APLICACIONES BIOLÓGICAS DE LA ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL

P. Carmona

Instituto de Estructura de la Materia (CSIC)

Aplicaciones Biológicas de la Espectroscopía Vibracional

Estudios estructurales

Aplicaciones bioanalíticas

Proteínas y RNA virales. Componentes de alimentos reestructurados (proteínas, agua, lípidos).

Biodiagnóstico

P. Carmona (IEM)M. Molina (UCM)C. Pargada (UCM)J. Bartolomé (FEHV)

P. Carmona (IEM)A. Toledano (IC)I. Alvarez (IC)

P. Carmona (IEM)M. Careche (IF)A. Herrero (IF)F. Jiménez (IF)

GRUPO DE BIOESPECTROSCOPIA

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA Y RAMAN

Interacción radiación electromagnética-vibraciones moleculares

Grupos funcionales Estructura espacial

Análisis Químico

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA Y RAMAN

Interacción radiación electromagnética-vibraciones moleculares

Grupos funcionales Estructura espacial

Análisis Químico

TIPOS DE ESTRUCTURAS A ESTUDIAR POR IR-RAMAN

Secundaria Terciaria Cuaternaria

Intercambio isotópico H/D

Espectroscopía de correlación 2D

Identificación

Frecuencias características. Correlaciones espectro-estructura.

Cuantificación

Ajuste de perfiles.

Regresión PLS.

Dominios temporales de intercambio H/D

2850 cm-1 2920 cm-1

725 cm-1 1450 cm-1 ~1300 cm-1 1350-1180 cm-1

1615-1640 cm-1

1650-1658 cm-1

A-DNA B-DNA

820-800 cm-1 850-825 cm-1

IR spectra of biological components highlighting the most prominent absorption features. Spectra for a protein(myoglobin), lipid (dimyristoylphosphatidylcholine, DMPC), nucleic acid (poly-A), and carbohydrate (sucrose) areshown.

1615-1640 cm-1

1650-1658 cm-1

Y = a + b1 X1 + b2 X2 +...+ bp Xp

Yi , Xi = espectros de proteínas

ESTRUCTURA SECUNDARIA DE PROTEINAS

Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales

U G A U 3’-C A CA G C G G G G G

5’-G C C A G C C C C C

1600 1400 1200 1000 800 600

1482

Ram

an In

tens

ity/A

rbitr

. Uni

ts

Wavenumber/cm-1

1705 15

9915

7515

30

1317

1250

1368

1416

1098

1043

983 92

186

781

278

372

4 668

629

1700 1650 1600

Ram

an In

tens

ity/A

rbitr

. Uni

ts

Wavenumber/cm-116

21

1635

1663

16761699

6 5

∅ 10

Membrane

Cell front plate

Syringe pump

6 5

∅ 10

Membrane

Cell front plate

Syringe pump

Quartz cell

syringe pump

microdialysis fibre

laser

CINETICAS DE INTERCAMBIO H/D MEDIBLES POR ESPECTROSCOPIA IR-RAMAN

(k ≤

2.5 min-1)

Proteínas Acidos Nucleicos

´ lámina-β

doble hélice A, B (pares GC)

α-hélice estructura Z (pares GC, AT, AU)

est. cuat. (lámina-β, α-hélice, desordenada) est. cuat. (pares GC, AT, AU)

(a) Synchronous and (b) asynchronous 2D correlation spectra constructed from dynamic spectra.

VENTAJAS DE LA ESPECTROSCOPIA OPTICA DE CORRELACION 2D

• Resolución de bandas solapadas.

• Asignación de modos vibracionales mediante correlación de bandas.

• Secuenciación temporal de cambios espectrales.

• Detectar interacciones moleculares a través de grupos que generan bandas correlacionadas.

1750 1660 1570 1480 1750

1660

1570

1480

A

cm

-1

Espectros síncronos de la proteína P22

Hepatitis C virus

5

10

15

20

25

700750800850900950 Wavenumber/cm-1

Tim

e/m

in

Microscopio Raman Renishaw

-15 -10 -5 0 5 10 15-40-35-30-25-20-15-10-505

1015202530

Fact

or 2

: 26.

56 %

Factor 1: 54.66 %

NCSINF

A Factor 1 versus Factor 2 plot (score plot) of principal component analysis from 16 healthy control and 29 scrapie-infected samples (NC and SINF groups, respectively). (Carmona et al., J. Gen. Virol., 2005).

Structure of protein

α Helix

β Sheet

β Turn

Other

Amino acid

The steric structure of the protein isformed by interaction of amino acids. Therefore, the steric structure depends on the sequence of amino acids.

The structure of the protein is classified into 4 structures as follows:1. Primary2. Secondary3. Tertiary4. Quaternary

Typical protein (lysozyme)

Quantitative analysis using UV/Vis spectrometer

0

5

200 400250 300 350

Abs

Wavelength[nm]

Almost all proteins have a peak at 280 n, therefore, quantitative analysis of protein can be performed with a UV/Vis spectrometer. An alternative quantitative analysis method is colorimetry using reagent (such as the Lowry method , Biuret method, etc.)

Concentration [%, M etc.]Concentration [%, M etc.]

Abs

Abs

Calibration curve Quantitative analysis First of all, spectra of each protein concentration are measured to produce a calibration curve. Next, unknown samples are measured and quantitative analysis is performed using the calibration curve.

Benzene ring(280 nm)

IR spectrum of typical protein

Amid I peak contains the secondary structure information (α-Helix, β- Sheet etc.)

Using this peak, the IR-SSE program calculates SSE by PCR ( Principal Component Regression) or PLS (Partial Least Square) method.

1700 1680 1660 1640 1620 1600

-1,2-1,0-0,8-0,6-0,4-0,20,00,20,40,60,8

Prin

cipa

l Com

pone

nt 1

, Loa

ding

s

cm-1

1632

1686

1654

Loadings plot of Factor 1 (Principal Component 1) for the score plot in the previous Figure.

0

5

10

15

20

25

30

35

Controls Infected

β-Sh

eet S

truc

ture

(%)

Bar diagram for the means of ß-sheet percentages measured for healthy control and scrapie-affected samples from genetically selected animals. (Carmona et al., Chemistry and Biology, 2004).

VIBRACIONES MOLECULARES ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ Espectroscopia Infrarroja Espectroscopia Raman ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ Absorción de radiación infrarroja Difusión inelástica de radiación ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ APLICACIONES ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ • Estructura de la materia a nivel molecular (moléculas orgánicas, inorgánicas y

cristales) • Análisis químico (determinación de compuestos inorgánicos, orgánicos y

biológicos) en estado sólido, líquido o gaseoso.

Teoría de grupos

ESTRUCTURA

Cálclulos de frecuencias de vibración