Predavanje 1 OBI (1)

8/18/2019 Predavanje 1 OBI (1)

1/36

Enzimska kinetika

vo=

Vmax [S]

K m + [S]

K m

Vmax &

E1E2E3

Prvi red

Nulti rad

Kompetitivna

Nekompetitivna

Akompetitivna

Direktni dijagram

Linearizacija

Bi supstratne reakcije istoSlede Mihaelis-Mentenovukinetiku, ali enzim je zasiendru!im supstratom

Mihaelisova

konstanta

Maksimalna

brzina I nh i b i c i j a

Aktivnost

Prvo utvrditi zavisnost "rzine od #S$i odrediti %m i vm

k 3 [Et]

k cat Broj izmena

k cat / K m

Jedinice aktivnosti

1 mole

min

S

peci&i'na aktivnost

unitm!

Značaj


2/36

P or a s t k on c en t r a c i j e s u p

s t r a t a

2 ! " # $ % &'

' 2 " $ &

(upstrat (mole)

P r o i z v

o *

&'

$'

"'

2'

'

(

+E

,

P ( z a o * r e - en ov r em e )


3/36

Enzimska kinetika

E (+ P+

Teorija stacionarnog stanjaTeorija stacionarnog stanja

. stacionarnom stanju brzina proizvo*nje i potro/nje

prelazno0 kompleksa je je*naka1 o znači *a je

koncentracija E( kompleksa konstantna3

(E E

4uan0 56 72''") 89basics


4/36

:E(; je konstantno u stacionarnom stanju

S P

E

ES

5eakciono vreme

K o

n

c e n

t r a c i j a

4uan0 56 72''") 89basics


5/36

5ealni po*aci za enzimsku kinetiku

P

o * a c i

no1

2

3

4

'12#

'1#'

1'

21'

'1"2

'1%2

'1&'

'1


6/36

Enzimska inhibicija 7Mehanizmi)

I

I

S

S

S

II

S

Kompetitivna Nekompetitivna Akompetitivna

E

E

5azličita mestaInhibitor

(ubstrate

M e h a

n i z a m

4

e * n a č i n a i o p i s

I se vezuje za slobo*an E

i takmiči se sa supstratom

I se mo@e vezati za slobo*an E

ili E( kompleks1

I se vezuje samo za E(

kompleks

E + ( E( E + P

+

I I *

E I I

B

C

E + ( E( E + P

+ +

I I I I * *

E I I + ( E I I (

B

C C

E + ( E( E + P

+

I I *

E I I (

B

C

E

I

S X


7/36

K m

EnzDme Inhibition 7Plots)

II Kompetitivna Nekompetitivna Akompetitivna

? i r e k t n i * i j a 0 r a m i

L i n e E e a v e r 3 8 u

r k

FmaG FmaG

K m K m’ :(;H mM

vo

:(;H mM

vo

I I I I

K m :(;H mM

FmaG

I I

K m’

FmaGFmaG

FmaG nepromenjeno

K m se poveJava

FmaG se smanjuje

K m nepromenjenoFmaG K m se smanjuju

I I

=:(;1/K m

1+vo

= FmaG

I I

Paralelne prave

I I

Presek sa osom

1+vo

= FmaG

=:(;1/K m =:(;1/K m

= FmaG

1+vo

Preseksa D osom

K m’


8/36

KINETIKA BISUPSTRATNIH ENZIMSKIH REAKCIJA

. *osa*a/njim izla0anjima razmatrane su samo one enzimske

reakcije u kojima enzim *eluje na je*an supstrat i pri čemu nastaje je*an proizvo* reakcije1

Primeri ovih reakcija u u@em smislu reči

) reakcije izomerizacije

2) reakcije raski*anja veza 939H 93OH 93NH 93( *irektno

bez učesJa vo*e

E B E A

→

←

BH OH AO H B A

→

←2

E C B E A

FeJina enzima katalizuje reakcije izme-u *va i vi/e supstrataH

*ajuJi je*an ili vi/e proizvo*a 7oksi*ore*uktazeH trans>erazeH

li0aze)

6i*rolazeH koje katalizuju reakcije raski*anja veza uz uče/Jemolekula vo*eH mo0u se smatrati enzimima koji *eluju na je*an

supstrat

const O H =][2


9/36


Primer *vosupstratnih reakcija ko* oksi*ore*uktaza

9

O

Primer *vosupstratnih reakcija ko* trans>eraza

B AX BX A →

←

lukoza + M0APlukoza + M0AP lukozo3$3>os>at +lukozo3$3>os>at +

M0A?PM0A?P


10/36


(ve bisupstratne reakcije se *ele prema Klilen*uKlilen*u 79lelan*9lelan*) na

) sekvencijalnesekvencijalne 7sekvencijalna zamena)2) ping-pongping-pong 7*vostruka zamena)

Ko* bisupstratnih reakcija koje se o*i0ravaju po

sekvencijalnomsekvencijalnom mehanizmu svi supstrati se vezuju zasvi supstrati se vezuju za

enzim pre oslobađanja proizvodaenzim pre oslobađanja proizvoda1 a*a se >ormiraTERNARNI K!"#EK$TERNARNI K!"#EK$ iz enzima i oba supstrataH EAB Sekvencijalne reakcije se alje ele na!

pravilne reakcijepravilne reakcije "orer reaction#$ to s% one kokoji& se ve'ivanje s%(strata i ot(%)tanje (roi'voa reakcijeovija %vek isti* reosleo* i

nasumi%ne reakcijenasumi%ne reakcije "rano*# sa nas%*i+ni*ve'ivanje* s%(strata i ot(%)tanje* (roi'voa,Pri*er! sve reakcije koje i*aj% kao s%(strat NA-. ili NA-Hoigravaj% se (o (ravilno* sekvencijalno* *e&ani'*% jer se

%vek (rvo ve'%je koen'i*$ a 'ati* r%gi s%(strat,


11/36


"ravilan sekvencijalni mehanizam-primer&"ravilan sekvencijalni mehanizam-primer&

Enzim e0zistira kao ternarni kompleks koji se sastoji prvo iz

enzima i supstrata i kasnije iz enzima i proizvo*a reakcije1

Nasumi%an sekvencijalni mehanizam-primer&Nasumi%an sekvencijalni mehanizam-primer&3>os>orilacija kreatina *o >os>okreatina katalizovana kreatin3kinazom


12/36


Nasumi%an sekvencijalni mehanizam-primer&Nasumi%an sekvencijalni mehanizam-primer&

Iako je re*osle* vezivanja supstrata slučajanH opet se >ormira

ternarni kompleks1

Ko* bisupstratnih reakcija koje se o*i0ravaju po ping-pongping-pong

mehanizmu jedan ili vi'e proizvoda reakcije se jedan ili vi'e proizvoda reakcije seoslobađaju pre nego se svi supstrati ve(u)oslobađaju pre nego se svi supstrati ve(u) Fa@naFa@nakarakteristika ovo0 mehanizma je stvaranje supstituisano0karakteristika ovo0 mehanizma je stvaranje supstituisano0

interme*ijera enzima u kome je enzim privremeno mo*i>ikovan1interme*ijera enzima u kome je enzim privremeno mo*i>ikovan1


13/36


"ing-pong mehanizam-primer&"ing-pong mehanizam-primer&

-- Prenos amino 0rupe sa aspartata na Q3keto 0lutarat katalizovanoaspartat3aminotrans>erazom


14/36


15/36

/ENERA0NA JE-NA1INA BISUPSTRATNIHREAKCIJA

[ ] [ ] [ ]

]

[ ]

[ ]

[ ] ] A B K B K K K

B K B AV v AB BA AB A

S

AB

=

max

eneralna je*načina u Mihaelis3Mentenovom obliku

za bilo koju :8;H privi*na MIhaelisova konstanta za supstrat A bi

bila

[ ]

[ ]

[ ]

]

A B K B K K K K AB BA AB A

S app

A

m

za slučaj K( A K8AH privi*na Mihaelisova konstanta ne zavisi o* :8;

i je*naka je K8AH to je slučaj je*no0 o* mehanizama bisupstratnih

reakcija1 (ličnoH za bilo koju :A;H privi*na Mihaelisova konstanta za supstrat

8 bi bila

[ ]

[ ]

] B A K A K K K K BA AB AB A S app B

m

za slučaj K( A K8AH privi*na Mihaelisova konstanta ne zavisi o* :8;

i je*naka je K A8

H to je slučaj je*no0 o* mehanizama bisupstratnihreakcija1


16/36



17/36



18/36

SEK2ENCIJA0NE REAKCIJE SA S0U1AJNIMMEHANIZM3M

Primenom Klilen*ove /eme 79lelan*)

"rimer&"rimer&

Iako je re*osle* vezivanja supstrata slučajanH opet se >ormira

ternarni kompleks1


19/36


Pret(ostavljeni *e&ani'a*!

[ ] [ ][ ] EA A E

K A S =[ ] [ ][ ] EA A E

K A

S = [ ][ ]

[ ] EB B E

K B S =[ ] [ ][ ] EB B E

K B

S = [ ][ ]

[ ] EBA A EB

K BA =[ ][ ][ ] EBA

A EB K

BA=

[ ][ ][ ] EAB

B EA K AB =

[ ][ ][ ] EAB

B EA K

AB=

K( A3ravnote@na konstanta za binarni

kompleks EA

K(83ravnote@na konstanta za binarni

kompleks E8K8A3ravnote@na ili Mihaelisova konstanta

za ternarni kompleks E8A

o ačno re/enje je*načine za stacionarne uslove je veoma slo@eno 7Makover)

o .vo*i se aproksimacija *a je k cat veoma malo tako *a su EH EAH E8 i EA8 u rav3

note@i

K A83ravnote@na ili Mihaelisova konstanta

za ternarni kompleks EA8

AB

BA

B S

A

S

K

K

K

K

= AB

BA

B

S

A

S

K

K

K

K =

[ ] EABk v cat = [ ] EABk vcat

=

1


20/36


[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] EAB EB EA E E t +++=[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] EAB EB EA E E t +++=

[ ] EABk v cat = [ ] EABk v cat =

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ][ ]

+++=

AB A

S

AB BAt

K K

B A

K

B

K

A E E 1[ ] [ ]

[ ] [ ] [ ][ ]

+++=

AB A

S

AB BAt

K K

B A

K

B

K

A E E 1

[ ]

[ ][ ][ ]

[ ] [ ] [ ][ ]

+++

=

AB A

S

AB BA

AB A

S

t

K K

B A

K

B

K

A

K K

E B A

EAB

1

[ ]

[ ][ ][ ]

[ ] [ ] [ ][ ]

+++

=

AB A

S

AB BA

AB A

S

t

K K

B A

K

B

K

A

K K

E B A

EAB

1

[ ]

[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ][ ]

+++

==

AB A

S

AB BA

AB A

S

t cat

cat

K K

B A

K

B

K

A

K K

E B Ak

EABk v

1

[ ]

[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ][ ]

+++

==

AB A

S

AB BA

AB A

S

t cat

cat

K K

B A

K

B

K

A

K K

E B Ak

EABk v

1


21/36



$$##$#$#

$$##ma

B A B K A K K K

B AV

v +++= BAABABAS $$##$#$#$$##ma

B A B K A K K K

B AV

v +++= BAABABAS


22/36



$$##$#$#

$$##ma

B A B K A K K K

B AV

v +++= BAABABAS $$##$#$#$$##ma

B A B K A K K K

B AV

v +++= BAABABAS

N a 0 i b

=:8;

maV

K K

Nagib

AB A

S

=

maV

K BA

maV

K

Nagib

AB

=

O * s e

č a k

=:8;

ma

1

V

(pecijalan slučaj ka*a vezivanje supstrata A ne utiče na vezivanje supstrata

8 i obratnoH ta*a je K( AK8A i ta*a se prave seku na y 3osi na L181 *ija0ramu1

( )( )$#$#

$$##ma

B K A K

B AV v

BA ++=

AB

( )( )$#$#

$$##ma

B K A K

B AV v

BA

++

=AB


23/36



Kaa je 4A5 konstantno

[ ][ ] B K

B

V

v

+=

ma

[ ][ ] B K

B

V

v

+=

ma

[ ][ ] A K AV V BA += ma

ma

[ ][ ] A K AV

V BA += ma

ma

[ ][ ]

[ ]( )[ ] A K A K K

A K

A K K K K

BA

A

S

AB

BA

AB AB A

S

++

=++

= [ ]

[ ][ ]( )

[ ] A K A K K

A K

A K K K K

BA

A

S

AB

BA

AB AB A

S

++

=++

=K A8

K (8

AB

BA B

S A

S K

K K K = AB

BA B

S A

S K

K K K =


24/36



Kaa je 4B5 konstantno

[ ][ ] A K

A

V

v

+=

ma

[ ][ ] A K

A

V

v

+=

ma

[ ][ ] B K BV V

AB += mama [ ][ ] B K

BV V AB +=

mama

[ ]

[ ]

[ ]

[ ][ ]( )

[ ] B K B K K

B K

B K K K

B K

B K K K K

AB

B

S

BA

AB

BA BA B

S

AB

BA AB A

S

++

=

=+

+=

+

+=

[ ]

[ ]

[ ]

[ ][ ]( )

[ ] B K B K K

B K

B K K K

B K

B K K K K

AB

B

S

BA

AB

BA BA B

S

AB

BA AB A

S

++

=

=

+

+=

+

+=

, K

K ( A

K 8A

BA

AB A

S B

S K

K K

K = BA

AB A

S B

S K

K K K =


25/36

SEK2ENCIJA0NE REAKCIJE SA PRA2I0NIMMEHANIZM3M


Pret(ostavljeni *e&ani'a*!

o ačno re/enje je*načine mo@e se *obiti za stacionarne usloveo Na osnovu ovo0 mehanizmaH enzim se mora prvo vezati za supstrat AH pa tek

on*a za supstrat 81o Sormira se ternarni kompleks

E + AK(

A

EA + 8K A8

EA8k cat

E + P +R

[ ] EABk v cat = [ ] EABk v cat = [ ][ ]

[ ] EA A E

K A S =[ ][ ][ ] EA

A E K A S = [ ][ ]

[ ] EAB B EA

K AB =[ ][ ][ ] EAB

B EA K AB =

K( A3ravnote@na konstanta za binarni kompleks EA

K A8

3ravnote@na ili Mihaelisova konstanta za ternarni kompleks EA8


26/36



Materijalni 6ilans 'a en'i*!

[ ] [ ] [ ] [ ] EAB EA E E t ++=[ ] [ ] [ ] [ ] EAB EA E E t ++=

[ ] [ ][ ] [ ] B A A K K K B A

V

v AB AB A

S ++=

ma

[ ] [ ][ ] [ ] B A A K K K B A

V

v AB AB A

S ++=

ma

[ ] t cat E k V =ma [ ] t cat E k V =ma

Kaa je 4B5 konstantno

[ ]

[ ] A K

A

V

v

+= ma

[ ]

[ ] A K

A

V

v

+=

ma

[ ][ ] B K BV

V AB +

= mama[ ]

[ ] B K BV

V AB +

= mama

[ ] B K K K

K AB

AB A

S

+=

[ ] B K K K

K AB

AB A

S

+=

, K

:8;

K ( A


27/36


28/36



Kaa je 4A5 konstantno

[ ][ ] B K

B

V

v

+=

ma

[ ][ ] B K

B

V

v

+=

ma

ma

ma V V = ma

ma V V =

[ ] AB

AB A

S K A

K K K +=

[ ] AB

AB A

S K A

K K K +=

, K

:A;

K A8

Reosle ve'ivanja s%(strata

o Zavisnost FmaG o* konstantne koncentracije supstrata mo@e *a se koristi

za utvr-ivanje re*osle*a vezivanja supstrata1 Ako postoji zavisnostH to znači

*a se *ru0i supstrat vezuje za enzim i obratnoH ako nema zavisnosti to znači

*a se prvi supstrat vezuje za enzim1


29/36



[ ] [ ]

[ ] [ ] B A A K K K B A

V

v AB AB A

S ++=ma

[ ] [ ]

[ ] [ ] B A A K K K

B A

V

v

AB AB A S ++=ma


30/36

PIN/ P3N/ BI BI MEHANIZAMPIN/ P3N/ BI BI MEHANIZAM

Pret(ostavljeni *e&ani'a*!o Ne >ormira se ternarni kompleks

o eneralna /ema ako se reakcija o*vija pri stacionarnim uslovima

E + A

k 1

k -1

EAk 2

ET + 8

k 3

k -3

ET8

k .E / 0

P

Km A Km

A

[ ] [ ] EA

A E

k

k k K

A

m =+

= −1

21[ ] [ ] EA

A E

k

k k K Am =

+= −

1

21 [ ][ ][ ] B E

B E

k

k k K Bm

3

.3=

+=

−

[ ][ ][ ] B E

B E

k

k k K Bm

3

.3=

+=

−

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] B E E EA E E t

+++=[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] B E E EA E E t +++=


31/36


Relacija i'*e7% E i E8 *o9e se na:i i' stacionarnog stanja 'a E8

[ ] [ ][ ]

[ ] A K k B E K k

E Bm

A

m

2

.

=[ ]

[ ][ ][ ] A K k B E K k

E Bm

A

m

2

.=

Nor*ali'acijo* jena+ine sa totalno* koncentracijo* en'i*a "v ;4E 5t#$s%(stit%cijo* i sre7ivanje* o6ija se!

[ ]

+++

=

2

.

2

.ma 1$$##$#

$$##

k k

B A A K B K k

k

B A

V

v

B

m

A

m[ ]

+++

=

2

.

2

.ma 1$$##$#

$$##

k k

B A A K B K k

k

B A

V

v

B

m

A

m

Za sl%+aj kaa je najs(oriji st%(anj reakcije konver'ija E8B % E<"k= k>#$ o6ija se!

$$##$#$#

$$##ma

B A B K A K

B AV v

A

m

B

m ++=

α $$##$#$#

$$##ma

B A B K A K

B AV v

A

m

B

m ++=

α 2

.

k

k =α

2

.

k

k =α


32/36


Konstantno B

[ ][ ] A K

A

V

v

+= ma

[ ]

[ ] A K A

V

v

+= ma

[ ][ ] B K BV

V B

m += mama

[ ][ ] B K BV

V B

m += mama

[ ][ ] B K B K K B

m

A

m

+= α

[ ][ ] B K B K

K Bm

A

m

+= α

Konstantno A

[ ][ ] A K

A

V

v

+= ma

[ ]

[ ] A K A

V

v

+= ma

[ ][ ] A K AV

V A

m +=

α

ma

ma

[ ][ ] A K AV

V A

m +=

α

ma

ma

[ ][ ] A K A K K A

m

B

m

+= α

[ ][ ] A K A K

K Am

B

m

+= α


33/36



34/36

Pore7enje *e&ani'a*a


35/36

T&e %se o? (ri*ar@ (lots

U Lineeaver38urk plots can be plotte* at varDin0 :A; an* *i>>erent >iGe*

values o> :8;

U Or*ere* an* ran*om3seVuential mechanisms can be *istin0uishe* >rom

pin03pon0 mechanismH 8. NO >rom each other bD the use o> primarD

plots

U 9ompetitive inhibitors or isotope eGchan0e stu*ies are use* to

*i>>erentiate these to mechanisms


36/36

T&e %se o? (ri*ar@ (lots

Documents

Predavanje 1 OBI (1)