Avaliação da citotoxicidade e da genotoxicidade de uma naftoquinona furano sintetizada a partir de 2-hidroxi-1,4-

naftoquinona (Lawsona)

1

SOUSA, Leilane Bentes; RIBEIRO, Gilderlany Gomes de Souza; CARDOSO, Mariana Filomena do Carmo; SILVA, Fernando de Carvalho da; FERREIRA, Vitor Francisco; VASCONCELLOS, Marne Carvalho de. Universidade Federal do Amazonas – UFAM.

PIBIC 2013/2014 – UFAM

Oncologia experimental e

toxicologia clínicaManaus - AM

Introdução

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Naftoquinonas

• Derivadas do naftaleno• Família das quinonas• Dois grupos carbonílicos nas posições 1,2 ou 1,4 do anel

naftaleno

Figura 1: Estrutura química da 1,2-naftoquinona (A) e 1,4-naftoquinona (B).

• Extrato da folha Lawsonia inermis -> Cosmético e tratamento de micoses

Antifúngica Antitumoral

Antibacteriana

Antiviral

Introdução

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IVS 320

• Naftoquinona furano• Derivada da Lawsona• Antifúngico contra Cryptococcus

spp. e diferentes espécies de Candida

IVS320 - 1H-ciclopenta[b]nafto[2,3-d]furano-5,10(3aH,10bH)-diona

Antitumoral ??

Objeti vo

4

Avaliar o potencial citotóxico e genotóxico da IVS320

(1H-ciclopenta[b]nafto[2,3-d]furano-

5,10(3aH,10bH)-diona) na linhagem de fibroblastos

humano não-tumoral (MRC5).

Metodologia

5

Obtenção da amostra:

Amostra:

Obtida sinteticamente a partir de 2-hidroxi-1,4-naftoquinona (Lawsona – C10H6O3) e cedida pelo Prof. Vitor Francisco Ferreira da

Universidade Federal Fluminense .

IVS320 - 1H-ciclopenta[b]nafto[2,3-d]furano-5,10(3aH,10bH)-diona

Metodologia

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Cultura de células

Meio de cultura Dulbeco’s Modified Eagle Medium (DMEM), contendo 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) e 1% de antibiótico Penicilina/Estreptomicina.

Fibroblasto Humano não-tumoral (MRC5);

Linhagem:

Cultura celular:

As células foram mantidas em estufa a 5% de CO2 e 37oC.

Fonte: Arquivo pessoal

Metodologia

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Cultura de célulasObtenção da amostra

Avaliação da Citotoxicidade Avaliação da Genotoxicidade

Alamar Blue Teste do Cometa

IVS320

Plaqueamento e tratamento

-Placas de 96 poços- 0,5 x 104 cél/poço- Curva 0,3125uM a 20uM

-Placas de 24 poços- 20 x 104 cél/poço- 1μM; 2,5 μM e 5 μM

- pH Alcalino- pH Neutro- ID e FD

- CI50

Controle positivo: DOXORRUBICINA

Controle negativo:DMSO

(Ahmed et al, 1994) (Singh et al, 1988)

Resultados e discussão

8

Citotoxicidade

SubstânciaCI50 (µM)

24 h 48 h 72 h

IVS320 3,83 (3,24 – 4,52) 3,44 (3,13 – 3,77)3,76 (3,38 –

4,18)

Doxorrubicina 3,90 (3,15 – 4,83) 0,43 (0,37 – 0,50)0,34 (0,27 –

0,43)Tabela 1: Efeito da IVS320 sobre a linhagem de fibroblasto humano não - neoplásico (MRC5) nos tempos de tratamento de 24, 48 e 72h. Os valores estão representados como CI50 (intervalo de confiança de 95%).

Doxorrubicina foi utilizada como controle positivo.

c

•A IVS320 foi capaz de ser menos tóxica que a doxorrubicina em 48 e 72h de tratamento;

•FREIRE et al (2010)

Resultados e discussão

9

Genotoxicidade –Índice de Dano Total

Gráfico 1- Índice de dano ao DNA em células MRC-5, após 3h de tratamento com a IVS320. A- Cometa alcalino; B- Cometa neutro. * p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo, quando comparado ao DMSO (0,2%) por ANOVA seguido de teste Tukey.

A B

•Cometa Alcalino: A IVS320 apresentou aumento significativo no ID nas concentrações de 2,5 e 5,0 µM comparado ao DMSO e DOX.

•Cometa Neutro: A IVS320 apresentou diminuição significativa no ID em todas as concentrações testadas comparado a DMSO e DOX.

Resultados e discussão

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Genotoxicidade – Frequência de dano

A B

Gráfico 2- Frequência de dano ao DNA em células MRC-5, após 3h de tratamento com a IVS320. A- Cometa alcalino; B- Cometa neutro.

0 1 2 3 40

20

40

60

80

100

Alcalino

Fre

quê

ncia

de

Dan

o

DMSOdox1,02.55,0

0 1 2 3 40

20

40

60

80

100

Neutro

Fre

quê

nci

a d

e D

ano

DMSODox1,02,55,0

Doxorrubicina

Alcalino: Graus 1 e 2

Neutro: Graus 3 e 4

IVS320 (2,5 µM)

Alcalino: Grau 3

Neutro: Grau 1

Conclusão

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IVS 320

Baixa citotoxicidade em linhagem de fibroblasto não-neoplásico comparada a Doxorrubicina após 48 e 72h de tratamento;

Apresentou genotoxicidade em todas as concentrações testadas, em menor intensidade que a Doxorrucinica no ensaio do cometa em pH neutro (quebra de fitas duplas);

Ensaios complementares são necessários para comprovar sua segurança e verificar se o tipo de dano causado ao DNA das células

é reversível ou não.

Agradecimentos

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À Deus e minha família Profa. Dra. Marne Carvalho de Vasconcellos Mariana Filomena do Carmo Cardoso Prof. Dr. Fernando de Carvalho da Silva Prof. Dr. Vitor Francisco Ferreira Gilderlany Gomes de Souza Ribeiro

À Faculdade de Ciências Farmacêuticas e à todos que contribuíram diretamente para a realização desta pesquisa.

Referências Bibliográfi cas

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AHMED, S. A.; GOGAL, R. M.; WALSH, J. E. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes an alternative to [3H] thymidine incorporation assay. Journal of immunological methods, v. 170, n. 2, p. 211-224, 1994.

FERREIRA, M. P. S.; CARDOSO, M. F. C.; SILVA, F. C.; FERREIRA, V. F.; LIMA, E. S.; SOUZA, J. V. B. Antifungal activity of synthetic naphthoquinones against dermatophytes and opportunistic fungi: preliminary mechanism-of-action tests. Ann Clin Microbiol Antimicrob, v. 13, n. 26, 2014.

FREIRE, C. P. V. et al. Synthesis and biological evaluation of substituted a- and b-2,3-dihydrofuran naphthoquinones as potent anticandidal agents. Med. Chem. Commun., v. 1, p. 229-232. 2010.

SINGH, N. P.; MCCOY, M. T.; TICE, R. R.; SCHNEIDER, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research, Volume 175, Issue 1, pp. 184-191, 1988.