AnvändningsområdenAnvändningsområden

• Binda någon till en brottsplats• Framställning av medicin• GMO• Faderskapsbestämning• Släktskap• Kloning• mm…

Molekylärbiologin ett av de områden som expanderat mest under senaste årtiondenJames Watson och Francis Cricks beskrev DNA-molekylens byggnad första gången 1953.

Watson/ Crick med DNA-Watson/ Crick med DNA-modellmodell

E-coliE-coli

I början av 1950-talet upptäcktes att vissa E-coli stammar inte skadades av bakterifager

• Bakterierna hade vissa enzymer som ”klippte” sönder Virus-DNA

sk restriktionsenzymer.

• Idag känner man till 100-tals restriktionsenzymer, vilka är specifika, dvs de binder in till en speciell nukleotid- kombination där enzymet passar och klyver DNA.

Molekylärbiologins verktyg -Molekylärbiologins verktyg -enzymerenzymer

Använder tre slags enzymer:

•Restriktionsenzymer – klipper DNA vid bestämda baspar•DNA-ligas – fogar samman DNA-sekvenser•DNA-polymeras – bygger komplimentära strängar till DNA-molekyler

Restriktionsenzymer kan klyva DNA på två sätt:

•Rakt av

•Utstickande enkelsträngade ändar sk ”sticky ends”. De kan binda komplementärt till ”sticky ends” på andra DNA-fragment

Alla bakteriearter har sitt eget restriktionsenzym. I Alla bakteriearter har sitt eget restriktionsenzym. I bakteriekromosomen sitter metylgrupper bundna till de bakteriekromosomen sitter metylgrupper bundna till de

platser där restriktionsenzymerna kan klippa DNA-strängen. platser där restriktionsenzymerna kan klippa DNA-strängen. Enzymerna kan då inte binda DNA som därför förblir intakt. Enzymerna kan då inte binda DNA som därför förblir intakt.

Namnsättning av restriktionsenzymNamnsättning av restriktionsenzym::

Bakt: Escherichia Coli

•Man utgår från namnet på bakterien enzymet kommer ifrån:•Eco (kursiverat)•Vilken stam bakterien tillhör (RY13)•R•Romersk siffra som anger i vilken ordning enzymerna upptäckts hos bakteriestammen.•I

•EcoR1

PlasmiderPlasmider• DNA-ringar hos bakterier och jästsvampar som ligger fritt i

cytoplasman.• De kan kopieras utan att bakteriekromosomen kopieras.

För gentekniska försök krävs att plasmiden:För gentekniska försök krävs att plasmiden:

• Har bindningplats för DNA-polymeras• Kan kopieras självständigt och ge många kopior i en cell• Har klyvningsställen för restriktionsenzymer• Har gen som kan användas för identifiering av celler som tagit

upp plasmid

Tillverkning av rekombinant bakterie Tillverkning av rekombinant bakterie

(rekombinant DNA eller hybrid DNA)(rekombinant DNA eller hybrid DNA)

1. Klyver plasmiden med restriktionsenzym

2. Fragment separeras med gelelktrofores och identifieras

3. Främmande DNA-fragment sätts in i plasmiden

4. Bakterier får ta upp plasmid (transformation) med främmande DNA (med önskad egenskap).

5. Celler som tagit upp rekombinanta plasmider identifieras.

Identifiering:Identifiering:…av rekombinanta plasmider.

1.Ha en känd egenskap och en egenskap som förblir intakt efter klyvning med restriktionsenzymer som kan identifieras.

1.Märka de bakterier som tagit upp främmande gener med en gen som kodar för fluorescerande ämne.

Plasmiden pBR322: (gener: ampicillinresistens ApR och tetracyklinresistens TcR)

1.Plasmid klyvs mha restriktionsenzym(BamHI) mitt i genen för tetracyklinresistens. När främmande DNA segment sätts in förstörs genen. Gen för ampicillinresistens är oskadad.

2. Bakterier får ta upp den rekombinanta plasmiden (transformation) och odlas sedan på agarplattor med antibiotikan ampicillin.

3. De som överlever har tagit upp plasmiden (ampicillinresistenta).

4. Bakterierkolonier överförs med hjälp av ”stämpeldyna” till agarplattor med tetracyklin.Bakterier med rekombinanta plasmiden kommer att dö medan de med ursprungsplasmiden överlever.

• 5. Plattorna jämförs och bakterier med rekombinanta bakterier från ampicillinplattan tas därifrån och odlas upp.

GelelkroforesGelelkrofores1. Man gjuter en gel av en polymer, antingen

agaros eller polyakrylamid. 2. En kam med breda tänder sätts i för att få

brunnar där DNA-prover ska placeras.3. Prover blandas med en lösning som innehåller

socker och färgämne.4. Brunnarna fylls med DNA fragment du vill

undersöka. En brunn fylls med kända DNA-fragment en sk DNA-stege.

5. Elektroforesen ansluts till strömkälla.

Några användningsområden idag:Några användningsområden idag:• Insulinframställning(Förr: från grisars bukspottkörtel)• Influensavaccin• Interferoner• Faktor VIII (koaguleringsfaktor för blödarsjuka)• Tillväxthormon(förr:…….)

……från döda människors hypofyser.från döda människors hypofyser.

• I framtiden kan dvärgväxt vara ett minne blott…