Predicción de Promotores y Elementos Reguladoresertello/bioinfo/sesion11.pdf · 2014-07-17 · por expresiones regulares o con PSSM Puntajes de coincidencia o no coincidencia en

Predicción de Promotores y Elementos Reguladores

Pedro Eduardo TORRES JIMÉNEZ

CINVESTAV-Zacatenco

09 de julio del 2013

Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del 2013 1 / 60

1 Predicción de Promotores y Elementos ReguladoresIntroducciónPromotores y elementos reguladores en procariotasPromotores y elementos reguladores en eucariotasMétodos basados en perfiles de expresiónRegulación transcripcionalSelección de sitios para construir un modelo para laspropiedades de unión de un TF específicoAlineamiento de sitioscreando la PFMconversión a PSSMCompartiendo motivosLocalizar genes y promotores de interés en especies dereferenciaLocalizando secuencias ortólogasIdentificando subsecuencias conservadas en el alineamiento


Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción




Introducción

Un problema relacionado con la predicción de genes es lapredicción de promotores

Los promotores son elementos de ADN localizados en los sitiosdonde inician los genes

Funcionan como sitios de unión en el proceso de transcripción degenes

Consisten en ARN Polimerasa y Factores de Transcripción



Introducción

Estos elementos de ADN regulan directamente la expresión delos genes

Los promotores y los elementos reguladores son determinadostradicionalmente por análisis experimental

Este proceso es extremadamente laborioso y tardado

La predicción computacional de promotores y elementosreguladores es útil para sustituir este proceso



Introducción

Sin embargo sigue siendo una tarea difícil:

Los promotores y los elementos reguladores no están claramentedefinidos y son muy diversos.

Cada gen parece tener una única combinación de motivosreguladores que determinan una única expresión temporal yespacial.

Los promotores y los elementos reguladores no pueden sertraducidos en secuencias de proteinas para incrementar lasensibilidad de su detección

Los sitios de los promotes y elementos reguladores que sepredicen son por lo general cortos (6 a 8 nucleótidos) y puedenser encontrados fácilmente debido al azar, lo que resulta en altosíndices de falsos positivos


Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Promotores y elementos reguladores en procariotas




Promotores y elementos reguladores en procariotas

En bacterias la transcripción es iniciada por una ARN polimerasala cual es una enzima multi-subunidad

La subunidad e.g σ70 de la ARN polimerasa es la proteina quereconoce las secuencias específicas hacia arriba del gen ypermite al resto de la enzima unirse

La secuencia hacia arriba donde la proteina σ se une constituye lasecuencia del promotor

Esta incluye los segmentos de secuencia ubicados a 35 y 10 bphacia arriba desde el sitio de inicio de la transcripción, tambiénconocidos como 35 box y 10 box respectivamente







Por ej. Para la subunidad σ en Escherichia coli, la -35 box tieneuna secuencia consenso de TTGACA y la -10 box tiene unasecuencia consenso de TATAAT

En adición a la ARN polimerasa también hay un número deproteinas que facilitan el proceso de transcripción conocidascomo factores de transcripción

Estas se unen a secuencias específicas de ADN para mejorar oinhibir las funciones de la ARN polimerasa

Las secuencias de ADN específicas a las cuales los factores detranscripción son unidos se llaman elementos reguladores

Estos elementos reguladores pueden unirse en la cercanía delpromotor o unirse a centenas de bp del promotor


Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Promotores y elementos reguladores en eucariotas




Promotores y elementos reguladores en eucariotas

La transcripción tiene una capa extra de complejidad, unconjuntno de tres distintos tipos de ARN polimerasa

Cada tipo de polimerasa transcribe diferentes conjuntos de genes

RNA polimerasa I y III son responsables de la transcripción deRNA ribosomal y ARNt respectivamente

RNA polimerasa II es responsable exclusivamente de transcribirgenes de proteinas codificantes (o síntesis de ARNm)




A diferencia de los procariotas, donde los genes forman unoperón con un promotor compartido, cada gen eucariótico tienesu propio promotor

El núcleo de varios promotores eucarióticos es la llamadaTATA-box, ubicada a 30 bp hacia arriba desde el sitio de inicio detranscripción, teniendo un motivo consenso TATA(A/T)A(A/T)







Sin embargo, no todos los promotores eucarióticos contienen laTATA-box

Las TATA-boxes son usadas como un indicador de existencia dealgún promotor

Varios genes tienen una secuencia iniciadora única, la cual esrica en piridiminas con un consenso (C/T)(C/T)CA(C/T)(C/T). Estesitio coincide con el sitio de inicio de transcripción



1 Predicción de Promotores y Elementos ReguladoresIntroducciónPromotores y elementos reguladores en procariotasPromotores y elementos reguladores en eucariotas

Algoritmos para predicciónAlgoritmos ab-initioPredicciones para procariotasPredicciones para eucariotasMétodos basado en huelas filogenéticas

Métodos basados en perfiles de expresiónRegulación transcripcionalSelección de sitios para construir un modelo para laspropiedades de unión de un TF específicoAlineamiento de sitioscreando la PFMconversión a PSSMCompartiendo motivosLocalizar genes y promotores de interés en especies dereferenciaLocalizando secuencias ortólogasIdentificando subsecuencias conservadas en el alineamiento



Algoritmos para predicción

Pueden ser categorizados en:

Basados en ab-initio: Hacen predicciones escaneandosecuencias individuales

Basados en similitud: Hacen predicciones basadas enalineamiento de secuencias homólogas



Algoritmos para predicción

Basados en perfiles de expresión: Usan perfiles construidos de unnúmero de secuencias de genes coexpresadas del mismoorganismo

Las predicciones por similitud son también conocidas comohuellas filogenéticas

Debido a que la ARN polimerasa II transcribe los ARNm, lamayoría de estos algoritmos se basan en la predicción depromotores en ARN polimerasa tipo II








Algoritmos ab-initio

Este tipo de algoritmos predice promotores y elementosreguladores procarióticos y eucarióticos, basados en patrones desecuencias características

Algunos son basados en señales, dependiendo del tipo depromotores tales como las TATA-boxes, otros dependen deinformación, por ejemplo en frecuencias de hexámeros

Las ventaja de este tipo de algoritmos es que la secuencia puedeser aplicada como tal sin la necesidad de obtener informaciónexperimental.

Una limitante es la necesidad de entrenamiento, la cual hace lapredicción específica para ciertas especies




Además este tipo de método tiene dificultad en descubrir nuevosmotivos

La manera convencional de detectar promotores o elementosreguladores es a través de patrones de secuencias representadospor expresiones regulares o con PSSM

Puntajes de coincidencia o no coincidencia en todas lasposiciones de la matriz son sumados. Este simple método tienedificultades para detectar entre promotores reales y aleatorios, ypor lo tanto genera altos índices de falsos positivos

Una nueva generación de algoritmos han sido diseñados paratomar en cuenta el orden de correlación de múltiplescaracterísticas usando funciones discriminantes, redesneuronales o HMMs.




Para mejorar la especificidad, algunos algoritmos excluyenregiones de búsqueda y se centran en regiones de subida (0.5 a2.0 kbp) donde comunmente se localizan promotores

De esta manera la predicción de promotores y la predicción degenes están acopladas








Predicciones para procariotas

Un aspecto único de los promotores en procariotas es ladeterminación de operones, debido a que los genes quecontienen un operón comparten un promotor común

Es por esto que la predicción de operones es la llave para lapredicción de promotores procarióticos

Hay métodos disponibles para la predicción de operones. El másacertado es un conjunto de reglas simples desarrolladas porWang et al (2004)

Este método depende de dos tipos de información: Orientación delos genes y distancia intergénica entre un par de genes y vínculosconservados entre genes basados en análisis genómicocomparativo

Un esquema de puntaje fue desarrollado para asignar operonescon distintos niveles de confianzaPedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del 2013 24 / 60





Predicciones para procariotas

Este método identifica operones acertadamente, lo que facilita ala predicción de promotores

BPROM

FindTerm








Predicciones para eucariotas

El método de ab-initio para predecir promotores y elementosreguladores en eucariotas depende de buscar las secuencias deentrada para hacer un matching con los patrones consenso depromotores conocidos.

Los patrones consenso son determinados experimentalmente,posteriormente compilados en perfiles y almacenados en unabase de datos para escanear secuencias desconocidas yencontrar patrones similares conservados

Este método tiende a generar altos índices de falsos positivos

Para incrementar la especificidad de la predicción, se ocupa unacaracterística unica de los eucariotas, la cual es la presencia deislas CpG




Se sabe que varios genes de vertebrados se caracterizan por unaalta densidad de dinucleótidos CG cerca de la región delpromotor, traslapándose con el sitio donde la transcripción esiniciada

Combinando el enfoque de islas CpG con otras señales delpromotor la confiabilidad de la predicción es mejorada




CpGProd

Epopine

Cluster-Buster

FirstEF

McPromoter

TSSW

CONPRO








Métodos basado en huelas filogenéticas

Se ha observado que los promotores y elementos reguladores deorganismos estrechamente relacionados como los del humano yel ratón son altamente conservados. La conservación es tanto anivel de secuencia y a nivel de organización de los elementos

La identificación de elementos de ADN conservados nocodificantes que tienen roles funcionales se conocen comohuellas filogenéticas

Este método puede ser aplicado tanto a procariotas comoeucariotas

La selección de organismos para comparación es una importanteconsideración para este tipo de análisis




Si el par de organismos seleccionados son estrechamenterelacionados, como el del humano y el chimpancé la diferenciaentre las secuencias puede no ser suficiente para filtrarelementos funcionales

De otra manera, si los organismos tienen una distancia evolutivalarga como el humano y el pez, habrá divergencia evolutiva muygrande, los promotores y otros elementos funcionales seránindetectables

La ventaja de este tipo de algoritmos es que no es necesario elentrenamiento de los modelos probabilísticos

Potencial de descubrir nuevos motivos reguladores

Una limitante es la restricción de las distancias evolutivas desecuencias ortólogas




ConSite

rVista

PromH

Bayes aligner

FootPrinter


Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Métodos basados en perfiles de expresión




Métodos basados en perfiles de expresión

Los genes con perfiles de expresión similares son consideradoscoexpresados.

La coexpresión se refiere al hecho de tener en común promotoresy elementos reguladores

Si esto es válido, las secuencias de subida de los genescoexpresados pueden ser alineados para revelar elementosreguladores en común reconocibles por factores de transcripciónespecíficos

El problema es que los elementos reguladores de genescoexpresados son cortos y débiles

Sus patrones son difíciles de discernir usando alineamientomúltiple de secuencias




Deben usarse métodos tales como EM y Gibbs

EM es un algoritmo de extracción de motivos por medio deoptimización repetida de una PSSM a través de comparacionesde secuencias

Gibbs usa una optimización de matriz similar pero con unaestrategia más flexible y con una probabilidad más alta de obtenerel patrón óptimo




MEME

AlignACE

Melina

INCLUSive

PhyloCon


Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Regulación transcripcional




Regulación transcripcional

La regulación transcripcional es uno de los procesos másimportantes a estudiar en la biología celular

La caracterización de promotores y TFBS para genes específicoses un tema muy estudiado

El modelo computacional estándar que describe las propiedadesde unión de los factores de transcripción es la PFM (PositionFrequency Matrix)

Una PFM se construye contando las ocurrencias de losnucleótidos en las columnas de un alineamiento de TFBScolectados de experimentos

La predicción es altamente correlacionada con propiedades deunión in vitro de los FT



Regulación transcripcional

Sin embargo el objetivo de la investigación en regulación degenes es la identificación de sitios de unión que sonfuncionalmente importantes in vivo, lo cual es un gran reto

Los sitios funcionales pueden ser encontrados pero pueden serindistinguibles en otras predicciones, se emplean ciertos métodospara aumentar la selectividad, por ejemplo la comparación deespecies cruzadas como un filtro de selección (huellasfilogenéticas)

Existen dos partes importantes en el proceso de búsqueda deelementos reguladores: construir un modelo para un factor detranscripción de interés y la predicción de elementos reguladores


Predicción de Promotores y Elementos ReguladoresSelección de sitios para construir un modelo para las propiedades

de unión de un TF específico



Predicción de Promotores y Elementos ReguladoresSelección de sitios para construir un modelo para las propiedades

de unión de un TF específico

Selección de sitios para construir un modelo para laspropiedades de unión de un TF específico

En la práctica, los sitios usados para construir modelos de TF sonbasados en sitios funcionales extraidos de artículos publicados oconjuntos de sitios identificados por una serie de rondas deselección in vitro

Como mínimo cinco sitios o más son requeridos para un modeloimprovisado , donde más de veinte en la mayoria de los casos esadecuado para un modelo representativo.

Si la selección in vitro es usada, el número de sitios usualmenteno es un problema

Existe un peligro de sobreselección, esto es, los sitiosseleccionados no son representativos in vivo


Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Alineamiento de sitios



Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Alineamiento de sitios

Alineamiento de sitios

Una vez que se tienen los sitios es necesario alinearlos para laconstrucción subsecuente del modelo, es necesario construir lamatriz del modelo sin huecos

Se usan algunas herramientas, los patternfinder como MEME

Como un patternfinder es probabilístico, es recomendado aplicarel mismo conjunto de secuencias varias veces para obtener unasolución estable


Predicción de Promotores y Elementos Reguladores creando la PFM



Predicción de Promotores y Elementos Reguladores creando la PFM

creando la PFM

Cada columna en el alineamiento es evaluadaindependientemente, contando las instancias de A,G,C y T

Esto puede hacerse con una herramienta como EMBOSS


Predicción de Promotores y Elementos Reguladores conversión a PSSM




conversión a PSSM

Una PFM puede ser considerada como una representaciónprimaria para los modelos de unión de los factores detranscripción, pero aun no está optimizada para el escaneo desecuencias de genomas

La mayoría de los investigadores convierten estas matrices aPSSM, debemos calcular la probabilidad de agregar el nucleótidon es la posición c pn,c

pn,c =fn,c+0,25

√N

N+√

N

dado pn,c podemos convertir los valores de la matriz a valoreslogit. La conversión está dada por:

wn,c = log2(pn,c0,25)



conversión a PSSM

Un puntaje cuantitativo S para un sitio potencial es calculado conla suma de los valores relevantes de W, y está dado por:

S =∑d

i=1 wl,c

donde d es el número de columnas en W e i el nucleótidoencontrado en la posición c en el sitio potencial

como las matrices tienen distintos rangos de puntaje, senormalizan

Snorm = S−SminSmax−Smin ∗ 100



conversión a PSSM

donde S es el puntaje obtenido de alguna subsecuencia usandola PSSM

La manera más popular de representar estas secuencias esusando Logo

Intuitivamente la información contenida en una columna de laPFM corresponde a qué tan restringidos están los requerimientosde unión en cierta posición

La información contenida para una columna c en F está dada por

Ic = 2 +∑

n=A,C,G,T P(fn,c)log2p(fn,c)

p(fn,c) =fn,cN


Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Compartiendo motivos



Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Compartiendo motivos

Compartiendo motivos

Un problema en general es la falta de calidad en la mayoría de losfactores de transcripción registrados

Es por eso que se recomienda compartir nuestros modelosconstruidos

Algunas herramientas que permiten esto son JASPAR y PAZAR


Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia



Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia

Localizar genes y promotores de interés en especiesde referencia

Una vez que una región es seleccionada, es posible usar elnavegador para extraer secuencias relevantes para los siguientespasos

No hay reglas simples para localizar regiones candidatas. Engeneral se asume que la mayoría de las regiones reguladorascaen en las regiones de subida del inicio del sitio de transcripción


Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Localizando secuencias ortólogas



Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Localizando secuencias ortólogas

Localizando secuencias ortólogas

Alinear las dos secuencias usando un programa apropiado.

Elegir un programa que sea ideal para alinear secuencias de bajasimilitud, por ej LAGAN, BLAST no es ideal para este tipo deanálisis


Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento




Identificando subsecuencias conservadas en elalineamiento

La forma más común de seleccionar las subsecuenciasconservadas del genoma es usar una ventana deslizante

Una ventana con tamaño fijo se desliza sobre los alineamientos,contando el número de nucleótidos alineados idénticos

El nucleótido del centro de la ventana es etiquetado con elprocentaje de identidad

La ventana se desliza 1 bp a lo largo del alineamiento

Todos los nucleótidos que tienen una etiqueta mayor a un umbralse consideran conservados

Una elección típica es comparar humano-ratón en una ventana de50 bp y un umbral del 70 por ciento

Este análisis puede hacerse con herramientas como ConSite yrVista



Identificando subsecuencias conservadas en elalineamiento

La interpretación de los resultados puede ser desalentadora,puesto que los modelos basados en matrices son propensos aproducir algunas predicciones falsas, aunque el método dehuellas filogenéticas pueda remover casi el 90 por ciento de laspredicciones comparado con el análisis simple de secuencias.

En general uno no debe esperar una única respuesta sinambiguedad

Sin embargo, en algunos casos el análisis puede acelerarsesignificativamente reduciendo el espacio de búsqueda a ciertasregiones reguladoras potenciales


Documents

Predicción de Promotores y Elementos Reguladoresertello/bioinfo/sesion11.pdf · 2014-07-17 · por expresiones regulares o con PSSM Puntajes de coincidencia o no coincidencia en