POTENSI ISOLAT BAKTERI SELULOLITIK UNTUK

PRODUKSI DEKOMPOSER

SKRIPSI

Disusun Oleh :

Dharma Sabaya

(062108015)

PROGAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PAKUAN

2012

POTENSI ISOLAT BAKTERI SELULOLITIK UNTUK

PRODUKSI DEKOMPOSER

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat mencapai gelar Sarjana Sains pada

Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Universitas Pakuan, Bogor

Disusun Oleh :

Dharma Sabaya

(062108015)

PROGAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PAKUAN

2012

DHARMA SABAYA. 062108015. 2012. Potensi Isolat Bakteri Selulolitik

Untuk Produksi Dekomposer. Dibawah bimbingan Dr. Tri Panji, MS

dan Ir. Suharyanto, M.Si

RINGKASAN

Bioetanol dapat diproduksi dari limbah lignoselulosa melalui pemecahan

limbah tersebut oleh enzim selulase menjadi gula sederhana yang dilanjutkan

dengan fermentasi. Teknologi bioetanol generasi kedua (G-II) ini mampu

meningkatkan nilai tambah limbah. Di samping itu, mikroba penghasil selulase

dapat dimanfaatkan untuk mempercepat proses pengomposan. Tujuan penelitian

ini adalah untuk memperoleh isolat bakteri selulolitik potensial untuk

mempercepat proses dekomposisi limbah lignoselulosa jerami padi.

Pada penelitian ini, isolat berasal dari jerami padi dan tanah bambu yang

diisolasi dan dimurnikan , serta kemampuan isolat dalam mendegradasi selulosa

diuji menggunakan medium Cellulose Congo Red Agar (CCRA). Aktivitas enzim

dalam mendegradasi selulosa diuji dengan metode asam dinitrosalisilat (DNS).

Sebanyak 1,5kg jerami padi diinkubasi dengan 5% inokulan. Variasi isolat yang

diaplikasikan adalah isolat DDH92, isolat JP72, dan air steril sebagai kontrol,

dengan waktu inkubasi selama 10, 20, dan 30 hari. Analisi yang dilakukan

meliputi pengujian kadar selulosa dan rasio C/N pada waktu inkubasi 30 hari.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat bakteri selulolitik DDH92 dari

kelompok Actinomycetes ini mampu menghasilkan selulase dengan aktivitas

tertinggi sebesar 50,675x10-3

Unit/mL Pemanfaatan bakteri ini untuk untuk

mempercepat pengomposan jerami padi berhasil mempercepat penurunan C/N

rasio menjadi sebesar 19,38 selama 30 hari, lebih cepat dibandingkan hasil

penelitian sebelumnya yang membutuhkan waktu hingga 6 minggu.

Kata Kunci : Bakteri selulolitik, enzim selulase, bakteri actinomycetes, bioetanol

G-II, pengomposan limbah.

DHARMA SABAYA. 062108015. 2012. The Potential of isolates Cellulolytic

Microbes for the Production of Decomposers. Under the Direction of

Dr. Tri Panji, MS and Ir. Suharyanto, M.Si

SUMMARY

Bioethanol can be produced from lignocellulosic waste through waste

breakdown by cellulase enzymes into simple sugars followed by fermentation.

This second generation bioethanol technology (G-II) is able to increase the value-

added waste. In addition, cellulase-producing microbes can be used to speed up

the composting process. The purpose of this study was to obtain cellulolytic

bacterial isolates potential to accelerate the decomposition process of waste rice

straw lignocellulose.

In this study, isolates derived from rice straw and bamboo ground was

isolated and purified, and the capability of isolates to degade cellulose was tested

using the medium of Cellulose Congo Red Agar (CCRA). Enzyme activity in

degading cellulose was tested with dinitrosalycilic acid (DNS). A total of 1.5 kg of

rice straw was incubated with 5% inoculant. Various isolates applied were isolate

DDH92, isolate JP72, and sterile water as a control with the incubation time of

10, 20, and 30 days. The analyses included levels of cellulose and C/N ratio in the

incubation time of 30 days.

The results showed that cellulolytic bacterial isolates DDH92 of

Actinomycetes goup was capable of producing highest cellulase activity of 50.675

x10-3

Units/mL Utilization of these bacteria to speed up the composting of rice

straw to successfully accelerate the decline in C/N ratio to be 19.38 for 30 days,

faster than the result of research before that takes up to 6 weeks.

Keywords : cellulolytic bacteria, cellulase enzymes, actinomycetes bacteria,

bioethanol G-II, composting waste.

i

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat dan

pertolongan-Nya, dalam menyelesaikan Skripsi dengan judul “Potensi Isolat

Bakteri Selulolitik Untuk Produksi Dekomposer”. Skripsi ini disusun berdasarkan

penelitian yang dilakukan di Laboratorium Mikroba dan Bioproses Balai

Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia di Jalan Taman Kencana No.1

Bogor Jawa Barat. Skripsi ini disusun sebagai kelengkapan salah satu syarat untuk

memperoleh gelar sarjana sains, Progam Studi Kimia Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pakuan Bogor.

Penulis menyadari bahwa Skripsi ini jauh dari sempurna, oleh karena itu

penulis mengharapkan saran dan masukan untuk penyempurnaan Skripsi ini.

Akhirnya penulis berharap agar Skripsi ini bermanfaat bagi semua pihak.

Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :

1. Bapak Dr. Darmono Taniwiryono, M.Sc. selaku Kepala Balai Penelitian

Bioteknologi Perkebunan Indonesia.

2. Ibu Dr. Prasetyorini, MS selaku Dekan Fakultas MIPA Universitas Pakuan

Bogor.

3. Bapak Drs. Husain Nashrianto, M.Si selaku Ketua Jurusan Progam Studi

Kimia FMIPA Universitas Pakuan Bogor.

4. Ibu Ade Heri Mulyati, M.Si selaku Sekretaris Jurusan Progam Studi Kimia

FMIPA Universitas Pakuan Bogor.

5. Bapak Dr. Tri Panji, MS selaku Pembimbing I yang telah memberikan

saran dalam pembuatan makalah rencana tugas akhir ini.

6. Bapak Ir. Suharyanto, M.Si selaku Pembimbing II yang telah berkenan

membimbing dan memberikan saran dalam proses penelitian dan

pembuatan makalah rencana tugas akhir ini.

7. Kak Haryo, kak Deden, Bu Ida, Mbak Ning, Mbak Uchi, Mbak Wulan,

Mbak devi, Pak Ari, Pak Mustari, Pak Jumino, dan Pak Latief yang telah

membimbing saat berjalannya penelitian ini.

8. Orang tua tercinta yang selalu memberikan dukungan moril dan materiil.

9. Kakak-kakak dan adik tercinta yang telah memberikan dukungan.

ii

10. Teman-teman kimia 2008 yang telah berjuang bersama-sama (Novi,

Agung, Oskar, Zaenal, Amen, Deo, Shelvi, Dea, Tiar, Siska, Retno,

Anggun, Kania, Desi, Giya, dan Icha).

Bogor , November 2012

Dharma S

iii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ............................................................................................ i

DAFTAR ISI ......................................................................................................... iii

DAFTAR TABEL ................................................................................................. v

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vi

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... vii

PENDAHULUAN .................................................................................................. 1

1.1 Latar Belakang .............................................................................................. 1

1.2 Tujuan Penelitian .......................................................................................... 2

1.3 Manfaat Penelitian ........................................................................................ 2

1.4 Hipotesis ........................................................................................................ 2

TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................................ 3

2.1 Jerami Padi .................................................................................................... 3

2.2 Lignoselulosa ................................................................................................ 4

2.2.1 Selulosa .................................................................................................. 4

2.2.2 Hemiselulosa .......................................................................................... 5

2.2.3 Lignin ..................................................................................................... 6

2.3 Manfaat Dekomposisi Lignoselulosa ............................................................ 7

2.3.1 Proses Pembuatan Pupuk Organik/ Kompos ........................................ 7

2.3.2 Proses Pembuatan Bioetanol Generasi Kedua ....................................... 9

2.4 Mikroorganisme Pendegadasi Selulosa (Bakteri Selulolitik) ..................... 10

2.5 Enzim Selulase ............................................................................................ 10

2.6 Spektrofotometer ......................................................................................... 12

METODE KERJA .............................................................................................. 15

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ..................................................................... 15

3.2 Alat dan Bahan ............................................................................................ 15

iv

3.3 Isolasi Bakteri Pendegadasi Selulosa .......................................................... 15

3.4 Pemurnian Kultur ........................................................................................ 16

3.5 Uji Kapasitas Hidrolisis Selulosa ................................................................ 16

3.6 Aktivitas Enzim Selulase ............................................................................ 17

3.7 Hidrolisis Selulosa Jerami Padi ................................................................... 17

3.8 Analisis Kadar Selulosa .............................................................................. 18

3.9 Preparasi Dan Analisis Rasio C/N Contoh ................................................. 18

3.9.1 Penetapan Kadar C-Organik ................................................................ 19

3.9.2 Penetapan Kadar N (Nitrogen) ............................................................. 19

HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................... 21

4.1 Isolasi Bakteri.............................................................................................. 21

4.2 Uji Degadasi Semi Kuantitatif .................................................................... 22

4.3 Analisis Kompos Jerami Padi ..................................................................... 23

4.3.1 Bobot .................................................................................................... 23

4.3.2 Tinggi ................................................................................................... 24

4.3.3 Kadar Selulosa ..................................................................................... 24

4.3.4 Kadar Lignin ........................................................................................ 25

4.4 Aktivitas enzim selulase .............................................................................. 26

4.5 Rasio C/N .................................................................................................... 27

KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................................... 29

5.1 Kesimpulan ................................................................................................. 29

5.2 Saran ............................................................................................................ 29

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 30

v

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Kandungan Lignoselulosa Pada Limbah Pertanian ................................ 4

Tabel 2. Jenis-Jenis Enzim Selulase...................................................................... 11

Tabel 3. Morfologi Koloni .................................................................................... 21

Tabel 4. Hasil Uji Penurunan Bobot Jerami Padi Setelah Inkubasi Selama

30 hari ..................................................................................................... 23

Tabel 5. Rasio C/N Dengan Variasi Inokulan ....................................................... 28

vi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Jerami Padi .......................................................................................... 3

Gambar 2. Struktur Selulosa ................................................................................. 5

Gambar 3. Mikrofibril Selulosa ............................................................................ 5

Gambar 4. Produk Nilai Tambah Dari Bahan Lignoselulosa ............................... 7

Gambar 5. Proses Pembuatan Bioetanol di IOGEN Corporation ......................... 9

Gambar 6. Skema Mekanisme Degadasi Selulosa Oleh Enzim Selulase ............. 12

Gambar 7. Penurunan Tinggi Penumpukan Jearmi Padi ...................................... 24

Gambar 8. Penurunan Kadar Selulosa Selama 30 Hari......................................... 25

Gambar 9. Penurunan Kadar Lignin Selama 30 Hari ........................................... 26

Gambar 10. Aktivitas Enzim Selulase Umur 30 Hari ........................................... 27

vii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Diagam Alir Penelitian ..................................................................... 34

Lampiran 2. Diagam Alir Pengenceran Bertingkat ............................................... 35

Lampiran 3. Diagam Alir Proses Metode Kuadran 4 goresan .............................. 36

Lampiran 4. Diagam Alir Proses Pembuatan NA miring ..................................... 37

Lampiran 5. Diagam Alir Hidrolisis Selulosa ....................................................... 38

Lampiran 6. Diagam Alir Proses Uji Aktivitas Enzim Selulase ........................... 39

Lampiran 7. Tabel Rasio HC ................................................................................ 40

Lampiran 8. Perhitungan Penurunan Bobot Jerami Padi ...................................... 41

Lampiran 9. Contoh Perhitungan Kadar Selulosa ................................................. 42

Lampiran 10. Contoh Perhitungan Kadar Lignin .................................................. 43

Lampiran 11. Contoh Perhitungan Aktivitas Enzim Selulase ............................... 44

Lampiran 12. Contoh Perhitungan Kadar C-organik ............................................ 45

Lampiran 13. Contoh Perhitungan Kadar N (Nitrogen) ....................................... 46

Lampiran 14. Hasil Analisis Rasio C/N Dekomposisi Jerami Padi ...................... 47

Lampiran 15. Gambar Hasil Penelitian ................................................................. 48

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi dalam bidang perkebunan

dan pertanian meningkatkan produk yang menyebabkan tingginya hasil limbah

seperti jerami padi. Jerami padi belum dinilai sebagai produk yang memiliki nilai

ekonomis. Pada sistem usaha tani yang intensif, jerami sering dianggap sebagai

sisa tanaman yang mengganggu pengolahan tanah dan penanaman padi. Oleh

karena itu, 75-80% petani membakar jerami di tempat. Tujuan utama petani

membakar jerami adalah untuk menyingkirkan jerami dari petakan sawah dengan

cara yang praktis. Perhitungan untung rugi atas tindakan pembakaran jerami

belum dipertimbangkan. Pembakaran jerami dapat meningkatkan suhu udara

dipermukaan tanah mencapai 700oC, sehingga dapat memusnahkan mikroba yang

berguna dalam proses biologis. Jerami padi memiliki komponen utama

lignoselulosa sehingga sukar didegadasi.

Lignoselulosa adalah bahan organik di alam yang berlimpah dan terdiri

dari tiga tipe polimer, yaitu selulosa, hemiselulosa dan lignin. Ketiganya

membentuk suatu ikatan kimia yang kompleks yang menjadi bahan dasar dinding

sel tumbuhan. Selulosa merupakan polimer linier dari D-glukosa yang terikat pada

ikatan 1,4 glikosidik dan sangat erat berasosiasi dengan hemiselulosa dan lignin.

Hemiselulosa merupakan salah satu penyusun dinding sel tumbuhan yang terdiri

dari kumpulan beberapa unit gula/heteropolisakarida dan dikelompokkan

berdasarkan residu gula utama sebagai penyusunnya seperti xilan, mannan,

galactan dan glucan (Fengel dan Wegener, 1995). Hemiselulosa mempunyai berat

molekul rendah dibandingkan dengan selulosa dan terdiri dari D-xilosa, D-

mannosa, D-galaktosa, D-glukosa, L-arabinosa, 4-0-metil glukoronat, D-

galakturonat dan asam D-glukoronat (Perez et al., 2002). Lignin merupakan

polimer aromatik yang berasosiasi dengan polisakarida pada dinding sel sekunder

tanaman. Pada umumnya, lignin mengandung tiga jenis alkohol aromatik yaitu

coniferyl, sinapyl dan p-coumaryl (Howard et al., 2003). .

2

Sejalan dengan perkembangan bioteknologi dan kekayaan Indonesia akan

sumber daya hayati, pemanfaatan mikroba dalam proses biokonversi limbah

lignoselulosa dapat dilakukan guna mendapatkan nilai tambah menjadi produk

lain seperti pupuk dan bioetanol. Proses hidrolisis selulosa dilakukan dengan

bantuan bakteri selulolitik secara enzimatik. Proses hidrolisis ini lebih disukai

karena ramah lingkungan walaupun laju hidrolisisnya rendah.

Tanah merupakan habitat yang didominasi oleh mikroorganisme seperti

bakteri, fungi, alga dan protozoa. Kualitas dan kuantitas mikroba tersebut

mempengaruhi kesuburan tanah karena beberapa mikroba berperan sebagai

dekomposer.

Penelitian mengenai potensi bakteri selulolitik sangat penting dilakukan,

karena mikroba penghasil enzim selulase menawarkan potensi yang besar di

bidang penanganan limbah selulosa.

1.2 Tujuan Penelitian

Memperoleh isolat bakteri selulolitik potensial untuk mempercepat proses

dekomposisi limbah lignoselulosa dari jerami padi.

1.3 Manfaat Penelitian

Mendapatkan isolat bakteri selulolitik yang potensial untuk produksi

dekomposer. Diharapkan dekomposer yang diperoleh dapat diaplikasikan untuk

hidrolisis selulosa menjadi glukosa dan etanol serta mempercepat pengomposan

jerami padi.

1.4 Hipotesis

Isolat bakteri selulolitik terpilih mampu mempercepat proses dekomposisi

jerami padi.

3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Perkembangan dalam bidang pertanian dan perkebunan di Indonesia

menimbulkan peningkatan residu tanaman. Residu tanaman ini sebagian besar

menghasilkan produk sampingan yang mengandung lignoselulosa. Produk

samping tanaman seperti jerami padi, serasah kacang tanah, serasah jagung dan

sabut kelapa sangat berperan sebagai sumber hara dan dijadikan sebagai bahan

organik dan berpotensi sebagai salah satu sumber energi melalui proses konversi,

baik proses fisika, kimia maupun biologis.

2.1 Jerami Padi

Jerami padi adalah bagian vegetatif dari tanaman padi (batang, daun,

tangkai malai), pada waktu tanaman padi dipanen, jerami adalah bagian tanaman

yang tidak diambil. Jerami merupakan golongan kayu lunak yang mempunyai

komponen utama lignoselulosa. Selulosa adalah serat polisakarida yang berwarna

putih yang merupakan hasil dari fotosintesis tumbuh - tumbuhan. Jumlah

kandungan selulosa dalam jerami antara 35 - 40 %.

Gambar 1. Jerami Padi

4

Tabel 1. Kandungan lignoselulosa pada limbah pertanian (Howard et al., 2003)

Bahan lignoselulosa Selulosa (%) Hemiselulosa (%) Lignin (%)

Tangkai kayu keras 40-55 24-40 18-25

Tangkai kayu lunak 45-55 25-35 25-35

Kertas 85-99 0 0-15

Jerami gandum 30 50 15

Jerami padi 32,1 24 18

Buangan sampah 60 20 20

Daun 15-20 80-85 0

Bagas segar 33,4 30 18,9

Rumput 25-40 25-50 10-30

2.2 Lignoselulosa

Lignoselulosa merupakan komponen utama tanaman yang

menggambarkan jumlah sumber bahan organik yang dapat diperbaharui.

Lignoselulosa terdiri dari selulosa, hemiselulosa, lignin dan beberapa bahan

ekstraktif lain. Semua komponen lignoselulosa terdapat pada dinding sel tanaman.

2.2.1 Selulosa

Selulosa adalah polisakarida yang mempunyai fungsi sebagai unsur

struktural pada dinding sel tumbuhan tingkat tinggi. Selulosa berbentuk serabut,

liat, tidak larut di dalam air, dan ditemukan terutama pada bagian berkayu pada

tumbuhan sekitar 40-45%. Selulosa merupakan bahan kimia organik yang

memiliki berat molekul tinggi dan polimer yang tidak bercabang yang terdiri dari

100-14.000 monosakarida atau lebih (Lehninger, 1982). Ikatan β(1→4) glikosida

yang berbentuk linier dan mempunyai kecenderungan kuat membentuk ikatan

hidrogen intra dan intermolekul (Lehninger, 1982).

5

Gambar 2. Struktur selulosa ( Lehninger, 1982).

Molekul selulosa tersusun dalam bentuk fibril. Pada kayu, fibril-fibril

membentuk struktur kristal dibungkus oleh lignin. Lignin berperan sebagai

pelindung selulosa dari serangan enzim pemecah selulosa (Judoamidjojo, 1989).

Kumpulan fibril disebut mikrofibril, sedangkan kumpulan mikrofibril membentuk

makrofibril. Bagian mikrofibril yang mengandung banyak ikatan hidrogen bersifat

sangat kuat, tidak dapat ditembus oleh air dan disebut bagian kristalin. Bagian

mikrofibril yang sedikit atau sama sekali tidak mengandung ikatan hidrogen

disebut bagian amorf (Tsao et al., 1978 dalam Judoamidjojo, 1989).

Gambar 3. Mikrofibril selulosa ( Tsao et al., 1978 dalam Judoamidjojo, 1989).

2.2.2 Hemiselulosa

Hemiselulosa adalah molekul bercabang yang hanya memiliki 150-200

monomer (Mulcahy, 1996). Hemiselulosa adalah polimer yang mirip dengan

selulosa. Backbone (rangka utama) dari hemiselulosa adalah terbentuk dari ikatan

β 1,4-D-pyranosyl dari unit penyususnnya.. Hemiselulosa mempunyai banyak

cabang, secara umum dapat dikatakan bahwa hemiseluloasa merupakan polimer

noncrystalline heteropolysaccharides. Komponen yang menyusun hemiselulosa

adalah gula pentosa ( D-xylose, L-arabinose ), gula heksosa ( D-galactose, L

6

galactose, D-mannose, Lrhamnose,\ L-fucose ) dan asam uronik (Lglucomonic

acid ) (Glazer dan Nikaido, 2007).

Hemiselulosa adalah polimer polisakarida yang komplek, komposisi dan

frekuensinya tergantung kepada jenis jaringan tanaman, jenis spesies dan tahapan

pertumbuhan pada tanaman. Hemiselulosa tidak hanya ditemukan berupa xylan,

namun juga ditemukan dalam jumlah yang banyak berupa glucomannans,

galactomannans, arabinogalactans dan senyawa yang lain (Mulcahy, 1996).

2.2.3 Lignin

Lignin merupakan fraksi non karbohidrat yang bersifat kompleks dan sulit

dikarakterisaasi. Pada dasarnya lignin merupakan polimer aromatik heterogen

dengan sistem jaringan yang bercabang serta tidak memiliki bentuk yang tetap

(Mc Donald dan Franklin, 1969 dalam Enny, 2008).

Pada saat dilakukan perlakuan dengan menggunakan suhu di atas 200°C,

maka lignin akan mengalami degadasi menjadi senyawa partikel dengan ukuran

yang kecil dan terlepasnya ikatan dengan selulosa (Tanahashi et al., 1983 dalam

Palonen, 2004).

Untuk mempermudah dalam mendegadasi lignin maka diperlukan

delignifikasi. Delignifikasi adalah suatu proses dalam menghilangkan lignin yang

dilakukan dengan menggunakan bahan kimia (Ahmed et al., 2001) sehingga

terputusnya ikatan ester dalam makro molekul lignin. Telah ditemukan

mikroorganisme yang dapat mendegadasi lignin dengan cepat dan telah disadari

bahwa menggunakan bahan kimia dalam proses penghilangan lignin akan

mengakibatkan limbah yang sangat berbahaya bagi lingkungan (Glazer dan

Nikaido, 2007).

Lignin tersusun oleh unit yang disebut dengan lignol, yang terdiri dari aryl

propanol yang tersusun pada senyawa aromatik dan tiga karbon rantai karbon.

Lignol secara struktural sangat berhubungan dengan asam amino phenylalanine

dan tyrosin.

7

2.3 Manfaat Dekomposisi Lignoselulosa

Gambar 4. Produk nilai tambah dari bahan lignoselulosa (Mtui, 2009)

2.3.1 Proses Pembuatan Pupuk Organik/ Kompos

Pupuk adalah zat atau unsur yang ditambahkan ke dalam tanah dengan

maksud untuk menyuburkan tanah. Secara umum pupuk terbagi atas pupuk

organik (pupuk kandang, pupuk kompos, pupuk hayati) dan pupuk anorganik

(pupuk kimia, bahan sintetis). Pupuk organik menjadi salah satu alternatif untuk

mengurangi penggunaan pupuk anorganik yang saat ini banyak digunakan petani.

Pupuk organik dapat menyediakan semua unsur hara yang dibutuhkan oleh

tanaman oleh karena itu bersifat multiguna. Pupuk yang bersifat ramah

lingkungan ini dapat memperbaiki sifat fisika, biologi dan kimia tanah serta dapat

meningkatkan kehidupan mikroba tanah yang merupakan sumber hara bagi

tanaman.

Beberapa jenis mikroba yang berperan dalam proses penyuburan tanah

antara lain mikroba pendegadasi selulosa, Azospirilum, Lactobacillus,

Acetobacter, mikroba pelarut fosfat, mikroba penambat nitrogen, mikroba

penghasil hormon pertumbuhan, mikroba penghasil metabolit sekunder dan

mikroba yang mampu melakukan biotransformasi logam berat sehingga dapat

menurunkan toksisitas pada lahan. Selain itu, jenis mikroba lain dari golongan

8

Actinomycetes juga berperan dalam proses pembuatan pupuk organik (Abdulla,

2007).

Bahan lignoselulosa sangat potensial untuk bahan dasar pembuatan pupuk

organik, disamping untuk bahan bakar, makanan ternak dan bahan pembuatan

kertas (Singhania, 2009). Penggunaan limbah selulosa untuk produksi pupuk

organik bertujuan untuk memberikan nitrogen dan berperan sebagai penggembur

tanah (Malik et al., 2001).

Kompos, adalah pupuk organik yang kaya nutrien dan bermanfaat sebagai

penyubur tanah. Prosesnya merupakan hasil perombakan senyawa komplek

menjadi senyawa sederhana dengan bantuan kombinasi mikroba yang terdiri dari

bakteri, kapang, aktinomisetes dan cacing yang dapat meningkatkan nilai limbah

lignoselulosa (Mtui, 2009). Pada proses pembuatannya, pH, suhu, struktur bahan

yang digunakan akan menentukan populasi mikroba. Kompos yang banyak

digunakan adalah kompos jerami padi.

Bahan lignoselulosa dapat digunakan sebagai sumber C bagi organisma

lignoselulolitik. Disamping unsur hara yang tersedia, organisma dapat

menghasilkan C sederhana dalam proses metabolisma yang dapat digunakan

sebagai bahan baku pupuk organik (Widiastuti et al., 2009). Kandungan hara

kompos jerami padi terdiri dari ratio C/N 18,88, C organik (%) 35,11, N (%) 1,86,

P2O5 (%) 0,21, K2O (%) 5,35, kadar air (%) 55. (Isroi, 2010). Pemanfaatan jerami

padi sebagai pupuk organik diantaranya memiliki kandungan C organik yang

tinggi, kandungan bahan organik tanah dapat dinaikkan dan kesuburan tanah dapat

dikembalikan dengan pemakaian kompos jerami padi secara konsisten.

Parameter standar mutu pupuk organik menurut Menteri Pertanian

No.06/Permentan/SR.130/2/2011, terdiri dari C organik, C/N ratio, bahan ikutan

(plastik, kaca, kerikil), kadar air, kadar logam berat (As, Hg, Pb, Cd), pH, kadar

total (N, P2O5, K2O), mikroba patogen (E. coli, Salmonella), mikroba fungsional,

ukuran butiran dan unsur mikro (Fe, Mn, Cu, Zn, B, Co, Mo). Persyaratan teknis

mutu pupuk organik meliputi ganula/pelet, cair/pasta dan remah/curah. C organik

dan C/N ratio merupakan parameter utama pupuk organik. C organik terdiri atas

ganula/ pelet baik yang murni maupun yang diperkaya mikroba sebesar > 12%,

cair/ pasta sebesar ≥ 4% dan remah/ curah baik yang murni maupun yang

9

diperkaya mikroba sebesar ≥ 12%. C/N ratio murni dan yang diperkaya mikroba

baik ganula/pelet maupun remah/curah masing masing sebesar 15-25%.

2.3.2 Proses Pembuatan Bioetanol Generasi Kedua

Gambar 5. Proses pembuatan bioetanol di IOGEN Corporation.

Iogen Corporation merupakan perusahaan yang berasal dari kanada yang

memproduksi bioetanol generasi kedua. Bahan yang digunakan untuk pembuatan

bioetanol adalah limbah lignoselulosa \ serat. sebelum tahap hidrolisis enzimatis,

dilakukan tahap pretrearment, yaitu meningkatkan luas permukaan dan

aksesbilitas dari serat tanaman untuk enzim dengan proses ledakan uap.

Tahap hidrolisis enzimatis merupakan tahap konversi tinggi selulosa

menjadi glukosa. Tahap separation merupakan tahap penggunaan lignin untuk

menghasilkan tenaga untuk menjalankan fasilitas dan C5 dan C6 gula sederhana

difermentasikan menjadi etanol. Hasil fermentasi etanol kira-kira menghasilkan

etanol 3% sehingga perlu didestilasi.

Etanol dari selulosa mengurangi gas rumah kaca dibandingkan dengan

bahan bakar fosil seperti bensin serta mengurangi ketergantungan bahan bakar

fosil.

Fibre

Pretreatment

Enzymatic

hidrolysis Separation

Fermentation

Distilation

Bioethanol G2

Power generation

Electricity

10

2.4 Mikroorganisme Pendegadasi Selulosa (Bakteri Selulolitik)

Bakteri selulolitik merupakan bakteri yang dapat mendegadasi selulosa.

Beberapa bakteri pendegadasi selulosa adalah bakteri mesofilik dan termofilik

aerobik (Cellumonas sp, celvibrio sp, Microbispora bispora, Thermomonospora

sp), bakteri mesofilik dan termofilik anaerobik (Acentivibrio cellulolyticus,

Bacteriodes cellulosolvent, Bacteriodes succinogenes, Ruminococcus albus,

Ruminococcus flavefaciens dan Clostridium termocellum). Bakteri pendegadasi

selulosa termofil dapat menghasilkan enzim selulase yang relatif stabil (tahan

pada kondisi asam atau basa dan pada suhu tinggi hingga 90°C) (Bhat dan Bhat,

1997).

Bakteri selulolitik sering diisolasi dari tanah yang mengandung seresah

daun. Hal ini disebabkan karena tanah mengandung bahan organik yang relatif

kaya dan terdapat seresah daun dengan kandungan polisakarida yang relatif

komplek. Kondisi tersebut menyebabkan tanah dan seresah daun menjadi habitat

yang baik untuk berbagai mikroorganisme (William dan Govind, 2003).

Pada penelitian yang dilakukan oleh Hatami et al., (2008) diketahui bahwa

jumlah bakteri yang berhasil diisolasi pada tanah hutan lebih banyak

dibandingkan dengan yang berhasil diisolasi pada lahan pertanian. Dari total

bakteri yang berhasil diisolasi juga diketahui bahwa jumlah total isolat bakteri

pendegadasi selulosa lebih banyak dibandingkan dengan yang diisolasi dari lahan

pertanian. Hal ini terjadi karena terdapat perbedaan material organik yang terdapat

pada hutan dan lahan pertanian. Hutan memiliki keanekaragaman material organik

yang lebih tinggi dibandingkan dengan lahan pertanian.

2.5 Enzim Selulase

Selulase adalah nama bagi semua enzim yang memutuskan ikatan

glikosidik beta-1,4 di dalam selulosa, selobiosa, dan turunan selulosa lainnya. Di

alam, enzim selulase ditemukan di berbagai ekosistem, terutama ditemukan pada

proses dekomposisi serasah daun, hingga keadaan anaerobik pada rumenansia

(Denman et al., 1996).

Sistem enzim selulosa sangat penting karena berperan dalam mengubah

selulosa menjadi gula sederhana. Enzim selulase merupakan system enzim yang

11

terdiri dari enzim Endoglukanase, Eksoglukanase, dan β- glukosidase (tabel 2).

Enzim selulase adalah enzim yang dapat mengkatalisis dan menghidrolisis ikatan

β 1-4 glukosidik pada selulosa (ikatan yang paling banyak di selulosa) (Bhat,

2000). Enzim endoglukanase (EC 3.2.1.4) terdiri dari satu jenis enzim yaitu 1,4-

D-glucan-4-glucanohydrolases (Bhat dan Bhat, 1997).

Endoglucanases atau yang sering disebut dengan CM-cellulases

(carboxymethylcellulose) atau Cx enzim, menghidrolisis secara acak ikatan pada

serat selulosa (Wood, 1985). Hal ini mengakibatkan rantai polisakarida yang telah

terpotong (oligosakarida) mempunyai panjang rantai yang berbeda-beda (Bhat,

2000). Hasil dari hidrolisis serat selulosa adalah glukosa, cellobiose, cellotriose,

dan oligosakarida yang lebih tinggi (Wood, 1985).

Cellobiohydrolyase yang sering disebut dengan eksoglukanase adalah

enzim pendegadasi selulosa yang ditemukan pada mayoritas fungi yang dapat

mendegadasi selulosa (Wood, 1985). eksoglukanase dapat menghidrolisis

mikrokristalline namun tidak dapat menghidrolisis carboxymethylcellulose (Kim

dan Kim, 1995). Enzim eksoglukanase (EC 3.2.1.91) terdiri dari 1,4- D-glucan

glucanohydrolases (lebih dikenal dengan cellodextrinases) dan 1,4-D-glucan

cellobiohydrolases (cellobiohydrolases). Enzim eksoglukanase adalah enzim yang

aktif pada sisi crystalline selulosa (Mattinen, 1998).

Tabel 2. Jenis-jenis enzim selulase (Bhat dan Bhat, 1997)

Jenis enzim Kode EC Sinonim Mekanisme reaksi

Endo-(1-4)-β-

Dselulase

EC

3.2.1.4

Endoselulase atau

endoglukanase

-G-G-G-G

↑ ↑

Memutuskan ikatan secara acak

Ekso-(1-4)-

β-Dselulase

EC

3.2.1.91

Selobiohidrolase atau

eksoselulase

G-G-G-G

↑

Melepaskan selobiosa baik yang reducing atau

nonreducing end

Ekso-(1-4)-

β-Dselulase

EC

3.2.1.74

Eksoglukanase

atau

glukohidrolase

G-G-G-G

↑

Melepaskan glukosa dari non-reducing end

β-glukosidase

EC

3.2.1.21

Selobiose G-G, G-G-G

↑ ↑

Melepaskan glukosa dari selobiosa atau rantai

cellooligosakarida pendek

12

β-glucoside glucohydrolases lebih dikenal sebagai β-glukosidase. β-

glukosidase adalah enzim yang digunakan untuk menghidrolisis cellobiose dan

pada beberapa kasus dapat menghidrolisis cello-oligosakarida menjadi glukosa.

Enzim endogluconases dan β- glukosidase dapat menghidrolisis selulosa menjadi

glukosa. β-glukosidase dibutuhkan untuk menghidrolisis inhibitor cellobiose

(Wood, 1985).

Laju hidrolisis enzim selulase ditentukan oleh struktur enzim dan struktur

substrat (Mandels, 1985), dimana struktur Kristal dari selulosa relatif lebih sulit

dihidrolisis dibandingkan dengan struktur amorf (Coughlan, 1985). Mekanisme

skematis kerja enzim selulase seperti pada Gambar 6.

Gambar 6. Skema mekanisme degadasi selulasa oleh enzim selulase (Beguin dan

Aubert, 1994)

2.6 Spektrofotometer

Spektrofotometer absorbansi adalah sebuah instrumen untuk mengukur

absorbs cahaya dalam panjang gelombang tertentu oleh suatu atom atau molekul.

13

Untuk daerah ultraviolet sampai cahaya tampak, nilai panjang gelombang berkisar

antara 160-780 nm. Kemampuan suatu senyawa mampu menyerap radiasi sinar

UV-VIS yaitu adanya spesi pengabsorbsi yang disebut dengan kromofor.

Kromofor merupakan gugus fungsional yang dapat menyerap radiasi UV-VIS.

Aplikasi dari spektrofotometri UV-VIS, yaitu analisis kuantitatif senyawa

organik dan anorganik, untuk analisis kualitatif tidak terlalu berguna karena

spektrum yang dihasilkan cenderung mempunyai pita yang melebar sehingga

informasi yang didapat sangat sedikit. Dalam analisis kuantitatif dilakukan pada

panjang gelombang maksimum yaitu panjang gelombang yang menberikan

absorbs terbesar (dapat ditentukan dari spektrum absorbsinya). Pada λmaks respon

sinyal (absorbans) berada dalam kondisi maksimum sehingga akan memiliki

sensitivitas yang baik dan limit deteksi yang rendah serta mereduksi kesalahan

dalam pengukuran (Skoog et al., 2004).

Instrumentasi spektrofotometer secara sederhana terdiri dari sumber

cahaya, monokromator, yang berfungsi sebagai penyeleksi cahaya dengan panjang

gelombang (energi) tertentu, kompartemen sampel, detektor, dan pengukur

intensitas cahaya (Skoog et al., 2004). Berikut penjelasan empat bagian penting

dari spektrofotometer, yaitu:

a. Sumber Cahaya

Sumber cahaya pada spektrofotometer haruslah memiliki pancaran radiasi

yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk

daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar

dengan kawat terbuat dari wolfarm (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola

lampu pijar dengan biasa dengan daerah panjang gelombang (λ) berkisar antara

350-2200 nm. Paling lazim adalah lampu tabung tidak bermuatan (discas)

hidrogen (atau deuterium) 175 ke 375 atau 400 nm. Lampu hidrogen atau lampu

deuterium digunakan untuk sumber pada daerah ultraviolet.

b. Monokromator

Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya

polikromatis menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu

(monokromatis) yang berbeda (terdispersi). Ada dua macam monokromator, yaitu

14

prisma dan gating (kisi difraksi). Cahaya monokromatis ini dapat dipilih panjang

gelombang tertentu yang sesuai untuk kemudian dilewatkan melalui celah sempit

yang disebut slit. Ketelitian dari monokromatis dipengaruhi juga oleh lebar celah

(slith width) yang dipakai.

c. Kuvet

Kuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat

contoh atau cuplikan yang akan dianalisis. Kuvet biasanya terbuat dari kwarsa,

kaca, plastik dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5

cm. Pada pengukuran di daerah ultraviolet dipakai kuvet kwarsa atau plexiglass,

sedangkan kuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV.

Semua macam kuvet dapat dipakai untuk pengukuran di daerah sinar tampak

(visible).

d. Detektor

Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya

pada berbagai panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi

sinyal listrik yang selanjutnya akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk

jarum penunjuk atau angka digital. Detektor yang biasa digunakan untuk

Spektrofotometer UV-VIS adalah detektor photo tube, Barrier Layer Cell, dan

Photo Multiplier Tube.

Spektrofotometer UV-VIS termasuk dalam spektroskopi absorbs. Prinsip

dasarnya ialah penyerapan (absorbs) gelombang elektromagnetik yang dilewatkan

pada sampel. Gelombang elektromagnetik yang digunakan pada daerah panjang

gelombang 160-780 nm. Absorbansi yang diperoleh dari sampel setelah diukur,

digunakan untuk membandingkan intensitas sinar yang dilalui menuju sampel (I)

dengan intensitas sinar sebelum dilewatkan ke sampel (I0). Transmitan diperoleh

dari rasio I/I0 dan absorban diperoleh dari nilai transmitan (Skoog et al., 2004).

Jenis spektrofotometer berdasarkan sistem optiknya terdapat 2 jenis, yaitu

spektrofotometer single beam (berkas tunggal) dan spektrofotometer double beam

(berkas ganda). Spektrofotometer single beam pada spektrofotometer ini hanya

terdapat satu berkas sinar yang dilewatkan melalui kuvet. Blanko, larutan standar,

dan contoh diperiksa secara bergantian.

15

BAB III

METODE KERJA

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikroba dan Bioproses, Balai

Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor Jawa Barat. Waktu

penelitian adalah dari bulan Mei 2012 sampai dengan Oktober 2012.

3.2 Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, oven,

refluks, desikator, penangas air, shaker incubator, vortex, neraca analitik digital,

ayakan 50 mesh, laminar, spektrofotometer UV-VIS, hotplate, perangkat destilasi

Markham, pH-meter, kertas saring, botol selai, cawan petri, mikropipet,

thermometer, loop inokulan, bunsen, indicator universal, kapas, alumunium foil,

kaca arloji, gelas piala 1 L, labu takar 100 mL, corong, batang pengaduk, spatula,

pipet tetes, buret, pipet volumetrik, erlenmeyer, kuvet, labu semprot dan tisu.

Peralatan dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini harus selalu

dalam keadaan steril. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah jerami

padi yang diperoleh dari sawah Dramaga dan tanah dari rhizosfer bambu Kota

Bogor. Bahan yang digunakan dalam isolasi bakteri pendegadasi selulosa

diantaranya Media Cellulose Congo Red Agar (CCRA), Media Nutrient Agar

(NA) dan Media Nutrient Broth (NB), H2SO4 pekat, NaOH, H3BO3, Na2B4O7,

K2Cr2O7, indikator Conway, indikator selenium, sedang bahan kimia untuk

analisis komponen kimiawi terdiri DNS (Dinitri Salicylic Acid), fenol, Kalium

Natrium Tartrat.

3.3 Isolasi Bakteri Pendegadasi Selulosa

Untuk mengisolasi bakteri pendegadasi selulosa digunakan medium

CCRA (Hendricks et al., 1995). Medium CCRA dibuat dengan dengan komposisi

16

K2HPO4 sebanyak 0,5 g, MgSO4 0,25 g, congo red 0,5 g, gelatin 2 g, CMC 1,88

g, 100 mL filtrat serbuk jerami padi dan 900 mL akuades steril. Bahan-bahan

tersebut dicampurkan kecuali agar dan gelatin. Keasaman medium adalah pH 7,0,

agar dan gelatin kemudian dilarutkan dalam medium dengan pemanasan

menggunakan hot plate. Medium kemudian diautoklaf selama 15 menit pada suhu

121°C dengan tekanan 1,5 atm, didinginkan lalu dituangkan ke cawan Petri steril

dan disimpan pada suhu 4°C. Pengenceran bertingkat dilakukan untuk

memudahkan isolasi dengan cara sebanyak 10 g sampel dimasukkan ke dalam

botol selai yang berisi 90 mL akuades steril lalu dimasukkan ke dalam shaker

inkubator dengan kecepatan 200 rpm selama 3 jam (pengenceran tingkat 10-1

).

Selanjutnya dilakukan pengenceran secara bertingkat hingga 10-9

.

Isolasi bakteri selulolitik dilakukan dengan cara meratakan 0,1 mL larutan

dari tingkat pengenceran 10-6

sampai 10-9

pada permukaan medium padat (CCRA)

spatula (Lampiran 2). Metode isolasi bakteri yang digunakan pada penelitian ini

adalah Spread Plate Methode. Koloni bakteri selulolitik yang tumbuh akan

menimbulkan zona bening di sekitarnya. Zona bening yang terbentuk

menunjukkan bahwa koloni bakteri tersebut menghasilkan enzim yang

mendegadasi selulosa yang ada disekitarnya.

3.4 Pemurnian Kultur

Setiap koloni terpisah yang memunculkan zona bening dimurnikan dengan

metode kuadran pada medium CCRA (Lampiran 3). Koloni bakteri yang

dimurnikan adalah koloni tunggal yang berada di ujung goresan kuadran. Dari

Isolat yang didapat diberi nama dan di kulturkan kembali pada medium CCRA

dan medium NA miring sebagai kultur stok (lampiran 4).

3.5 Uji Kapasitas Hidrolisis Selulosa

Uji kapasitas hidrolisis (HC) merupakan pengujian yang dilakukan untuk

mengetahui kemampuan isolat bakteri dalam laju degadasi selulosa di lingkungan

sekitarnya. rasio HC adalah rasio antara diameter zona bening dengan diameter

koloni yang menghasilkan zona bening (Lu et al., 2005). Medium CCRA padat

17

digunakan pada pengujian ini. Biakan dari isolat murni diambil dengan

menggunakan jarum ose kemudian disentuhkan bagian ujung jarum yang

mengandung biakan pada bagian tengah medium CCRA. Biakan diinkubasikan di

dalam inkubator pada suhu 37º C. Pengukuran zona bening dan diameter koloni

dilakukan setiap hari selama 5 hari. Maka akan terlihat laju degradasi dengan

persamaan reaksi A 𝒌 B. k = −

𝜹𝑨

𝜹𝒕 = +

𝜹𝑩

𝜹𝒕

3.6 Aktivitas Enzim Selulase

Aktivitas enzim selulase dihitung berdasarkan metode DNS (Dinitro

Salicylic Acid). Sampel tiap-tiap perlakuan yang dikomposkan diambil masing-

masing sebanyak 10 g dan ditambahkan 30 mL buffer phosphat kemudian

diblender sampai halus dan disaring. Filtat diambil lalu disentrifugasi dengan

kecepatan 10.000 rpm, kemudian larutan jernih (supernatan) diambil sebanyak 1

mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 1 mL substrat CMC

1% diinkubasi selama 30 menit pada suhu 500C. Larutan tersebut kemudian

ditambahkan dengan 3 mL pereaksi DNS, dikocok hingga homogen menggunakan

vortex, dan ditempatkan dalam air mendidih selama 15 menit, lalu ditambahkan 1

mL KNa-Tartrat 40% dinginkan sampai suhu ruang. Larutan yang telah

didinginkan tadi diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-VIS

pada panjang gelombang 570 nm. Untuk pengukuran blanko, supernatan sebanyak

1 mL ditambahkan dengan 1 mL buffer phosphat pH 7. Kurva standar dibuat

dengan menggunakan larutan glukosa standar dengan kisaran 100-500 mg/L.

Penghitungan aktivitas enzim selulase dilakukan dengan rumus berikut,

Aktivitas enzim unit/mL = Kadar glukosa x factor pengenceran

BM glukosa x waktu inkubasi

3.7 Hidrolisis Selulosa Jerami Padi

Jerami kering ditimbang sebanyak 1,5 kg, kemudian direndam dalam

ember selama 1 malam. Lalu ditiriskan selama 2 jam, kemudian dimasukkan ke

dalam keranjang plastik dan ditambahkan inokulan 5% yang berasal dari isolat

JP72, DDH92, dan kontrol, kemudian diaduk rata. Proses inkubasi dilakukan

18

selama 30 hari dan juga dicek kelembabannya agar tetap terjaga. Proses

pengomposan ini dapat dilihat pada lampiran 5.

3.8 Analisis Kadar Selulosa

Metode untuk mengukur kandungan selulosa dan lignin berdasarkan

metode Chesson yang dikemukakan oleh Datta (1981). Sebanyak satu g sampel

kering (berat a) ditambahkan 150 mL H2O atau alkoholbenzene dan direfluk pada

suhu 100°C dengan water bath selama 1 jam. Hasilnya disaring, residu dicuci

dengan air panas 300 mL. Residu kemudian dikeringkan dengan oven sampai

beratnya konstan dan kemudian ditimbang (berat b). Residu kemudian

ditambahkan 150 mL H2SO4 1 N, dan direfluk dengan water bath selama 1 jam

pada suhu 100°C. Hasilnya disaring dan dicuci sampai netral (300 mL) kemudian

residunya dikeringkan hingga beratnya konstan. Berat ditimbang (berat c). Residu

kering ditambahkan 100 mL H2SO4 72% dan direndam pada suhu kamar selama 4

jam kemudian ditambahkan 150 mL H2SO4 1 N dan direfluk pada suhu 100oC

dengan water bath selama 1 jam pada pendingin balik. Residu disaring dan dicuci

dengan H2O sampai netral (400 mL). Residu kemudian dipanaskan dengan oven

dengan suhu 105oC sampai beratnya konstant dan ditimbang (berat d).

Selanjutnya residu diabukan dan ditimbang (berat e). Perhitungan kadar selulosa

dan kadar lignin menggunakan rumus berikut ini:

Kadar selulosa = (c-d)/a x 100%

Kadar lignin = (d-e)/a x 100%

3.9 Preparasi Dan Analisis Rasio C/N Contoh

Contoh diambil dari jerami padi yang sudah diinkubasi dengan

pengambilan pada hari ke-30. Diambil beberapa bagian dari jerami padi lalu

dikeringkan. Setelah kering, contoh diblender dan diayak menggunakan saringan

berukuran 50 mesh, akan dihasilkan serbuk contoh. Serbuk ini kemudian

ditentukan kadar karbon (C) dan nitrogen (N).

19

3.9.1 Penetapan Kadar C-Organik

Kadar C-organik ditentukan dengan metode Walkley dan Black. Timbang

0,010-0,050 g contoh, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL.

tambahkan 5 mL K2Cr2O7 2N, lalu dikocok. Tambahkan 7 mL H2SO4 pekat,

dikocok lalu diamkan selama 30 menit. Encerkan, biarkan dingin dan ditepatkan.

Keesokan harinya diukur absorbansi larutan jernih dengan spektrofotometer pada

panjang gelombang 561 nm. Sebagai pembanding dibuat standar 0 dan 150 ppm

C, dengan memipet 0 dan 3 mL larutan standar 5.000 ppm C ke dalam labu ukur

100 mL dengan perlakuan yang sama dengan contoh. Kadar C dihitung dengan

persamaan berikut:

Kadar C-organik(%)= ppm kurva x mL ekstrak1.000 mL-1

x 100 contoh-1

x fk

= ppm kurva x 100 1.000-1

x 100 10-1

x fk

= ppm kurva x 10 10-1

x fk

Keterangan: Larutan standar : 12,510 g glukosa dalam 1L.

100 : faktor konversi ke %

Fk : faktor koreksi kadar air = 100/(100-%kadar air)

Reaksi :

2 K2Cr2O7 + 8 H2SO4 + 3 C → 2 Cr2(SO4)3 + 3 CO2 + 2 K2SO4 + 8 H2O

3.9.2 Penetapan Kadar N (Nitrogen)

Kadar N ditentukan dengan menggunakan metode kjeldahl. Sebanyak 0,2g

serbuk contoh ditimbang lalu dimasukkan ke labu kjehdahl 100 mL, ditambahkan

serbuk selenium sebanyak 1 g sebagai katalis dan 5 mL H2SO4 pekat, kemudian

didestruksi hingga didapatkan larutan jernih. Hasil destruksi dimasukkan ke alat

destilasi Markham, dibilas dengan air, ditambah 30 mL NaOH 30% kemudian

didestilasi. Hasil destilasi ditampung dengan 20 mL asam borat (H3BO3) 1% dan

empat tetes indikator Conway (merah). Setelah destilat berwarna hijau kemudian

destilasi dilanjutkan selama 10 menit. Destilat kemudian dititar dengan H2SO4

0,05 N hingga didapat titik akhir titrasi, larutan berwarna merah muda. Kadar

Nitrogen dihitung dengan persamaan:

Kadar N = 𝑽𝒄−𝑽𝒃 𝒙 𝑵 𝑯𝟐𝑺𝑶𝟒 𝒙 𝟏𝟒,𝟎𝟎𝟖

𝒎𝒈 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒐𝒉 x 100 %

20

Keterangan: Vc : Titran H2SO4 0,05N contoh (mL)

Vb: Titran H2SO4 0,05N blanko (mL)

Standarisasi H2SO4

Sebanyak 10 mL dinatriun tetraborat (Na2B4O7) 0,05 N dimasukkan ke

dalam Erlenmeyer 250 mL, ditambahkan dua tetes indikator merah metil (larutan

menjadi berwarna kuning), kemudian dititar dengan H2SO4 yang akan

distandarisasi hingga didapat titik akhir merah muda.

Reaksi yang terjadi :

N-organik + H2SO4 pekat → CO2+H2O+(NH4)2SO4(N-anorganik) (Destruksi)

(NH4)2SO4 + 2 NaOH → Na2SO4 + 2 NH3 + 2 H2O (Destilasi)

NH3 + H3BO3 + Conway → NH4H2BO3 (hijau) (Destilasi)

NH4H2BO3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 + H3BO4 (Titrasi)

21

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi Bakteri

Pada penelitian ini berhasil diisolasi 4 isolat bakteri yang berpotensi

sebagai bakteri pendegadasi selulosa yang berasal dari jerami padi di daerah

sawah Dramaga dan 1 isolat yang berasal dari rhizosfer tanah bambu di daerah

kota Bogor. Keempat isolat yang berasal dari jerami padi diberi kode dengan

nama JP71, JP72. JP91, dan JP92. Huruf JP pada kode isolat adalah kependekan

dari jerami padi dan satu isolat yang berasal dari rhizosfer tanah bambu diberi

kode dengan nama DDH92. Tabel 3 menunjukkan karakter koloni tersebut.

Karakter isolat DDH92 berbeda dengan keempat isolat yang berasal dari

jerami padi. Koloni dari isolat DDH92 menunjukkan adanya miselium. Koloni

Actinomycetes muncul perlahan ,menunjukkan konsistensi berbubuk dan melekat

erat pada permukaan media. Pengamatan di bawah mikroskop menunjukkan

adanya miselium ramping bersel satu yang bercabang membentuk spora aseksual

untuk perkembangbiakannya (Nonomura dan Ohara, 1971). Rentang pH yang

paling cocok untuk perkembangbiakan Actinomycetes adalah antara 6,5-8,0.

Tanah yang tergenang air tidak cocok untuk pertumbuhan Actinomycetes,

sedangkan tanah gurun yang kering atau setengah kering dapat mempertahankan

populasi dalam jumlah cukup besar, karena adanya spora (Nonomura dan Ohara,

1971).

Table 3. Morfologi koloni bakteri

No Kode Isolat Bentuk Pinggiran Warna miselium

1 JP71 Bulat Utuh Merah -

2 JP72 Bulat Utuh Merah -

3 JP91 Bulat Utuh Merah -

4 JP92 Bulat Utuh Merah -

5 DDH92 Bulat Utuh Merah +

22

4.2 Uji Degadasi Semi Kuantitatif

Uji degadasi adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui seberapa besar

kemampuan isolat bakteri untuk mendegadasi selulosa. Uji HC dilakukan dengan

menggunakan medium padat Congo Red Agar (CCRA) yang mengandung 2

macam material selulotik yaitu Carboxymethylcellulose (CMC) dan filtrat dari

serbuk jerami padi. Ratio HC menunjukkan kemampuan isolat bakteri yang

diperoleh dalam mendegadasi selulosa yang diindikasikan dengan terbentuknya

zona bening. Ratio HC adalah perbandingan antara diameter zona bening dengan

diameter koloni. (Sudiana et al., 2002).

Uji degadasi dengan menggunakan metode zona bening adalah uji semi

karena data hanya berupa perbandingan antara diameter zona bening dan dengan

diameter koloni. Kesulitan metode ini adalah apabila bentuk koloni atau zona

bening yang dihasilkan tidak benar-benar berbentuk bulat, atau bahkan tidak bulat

sama sekali. Zona bening yang terbentuk terkait dengan kelarutan dari enzim

selulase. Semakin tinggi tingkat kelarutan suatu enzim maka akan semakin besar

zona bening yang terbentuk. Diameter zona bening umumnya berukuran lebih

besar dibandingkan dengan diameter koloni, karena enzim selulase disekresikan

ke lingkungan sekitarnya oleh bakteri pendegadasi selulosa. Bakteri tidak dapat

memasukkan molekul selulosa, karena ukuran selulosa lebih besar daripada

ukuran sel bakteri. ( Zverlova et al., 2003)

Luas zona bening tergantung pada konsentrasi CMC dan agar yang

digunakan. Semakin banyak CMC dan agar yang digunakan semakin tinggi

kepadatan medium. Semakin tinggi konsentrasi agar, semakin kecil pori medium

sehingga enzim selulase yang disekresikan lebih sulit melewati pori tersebut dan

mengakibatkan terhambatnya proses degadasi. Demikian pula sebaliknya. Namun

penggunaan agar pada medium yang digunakan juga tidak boleh terlalu sedikit,

penggunaan agar dibawah 0,8% menyulitkan proses isolasi bakteri (Hankin and

Anagnostakis, 1997), medium menjadi terlalu lunak sehingga sulit untuk isolasi

dan inokulasi. Pada awal penelitian ini agar yang semula digunakan adalah 0,5 %,

namun karena medium yang dihasilkan terlalu lunak maka agar ditingkatkan

menjadi 1,5%.

23

Berdasarkan ratio HC pada hari ke-5 masa inkubasi, isolat JP 72 adalah

yang mempunyai kemampuan tertinggi dalam mendegadasi CMC dan filtrat

serbuk jerami padi sebesar 6,67 yang kemudian diikuti oleh isolat JP71 sebesar

4,5, JP91 sebesar 4,5, JP92 sebesar 3,09 dan DDH92 sebesar 1,25 (Lampiran 7).

Sedangkan untuk isolat DDH92 ratio HC lebih kecil dibandingkan isolat yang

lain, akan tetapi zona beningnya dapat terlihat dengan jelas. Hal ini disebabkan

oleh pembentukan koloni yang perlahan.

4.3 Analisis Kompos Jerami Padi

Analisis kompos jerami padi dilakukan untuk menentukan penurunan rata-

rata bobot, tinggi tumpukan, kadar selulosa, dan kadar lignin dari jerami padi.

Hidrolisis selulosa jerami padi menggunakan 2 isolat saja yaitu isolat JP72 yang

berasal dari jerami padi dan isolat DDH92 yang berasal dari rhizosfer tanah

bambu, dilihat dari rasio HC terbesar dan perbedaan sampel. Proses inkubasi

selama 30 hari dilakukan secara non steril karena pengaplikasian ini secara

aerobik dan prosesnya lebih mudah dibandingkan jika harus steril. Sehingga

menggunakan kontrol sebagai pembanding isolat yang diinkubasikan dan kontrol

juga mengalami penurunan dalam analisis karena masih terdapat mikroba alami

pada jerami padi.

4.3.1 Bobot Jerami Padi

Analisis hasil inkubasi jerami padi selama 30 hari, didapatkan bahwa

isolat DDH92 lebih banyak menurunkan bobot jerami padi sebesar 26,67%. Isolat

JP72 sebesar 20% dan kontrol sebesar 13,33%. Hal ini membuktikan bahwa

semakin menurun bobot jerami padi yang diinkubasi maka semakin menurun

kadar C-0rganik pada jerami padi, maka isolat DDH92 lebih baik dalam

mendegadasi jerami padi.

Tabel 4. Hasil uji penurunan bobot jerami padi setelah inkubasi selama 30 hari

No Kode Isolat Rata-rata penurunan berat kering (%)

1 JP72 20,00

2 DDH92 26,67

3 Kontrol 13,33

24

4.3.2 Tinggi Tumpukan Jerami Padi

Proses inkubasi jerami padi menggunakan keranjang yang berukuran

panjang 37 cm, lebar 32,5 cm dan tinggi 18,5 cm. Proses inkubasi ini akan

menurunkan tinggi dari jerami padi karena glukosa yang terbentuk sebagian akan

dijadikan sebagai sumber makanan bakteri. Glukosa diubah menjadi CO2 dan H2O

yang nantinya CO2 akan terbang ke udara karena bersifat gas. Pada penelitian ini,

isolat DDH92 mampu menurunkan tinggi menjadi 6 cm, isolat JP72 menjadi 7cm

dan kontrol menjadi 8 cm.

Gambar 7. Penurunan tinggi Tumpukan jerami padi

4.3.3 Kadar Selulosa

Jerami padi adalah limbah selulosa yang merupakan unsur pokok pada

tanaman dan merupakan komponen yang dihidrolisis menjadi glukosa sehingga

perlu untuk mengetahui penurunan kadar selulosa selama inkubasi. Penurunan

kadar selulosa setelah inkubasi selama 30 hari secara non steril tertinggi adalah

pengomposan oleh isolat DDH92 menjadi 8,047%. Sedangkan isolat JP72 selama

30 hari menjadi 10,704% dan kontrol mengalami penurunan menjadi 11,119%.

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30

Tin

ggi t

um

pu

kan

(cm

)

Waktu Inkubasi (hari)

Kontrol

JP72

DDH92

25

Hal ini membuktikan bahwa isolat DDH92 mampu menghidrolisis jerami padi

lebih cepat dibandingkan dengan isolat JP72.

Gambar 8. Penurunan kadar selulosa selama 30hari.

4.3.4 Kadar Lignin

Fungsi utama lignin adalah memperkuat struktur tanaman dalam menahan

terhadap serangan mikroba dan tekanan oksidasi (Hendriks dan Zeeman, 2009).

Sehingga perlu adanya penghilangan lignin agar dalam mendegadasi selulosa

tidak terhalangi oleh senyawa ini. Pada penelitian ini. Isolat DDH92 mampu

menurunkan kadar lignin menjadi 7,56% yang semula kadarnya adalah 14,4%.

Hal ini menunjukkan bahwa isolat DDH92 mampu mendegadasi lignin sebesar

47,5%.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 5 10 15 20 25 30

Kad

ar S

elu

losa

(%

)

Waktu Inkubasi (hari)

Kontrol

JP72

DDH92

26

Gambar 9. Penurunan kadar lignin selama 30 hari.

4.4 Aktivitas enzim selulase umur 30 hari

Aktivitas enzim didefinisikan sebagai kecepatan pengurangan substrat atau

kecepatan pembentukan produk pada kondisi optimum. Satu unit aktivitas enzim

selulase didefinisikan sebagai jumalah enzim yang menghasilkan satu mikromol

gula reduksi (glukosa) setiap menit (Lehninger, 1982).

Penelitian ini aktivitas enzim selulase pada isolat DDH92 cukup besar

yaitu sebesar 50,675x10-3

U/mL sedangkan isolat JP72 sebesar 26,9x10-3

U/mL.

Pada uji rasio HC, isolat JP72 lebih besar dibandingkan dengan isolat DDH92

yaitu 6,67:1,25. Tetapi pembentukan zona bening pada isolat JP72 tidak terlalu

jelas seperti isolat DDH92. Hal ini membuktikan bahwa enzim selulase dari isolat

DDH72 mampu mendegadasi substrat dalam bentuk amorf dan kristalin. Sehingga

aktivitas enzim dari isolat DDH92 lebih besar dibandingkan dengan isolat JP72.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 5 10 15 20 25 30

Kad

ar L

ign

in (

%)

Waktu Inkubasi (hari)

Kontrol

JP72

DDH92

27

Gambar 10. Aktivitas enzim selulase umur 30 hari.

Pada penelitian yang dilakukan oleh LIPI, menyatakan bahwa isolat

Actynonomycetes dari genus streptomyces yang berasal dari Taman Nasional

Bukit Duabelas Jambi memiliki aktivitas selulase sebesar 13,4 x 10-3

U/mL. Isolat

DDH92 sangat potensial untuk bahan dekomposer karena laju hidrolisisnya

sangat berpotensi untuk mendekomposisi jerami padi.

4.5 Rasio C/N

Kompos adalah pupuk organik yang kaya nutrien dan bermanfaat sebagai

penyubur tanah. Prosesnya merupakan hasil perombakan senyawa komplek

menjadi senyawa sederhana dengan bantuan kombinasi mikroba yang terdiri dari

bakteri, kapang, Actinomycetes dan cacing yang dapat meningkatkan nilai limbah

lignoselulosa (Mtui, 2009).

Dalam permentan No.06/Permentan/SR.130/2/2011, tentang pupuk

organik pembenah tanh, dikemukakan bahwa rasio C/N dari bahan organik <20.

Definisi tersebut menunjukkan bahwa pupuk organik lebih ditujukan kepada

kandungan C-organik, nilai C-organik itulah yang menjadi pembeda pupuk

organik dengan pupuk anorganik.

Dalam penelitian, isolat DDH92 mampu menurunkan rasio C/N menjadi

19,38 selama 30 hari. Hal ini membuktikan bahwa isolat DDH92 dapat dijadikan

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

Kontrol JP72 DDH92

Laju

Hid

rolis

i (U

nit

/mL)

Kode Isolat

28

sebagai bahan dekomposer karena mampu menurukan rasio C/N di bawah 20

sesuai dengan peraturan pemerintah.

Tabel 5. Rasio C/N jerami padi yang diberi decomposer selama 30 hari inkubasi

nonsteril.

Kode Isolat Kadar C (%) Kadar N (%) Rasio C/N

Kontrol 86,938 1,682 51,687

JP72 59,479 1,647 36.113

DDH92 33,258 1,716 19,381

Dari data tabel diketahui bahwa rasio C/n dari Kontrol dan isolate JP72 masih di

atas 20, padahal kadar selulosa dari ketiga perlakuan ini hamper sama.

Dikarenakan mikroba pada Kontrol dan JP72 baru memotong ikatan hingga ke

tahap oligosakarida dan disakarida belum mencapai glukosa yang nantinya

dijadikan sumber makanan bagi mikroba yang akan menghasilkan CO2 yang akan

terbang ke udara, sehingga kadar C-organik dalam kontrol dan JP72 masih tinggi.

29

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Isolat DDH92 yang merupakan golongan dari Actinomycetes berpotensi

sebagai agensia dekomposer jerami padi. Isolat ini memiliki aktivitas enzim

selulase yang tinggi, yaitu sebesar 50,675x10-3

U/mL, sehingga baik untuk proses

hidrolisis enzimatis lignoselulosa menjadi glukosa sebagai bahan baku fermentasi

bioetanol.

Nilai tambah dari isolat DDH72 adalah untuk pengomposan jerami padi

karena mampu menurunkan rasio C/N menjadi sebesar 19,38 selama 30 hari

sesuai dengan standar kriteria kompos yang bagus yaitu rasio C/N 20. Kompos

jerami padi yang dihasilkan bertekstur lunak dan berwarna kehitaman mirip

humus.

5.2 Saran

Penelitian selanjutnya disarankan untuk mengidentifikasi spesies mikroba

selulolitik pada penelitian ini. Aplikasi isolat mikroba ini pada media CCRA

hendaknya dilakukan optimasi pertumbuhan mikroba lebih dahulu. Pengomposan

limbah lignoselulosa tidak hanya untuk jerami padi tapi diharapkan untuk bahan

lignoselulosa lain yang memiliki kadar C-organik yang tinggi.

30

DAFTAR PUSTAKA

Abdulla, H.M. 2007. Enhancement of rice straw composting by lignocellulolytic

actinomycete strains. Int. J. of Agiculture & Biology. Vol. 9(1), 106-109.

Ahmed, Z., H. Banu, M.M, Rahman, F. Akhter & M.S. Haque. 2001. Microbial

activity on the degradation of lignocellulosic polysaccharides. Journal of

biological sciences. 1(10):993- 997.

Beguin, P. & J.P. Aubert. 1994. The Biological degradation of cellulose. FEMS

Microbiology Reviews, 13: 25-58.

Bhat, M.K. & S. Bhat. 1997. Cellulose degrading enzymes and their potensial

industrial applications. Biotechnology Advances, 15: 583.

Bhat, M. K. 2000. Cellulose and releted enzymes ln biotechnology. Biotecnology

Advanteces, 18: 355-358.

Coughlan, M. P. 1985. The properties of fungal and bacterial cellulases with

comment on their production and application. Biotechnology Genetic

Engineering. Review, 3: 39-109.

Datta, A., A. Betterman, & T.K. Kirk. 1981. Identification of spesific manganese

peroxidase among lignolitic enzym secreted by Phanerochaete

chrysosporium during wood decay, Appl. Environ. Microbiol. 57 : 1453 –

1460.

Denman, S., G. Xue, & B. Patel. 1996. Characterisation of Neocallomastix

patriciarum cellulose cDNA (CelA) homologus to Tricoderma reesei

cellobiohydrolase II. Applied. Environ. Microbiol, 62:1889- 1896.

Enny, H.L. 2008. Optimasi proses hidrolisis kimiawi dan enzimatis tandan kosong

kelapa sawit menjadi glukosa untuk produksi etanol. Thesis. PAU

Bioteknologi IPB, Bogor.

Fengel, D., & G. Wegener. 1995. Kayu : Kimia, Ultrastruktur, Reaksi-reaksi.

Diterjemahkan oleh Hardjono Sastrohamidjoyo. Cetakan I, Gajah Mada

University Press, Yogyakarta. Hal. 124-154.

Glazer, A. N., & H. Nikaido. 2007. Microbial biotechnology: Fundamentals of

Applied Microbiology, second edition. Cambridge : USA

31

Hankin, L., & S.L. Anagnostakis. 1997. Solid media containing

carboxymethylcellulose to detect Cx cellulase activity of microorganisms.

Journal of General Microbiology. 98:109- 115.

Hatami, S., H.A. Alikhani, H. Besharati, N. Salehrastin, M. Afrousheh, & Y.Z.

Jahromi. 2008. Investigation on aerobic cellulolytic bacteria in some of

north forest and farming soils. American-Eurasian J. Agic. & Environ. Sci.

3 (5): 713-716.

Hendricks, C.W., J.D. Doyle & B. Hugley. 1995. A new solid media for

enumerating cellulose-utilizing Bacteria in soil. Environmental Research

Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency,1 and Mantech

Environmental Technology, inc.,2 corvallis: Oregon.

Hendriks, A.T.W.M., & G. Zeeman. 2009. Pretreatments to enhance the

digestibility of lignocellulose biomass. Biores Technol. 100, 10-18.

Howard R.L., E. Abotsi, E.L.J. van Rensburg & S. Howard. 2003. Lignocellulose

biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. African J.

Biotechnol. 2(12):602-619.

Isroi. 2010. Pemanfaatan jerami padi sebagai pupuk organik in situ untuk

mengurangi penggunaan pupuk kimia dan subsidi pupuk.

http://isroi.wordpress.com/2010/02/12/4905/.

Judoamidjojo R.M Said EG & L. Hartoto. 1989. Biokonversi. PAU Bioteknologi

IPB, Bogor.

Kim, C. H., & D. S. Kim. 1995. Purification and specificity of a specific endo-β-

D-glucanase (Avicelase II) resembling exocellobiohydrolase from Bacillus

circulans. Enzyme and Microbial Technology, 17: 248-254.

Lehninger, A. L. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga.

Lu, W.J., H. Wang, S. Yang, Z. Wang, & Y. Nie. 2005. Isolation and

characterization of mesophilic cellulose-degading bacteria from flower

stalks- vegetable waste co-composting system. J.Gen.Appl.Microbiol. 51:

353- 360.

Malik, F.R., S. Ahmed, & Y.M. Rizki. 2001. Utilization of lignocellulosic waste

for the preparation of nitrogenous biofertilizer. Pakistan J. Biological

Sciences 4(10), 1217-1220.

32

Mandels, M. 1985. Aplication of cellulases. Biochem Society Trans., 13:414-16..

Mattinen, M.L. 1998. Structural and functional studies of fungal cellulose binding

domain by NMR spectroscopy. Academic Dissertation. University of

Helsinki, Finland.

Mtui, Y.S. 2009. Recent advances in pretreatment of lignocellulosic wastes and

production of value added products. African J. of Biotechnology Vol. 8(8),

1398-1415.

Mulcahy. 1996. An investigation of cellulose Binding Domain in non-celululose

binding domains in non-cellulolytic enzymes. Final Year Project University

of Limerick.

Nonomura, H., & Y. Ohara. 1971. Distribution of soil actinomycetes. VIII. Geen

spore Goup of Microtetraspora, Its Preferential Isolation and Taxonomic

Characteristics. 49: 1-7.

Palonen, H. 2004. Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocelluloses.

Disertation. University of Technology.Helsinki Finland.

Perez, J., J.M. Dorado, T. Rubia, & J. Martinez. 2002. Biodegadation and

biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: an overview.

Int. Microbiol. 5, 53-63.

Singhania. 2009. Cellulolytic enzymes. Biotechnology for Ago-Industrial

Residues Utilization. Chapter 20, 371-381.

Skoog D.A., D.M. West, F.J. Holler, & S.R. Crouch. 2004. Fundamentals of

Analytical Chemistry 8th

Ed. UK : Thomson Brooks.

Sudiana, I. M., A. Kanti, M. Rahmansyah, S. Widawati, Suliasih, R. W. Rahayu &

H. Imanuddin. 2002. Populasi dan karakterisasi bakteri selulotik yang

diisolasi berbegai ketinggian lokasi di taman nasional gunung Halimun.

Laporan Teknik Proyek Inventarisasi dan Karakterisasi Sumberdaya

Hayati, Puslit biologi-LIPI, Indonesia.

Widyastuti, H., Siswanto, & Suharyanto. 2007. Optimasi pertumbuhan dan

aktivitas enzim lignolitik Omphalina sp dan Pleurotus ostreatus pada

fermentasi padat. Menara Perkebunan, 75(2): 93-105.

William, R. & N.S. Govind. 2003. Identification of carbohydrate degading

bacteria in sub-tropical regions. Rev. Biol. Trop., 51, Supl. 4: 205-210.

33

Wood, T. M. 1985. Properties of cellulolytic enzyme systems. Biochem Society

Trans, 13: 407-10.

Zverlova, V. V., W. Holl, & H. Schwarz. 2003. Enzymes for digestion of

cellulose and other polysaccharides in the gut of longhorn beetle larvae,

Rhagium inquisitor L. (Col., Cerambycidae). International Biodeterioration

& Biodegadation. 51:175–179.

34

Lampiran 1. Diagam Alir Penelitian

Kapasitas Hidrolisis (Diukur

setiap hari selama 5 hari)

Sampel Tanah dan jerami

Isolasi

Pemurnian

Metode CCRA Kualitatif

Metode Kuadran

NA /CCRA (agar miring) penyimpanan

n

Aktivitas Enzim Selulase

Metode DNS

Hidrolisis selulosa

Selama 30 hari

Metode Kuadran

NA /CCRA (agar miring)

Rasio C/N

Hari ke-30

Uji Kadar Selulosa

Metode Chesson

35

Lampiran 2. Diagam Alir Pengenceran Bertingkat

1000 mL

Buffer Salin 0,85 %

90

90 mL x 1 buah

9 mL x 1 buah

99 mL x 4 buah

Autoclaf

1210C 15

menit 1,5 atm

+ sampel 10 gr

Shaker

inkubator

3 jam

90

99

99

ml

ml 99

99

9

ml

1 mL

1 mL

1 mL 1 mL

1 mL

0,1 mL

36

Lampiran 3. Diagam Alir Proses Metode Kuadran 4 Goresan

Diambil 1 Ose

Digoreskan berurutan dimulai

dari I sampai IV

Dengan diputar setiap goresan.

Pengerjaan dilakukan secara

aseptis dan loop inokulan

dibakar setiap mulai menggores.

Koloni yang terpisah diujung

goresan disebut kultur murni.

IV I

III II

37

Lampiran 4. Diagam Alir Proses Pembuatan Na Miring

Dihomogenkan

1000 mL

aquadest +

nutrient agar 15

gr/L

Dimasukkan 5 mL Na ke

dalam tabung ulir

Disterilkan

Dimiringkan

38

Lampiran 5. Diagam Alir Hidrolisis Selulosa

Jerami 1,5 kg dianalisis

kadar selulosa

Dicacah Direndam selama

1 malam

Ditiriskan selama

2 jam

Disimpan dalam keranjang

plastik A, B, C

Dicampurkan

inokulan 5% dan

diaduk rata

Diinkubasi selama

30 hari

Dijaga kelembabannya

dengan disemprotkan

dengan air

A → Air Steril

B → Jerami

C → Bambu

39

Lampiran 6. Diagam Alir Proses Uji Aktivitas Enzim Selulase

Pengambilan enzim → 10 g sampel yang dikomposkan + 30 mL buffer phosphate

pH 7,0 diblender dan sentrifugasi 10.000rpm, supernatan di ambil.

Sample blanko baku glukosa

1mL supernatan 1mL supernatan 1mL A + 1mL B

+ 1mL substrat + 1mL A

+ 3 mL larutan C + 3 mL larutan C

+ 1 mL larutan D + 1 mL larutan D

Ukur ABS λ= 570 nm Ukur ABS λ= 570 nm

Ket :

Larutan A : Larutan buffer phosphat

1,779 gr Na2HPO4 dilarutkan dalam 100 ml H2O

Larutan B : Larutan stok glukosa 0,1 M (dalam larutan A)

Larutan C : Larutan DNS 1% → DNS 10 gr, fenol 2 gr, NaSO4 0,5 gr, NaOH

10 gr dalam 1 L H2O

Larutan D : K Na tartrat 40%

Larutan Substrat : CMC 1% ( 1 gr dalam 100 mL larutan A)

Inkubasi 30menit 500C

Dididihkan 5-15 menit

Didinginkan

40

Lampiran 7. Tabel Rasio HC

Kode

Isolat

JP71 JP72 JP91 JP92 DDH92

Waktu

(Hari)

DZB

(cm)

DK

(cm)

HC DZB

(cm)

DK

(cm)

HC DZB

(cm)

DK

(cm)

HC DZB

(cm)

DK

(cm)

HC DZB

(cm)

DK

(cm)

HC

1 2,7 1 2,7 2,0 0,5 4,0 2,5 0,9 2,8 1,0 0,5 2,0 0,10 0,05 2,00

2 4,0 1 4,0 3,0 0,5 6,0 3,2 0,9 3,5 2,0 0,5 4,0 0,15 0,05 3,00

3 4,2 1 4,2 3,5 0,6 5,8 4,0 0,9 4,4 2,7 0,7 3,8 0,20 0,10 2,00

4 4,4 1 4,4 3,8 0,6 6,3 4,1 0,9 4,5 3,0 0,9 3,3 0,30 0,20 1,50

5 4,5 1 4,5 4,0 0,6 6,6 4,5 1,0 4,5 3,4 1,1 3,1 0,50 0,40 1,25

Keterangan : DZB = Diameter Zona bening

DK = Diameter Koloni

HC = Hidrolysis Capacity

41

Lampiran 8. Perhitungan Penurunan Bobot Jerami Padi

% penurunan bobot kontrol = 𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐰𝐚𝐥 – 𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐤𝐡𝐢𝐫

𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒂𝒘𝒂𝒍 x 100%

% penurunan bobot kontrol = 𝟏,𝟓 𝐤𝐠 − 𝟏,𝟑 𝐤𝐠

𝟏,𝟓 𝒌𝒈 x 100%

% penurunan bobot kontrol = 13,33 %

% penurunan bobot JP72 = 𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐰𝐚𝐥 – 𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐤𝐡𝐢𝐫

𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒂𝒘𝒂𝒍 x 100%

% penurunan bobot JP72 = 𝟏,𝟓 𝐤𝐠−𝟏,𝟐 𝐤𝐠

𝟏,𝟓 𝒌𝒈 x 100%

% penurunan bobot JP72 = 20 %

% penurunan bobot DDH92 = 𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐰𝐚𝐥 – 𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐤𝐡𝐢𝐫

𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒂𝒘𝒂𝒍 x 100%

% penurunan bobot DDH92 = 𝟏,𝟓 𝐤𝐠−𝟏,𝟏 𝐤𝐠

𝟏,𝟓 𝒌𝒈 x 100%

% penurunan bobot DDH92 = 26,67 %

42

Lampiran 9. Contoh Perhitungan Kadar Selulosa

Kadar a = 1,000 g

Kadar b = 0,736 g

Kadar c = 0,711 g

Kadar d = 0,299 g

Kadar e = 0,137 g

% selulosa = 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒄−𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒅

𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒂 x 100 %

% selulosa = 𝟎,𝟕𝟏𝟏 –𝟎,𝟐𝟗𝟗

𝟏,𝟎𝟎𝟎 x 100 %

% selulosa = 𝟒𝟏, 𝟐 %

Hari ke- Kadar Selulosa Kontrol

(%)

Kadar Selulosa

JP72 (%)

Kadar Selulosa

DDH92 (%)

0 39,400 39,400 39,400

10 34,340 32,213 22,413

20 15,305 10,746 8,613

30 11,119 10,704 8,047

43

Lampiran 10. Contoh Perhitungan Kadar Lignin

Kadar a = 1,000 g

Kadar b = 0,736 g

Kadar c = 0,711 g

Kadar d = 0,299 g

Kadar e = 0,137 g

% Lignin = 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒅 − 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒆

𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒂 x 100 %

% Lignin = 𝟎,𝟐𝟗𝟗 –𝟎,𝟏𝟑𝟕

𝟏,𝟎𝟎𝟎 x 100 %

% Lignin = 𝟏𝟔, 𝟐 %

Hari ke- Kadar Lignin Kontrol

(%)

Kadar Lignin

JP72 (%)

Kadar Lignin

DDH92 (%)

0 14,400 14,400 14,400

10 10,940 10,467 10,647

20 8,885 8,792 8,112

30 7,913 7,624 7,560

44

Lampiran 11. Contoh Perhitungan Aktivitas enzim selulase

Aktivitas selulase ( U/mL ) = 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒈𝒍𝒖𝒌𝒐𝒔𝒂 𝒙 𝒇𝒂𝒌𝒕𝒐𝒓 𝒑𝒆𝒏𝒈𝒆𝒏𝒄𝒆𝒓𝒂𝒏

𝑩𝑴 𝒈𝒍𝒖𝒌𝒐𝒔𝒂 𝒙 𝒘𝒂𝒌𝒕𝒖 𝒊𝒏𝒌𝒖𝒃𝒂𝒔𝒊 (𝒎𝒆𝒏𝒊𝒕)

Aktivitas selulase ( U/mL ) = 𝟐𝟗𝟑,𝟎𝟐 𝒙 𝟏

𝟏𝟖𝟎 𝒙 𝟑𝟎

Aktivitas selulase ( U/mL ) = 54,43

No Kode islolat Absorbansi Konsentrasi (ppm) Aktivitas enzim

(U/mL)

1 Kontrol 1 0,091 105,39 25,07 x 10-3

2 Kontrol 2 0,092 105,39 25,07 x 10-3

3 JP72 1 0,142 144,36 26,72 x 10-3

4 JP72 2 0.145 146,32 27,09 x 10-3

5 DDH92 1 0,336 293,02 54,43 x 10-3

6 DDH92 2 0,284 253,40 46,92 x 10-3

Gambar kurva standar Glukosa

y = 0.002x - 0.009R² = 0.990

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 100 200 300 400 500

abso

rban

si

ppm

Kurva Standar Glukosa

Linear (Kurva Standar Glukosa)

45

Lampiran 12. Contoh Perhitungan Kadar C-organik

% C-organik Kontrol = 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍 𝒙 𝒎𝑳 𝒆𝒌𝒔𝒕𝒓𝒂𝒌 𝒙 𝒇𝒌

𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒐𝒉 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝒍 x 100%

% C-organik Kontrol = 𝟖𝟓,𝟐 𝒑𝒑𝒎 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝒎𝑳 𝒙 𝟏𝟎𝟎/𝟗𝟖

𝟏𝟎 𝒎𝒈 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝑳 x 100%

% C-organik Kontrol = 86,938 %

% C-organik JP72 = 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍 𝒙 𝒎𝑳 𝒆𝒌𝒔𝒕𝒓𝒂𝒌 𝒙 𝒇𝒌

𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒐𝒉 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝒍 x 100%

% C-organik JP72 = 𝟓𝟕,𝟏 𝒑𝒑𝒎 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝒎𝑳 𝒙 𝟏𝟎𝟎/𝟗𝟔

𝟏𝟎 𝒎𝒈 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝑳 x 100%

% C-organik JP72 = 59,479 %

% C-organik DDH92 = 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍 𝒙 𝒎𝑳 𝒆𝒌𝒔𝒕𝒓𝒂𝒌 𝒙 𝒇𝒌

𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒐𝒉 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝒍 x 100%

% C-organik DDH92 = 𝟑𝟏,𝟓𝟗𝟔 𝒑𝒑𝒎 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝒎𝑳 𝒙 𝟏𝟎𝟎/𝟗𝟓

𝟏𝟎 𝒎𝒈 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝑳 x 100%

% C-organik DDH92 = 33,258 %

Gambar Kurva Standar C-organik

y = 601.2x - 0.677R² = 0.999

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300

abso

rban

si

ppm

Konsentrasi (ppm)

Linear (Konsentrasi (ppm))

46

Lampiran 13. Contoh Perhitungan Kadar N (nitrogen)

% kadar N Kontrol = 𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍−𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎 𝒌𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍 𝒙 𝑵 𝑯𝟐𝑺𝑶𝟒 𝒙 𝑨𝒓 𝑵

𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒐𝒉 x 100 %

% kadar N Kontrol = 𝟐𝟒,𝟗𝒎𝑳 –𝟐𝟎𝒎𝑳 𝒙 𝟎,𝟎𝟒𝟗𝑵 𝒙 𝟏𝟒,𝟎𝟎𝟖

𝟐𝟎𝟎𝒎𝒈 x 100 %

% kadar N Kontrol = 𝟏, 𝟔𝟖𝟐 %

% kadar N JP72 = 𝟏, 𝟔𝟒𝟕 %

% kadar N DDH92 = 𝟏, 𝟕𝟏𝟔 %

47

Lampiran 14. Hasil Analisis Rasio C/N Dekomposisi Jerami Padi

Rasio C/N DDH92 = 𝑲𝒂𝒅𝒂𝒓 𝑪

𝑲𝒂𝒅𝒂𝒓 𝑵

Rasio C/N DDH92 = 𝟑𝟑,𝟐𝟓𝟖

𝟏,𝟕𝟏𝟔

Rasio C/N DDH92 = 19,381

Kode Isolat Kadar C (%) Kadar N (%) Rasio C/N

Kontrol 86,938 1,682 51,687

JP72 59,479 1,647 36.113

DDH92 33,258 1,716 19,381

48

Lampiran 15. Gambar hasil Penelitian

Gambar kontrol dan bakteri selulolitik berasal dari jermi padi

Gambar medim cair isolat DDH92 Gambar isolat DDH92 pada media CCRA

Gambar kompos jerami padi dari kiri, control, JP72, dan DDH92.

49

Gambar isolat DDH92

Gambar jerami padi sebelum perlakuan

Gambar jerami sesudah perlakuan selama 30 hari dengan inokulum isolat DDH92