Click here to load reader

Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

  • View
    1

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri...

  • Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah

    asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem.

    Specializirani hematološki laboratorij kliničnega oddelka za hematologijoUniverzitetni klinični center Ljubljana

  • Mieloproliferativne novotvorbe (MPN) So skupina kronično potekajočih klonskih krvnih

    bolezni, pri katerih je zvečano nastajanje krvnih celic zaradi motnje na ravni matične krvotvorne celice esencialna trombocitemija (ET), prava policitemija ali policitemija rubra vera (PV), primarna mielofibroza (PM) kronična mieloična levkemija (KML)

    (Dameshek,1951) kronično nevtrofilno levkemijo, kronično eozinofilno levkemijo, mastocitozo in neklasificirane MPN

    (Vardiman, JW, Thiele, J, Arber DA et al. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes Blood, 2009; 114: 937-951)

  • Značilnosti MPN Kostni mozeg je hipercelularen in v njem je prekomerna

    razrast ene ali več hematopoetskih celic.

    Hematopoetske nezrele celice iz kostnega mozga ali periferne krvi rastejo v celičnih kulturah brez zunanjega hematopoetskega rastnega dejavnika.

    Možen prehod iz ene oblike MPN v drugo in v akutno levkemijo (redko).

    Potek je večinoma dolgotrajen, razen pri KML.

  • Protein tirozin kinaze pri različnih novotvorbah hematopoetskega tkiva

    Opomba: na sliki uporabljena stara klasifikacija SZO

  • Somatska mutacija Janus kinaza 2 (JAK2) V617F

    Baxter EJ et al., Lancet 2005; 365: 1054-1061

    Levine RL et al. Cancer Cell 2005; 7(4): 387-397

    somatska mutacija JAK2V617F večina bolnikov s pravo policitemijo (PV) (65-97 %)

    pribl. 50 % bolnikov z esencialno trombocitemijo (ET)(33-57 %)

    pribl. 50 % primarno mielofibrozo (35-50 %)

    pribl . 50 % bolnikov z refraktarno anemijo s prstanastimi sideroblasti in trombocitozo

    redko: ostale mieloproliferativne in mielodisplastične bolezni

    pri zdravih je niSkoda, R. Biological basis of myeloproliferative neoplasms. Hematology Education: the education programme for the annual congress of the European Hematology Association 2010; 4: 183-188.

  • Janus kinaza 2 (JAK2)

    protein iz družine znotraj celičnih tirozin kinaz: JAK 1,JAK 2, JAK 3 in TYK 2.

    Vključen v prenos signalov iz različnih receptorjev zarastne dejavnike

    Gen JAK2 se nahaja na kromosomu 9p24.

  • mutacija JAK2V617F

    točkovna mutacija v domeni pseudokinaze JH2 (ekson 14; G>T). Zamenjava AK valin (V) v fenilalanin (F) na mestu 617 AK zaporedja.

    Stalna aktivacija in delovanje JAK2 tirozin kinaze

    Preobčutljivost za citokine in hitra proliferacija

    Najdena v celicah mieloične vrste (granulociti, trombociti), limfocitih ne

  • Najpogostejši načini ugotavljanja mutacije JAK2V617F

    Molekularno genetski načini:

    Alelno-specifična verižna reakcija s polimerazo (alelno-specifičen PCR)

    PCR in restrikcija pridelkov z restriktazo

    PCR v realnem času

    sekveniranje dela DNA gena JAK2, kjer se nahaja mutacija

  • Primer: alelno-specifičen PCR

    Vz. VzorecK+ pozitivna klonalna kontrola (Homozigot pozitiven JAK2

    V617F, Ipsogen, Francija)K- negativna kontrola NTC vodaM označevalev velikosti DNA (100 do 1000 bp) + pozitiven rezultat (364 bp in 203-bp velik produkt)

    M + + + + +

    2 % agarose gel

    364 bp (interna kontrola)

    203 bp (mutiran alel)

    Metoda po Baxter EJ et al., Lancet 2005; 365: 1054-1061

  • Občutljivost načina alelno-specifičnega PCR JAK2V617F

    M 1 10-1 10-2 10-3 10-4

    10-kratna zaporedna redčitev klonalne homozigot pozitivne JAK2V617F DNA(InVivoScribe Technologies) v vzorec normalne DNA.

    2,0 % agarose E-gel (Invitrogen)

    Kvantitativni PCR (qPCR)- Bolj občutljiv kot alelno-specifični PCR- Določimo delež JAK2V617F pozitivnega alela -dražja preiskavauporabimo komplet od Ipsogen, Francija.

  • Mutacija v eksonu 12 gena JAK2 pri bolnikih s PV ali izolirano eritrocitozo pri katerih niso

    dokazali mutacije JAK2V617F Pojavnost: do 83 % bolnikov neg. za JAK2V617F in potrjeno diagnozo

    PV, odstotek je nižji pri bolnikih z izolirano eritrocitozo)

    niso ugotovili pri ostalih MPN in so močno povezane s fenotipom PV

    spremenijo različna nukleotidna mesta v bližini kodona 539. Pogosto opazimo delecijo 1 do 3 kodonov.

    nekatere najpogostejše mutacije: N542-E543del, H538QK539L, F537-K539delins, K539L

    prisotne tudi duplikacije npr. duplikacija 11 kodonov (V536-F547dup)

    Scott et al. NEJM 2007;356:459-68.

    Schnittger S et al. Haematologica 2009;94: 414-418

    Skoda, R. Hematology Education: the education programme for the annual congress of the EHA 2010; 4: 183-188.

  • Načini ugotavljanja mutacije v eksonu 12 gena JAK2-naš pristop PCR v realnem času z dvojno hibridizacijsko sondo in

    analiza talilne krivulje pomnožene cDNA (analiza kodonov od mesta 535 do 555) (Schnittger S et al. Haematologica 2009;94: 414-418)

    PCR in agarozna gelska elektroforeza (duplikacije)

    sekveniranje dela DNA gena JAK2, kjer se nahaja mutacija

  • Preliminarni izsledki-mutacije v eksonu 12 JAK2 N=5 , 3 PV, 1 eritrocitoza, 1 ni podatka vsi JAK2V617F neg. 2 pozitivna (oba PV) po načinu PCR v realnem času z dvojno

    hibridizacijsko sondo in analiza talilne krivulje pomnožene cDNA (metoda poSchnittger S et al. Haematologica 2009;94: 414-418)

    Oba pozitivna z PCR in agarozno gelskoelektroforezo

    Vidni dodatni madeži na elektroforezi-duplikacija ?

    Sekveniranje (v obdelavi)

    mutacija

    Duplikacija ?

    Vz1. vz.2

    Nemutiran genotip

  • Mutacije v eksonu 16 gena za JAK2

    Pri bolnikih z Downovim sindromom in z B-ALL

    povezane z novotvorbo B-celične vrste ob prisotnosti dodatnega kromosoma 21

    Za izražen fenotip bolezni ali celo drugo obliko bolezni so zraven mutacije v genu JAK2 pomembni še dodatni dejavniki

    Skoda, R. Biological basis of myeloproliferative neoplasms.

    Hematology Education: the education programme for the

    annual congress of the European Hematology Association 2010; 4: 183-188.

  • Mutacije v genu za trombopoetinski receptor pri 3 do 5 % bolnikov z ET in pri 5 do 8 % bolnikov z

    PM gen za trombopoetinski receptor se nahaja na

    kromosomu 1p34 (Myeloproliferative Leukemia Virus Oncogene, MPL)

    najpogostejše mutacije zamenjavi aminokisline tripofan za levcin (MPL W515L), lizin (MPL W515K) ali alanin (MPL W515A) na mestu 515 AK

    mutacija najverjetneje povzroči, da je beljakovina aktivna brez vezanega liganda Skoda, R. Biological basis of myeloproliferative neoplasms. Hematology Education: the education programme for the

    annual congress of the European Hematology Association 2010; 4: 183-188.

  • Preliminarni izsledki Izvedba:

    DNA granulocitov periferne krvi, uporaba reagenčenga kompleta MPL MutaScreen Kit

    (Ipsogen, Francija), verižna reakcija s polimerazo v realnem času z analizo alelne diskriminacije Omejitev preiskave: samo mutaciji MPL W515L in MPL W515K

    N=80 (77 ET, 3 PM vsi JAK2V617F Neg.; 20 moških, 60 žensk, mediana starosti 48, razpon 18 do 89 let)

    Rezultat: 3 poz. za MPL W515L Vsi ET 1 poz. za MPL W515K ET 76 negativnih za MPL W515L/K Pojavnost 3,75 %

  • Mutacija KITD816VMastocitoza Mutacija KITD816V

    Opredelitev bolezni (minor criteria) Rezistenca za inhibitor tirozin kinaze

    Načini ugotavljanja-naš pristop Alelno-specifični PCR (DNA)

    90 bp

    184 bpNTCm

    M S01w S01m S02w S02m Kw+ Km+ Kw- Km- NTCw M

  • Nove mutacije v različnih genih

    gen »Ten Eleven Translocation 2« (imenovan tudi »tet oncogene family member 2«, TET2), kromosom 4q24

    MPN, MDS, AML Delovanje proteina ni poznano, morda ima pomembno

    vlogo pri nastanku in napredovanju MPN

    gen »Casitas B-cell lymphoma« (CBL), kromosom 11q23.3.

    Vpleten v razpad tirozin kinaz

    drugi geni: »Additional Sex Combs-Like 1« (ASXL1), za encim isocitrat dehidrogenazo (IDH1 in IDH2) »IKAROS family zinc finger 1« (IKZF1).

  • Zaključek Določitev mutacij v genu JAK2, MPL in KIT z

    molekularno genetskimi načini so pomembne preiskave, ki jih opravimo za opredelitev MPN.

    Te mutacije so povezane s povečano proliferacijo krvnih celic, najverjetneje so vpletene v nastanek bolezni.

    Pomembne so in bodo najverjetneje tudi pri izbiri zdravljenja z novejšimi zdravili, predvsem pri napredovalih oblikah MPN.

    Znane so nove mutacije v različnih genih; njihova vloga in pomen se še raziskuje

  • Zahvala Anica Mihajlović Marija Jedrt Mandelc Mazaj Martina Fink Urška Ribič Špela Žula Leonida Kovačič (študentka) Nejc Lamovšek (študent) in drugi

    Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbahMieloproliferativne novotvorbe (MPN)Značilnosti MPNProtein tirozin kinaze pri različnih novotvorbah hematopoetskega tkivaSomatska mutacija Janus kinaza 2 (JAK2) V617FJanus kinaza 2 (JAK2)mutacija JAK2V617FNajpogostejši načini ugotavljanja mutacije JAK2V617FPrimer: alelno-specifičen PCRObčutljivost načina �alelno-specifičnega PCR JAK2V617FMutacija v eksonu 12 gena JAK2Načini ugotavljanja mutacije v eksonu 12 gena JAK2-naš pristopPreliminarni izsledki-mutacije v eksonu 12 JAK2Mutacije v eksonu 16 gena za JAK2Mutacije v genu za trombopoetinski receptor Preliminarni izsledkiMutacija KITD816VNove mutacije v različnih genihZaključekZahvala