PowerPoint Presentation
PERANCANGAN PRIMERKELOMPOK B1
Anggota Kelompok :Marsalita Irine P.( 132210101002 )Fikriatul
Hidayah( 132210101010 )Zulfiah Nurfajriani( 132210101012 )Ayunda
Nur H.( 132210101014 )Mia Rahmaniah( 132210101016 )Erlita Dinda(
132210101020 )Fergi Rizkhaltum F.( 132210101022 )Wilda Yuniar(
132210101024 )Meylani Nur Riskiana( 132210101026 )
TUJUANMahasiswa mengetahuidan mampu melakukan perancangan primer
menggunakan software.
Mahasiswa dapat menentukan spesifitas primer yang dibuat.
TEORI DASARPolymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu tehnik
sintesis dan amplifikasi DNA secara invitro. Tehnik ini ditemukan
oleh Kary B. Mullis dan F. Faloona pada tahun 1985. PCR didasarkan
pada amplifikasi enzimatik fragmen DNA dengan menggunakan dua
oligonukleotida primer yang komplementer dengan ujung 5 dari kedua
untaian sekuensi target. Oligonukleotida ini digunakan sebagai
primer (primer PCR) untuk memungkinkan DNA template dicopy oleh DNA
polymerase (Nasir, 2002). PCR melibatkan tiga tahap siklus
temperatur yang berurutan yaitu denaturasi template (94 - 95oC),
annealing (penempelan) pasangan primer pada untai ganda DNA target
(50 60oC) dan pemanjangan (72oC) (Retnoningrum, 2001).
METODE PCRDenaturasiDi dalam proses PCR, denaturasi awal
dilakukan sebelum enzim taq polimerase ditambahkan ke dalam tabung
reaksi. Denaturasi DNA merupakan proses pembukaan DNA untai ganda
menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya berlangsung sekitar 3
menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA
untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA
mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat,
dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu denaturasi
yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase.
Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40
menit, 5 menit masing-masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5oC.
Annealing (penempelan primer)
Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik
adalah bahwa primer sebaiknya berukuran 18 25 basa, mengandung 50
60 % G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens
DNA dalam masing-masing primer itu sendiri juga sebaiknya tidak
saling berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya
struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi
PCR.Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 45
detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya.
Kisaran temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36oC
sampai dengan 72oC, namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah
antara 50 60oC.
Pemanjangan Primer (Extention)Selama tahap ini Taq polymerase
memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari ujung 3.
Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72oC
diperkirakan 35 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH,
konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian untuk
produk PCR dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah
lebih dari cukup untuk tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di
akhir siklus PCR waktu yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang
sampai 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan terbentuk DNA
untai ganda.
KOMPONEN UTAMA PCRPada proses PCR diperlukan beberapa komponen
utama adalah (Nasir, 2006; Yuwono, 2006) :DNA cetakan, yaitu
fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. DNA cetakan yang digunakan
sebaiknya berkisar antara 105 106 molekul. Dua hal penting tentang
cetakan adalah kemurnian dan kuantitas.Oligonukleotida primer,
yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (18 28 basa nukleotida)
yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA yang mempunyai
kandungan G + C sebesar 50 60% untuk kestabilan penempelan
primer.Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP) terdiri dari dATP,
dCTP, dGTP, dTTP. dNTP mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah
konsentrasi efektif ion. Komponen ini yang diperlukan untuk reaksi
polimerasi.
Enzim DNA Polimerase yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi
sintesis rantai DNA. Enzim ini diperoleh dari Eubacterium yang
disebut Thermus aquaticus, spesies ini diisolasi dari taman
Yellowstone pada tahun 1969. Enzim polimerase Taq tahan terhadap
pemanasan berulang-ulang yang akan membantu melepaskan ikatan
primer yang tidak tepat dan meluruskan wilayah yang mempunyai
struktur sekunder.Komponen pendukung lain adalah senyawa buffer.
Larutan buffer PCR umumnya mengandung 10 50mM Tris-HCl pH 8,3-8,8
(suhu 20oC); 50 mM KCl; 0,1% gelatin atau BSA (Bovine Serum
Albumin); Tween 20 sebanyak 0,01% atau dapat diganti dengan Triton
X-100 sebanyak 0,1% disamping itu perlu ditambahkan 1,5 mM MgCl2.
Pada proses PCR menggunakan menggunakan alat termosiklus. Sebuah
mesin yang memiliki kemampuan untuk memanaskan sekaligus
mendinginkan tabung reaksi dan mengatur temperatur untuk tiap
tahapan reaksi.
PRIMERPrimer adalah rantai asam nukleat yang berfungsi sebagai
titik awal untuk mensintesis DNA, yang diperlukan untuk mereplikasi
DNA karena enzim-enzim yang mengkatalisis proses ini, yaitu DNA
polimerase, hanya dapat menambahkan nukleotida yang baru ke rantai
DNA yang ada. Polimerase mulai melakukan replikasi dimulai pada
akhir 3 pada primer dan menyalinnya dengan rantai yang berlawanan.
Dalam beberapa kasus replikasi DNA alami, primer untuk mensintesis
DNA dan replikasi adalah rantai pendek pada RNA. Banyak teknik pada
laboratorium biokimia dan biologi molekuler yang melibatkan DNA
polimerase, seperti sequencing DNA dan reaksi rantai polimerase
(PCR) yang memerlukan primer DNA. Primer ini biasanya pendek,
oligonukleotida disintesis secara kimia, dengan panjang sekitar 20
basa, dimana primer melakukan hibridisasi ke DNA target, yang
kemudian disalin oleh polimerase.
KARAKTERISTIK PRIMERPemilihan primer yang akan digunakan pada
PCR harus memenuhi kriteria atau parameter tertentu agar primer
berfungsi maksimal, parameter tersebut adalah :Panjang primer 18-24
nukleotida Jika kurang dari 15 nukleotida akan menurunkan
spesifitas hibridisasi dengan DNA target, jika lebih dari 40
nukleotida akan menurunkan aktivitas DNA polymerase.Suhu leleh (Tm)
primer 50-60o C, dengan selisih Tm antara primer kurang dari 5o C.
Tm berhubungan dengan suhu annealing, jika temperature terlalu jauh
dianding dengan suhu annealing maka tidak dapat menempel.
Urutan nukleotida yang sama tidak boleh lebih dari 4 kali karena
akan menurunkan spesifitasKandungan GC sebanyak 40-60 %, karena
ikatan hydrogen anatar G dan C lebih kuat sehingga apabila sudah
menempel akan susah lepas.Ujung 3 kedua primer tidak saling
berkomplemen.
ALAT DAN BAHANAlat yang digunakan meliputi :Software perlprimer
dan seperangkap lengkap computer dan assesorisnya.
Bahan yang digunakan meliputi:CDS gen dari suatu organisme
tertentu sebagai molekul DNA target.
PROSEDUR KERJAPada Laman NCBI
Pada Software Perlprimer
LAMAN NCBI
HASIL PENGAMATANNo.PrimerPanjangPanjangGCTm
DimerHasilPrimerProduk(o
C)Blast1FTTAGTTAGTCTACCAATTGCGC22158140%58,971100%RATTTCGGATAAAGTGTAGTGCC22158140%58,961100%2FTTAGTTAGTCTACCAATTGCGC22158140%58,971100%RTTTCGGATAAAGTGTAGTGCC21158142%58,501100%3FTAGTTAGTCTACCAATTGCGC21158142%58,311100%RTTTCGGATAAAGTGTAGTGCC21158142%58,501100%
LAMPIRAN
Primer 1
Blast Reverse
Blast Forward
Primer 2
Blast Forward Blast Reverse
Primer 3
Blast Forward Blast Reverse
