25.1.2012

1

Preverjanje porekla z Preverjanje porekla z genskim testom genskim testom

Andreja Opara univ. dipl. ing. zoot

mag. Betka Logar

Kmetijski inštitut Slovenije

Hacquetova ulica 17, 1000 Ljubljana, Slovenija

UVOD

• Glavni nameni testiranja je kontrola rodovnikovoz. porekla

• TEST KRVNIH SKUPIN – manj specifičen

• GENSKI TEST– Možnost hitre diskriminacije– Velika zanesljivost > 99%

• Temelji na DNK – dednem materialu– Potrebne so majhne količine DNK, dovolj je že ena celica

• Osnova je pravilno odvzet vzorec

OD VZORCA DO DNK

DNK

Testiranje se začne z izolacijo genetskega materiala (DNK) iz vzorcev dlak, semena, krvi..

25.1.2012

2

ANALIZA

vodna raztopina DNKraztopina namnoženih 11 DNK označevalcev (5 živali)

1

4

23

5

DNK

seme v slamici

Foto: Andreja Opara

DNK OZNAČEVALCI

DNK označevalci, pogosto imenovani

DNK markerji soJedro

Celica

DNK

značilni, kratki deli DNK, ki jih lahko določimo in sledimo njihovemu

dedovanju.

DNK = deoksiribonukleinska kislina

Kromosom

• Za mikrosatelite so značilni kratki, enostavni osnovni motivi, navadno dolgi od 2-6 bp.

• Standardni nabor 11 mikrosatelitov

MIKROSATELITI

Vir variabilnosti je

različno število ponovitev osnovnega motiva, ki je za lokus specifičen

25.1.2012

3

• Prvi korak je izolacija DNK

• Količina DNK v vzorcu je dosti premajhna, da bi jo lahko zanesljivo merili, zato s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (PCR) pomnožimo DNK na nivo, ki ga lahko zaznamo. Tehnika je prinesla v genetiko revolucijo z njenim odkritjem leta 1984.

OPIS METODE

OPIS METODE

• Po pomnoževanju DNK ločimo na “Genetskem Analizatorju”, ki ločuje DNK fragmente. Ti se ločijo po velikosti in barvi.

TESTIRANJE STARŠEVSTVA

Vsak oštevilčen vrh predstavlja eno inačico DNK označevalca pri dveh potencialnih bikih, kravi in teletu. Tele ima inačici 139 in 145. Inačico 139 je tele podedovalo po kravi, inačico 145 pa ima le bik 2. Pravi oče teleta je bik 2, bika 1 pa izključimo.

kandidatnibik 1

krava

tele

kandidatnibik 2

V testu starševstva se DNK rezultate teleta primerja z rezultati potencialnih staršev. Vsak potomec ima dve inačici vsakega DNK označevalca. Za vsakega od 11 označevalcev mora veljati, da se ena inačica ujema z eno materino in druga z eno očetovo. Vsako neujemanje izključi starša (ali oba starša) – poreklo se ovrže.

141

141

135

145

139

139 145

25.1.2012

4

REZULTAT ANALIZE

IZPIS REZULTATOVOZNAČEVALEC POTOMEC OČE MATI

BM1824 178 178 178 182 178 182

BM2113 131 135 131 135 131 131

ETH10 217 221 219 221 217 221

ETH225 140 150 144 150 140 140

ETH3 117 127 117 127 117 127

INRA23 206 214 198 214 206 214

SPS115 248 252 248 260 248 252

TGLA122 143 149 143 149 143 143

TGLA126 115 115 115 115 113 115

TGLA227 81 91 81 81 89 91

TGLA53 160 164 160 164 160 164

BM1818 258 262 258 262 262 262

MGTG4B 135 135 135 145 135 140

SPS113 285 296 296 302 285 300

RM067 91 97 97 97 89 91

CSRM60 103 105 105 105 103 105

CSSM66 187 199 185 187 185 199

ILSTS006 296 298 294 298 296 298

ODVZEM VZORCA

25.1.2012

5

NAVODILA ZA ODVZEM VZORCA-OZNAČEVANJE

• Plastične vrečke z ZIP načinom zapiranja – pred odvzemom vzorca na vsako vrečko z alkoholnim pisalom čitljivo napišite:

• ID

• ime živali

(če ga ima)

• pasmo

• datum rojstva

• datum vzorčenja

Foto: Andreja Opara

KORAK 1 – PRIPRAVA

•Preglej konico repa, da se izogneš smetem oz. nečistočam, izpadlim, mrtvim dlakam. •Če je rep zelo umazan (predvsem krave), ga operi, dobro izplakni in povsem osuši. •Lasni mešički ne smejo vsebovati urina oziroma fekalij. •Umazani vzorci niso primerni za analizo DNK.

KORAK 2 - PULJENJE

• Zberi šop dlak približno 2 cm stran od korena (kože) in potegni, da dlake izvlečeš.

• Poglej, če so na korenu dlak vidni mešički.

• Dlake brez mešičkov ne vsebujejo dovolj DNK in jih ne bo mogoče analizirati.

• Dlake lahko izvlečeš tudi s pinceto, ki dlak ne pretrga. Šop dlak izvleci z rahlim potegom.

25.1.2012

6

Foto: Andreja Opara

Foto: Blaž ŠegulaFoto: Blaž Šegula

25.1.2012

7

KORAKI 3, 4 in 5

Korak 3: Ponavljaj korak 2, dokler ne dobiš približno 50 dlak z dlačnimi mešički.

Korak 4: Obrni vse dlačne mešičke v isto smer. Položi vzorec v označeno vrečko in jo takoj zapri, da preprečiš kontaminacijo (pomešanje z dlako drugih živali). V eni vrečki je lahko vzorec dlake le ene živali.

Korak 5: Pred jemanjem dlake naslednje živali si je potrebno oprati roke. To je preventivni ukrep pred navzkrižno kontaminacijo vzorcev.

KORAK 6 - SHRANJEVANJE

• Vzorce je najbolje hraniti v hladilniku ali na sobnitemperaturi. Ne smejo biti izpostavljeni vlagi in direktni sončni svetlobi.

• Pravilno označene vzorce v kuverti pošljite na naslov:

Kmetijski inštitut SlovenijeOddelek za živinorejoAndreja Opara - vzorci

Hacquetova 17 SI-1000 Ljubljana

POMNIDlake izpuli iz konice repa.

Največ DNK je v mešičkih

dlak, zato je dlake

potrebno SPULITI in ne

rezati.

V primeru, da žival nimarepa lahko dlake izpuliš iz katerega koli dela živali, pomembno je, da so na dlakah prisotni dlačni mešički (ki so največji na konici repa).

Foto: Andreja Opara

25.1.2012

8

HVALA ZA POZORNOST!