PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍSEKUNDÁRNÍ METABOLIZMUS Studium primárního metabolizmuStudium primárního metabolizmu

Fotosyntéza, ovlivnění fotosyntézy vnějšími podmínkami, asimilace N, inhibice produkty, transport cukrů, akumulace rezervních látek….

Studium a využití sekundárního Studium a využití sekundárního metabolizmumetabolizmu

• syntéza sekundárních metabolitů (známo asi 30 000 látek)

• biotransformace

Rostliny -- zdroj - potravy

- chemických látek

• léčiva• insekticidy• barviva• aromatické látky

látky obtížně získatelné jinou cestou

Snaha o získání kultivací rostlinných explantátů in vitro

Výhody kultivace in vitro:

nezávislost na sezónní proměnlivosti (zkrácení

doby)

-“- škůdcích a chorobách

-“- geografických a politických omezeních

možnost řídit produkci podle potřeby

-“- zajistit stálou kvalitu produktuAle : ??? rentabilita produkce

nutnost vysokých výtěžků

Dva základní přístupy k dosažení produkce sekundárních Dva základní přístupy k dosažení produkce sekundárních metabolitů:metabolitů:

• produkce v suspenzní buněčné kultuře

• imobilizace buněk – růst a produkce po prodloužený časový úsek

Kultivace suspenzní buněčné kultury stálá nezamýšlená selekce buněk s

nejvyšší růstovou rychlostí – buňky malé, „ meristematické“, mitoticky aktivní

Syntéza sek. metabolitů NE!NE! u rychle rostoucích nediferencovaných buněk (často je nutný určitý stupeň diferenciace (morfologické, biochemické) pomalejší růst

In vivo akumulace sekundárních metabolitů často ve vysoce specializovaných buňkách, ale pozor !!, někdy specifická místa slouží jen ke skladování

Potřeba nalézt podmínky, které vedou současně k dobrému růstu i dobré produkci

Ztráta produkce při dediferenciaci buněk

alternativa : kultivace organizovaných kultur

kořenové kultury

Př.: tkáňové kultury za podmínek diferenciace kořenů ---- produkce atropinu

Dvoustupňová kultivace

1. stupeň ---- pěstování na udržovacím (množícím) médiu –

získání dostatečného množství biomasy

2. stupeň ----- pěstování na produkčním médiu

indukce tvorby sekundárního metabolitu

Změna v mnoha složkách

Udržovací Udržovací XX produkční média produkční média

hormony – asi nejdůležitější faktor – rovnováha i koncentrace a typ, zejména

auxinů a cytokininů

minerální složení média největší vliv N, P, důležitá koncentrace i typ: NO3-,

NH4+,

močovina, aminokyseliny obvykle omezení zásobení N a P potlačení růstu zvýšení produkce

Př.: Morinda citrifolia – produkce antrachinonu … po koncentrace PO3-

Př.: Catharanthus roseus produkce indolových alkaloidů po koncentrace PO3-

cukry konc. z 1-2 % (udržovací médium) 5-10 % produkce sek.

metabolitů

pH média

organické přídavky

Př.: Nicotiana tabacum produkce nikotinu po snížení koncentrace NAA a KIN a vynechání hydrolyzátu kaseinu

stresstres - podmínky negativně působící na růst

• hormonální stres

• výživový stres (cukr, N, P, vzdušnění)

• chemický stres (antibiotika, těžké kovy, elicitory)

• osmotický stres

• stres infekce (mikroorganizmy, viry)

• světelný stres

• teplotní stres

produkce sek. metabolitů

Př.: produkce karotenoidů, flavonoidů, polyfenolů po ozářenosti

Př.: produkce alkaloidů po ozáření modrým světlem

Př.: produkce alkaloidů při změnách teploty

Velkoobjemové kultivace

Podmínky průmyslových kultivačních postupů – pěstování obdobné mikrob. kultivacím

Ale !!!Ale !!! některé podstatné rozdíly

Inokulační denzita

Rychlost růstu

Citlivost ke střižnému napětí

Morfologie kultury

Požadavky na vzdušnění

Mikrob.

kultura Rostlinná

kultura malá

velká

malá

jednotlivé buňky

vysoké

velká

malá

velká

shluky

nízké

Rychlost růstu: čas zdvojení 1-3 dny, experiment trvá

týdny problém sterility

Citlivost ke střižnému napětí: velké rozměry

buněk,rigidní buněčná stěna, vakuola nutnost specifických míchacích zařízení

Uvolňování produktů – problém (hromadění ve vakuole)

dvoustupňový postup : hromadění- uvolňování

Imobilizace Imobilizace

• možnost znovupoužití biomasy

• oddělení buněk od produktu

• dobré prostorové využití kultivačních nádob

• dosažení kontinuálního procesu

+

• nutnost získání vyhovujících linií

• vhodná imobilizační metoda

• uvolňování produktu do média

Metody imobilizace

Citlivost k mechanickému, osmotickému, výživovému stresu, teplotě , pH, O2 omezený výběr imobilizačních metod

Co se nehodí ? - poutání na povrch kovalentní vazbou, zachycení do polyakrylamidu, vinylových polymerů

Co se hodí ? -- alginát, agaróza, nosiče - nylon, někdy polyuretan

Produkce kapsicinu

Hlavní problém imobilizace – difúze látek

Vytvoření mikroprostředí – závisí na velikosti částic, porozitě, míchání, koncentraci substrátu, distribuci biomasy uvnitř partikulí

??!! Někdy vhodné pro navození stresu

Př.:Př.: 1. průmyslově využívaná produkce – šikoninšikonin. Tradiční

japonské léčivo a barvivo - producent Lithospermum erythrorhizon; v

přírodě obsah 1-2%, v kulturách in vitro 12-15 %

Př.:Př.: 1. průmyslově využívaná produkce – šikoninšikonin. Tradiční

japonské léčivo a barvivo - producent Lithospermum erythrorhizon; v

přírodě obsah 1-2%, v kulturách in vitro 12-15 %

Př:Př: Produkce sekundárního metabolitu – léčivo taxoltaxol

19691969 - objeveno nové protinádorové antibiotikum - taxol produkuje Taxus brevifolia

19831983 – 1.fáze klinických testů – v současnosti jedno z nejdůležitějších cytostatik,

Ale !!! K získání 1 kg taxolu je třeba 700 – 900 kg kůry tisu

Snaha o produkci látky kulturami in vitro

založení tkáňových kultur různé typy primárních explantátů média růstové regulátory

sacharidy antioxidanty adsorbenty fenolických látek světelné podmínky teplota

elicitace přídavky prekurzorů infekce Agrobacteriem

Odvozeny linie s 40x vyšším obsahem taxolu než je v kůře T. brevifolia, suspenzní kultury produkující 20 mg taxolu v 1l média

20022002 zahájení komerční produkce taxolu

prototyp nové řady antibiotik

Př.:Př.: chinin Cinchona officinalis antimalarikum

dogoxin Digitalis lanata kardiotonikum

morfin Papaver somniferum analgetikum

thebain Papaver bracteatum zdroj kodeinu

scopolamin Datura stramonium snížení krevního

tlaku

atropin Atropa beladona spasmolytikum

steviocid Stevia rebaudiana sladidlo

kapsicin Capsicum frutescens léčivo

jasmin Jasminum spp. parfém

pyrethriny Chrysanthemum cinerariaefolium insekticidy

 

Př:Př: Biotransformace

digitoxin digoxin

Obě látky produkuje Digitalis lanata , ale účinné kardiotonikum je digoxin, rostlina produkuje zejména digitoxin

Zvládnuta biotransformace digitoxinu suspenzními buněčnými kulturami nebo imobilizovanými buňkami D. lanata

za použití : suspenzních kultur imobilizovaných buněk částí buněk izolovaných enzymů

Biotransformace

Ztráta schopnosti syntetizovat sekundární metabolit, ale zachování aktivit některých enzymů

Možnost modifikace přirozených

syntetických

látek

... oxidace, redukce, hydroxylace, metylace, glykosylace, esterifikace, epoxidace…

Př:Př: Biotransformace

steviol (aglykon) steviocid, steviobiocid

Zvládnuta biotransformace steviolu suspenzními buněčnými kulturami Stevia rebaudiana a Digitalis purpurea