrer dans les cellules par les

transporteurs phosphate (Yompakdee et al., 1996, Rosen, 2002). Une fois dans la cellule, il

peut se substituer aux groupements phosphate des molécules biologiques, telles que l’ADP,

l’ATP ou les pompes ioniques (Moore et al., 1983, Slooten & Nuyten, 1983, Kenney &

Kaplan, 1988). Enfin, quoique dans une moindre mesure que l’As(III), l’As(V) peut entraîner

la production de radicaux libres pouvant endommager l’ADN (Ding et al., 2005).

Mécanismes de résistance à l’arsenic chez les procaryotes et chez les eucaryotes. Différents

mécanismes de résistance ont été développés par les procaryotes et les eucaryotes pour

résister à la toxicité de l’arsenic. Dans les écosystèmes de type AMD, la première stratégie de

détoxification est la précipitation extracellulaire de phases solides riches en Fe-As (Morin et

al., 2003, Morin & Calas, 2006). Mais les mécanismes intracellulaires jouent également un

rôle important en permettant de maintenir les concentrations cytoplasmiques d’As à des

niveaux bas et vont se révéler d’importance majeure pour les Euglènes étudiées dans l’AMD

de Carnoulès. Le schéma classique de détoxification cellulaire de l’arsenic passe par (1) le

prélèvement de l’arsenic sous forme d’As(III) via des aquaglycéroporines ou sous forme

d’As(V) via des transporteurs phosphate ; (2) la réduction de l’As(V) en As(III) par des

arsenate réductases et (3) l’export ou la séquestration intracellulaire de l’As(III) (Rosen,

2002). Cependant, si le schéma global est similaire chez les procaryotes et les eucaryotes,

certaines protéines spécifiques sont le fruit de convergences évolutives. En particulier, au

moins trois familles d’arsenate réductases ont été identifiées, qui seraient issues de chemins

évolutifs différents (Mukhopadhyay & Rosen, 2002) : l’arsenate réductase ArsC du plasmide

Page 208: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

208

pI258 de Staphylococcus aureus (Ji et al., 1994), l’arsenate réductase procaryote ArsC

d’Escherichia coli (Rosen, 1999) et l’arsenate réductase Acr2p de Saccharomyces cerevisiae

(Bobrowicz et al., 1997) qui est la seule arsenate réductase eucaryote identifiée à ce jour. Par

ailleurs, les enzymes impliquées dans le cycle du glutathion jouent un rôle clé dans la phase

de réduction de l’As(V) en As(III) et dans la complexation de l’As(III) avant son export ou sa

séquestration vacuolaire, aussi bien chez les procaryotes, que chez les plantes ou les

mammifères (Zaman et al., 1995, Mukhopadhyay et al., 2000, Cobbett, 2000). Le glutathion

est un peptide de trois acides aminés (γ-Glu-Cys-Gly), dont la synthèse s’effectue en deux

étapes ATP-dépendantes, catalysées successivement par la γ-glutamyl-cystéine-synthase et

par la glutathion-synthase. Sous sa forme réduite (GSH), il réduit l’As(V) en As(III), selon

l’équation 1:

H2AsO4- + 2 GSH + H

+ � H3AsO3 + GS-SG + H2O (Eqn. 1)

Les glutarédoxines, oxydoréductases ubiquistes de la famille des thiorédoxines, ont également

été identifiées chez E. coli, chez la levure (Fernandes & Holmgern, 2004) et plus récemment

dans une plante (Sundaram et al., 2008), qui peuvent aussi jouer ce rôle de réducteur.

La polymérisation du glutathion, catalysée par la phytochélatine-synthase, conduit à la

formation de peptides de plus haut poids moléculaire, les phytochélatines : γ-(Glu-Cys)n-Gly,

avec n<10. Ces peptides jouent un rôle dans la détoxification de l’arsenic mais aussi d’autres

métaux lourds, tels que le Cd chez de nombreux microorganismes ou plantes (Cobbett, 2000).

Le rôle de la méthylation de l’arsenic comme mécanisme de détoxification est largement

remis en question depuis quelques années. Plusieurs auteurs observent que les espèces

méthylées (et plus particulièrement les espèces méthylées d’As(III)) sont responsables d’une

toxicité accrue de l’arsenic (Styblo et al., 2002).

Objectifs de cette étude. Dans les environnements extrêmes que représentent les AMD, les

concentrations en As(III) et en As(V) dissous peuvent atteindre des concentrations létales

pour la plupart des organismes vivants (de l’ordre de 260 et 100 mg.L-1

respectivement dans

l’AMD de Carnoulès). Pourtant, même si la diversité microbienne est plus faible dans ces

environnements que dans des systèmes non pollués (Bruneel et al., 2006), plusieurs espèces

procaryotes et de rares eucaryotes sont adaptés à ces conditions. E. gracilis et E. mutabilis

sont parmi les seuls eucaryotes résistant à ces concentrations en métalloïdes, ce qui pose la

question des mécanismes de résistance à l’arsenic de ces microorganismes. Si les mécanismes

Page 209: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

209

de résistance ont été déjà en partie élucidés chez les mammifères ou chez des procaryotes, ils

restent largement inexplorés chez les eucaryotes présents dans les AMD.

Méthodologie.

Utilisation de la spectroscopie d’absorption X pour l’analyse d’éléments traces. Pour fournir

des éléments de réponse à cette question, nous avons déterminé la spéciation de l’arsenic dans

des cellules d’E. gracilis, cultivées au laboratoire dans des milieux enrichis en As(III) (article

#6, p. 201) ou As(V) (article #7, p. 207). Dans ces deux cas, la spéciation de l’arsenic a été

explorée par spectroscopie d’absorption des rayons X (XAS) au seuil K de l’As. Cette

technique permet d’accéder aux caractéristiques de l’environnement atomique de l’élément

d’intérêt dans des systèmes dilués (quelques dizaines de mg.kg-1

). Il permet par ailleurs de

déterminer la nature des ligands de la première sphère de coordination de l’arsenic (O, C, S en

particulier). En revanche, ne permettant pas d’accéder à la nature des atomes situés à plus de 5

Å de l’atome central d’arsenic dans des matériaux non cristallins, cette méthode ne permet pas

de discriminer une unité peptidique d’un polymère composé de plusieurs de ces unités. En

conséquence, les techniques classiques de biologie moléculaire (e.g. HPLC, spectrométrie de

masse) sont complémentaires de cette approche.

Principaux résultats et perspectives.

Nos résultats indiquent qu’E. gracilis est plus résistante à l’As(III) qu’à l’As(V). A faible

concentration en As(V), les mécanismes de détoxification passent par une étape de réduction

en As(III). Ensuite, que l’arsenic soit initialement fourni sous forme d’As(III) ou d’As(V),

l’As(III) est complexé dans le cytoplasme à des ligands protéiques de faible poids moléculaire

via des liaisons thiols, avant d’être exporté de la cellule. L’utilisation d’une molécule inhibant

des enzymes participant à la synthèse du glutathion (la buthionine sulfoximine) montre que le

cycle du glutathion est impliqué dans l’étape de complexation de l’As(III). Nous avons

également testé d’autres inhibiteurs enzymatiques afin de mieux cerner les protéines en jeu

dans le mécanisme de détoxification de l’As(III) chez E. gracilis (Fig. 2B-1). Les résultats

préliminaires que nous avons obtenus nécessiteront d’être répliqués dans le futur, afin de

confirmer les hypothèses que nous émettons. La molécule MK-571 est un inhibiteur des

multidrug resistance proteins (MRP), impliquées dans l’export des complexes métal-

glutathion des cellules chez les mammifères. A une concentration de 5 µmol.L-1

, cette

molécule n’a aucun effet sur la croissance des cellules cultivées en l’absence d’arsenic. En

revanche, en présence de 100 mg.L-1

d’As(III) dans le milieu de culture, la densité cellulaire

Page 210: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

210

obtenue en phase stationnaire est diminuée. Ceci suggère une potentielle implication de MRP

ou d’autres transporteurs sensibles au MK-571, dans l’export d’As(III) depuis la cellule d’E.

gracilis. Par ailleurs, il serait également intéressant de tester l’effet du Vérapamil, inhibiteur

des P-glycoprotéines, une autre famille de transporteurs impliqués dans l’export de complexes

glutathion-métal. En effet, une étude a identifié de tels transporteurs chez E. gracilis

surexprimés en présence de cadmium (Einicker-Lamas et al., 2003).

A des concentrations initiales en As(V) dépassant 100 mg.L-1

, l’As(V) n’est majoritairement

pas réduit en As(III) et affecte fortement la croissance cellulaire. Dans ces conditions, l’As(V)

est presqu’exclusivement concentré dans la fraction insoluble des cellules

(membranes+organites). Notre étude suggère que deux étapes pourraient être responsables de

la toxicité accrue de l’As(V) dans E. gracilis : (1) le prélèvement préférentiel de l’As(V) en

solution par comparaison avec l’As(III) et (2) la compétition entre la réduction de l’As(V) et

la substitution de l’arsenate aux groupements phosphate dans les composants cellulaires.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

WTWT + 0.5 µM MK 571WT + 2 µM MK 571WT + 5 µM MK 571

Ab

so

rban

ce (

64

0 n

m)

Temps, jours

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

As 100As 100 + 0.5 µM MK571As 100 + 2 µM MK571As 100 + 5 µM MK 571

Ab

so

rban

ce (

64

0 n

m)

Temps, jours

Figure 2B-1. Courbes de croissance d’E. gracilis en présence en l’absence (WT) ou en

présence d’As(III) à 100 mg.L-1

(As 100) et en présence de l’inhibiteur MK 571, inhibiteur

des multidrug resistance proteins (MRP1).

Si nos résultats prouvent que l’utilisation de la spectroscopie d’absorption des rayons

X (XAS) permet de contraindre fortement les mécanismes de résistance à l’arsenic chez un

eucaryote unicellulaire, il est évident que le couplage à des techniques biochimiques (e.g.

HPLC, spectrométrie de masse), permettra –dans le futur – d’identifier plus précisément les

A B

Page 211: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

211

protéines ou peptides impliqués dans ces mécanismes. De telles expériences ont récemment

débuté dans notre laboratoire et en collaboration avec Laurence Sabatier à l’Institut

Pluridisciplinaire Hubert Curien (IPHC) de Strasbourg.

Page 212: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

212

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217

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218

Page 219: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

219

Detoxification and high toxicity of As(V) in Euglena gracilis.

Jennyfer Miot1,*, Guillaume Morin1, Fériel Skouri-Panet1, Céline Férard1, Antonine

Poitevin1, Emmanuel Aubry2, Georges Ona-Nguema1, Farid Juillot1, François Guyot1,

Gordon E. Brown Jr3,4

.

1 Institut de Minéralogie et de Physique des Milieux Condensé and Institut de Physique du

Globe de Paris, Universités Paris 6 et Paris 7, UMR 7590, CNRS.

140, rue de Lourmel 75015 Paris, France

2 Biogéochimie et Ecologie des Milieux Continentaux (Bioemco)

UMR 7618 Université Paris 6, INRA, INAPG, CNRS, ENS, ENSCP

Case 120 Tour 56, couloir 56-66 4ème étage 4 place Jussieu 75252 Paris cedex 05, France.

3Surface & Aqueous Geochemistry Group, Department of Geological & Environmental

Sciences, Stanford University, Stanford, CA 94305-2115, USA

4Stanford Synchrotron Radiation Laboratory, MS 69, SLAC, Menlo Park, CA 94025, USA

Submitted to

Environmental Science & Technology

September 2008

*Corresponding author:

[email protected] Tel: 0033144279832; Fax: 0033144273785

Page 220: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

220

Abstract

Euglena gracilis is a photosynthetic eukaryote ubiquitous in arsenic-polluted acid mine

drainages. This protozoan is locally exposed to As(III) and As(V) concentrations up to 250

mg L-1

and 100 mg L-1

respectively. In a previous study (1), we investigated the resistance of

E. gracilis to As(III), which was found to accumulate only at very small extent in the cells. In

the present paper, As(V) toxicity towards E. gracilis is evaluated by X-ray absorption

spectroscopy and selected (bio)chemical methods. We observe that E. gracilis is less resistant

to As(V) than to As(III). At As(V) concentrations < 100 mg L-1

, our results suggest the

following detoxification scheme: (1) uptake of As(V) from solution, (2) intracellular

reduction to As(III), (3) complexation by specific proteic thiol ligands of low molecular

weight in the cytoplasm, and (4) As(III) expulsion from the cell. However, at As(V)

concentrations > 100 mg L-1

, cell growth is dramatically affected, and As(V) remains mostly

unreduced. Intracellular As(V) is found to be exclusively concentrated in the insoluble

fraction, suggesting that arsenate could substitute for phosphate groups in membranes or in

phosphate-containing macromolecules. Thus, our study highlights the partitioning of arsenic,

with proteic As(III)-thiol compounds concentrated in the cytoplasmic proteic pool and As(V)-

compounds associated with the membrane+organite fraction. In addition, arsenic was not

accumulated at high levels in the cells, although accumulation was higher when arsenic was

introduced as As(V) than as As(III). We suggest that two steps could account for the higher

toxicity of As(V) compared to As(III) in E. gracilis: (1) higher bioavailability and uptake of

As(V) from solution and (2) competition between As(V) reduction and arsenate substitution

for phosphate in cell components.

Page 221: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

221

Introduction

Water contamination by arsenic is a major health and environmental issue because its

concentration exceeds the current World Health Organization maximum contaminant level

(10 µg L-1

) in tens of thousands of sites worldwide (2). In particular, acid mine drainages

(AMD) resulting form the weathering of As-rich sulfide mine wastes exhibit extremely high

concentrations of dissolved arsenic (up to 250 mg L-1

) (3). At the acidic pH prevailing in these

systems (pH 2-4) (3), dissolved arsenic is present dominantly in two highly toxic forms:

H3AsIII

O3 and H3AsVO4. In AMD, arsenic is dominantly released as H3As

IIIO3, but dissolved

As(V) concentrations can also reach very high levels (e.g., more than 100 mg L-1

in the

Carnoulès AMD) (4).

Although biodiversity is lower in these systems than in unpolluted ones, various

microorganisms are adapted to these extreme environments (5). In particular, photosynthetic

protozoans of the genus Euglena are among the few eukaryotes ubiquitous in these systems

(4, 5, 6). At the Carnoulès site (Gard, France), Euglena mutabilis, a close relative of Euglena

gracilis (7), is locally exposed to very high As(III) concentrations, up to 250 mg L-1

and to

high levels of As(V), reaching more than 100 mg L-1

(4).

As(III) detoxification in E. gracilis has been shown to proceed through the glutathione

pathway (8), leading to the production of As(III)-thiol bonds, potentially in the form of

As(III)-(SG)3 or As(III)-phytochelatin complexes (1). The toxicity of As(V) is related to the

similarity of arsenate and phosphate oxoanions. Outside the cell, arsenate substitutes for

phosphate groups and for choline heads in phospholipids of the plasma membrane (9).

Arsenate can also enter the cell through phosphate transporters (10, 11), and once inside the

cell, it can substitute for phosphate groups in molecules such as ADP, ATP, or ion-pumps (12,

13, 14). Arsenate can also enhance the production of free radicals inducing DNA damage,

though to a lesser extent than As(III) (15). Despite these important findings, the mechanisms

of arsenate detoxification have not been studied in eukaryotic microorganisms observed in

As-rich AMD.

In the present study, we investigate the resistance of the photosynthetic protozoan E. gracilis

to As(V) concentrations reaching those encountered in AMD in order to assess possible

mechanisms accounting for the adaptation of this eukaryote to elevated As(V) concentrations

in the field. E. gracilis cells were exposed to As(V) concentrations ranging from 0 to 200 mg

L-1

in batch cultures performed at acidic pH. Arsenic speciation in the cells and intracellular

Page 222: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

222

localization of As-bearing compounds were determined by X-ray Absorption Spectroscopy

(XAS) and by chemical and biochemical methods.

Materials and Experimental Procedures

Cell cultures. All reagent grade chemicals used for culture medium preparation were from

Sigma-Aldrich, except for FeCl3 and Na3AsVO4, which were purchased from Fluka-Chemika.

Euglena gracilis Z (n°1224-5d, Cambridge) was cultured at ambient temperature under

permanent light exposure in a pH 3.2 culture medium composed of KH2PO4 (0.5 g L-1

),

MgSO4, 7H2O (0.5 g L-1

), CaCl2, 2H2O (0.26 g L-1

), (NH4)2HPO4 (0.5 g L-1

), and a

complement of vitamins, zinc (as ZnSO4), iron (as FeCl3), and manganese (as MnSO4) (16).

Ethanol was supplied as a carbon source. In test cultures and abiotic controls, arsenic was

added as Na2HAsVO4 at the following concentrations: 10, 50, 100, and 200 mg L

-1. Growth

kinetics of the cultures were monitored by measuring the optical absorbance of the cultures at

640 nm for 8 days.

Sample preparation. For XAS analyses and arsenic concentration measurements, cells were

harvested by centrifugation (5000 g, 10 min) either in the exponential phase (Eg-As50, Eg-

As100 and Eg-As200) or the stationary phase (Eg-As100*), rinsed twice in MilliQ water,

dried at ambient temperature under vacuum, and ground in an agate mortar. Powders were

stored under nitrogen atmosphere before XAS analyses. For total arsenic analysis, 10 to 20

mg of dry powders were weighed (precision: 0.1 mg) and batch digested in 1 mL 15M HNO3

at 100°C for 24 h, sonicated for 5 minutes, and diluted to 5 mL in MilliQ water.

Supernatants of the 10-day old cultures and the abiotic controls were filtered through a

0.22µm membrane filter. A first fraction of filtered supernatants was acidified with 1M HNO3

for analysis of total As concentration in solution. A second fraction was used to separate

As(III) and As(V) on an anionic resin (Varian Bondelut JR-SAX 500mg) after a method

modified from Ficklin (17). The resin was first humidified with 5 mL of MilliQ water, and

then 5 mL of the filtered supernatant of the culture and 15 mL of MilliQ water were

successively eluted through the resin to obtain the As(III)-extract. Finally, 15 mL of 0.12M

HCl were eluted to obtain the As(V)-extract.

Page 223: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

223

Cells used for intracellular localization of As-containing compounds by XAS and for

liquid chromatography analyses of the culture of E. gracilis cells exposed to 100 mg L-1

As(V), cells were harvested by centrifugation (5000 g, 10 min), and rinsed twice in 50 mM

Tris – 20 mM NaCl buffer (pH 7). Cells were then sonicated in the same buffer to which 0.2

µM AEBSF (antiprotease from Novagen) was added and centrifuged 2 to 4 times (11000 g,

30 min). The supernatant following centrifugation is referred to as the cytoplasmic fraction,

and the pellet, which contained a mixture of membranes and organites, is referred to as the

insoluble fraction. The insoluble fraction was dried under vacuum and ground in an agate

mortar inside an anoxic glove-box for XAS analyses. The cytoplasmic fraction was split into

two portions, one of which was used for Liquid Phase Chromatography analyses (see infra).

The other portion was prepared for XAS analyses by precipitating proteins with 6.1 M

trichloroacetic acid. Proteins were subsequently collected as a pellet by centrifugation (11000

g, 45 min), dried under vacuum, and ground in an agate mortar in an anoxic glove box.

Protein separation by liquid chromatography. Proteins from the cytoplasmic fraction were

size-separated by Liquid Phase Chromatography (LPC) using a Sephacryl S200 16/60 column

(GE Healthcare) and a 50 mM Tris-20 mM NaCl (pH 7) buffer as an eluent. Proteins were

detected at λ = 280 nm. The separated proteins of the profile were collected, and a total of 43

fractions (2 mL each) were further analyzed for their arsenic content.

Arsenic analysis in solution. Total As concentrations in the digests, in the culture

supernatants, in the fractions collected from liquid chromatography, in the abiotic controls,

and in the As(III)-extracts from the culture supernatant were determined by Flame Atomic

Absorption Spectrometry (Solaar S, Thermo electron corporation). Arsenic concentrations in

the As(V)-extracts from the culture supernatants were measured by Furnace Atomic

Absorption Spectrometry (Unicam 989 QZ, Thermo electron corporation).

Model compounds. Arsenobetaine (AB, Sigma-Aldrich) and As(III)-tris-glutathione (As-

(GS)3) were used as model compounds for the XAS experiments. As-(GS)3 was synthesized

under dry nitrogen atmosphere by adding an excess of reduced glutathione (GSH, Sigma-

Aldrich) to NaAsO2 (Fluka Chemika): 1 mg of NaAsO2 was allowed to react overnight with

100 mg of GSH in 5 mL of degassed MilliQ water. The solution was evaporated to dryness at

ambient temperature under a nitrogen atmosphere, and the resulting white precipitate was

collected as a powder.

Page 224: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

224

XAS data collection and analyses. Data were recorded at the As K-edge (11859 eV) on

beamline 11-2 at the Stanford Synchrotron Radiation Laboratory (SSRL) using the same

procedure as described in Miot et al. (1) and Ona-Nguema et al. (18). X-ray absorption

spectra were averaged using the SixPack software (19). Background-subtracted EXAFS data

were extracted using the XAFS program (20) following the procedure detailed previously

(18). Least-squares fitting of the unfiltered EXAFS functions was performed with the plane-

wave formalism, using a Levenberg-Marquard minimization algorithm (18). Ab initio phase

shifts and total amplitude functions employed in this fitting procedure were calculated with

the curved-wave formalism using the ab-initio FEFF 8 code (21) and the crystallographic

parameters of phenyldichloroarsine-British Anti-Lewisite (22). For sample Eg-As100*,

XANES data were fit by linear lest-squares fitting (LSF) within the 11860 – 11890 eV energy

range, using linear combinations of XANES spectra of the As-(GS)3 model compound and the

Eg-As100*-insoluble fraction sample. This LSF procedure is detailed in a previous study by

Morin et al. (23).

Results

E. gracilis growth in the presence of arsenate. Growth kinetics of E. gracilis exposed to

arsenate at concentrations ranging from 10 to 200 mg L-1

are presented in Fig. 1. The final cell

density is highly dependent on the initial dose of As(V) in the culture medium: the cell

density is about 5 times lower in the presence of 200 mg L-1

As(V) than in the absence of

arsenic after 8 days of culture. Thus, E. gracilis is tolerant to As(V) up to 100 mg L-1

, but

growth is almost completely inhibited at an As(V) concentration of 200 mg L-1

.

Initial [AsV]

in the culture medium, mg L

-1

Total [As] in the supernatant, mg L

-1

[AsIII]/total[As] in the

supernatant, %

Total [As] in dry

cells, mg kg-1

As concentration

factor

10 8.5 ± 1 23.4 21 ± 5 0.20 ± 0.05 50 47.1 ± 1 16.6 51 ± 5 0.10 ± 0.01

100 92.4 ± 1 6.8 123 ± 10 0.12 ± 0.01 200 181.6 ± 1 3.2 946 ± 10 0.48 ± 0.005

TABLE 1. Total arsenic concentrations and As(III)/total As concentrations measured by

Atomic Absorption Spectrometry in abiotic controls, in the filtered supernatants and in the dry

cell mass of E. gracilis cultures, with initial As(V) concentrations ranging from 10 to 200 mg

L-1

, after 8 days of culture. As concentration factor in the living cells with respect to the

supernatant was calculated as: (Total [As]dry cells * 0.1) / Initial [AsV]culture medium

Page 225: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

225

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Ab

so

rban

ce (

640

nm

)

Time, days

Figure 1. Growth curves of E. gracilis cultures determined by measuring absorbance at 640

nm. Cells were cultured at increasing As(V) concentrations: (●) 0 mg L-1

, (□) 10 mg L-1

, (■)

50 mg L-1

, (∆) 100 mg L-1

, (×) 200 mg L-1

. Cells were sampled either in the exponential or in

the stationary phase (grey areas). Growth kinetics are slowed down with increasing As(V)

concentrations in the culture medium.

Measurements of As concentration in the supernatants of the cultures and in the acid-

digested pellets (Table 1) indicate that small amounts of arsenic are accumulated within the

cells. Indeed, 21±5 to 946±10 µg of As are accumulated per g of dry cells for initial As(V)

concentrations in the culture medium ranging from 10 to 200 mg L-1

. Assuming that E.

gracilis cells are composed of 90 wt% water, we deduce that As concentrations in the living

cells range from around 2 to 90 mg L-1

for initial As(V) concentrations ranging from 10 to

200 mg L-1

, respectively. Calculating the arsenic concentration factor in the living cells as:

As concentration factor = (Total [As]dry cells * 0.1) / Initial [AsV]culture medium

we conclude that As concentration in the living cells is 2 to 10 times lower than in the culture

medium. Moreover, no intracellular arsenic accumulation could be detected by EDX (Energy

Dispersive X-ray Spectroscopy) performed in a TEM (Transmission Electron Microscope) on

E. gracilis thin sections (data not shown). These results indicate that E. gracilis does not

accumulate significant amounts of arsenic. Moreover, we observe that arsenic in the

supernatants is partly reduced to As(III), the proportion of As(III) decreasing with increasing

initial As(V) concentration in the culture medium and being negligible at 200 mg L-1

As(V).

Page 226: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

226

Arsenic speciation in E. gracilis. X-ray Absorption Near Edge Structure (XANES) spectra of

dry cells of E. gracilis exposed to 50 mg L-1

As(V) and sampled in the exponential phase (Fig.

2A) exhibit an absorption maximum at 11869.8 eV, which corresponds to As(III) coordinated

to three thiolate groups, such as in As(III)-(SG)3 (Fig. 2) (24). With increasing initial As(V)

concentration in the culture medium, we observe an absorption maximum at 11875 eV, which

corresponds to inorganic As(V). At the highest initial As(V) concentration (200 mg L-1

), only

the absorption maximum at 11875 eV remains. At intermediate values of initial As(V)

concentration (100 mg L-1

), this peak is predominant in the exponential phase sample (Eg-

As100), whereas absorption maxima at 11869.8 eV and at 11875 eV coexist in the stationary

phase sample (Eg-As100*).

11860 11870 11880 11890

No

rmali

ze

d a

bs

orb

an

ce

Energy, eV

11875 eV

11869.8 eV

CpFh-As(V)

Eg-As50

Eg-As100

Eg-As200

As-(SG)3

2

AB

Eg-As100*

11872.4 eV

4 6 8 10 12

k3χχ χχ

(k)

k, A-1

AB

As-(SG)3

Eg-As50

Eg-As100*

Eg-As200

10

CpFh-As(V)

Eg-As100

Figure 2. XAS data at the As K−edge of E. gracilis cells collected in exponential phase (Eg-

As10 to Eg-As200) or in stationary phase (Eg-As100*) exposed to As(V)

(As(V)

concentrations ranging from 50 (As50) to 200 mg L-1

(As200)), compared with the spectra of

the standards As(III)-tris glutathione (As-(GS)3), arsenobetaine (AB) and As(V) (1 wt%)

coprecipitated with ferrihydrite (CpFh-As(V)). Eg-As100 and Eg-As100* samples are from

two independent cultures at 100 mg L-1

As(V). A: XANES spectra. B: Unfiltered k3χ(k) data

and C: corresponding Fourier Transforms. Dashed lines show the data and solid lines the best

fits on the k3χ(k) data (see Table 2).

0.5 1.5 2.5 3.5

FT

mag

nit

ud

e

R(Å)

AB

As-(SG)3

Eg-As50

Eg-As100*

Eg-As100

20

CpFh-As(V)

Eg-As200

A B C

Page 227: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

227

Sample N

(± 0.3)

Bond R (Å)

(± 0.03)

σσσσ (Å)

(± 0.02)

E0 (eV)

(± 3)

χχχχ

2

AB 3.5 As-C 1.91 0.05 14 32.0 As-(GS)3 3.2 As-S 2.25 0.05 13 20.0

Eg-50ppm 1.5 As-S 2.27 0.07 19 29.2

1.2 As-C 1.98 Eg-100ppm 1.6 As-S 2.27 0.05 17 22.6

0.8 As-C 1.99 0.2 As-O 1.72

Eg-100ppm* 0.6 As-S 2.24 0.06 3 22.3 2.5 As-O 1.68 0.4 As-M 3.23 12.3 As-O-O 3.00

Eg-100ppm*, insoluble fraction

0.2 As-S 2.27 0.05 5 46.6

3.5 As-O 1.69 0.4 As-M 3.25 12 As-O-O 3.03

Eg-100ppm*, soluble proteins

2.4 As-S 2.26 0.04 14 166

Eg-200ppm 0.2 As-S 2.31 0.05 4 29.7 3.6 As-O 1.69 0.5 As-M 3.18 12.1 As-O-O 3.00

TABLE 2. Fitting results for arsenic K-edge EXAFS data of E. gracilis cells exposed to

As(V) and collected in exponential phase (Eg-50ppm, -100ppm, -200ppm) or in stationary

phase (Eg-100ppm*) and of the As-tris-glutathione (As-(GS)3) and arsenobetaine (AB) model

compounds. Coordination number (N), interatomic distance (R), Debye-Waller parameter (σ)

and energy offset (E0). The fit quality was estimated within the 2.7 – 13 Å-1

k-range, using a

reduced χ2 of the following form:

χ2 = Nind / ( Nind - p ) Σ ( k

4 χ(k)exp – k4 χ(k)calc)

2

with Nind (the number of independent parameters) = (2∆k∆R)/π), p the number of free fit

parameters. Standard deviations indicated under bracket are estimated from the fit of the As-

tris-glutathione model compound.

Fitting results of the Extended X-ray Absorption Fine Structure (EXAFS) spectra are

presented in Table 2 and plotted in Figs. 2B and 2C. At low initial As(V) concentration in the

culture medium (50 mg L-1

), the first-neighbour shell around As mainly consists of S ligands

at a distance (2.27±0.03 Å), which is consistent with the distance measured in As(III)-(SG)3

(2.25±0.03 Å). Arsenic is also partly bound to C ligands at 1.98±0.03 Å. This distance is

longer than the As(V)-C distance measured by EXAFS in the As(V)-methylated molecule

arsenobetaine (1.91±0.03 Å, Table 2) or calculated from the crystal structure of

tetramethylarsonium (1.90 ± 0.02 Å) (25). In contrast, this distance is consistent with that

reported for crystal structures of As(III)-methylated compounds (22). Therefore, our EXAFS

results suggest that arsenic is partly present as an As(III)-methylated compound.

Page 228: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

228

At higher initial As(V) concentrations in the culture medium (100 mg L-1

), the first-

neighbor shell consists of a mixture of S ligands at 2.24±0.03 Å and O ligands at 1.68±0.03

Å, which is consistent with the distance measured in inorganic As(V) compounds (e.g. (26)).

At an initial As(V) concentration of 200 mg L-1

, S ligands are almost negligible in the first

shell that consists mainly of O ligands at 1.69±0.03 Å. These results indicate that As(V) is

reduced to As(III) and incorporated into an As(III)-thiol compound at low initial As(V)

concentrations and in minor proportions into an As(III)-methylated compound. However, with

increasing As(V) concentration in the culture medium, most of arsenic remains in an oxidized

form bound to O ligands in the cells.

Finally, EXAFS data fits require the contribution of a metal ligand at ≈ 3.2 Å to fit the second

shell in the cells exposed to 100 and 200 mg L-1

As(V). Fits were performed using an As-As

pair: however, this EXAFS signal could also be fitted by another metal ligand, such as Fe or

Zn. Indeed, intracellular Fe accumulation has been described in E. gracilis (27), and high

concentrations of Zn within E. gracilis cells were observed by XAS in fluorescence-yield

mode (data not shown). Assessing the nature of this additional component would require

further investigations.

Intracellular localization of arsenic species. Because As was not accumulated at high levels

in the cells, classic methods such as energy-dispersive X-ray microanalyses could not help in

localizing As-bearing compounds in E. gracilis. To overcome this difficulty, we disrupted E.

gracilis cells exposed to 100 mg L-1

As(V) and sampled the in stationary phase (Eg-As100*),

which were shown to contain a mixture of As(III)-thiol molecules and As(V)-bearing

compounds. Cell disruption allowed the separation of a “cytoplasmic” fraction from an

“insoluble” fraction (containing membranes and organites). Proteins in the cytoplasmic

fraction were precipitated and analyzed by XAS (fraction denoted “soluble proteins”) as well

as the insoluble fraction.

Page 229: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

229

11860 11870 11880 11890 11900

No

rma

lize

d a

bs

orb

an

ce

Energy, eV

2

CpFh-As(V)

Eg-As100*

Eg-As100*,insoluble fraction

Eg-As100*soluble proteins

As-(SG)3

11875 eV

11869.8 eV

4 5 6 7 8 9 10 11 12

k3χχ χχ

(k)

k, A-1

10

As-(SG)3

Eg-As100*, soluble proteins

Eg-As100*

Eg-As100*,insoluble fraction

CpFh-As(V)

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

FT

ma

gn

itu

de

R(Å)

As-(SG)3

Eg-As100*, soluble proteins

Eg-As100*

Eg-As100*,insoluble fraction

20

CpFh-As(V)

Figure 3. XAS data at the As K−edge of the whole cells of E. gracilis exposed to 100 mg L-1

As(V) and collected in stationary phase, and of the soluble proteins and insoluble fraction of

the same culture, compared with the spectra of the standards As(III)-tris glutathione (As-

(GS)3) and As(V) (1 wt%) coprecipitated with ferrihydrite (CpFh-As(V)). A: X-ray

Absorption Near-Edge Structure (XANES) spectra. B: Unfiltered k3χ(k) EXAFS data and C:

corresponding Fourier Transforms. Dashed lines show the data and solid lines the best fits on

the k3χ(k) data (see Table 2).

XANES spectra of the soluble proteins exhibit an absorption maximum at 11869.8 eV,

whereas the XANES spectra of the insoluble fraction exhibit an absorption maximum at

11875 eV, with a small shoulder at 11869.8 eV (Fig. 3A). Accordingly, best fits of the

EXAFS data indicate that As is mainly bound to S ligands at 2.26±0.03 Å in the soluble

proteins, whereas As is mainly bound to O ligands at 1.69±0.03 Å in the insoluble fraction

(with a minor contribution of S ligands at 2.27±0.03 Å; Table 2). In addition, the XANES

spectrum of the whole cells exposed to 100 mg L-1

As(V) is well fit (χ2 = 4.4 10

-4) with a

linear combination of the XANES spectra of As(III)-(SG)3 (22.7 %) and the insoluble

fraction (representing an As(V) reference compound) (77.7 %) (Fig. 4). These results are

consistent with a partitioning of the As-bearing species within E. gracilis cells exposed to

As(V): the reduced As(III)-thiol compounds are mainly present in the cytoplasmic proteic

pool and the As(V) compounds are specifically associated with membranes and/or organites.

A B C

Page 230: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

230

11860 11870 11880 11890 11900

No

rma

lize

d a

bs

orb

an

ce

Energy, eV

0,511875 eV

11869.8 eV

Eg-As100*

Eg-As100*,membranes

As-(SG)3

Figure 4. Linear decomposition of the XANES spectrum of E. gracilis cells exposed to 100

mg L-1

As(V) collected in the stationary phase (Eg-As100*) with the spectrum of As(III)-tris

glutathione (As-(GS)3) model compound and the insoluble fraction of the E. gracilis cells

exposed to 100 mg.L-1

As(V) (Eg-As(V)100*-insoluble fraction). Dashed lines represent the

data and solid lines represent the best fit. The fit gives a composition of 23 % As-(GS)3 and

78 % insoluble fraction, standing for an As(V) reference compound; χ2 = 4.4 10

-4.

Nature of As(III)-S complexes. In order to further characterize As(III)-bearing complexes

localized in the soluble protein fraction of E. gracilis cells exposed to 100 mg L-1

As(V),

proteins of the cytoplasmic fraction were size-separated by Liquid Phase Chromatography

(LPC), and total As concentration was measured in each 2-mL fraction collected after

separation. As shown in Fig. 5, the general profile is qualitatively similar in the absence and

presence of arsenic. Moreover, in the culture grown at 100 mg L-1

As(V), As concentration is

below the detection limit (2 µg L-1

) all along the profile except for two peaks near the end of

the profile (grey). This suggests that As(III) is bound by specific proteins but not by any of

protein containing thiolate groups. With an elution volume ranging from 97 to 119 mL, the

fractions enriched in As correspond to low molecular weight proteins (<6500 Da) or peptides.

Similar results have been obtained with cultures of E. gracilis cells exposed to 100 mg L-1

As(III) (data not shown), wherein As(III) was shown to bind to thiol ligands, presumably in

the form of As-(SG)3 or As-bearing phytochelatins (1). These results show that As(III)-thiol

insoluble fraction

Page 231: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

231

complexes observed by XAS in the cytoplasmic proteic pool of E. gracilis exposed to 100

mg.L-1

As(V) consist of specific As-bearing peptides or low molecular weight proteins.

0 50 100 150

Ab

so

rba

nc

e (

280 n

m),

a.u

.

Volume (mL)

Eg-As0

Eg-As100

96 100 104 108 112 116 1200

2

4

6

8

10

As

co

nc

en

tra

tio

n (

µg

.L-1

)

Volume (mL)A

bs

orb

an

ce

(2

80

nm

)(a

.u.)

Figure 5. Arsenic partitioning in the protein profile of E. gracilis cells exposed to As(V). A: Liquid Phase Chromatography profiles (absorbance at 280 nm) of the cytoplasmic fraction of

E. gracilis cells cultured in the absence of arsenic (top) or exposed to 100 mg L-1

As(V)

(bottom). B: Analysis of the two peaks containing As (highlighted in grey in A) for the

As(V)-exposed culture: Liquid Phase Chromatography profile (solid line) and total arsenic

concentrations (■) measured in the different fractions.

Discussion

As(V) detoxification by E. gracilis. In this study, we observe that E. gracilis is resistant to

As(V) up to 100 mg L-1

(Fig. 1). At low As(V) concentration (50 mg L-1

), As(V) is mostly

reduced to As(III) that binds to S ligands and to a lesser extent to C ligands (Fig. 2 and Table

2). As(III) complexed by C ligands is presumably in the form of As(III)-methylated

compounds (Table 2). Similar complexes have been previously observed in E. gracilis

exposed to low As(III) levels (< 100 mg L-1

) (1). On the other hand, As-S distances are

consistent with those measured in the reference compound As(III)-(SG)3. These As(III)-S

complexes are specifically localized in the proteic pool of the cytoplasm (Fig. 3), and

cytoplasmic arsenic is concentrated in the proteic fraction of low molecular weight (< 6500

A B

Page 232: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

232

Da), which is consistent with the molecular weights of glutathione (γ-Glu-Cys-Gly, MW=307

Da) or phytochelatins ((γ-(Glu-Cys)n-Gly, with n < 10, i.e. MW < 3000 Da, Fig. 5). These

results suggest that As(III) is complexed by thiol groups in the form of As-tris-glutathione

(As-(SG)3) or As-bearing phytochelatins in the cytoplasm of E. gracilis. In addition, we

observed that As speciation in the cells depends on the growth stage of the culture, with

As(V) reduction and complexation by thiol ligands being enhanced in the stationary phase

(Fig. 2). Finally, the presence of As(III) at non-negligible levels in the supernatants of the

cultures performed at low initial As(V) concentration suggests that As(III) is exported from

the cells (Table 1).

These results are consistent with the classical scheme of As(V) detoxification in

prokaryotes and eukaryotes (10). Indeed, given the chemical similarity of arsenate and

phosphate, As(V) is usually taken up by phosphate transporters, such as the Pho86p

transporter identified in Saccharomyces cerevisiae (11). Following this step, As(V) is reduced

into As(III) by an arsenate reductase, with GSH and glutaredoxin serving as electron donors

(28). As(III) then binds to S ligands in the form of glutathione or phytochelatins (29-32).

Similar complexation of As(III) by thiol ligands involved in the glutathione cycle have been

described in E. gracilis exposed to high As(III) levels (1). Finally, the As-S complexes are

either sequestered in vacuoles (10, 33) or exported from the cell through membrane proteins

such as multi-drug resistance proteins (MRP) or P-glycoproteins (33, 34). Interestingly, a P-

glycoprotein has been identified in E. gracilis exposed to Cd (35). In conclusion, the

following scheme can be proposed for As(V) detoxification in E. gracilis: (1) uptake of As(V)

from solution presumably through phosphate transporters, (2) reduction into As(III) within the

cell, (3) complexation by proteic thiol ligands of low molecular weight in the cytoplasm, and

(4) extrusion from the cell.

As(V) toxicity towards E. gracilis cells. At initial As(V) concentrations in the culture

medium equal to or higher than 100 mg L-1

, an important proportion of As(V) is not reduced

into As(III) but remains in an oxidized form bound to O ligands (Fig. 2 and Table 2). At 200

mg L-1

As(V), As(V) reduction is not detectable by XAS (i.e. less than 15% As(III)).

Interestingly, this coincides with a higher sensitivity of E. gracilis cells to As(V), the final cell

density being drastically reduced with increasing initial As(V) concentration above 100 mg L-

1 (Fig. 1). Because As(V) detoxification usually proceeds through a first step of reduction (see

supra), our results suggest that insufficient As(V) reduction in E. gracilis for initial As(V)

concentrations above 100 mg L-1

leads to relative accumulation of As(V), which appears to be

Page 233: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

233

harmful to the cells. This limitation of As(V) reduction could account in part for the lower

resistance of E. gracilis cells to As(V) than to As(III) (this study and (1)).

The relative toxicity of inorganic As(III) vs. inorganic As(V) is not well understood.

Indeed, As(III) toxicity relies on its capacity to enter the cells by passive diffusion through

aquaglyceroporins (10) and to enhance the production of free radicals in the cell (36). In

contrast, As(V) toxicity is related to its chemical similarity to phosphate. Arsenate is taken up

through phosphate transporters (28, 37) and has been shown to substitute for phosphate

groups and for choline heads in the phopsholipids of the plasma membrane (9). Moreover,

arsenate can substitute for phosphate groups in ADP, ATP or ion-pumps (12-14). In this

study, we observe that excess As(V) that could not be reduced is specifically concentrated in

the insoluble fraction, i.e. is potentially associated either with membranes or with phosphate-

containing biomolecules. Such accumulations are likely associated with cell death or their

inability to divide and grow.

We observed a greater accumulation of As(V) in the insoluble fraction of E. gracilis

cells in the present study (21 to 946 mg kg-1

for initial As(V) concentrations of 10 to 200 mg

L-1

, respectively) than of As(III) (14 to 315 mg kg-1

for initial As concentrations of 10 to 200

mg L-1

, respectively). This relative accumulation of As(V) suggests that the rate of As uptake

is higher for As(V) than for As(III), which may be related to the fact that As(V) uptake

proceeds actively (through phosphate transporters) (28, 37), whereas As(III) uptake proceeds

passively (through aquaglyceroporins) (10). Moreover, our results suggest an additional factor

that could account for the higher toxicity of As(V) in E. gracilis. Indeed, another rate-limiting

step in As(V) detoxification in E. gracilis could be the competition between As(V) reduction

and arsenate substitution for phosphate in cell components. Rosen (10) suggested that arsenate

detoxification (through reduction to As(III)) was inherited from the evolution of resistance

mechanisms to As(III) in the primitive ocean at the contact with the primordial reduced

atmosphere. Arsenate-reductases would have evolved from widespread phosphatases, as the

oxygen level rose in the atmosphere and as As(V) concentration increased in natural systems

(38). Three independently evolved families of arsenate reductases have been identified (39),

but only one enzyme is known in eukaryotes - namely the membrane protein Acr2p, which is

a member of the superfamily of the proteins tyrosine phosphate phosphatases (28, 37).

Because the genus Euglena branches very close to the root of eukaryotes, it would be

interesting to identify and characterize the arsenate reductase of E. gracilis that could

potentially share more similarities with phosphatases.

Page 234: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

234

Acknowledgments

The authors are indebted to the Stanford Synchrotron Radiation Laboratory (SSRL) staff,

especially John R. Bargar, Joe Rogers and Samuel Webb, for their technical assistance during

the XAFS experiments. This work was supported by the ECCO/ECODYN CNRS/INSU

Program, by ACI/FNS grant #3033, by SESAME IdF grant #1775, by NSF-EMSI Grant

CHE-0431425 (Stanford Environmental Molecular Science Institute), and by the France-

Stanford Institute for Interdisciplinary Studies. Portions of this research were carried out at

SSRL, a national user facility operated by Stanford University on behalf of the U.S.

Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences. This is IPGP contribution #nnnn.

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Page 238: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

238

Page 239: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

239

Conclusions

&

Perspectives

Page 240: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

240

Page 241: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

241

1. Mécanismes de résistance aux métaux et métalloïdes

Les environnements extrêmes (au sens entendu dans cette thèse c’est à dire

caractérisés par de fortes concentrations en éléments majeurs ou traces potentiellement

toxiques et de forts taux de minéralisation) ont pu favoriser l’émergence de systèmes

biochimiques spécifiques basés sur le transfert d’électrons et orientés soit à des fins

métaboliques, soit à des fins de détoxification uniquement. Les deux souches procaryotes

étudiées (BoFeN1 et SW2) utilisent le Fe(II) (en l’absence stricte d’O2) comme donneur

d’électrons pour leur métabolisme, ce qui conduit à la précipitation de Fe(III) à distance et/ou

au sein même des structures cellulaires (Chapitres 1A, 1B, AC). Chez la souche SW2, la

précipitation du fer est exclusivement localisée à l’extérieur des cellules sur des fibres lipo-

polysaccharidiques (Chapitre 1C et voir la Figure C-1 pour une comparaison des modes de

biominéralisation du fer chez ces deux souches). En revanche, la minéralisation du périplasme

mise en évidence chez BoFeN1 (Chapitre 1A) pose clairement la question de la viabilité

cellulaire et de la potentielle létalité de la biominéralisation intracellulaire du fer chez ces

bactéries (Chapitre 1E), question qui reste encore ouverte à l’issue de cette thèse. Les espèces

eucaryotes étudiées (Euglena mutabilis et Euglena gracilis) sont quant à elles exposées à de

fortes concentrations en Fe(II), As(III) et As(V) dans le milieu naturel, éléments dont la

toxicité vis-à-vis des cellules est très élevée (voir discussion Chapitre 1B). Des mécanismes

de réduction de l’As(V), de complexation de l’As(III) par des molécules organiques et

d’export hors de la cellule permettent à ces eucaryotes de résister à l’arsenic (Chapitre 1B et

voir la Figure C-2 pour un bilan de la détoxification de l’As chez E. gracilis comparée aux

mécanismes décrits chez la bactérie modèle E. coli et chez l’eucaryote modèle S. cerevisiae).

Concernant le fer, une compartimentation vacuolaire de cet élément lourd totalement

découplée des mécanismes de détoxification de l’arsenic, constitue d’après nos résultats une

adaptation de ces eucaryotes aux concentrations élevées rencontrées dans les drainages

miniers acides (Chapitre 1A).

Page 242: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

242

Figure C-1. Comparaison des modes de biominéralisation du fer chez deux souches ferro-

oxydantes anaérobies neutrophiles, SW2 (A) et BoFeN1 (B). Le fer est symbolisé par la

couleur rouge. A : Sur SW2, la biominéralisation du fer est essentiellement extracellulaire,

sous forme de nanoparticules d’oxydes de fer (goethite) ou de phosphates de fer amorphes,

qui nucléent sur une fibre lipo-polysaccharidique émergeant d’un des pôles de la bactérie. La

croissance minérale sur ces fibres est limitée. Une proportion très minoritaire de fer s’adsorbe

également à la surface de la cellule. B : Dans le cas de BoFeN1, une proportion importante de

fer précipite sous forme de phosphates de fer amorphes dans le périplasme de la cellule. Cet

encroûtement débute sur la face périplasmique de la membrane plasmique de façon

discontinue. La croissance minérale dans le périplasme est ensuite limitée par la quantité de

carbone organique présente. La biominéralisation complète du périplasme conduit à la

fossilisation de protéines (points blancs dans le périplasme minéralisé apparaissant en rouge)

et du peptidoglycane (liseré jaune). Une proportion importante de fer est également

biominéralisée à l’extérieur des cellules. On observe une croissance de ces minéraux

extracellulaires, dont la nucléation débute sur des filaments polysaccharidiques.

SW2

Adsorption

NucléationCroissance limitée

Fibrelipo-polysaccharidique

Biominéralisationextracellulaire

NucléationCroissance

BoFeN1Filament

polysaccharidique

Fossilisation deprotéines

Biominéralisationpériplasmique Biominéralisation

extracellulaire

A

BFossilisation dupeptidoglycane

NucléationCroissance limitée

SW2

Adsorption

NucléationCroissance limitée

Fibrelipo-polysaccharidique

Biominéralisationextracellulaire

NucléationCroissance

BoFeN1Filament

polysaccharidique

Fossilisation deprotéines

Biominéralisationpériplasmique Biominéralisation

extracellulaire

A

BFossilisation dupeptidoglycane

NucléationCroissance limitée

Page 243: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

243

As(OH)3As(OH)3

Glu + Cys

γγγγ−−−−GCS

γγγγ-glu-cys

GSH-synthase

GSH As-(SG) 3

GSH

PC-AsPCS

LMW complex

Export

Paroi Membrane plasmique

Milieu, pH 3.2 Cytoplasme

-BSO

AQP

?

?

H2AsO4-

Trans-P As(V)

Stress oxydatif

As(III)Acr2p

?

?

MRPP-gp

Méthylation

Dommagesmembranaires

As(OH)3As(OH)3

Glu + Cys

γγγγ−−−−GCS

γγγγ-glu-cys

GSH-synthase

GSH As-(SG) 3

GSH

PC-AsPCS

LMW complex

Export

Paroi Membrane plasmique

Milieu, pH 3.2 Cytoplasme

--BSO

AQP

?

?

H2AsO4-

Trans-P As(V)

Stress oxydatif

As(III)Acr2p

?

?

MRPP-gp

Méthylation

Dommagesmembranaires

Page 244: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

244

Figure C-2. Mécanismes de détoxification de l’arsenic (As(III) : As(OH)3 et As(V) : AsO43-

ou H2AsO4-) chez la bactérie E. coli et l’eucaryote S. cerevisiae (levure) (Rosen, 2002) et chez

E. gracilis (notre étude). Pour le cycle du glutathion, se reporter à Cobbett, 2000. Glu, acide

glutamique. Cys, cystéine. γ-GCS, γ-glutamyl-cystéine synthase. γ-glu-cys, γ-glutamine-

cystéine. GSH, glutathion. BSO, buthionine sulfoximine, inhibiteur de la synthèse de

glutathion. PCS, phytochélatine-synthase. Pc-As, complexe As(III)-phytochélatine. LMW

complex, complexe de faible poids moléculaire. AQP : Aquaglycéroporine. ArsC et Acr2p,

arsenate réductases cytoplasmiques. ArsB et Acr3p, protéines membranaires d’export de

l’As(III) (chez les bactéries, couplée à ArsA pour former une ATPase). GlpF et Fps1p, les

protéines de transport du glycérol, qui transportent aussi l’arsenite. Trans-P, Pit et Pho87p, les

transporteurs de phosphate (et d’arsenate). PstB, PstC, PhoS, le système ATP-dépendant de

prélèvement des phosphates (et de l’arsenate). Ycf1p, le transporteur d’As(III)-GSH qui

transporte le complexe dans le compartiment vacuolaire de la levure. MRP et P-gp, Multidrug

Resistance associated Protein et P-glycoprotéine, exportant les complexes As(III)-glutathion

ou As(III)-PC.

2. Des signatures potentiellement spécifiques de l’activité de microorganismes

Nous avons mis en évidence l’existence d’un découplage entre les mécanismes de

résistance au fer et à l’arsenic chez E. gracilis et E. mutabilis. Tandis que les

biominéralisations bactériennes observées dans les AMD sont assez proches des minéraux qui

se forment par précipitation chimique dans les systèmes abiotiques de basse température Fe-

As, les accumulations ferreuses intracellulaires mises en évidence chez les euglènes ne

contiennent pas de quantités significatives d’arsenic (Chapitre 2A), ce qui d’après notre

modèle est cohérent avec l’export d’As(III) hors des cellules (Chapitre 2B). En cela, la chimie

des dépôts vacuolaires de fer observés chez ces microorganismes pourrait constituer une

signature eucaryote spécifique. Dans ce cadre, il pourrait être intéressant d’étudier les modes

de résistance à d’autres éléments traces (Zn, Cd, Se, …) chez ces algues et/ou chez les

bactéries identifiées dans les AMD. On pourrait ainsi rechercher les éléments qui seraient

couplés ou découplés des mécanismes de biominéralisation du fer. Ces études pourraient

ouvrir des perspectives pour la recherche de critères de biogénicité (en particulier spécifiques

des eucaryotes) à explorer dans le registre fossile, mais aussi pour une compréhension plus

exhaustive du mode de fonctionnement des systèmes pollués actuels, tels que les AMD et

enfin pour la compréhension des mécanismes de détoxification de ces métaux dans des

microorganismes modèles.

Page 245: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

245

D’autre part, les minéralisations du fer étudiées au cours de cette thèse chez les

bactéries ferro-oxydantes anaérobies neutrophiles BoFeN1 et SW2 présentent des spécificités

qui pourraient être également utilisées à l’avenir comme biosignatures potentielles de tels

métabolismes dans des environnements actuels ou dans des roches anciennes. Cette

perspective est d’autant plus prometteuse qu’elle pourrait permettre de rechercher

l’implication de bactéries présentant des métabolismes proches de ceux étudiés ici dans le

mise en place des gisements de fer rubanés du Précambrien (BIF, e.g. Konhauser et al., 2007).

Au cours de cette étude, nous avons effectivement mis en évidence à plusieurs reprises

l’existence d’hétérogénéités redox au sein de nos échantillons, en particulier la coexistence de

phases riches en Fe(III) au contact direct des bactéries avec des phases plus réduites à distance

des bactéries (Chapitres 1A, 1B et 1C). De telles hétérogénéités redox ont déjà été reportées

dans des échantillons naturels actuels (Benzerara et al., 2007) et pourraient être recherchées

de façon plus systématique dans les environnements actuels et dans des roches anciennes.

Cela implique cependant de mieux comprendre parallèlement l’impact des processus

secondaires (diagenèse et métamorphisme) sur ces objets car ils sont susceptibles d’effacer

entièrement de telles « signatures » ou de les créer secondairement et abiotiquement. De

manière plus intéressante peut-être pour ce problème, nous avons mis en évidence la

préservation de protéines et de structures cellulaires fines telles que le peptidoglycane dans le

périplasme des cellules de BoFeN1 (Chapitre 1D, Figure C-1). La fossilisation de ces

structures et molécules organiques fournit des perspectives prometteuses pour la recherche de

traces de vie fossile. Enfin, les associations quasi-systématiques de minéraux riches en fer et

de filaments organiques (polysaccharidiques ou lipo-polysaccharidiques) fournissent des

pistes pour étudier les potentialités de préservation de tels assemblages minéral/organique, qui

pourraient être recherchés à l’aide d’outils spécifiques dans des échantillons naturels (actuels

ou anciens).

3. Des outils pour caractériser les assemblages métal(loïde)-organique

3.a- Approches spectroscopiques et microscopiques.

L’ensemble de nos résultats montre le rôle clé des molécules organiques dans les

processus de biominéralisation et de détoxification étudiés, chez les eucaryotes comme les

procaryotes. Dans ce cadre, il est primordial de disposer d’outils performants pour caractériser

Page 246: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

246

finement ces assemblages, que ce soit dans le but de mieux contraindre les mécanismes

moléculaires de la détoxification ou de la biominéralisation ou de rechercher ces assemblages

dans des échantillons naturels actuels ou anciens. L’approche via la spectroscopie et la

microscopie que nous avons suivie au cours de cette thèse montre l’intérêt de coupler ces

techniques ou d’utiliser des techniques mixtes telles que le STXM pour obtenir des

informations chimiques et structurales sur les systèmes que nous étudions. Le STXM permet

en effet de caractériser chimiquement à la fois les molécules organiques et les éléments lourds

comme le fer ou l’arsenic (Benzerara et al., 2008) et ce à une échelle de quelques nanomètres.

Afin d’aller plus loin dans la caractérisation des molécules organiques rencontrées dans les

systèmes d’oxydation bactérienne du fer étudiés au cours de cette thèse, il sera intéressant

d’analyser ces échantillons aux seuils d’autres éléments légers que le carbone, tels que l’azote

ou l’oxygène par exemple. En effet, la signature spectrale des protéines par exemple est très

variée à ces seuils et une approche multi-élémentaire fournirait donc des contraintes plus

fortes sur la nature des molécules organiques présentes dans nos échantillons. En outre,

l’utilisation de méthodes de microscopie préservant l’état natif des échantillons, telles que le

CEMOVIS, s’est révélée être déterminante pour mettre en évidence des assemblages minéral-

organique qui n’auraient pas été préservés par les méthodes de préparation classiques en

microscopie. L’utilisation de cette technique, certes lourde à développer mais très porteuse,

sur des échantillons naturels ou d’autres échantillons de laboratoire fournirait probablement

une vision beaucoup plus complète et fine des systèmes biogéochimiques étudiés. Dans des

perspectives très proches de cette thèse, on pourrait envisager d’étudier par cette méthode des

échantillons d’E. mutabilis ou d’E. gracilis cultivée en présence de fer afin de mieux

caractériser les accumulations ferreuses intracellulaires et éventuellement leur assemblage

avec des phases organiques ou encore d’imager SW2 pour déterminer les caractéristiques

structurales de sa paroi cellulaire et des fibres lipo-polysaccharidiques. Cette méthode pourrait

évidemment être appliquée à de nombreux autres systèmes biogéochimiques d’intérêt.

3.b- Approches biochimiques.

Une autre approche, complémentaire de celle suivie au cours de cette thèse et

indispensable à la compréhension des mécanismes biologiques sous-tendant les processus de

biominéralisation et de détoxification étudiés ici, serait de combiner les outils de la biochimie

aux outils de la spectromicroscopie. En effet, nous avons par exemple mis en évidence le rôle

de composés thiols dans la détoxification de l’As(V) et de l’As(III) chez E. gracilis (Figure C-

Page 247: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

247

2). Ces résultats s’inscrivent dans le schéma classique de détoxification de l’arsenic chez les

microorganismes (procaryotes et eucaryotes) et les plantes. Cependant, nous avons pu mettre

en évidence les limites de l’approche spectroscopique (XAS) pour la caractérisation des

protéines impliquées dans ces mécanismes. L’utilisation complémentaire d’outils de la

protéomique, tels que la spectrométrie de masse et la chromatographie permettront dans le

futur de caractériser plus précisément ces molécules. De telles expériences ont débuté

récemment dans notre laboratoire et en collaboration avec Laurence Sabatier de l’IPHC

(Strasbourg). Dans la même perspective, la protéomique et la génétique appliquées à des

systèmes tels que les bactéries ferro-oxydantes anaérobies neutrophiles pourront permettre des

avancées fondamentales dans la compréhension des mécanismes d’oxydation du fer à

l’origine des processus de biominéralisation que nous avons étudiés. De telles approches ont

par exemple déjà permis d’identifier des gènes codant des protéines potentiellement

impliquées dans l’oxydation du fer par SW2 (Croal et al., 2007, Jiao & Newman, 2007).

3.c- Approches isotopiques.

Enfin, les résultats acquis au cours de cette thèse pourraient servir de base pour une

étude ultérieure des fractionnements isotopiques du fer (et éventuellement du carbone et de

l’azote dans le cas de la bactérie dénitrifiante BoFeN1) dans des systèmes d’oxydation

microbienne du fer en conditions anoxiques. Les fractionnements isotopiques du fer par

exemple sont au premier ordre dépendants de la spéciation de cet élément, i.e. son redox mais

aussi la nature des phases dans lesquelles il s’insère. Ainsi, la diversité des phases minérales

rencontrées dans des conditions de culture données au cours de la croissance bactérienne

montre qu’une telle étude isotopique ne peut pas se limiter à une mesure à un stade donné de

la croissance mais nécessitera un suivi au cours du temps des fractionnements isotopiques.

L’utilisation des outils isotopiques pourra permettre une approche quantitative des différents

processus impliqués dans l’oxydation bactérienne du fer et de la dénitrification dans ces

systèmes. En outre, elle pourra éventuellement fournir une base pour mieux comprendre

l’origine des compositions isotopiques dans les échantillons naturels actuels ou anciens (en

particulier les BIF).

Page 248: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

248

4. Evolution des mécanismes de détoxification de l’arsenic au cours des temps

géologiques

Nous avons rappelé dans l’introduction de cette thèse la vision actuelle de l’évolution des

métabolismes utilisant l’arsenic au cours des temps géologiques, qui suggère une apparition

précoce des métabolismes chimiolithoautotrophes et photosynthétiques basés sur l’oxydation

de l’As(III) (Duval et al., 2008, Kulp et al., 2008) et une apparition plus tardive de la

respiration de l’As(V) (Lebrun et al., 2003). En revanche, l’évolution des mécanismes de

détoxification de l’arsenic au cours de temps géologiques, reste encore très mal connue. Il est

proposé que les mécanismes de détoxification de l’As(V) sont hérités de l’évolution des

mécanismes de résistance à l’As(III), qui auraient pu apparaître sur une Terre privée d’O2

(Rosen, 2002). Au cours de cette thèse, nous avons mis en évidence le rôle clé du cycle du

glutathion dans les mécanismes de résistance à l’arsenic chez E. gracilis. Le glutathion est un

peptide ubiquiste chez les eucaryotes, dont une des fonctions majeures est la protection contre

les stress oxydatifs (e.g. Halliwell & Gutteridge, 1999, Todorova, 2007). Il a été proposé que

la synthèse du glutathion aurait évolué à des dates contemporaines ou proches de l’évolution

de la photosynthèse oxygénique (Fahey et al., 1987). En outre, l’oxygénation de l’atmosphère

aurait pu contribuer à l’augmentation de la concentration en As(V) dans l’environnement et

favoriser l’évolution des arsenate-réductases à partir de phosphatases (Mukhopadhyay et al.,

2003). Dans le but de mieux comprendre l’évolution des mécanismes de résistance à l’arsenic

au cours des temps géologiques, plusieurs pistes pourraient être suivies dans le futur :

• Nous avons montré que différents peptides/protéines sont des candidats potentiels

pour la complexation de l’As(III) chez E. gracilis, à commencer par le glutathion ou

des phytochélatines. Il existe cependant une diversité de phytochélatines, liée à la

longueur de la chaîne polymérisée. En outre, il est intéressant de noter que des

microorganismes tels que les trypanosomes (eucaryotes unicellulaires parasites,

phylogénétiquement ancrés proche de la racine des eucaryotes, et présentant des

homologies évolutives avec Euglena gracilis (Delihas et al., 1981)) produisent des

thiols spécifiques, différents de ceux connus dans toutes les autres espèces étudiées et

impliqués dans la détoxification de l’arsenic (Mukhopadhyay et al., 1996) : les

trypanothiones sont des tri-peptides résultant de l’association de deux glutathions par

l’intermédiaire d’une chaîne polyamine (spermidine) (Krauth-Siegel & Comini, 2008).

La mise en évidence d’une trypanothione-réductase chez E. gracilis ouvre la

possibilité de l’existence de ces thiols chez cette algue (Montrichard et al., 1999). La

Page 249: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

249

caractérisation protéomique des thiols produits par E. gracilis pourra permettre de

déterminer la nature de ces thiols et leur éventuelle parenté avec des molécules

présentes chez des organismes ancrés eux-aussi proche de la racine des eucaryotes.

• Trois familles d’arsenate-réductases ont été identifiées, mais une seule enzyme

(Acr2p), membre de la super-famille des protéines tyrosine-phosphate phosphatases a

été identifiée à ce jour chez les eucaryotes (Mukhopadhyay et al., 2002). La

caractérisation de l’arsenate réductase impliquée dans la détoxification de l’As(V)

chez E. gracilis serait très probablement riche d’enseignement, chez ce

microorganisme ancré proche de la racine des eucaryotes.

• L’étude des mécanismes de détoxification de l’arsenic chez des procaryotes pratiquant

un métabolisme adapté aux conditions de la Terre primitive pourrait fournir des

informations clés sur l’évolution précoce des systèmes de détoxification de l’arsenic

au cours des temps géologiques. Dans ce cadre, des bactéries pratiquant une

photosynthèse anoxygénique (par exemple la souche SW2 étudiée au cours de cette

thèse, qui peut être cultivée avec H2 comme source d’électrons) seraient par exemple

des objets d’étude des mécanismes de détoxification de l’arsenic, et des

métaux/métalloïdes toxiques d’une façon générale, potentiellement intéressants.

5. Retour au milieu naturel

L’étude que nous avons menée a permis de définir un certain nombre de

caractéristiques des mécanismes de détoxification et de biominéralisation de

métaux/métalloïdes dans des systèmes microbiens modèles, cultivés en laboratoire. L’étape

suivante de ces travaux consisterait naturellement à retourner sur le terrain, dans des

environnements présentant une chimie proche de celle utilisée dans nos systèmes de

laboratoire, ceux-là même qui avaient motivé notre choix des conditions de culture et des

organismes modèles pour la présente étude. On pourrait ainsi rechercher des bactéries ferro-

oxydantes neutrophiles proches de SW2 et BoFeN1 dans des environnements naturels actuels,

tels que des sédiments de rivière similaires à ceux d’où ont été isolées les souches que nous

avons étudiées, ou tels que la colonne d’eau anoxique de certains lacs. Par exemple, nous

avons constaté que le lac Pavin (Massif central) présente un ensemble de caractéristiques tout

à fait compatibles avec l’existence de tels métabolismes: la colonne d’eau est anoxique en

Page 250: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

250

profondeur à certaines époques de l’année, contient du Fe(II) et des nitrates en abondance

(Michard et al., 1994). Il serait alors intéressant de comparer les motifs de biominéralisation

dans ces environnements naturels à ceux décrits dans cette thèse : quelle est la nature

minéralogique des phases formées ? Retrouve-t-on des hétérogénéités redox à l’échelle

nanométrique ? Observe-t-on des filaments organiques à proximité des bactéries, et de quelle

nature ? Observe-t-on des microfossiles comparables à ceux décrits dans cette thèse ? etc…

De même, l’étude de la diversité potentielle des mécanismes de détoxification de l’arsenic et

du fer dans les microorganismes (eucaryotes et procaryotes) présents dans les AMD pourrait

également compléter notre compréhension de la biogéochimie de ces systèmes. Ce retour au

terrain serait en outre une seconde étape indispensable pour l’appréhension d’échantillons

anciens.

Page 251: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

251

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Protocoles

Page 268: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

268

Page 269: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

269

Protocole de préparation du milieu de culture liquide pour bactéries Fe(II)-oxydantes neutrophiles anaérobies (BoFeN1 et SW2)

A autoclaver avant de dispenser le milieu dans les flacons de 50 ou 100 mL:

� Milieu de base.

� Solution tampon NaHCO3.

� Solution d’éléments traces.

� Solution sélénite.

� Solution d’acétate, 1M.

� Solution de nitrate, 1M.

A stériliser au four:

� Flacons de 50 mL pour dispenser le milieu, recouverts d’alu.

� Bouchons en butyl (dans un bécher recouvert d’alu).

� Pinces.

� Flacon de Widdel.

Milieu de base (pour 500 mL) (à autoclaver):

On prépare 500 mL de ce milieu dans une bouteille d’1L. Les poudres sont pesées

ensemble à l’extérieur de la boîte à gants. 500 mL d’ED anoxique est ajoutée dans la

boîte à gants.

NH4Cl [MW 53.49] 0.15 g 5.61 mM

KH2PO4 [MW 136.09] 0.3 g 4.41 mM

CaCl2·2H2O [MW 147.02] 0.05 g 0.68 mM

MgSO4·7H2O [MW 246.47] 0.25 g 2.0 mM

Seulement si pas de MgSO4 disponible:

MgCl2·6H2O [MW 203.31] 0.2 g 1.97 mM

� Autoclaver le milieu.

� Autoclaver les différentes parties du flacon de Widdel, dans lequel a été introduit

un agitateur magnétique (protéger les extrémités avec de l’alu, fermer les

bouchons à moitié seulement). Assembler le flacon autoclavé sous la hotte à flux

laminaire. Refermer les bouchons à fond.

� Sous la hotte, verser les 500 mL de milieu de base dans le flacon.

� Fermer tous les bouchons.

Additions sous flux de N2/CO2 (pour 500 mL de milieu de base autoclavé):

Page 270: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

270

Solution tampon NaHCO3 11 mL de solution mère 1 M (autoclavée)

Solution d’éléments traces 0.5 mL de solution mère (autoclavée)

Solution de vitamines 0.5 mL de solution mère (filtrée à 0.22 µm)

Solution de sélénite 0.5 mL de solution mère, autoclavée

En conditions stériles (flamme) :

� Placer le flacon de Widdel sur la paillasse.

� Agiter avec l’agitateur magnétique.

� Clamper le distributeur de milieu.

� Ouvrir la vanne IN.

� Ouvrir la vanne N2/CO2. Laisser sous flux de N2/CO2 pendant environ 30

minutes minimum.

Quand le milieu est à température ambiante :

� Ajouter les différentes solutions (tampon, éléments traces, vitamines, sélénite)

dans la vanne IN.

� Mesurer et ajuster le pH à 6.8-7.0 après les additions (en restant en conditions

stériles) : on prélève quelques mL de milieu dans la vanne OUT avec une

pipette Pasteur stérilisée dans la flamme. On mesure le pH de ce prélèvement.

Si le pH n’est pas dans l’intervalle 6.8-7.0, on l’ajuste avec du Na2CO3 ou du

HCl 37%. (utiliser les valeurs reportées dans le tableau, mais attention, elles

donnent des volumes surestimés !). Exemple : pHinitial = 7,22. Ajout de 100

uL de HCL à 37%. pH final = 7,03.

� On enlève le surplus de milieu (présent dans les tubes) dans un flacon stérile

poubelle.

� Dispenser le milieu dans les flacons autoclavés jusqu’à 25 mL : Fermer les

vannes IN et OUT. On place le flacon entièrement dans la zone de

prélèvement et on le descend au fur et à mesure du remplissage, en

déclampant temporairement le distributeur. On passe le sommet du flacon

dans la flamme. On dépose un bouchon au sommet du flacon avec la pince

stérile. On passe la seringue N2/CO2 dans la flamme. On introduit la seringue

(sans toucher le liquide) pendant environ 40 secondes dans le flacon (en

recouvrant au maximum avec le bouchon). On ferme le bouchon. On repasse

le sommet du flacon dans la flamme avant de refermer complètement le

flacon.

� Sceller les flacons.

Préparation des solutions mères: (pour 500 mL de milieu)

A) Préparation d’eau distillée anoxique

Page 271: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

271

On remplit une bouteille d’1L d’eau MilliQ. On referme cette bouteille avec le bouchon

pour dégazage. On règle la température du bain chauffant à 80°C. On met la bouteille

dans l’eau en la fixant. Quand la température est stabilisée, on ouvre la vanne de la

bouteille d’N2 pour faire buller l’azote dans l’eau (le flux d’azote a tendance à diminuer

avec le temps, le régler un peu fort au début). On laisse la sortie d’air ouverte. On laisse

buller l’azote pendant environ 1h. Puis, on met le clamp au niveau de l’arrivée d’azote,

sans le fermer complètement. On clampe (totalement) la sortie d’air. On finit de clamper

l’arrivée d’azote. On ferme rapidement la vanne de la bouteille d’N2.

On refroidit la bouteille d’eau dans de la glace + chambre froide. On la rentre dans la

boîte à gants (ne pas pomper trop longtemps !) et on remet un bouchon normal.

B) Solution tampon NaHCO3, 1 M

� Peser 924 mg de NaHCO3 dans un flacon de 50 mL non stérile

� Parallèlement, verser 11mL d’eau distillée anoxique dans un flacon de 50 mL non

stérile dans la boîte à gants. Refermer et sceller ce flacon dans la boîte à gants et

le sortir.

� A proximité de la bouteille N2/CO2, verser rapidement les 11 mL d’eau anoxique

dans le flacon contenant la poudre de NaHCO3. Dégazer avec un flux de N2/CO2

pendant 1 minute minimum.

� Refermer et sceller le flacon.

� Autoclaver.

C) Solution d’éléments traces

On prépare 20 mL final de cette solution.

On pèse les poudres dans des falcons séparés à l’extérieur de la boîte à gants (sauf EDTA

pesé dans un flacon en verre de 50 mL).

On introduit ensuite tous les falcons + flacons dans la boîte à gants et on dissout les

poudres contenues dans les falcons dans de l’eau distillée anoxique. On ajoute environ 10

mL d’eau dans le falcon contenant FeSO4. On verse cette solution dans le flacon

contenant l’EDTA. On ajoute les prélèvements des différentes solutions contenues dans

les autres falcons. On homogénéise la solution. On la verse dans une éprouvette de 50

mL. On complète à 20 mL avec de l’ED anoxique. On remet cette solution dans le flacon

de 50 mL, qu’on ferme avec un bouchon en butyl et qu’on scelle.

� Na2-EDTA * 2 H20 [MW 372.2]

60 mg, introduits dans un flacon verre de 50 mL.

� FeSO4 * 7 H2O [MW 278.01]

22 mg, introduits dans un falcon de 15mL.

� CoCl2 * 6 H2O [MW 237.93]

Page 272: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

272

On prépare une solution mère à 80 mM: 103.9 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.

On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.

� ZnCl2 [MW 136.3]

On prépare une solution mère à 0.03 M: 40.9 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.

On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.

� NiCl2 * 6 H2O [MW 237.7]

On prépare une solution mère à 0.01 M: 23.8 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.

On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.

� Na2MoO4 * 2 H2O [MW 241.95]

On prépare une solution mère à 7 mM: 17 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.

On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.

� H3BO4 [MW 61.83]

On prépare une solution mère à 0.49 M: 303 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.

On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.

� CuCl2 * 2 H20 [MW 170.48]

On prépare une solution mère à 11.7 mM: 20 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.

On introduit 20 µL de cette solution dans la solution finale.

� MnCl2 * 4 H20 [MW 197.91]

On prépare une solution mère à 25 mM: 49.5 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.

On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.

� Ajouter Na2-EDTA en premier.

� Ajuster à pH 6.5 avant d’autoclaver, dans la boîte à gants. (avec quelques

gouttes de HCl, 2N).

Qté dans la sol. mère (1L) Conc. dans le milieu (1 L)

Na2-EDTA * 2 H20 [MW 372.2] 3.0 g 8.1 µM

FeSO4 * 7 H2O [MW 278.01] 1.1 g 4.0 µM

CoCl2 * 6 H2O [MW 237.93] 190 mg 0.80 µM

ZnCl2 [MW 136.3] 42 mg 0.31 µM

NiCl2 * 6 H2O [MW 237.7] 24 mg 0.10 µM

Na2MoO4 * 2 H2O [MW 205.92 w/o H2O] 18 mg 0.087 (0.074 µM)

H3BO4 [MW 61.83] 300 mg 4.8 µM

CuCl2 * 2 H20 [MW 170.48] 2 mg 0.01 µM

Page 273: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

273

MnCl2 * 4 H20 [MW 197.91] 50 mg 0.25 µM

D) Solution de vitamines

On prépare 10 mL final de cette solution.

On procède de la même façon en pesant les poudres dans des falcons distincts en dehors

de la boîte à gants et en effectuant les dissolutions et dilutions dans la boîte à gants.

� 4 Aminobenzoic acid [MW 137.14]

On prépare une solution mère à 29 mM: 39.8 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.

On introduit 100 µL de cette solution dans la solution finale.

� D (+) biotin [MW 244.3]

On prépare une solution mère à mM: 48.9 mg dissous dans 150 mL d’ED anoxique.

On introduit 300 µL de cette solution dans la solution finale. SE DISSOUT TRES MAL!

� Nicotinic acid [MW 123.11]

On prépare une solution mère à 81 mM: 20 mg dissous dans 2 mL d’ED anoxique.

On introduit 100 µL de cette solution dans la solution finale.

� Ca-(+) pantothenate [MW 476.53]

On prépare une solution mère à 0.01 M: 47.7 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.

On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.

� Pyridoxamine dihydrochloride [MW 241.12]

On prépare une solution mère à 0.829 M: 1 g dissous dans 5 mL d’ED. (flacon livré)

On introduit 120 µL de cette solution dans 10 mL d’ED.

On introduit 410 µL de cette solution dans la solution finale.

� Thiaminium dichloride [MW 337.3]

On prépare une solution mère à 15 mM: 25.3 mg dissous dans 5 mL d’ED anoxique.

On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.

� Riboflavin [MW 376.4]

On prépare une solution mère à 67 mM: 25 mg dissous dans 1 mL d’ED anoxique.

On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.

� On complète à 10 mL la solution finale.

Page 274: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

274

� On filtre cette solution à 0.22 µm dans un flacon de 50 mL autoclavé. On ferme

ce flacon avec un bouchon en butyl autoclavé. On le scelle.

� Le flacon est stocké à l’abri de la lumière à 4°C.

Qté dans la sol. mère (100 mL) Conc dans le

milieu (1 L)

4 Aminobenzoic acid [MW 137.14] 4 mg 0.29 µM

D (+) biotin [MW 244.3] 1 mg 41 nM

Nicotinic acid [MW 123.11] 10 mg 0.81 µM

Ca-(+) pantothenate [MW 238.3 w/ ½ Ca)] 5 mg 0.21 µM

Pyridoxamine dihydrochloride [MW 241.12] 10 mg 0.41 µM

Thiaminium dichloride [MW 337.3] 10 mg 0.29 µM

Riboflavin [MW 376.4] 50 mg 1.32 µM

E) Solution de sélénite

On prepare 20 mL de cette solution, selon le même principe que précédemment.

� NaOH [MW 40]

On prépare une solution mère à 2 M: 8 g dissous dans 100 mL d’ED anoxique (flacon

plastique).

On introduit 125 µL de cette solution dans la solution finale.

� Na2SeO3. 5H2O [MW 263.02]

On prépare une solution mère à 11.4 mM: 30 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.

On introduit 20 µL de cette solution dans la solution finale.

� Na2WO4. 2H2O [MW 329.87]

On prépare une solution mère à 12.1 mM: 40 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.

On introduit 20 µL de cette solution dans la solution finale.

� On complète à 20 mL.

� A autoclaver.

Qté dans la solution mère (1 L)

NaOH [MW ] 0.5 g

Na2SeO3. 5H2O [MW ] 3 mg

Page 275: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

275

Na2WO4. 2H2O [MW ] 4 mg

Milieu pour BoFeN

On travaille près de la flamme, sur une paillasse nettoyée avec de l’éthanol et loin des

courants d’air !

� Stériliser le dessus du flacon contenant l’acétate et le dessus du flacon contenant

le milieu avec la seringue éthanol 100°, dans la flamme. (Les flacons doivent être

scellés préalablement).

� Prendre une aiguille (verte) et une seringue de 1 mL.

� Stériliser la seringue N2/CO2 dans la flamme.

� Echanger 6 à 7 fois l’air de la seringue avec le flux N2/CO2. Souffler le mélange

N2/CO2 en déplaçant la seringue vers le flacon d’acétate, jusqu’à l’introduction

de l’aiguille dans le flacon.

� Prélever le solution d’acétate :

� Près de la flamme, flacon tête en bas, rentrer totalement l’aiguille.

� Prélever (un volume plus important que le volume à inoculer).

� Retirer l’aiguille jusqu’à mi chemin dans le bouchon. Attendre 20

à 30 secondes que le trou se referme.

� Retirer doucement l’aiguille (en montant lentement le flacon).

� Enlever les bulles d’air.

� Inoculer le volume nécessaire dans le flacon contenant le milieu :

� Flacon tête en bas.

� Introduire totalement la seringue.

� Inoculer.

� Retirer la seringue jusqu’à mi chemin dans le bouchon.

� Attendre 20 à 30 secondes que le trou se referme.

� Retirer totalement l’aiguille.

Pour la souche BoFeN, on introduit dans 25 mL de milieu, selon ce protocole,

successivement :

� Acétate 5 : 125 µL de solution mère Na-acétate, 1M.

� NO3 10 : 250 µL de solution mère NaNO3, 1M.

� Fe 10 : 250 µL de solution mère FeCl2, 1M. A toujours introduire en dernier et

changer de seringue + aiguille pour chaque flacon.

Ou seulement :

� Acétate 5 : 125 µL de solution mère Na-acétate, 1M.

� NO3 10 : 250 µL de solution mère NaNO3, 1M.

Page 276: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

276

Inoculation des souches :

� Selon le même principe, on introduit 2.5 mL de culture dans le milieu, avec une

nouvelle seringue de 5 mL à chaque inoculation.

Milieu pour SW2

Pour la souche SW2, on introduit dans 25 mL de milieu, selon ce protocole :

� Fe 10 : 250 µL de solution mère FeCl2, 1M. Changer de seringue + aiguille pour

chaque flacon.

Inoculation des souches :

� Selon le même principe, on introduit 1.5 mL de culture dans le milieu, avec une

nouvelle seringue de 2.5 mL à chaque inoculation.

Préparation des solutions mères :

A) Solution d’acétate, 1 M

� Introduire 2.05 g de Na-acétate [MW 82.03] dans 25 mL d’eau distillée

anoxique dans un flacon de 50 mL dans la boîte à gants.

� Sceller le flacon.

� Autoclaver.

B) Solution de nitrate, 1M

� Introduire 2.125 g de NaNO3 [MW 85.01] dans 25 mL d’eau distillée anoxique

dans un flacon de 50 mL dans la boîte à gants.

� Sceller le flacon.

� Autoclaver.

C) Solution de FeCl2, 1M

Page 277: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

277

� Fermer 1 flacon de 50 mL (contenant une goutte d’eau distillée anoxique) dans la

boîte à gants avec un bouchon en butyl. Le sceller et sortir de la boîte à gants ce

flacon + la boîte de FeCl2.

� Autoclaver le flacon de 50 mL.

� Stériliser le bouchon de ce flacon avec de l’éthanol 100° dans une flamme. Le

recouvrir d’alu.

� Peser 4.97 g de FeCl2 dans un flacon de 50 mL non stérile. Le recouvrir d’alu.

� Introduire dans la boîte à gants :

� Seringue, filtre à 0.1 µm, aiguille.

� Le flacon contenant FeCl2, recouvert d’alu + son bouchon.

� La boîte de FeCl2.

� Le flacon autoclavé.

� Une éprouvette de 50 mL.

� Introduire 25 mL d’eau distillée anoxique dans le flacon contenant la poudre de

FeCl2. Agiter.

� Prélever cette solution avec la seringue.

� Filtrer cette solution dans le flacon stérile (filtre + aiguille).

Page 278: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

278

Protocole de dosage Fe(II)/Fe(III) par la ferrozine D’après Viollier et al., 2000.

Dosage du Fe dissous :

- Dans la chambre anaérobie (N2), prélever 200 µL de culture. Filtrer à 0.22 µm.

- Prélever 100 µL de la solution filtrée et ajouter 900 µL de HCl, 1M.

- Cette solution peut être conservée dans la boîte à gants, jusqu’à analyse.

- Hors de la boîte à gants, prélever 400 µL de ce mélange. Y ajouter 2.9 mL HCl,

1M (dosage Fe(II)) OU 2.9 mL de la solution de réducteur (attente 20 minutes-

dosage du Fe(II)+Fe(III)).

- Ajouter 500 µL de la solution de ferrozine et 200 µL de tampon pH 9.5.

- Après 5 minutes, mesurer l’absorbance à 562 nm.

Dosage du Fe total (solide + dissous) :

- Dans la chambre anaérobie (N2), prélever 350 µL de culture. Y ajouter 1 650 µL

de HCl, 6M. Laisser agir 1 heure.

- Filtrer la solution à 0.22 µm.

- Cette solution peut être conservée dans la boîte à gants, jusqu’à analyse.

- Hors de la boîte à gants, prélever 400 µL de ce mélange. Y ajouter 2.9 mL HCl,

1M (dosage Fe(II)) OU 2.9 mL de la solution de réducteur (attente 20 minutes-

dosage du Fe(II)+Fe(III)).

- Ajouter 500 µL de la solution de ferrozine et 200 µL de tampon pH 9.5.

- Après 5 minutes, mesurer l’absorbance à 562 nm.

Page 279: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

279

Protocole de dosage des protéines totales de bactéries ferroxydantes par la méthode de Bradford

Réactifs :

• NaOH, O.1 M

• Acide trichloroacétique, 6.1 N (TCA)

• Réactif de Tamm (acide oxalique – oxalate d’ammonium)

Gamme étalon :

On prépare une gamme étalon de γ-globuline 0 à 25 µg.mL-1 dans NaOH 0.1 M.

On laisse réagir 250 µL de standard avec 250 µL de réactif de Bradford pendant 5

minutes.

On mesure l’absorbance à 595 nm.

Dosage des protéines totales dans les cultures :

On prélève 1 mL de culture. On y ajoute 840 µL de réactif de Tamm (pour dissoudre les

phases amorphes porteuses de fer et lyser les bactéries) et 160 µL de TCA (pour

précipiter les protéines). On laisse les eppendorfs tourner environ 10 minutes sur la roue,

à l’obscurité.

On centrifuge 30 minutes à 13 000 rpm.

On remplace le surnageant par 1 mL de NaOH, 0.1 M. On chauffe les échantillons à 60°C

(bain à sec) pendant 6 minutes.

On mélange 250 µL d’échantillon avec 250 µL de réactif de Bradford. On mesure

l’absorbance à 595 nm après 5 minutes.

Page 280: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

280

Préparation de géloses pour la culture de bactéries ferroxydantes neutrophiles anaérobies en milieu solide

Préparation du milieu de base :

♦ Pour 500 ml (à preparer dans une bouteille d’1L; environ 15 boîtes):

NH4Cl 0,15 g

KH2PO4 0,3 g

CaCl2 0,05 g

MgSO4 0,25 g

Agar 7,5 g

♦ Dissoudre avec 500 ml eau non dégazée.

♦ Autoclaver.

Préparation tampon carbonate de sodium :

♦ 924 mg

♦ 11 ml eau anoxique

♦ Sceller

♦ Autoclaver

Dégazage du milieu préparé :

♦ Sous PSM, verser le tampon NaHCO3 dans le milieu de base.

Laisser refroidir un peu le milieu avant d’ajouter le tampon !

♦ Adapter système dégazage avec filtre 0.22 µm sur tuyau entrée gaz. Clamper entrée /

sortie de gaz pour sortir le milieu de sous le PSM.

♦ Laisser dégazer 30-40 min à dans bain-marie 80°C sous flux N2/CO2 ou N2 seul.

Préparation des géloses dans boîte à gants :

♦ Entrer dans boîte à gants :

• milieu de base

• Solutions éléments traces, vitamines, sélénium

• Solutions Na-acétate, Na-nitrate

• Si besoin, FeCl2

• Boîtes de Pétri

• Parafilm

• Seringues, aiguilles

♦ Laisser refroidir un peu le milieu avant d’ajouter en condition stériles :

• 500 µl solutions vitamines, sélénites, éléments traces

• 2,5 ml Na-acétate

• 5 ml Na-nitrate

• éventuellement 5 ml FeCl2

Page 281: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

281

♦ Couler dans les boîtes de Pétri (environ 25 mL par boîte) et laisser prendre en

conditions stériles.

♦ Parafilmer, sceller dans papier aluminisé, stocker à 4°C.

Page 282: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

282

MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A TRANSMISSION Protocole de fixation et inclusion des échantillons

FIXATION CHIMIQUE

Solution tampon : 630 mL d’acide acétique 0,2 mol/L + 370 mL d’acétate de sodium 0.2

mol/L. (pH 4,4)

Ou tampon phosphate

Ou tampon cacodylate

Solution de fixateur : 1 volume de Glutaraldéhyde (25%)

+ 5 volumes de solution tampon

Technique : Faire des prélèvements, centrifuger et enlever le surnageant. Répéter

l’opération jusqu’à obtenir un culot suffisamment dense. Remplacer le dernier surnageant

par la solution de fixateur.

La durée de fixation est de 1h30 minimum à +4°C.

Remplacer le fixateur par la solution tampon. L’échantillon y reste au moins 18h et peut

se conserver pendant 15 jours à +4°C.

POST FIXATION

Solution de tétroxyde d’osmium (OsO4) : une ampoule de 1 g est chauffée dans l’eau

(40°C) pour liquéfier l’OsO4, puis refroidie pour le cristalliser sur les parois de

l’ampoule. L’ampourle est cassée dans un flacon fermant hermétiquement (danger lié aux

vapeurs) et très propre. On ajoute 25 mL d’eau pure. Cette solution doit être conservée à

l’abri de la lumière sous hotte dans une double enceinte bien fermée.

Technique : remplacer la solution tampon par une solution d’OsO4 à 1% (dans la

solution tampon) pendant 1 à 2h à température ambiante. (0,5 mL d’OsO4 à 1% + 0,25

mL de solution tampon à 0,2 mol/L + 0,25 mL d’eau distillée).

DESHYDRATATION

Rinçages successifs séparés chacun par des centrifugations/éliminations du surnageant :

-H2O distillée : 3 rinçages de 5 min

-Ethanol 50° : 1 rinçage de 10 min

-Ethanol 70° : 1 rinçage de 10 min

-Ethanol 95° : 1 rinçage de 10 min

-Ethanol 100° : 3 rinçages de 20 min

Les différents alcools sont préparés à partir d’éthanol pur 100°.

Page 283: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

283

-Oxyde de propylène1,2 : 1 rinçage de 30 min

INCLUSION

Produits : Sol A : Epon (epoxy medium) : 38%

DDSA : 62%

Sol B : Epon (epoxy medium) : 53%

MNA : 47%

On agite l’ensemble sous hotte aspirante dans les proportions : 2 volumes de Sol A pour 3

volumes de Sol B. (à préparer extemporanément). On agite lentement pendant 15 min,

puis on ajoute 2,5% de DMP 30 (accélérateur) et on agite à nouveau pendant 15 min.

Cette solution finale peut se conserver 24h à +4°C.

Technique : Le bain d’oxyde de propylène est remplacé par le mélange suivant :

1 volume de solution finale d’Epon + 1 volume d’oxyde de propylène.

Laisser le tube débouché sous la hotte aspirante à la température du laboratoire pendant

18h.

On centrifuge et on remplace le surnageant par le mélange final d’Epon (3 fois).

On laisse agir pendant 4h, en laissant le tube débouché.

La polymérisation est obtenue en chauffant les tubes débouchés à l’étuve :

24h à 37°C

24h à 45°C

48h à 60°C.

Page 284: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

284

MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A TRANSMISSION Protocole de contraste des coupes

I. CONTRASTE A L’ACETATE D’URANYL

Solution d’acétate d’uranyl : 1,25g d’acétate d’uranyl dans 25 mL d’eau distillée, dilué

de moitié dans de l’alcool 100°. A conserver à l’abri de la lumière et à 4 °C.

Filtrer la solution avant utilisation (à 0,22 µm).

Déposer des gouttes sur un parafilm. Déposer les coupes au contact des gouttes et laisser

agir 15 minutes, à l’abri de la lumière (sous un couvercle). Rincer dans l’alcool 50°

(plusieurs bains). Laisser sécher les grilles sur un papier filtre.

II. CONTRASTE AU CITRATE DE PLOMB

Solution de citrate de plomb :

Déposer des gouttes de citrate de plomb (solution filtrée à 0,22 µm) sur un parafilm posé

au fond d’une boîte de Pétri contenant des pastilles de soude. Déposer les coupes au

contact des gouttes et laisser agir pendant 7 minutes.

Rincer à l’eau distillée.

Laisser sécher les grilles sur un papier filtre sous un couvercle de boîte de Pétri.

Page 285: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

285

Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Tous les réactifs doivent être préparés avec de l’eau mQ, filtrés à 0.2 µm et autoclavés si

possible

1. FIXATION DES CELLULES Placer l’échantillon dans un volume 10 fois plus important de PBS + 2% formaldéhyde

(pour 50 ml ajout de 2,7 ml de formaldéhyde 37% par exemple), agiter pour imprégner

l’échantillon, laisser 1h à 4h à 4°C (plus l’incubation est longue plus les risques

d’autofluorescence sont importants).

Lavage : Centrifuger 6000 rpm, 10 minutes

Resuspendre dans PBSx1 (50ml)

Centrifuger 6000 rpm, 10 minutes

Recommencer lavage une deuxième fois

Reprendre dans PBSX1 (25 ml) et ajouter un même volume d’éthanol 100%

Stocker à -20°C

2. DEPOT SUR LAMES Utilisation de lames 10 puits 6 mm de diamètre

Lavage échantillon dans PBSx1 (2 mL)

Reprendre échantillon dans volume adéquat de PBSx1 (200 µL pour les cultures Acétate,

2 mL pour les cultures Fe)

Dépôt de 5 ou 10 µl par puits

Sécher à 46°C pendant environ 15 minutes (ne pas trop sécher sinon ça se décolle lors de

la deshydratation)

3. DESHYDRATATION Tremper les lames dans des bains successifs d’éthanols (50%, 80%, 100%), 3 minutes

(minimum) pour chaque bain. Laisser sécher à l’air.

4.HYBRIDATION

Sondes : solution stock à 500 ng/µl dans TE

working solution 50 ng/µl pour les sondes marquées au FITC 30 ng/µl pour les

sondes marquées au cy3 dans mQ

Dans la solution d’hybridation la concentration finale en sonde est de 5 ng/ul ou 3 ng/ul

Utiliser 1 ml de solution d’hybridation par lames : [ ] finale

[formamide] 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 45% 50%

NaCl 5M 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 0,9 M

Tris-HCl pH

8, 1M

20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 mM

formamide 0 ul 50 ul 100 ul 150 ul 200 ul 250 ul 300 ul 350 ul 400 ul 450 ul 500 ul

mQ 799 ul 749 ul 699 ul 649 ul 599 ul 549 ul 499 ul 449 ul 399 ul 349 ul 299 ul

SDS 10% 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 0,01 %

Page 286: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

286

Pour chaque puits mettre 9 ul de la solution d’hybridation + 1 ul de la sonde à 50 ng/ul ou

30 ng/ul

Placer la lame dans un tube Falcon (50 mL) avec de l’essuie tout imprégné du reste de la

solution d’hybridation (environ 1 mL, chambre humide)

Hybrider au moins 1 heure 30 à 46°C (éviter over-night car agarose low-melting à

tendance à se décoller)

5. LAVAGE 10 minutes à 48°C dans tampon préchauffé (50 ml pour deux lames)

Composition du tampon de lavage (50 ml) en fonction de la concentration en formamide

dans le tampon d’hybridation : [formamide] 0% 5% 10% 15 % 20% 25% 30% 35% 40% 45% 50%

NaCl 5M 9 ml 6.30 ml 4.5 ml

3.18 ml 2.15 ml 1.49 ml 1.02 ml 0.70 ml 0.46 ml 0.3 ml 0.18 ml

Tris-HCl

pH8, 1M

1 ml 1 ml 1 ml 1ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

EDTA

à 0.5M pH 8 0 0 0 0 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

mQ Jusqu’à

50 ml

Jusqu’à

50 ml

Jusqu’à

50 ml

Jusqu’à

50 ml

Jusqu’à

50 ml

Jusqu’à

50 ml

Jusqu’à

50 ml

Jusqu’à

50 ml

Jusqu’à

50 ml

Jusqu’à

50 ml

Jusqu’à

50 ml

Tremper rapidement dans mQ à 4°C

Sécher le plus rapidement possible sous air comprimé

6. COLORATION DAPI

Solution stock de DAPI 100 ug/ml dans l’eau à -20°C

Working solution 1 ug/ml

Ajouter 10 ul de DAPI à 1 ug/ml dans chaque puits

Laisser 2 minutes au moins

Laver à l’eau (4°C, tremper) et laisser sécher (ne pas sécher à l’air comprimé pour éviter

de disperser du DAPI) .

7. MONTAGE Ajouter des petites gouttes de citifluor AF1 dans les puits

Couvrir d’une lamelle ESCO ultra propre et attendre que le citifluor difuse dans les puits

(éponger avec le papier)

Les lames avant montage peuvent se garder quelques jours à 4°C, après montage au plus

une nuit à 4°C.

8. OBSERVATION AU MICROSCOPE À ÉPIFLUORESCENCE

Page 287: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

287

Kit de Viabilité.

Page 288: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

288

Page 289: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

289

Page 290: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

290

Protocole de culture d’Euglena gracilis

Produits Formules Par litre Di-potassium

hydrogénophosphate

K2HPO4 0,5 g

Magnésium sulfate

MgSO4, 7 H2O 0,5 g

Calcium chlorure CaCl2, 2 H2O 0,265 g

di-amonium

hydrogénophosphate

(NH4)2HPO4 0,5 g

Perchlorure de fer en

solution à 27 % (0,27

g / 1 ml)

FeCl3 1 goutte (20 µL)

Acide lactique

C3H6O3 3 mL

Vitamine B1 (sol à

0,1 g / 100 ml)

Thiamine

1 mL

Vitamine B12 (sol à 2

mg / L)

0,5 mL

Solution X (ZnSO4, 7

H2O : 5 g / L +

MnSO4 : 4 g / L)

20 mL

Préparation milieu :

- Dissoudre les poudres, ajouter l’acide lactique et la solution X.

- Ajuster le pH du milieu à 3.5 avec du KOH

- Autoclaver.

- Ajouter 20 µL de FeCl3 et les vitamines (solutions préalablement filtrées à 0.2 µm).

Le lactate peut être remplacé par 3 mL d’éthanol à 95°C. Dans ce cas, préparer le milieu

sans lactate, ajuster le pH à 3.5 puis autoclaver. On rajoute l’éthanol, à température

ambiante avant de repiquer les cellules.

Ce milieu peut servir à cultiver des euglènes à la lumière (photo-organotrophie).

Page 291: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

291

Lexique

Page 292: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

292

Page 293: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

293

Acidophile. Bactérie dont le pH optimum pour la croissance est acide.

Anaérobie. Se dit d’un métabolisme qui ne requiert pas d’O2 pour fonctionner.

Anoxique. Se dit d’un milieu dépourvu d’O2.

Anoxygénique. Se dit d’une réaction (ou d’un métabolisme) ne produisant pas d’O2.

Autotrophe (vis-à-vis du carbone). Utilisant une source de carbone inorganique (souvent le

CO2).

Chimiolithoautotrophe. Utilisant des réactions d’oxydo-réduction comme source

d’énergie et des sources de carbone et d’électrons inorganiques.

Chimiotrophe. Utilisant des réactions d’oxydo-réduction comme source d’énergie.

Eucaryote. Organisme dont les cellules contiennent un matériel génétique compartimenté

dans un noyau.

Génome. Ensemble du matériel génétique d’un organisme.

Gram-négative. Bactérie dont la paroi ne prend pas la coloration de Gram : la paroi est

composée d’une membrane plasmique, d’un périplasme contenant une couche de

peptidoglycane peu épaisse (réseau de polysaccharides linéaires liés entre eux par des

protéines) et d’une membrane externe.

Gram-positive. Bactérie dont la paroi prend la coloration de Gram : la paroi est composée

d’une membrane plasmique et d’un peptidoglycane épais.

Hétérotrophe (vis-à-vis du carbone). Utilisant une source de carbone organique.

Lithotrophe. Utilisant une source d’électrons inorganique.

Mitochondrie. Organite présent dans la plupart des cellules eucaryotes, issu d’une

endosymbiose primaire, impliqué dans la production de l’énergie cellulaire.

Neutrophile. Bactérie dont le pH optimum pour la croissance se situe aux alentours de la

neutralité.

Opéron. Groupe de gènes dont l’expression est contrôlée par un seul opérateur, i.e. une

région de l’ADN, à laquelle une protéine de répression peut se lier entraînant le blocage de la

synthèse des ARNm.

Organotrophe. Utilisant une source d’électrons organique.

Oxydation. Réaction conduisant à la perte d’un ou plusieurs électrons par une molécule,

parfois accompagnée d’une perte de protons (H+).

Peptidoglycane. Polymère présent dans la paroi bactérienne, composé d’N-

acétylglucosamine, d’acide N-acétylmuramique, et de quelques acides aminés.

Périplasme. Espace situé entre la membrane plasmique et la membrane externe des

bactéries Gram-négatives.

Photosynthèse anoxygénique. Mode de production primaire utilisant la lumière comme

source d’énergie et utilisant un donneur d’électrons autre que H2O (par exemple, Fe2+

), donc

ne conduisant pas à la production d’O2.

Photosynthèse oxygénique. Mode de production primaire (production de matière

organique CH2O), utilisant la lumière (hν) comme source d’énergie, H2O comme source

d’électrons et libérant O2 comme produit de la photolyse de l’eau :

CO2+H20 + hν � CH2O + O2

Phototrophe. Utilisant la lumière comme source d’énergie.

Plaste. Organite, présent dans les cellules eucaryotes photosynthétiques, issu d’une

endosymbiose (primaire, secondaire ou tertiaire). Les chloroplastes en particulier sont

impliqués, entre autres, dans les étapes de conversion de l’énergie lumineuse lors de la

photosynthèse.

Procaryote. Organisme dont les cellules contiennent un matériel génétique qui n’est pas

compartimenté dans un noyau vrai (pas de membrane nucléaire). Ils correspondent d’une

manière générale aux Bactéries et Archées.

Producteur primaire. Organisme autotrophe, produisant de la matière organique.

Page 294: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

294

Protéome. Ensemble des protéines produites par un génome, dans des conditions données, à

un instant donné.

Réduction. Gain d’un ou plusieurs électrons par une molécule, parfois accompagné d’un

gain de protons (H+).

Page 295: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

295

Page 296: Processus microbiens de biominéralisation et de détoxification des

296

Processus microbiens de biominéralisation

et de détoxification des métaux/métalloïdes. ~

Oxydation du fer par des bactéries anaérobies neutrophiles et résistance au fer et à l’arsenic

chez des eucaryotes unicellulaires de drainages miniers acides.

Résumé. Nous avons exploré les mécanismes permettant à des organismes procaryotes et

eucaryotes de répondre au stress induit par la présence d’éléments toxiques comme l’arsenic

et/ou par la précipitation de phases minérales au niveau des structures cellulaires. Notre étude

a notamment impliqué le développement de techniques de microscopie et de spectroscopie

adaptées à ces objets composites phases minérales - matière organique. Les deux souches

procaryotes étudiées utilisent le Fe(II) comme donneur d’électrons en l’absence stricte d’O2 à

pH neutre, ce qui conduit à la précipitation de phases riches en Fe(III) à distance des cellules

ou au contact direct des structures cellulaires. Chez la souche phototrophe SW2, le fer

précipite exclusivement dans le milieu extracellulaire le long de fibres lipo-

polysaccharidiques. En revanche, chez la souche dénitrifiante BoFeN1, le fer précipite aussi

massivement dans le périplasme des bactéries. Nous montrons que des structures cellulaires

fines (peptidoglycane, périplasme) et des molécules organiques (globules protéiques) sont

préservées dans ces cellules encroûtées qui constituent alors de stades précoces de

microfossiles. D’autre part, l’étude d’eucaryotes unicellulaires présents dans des drainages

miniers acides riches en Fe(II) et en arsenic a révélé une accumulation intracellulaire du fer

par ces eucaryotes, découplée des mécanismes de détoxification de l’arsenic. Ces derniers

procèdent par une étape de réduction de l’As(V) en As(III) suivie de sa complexation par des

groupements thiols, mettant en jeu le cycle du glutathion, et enfin de l’export de l’As(III).

Nous avons en outre montré que l’As(V) est plus toxique que l’As(III) chez ces eucaryotes.

L’ensemble de nos résultats fournit des éclaircissements pour la compréhension des

mécanismes de biominéralisation et de détoxification des métaux/métalloïdes par des

microorganismes et ouvre également la perspective de rechercher des bio-signatures

potentielles de métabolismes spécifiques dans des échantillons naturels actuels ou anciens.

Abstract. This work aimed at studying the response of microorganisms to toxic elements,

such as arsenic and to the lethal effects of mineral precipitation within cellular structures. We

applied microscopic and spectroscopic tools adapted to the study of these organic-mineral

assemblages. In a first section, we studied two different bacterial strains, both using Fe(II) as

an electron donor under strictly anoxic conditions at neutral pH. The phototrophic strain SW2

precipitated iron on lipo-polysaccharidic fibres only at distance from the cells, whereas the

denitrifying strain BoFeN1 precipitated iron within its periplasm. Ultrafine cellular structures

and proteins were preserved within these encrusted cells that can be considered as

microfossils. In a second section, we studied unicellular eukaryotes from a Fe and As-rich

acid mine drainage. Iron accumulation within the cells was shown to be completely decoupled

from the processes of arsenic detoxification. Arsenic detoxification starts with As(V)

reduction to As(III), followed by its complexation by thiol groups, involving the glutathione

pathway and leading to its export from the cell. However, we show that As(V) was more toxic

to the cells than As(III). Our results altogether provide new insights on the mechanisms of

microbial biomineralization and detoxification of metals/metalloids and opens new

perspectives for the search of biosignatures of specific metabolisms.